Anda di halaman 1dari 12

Penentuan Potensi Antibiotika (Kloramfenikol) Uji Potensi Tiga Dosis

I. TUJUAN

Menentukan besarnya potensi sampel antibiotika kloramfenikol di pasaran terhadap antibiotika standar.

II. 1.

PRINSIP Membandingkan respon yaitu derajat hambatan pertumbuhan dari jasad renik yang peka dan sesuai dalam kondisi pertumbuhan yang sama dari dosis sediaan yang diperiksa (control) terhadap dosis sediaan baku.

2.

Metode lempeng silinder atau metode difusi, dimana zat yang diperiksa akan berdifusi dari reservoir ke dalam media agaryang telah diinokulasikan dengan bakteri, diameter zona bening diukur dan dibandingkan dengan larutan standar baku.

3. Pengenceran bertingkat Memperoleh konsentrasi yang lebih kecil dengan cara menambahkan pelarutnya. V1.M1 = V2.M2

III.

TEORI Antibiotika adalah zat-zat yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri , yang

memiliki khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan kuman. Turunan zat tersebut yang dibuat secara semisintetik, termasuk dalam kelompok ini, begitu pula senyawa sintesis dengan khasiat antibakteri lazimnya disebut antibiotika (Tjay & Rahardja, 2002). Antibiotik memiliki cara kerja sebagai bakterisidal (membunuh bakteri secara langsung) atau bakteriostatik (menghambat pertumbuhan bakteri). Pada kondisi bakteriostasis, mekanisme pertahanan tubuh inang seperti fagositosis dan produksi antibodi biasanya akan merusak mikroorganisme. Ada beberapa cara kerja

antibiotik terhadap bakteri sebagai targetnya, yaitu menghambat sintesis dinding sel, menghambat sintesis protein, merusak membran plasma, menghambat sintesis asam nukleat, dan menghambat sintesis metabolit esensial (Naim, 2003). Lazimnya antibiotika dibuat secara mikrobiologi, yaitu fungi yang dibiakkan dalam tangki-tangki besar bersama zat-zat gizi khusus. Oksigen atau udara steril disalurkan ke dalam cairan pembiakan guna mempercepat pertumbuhan fungi dan meningkatkan produksi antibiotikumnya. Setelah diisolasi, antibiotikum

dimurnikan dan aktivitasnya ditentukan. Cara pembuatan antibiotika dibedakan menjadi dua: a. Antibiotika semisintesis, yaitu apabila ada persemaian dibubuhi zat-zat

pelopor tertentu, maka zat-zat ini diinkoperasi ke dalam antibiotikum dasarnya, misalnya Penisilin-V. b. Antibiotika sintesis, yaitu dibuat dengan sintesa kimiawi, bukan lagi dengan

jalan biosintesis, contohnya kloramfenikol Beberapa antibiotika bekerja pada dinding sel atau membran sel. Namun antibiotika tidak aktif terhadap kebanyakan virus kecil, mungkin karena virus tidak memiliki proses metabolisme sesungguhnya, tetapi seluruhnya tergantung pada proses tuan rumah ( Tjay & Rahardja, 2002). Suatu zat antimikroba yang ideal memiliki toksisitas selektif. Istilah ini berarti bahwa suatu obat berbahaya bagi parasit, tetapi tidak membahayakan inang. Seringkali, toksisitas selektif lebih bersifat relative dan bukan absolut; ini berarti bahwa suatu obat yang pada konsentrasi tertentu dapt ditoleransi oleh inang, dapat merusak parasit (Jawetz, et. al., 1987). Toksisitas selektif dapat berupa fungsi dari suatu reseptor khusus yang dibutuhkan untuk pelekatan obat, atau dapat bergantung pada penghambatan proses biokimia yang penting untuk parasit, tetapi tidak untuk inang. Mekanisme kerja sebagian besar obat antimikroba belum dimengerti secara jelas. Namun, untuk mudahnya dapat dibagi menjadi empat cara: 1. Penghambatan sintesis dinding sel. 2. Penghambatan fungsi selaput sel.

