TRABAJO PRACTICO N 1 DETERMINACIN DE PROTENAS. OBJETIVO.

Realizar curvas de calibracin a partir de una muestra de protenas (albmina bovina), con distintas concentraciones conocidas, utilizando el mtodo de Bradford y Lowry estndar, con HEPES y TCA. Hallar la concentracin de protenas en dos muestras incgnita: una sin interferentes y otra con el interferente HEPES. INTRODUCCIN. El mtodo de Lowry se aplica para hallar la concentracin de protenas en las muestras. Este mtodo utiliza una solucin, scn 1, que contiene cobre (aumenta la sensibilidad en la determinacin de protenas) y un reactivo, llamado Reactivo de Folin, que se reduce en presencia de protenas. Las especies reducidas cambian su color hacia el azul y son capaces de ser ledas por el espectrofotmetro para averiguar su absorbancia. Si las concentraciones de las protenas son conocidas, se realiza la curva estndar de calibracin (Absorbancia vs. Concentracin). Si, en cambio, las concentraciones de las muestras no son conocidas, se mide su absorbancia, se interpola este valor con la curva de calibracin y as se halla la concentracin de la muestra incgnita. A la muestra se le puede agregar HEPES, interferente, y luego tratarla con TCA, para precipitar la protena. Se hallan nuevas curvas y se las puede comparar con la estndar. El mtodo de Bradford, que tiene las mismas aplicaciones que el de Lowry, utiliza un reactivo, llamado reactivo de Bradford, que al entrar en contacto con protenas se reduce, virando su color del amarillento al azul intenso. Las muestras son ledas a 595nm y con estos datos se realiza la curva de calibracin. PROCEDIMIENTO. Bradford Std. Se tomaron 5 tubos de vidrio en los que se colocaron distintas cantidades de solucin de BSA (albmina sero bovina) 1mg/ml y luego se llevaron los tubos al mismo volumen final (100 ul) con agua destilada. Se agregaron 1000 ul de reactivo de Bradford, se dej reaccionar dos minutos y se midi la absorbancia de cada tubo en el espectrofotmetro a 595 nm de h. Se realiz la curva de calibracin con los valores obtenidos, se hizo la regresin lineal y se calcul el ajuste de la recta. Tubo 0 1 2 3 4 5 Cant. BSA [ug] 0 1 5 10 20 40 Volumen agua [ul] 100 99 95 90 80 60 Volumen final [ul] 100 100 100 100 100 100 Reactivo de Bradford [ul] 1000 1000 1000 1000 1000 1000

 Lowry STD. Se tomaron 7 tubos de vidrio con distintas cantidades de scn. de BSA y se llevaron al mismo volumen final (300 ul) con agua destilada. A cada tubo se lo incub primero durante 10 minutos con la solucin 1 y luego se agreg el reactivo de Folin (150 ul), se agit y se incub durante 30 minutos. Finalmente se midi la absorbancia de cada tubo en el espectrofotmetro a 660 nm, se realiz la curva de calibracin y se calcul el ajuste de la recta. Lowry HEPES. Se tomaron 7 tubos con diferentes cantidades de scn. BSA. Se llevaron al mismo volumen final (300ul) con HEPES (interferente), luego se incub 10 minutos con scn. 1 y finalmente 30 minutos con el reactivo de Folin (150 ul). Se midieron las absorbancias en el espectrofotmetro a 660 nm y se realiz con estos valores la curva de calibracin. Tubo 0 1 2 3 4 5 6 Cantidad BSA [ug] 0 1 5 10 25 50 75 Volumen HEPES [ul] 300 299 295 290 275 250 225 Volumen final [ul] 300 300 300 300 300 300 300 Vol. Scn. 1 [ul] 1500 1500 1500 1500 1500 1500 1500 Vol. Reactivo de Folin [ul] 150 150 150 150 150 150 150

