IES SARDIEIRA ENSAYOS BIOTECNOLGICOS Noelia Deibe Prez Alba Gndara Crespo Paula Prez Morandeira LACC2 M1

Curso 2013/2014

Transformacin bacteriana pGLO

Imagen de las placas:
Luz Visible Luz UV

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Resultados obtenidos:
LB -pGLO LB con ampicilina LB con ampicilina +pGLO LB con ampicilina y arabinosa No aparece crecimiento No aparece crecimiento Crecimiento de una colonia blanca a la luz normal de la habitacin y verde bajo la luz ultravioleta (1 UFC) Crecimiento abundante de colonias amarillentas (>300 UFC)

Clculos:
Si se supone que cada colonia de la placa procede de una nica clula, la cual, tras mltiples y sucesivas reproducciones, origina la colonia bacteriana: N colonias (clulas) en placa LB con ampicilina y arabinosa = 1

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Sabiendo que la tasa de transformacin terica estimada para este proceso se sita entre 8x102 y 7x103 clulas transformadas/g ADN podemos concluir que la tasa de transformacin obtenida es mucho menor.

Conclusiones y observaciones:
Lo primero que comentaremos es que tras la observacin de la solucin plasmdica pGLO bajo la luz UV no se observa fluorescencia, lo que era de esperar teniendo en cuenta que dentro de ese tubo no ha tenido lugar ningn tipo de transformacin bacteriana. Por otro lado hablaremos de los resultados obtenidos en las placas: Para las placas 1 y 2, placas de control, los resultados obtenidos son los esperados puesto que, al no haber puesto solucin plasmdica pGLO en el tubo con E.coli del que se han sembrado ambas placas, lo normal es que en la primera en la que slo hay agar LB el E.coli pueda desarrollarse y crecer sin problemas mientras que, en la segunda, en la que al agar LB se le ha aadido el antibitico ampicilina, el E.coli no puede crecer al no haber desarrollado resistencia al mismo. Por otro lado, para las placa 3 y 4, a pesar de haber habido algo de crecimiento en la primera de ellas, lo normal sera que hubiesen crecido ms colonias en ambas las dos, puesto que las mismas se han sembrado a partir de un tubo con E.coli en el que se haba puesto solucin plasmdica pGLO. Dicha solucin contiene un gen para la sntesis de la protena verde fluorescente (GFP, por sus siglas en ingls, green fluorescent protein), que se puede activar en las clulas transformadas aadiendo al medio de cultivo arabinosa de modo que las bacterias transformadas se expresan de color blanco a la luz normal de la habitacin y de color verde fluorescente bajo la luz ultravioleta; y otro gen para la produccin de betalactamasas, las cuales inactivan la ampicilina presente en el agar LB, lo que
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hace que las bacterias portadoras de este gen sean resistentes a dicho antibitico de modo que pueden crecer sin problemas. Es importante tener en cuenta que slo un reducido porcentaje de clulas captan el plsmido pGLO y que las que no se transforman o no expresan las betalactamasas no pueden crecer en presencia de ampicilina. As, y teniendo en cuenta todos estos datos, lo normal sera que en la placa 3 hubieran crecido ms colonias de apariencia blanca al ser observadas bajo luz normal y de color verde fluorescente bajo luz ultravioleta mientras que, en la placa 4 deberan haber crecido colonias de apariencia blanca al ser observadas bajo luz normal pero, como se puede observar en las imgenes adjuntas ms arriba, es evidente que esto no ha sido as por lo que pasaremos a analizar los factores que pueden causar problemas en el proceso: Etapa de transferencia de colonias bacterianas de las placas a los tubos: Hay que evitar coger ms clulas de las necesarias por lo que ser suficiente con pinchar una nica colonia de la placa con E.coli ya que en la misma habr millones de clulas. Hemos descartado este factor al asegurarnos de pinchar una sola colonia. Etapa de transferencia del ADN: Es muy importante asegurarse de que el asa de siembra se ha cargado bien con la solucin plasmdica pGLO antes de introducirla en el tubo con solucin de transformacin y E.coli. Si este paso non se lleva a cabo cuidadosamente es posible que no se transfiera la cantidad suficiente de pGLO para que se puedan producir las transformaciones bacterianas necesarias para que la bacteria sea capaz de crecer en presencia de ampicilina. Este factor se ha descartado asimismo ya que nos hemos fijado en que el asa de siembra llevaba la carga suficiente antes de introducirla en el tubo marcado como +pGLO. Etapa de choque trmico: Esta etapa tiene como finalidad favorecer la captacin de ADN extrao (pGLO) por parte del E.coli al aumentar la permeabilidad de su membrana celular al mismo y consiste en llevar a cabo dos cambios bruscos y rpidos de temperatura, el primero de ellos desde un recipiente con hielo hasta un bao con agua a 45C y el segundo desde el bao hasta el hielo otra vez. Los dos puntos clave de esta etapa son que, como ya se ha dicho, los cambios de temperatura sean bruscos y el respeto de los tiempos indicados, ya que la duracin del choque es crtica para el proceso. Si esta etapa se hace mal, el crecimiento bacteriano obtenido se reduce sensiblemente al mermarse las transformaciones producidas.
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Etapa de agitacin de los tubos previa a la siembra: Es muy importante agitar bien los tubos antes de sembrar las placas puesto que las clulas estarn depositadas en el fondo de los mismos tras la etapa de reposo previa de modo que, si no se agitan, las clulas no se transferirn a las placas y, por lo tanto, no se producir crecimiento alguno. Este factor tambin se ha descartado al asegurarnos de agitar los tubos antes de la siembra.

As, la causa ms probable de que no se haya producido el crecimiento esperado en las placas 3 y 4 parece ser que haya habido problemas con la etapa del choque trmico, aunque tampoco debemos olvidarnos de la tan importante etapa de siembra como fuente de problemas ya que si esta no se lleva a cabo correctamente, el crecimiento en las placas se ve mermado llegando incluso a ser inexistente, por lo que hemos de prestar especial atencin en cargar bien el asa de siembra y en distribuir las clulas uniformemente por todo el medio de cultivo. Diremos por ltimo que estas seran tambin las causas de que la tasa de transformacin obtenida en el apartado anterior sea mucho menor que la esperada.

Fuentes de informacin:
Manual: Kit de transformacin bacteriana con pGLO. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lse/literature/4006097ES.pdf http://www.bio-rad.com/LifeScience/pdf/Bulletin_9563.pdf

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Video procedimiento:

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