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PCR - Amplificao de DNA in vitro (Biologia) | e-escola

e-escola PCR - Amplificao de DNA in vitro Bsico

Publicado em 24/11/2005

Fundamentos da Tcnica de PCR

Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao servio da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califrnia, recebeu o prmio Nobel da Qumica pelo desenvolvimento de um mtodo que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta tcnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a reas como o diagnstico de doenas, medicina forense entre muitas outras para alm da Investigao em Biologia. A tcnica de PCR (polymerase chain reaction - reaco em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicao de DNA que ocorre in vivo . Durante o PCR so usadas elevadas temperaturas de forma a separar as molculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo ento a ligao de oligonucletidos iniciadores (primers), tambm em cadeia simples e geralmente constitudos por 15 a 30 nucletidos, obtidos por sntese qumica. Para amplificar uma determinada regio so necessrios dois iniciadores complementares das sequncias que flanqueiam o fragmento de DNA a amplificar, nos seus terminais 3', de modo a permitir a actuao da DNA polimerase durante a sntese da cadeia complementar, usando como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do DNA a amplificar (figura 1).

Para realizar PCR so necessrias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampo salino contendo a polimerase, oligonucletidos iniciadores, os quatro desoxinucletidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura submetida a vrios ciclos de amplificao que consistem em: Desnaturao do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96C), de modo a separar as duas cadeias Associao dos iniciadores por ligaes de hidrognio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associao, a mistura de reaco arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65C, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequncia a amplificar) Extenso dos iniciadores atravs da sntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72C) O processo envolvendo estes trs passos, pode ser repetido vrias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possvel aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentrao de DNA pr-existente (figura 2). Em teoria, se for possvel levar a cabo 25 ciclos de amplificao seguidos, a concentrao de DNA aumentaria 225 vezes embora, na prtica, devido a alguma ineficincia no processo de amplificao, esse aumento fique por um milho de vezes.

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Como na tcnica de PCR se encontram envolvidos vrios ciclos de amplificao, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contnua e automatizada, os vrios ciclos de aquecimento e arrefecimento. Para tal ser concretizvel, as DNA polimerases utilizadas devero ser termoestveis, tendo tal sido conseguido com o isolamento da DNA polimerase da estirpe termoflica Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) que actua a temperaturas elevadas levando assim a um aumento da especificidade da reaco. De referir ainda que o produto de PCR pode ser visualizado aps electroforese em gel de agarose e o seu tamanho ser estimado por comparao com padres lineares de DNA.

Autor e Crditos Autor: Grupo de Cincias Biolgicas do IST

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