UNIVERSIDAD SIMON BOLIVAR FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGA LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA APLICADA M EN C KARINA SANCHEZ ARANDA Nombre: Mariana Delgado

Domnguez Carrera: BQC 1.- Defina que es un microorganismo indicador y d tres ejemplos de ellos y en que productos son empleados. La deteccin en el laboratorio de microorganismos patgenos puede ser complicada, lenta y/o muy costosa cuando se encuentra un microorganismo patgeno, pero puede haber casos en que no se detecte por razones circunstanciales como el clima o la cantidad de individuos infectados que estn contaminando, Por esas razones, las normas en materia de alimentos, generalmente establecen la calidad microbiolgica en trminos de microorganismos indicadores. stos son organismos (o grupos) que advierten oportunamente de un manejo inadecuado o contaminacin que incrementan el riesgo de presencia de microorganismos patgenos en alimentos. Adems de que su deteccin en el laboratorio es ms sencilla, rpida y/o econmica, los microorganismos indicadores permiten un enfoque de prevencin de riesgos, puesto que advierten manejo inadecuado y/o contaminacin. 2.- Investigue los componentes y fundamentos de los siguiente medios de aislamiento primario as como el tipo de muestra para los que son empleados. Agar bismuto, es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de Salmonella typhi y otros bacilos entricos. Fundamento: el verde brillante y el bismuto sulfito inhiben considerablemente los grmenes de acompaamiento. El sulfato de hierro III es un indicador de sulfuro de hidrgeno que producen las colonias de Salmonella H2S-positivas. Habitualmente esta reaccin produce una precipitacin marrn o negra en el medio de cultivo as como colonias de color negro o verde con brillo metlico. Composicin Extracto de carne 5,0 g Digerido pancretico de casena 5,0 g Digerido pptico de tejido animal 5,0 g Dextrosa 5,0 g Fosfato de sodio 4,0 g Sulfato ferroso 300,0 mg Indicador de sulfito de bismuto 8,0 g Agar 20,0 g

Verde brillante 25,0 mg Agua destilada 1.000 mL pH final 7,6 0,2lfito Agar Hektoen, es un medio ideal para el aislamiento selectivo de

Salmonella y Shigella spp., a partir de heces y alimentos.

Fundamento El medio de cultivo contiene sales biliares que inhiben el desarrollo de la flora acompaante, y 2 sistemas indicadores: (i) azul de bromotimol y fucsina cida como indicadores de la fermentacin de carbohidratos, y (ii) el citrato de hierro como un indicador de la formacin de SH2 a partir del tiosulfato. El desarrollo de Shigella spp. es adecuado debido a que la inhibicin de estos microorganismos por las sales biliares est disminuida por la adicin de cantidades relativamente elevadas de peptona y carbohidratos. El medio de cultivo, permite una buena diferenciacin de las colonias e inhibe el desarrollo de algunos coliformes y otras bacterias no fermentadoras de lactosa, facilitando as la identificacin de Salmonella y Shigella a partir de la muestra. Frmula (en gramos por litro) Proteosa peptona Extracto de levadura Sales biliares Lactosa Sacarosa Salicina Cloruro de sodio Tiosulfato de sodio Citrato de hierro y amonio Agar Azul de bromotimol 12.0 3.0 9.0 12.0 12.0 2.0 5.0 5.0 1.5 14.0 0.065 Suspender 76 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar reposar de 10 a 15 minutos. Calentar y hervir hasta lograr una disolucin completa. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45C y distribuir en cajas de Petri. Instrucciones

Fucsina cida Microorganismos

0.1 pH final: 7.5 0.2 Colonias Verdes, elevadas, hmedas Verde-azuladas, con o sin centro negro Verde-azuladas, con o sin centro negro biliar

Shigella flexneri ATCC 12022 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Proteus mirabilis ATCC 43071 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC

