Biologa celular y molecular del virus de inmunodeficiencia humana (VIH).

Alfredo Santana , Casimira Domnguez , Angelines Lemes , Teresa Molero , Eduardo 1 Salido . Unidad de Investigacin Hospital Universitario de Canarias/ Facultad de Medicina Universidad de La Laguna (1); Servicio de Anlisis Clnicos (2) y de Hematologa y Hemoterapia (3) / Hospital de Gran Canaria Dr Negrn.
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Palabras clave: Retrovirus; Key Words: Retrovirus; AIDS; molecular biology.

SIDA;

biologa

molecular.

Recibido: Aceptado: Correspondencia: Hospital Universitario sanrod@teleline.es

de

Canarias.

La

Alfredo Cuesta.

35320-Sta

Cruz

de

27-VII-02 23-XII-02 Santana Tenerife

Introduccin. El VIH es un retrovirus perteneciente a la subfamilia de los lentivirus. El estudio de stos, se ha 1, 2 visto notablemente incrementado despus del descubrimiento del VIH . Los lentivirus son retrovirus exgenos no oncognicos que causan infecciones persistentes, dando lugar a enfermedades con largos periodos de incubacin. El prefijo lenti- hace mencin, precisamente, a la capacidad de estos virus para instalarse en el organismo infectado durante amplios periodos de tiempo. Normalmente infectan clulas del sistema inmune (macrfagos, clulas T) y causan en ellas efectos citopticos. Una caracterstica importante, carente en otros retrovirus, es su habilidad para infectar a clulas quiescentes. Comparado con otros virus, los lentivirus tienen un genoma de Acido Ribonucleico (ARN) ms extenso, en torno a las 10 Kilobases (Kb). Su propiedad ms relevante estriba en la capacidad de codificar genes esenciales que permiten la regulacin de su propia expresin en la clula infectada. La replicacin de los lentivirus es, en general, txica para la clula conduciendo a su disfuncin y posterior muerte. Muchas de las propiedades estructurales y funcionales del VIH son comunes a todos los retrovirus. Por ello, la intensa investigacin desarrollada en el campo de los retrovirus ha permitido profundizar y conocer muchos aspectos inditos de la biologa molecular del VIH. Estructura. El VIH consta de una bicapa lipdica externa, como envoltura, donde se han encontrado diferentes protenas membranales del husped, adems de glicoprotenas virales asociadas en trmeros o 3 tetrmeros (Figura 1). La glicoprotena de superficie gp120 est unida de forma no covalente a la tambin glicoprotena transmembranal gp41; estos oligmeros son fundamentales para la actividad

biolgica del virin ya que aportan el sitio de interaccin y fusin con las clulas blanco, adems de aumentar el tamao del virus hasta en 10 nanmetros (nm) siendo, por tanto, fcilmente identificables por microscopa electrnica. Las partculas virales maduras miden entre los 100 y 130 4 nm de dimetro, mientras que las inmaduras estn entre los 120 y 140 nm .

Por debajo de la envoltura, la protena miristilada MA (p17) forma la matriz viral de estructura icosadrica. En el centro, se encuentra la cpside que asemeja a un cono y est constituida por la protena viral ms abundante en la partcula, CA (p24). A excepcin de los desoxirribonucletidos, dentro del cono se encuentra todo el material necesario para armar el provirus: las protenas virales PR (p15), RT (p55 y p66), IN (p11), NC (p17), Ll (p6), ms las dos cadenas idnticas de ARN y un par de iniciadores de ARN transferente (ARNtLys). El VIH, como cualquier otro retrovirus, posee un genoma de ARN de cadena simple (ss) que depende de una sola enzima, la retrotrancriptasa, para convertir su ARN genmico en ADN (provirus) que es posteriormente integrado en el genoma 5 celular. Este provirus posee aproximadamente 9.8 Kb de longitud . Al igual que el resto de retrovirus, en su genoma encontramos tres regiones codificantes, gag, pol y env, que codifican las protenas de la cpside (Gag), las enzimas necesarias para la replicacin (Pol) y la glicoprotena externa (Env), responsable de la infectividad de la partcula viral a travs de la unin a receptores especficos de la clula. Las enzimas virales codificadas por pol son la transcriptasa inversa (RT), la integrasa (IN) y la proteasa (PR). Como la mayora de los retrovirus, el VIH posee un promotor y un sitio de poliadenilacin dentro de la regin larga terminal (LTR) y expresa un solo transcrito primario. Las protenas adicionales expresadas por el VIH son parte de la partcula viral (Vif, Vpr, Vpx), regulan directamente la expresin gnica viral (Tat, Rev) o interactan con la maquinaria celular para facilitar la propagacin del virus (Vpu, Nef). Estas protenas adicionales incrementan la complejidad de la organizacin y expresin del VIH. Se ha propuesto que los lentivirus deben 6, 7 incluirse en un subgrupo de los retrovirus denominado retrovirus complejos . La caracterstica distintiva de este subgrupo es la habilidad para regular su propia expresin va factores proteicos codificados por el virus. Es esta propiedad la que permite a los virus que la poseen, como el VIH, permanecer durante largos periodos en la clula infectada, generando con ello infecciones crnicas activas.

