CTEDRA: BIOQUMICA

Carreras: Farmacia
Profesorado en Qumica
Licenciatura en Qumica
Licenciatura en Alimentos

ENZIMOLOGA Y CINTICA ENZIMTICA

Definiciones tiles
- Unidad de enzima (U): cantidad de enzima que cataliza la conversin de 1
mol de sustrato en producto(s) en 1 minuto de reaccin, bajo condiciones
previamente determinadas.
- Actividad enzimtica o concentracin de enzima: unidades de enzima por
ml de solucin. (U/ml)
- Actividad especfica (U/mg): actividad enzimtica (U/ml)/concentracin de
protenas (mg/ml) de la solucin.
- ndice de recambio (min
-1
s
-1
):
a) nmero de moles de sustrato transformados por minuto por mol de
enzima (actividad molar molecular).
b) si es una enzima con n subunidades, cada una con un sitio activo, es el
nmero de moles de sustrato transformados por minuto por mol de
subunidad activa o centro cataltico (actividad de centro cataltico)
- Ciclo cataltico (min s): tiempo que transcurre un ciclo cataltico.
- Katal: cantidad de enzima que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato
en producto (s) en 1 segundo. Actividad especfica: katal/kg de protena.

Para resolucin de tablas de purificacin:
.Actividad total: Actividad enzimtica x volumen total.
.Protenas totales: Concentracin de protenas x volumen total.
.Rendimiento parcial (%): (Actividad total etapa/Actividad total etapa anterior) x
100.
.Rendimiento total (%): (Actividad total etapa/Actividad total primera etapa) x 100.
.Purificacin parcial: Actividad especfica etapa/ Actividad especfica etapa ante-
rior.
.Purificacin total: Actividad especfica etapa/ Actividad especfica primera etapa.

ENZIMOLOGA:

PROBLEMAS:

1- Sea la reaccin A+B AB. Concentraciones iniciales de A y de B de 1 mM y 2 mM
respectivamente llegan al equilibrio despus de 45 horas de incubacin. Las
concentraciones en el equilibrio son [A]= 0,5mM, [B]=1,5 mM y [AB]=0,5 mM. En
presencia de una enzima adecuada el equilibrio se alcanza en un minuto. Cuales
sern las concentraciones alcanzadas en este caso? Cul es el valor de la Keq en
ambos casos?

2- Un extracto libre de clulas de Escherichia coli contiene 24 mg de protena por
mililitro. Veinte microlitros de este extracto en un volumen de incubacin patrn de 0,2
ml catalizaron la incorporacin de la glucosa-
14
C al glucgeno con una velocidad de 1,6
2
nmoles/min. Calcular la actividad expresada (U/ml) y la actividad especfica (U/mg) en
la cubeta y en la muestra.

3- Un extracto crudo libre de clulas contiene 20 mg de protena por mililitro. Diez mi-
crolitros de este extracto en un volumen de reaccin total de 0,5 ml catalizaron la for-
macin de 30 nmoles de producto en un minuto en condiciones de ensayo ptimas (pH
y fuerza inica, concentraciones saturantes de todos los sustratos, coenzimas, activa-
dores y otros). (a) Expresar la velocidad inicial v
i
en mM/min. (b) Cul ser v
i
si los
mismos 10 l del extracto se ensayaran en un volumen total de 1,0 ml? (c) Cul es la
concentracin de enzima en la mezcla de ensayo y en el extracto (en U/ml)? (d) Cul
es la actividad especfica de la preparacin?

4- Quince microlitros de la preparacin de una enzima catalizaron la produccin de 0,52
moles de producto en un minuto en condiciones ptimas en un ensayo patrn (a)
Cunto producto se producir en un minuto por 150 microlitros de la preparacin en
las mismas condiciones de reaccin? (b) Cunto tiempo necesitarn los 150 microli-
tros de la preparacin para producir 0,52 micromoles de producto en las mismas condi-
ciones de ensayo?