3. Penghambatan sintesis protein (yaitu hambatan translasi dan transkripsi bahan genetik). 4. Penghambatan sintesis asam nukleat (Jawetz et. al., 1987). Pada keadaan awal kekuatan antibiotik bisa ditentukan karena kadarnya ekuivalen dengan konsentrasinya. Tetapi uji yang paling tepat adalah uji secara mikrobiologi untuk mengetahui efeknya secara langsung terhadap mikroba (in vitro) dan berapa MIC-nya. Bila diuji secara in vitro perlu dilihat waktu pemberian obat sehingga didapatkan potensi maksimumnya yang mempunyai daya kerja yang optimal jangan sampai pada pemberian berikutnya diberikan pada saat konsentrasi obat dalam darah habis., karena itu konsentrasi obat dalam darah diusahakan selalu tetap stabil dengan menggunakan aturan pakai obat antibiotik. Farmakope menentukan potensi antibiotik standar antara 85 %-105 %. Potensi suatu antibiotik lama-lama dapat menurun, hal ini disebabkan oleh: 1.Waktu kadaluwarsa telah dicapai 2.Penyimpanan yangtidak baik 3.Terjadi penguraian obat yang menghasilkan zat lain sehingga tidak memiliki efek lagi. Ada dua cara yang diguakan dalam penetapan potensi antibiotik, yaitu: 1.Cara Lempeng/Difusi Zat yang diperiksa berdifusi dari resevoir ke dalam media agar yang telah diinokulasi dengan bakteri setelah itu diinkubasi, hambatan pertumbuhan mikroba diukur dan dibandingkan dengan baku. 2.Cara Turbidimetri Menggunakan media cair, kekeruhan disebabkan oleh pertumbuhan bakteri diukur dengan menggunakan instrumen yang cocok yaitu spektofotometer atau neferometer (Melnick & Aldelberg, 1996). Rifampisin merupakan antibiotik semisintetik derivat dari Rivamycin SV yang ditemukan pada tahun 1957. Rivamycin SV ini diisolasi dari Streptomyces

mediteranei dan menunjukkan efek antituberkulosis dan antikusta. Opramolla pada tahun 1963 menggunakan Rivamycin SV secara parenteral. Rifampisin dapat mengurangi efektifitas beberapa obat bila diberikan bersama-sama, obat-obat ini adalah : antikoagulan oral, antidiabetik oral, dan kontrasepsi oral. Bilamana diberikan bersama PAS, maka obat ini dapat mempertambah absorpsi Rifampisin dan karenanya harus diselang 4-8 jam dalam pemakaian kedua obat tersebut. Pemakaian bersama-sama dengan Isoniazid dapat menambah resiko gangguan fungsi hati. Rifampisin mengandung tidak kurang dari 95,0 % dan tidak lebih dari 103,0 % C43H58N4O12 per mg, dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan, rifampisin memiliki berat molekul 822,95. Rifampisin memiliki serbuk hablur berwarna coklat merah. Rifampisin sangat sukar larut dalam air; mudah larut dalam kloroform; larut dalam etil asetat dan dalam methanol. Rifampisin merupakan salah satu obat yang banyak digunakan sebagai anti-tuberkulosis (TBC) yang sangat sukar larut dalam air, sehingga absorbsinya kurang baik (Melnick & Aldelberg, 1996).