Ciclo vital del VIH. Generalidades. El ciclo vital del VIH sigue, en general, las pautas del resto de retrovirus (Figura 2). Despus de que el virus alcanza la clula diana y logra penetrar a travs de la membrana plasmtica, la RT convierte el ARN viral en ADN. El ADN retrotranscrito es transportado al ncleo e integrado al ADN celular, proceso mediado por la enzima IN. Debido a las caractersticas de replicacin de los retrovirus, el ADN proviral est flanqueado por las regiones LTR (long terminal repeats), con importantes funciones reguladoras.

Despus de la integracin, el ADN retroviral (provirus) usa la maquinaria celular para expresar el ARN viral. El ARN genmico, junto a las protenas virales, son ensamblados en la partcula viral, que sale de la clula e infecta nuevas clulas mediante la unin a receptores celulares especficos. Penetracin del virus. Comienza cuando la protena Env del VIH se une al receptor de superficie CD4, un miembro de las 8-11 inmunoglobulinas . Este receptor se encuentra en los linfocitos T, monocitos, linfocitos B y otras 12 clulas . Aunque CD4 es el receptor primario, se han descrito receptores alternativos para la 13 penetracin del VIH en clulas CD4(-) como, por ejemplo, el esfingolpido galactsido ceramida . El CD4 es una glicoprotena transmembrana de 58 KiloDalton (KDa), siendo la regin comprendida 14,15 entre los aminocidos 400-430 la que define el sitio de unin con la protena viral Env. La interaccin de CD4 con Env es de vital importancia para el VIH, permitiendo la infeccin y disregulacin de CD4. Esto afecta la funcin de las clulas T y eventualmente permite la deplecin de las clulas T CD4(+) causando inmunodeficiencia en los pacientes infectados.