Rosa salmn rodeadas en algunas ocasiones por un precipitad

Rosa salmn rodeadas en algunas ocasiones por un precipitad

700603 biliar Agar tergitol 7, es un medio selectivo y diferencial para aislamiento de microorganismos coliformes y otros bacilos entricos a partir de diversas muestras. Fundamento: El tergitol 7 (heptadecilsulfato de sodio) acta inhibiendo la flora secundaria indeseable, inhibe la difusin de swarming de Proteus y favorece una mayor recuperacin de coliformes. Los microorganismos capaces de fermentar la lactosa en el medio producen colonias amarillas debido a la reaccin con el indicador azul de bromotimol y los que no son capaces de fermentarla producen colonias azules. En algunas ocasiones se agrega 2,3,5- Clorhidrato de TrifenilTetrazolio para reconocimiento e identificacin de Escherichia coli y

Enterobacter aerogenes.

Composicin Agar 15.0 Lactosa 10.0 Azul de bromotimol 0.025 Peptona especial 5.0 Extracto de levadura 3.0 Tergitol 7 0.1 pH 6.9 0.2

3.-Desarrolle una metodologa fundamental para la determinacin de Listeria monocytogenes en queso y cul es la relevancia para hacer dicha determinacin. La relevancia para dicha determinacin se realiza porque listeria ha sido transformada de un microorganismo desconocido a un patgeno plenamente reconocido relacionado con alimentos, se a detectado brote de listeriosis asociado al queso, lo que ha conducido investigaciones para obtener una serie de conocimientos poniendo en relieve a necesidad de resolver muchas preguntas criticas, en relacin con el procesamiento de alimentos, haciendo una evaluacin en la sobrevivencia del patgeno sometido a tratamientos con calor usaos en la industria alimentaria, obtener informacin respecto a la relacin con la salud y desarrollo de metodologas para identificarlo. Tomar una muestra representativa del alimento, tanto de la superficie externa como del interior. Colocar 25 ml o 25 g de la muestra en un recipiente conteniendo 225 ml de medio de enriquecimiento (EB), homogeneizar e incubar por 48 h a 30 En el caso de muestras en donde se sospecha que tienen clulas de Listeria spp daadas, se recomienda la incubacin en un caldo de enriquecimiento que contenga piruvato de sodio al 0,1 % (p/v) incubado a 30 por 6 h sin suplementos. Despus de las 6 h de incubacin los suplementos deben agregarse y continuar la incubacin a 30 hasta un total de 48 h. Aislamiento Despus de 24 y 48 h de incubacin en el medio EB, resembrar en los medios LMP y OXA. Incubar las placas del medio LMP a 30 ;C por 24 a 48 h y las de medio OXA a 35 por el mismo periodo. Observar el crecimiento en las placas del medio LMP con luz blanca en un ngulo de 45 (iluminacin de Henry), a simple vista o con la ayuda de una lupa. En este medio generalmente aparecen las colonias de color blanco o azul iridiscentes. En el medio OXA las colonias de Listeria son negras, con halo negro. Algunas colonias pueden aparecer con un tono caf oscuro que se define mejor a los siete das de incubacin. Seleccionar cinco o ms colonias tpicas del medio de OXA o LMP y pasar a placas de medio ASTEL. Este paso es importante debido a que las colonias aparentemente aisladas en los medios OXA y LMP

pueden estar contaminadas con flora competitiva parcialmente inhibida, invisible a simple vista. Debido a que puede estar presente ms de una especie de Listeria en la muestra, deben identificarse como mnimo cinco colonias. Identificacin Se deben utilizar cepas de referencia positivas y negativas para cada una de las pruebas. Seleccionar colonias tpicas y sembrar en medio ASTEL. Incubar a 35 por 24 h. Estos cultivos pueden mantenerse a 4 y utilizarse como inculo para realizar las pruebas de identificacin. Prueba de movilidad en fresco Hacer preparaciones en fresco (en gota suspendida o entre porta y cubreobjetos) utilizando solucin salina al 0,85%. La suspensin debe ser densa y emulsificarse completamente, y observar con objetivo de inmersin en un microscopio de contraste de fase o microscopio de campo oscuro. Las clulas de Listeria spp son bacilos cortos con movilidad rotatoria o como si brincaran. Los bacilos con movimientos rpidos no son Listeria spp.