Escherichia coli Bakteri Escheria Coli merupakan kuman dari kelompok gram negatif, berbentuk batang dari pendek sampai kokus, saling terlepas antara satu dengan yang lainnya tetapi ada juga yang bergandeng dua-dua (diplobasil) dan ada juga yang bergandeng seperti rantai pendek, tidak membentuk spora maupun kapsula, berdiameter 1,1 1,5 x 2,0 6,0 m, dapat bertahan hidup di medium sederhana dan memfermentasikan laktosa menghasilkan asam. Media Nutrient Agar Penyiapan media pertumbuhan mikroorganisme harus mengandung nutrisi yang dibutuhkan bakteri supaya dapat tumbuh membentuk koloni dan harus steril sehingga tidak ada kontaminan dari lingkungan. Media pertumbuhan dasar untuk

bakteri adalah Nutrient Broth (NB), Nutrient Agar (NA), Tryptic Soy Broth (TSB), dan Tryptic Soy Agar (TSA) ( Anonymous, 2007). Medium padat biasanya digunakan untuk mengamati penampilan atau morfologi koloni dan mengisolasi biakan murni. Untuk membuat medium padat, dapat ditambahkan agar-agar, gelatin, atau gel silika ke dalam medium kaldu. Agaragar menjadi larut atau cair bila dipanaskan pada suhu hampir 1000 C dan tetap berbentuk cair bila didinginkan sampai kurang lebih 430 C. Hal ini berbeda dengan gelatin, sekali menjadi padat maka tidak dapat dicairkan lagi. Oleh karena itu yang paling umum digunakan adalah agar-agar namun tidak dianjurkan untuk mencairkan kembali medium padat agar lebih dari dua kali karena dapat memberikan hasil yang kurang baik (Anonymous, 2007).

IV. Alat:

ALAT DAN BAHAN

1. Cawan petri. 2. Corong saring. 3. Inkubator. 4. Jangka sorong. 5. Labu ukur 100 mL dan 25 mL. 6. Mikropipet. 7. Mortir dan stamper.

8. Pembakar spiritus. 9. Perforator. 10. Pinset. 11. Rak tabung. 12. Spatel. 13. Tabung reaksi.

Bahan : 1. Aquadest steril. 2. Larutan desinfektan. 3. Media nutrient agar. 4. Metanol. 5. Sediaan antibiotika kloramfenikol standar dan sampel kloramfenikol. 6. Suspensi bakteri Escherichia coli.

V.

PROSEDUR Pertama-tama disiapkan suspensi bakteri dalam Nutrien Broth yang berumur

18-24 jam, bakteri ini harus homogen. Setelah itu disiapkan perbenihan nutrient agar dengan cara melarutkan sejumlah tertentu nutrient agar dalam aquadest kemudian disterilkan dalam otoklaf selama 15 menit pada 121oC selama 15 menit. Sediaan uji digerus dulu dalam mortar, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur dan dilarutkan sedikit dengan pelarutnya, lalu ditambahkan air suling sampai tanda batas. Kemudian dibuat pengenceran bertingkat untuk tiga seri dosis yaitu 12,5 g/mL, 25 g/mL, dan 50 g/mL. Setelah itu dibuat larutan inokulum dengan cara memasukkan suspensi biakan bakteri ke dalam NA yang telah disterilisasi. Dalam keadaan masih cair, NA yang telah disterilisasi dituangkan ke dalam cawan Petri

sebanyak 20 mL dan dibiarkan sampai membeku. Permukaan dasar cawan Petri dibagi menjadi 6 bagian sama besar dan diberi label tergantung variasi seri dosis yang diberikan. Kemudian dibuat 6 cetakan reservoir pada masing-masing cawan Petri dengan menggunakan perforator secara aseptis. Agar yang ada dalam cetakan reservoir dibuang dengan menggunakan spatel, dan hasil buangan dimasukkan ke dalam desinfektan. Larutan sampel dan baku dimasukkan ke dalam reservoir sebanyak 50 g/mL dengan menggunakan mikropipet secara aseptis. Cawan Petri diinkubasikan pada suhu 370C selama 18-24 jam, kemudian diukur dan dicatat diameter daerah bening/zona lisis yang terjadi di sekeliling reservoir yang telah mengandung antibiotika tersebut dengan menggunakan jangka sorong, dan dihitung potensi antibiotiknya.

VI.