Los mecanismos post-unin requeridos para la fusin entre VIH y la membrana celular no son bien conocidos. El VIH, como otros retrovirus, infecta a las clulas de forma pH-independiente, a travs 16-18 de la fusin directa entre las membranas viral y celular . Se piensa que el proceso es conducido inicialmente a travs de cambios conformacionales en Env, justo despus de la unin a CD4, los cuales hacen exponer dominios de fusin, localizados en la regin hidrofbica N-terminal de la 19-21 subunidad transmembrana de Env . En la superficie celular humana existen otras molculas que, junto a CD4, y actuando como cofactores, son cruciales para la eficaz entrada de VIH; destacan el receptor fusina-CCR5 o el 22-26 receptor para quimiocinas CKR5 . Sntesis del Provirus. Despus de la penetracin del virus, la cpside se desestructura y la RT viral es activada. Existen evidencias experimentales que sugieren el posible comienzo de la retrotranscripcin del VIH 27-28 incluso dentro del virin . Un complejo ribonucleoproteico (RNP) conocido como "complejo de preintegracin" se estructura en el citoplasma de la clula infectada y es responsable de la transcripcin reversa y del transporte al ncleo. El RNP contiene al ARN genmico junto a las 29 protena NC y MA as como las enzimas virales RT e IN . Durante la retrotranscripcin, las dos molculas de ARN del virin son convertidas a una doble 30 cadena lineal de ADN . Transporte nuclear e Integracin. El ADN proviral de doble cadena unido a protenas es transportado al ncleo de la clula infectada. La cuestin de cmo el complejo de preintegracin es transportado desde la membrana plasmtica a la membrana nuclear no est del todo claro. Se especula con la posibilidad de que Vif est implicada en el proceso teniendo en cuenta que la protena es empaquetada en las partculas 31 virales de VIH asociada al core viral . Por otra parte, Vif tiene la habilidad de asociarse con 32 filamentos intermedios como la vimentina que conecta las membranas nucleares y plasmticas . Por ello, parece probable que Vif acte como puente de unin entre el complejo de preintegracin y las molculas motoras de los microtbulos celulares para el transporte activo hacia el ncleo. A diferencia de los oncoretrovirus, VIH puede entrar en el ncleo de clulas quiescentes como los macrfagos diferenciados. Las tres protenas virales ms importantes en el proceso de 33-37 translocacin nuclear son MA, IN y Vpr . Uno de los primeros pasos en la importacin nuclear del complejo es el reconocimiento de seales de localizacin nuclear (NLS) presentes en el complejo de preintegracin. El proceso en cuestin est mediado por un complejo proteico heterodimrico compuesto por Importina-a (Imp-a) e Importina-b (Imp-b). Imp-a une las NLS 38 mientras que Imp-b media la translocacin a travs del poro nuclear . Tanto MA como IN portan 39-41 secuencias NLS y se sabe que interaccionan con miembros de las Importinas . El ADN del VIH es integrado en el genoma celular a travs de la accin de la IN viral en sitios 42,43 localizados al azar, aunque se han descrito regiones de alta probabilidad de integracin . Se sabe que el ADN viral lineal es el sustrato directo para la integracin siendo inviable la integracin de formas circularizadas. El provirus integrado es homlogo al ADN viral excepto que se eliminan algunos nucletidos de cada extremo adems de la presencia, en ellos, de cortas 47 repeticiones procedentes del genoma del husped . La integracin requiere que IN reconozca los extremos del ADN viral (los sitios att). La IN cataliza la eliminacin de dos pares de bases de los extremos 3 de cada cadena de ADN viral exponiendo un dinucletido CA, muy conservado entre 47 todos los retrovirus . Este ADN viral procesado es unido entonces a los extremos 5 del ADN 48 celular, previamente cortados, a travs de una reaccin de transesterificacin . Las enzimas
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celulares reparan entonces las uniones generando las repeticiones cortas que flanquean las secuencias virales. La protena Nef est implicada en la regulacin de la infectividad viral . De hecho, hay similitudes considerables entre los fenotipos derivados de defectos en Vif y en Nef. Para ambas protenas, los defectos se manifiestan en un paso muy temprano del ciclo viral y se caracterizan 51 por niveles reducidos en la sntesis de ADNc . Expresin gnica. El provirus integrado y flanqueado por los LTRs se organiza como una unidad transcripcional eucaritica. El LTR 5 contiene un promotor/activador y el LTR 3 contiene un eficiente sitio de poliadenilacin. La transcripcin del provirus, va ARNpol II celular, da lugar a un transcrito primario que tiene dos importantes funciones: puede servir como ARN genmico para ser incorporado en el virin, o bien ser procesado para proveer todos los ARN mensajeros (ARNm) que codifican las protenas virales. El promotor del VIH es regulado por factores celulares y virales y su actividad vara dependiendo del estado celular. En muchas clulas de individuos VIH positivos la expresin del virus es indetectable. De este modo, puede existir un estado de latencia en clulas individuales aunque la infeccin est crnicamente activa debido a la expresin continua de VIH en una fraccin de las clulas. La protena Tat incrementa en gran medida la expresin del promotor de VIH. Esta protena es la que permite la alta expresin de ARNm en los primeros momentos posteriores a la infeccin. Mientras que la activacin de Tat conduce bsicamente a la obtencin de ARNm maduros, la protena Rev (regulacin postranscripcional) regula el balance entre ARNm pre y post splicing. La activacin de Rev conduce la ltima etapa de la expresin viral donde el ARNm que no ha sufrido splicing predomina. La funcin de Rev dirige el balance de la expresin de las protenas virales a travs de un feedback negativo; la disfuncin de esta protena conduce al estancamiento del virus 52,53 en un estado en el que domina un patrn ineficaz de la expresin gnica . En la mayora de las clulas, la transicin desde la primera etapa de la expresin viral (produccin de Tat y ARNm maduros) a la ltima (produccin de Tat y Rev con expresin eficiente de todos los ARNm virales) ocurre con rapidez (horas). Aunque pueden detectarse muchas clulas conteniendo el genoma de VIH pero sin expresin proteica, parece que slo unas pocas pueden bloquearse en 54 las primeras etapas de la expresin viral . Ensamblaje del virin. Las protenas estructurales traducidas se van acumulando dentro de la membrana plasmtica. La protena Gag interacciona con Env que est embutida en la membrana plasmtica. La multimerizacin del precursor Pr55gag lleva consigo el inicio de la formacin de la partcula. Junto a Pr55gag, algunas Pr160gag-pol son tambin incorporadas al virin. Dos molculas de ARN genmico son tambin encapsuladas junto a las molculas de ARNtLys3. La integracin de Pr160gag-pol a la partcula permite la activacin de la misma. El corte ordenado de Pr160gag-pol y Pr55gag dirige la maduracin de la partcula y su inmediata liberacin. Este es un paso esencial para la produccin de viriones infectivos, ya que las partculas virales conteniendo las molculas precursoras no son infectivas. El proceso descrito permite que se inicie tambin la maduracin y activacin de otras enzimas virales. La RT est asociada con el complejo ARNgenmico-ARNt e inicia la retrotranscripcin si hay disponibilidad de nucletidos trifosfato (dNTP). Las protenas accesorias Vif y Vpr y posiblemente Nef son tambin incorporadas al virin junto con las protenas celulares|, jugando un papel importante en el proceso de
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ensamblado . En algunos casos, estas protenas celulares son muy importantes para la 58-59 infectividad viral . Una de las peculiaridades de VIH es el requerimiento de ciclofilina A (CyPA) para la infectividad del 60,61 virus . CyPA, una chaperona con actividad peptidil isomerasa tiene un papel general en el 62,63 61 plegamiento proteico y se cree que interacciona directamente con Gag del VIH . 64 Probablemente sea necesaria para el correcto plegamiento de Gag . Promotor viral. El potente promotor del VIH contiene una caja TATA y sitios de unin para factores de 65-69 transcripcin celulares incluyendo sitios para NF-KB y Sp1 . Estos factores de transcripcin son esenciales para la funcin del promotor. Hay dos sitios de unin en tandem para NF-KB (posiciones -104 y -90) y tres sitios de unin para Sp1 (-78 a -47). La deleccin de los sitios Sp1 o de los NF-kB reduce la actividad del promotor mientras que la retencin de un solo sitio NF-kB es 65, 67, 69 suficiente para el desarrollo completo de la actividad del promotor . Por ello, la composicin del promotor ms simple eficaz contiene 1 sitio NF-kB, los sitios Sp1, la caja TATA, el sitio de iniciacin de transcripcin y el elemento sensible a Tat (TAR). El promotor de VIH es altamente inducible y responde al estado de activacin de la clula infectada. NF-kB es el mayor activador inducible conocido. Se han identificado otros sitios de unin para otros tantos factores como NFAT y AP1 en la regin U3. Sin embargo, parece que slo los sitios para Sp1, NF-kB, Ap2 y HIP-1 afectan a la expresin del promotor de VIH en clulas 70 humanas . Estas interacciones unen la expresin de VIH a la activacin de genes especficos de clulas T y contribuyen a explicar las propiedades biolgicas descritas de este virus. Los factores celulares que interaccionan con el promotor han sido intensamente estudiados y son motivo de 71-73 bastantes revisiones . Est bien establecido que en muchas clulas del tejido linfoide de individuos infectados se 74,75 encuentra el VIH latente , aunque la replicacin viral en el organismo est siempre activa. En las clulas T en reposo la actividad del promotor de VIH es mnima siendo ste uno de los mecanismos ms importantes que permiten la quiescencia viral en la mayora de las clulas primarias. La activacin celular est asociada con la activacin viral. Debido a la baja actividad basal de LTR en los linfocitos T en reposo, la transactivacin dependiente de NF-kB es necesaria para la induccin del LTR del VIH y para la propagacin viral. Adems, el VIH emplea un segundo paso regulatorio esencial en el que interviene la protena viral Tat. Esta se une al elemento TAR del ARN en el comienzo de la transcripcin, incrementndola en gran medida. Por todo lo expuesto, el promotor completo activado del VIH es uno de los ms potentes conocidos en clulas humanas. Seales regulatorias en el ARN viral. Se han identificado muchos sitios en el ARN viral del VIH que son esenciales para su propagacin. Entre ellos, se incluyen los elementos reguladores positivos TAR y el elemento sensible a Rev (RRE) junto a los negativos, que inhiben la expresin (INS o CRS). Estos elementos negativos regulan la expresin mediante la interferencia en la estabilidad, transporte y traduccin de los ARNm. Junto a los descritos, el ARNm tambin contiene varios sitios necesarios para otros pasos en el ciclo viral como la dimerizacin del ARN genmico y la encapsidacin (sitio psi). Como otros lentivirus, el VIH contiene muchos sitios de splicing comparado con los oncoretrovirus. El control preciso del splicing es esencial para los retrovirus ya que requieren del ARNm sin procesar para la encapsidacin dentro de la partcula viral (ARN genmico). El splicing de VIH no 76 ocurre rpidamente in vitro ni in vivo permitiendo su precisa regulacin.