Lowry TCA. Se tomaron 7 tubos a los que se agregaron diferentes cantidades de scn. BSA y se llevaron al mismo volumen final con agua destilada (300 ul). A cada tubo se agreg HEPES y la misma cantidad de TCA. El TCA se agrega para que precipite la protena y as poder separarla del interferente. Se dej a los tubos as preparados durante 15 minutos en fro para favorecer la precipitacin. Luego se centrifugaron (15 minutos 3500 r.p.m.), se descart el sobrenadante por inversin sobre papel absorbente, se agreg ter etlico para descartar el TCA, se centrifug nuevamente y se retir el sobrenadante con pipeta Pasteur. El pellet se resuspendi en NaOH. A los tubos con las soluciones resultantes se le agreg la scn. 1, se dej incubar 10 minutos, se agreg el reactivo de Folin y se incub 30 minutos. Se midieron las absorbancias en el espectrofotmetro a 660 nm, se realiz la curva de calibracin y se hizo el ajuste de la recta resultante. Muestras incgnitas. Se prepararon 4 tubos con 30 ul cada uno de scn. de protena incgnita. Dos de ellos se llevaron al volumen final de 300 ul con agua destilada y los otros dos se llevaron a 300 ul con HEPES. Se agregaron 1500 ul de scn. 1 y se incub por 10 minutos, luego se incub durante 30 minutos con reactivo de Folin (150 ul). Se midieron las absorbancias a 660 nm y los resultados obtenidos se interpolaron en las curvas de calibracin confeccionadas en los pasos anteriores. 2

Cabe destacar que para los 4 tubos se utiliz el mismo blanco utilizado para la curva de calibracin de Lowry HEPES. Vol. Scn. Incgnita [ul] 30 30 30 30 Vol. agua [ul] 270 270 0 0 Vol. HEPES [ul] 0 0 270 270 Volumen final [ul] 300 300 300 300 Vol. Scn. 1 [ul] 1500 1500 1500 1500 Vol. Reactivo Folin [ul] 150 150 150 150

RESULTADOS Y CONCLUSIONES. A) B) C)

D) Si el HEPES no fuera un interferente en el mtodo de Lowry, las pendientes de las curvas de calibracin de Lowry HEPES y Lowry Std. deberan ser las mismas. Como no los son, se demuestra que HEPES acta como interferente en este mtodo. Al utilizar TCA para eliminar el interferente, se espera que las pendientes de las curvas de calibracin de Lowry TCA y Lowry Std. fueran iguales o al menos muy similares, ya que en ninguna de las dos hay interferente. Sin embargo, al compararlas, notamos que difieren en un factor de 1.25, dando un error porcentual aproximadamente igual al 27%. Este es un error experimental muy elevado y no sera una buena aproximacin utilizar los valores de esta curva de calibracin TCA para encontrar la concentracin de una muestra incgnita. Seguramente hubo errores sistemticos en las mediciones, en los tiempos de incubacin, en el pipeteo, al descartar los sobrenadantes, etc. E) Vol. Scn. Incgnita [ul] 30 (sin HEPES) 30 (sin HEPES) Absorbancia 0 0 3

30 (con HEPES) 30 (con HEPES)