Prueba de catalasa Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solucin de perxido al 3%. La formacin inmediata de burbujas indica que la prueba es positiva. Las especies de Listeria son catalasa positivo.

Tincin de Gram Hacer una tincin de Gram de cultivos de 16 a 24 h. Todas las especies de Listeria son bacilos cortos Grampositivo; sin embargo en cultivos viejos pueden presentarse como formas cocoides. En extensiones delgadas se observan de color plido y pueden confundirse con Bacteroides spp. Prueba de hemlisis

Dibujar una cuadrcula de 20 a 25 espacios en el fondo de la placa de agar sangre de carnero al 5%. Inocular por picadura un cuadro por cada cultivo. Incubar por 48 h a 35 Al inocular, observar la reaccin hemoltica en las placas. L. monocytogenes y L. seeligeri producen una zona ligeramente clara alrededor del punto de picadura. Confirmar las reacciones dudosas con la prueba de CAMP.

Prueba de reduccin de nitratos Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35 por 5 das. Para la lectura se debe agregar 0,2 ml del reactivo A y 0,2 ml del reactivo B, un color rojo indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloracin no se observa, adicionar zinc en polvo. El desarrollo de color rojo despus de una hora confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). En forma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 0,2 ml del reactivo B y 0,2 ml del reactivo C. Un color naranja indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloracin no se observa, adicionar 0,2 ml del reactivo de cadmio, el desarrollo de un color naranja confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). Este procedimiento alternativo elimina el uso del alfa naftilamina, que es carcinognica.

Prueba de movilidad en agar Inocular el medio SIM o MTM, incubar por 7 das a temperatura ambiente (20-25 ), observar diariamente. Las especies de Listeria son mviles, dando un crecimiento tpico en forma de paraguas. Prueba de utilizacin de carbohidratos Inocular tubos de caldo prpura para fermentacin de carbohidratos al 0,5 %: dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa. Incubar 7 das a 35. Una coloracin amarilla indica una prueba positiva. Todas las

especies de Listeria dan positivas las pruebas para dextrosa, esculina y maltosa. Consultar el cuadro 1 para reacciones con ramnosa, xilosa y manitol. Si la pigmentacin prematura del aislamiento en el medio OXA no deja lugar a duda, el ensayo de esculina puede omitirse. 4.- Defina que es una endotoxina y ejemplifique 5 microorganismos productores de dichas sustancias y como se clasifican. Bacterias GRAM negativas que producen Lipopolisacridos como parte de la capa externa de sus paredes celulares, y estos, en muchas condiciones producen son txicos y estas sustancias se denominan endotoxinas, debido a que generalmente estn unidas a las clulas y se liberan en grandes cantidades slo cuando se lisa.

Salmonella typhi (fiebre tifoidea)- Bacilos aerobios facultativos GRAMProteus spp. (infecciones urinarias)-Bacilos aerobios facultativos GRAMEscherichia (diarrea)- Bacilos aeorobios facultativos GRAMNeisseria meningitidis (meningitis meningoccica)- Coco aeorobio
GRAM

Pseudomonas-bacilos aerobios GRAM5.- Cules son las reacciones alterativas ms frecuentes en alimentos? 6.- Determine cules son los microorganismos alterantes de la leche as como la evaluacin de la calidad de la misma segn la norma que le corresponda.