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ARNm virales. El transcrito primario del VIH generado por la ARNpol II est protegido con una estructura CAP en 5 y una cola de poliAdeninas en el extremo 3. Una porcin de este transcrito es sometido a 5, 76-82 splicing alternativo, generando ms de 30 especies diferentes de protenas virales . Para propsitos de regulacin gnica estos ARNm pueden dividirse en dos clases. La primera clase, incluyendo los ARNm inmaduros y los que han sufrido parcialmente el proceso de splicing dependen de la protena Rev para una expresin eficaz. Estos ARNm codifican para Gag, Pol, Vif, Vpr, Vpu, Env y Tat-1. La segunda clase comprende a los ARNm pequeos sometidos a splicing completo. Estos ARNm son expresados eficazmente en ausencia de Rev y codifica para Tat-2, Rev y Nef as como para Vpr y otras como Tev. Se sabe que la produccin de ARNm maduros est gobernada por la interaccin de las protenas virales Tat y Rev con elementos cis-acting sobre los ARNm (TAR y RRE). Se han descrito tanto ARNm monocistrnicos (gag-pol, tat, tat-1) como bicistrnicos (rev/nef, vpu/env). En general, cada protena viral es producida por ms de un ARNm. Estos ARNm son sometidos a splicing y codifican una de las protenas como el primer ORF(marco de lectura abierto), resultando una expresin ptima. Las excepciones a esta regla general estn en el precursor de Gag/Pol que es producido por el ARNm sin splicing mientras que Env es producida 83 como el segundo ORF por el ARNm bicistrnico vpu/env . Mltiples estudios corroboran el hecho de que la produccin de VIH puede tener lugar dentro de un gran margen de niveles de ARNm. Est bien establecido que los diferentes VIH aislados varan ampliamente en sus caractersticas biolgicas como tropismo, niveles de expresin y citopaticidad. Debido a la variacin en el splicing de los aislados primarios, como se ha descrito, es concebible que algo de la variabilidad en las propiedades biolgicas de los diferentes VIH debe poder ser explicado como resultado de diferencias en el splicing. Protenas virales. Los genes del VIH codifican para diversas protenas que pueden clasificarse, bsicamente, en tres clases. Protenas estructurales. * Gag: el gen gag da lugar a una protena precursora de 55 KDa tambin llamada p55 que se expresa a partir del ARNm viral sin procesar. La poliprotena Gag es la encargada de reclutar dos copias del ARN genmico viral junto a otras protenas celulares y virales que permite la expulsin de la partcula viral desde la superficie de una clula infectada. Despus de la expulsin, la p55 es 84 fraccionada por proteasas codificadas por el virus (derivadas del gen pol) durante el proceso de maduracin. Las cuatro protenas derivadas de este procesamiento proteoltico son MA (matriz, 84 p17), CA (capside, p24), NC (nucleocapside, p9) y p6 . Las molculas MA facilitan el transporte nuclear del genoma viral mediante una seal que reconoce la maquinaria nuclear celular. Este fenmeno es el que permite al VIH infectar a clulas que no estn en mitosis (85). La protena CA o p24 forma el core cnico de las partculas virales (61,62,86). La regin NC de Gag es responsable del reconocimiento especfico de la llamada seal de empaquetamiento de VIH (87). La regin polipeptdica p6 media las interacciones entre p55 y la 88 protena accesoria Vpr, permitiendo la incorporacin de Vpr a los viriones .