0,109 0,114

Los valores de cero de las absorbancias se deben a que los blancos utilizados para obtener los valores de las mismas fueron los utilizados para la curva de Lowry HEPES, es decir que los blancos contenan HEPES mientras que las muestras no. En realidad los valores dieron negativos, lo que es absurdo y es, por lo tanto, vlido tomarlos como valores nulos. Puede deducirse de esto que el interferente se une a los colorantes utilizados en el mtodo de Lowry, ya que de otra forma las muestras podran dar valores de absorbancia linealmente proporcionales con respecto al blanco, donde al no haber protenas, el interferente no tendra a quien unirse. Conociendo la relacin lineal que hay entre la absorbancia y la concentracin (Ley de LambertBeer: A= b c, donde A es la absorbancia, es el coeficiente de absorbancia, b es el camino ptico recorrido y c es la concentracin), puede obtenerse la concentracin de la muestra incgnita con HEPES tomando en cuenta cada curva de calibracin realizada. Para el caso de Bradford Std.: y = 0.0168 1/ug prot. * x O mejor expresado, A = 0.0168 1/ug prot. * c , donde la pendiente representa el valor de = 0.0168. Tomando el promedio de los dos valores de absorbancia para la incgnita con HEPES y reemplazando en la ecuacin: 0.112 = 0.0168 1/ug prot. * c ! c = 0.112ug prot / 0.0168 = 6.67ug prot. La concentracin de la protena incgnita por ul de scn. de protena es, entonces: C = 6.67ug prot. * 1ul scn. prot. / 30ul scn. prot. = 0.22ug prot/ul scn. prot. Evidentemente, al interpolar en la curva Bradford Std., el valor obtenido no puede tomarse en cuenta debido a que para medir la absorbancia de la muestra incgnita se utiliz el mtodo de Lowry, que utiliza otros colorantes y se lee a otra longitud de onda y por lo tanto no va a ser comparable con los valores obtenidos en el mtodo de Bradford. Para el caso de Lowry Std.: A = 0.0055 1/ug prot. * c ! c = 0.112ug prot / 0.0055 = 20,36ug prot. La concentracin de la protena incgnita por ul de scn. de protena es para este caso: C = 20,36ug prot. * 1ul scn. prot. / 30ul scn. prot. = 0.68ug prot/ul scn. prot. Para el caso de Lowry TCA: A = 0.004 1/ug prot. * c ! c = 0.112ug prot / 0.004 = 28ug prot. La concentracin de la protena incgnita por ul de scn. de protena es para este caso: 4

C = 28ug prot. * 1ul scn. prot. / 30ul scn. prot. = 0.93ug prot/ul scn. prot. En el caso de calcular la concentracin de la incgnita con la curva de Lowry Std., al no tener sta HEPES, y al haberse demostrado ya que ste se une a los reactivos de Lowry produciendo interferencia en la lectura de la absorbancia, el valor no puede tomarse en cuenta. Lo mismo pasa al calcular con Lowry TCA, con el agravante de que en este caso se introduce un error del 27 % aprox., lo que lo hace mucho ms inexacto. Para el caso Lowry HEPES: A = 0.0341 1/ug prot. * c ! c = 0.112ug prot / 0.0341 = 3,28ug prot. La concentracin de la protena incgnita por ul de scn. de protena es para este caso: C = 3,28ug prot. * 1 ul scn. prot. / 30 ul scn. prot. = 0,109 ug prot/ul scn. prot. Para la curva de Lowry HEPES se tomaron pocos valores porque en los que la concentracin de la protena era elevada, no respondan ya a la relacin lineal de LambertBeer. As, al interpolar en dicha curva, el valor de la concentracin de protena de la muestra incgnita que se obtiene es solamente una aproximacin del valor real. Esto puede verse en el ajuste de la recta en el grfico (R2 = 0.8942), que si bien es bastante bueno por tratarse de una scn. con interferente, es suficientemente bajo para ser una buena aproximacin. Las interferencias de numerosas sustancias constituyen uno de los principales inconvenientes del mtodo de Lowry en comparacin con otros. Estas sustancias son derivados aminados, componentes de ciertos buffers, agentes quelantes, detergentes, algunas sales, azcares, etc. Las principales interferencias con el Coomassie blue son los detergentes. La sensibilidad de un mtodo representa la cantidad mnima de protena necesaria para dar una respuesta detectable. El mtodo de Bradford es ms sensible que el de Lowry. La eleccin de un mtodo de dosaje de protenas depender sobre todo de la precisin requerida y de la cantidad de protena a dosar, adems de la facilidad de puesta en marcha, la rapidez de la respuesta durante el proceso, las condiciones de dosaje, etc.