Streptococcus lactis es el principal productor de agrio de la leche cruda

a temperatura entre 10 y 37C, con posibilidad de que existe tambin algn crecimiento de bacterias coliformes, enterococos, lactobacilos y micrococos. A temperaturas ms elevadas, entre 37 y 50C, S.

thermophilus y Sfaecalis pueden originar al rededor del 1 % de cido

lctico y seguidamente los lactobacilos, como Lactobacillus bulgaricus, dara lugar a ms acidez. Ciertos lactobacilus son capaces de multiplicarse a temperaturas por encima de 50C, pero producen menor cantidad de cido. Algunas bacterias termffilas, como L . thermophilus creceran incluso a temperaturas ms altas. La pasteurizacin destruye la mayor parte de las bacterias ms activas en la produccin de cido, pero sobreviven las lcticas termorresistentes (por ejemplo, los enterococos,

Streptococcus

thermophilus

lactobacilos, que darn lugar a fermentacin cida, durante la ulterior

conservacin de la leche, si la temperatura es suficientemente alta. Las bacterias coliformes originan pequeas cantidades de cido lctico y considerables de productos voltiles, tales como el hidrgeno, dixido de carbono, cidos acticos, frmico, alcohol, etc. Algunas especies de

Micrococcus, Microbacterium y Bacillus pueden producir cido en la

leche, principalmente lctico, pero en condiciones normales, no son capaces de competir con las bacterias lcticas. Diversas especies del gnero Clostridium producen cido butrico en condiciones que impiden o inhiben la formacin normal de cido lctico. La leche, sometida a un tratamiento trmico capaz de destruir todas las formas vegetativas bacterianas pero no las esporas de Clostridium, puede sufrir la fermentacin butrica con formacin de hidrgeno de dixido de carbono.
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-243-SSA1-2010. PRODUCTOS Y SERVICIOS. LECHE, FORMULA LACTEA, PRODUCTO LACTEO COMBINADO Y DERIVADOS LACTEOS. DISPOSICIONES Y ESPECIFICACIONES SANITARIAS.

7.- Actualmente el uso de microorganismos es altamente difundido para el mejoramiento de diversos productos. Elija algn campo de su inters y explique en forma breve como es que se realiza y emita su opinin al respecto. Las bacterias del cido lctico constituyen un amplio conjunto de microorganismos benignos que, a partir de azcares (lactosa en el caso de la leche), crean cido lctico como producto final del proceso de la fermentacin. Las bacterias cido lcticas se han empleado para fermentar alimentos desde tiempos remotos. Su uso ms corriente son los productos lcteos fermentados, como el yogur, el queso o la mantequilla, pero tambin otros menos conocidos como el kfir o el extico kumis. El hecho de que cuando fermentan creen un cido, hace que el producto resultante no sea adecuado para el desarrollo de la mayora de otros microorganismos. De ah que, adems de producirse un nuevo alimento de caractersticas diferentes, se crea un medio de conservacin de alimentos tan vulnerables como la leche. En mi opinin es de los microorganismos ms utilizados ya que el campo de los productos lcteos es de los ms consumidos y de los que tienen ms variedad y uso de microorganismos que con esto se

preservan ms tiempo y se mantienen en buen estado permitiendo que su composicin y sabor se conserven mejor. 8.-Clostridium perfringens es de suma importancia en la industria alimenticia Explique por qu? es una de las causas ms comunes de intoxicacin
alimentaria en Estados Unidos. Segn algunos clculos, este tipo de bacteria causa cerca de un milln de enfermedades por ao. La coccin mata las clulas de C. perfringensque se estn cultivando y que causan intoxicacin alimentaria, pero no mata necesariamente las esporas que se pueden convertir en clulas nuevas. Si los alimentos cocidos no se sirven o se refrigeran de inmediato, las esporas pueden crecer y producir clulas nuevas. Estas bacterias proliferan entre los 40-140 F. Esto significa que crecen rpidamente a temperatura ambiente, pero no pueden crecer en la temperatura del refrigerador o del congelador. Las infecciones de C. perfringens con frecuencia suceden cuando se preparan alimentos en grandes cantidades y luego se mantienen calientes durante un largo tiempo antes de servirlos. Por eso los brotes de estas infecciones por lo general estn relacionados con instituciones (como hospitales, cafeteras de escuelas, prisiones y residencias de ancianos) o eventos Fuentes Carne de res