DATA PENGAMATAN DAN PERHITUNGAN Data hasil pengamatan - Tabel pengamatan. Cawan 1 2 Jumlah Baku (cm) BT 1,86 1,81 3,67 1,835 BM 1,78 1,63 3,41 1,705 BR 1,24 1,29 2.53 1,265 ST 1,71 1,74 3,45 1,725 Sampel (cm) SM 1,62 1,6 3,22 1,61 SR 1,04 1,22 2,26 1,13

Rata-rata

Keterangan: BT BM BR : Baku dengan dosis tinggi. : Baku dengan dosis sedang. : Baku dengan dosis rendah. ST SM SR : Sampel dengan dosis tinggi. : Sampel dengan dosis sedang. : Sampel dengan dosis rendah.

Perhitungan Pengenceran antibiotika.

KonsentrasiKloramfenikol = 2500 g/mL

Dosis Tinggi 10 g/mL x 20 = 200 g/mL M1.V1 = M2.V2 2500 g/mL . 1 = 200 g/mL . X V1 = 12,5 mL Volume antibiotik = 1 mL Volume aquadest yang ditambahkan = 11,5 mL

Dosis Menengah 5 g/mL x 20 = 100 g/mL M1.V1 = M2.V2 200 g/mL . 1 = 100 g/mL . X V1 = 2 ml Volume antibiotik = 1 mL Volume aquadest yang ditambahkan = 1 mL

Dosis Rendah 2,5 g/mL x 20 = 50 g/mL M1.V1 = M2.V2 200 g/mL . 1 = 50 g/mL . X V2 = 4 mL Volume antibiotik = 1 mL Volume aquadest yang ditambahkan = 3 mL

(( (

( )

))

(( (( ) (

( ))

))

Potensi = Antilog M x 100% = 0,76366 x 100% = 76,366% Jadi, potensi dari sediaan yang diperiksa = 76,366% terhadap potensi baku.

VII.

PEMBAHASAN

Pada percobaan kali ini, metode yang digunakan dalam penentuan potensi antibiotika adalah metode penetapan dengan lempeng silinder yaitu menggunakan perforator untuk menguji antibiotik pada media nutrien agar yang berisi inokulum bakteri pada cawan petri Potensi dapat ditentukan dengan mengukur zona bening yang dihasilkan dan membandingkannya dengan diameter zona bening dari antibiotika standar. Percobaan yang dilakukan kali ini memakai dua cawan Petri yang bertujuan untuk mengurangi tingkat kesalahan pada saat perhitungan. Pada percobaan ini dilakukan pengenceran untuk menentukan dosis tinggi, dosis menengah dan dosis rendah yang akan digunakan dalam percobaan uji potensi antibiotika tiga dosis. Pada percobaan ini diambil dosis tinggi 10 g/ml dengan penambahan dosis antibiotik 1 mL dan aquadest steril 11,5 ml, dosis tengah 5 g/ml dengan penambahan dosis