* Gag-Pol (precursor): las protenas PR, IN, ARNasa H y RT son tambin expresadas dentro del 89 contexto de una fusin proteica Gag-Pol . El precursor Gag-Pol (p160) es generado por un evento de cambio de marco de lectura ribosomal (frame shifting) desencadenado por un elemento cis90 acting especfico . Cuando los ribosomas encuentran este motivo cambian al marco de lectura de pol (aprox 5% del tiempo) sin interrumpir la traduccin. Durante la maduracin viral, las proteasas virales separan el polipptido Pol del Gag y a continuacin digieren ste para separar la PR (p10), RT (p50), ARNasa H (p15) y la IN (p31). La PR del VIH es una aspartil proteasa que acta como un dmero. La actividad proteasa es importante para la escisin de los precursores durante la maduracin del virin. El conocimiento de 92 la estructura tridimensional de esta proteasa ha sido de gran inters farmacolgico permitiendo la generacin de nuevos frmacos, diseados para inhibir especficamente esta enzima viral. Es quiz uno de los mejores ejemplos de la utilidad real que la investigacin bsica presta a la medicina clnica. La RT es codificada por el gen pol. El ADN viral puede ser completamente sintetizado en 6 horas desde la penetracin del virus, aunque puede permanecer sin integrar durante largos perodos de 92 tiempo . La IN media la insercin del ADN proviral en el ADN genmico de la clula infectada. En el proceso 44 se ven implicadas 3 funciones diferentes de IN . Por una parte la actividad exonuclesica corta dos nucletidos de cada final 3 del dplex de ADN viral lineal. A continuacin, una endonucleasa de actividad "doble cadena" corta el ADN de la clula husped en el sitio de integracin. Por ltimo, la actividad ligasa genera una unin covalente simple en cada extremo del ADN proviral. Se cree que la zona de integracin viene influenciada por la accesibilidad al ADN incluido en la 93 cromatina . Al menos in vitro, los sitios donde el ADN se encuentra retorcido dentro de la 94 cromatina son puntos calientes para la integracin . Sin embargo, la integracin preferencial en regiones de cromatina abierta, transcripcionalmente activa, facilita la expresin del provirus. Los 95 genes virales no son expresados eficazmente desde el ADN proviral no integrado . * Env: se trata de una protena de 160 KDa (gp160) que se expresa a partir de un ARNm sometido a splicing simple. Sintetizada en el retculo endoplsmico, Env emigra a travs del complejo de Golgi donde es glicosilada con 25-30 cadenas de carbohidratos en los residuos de asparagina. 96 Esta glicosilacin es importante para la infectividad del virus . Una proteasa celular escinde gp160 para generar gp41 y gp120. Mientras que gp41 contiene el dominio transmembrana del Env, la gp120 se localiza en la superficie de la clula infectada y del virin a travs de interacciones no covalentes con gp41. Se sabe que Env existe como un trmero en la superficie del virin. Las interacciones entre el VIH y el receptor del virin, CD4, estn mediadas a travs de dominios 97 especficos de gp120 . La gp120 presenta 9 puentes disulfuro intracadenas muy conservados y 5 regiones hipervariables (V1 a V5) cuyas secuencias de aminocidos varan bastante entre los diferentes VIH aislados. Una de ellas, conocida como bucle V3, aunque no est implicada en la unin a CD4, es un importante determinante del tropismo preferencial de VIH por las clulas 97 Linfoides T o los macrfagos primarios Asimismo, este bucle es la principal diana para los 98 anticuerpos neutralizantes que bloquean la infectividad de VIH . Por otra parte, la gp41 contiene un dominio N-terminal fusognico que media la fusin de las 99 membranas viral y celular permitiendo el vertido de los componentes virales a la clula infectada . Protenas reguladoras. * Tat: es un transactivador transcripcional esencial para la replicacin del VIH . Tat es una protena que une ARN a diferencia de los factores transcripcionales habituales, que suelen 101,102 interaccionar con ADN . En concreto, se une a una estructura corta, en forma de bucle,
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conocida como "elemento de respuesta a la transactivacin" (TAR) que est localizado en el extremo 5 del ARN viral. Esta unin de Tat a TAR activa la transcripcin del LTR de VIH en un orden magnitud de al menos 1000 veces. Tat puede activar la expresin de un nmero 103 considerable de genes celulares incluyendo el gen del factor de necrosis tumoral (TNF) , 104 105 pudiendo asimismo regular la expresin de otros tantos como el gen bcl-2 y el gen MIP-1a . * Rev: se trata de una protena de 13 KDa que une ARN . Producida a partir de ARNm totalmente procesado, Rev induce el trnsito de la expresin gnica temprana de VIH a su etapa 107 avanzada. . Experimentalmente se ha comprobado que Rev es absolutamente necesaria para la replicacin de VIH; as, los provirus que carecen de la funcin Rev son transcripcionalmente activos pero no expresan genes virales tardos y, por tanto, no producen viriones. Protenas accesorias. Aparte de los genes y sus correspondientes protenas descritas anteriormente, VIH contiene otros genes adicionales: nef, vif, vpr, vpu, codificando las llamadas protenas accesorias. Las protenas accesorias no son absolutamente necesarias para la replicacin vrica in vitro pero, sin embargo, representan factores de virulencia crticos in vivo. Nef se expresa a partir de un ARNm muy procesado y por tanto, es independiente de Rev. En contraste, Vpr, Vpu y Vif son productos de ARN sometido a splicing incompleto y, por tanto, slo son expresadas en la fase de replicacin tarda Rev-dependiente. La mayora de las protenas accesorias de VIH tienen mltiples funciones tal y como se describe a continuacin. * Nef (negative factor): El gen nef pertenece al grupo de genes de expresin temprana siendo su producto la primera protena viral que se acumula hasta niveles detectables en la infeccin por 107 VIH . De entre sus mltiples funciones conocidas, destacan la regulacin de la expresin de CD4 108 en la superficie celular , la perturbacin de la activacin de las clulas T y la estimulacin de la 109 infectividad del VIH . Nef acta post-transcripcionalmente para disminuir la expresin en la 110 superficie celular de CD4 , incrementa la velocidad de endocitosis de CD4 y su degradacin 111 lisosomal . El dominio citoplasmtico de CD4 y, en particular, una secuencia repetida de dileucinas es el sitio de accin de Nef; asimismo, tambin regula, aunque en menor medida, la expresin celular de las molculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase I. Est demostrado la capacidad de Nef para perturbar la activacin de las clulas T. Diversos estudios demuestran que la expresin de Nef tiene un efecto negativo en la induccin de NF-kB y 50 en la expresin de IL-2 . En cualquier caso, Nef ejerce efectos pleiomrficos en la activacin de las clulas T dependiendo del contexto de expresin. Consistente con este modelo, se ha encontrado que Nef est asocida con diversas quinasas presentes en las clulas T helper. Nef tambin es capaz de estimular la infectividad de los viriones . Las partculas de VIH producidas en presencia de Nef pueden ser 10 veces ms infectivas que los viriones producidos en su ausencia. * Vpr: aproximadamente 100 copias de Vpr estn asociadas con cada virin . Juega un papel en la habilidad del VIH para infectar clulas que no estn en mitosis en tanto que facilita la localizacin 36 114 nuclear del complejo de preintegracin . Tambin puede bloquear la divisin celular ; las 115, 116 clulas que expresan Vpr arrestan en la fase G2 del ciclo celular . La expresin de Vpr parece prevenir la activacin del complejo p34cdc2/ciclina B, conocido regulador del ciclo celular,
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importante para la entrada en mitosis (117-119). Asimismo, Vpr interacciona con la protena uracil119 ADN-glicosilasa (UNG) cuyas consecuencias biolgicas estn an por determinar. * Vpu: este polipptido de 16 KDa es una fosfoprotena integral de membrana que est localizada 120 en las membranas celulares . Vpu es expresada del mismo ARNm que codifica a Env. Vpu es traducida, desde este ARNm, a niveles 10 veces menores que Env ya que el codn de iniciacin 83 en la traduccin de Vpu no es eficaz . Las dos funciones de Vpu, la modulacin de CD4 y el incremento de la liberacin de viriones, estn 121 genticamente separadas . En las clulas infectadas por VIH los complejos formados entre CD4 y la protena de la cubierta viral en el retculo endoplsmico causan el atrapamiento de ambas protenas dentro de este compartimento. La formacin de complejos Env-CD4, por tanto, interfieren con el ensamblaje del virin. Vpu se encarga de liberar la cubierta viral, desencadenando la degradacin de las 122 molculas de CD4 unidas con Env . Vpu tambin incrementa la liberacin de VIH desde la superficie de una clula infectada. En ausencia de Vpu, puede observarse un nmero alto de viriones agregados a la superficie de la 58 clula infectada . * Vif: es una polipptido de 23 KDa, esencial para la replicacin de VIH en los linfocitos de sangre 59 perifrica, macrfagos y algunas lneas celulares . En muchas lneas celulares Vif no es imprescindible y, por ello, se denominan como permisivas para VIH-mutantes de Vif. Los viriones producidos en estas condiciones pueden infectar a clulas no permisivas aunque los virus resultantes no son infectivos. Diversos estudios indican que es posible complementar la infectividad de estos mutantes de Vif mediante su expresin en las clulas productoras pero no en 123 la diana . Estos resultados indican que Vif debe estar presente durante el ensamblaje del virin 31 siendo incorporada a posteriori . Este fenmeno, sin embargo, no es especfico porque Vif es 124 tambin incorporada a retrovirus heterlogos como los virus de la leucemia murina . Los VIH sin Vif pueden entrar en las clulas pero no sintetizan eficazmente el ADN proviral . No est claro si el defecto en Vif afecta directamente a la retrotranscripcin, a la desestructuracin del virus o a la estabilidad del complejo nucleoproteico viral. Los viriones mutantes de Vif tienen cores con nucleoprotenas empaquetadas errneamente como revelan los anlisis de microscopa 125 electrnica . Regulacion de la expresion gnica de VIH. La regulacin de la expresin gnica de VIH es llevada a cabo por una combinacin de factores celulares y virales. Se produce a niveles tanto pre como post-transcripcionales. Los genes del VIH se dividen en genes tempranos y genes tardos . Los genes tempranos (tat, rev, nef) se expresan a travs de un proceso Rev-independiente. Los ARNm que codifican para genes tardos (gag, pol, env, vpr, vpu, vpi) requieren de Rev para ser localizados citoplasmticamente y poder ser expresados. * Regulacin de la transcripcin: como ya se ha comentado, el LTR de VIH contiene sitios de unin a ADN para mltiples factores de transcripcin. Los ms directamente implicados en la regulacin de la transcripcin de VIH son aquellos pertenecientes a la familia NF-kB. La protena NF-kB permite al virus ser el responsable del estado de activacin de la clula T infectada. La estimulacin del TCR provoca que la forma inactiva de NF-kB (localizada en el citoplasma) sea translocada al ncleo donde induce la expresin de una serie de genes especficos relacionados con la activacin de la clula T. La NF-kB y la consiguiente activacin de la transcripcin del 128 provirus puede tambin ser inducida por la citocinas TNF-a e IL-1 . Este fenmeno podra ser de
126, 127