Carne de aves Jugos de las carnes

Perodo de incubacin Sntomas

de 6 a 24 horas

Diarrea y calambres abdominales (sin fiebre ni vmitos) Duracin de la enfermedad Quines estn en riesgo? 24 horas o menos En casos graves, los sntomas pueden durar entre 1 y 2 semanas.

Adultos mayores Bebs y nios pequeos

Qu debo hacer? Cmo prevengo la enfermedad?

Beba abundante lquido y descanse. Si no puede beber suficiente lquido para prevenir la deshidratacin, llame a su mdico.

Cocine bien los alimentos, sobre todo la carne de res, la carne de aves y el jugo de la carne, a una temperatura interna segura. Utilice un termmetro para alimentos Mantenga caliente los alimentos despus de cocinar (a 140 F o ms) Caliente bien la comida recalentada en el microondas (a 165 F o ms) Refrigere los alimentos perecederos dentro de las dos

horas (a 40 F o menos)

Divida las sobras, colquelas en recipientes poco profundos y refrigere de inmediato. No deje que se enfren en la encimera.

9.- Realice un ensayo con sus propias palabras sobre el tema: Calidad Sanitaria y Aseguramiento higinico sanitario.

10.- Determine el plan de muestreo para Salmonella. Aislamiento de Salmonella Cerrar firmemente el tapn de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitucin del caldo tetrationato puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport. Incubar de 18 a 24 h a 35 o, para alimentos fuertemente contaminados a 42 por el mismo periodo. Estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos. Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entrico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato. Incubar las placas ; 2 h a 35 . Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella, de acuerdo con las siguientes caractersticas: Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.

Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. Agar entrico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras. Agar Sulfito de Bismuto: las colonias tpicas de Salmonella pueden ser cafs, grises o negras; con o sin brillo metlico. Generalmente el medio circundante (halo) es caf, tornndose posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formacin del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias tpicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales. Agar SS: colonias translcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas

11.-Seale con una x los grupos microbianos que se deben determinar en el anlisis
de los siguientes productos. Salmonella Leche en polvo Pescado Mantequilla Harinas Queso madurado Mesoflicos aerobios Coliformes Enterococos Hongos S. aureus o su toxina

Referencias Ashbolt, N.J., W.O.K. Grabow and M. Snozzi (2001). Indicators of microbial wter quality. In Fewtrell, L. and Bartram, J. (ed.), Water Quality: Guidelines, Standards and Health. Risk assessment and management for water-related infectious disease. IWA Publishing, London. Disponible a travs de Internet en: www.who.int/entity/water_sanitation_health/dwq/iwachap13.pdf 19

Koburger J. & Martha E. (1984) Yeasts and Molds. In: Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 2nd ed. Marvin S. (Ed.) APHA. USA. 197-199. Pierson M. & Smoot L. (2001) Indicator Microorganisms and Microbiological Criteria. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 71-87. Secretara de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Norma Oficial Mexicana. Mxico. Secretara de Salud. NOM-092-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para la cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. Norma Oficial Mexicana. Mxico. Stevens, M., N. Ashbolt & D. Cunliffe. 2003. Recommendations to change the use of coliforms as Microbial indicators of drinking water quality. Department of Human Services, South Australia. Disponible a travs de Internet en: http://www.nhmrc.gov.au/publications/synopses/_files/eh32.pdf NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-143-SSA1-1995, BIENES Y SERVICIOS. METODO DE PRUEBA MICROBIOLOGICO PARA ALIMENTOS. DETERMINACION DE LISTERIA MONOCYTOGENES. Disponible a travs de Internet en: http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/143ssa15.html