En una columna cromatografica

Para tener mas platos teoricos conviene usar particulas mas finas

Ecuacin de van Deemter

altura plato terico

caminos mltiples MEJORA CON PARTICULAS FINAS. difusin longitudinal

tiempo de equilibracion entre fases MEJORA CON PARTICULAS FINAS.

Se usa silica mas fina, y por lo tanto se precisa mas presin ...

y se sigue por este camino ...

... hasta tener una HPLC

Equipos de HPLC

HPLC
Las fase movil es un lquido. Las columnas estan empaquetadas con una fase estacionaria muy fina que obliga a usar altas presiones. Por lo tanto hay que usar una bomba capaz de dar esas altas presiones, y mangueras (tubing) que las pueda soportar.

La resolucin y el dimetro de las partculas de la fase estacionaria.

silica 10 micrones

silica 5 micrones

HPLC es un conjunto de cromatografas, segn las columnas que se usen.

Partes comunes
Vlvula de inyeccin. Bomba. Detector

Partes diferenciadas
Columnas de distinto tipo. Mezcladores de solvente. Otros accesorios.

Vlvula de inyeccin
Poder cargar a baja presion y eluir la muestra a alta presin.

Alta repetibilidad en cantidad de muestra inyectada.

Bomba
Generar muy alta presion (6000 psi ~ 400 Atm). No tener pulsaciones. Poder regular el caudal y/o la presin. Resistir la corrosin de los solventes y las muestras.

Detectores

El mas usado: Detector de absorbancia

La celda tiene muy pequeo volumen y paso ptico normal.

Espectros a lo largo de la elusin, tomados con espectrofotmetro de matriz de diodos.

Detector de fluorescencia: muy selectivo y sensitivo

Para los compuestos de alta fluorescencia, el lmite de deteccin es unas 100 veces menor que los de absorbancia.

El ms universal: Detector de indice de refraccin

Detectores electroqumicos

Comparacin de detectores

 Qu columna usar ?

Qu columna usar ?

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Solventes
Los solventes para HPLC deben ser MUY puros. Calidad HPLC es una de las calidades mas altas. Las impurezas de un solvente malo producen: - seal de fondo en el detector - arruinan las columnas, en especial por partculas Aun con estas precauciones, se usa una precolumna cortita del mismo tipo que la columna a usar, pero mas barata.

Solventes - poder de elusin

Serie eluotrpica en cromatografia en fase directa de almina o slica

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Fase reversa

El pH no debe ser mayor a 7.5 o se destruye la columna !

Fuerza eluotrpica en fase reversa

Smezcla = VaSa + VbSb + ...

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Gradientes de solventes
Si se tienen 2 bombas, se pueden mezclar 2 o ms solventes en la proporcion que uno quiera. De esta forma, se comienza con un solvente que eluye poco, y las substancias mas afines por el solvente salen rpido. Las substancias mas afines por la fase estacionaria se van sacando aumentando la fuerza de elucin de la mezcla con un gradiente.

Aminoacidos derivatizados con o-ftalaldehido en columna de fase reversa C18

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Columnas de exclusin molecular

Partculas nanoporosas de slica o polmeros que atrapan a las moleculas pequeas, y las grandes no entran. En un rango intermedio, las molculas pasan tiempos estadisticamente diferentes dentro de la fase slida.

Columnas de exclusin molecular

La slica es mas rgida, soporta mayor presin y T. Los polimeros pueden sintetizarse de diversas propiedades y tamao de poro en 5 rdenes de magnitud

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Cromatografa de intercambio inico

Los cationes o aniones presentan diferente afinidad por el relleno de la columna, permitiendo la cromatografa.

Resinas de intercambio inico

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Detectores para cromatografia ionica

CONDUCTIVIDAD CONDUCTANCIA ELECTRICA ANIONES Y CATIONES DE ACIDOS O BASES MODERADAMENTE FUERTES (pKa O pKb < 7) ANIONES Y CATIONES OXIDABLES O REDUCIBLES ANIONES Y CATIONES QUE ABSORBEN. METALES PESADOS DESPUES DE REACCION CON COMPLEJANTES QUE DAN COLOR. SILICATOS Y FOSFATOS MEDIANTE REACCION CON MOLIBDATO. ALCALINOTERREOS CON ARSENAZO I NH4+, AMINOACIDOS, POLIAMINAS CON REACCION CON orto FTALALDEHIDO

AMPEROMETRIA UV/VIS

OXIDAXION/REDUCCION EN UN ELECTRODO INERTE ABSORCION DE LUZ

FLUORESCENCIA

EMISION MOLECULAR

Selectividad a diversos iones

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Cromatografa inica

columna de intercambio aninico

mS

Columnas supresoras.
sin supresion

columna de intercambio aninico

mS

con supresion
columna supresora (catinica)

mS

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Solventes de elusin

Aplicaciones de la cromatografa inica

Iones inorgnicos, con columna supresora y detector conductimtrico alfa-aminocidos naturales

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Otros tipos de cromatografas

- de afinidad. - de exclusin inica - de gases (muy usada, la vemos en la prxima clase)

El mejor detector de todos: el espectrometro de masas.

Los espectrmetros de masa permiten determinar la masa exacta de molculas nicas, por lo tanto su identidad qumica. Precisan un alto vaco para que las molculas puedan volar libremente sin chocar, ya que en eso se basa la separacin por masa molecular.

como conectar un HPLC, cuya salida es un lquido a T y P ambientes con un sistema de ultra-alto vaco ?

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Electrospray

Electrospray

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