inters en la patogenia del SIDA. Por una parte, la activacin fisiolgica de una clula T latente infectada puede ser el modo en el que la latencia finaliza y comienza la produccin del virus. Por otra, las mltiples infecciones que sufren los pacientes con SIDA suponen una elevada expresin 129 de TNF pudiendo ste estimular la produccin de VIH y la infeccin de ms clulas . El LTR de VIH tambin contiene sitios de unin para los factores de transcripcin constitutivos Sp130, 131 1, Lef y Ets as como para los factores de transcripcin inducibles NF-AT y AP-1 . Es sabido que Lef y NF-At son factores especficos de las clulas T mientras que los sitios de unin para Sp-1 son esenciales para el eficaz funcionamiento del promotor del VIH. La activacin inicial del LTR del VIH es una consecuencia de los factores de transcripcin constitutivos e inducibles celulares. La activacin del LTR por factores de transcripcin conduce a 132 la generacin de transcritos cortos . En el proceso interviene un elemento localizado justo despus (downstream) del sitio de iniciacin de la transcripcin conocido como "inductor de 133 transcritos cortos" (IST) . Sin embargo, se generan tambin algunos transcritos completos que permiten la produccin de Tat. La protena Tat interacciona entonces con TAR para incrementar inmediatamente los niveles de transcripcin del ARN viral. * Splicing del ARNm y localizacin celular: el transcrito primario de VIH contiene mltiples donadores (5 splice sites) y aceptores (3 splice sites) de splicing que pueden procesarse dando 80 lugar a ms de 30 ARNm alternativos . La mayora de los ARNm son policistrnicos conteniendo ORF de ms de una protena. Estos ARNm expresan generalmente un solo producto gnico. La eleccin de un determinado ORF est gobernado por la eficacia del codn de iniciacin y de la 134 proximidad de este codn al extremo 5 del ARNm . Los ARNm de VIH producidos pueden ser clasificados en tres clases: 1. ARN sin procesar: el transcrito primario no sometido a splicing de 9 Kb puede ser expresado para generar los precursores de Gag y Gag-Pol o bien empaquetado en los viriones sirviendo entonces como ARN genmico. 2. ARN sometido a splicing incompleto: estos ARNm usan el sitio donador de splice cercano al extremo 5 de ARN genmico del VIH en combinacin con cualquiera de los aceptores localizados en la regin central del virus. Estos ARN pueden expresar en potencia Env, Vif, Vpu, Vpr y Tat (isoforma de un exn). Todos ellos retienen el segundo intrn del VIH. 3. ARN sometido a splicing completo: en ellos se han eliminado los dos intrones de VIH y pueden expresar Rev, Nef y Tat (isoforma de dos exones). Estos ARNm no requieren la expresin de la protena Rev. Como norma general, los ARN que contienen intrones deben ser sometidos a splicing completo antes de que puedan salir del ncleo. Esta regulacin es esencial ya que previene la traduccin de secuencias intrnicas contenidas en los ARNm con splicing parcial. En el caso de VIH, la protena Rev une al ARN viral y retiene las secuencias intrnicas dirigiendo su exportacin desde el ncleo. Esta estrategia permite la salida del ncleo de ARNm parcialmente procesados, portando secuencias intrnicas. Los ARNm totalmente procesados dejan el ncleo a travs de los mecanismos habituales de transporte. En cualquier caso, es necesario la existencia de unos niveles mnimos de Rev para que se produzca la salida nuclear de ARNm con intrones lo que explica el porqu stos codifican para productos gnicos virales tardos. En contraste, las protenas codificadas por los ARNm totalmente procesados (Nef, Tat y Rev) pueden producirse inmediatamente y son por ello productos gnicos virales precoces.