antibiotik 1 ml dan aquadest steril 1 ml, dan dosis rendah 2,5 g/ml dengan volume antibiotik 1 ml dan penambahan aquadest steril 3 ml. Pengenceran untuk dosis tengah dan dosis rendah diambil dari larutan kloramfenikol pada dosis tinggi. Hal ini dikarenakan jika pengenceran diambil dari larutan stock kloramfenikol, maka dibutuhkan penambahan aquadest steril yang banyak. Hal pertama yang dilakukan adalah menyiapkan suspensi bakteri dalam nutrient broth yang berumur 18-24 jam dan dihomogenkan. Hal ini agar bakteri yang dibiakkan terdapat dalam jumlah yang cukup. Syarat penggunaan biakan bakteri yang dipakai adalah harus biakan murni (pure strained). Maksud dari biakan murni adalah bakteri yang diambil dari alam secara langsung kemudian dibiakkan, bukan dari bakteri yang diisolasi dari laboratorium klinis. Bakteri yang dipakai pada percobaan kali ini adalah Escherichia coli dan sampel dan baku standar antibiotika yang kita pakai adalah Kloramfenikol. Kemudian menyiapkan perbenihan nutrient agar dan sediaan antibiotik Kloramfenikol dengan cara digerus terlebih dahulu kemudian dilarutkan dengan etanol hingga larut dalan labu ukur 100 mL. Setelah itu ditambahkan aquadest steril sampai tanda batas, larutan tersebut dihomogenkan. Hal ini harus dilakukan dengan cara kuantitatif agar tidak mempengaruhi kadar dan agar pengujian potensi antibiotik dapat tepat. Setelah itu perencanaan pengenceran terhadap sampel dan standar hingga didapat variasi dosis yang diinginkan (dosis tinggi, dosis tengah, dan dosis rendah) dilakukan. Sampel dan standar diberi perlakuan yang sama agar dapat dibandingkan dan diketahui kadarnya. Kemudian dibuat larutan inokulum dengan cara suspensi bakteri dimasukkan ke dalam cawan petri menggunakan mikropipet, kemudian ditambahkan nutrient agar dengan suhu yang sesuai, homogenkan dan biarkan sampai membeku. Harus sampai membeku semua dikarenakan jika tidak beku semua bagian, pada saat di lubangi dengan perforator, akan membuat bentuk yang tidak bulat, karena bagian dalam nutrient agar yang belum beku akan membuat lubang menjadi berbentuk tidak bulat sempurna.

Setelah itu, permukaan dasar cawan petri dibagi menjadi enam area sama besar. Masing-masing area tersebut diberi label tergantung variasi seri dosis yang digunakan, yaitu BT; BM; BR; ST; SM; dan SR. Area tersebut dibuat bersilangan agar zona yang terbentuk tidak menumpuk. Pada masing-masing area tersebut dibuat enam cetakan reservoir (lubang) dengan menggunakan perforator secara aseptis, yaitu dekat dengan api. Maksud dari dekat dengan api adalah agar tidak terjadi kontaminan dari bakteri lain yang berada disekitarnya. Kemudian larutan antibiotik standar dan sampel sebanyak 50 L dimasukkan pada masing-masing reservoir sesuai dengan dosis yang ditentukan dengan menggunakan mikropipet. Keuntungan menggunakan mikropipet adalah mencegah tertelannya antibiotika tersebut dan mampu mengambil zat dengan jumlah yang sangat kecil dan akurat. Mikropipet yang digunakan haruslah bersih, setelah digunakan harus dicuci dengan desinfektan. Setelah itu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Penginkubasian ini bertujuan agar bakteri dapat tumbuh dan berkembang. Setelah diinkubasi, diperoleh zona hambat dengan diameter yang beragam, antibiotik dengan dosis tinggi memiliki diameter yang lebih besar daripada antibiotik dengan dosis rendah. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan antibiotik untuk menghambat aktivitas bakteri berbanding lurus dengan konsentrasinya. Melalui perhitungan potensi antibiotika, didapatkan potensi antibiotika sampel kloramfenikol terhadap standard kloramfenikol ialah 76,366%.

VIII. KESIMPULAN Besarnya potensi sampel antibiotika Kloramfenikol terhadap antibiotika kloramfenikol standar adalah 76,366%.

DAFTAR PUSTAKA

Anonymous.

2009.

Nutrient

Agar

and

Nutrient

Broth

Preparation.

http://www.austin.cc.tx.us./microbugz/01mediaprep.html Jawetz, E., J. L. Melnick, & L. N. Ornston. 1987. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 20, alih bahasa: Edi Nugroho & RF Maulany. EGC. Jakarta. Melnick, J & Aldelberg. 1996. Mikrobiologi Kedokteran, diterjemahkan oleh: Edi Nugroho, R. F. Maulany. Edisi 20. EGC. Jakarta. Naim, Rochman. 2003. Antibiotik. http://www2.kompas.com/kompas-

cetak/0312/11/ilpeng/734094.htm Tjay, T.H & K. Rahardja. 2002. Obat-Obat Penting, Khasiat, Penggunaan dan Efekefek Sampingnya. PT Elex Media Komputindo Gramedia . Jakarta.