Variabilidad del VIH. La secuenciacin del genoma de diferentes VIH aislados, procedentes de diversas regiones han 135 demostrado una amplia divergencia . El VIH-1 puede ser dividido al menos en 9 subtipos genticos (A-J y O). En Europa y USA hay dominancia del subtipo B mientras que en otras partes del mundo predominan otros subtipos solos o en combinacin. Se sabe que existen diferencias en cuanto a los diferentes subtipos se refiere; as, los subtipos noB parecen transmitirse de forma diferente que los B pudiendo causar epimedias con caractersticas diferenciadas. Los subtipos A y E parecen ser ms eficaces en la transmisin heterosexual pudiendo causar nuevas y severas epidemias tanto en pases del primer mundo como en aqullos en vas de desarrollo. El mecanismo de generacin de la variabilidad de VIH-1 es similar a la de otros retrovirus. La falta de funcin correctora en las enzimas virales y celulares implicadas en la replicacin viral lleva a -5 tasas altas de error con la continua generacin de variantes (aproximadamente 3x10 por base y por ciclo de replicacin). Las mutaciones incorporadas por la RT retroviral incluyen sustituciones de 136 aminocidos, mutaciones frameshift (cambio pauta de lectura) y delecciones . Junto a ello, parece que la transcripcin inversa puede conducir a provirus hipermutados que contienen 137 mltiples sustituciones G--A . Adems, es posible variaciones en el genoma viral a travs de 138,139 recombinacin entre las dos molculas de ARN viral durante la sntesis de ADN. Se sabe que la variabilidad gentica del VIH-1 afecta ms a unos genes que a otros. Parece claro 140 que el gen env es el que presenta el mayor nmero de mutaciones . El anlisis bioqumico profundo ha demostrado que no slo se conservan ms los genes como gag o pol sino que los tipos de nucletidos y aminocidos de esas regiones son distintos a los encontrados en la 141 envoltura . En gag y pol la mayora de los cambios de las secuencias de nucletidos se deben a mutaciones puntuales mientras que en la envoltura existen agrupaciones de cambios que afectan a delecciones en tramas, inserciones y duplicaciones. En la envoltura es frecuente encontrar mutaciones de un solo nucletido que dan lugar a mutaciones no silentes. A pesar de esta extrema variabilidad del gen env del VIH-1, existen regiones muy conservadas que previsiblemente desempean importantes funciones biolgicas. Las 18 cistenas localizadas en la regin extracelular de la envoltura y la mayora de las localizadas en la gp41 estn conservadas en casi 142 todos los virus . Este hallazgo respalda la teora de que las cistenas son necesarias para mantener la envoltura con una configuracin estructural tridimensional adecuada. Existen tambin otras regiones muy conservadas, identificadas como C-1 a C-4, entremezcladas con regiones de hipervariabilidad (V1-V5) en la regin de la envoltura extracelular. Durante la infeccin crnica activa, la continua propagacin de altos niveles de virus lleva a muchos ciclos de replicacin y a la generacin de un enorme nmero de variantes. La seleccin de variantes antignicas y de mutantes resistentes a drogas es fcil en estas condiciones. Existen pruebas suficientes que indican que la variacin genotpica del VIH-1 in vivo es rpida y amplia, que numerosas variantes de formas viricas coexisten en el tiempo dentro del mismo enfermo y que los cultivos de VIH-1 consisten realmente en mezclas complejas de virus genotpicamente distintos aunque emparentados. Sin duda la diversidad genmica del VIH-1 es uno de los mayores obstculos actuales en la obtencin de terapias efectivas. VIH-2. El VIH-1 es el agente etiolgico del SIDA epidmico de Africa Central, Europa, USA y la mayora de los restantes pases. Las primeras pruebas de un segundo grupo importante de retrovirus asociados a la inmunodeficiencia humana adquirida se muestran en las publicaciones de Barin et 143-145 al . Investigaciones posteriores llevaron al aislamiento de un virus linftropo T humano

emparentado con el SIV, denominado actualmente como virus de la inmunodeficiencia humana-2 146-148 (VIH-2) y que se encuentra con mayor frecuencia en Africa Occidental. Antignicamente, el virus VIH-2 slo presenta reacciones cruzadas con el VIH-1 en la protena p24/p25 y de forma ligera con Pol mientras que guarda ms semejanzas con el SIV de macaco. Entre el SIV y VIH-2 existe una homologa en la secuencia de nucletidos de alrededor del 75% 149 mientras que entre VIH-2 y VIH-1 slo es del 40% . Como sucede con el VIH-1, el VIH-2 es un retrovirus, posee ARN como genoma, est limitado por secuencias LTR terminales redundantes y contiene los genes gag, pol y env. Existen 6 genes ms (tat, rev, nef, vif, vpr y vpx) estando todos relacionados con los del VIH-1 salvo el vpx que sustituye al vpu. La mayor similitud entre ambos subtipos es a nivel de las protenas del core (Gag, Pol) lo que explicara la reactividad cruzada entre ambos virus.. Tiene un ciclo biolgico similar al VIH-1 infectando de la misma forma a clulas que presenten CD4. A pesar de todo, ambos tipos causan sndromes clnicos similares. Es interesante sealar la existencia de algunas publicaciones en las que se muestran datos sobre la menor patogenicidad 147 de los grupos de virus VIH-2 .

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