5- Una enzima pura tiene una actividad especfica de 120 unidades/mg de protena.
(a) Calcular el ndice de recambio si el PM=360000. (b) Calcular el tiempo requerido
para un ciclo cataltico.

6- Un microgramo de una enzima pura (PM=92000) cataliz una reaccin a la veloci-
dad de 0,5 moles/min en condiciones ptimas. Calcular (a) la actividad especfica de
la enzima expresada en U/mg de protena y en U/mol, (b) el ndice de recambio y (c)
cunto tiempo dura un ciclo cataltico?

7- Una preparacin comercial de enzima tiene una actividad especfica de 42 U/mg de
protena y contiene 12 mg de protena por mililitro. Para corroborar estos datos un
operador ensaya una medida de actividad de la enzima en un medio de reaccin de 1
ml. El mtodo utiliza una concentracin de sustrato en el medio de 30 mM y un tiempo
mnimo de lectura de 1 min. El volumen mnimo de la preparacin enzimtica que se
puede utilizar es de 5 l. (a) Puede el operador hacer el ensayo o debe dilur
previamente la preparacin? (b) En caso de que deba dilur y suponiendo que la
enzima se descompone si lo hace, qu actitud debera tomar el operador?

8- Las |-lactamasas son enzimas capaces de hidrolizar la penicilina segn la reaccin:
penicilina +H
2
O cido peniciloico.
Esta reaccin puede estudiarse monitoreando el descenso de absorbancia a 230 nm
(coeficiente de absorcin =1,09 mM
-1
cm
-1
). Se determina la actividad de |-lactamasa
en una muestra cuya concentracin de protena es de 20 g/ml empleando penicilina a
concentracin saturante (1mM) en amortiguador de pH 7 y t =30C, observndose una
diferencia en la absorbancia de 0,3 para un tiempo de 100 segundos. El volumen final
en la cubeta de reaccin es 2 ml, el camino ptico 1 cm y el volumen de muestra
empleado es 15 l. Cules son la actividad en U/ml y la actividad especfica de la
muestra?

9- La actividad de una muestra de lctico deshidrogenasa (LDH) pura con una
concentracin de protena de 2 mg/ml se ensay por un mtodo discontnuo (aparicin
de piruvato). Diez microlitros de la muestra se incubaron con concentraciones
3
saturantes de lactato y NAD
+
en un volumen final de 3 ml. Luego de 3 minutos la
reaccin se detuvo por la adicin de 0,5 ml de DNFH (reactivo de color). Despus de
10 minutos se agregaron 1,5 ml de NaOH 0,4 N y se midi la absorbancia de la
hidrazona formada a 505 nm. Se obtuvo una variacin de absorbancia de 0,6. Para
realizar la curva de calibracin de la reaccin del piruvato con la DNFH se trabaj en
idnticas condiciones utilizando una solucin de cido pirvico (PM=88) conteniendo
4,4 mg/ml. Los valores obtenidos se muestran en la tabla. Calcule el nmero de
recambio de la LDH considerando que el PM de la enzima es 130000 y que posee dos
sitios activos por molcula.

ml de testigo 0,00 0,05 0,10 0,20 0,30 0,40
absorbancia 0,05 0,15 0,25 0,44 0,66 0,85

10- Cincuenta mililitros de un extracto libre de clulas que contenan 24 mg de protena
por ml del mismo y cuya actividad era de 0,08 U/ml se fraccionaron por precipitacin
con sulfato amnico. La fraccin que precipitaba entre el 30% y 50% de saturacin se
redisolvi en un volumen total de 10 ml y se dializ. La disolucin despus de la dilisis
ocupaba 12 ml y contena 30 mg de protena por ml. Veinte microlitros de la fraccin
purificada catalizaron la reaccin de la fosforilasa con una velocidad de 5,9
nnmoles/minuto en condiciones de un ensayo patrn. Calcular (a) la recuperacin de la
enzima y (b) el grado de purificacin obtenido mediante la etapa del sulfato amnico.

11- Un extracto crudo libre de clulas de msculo esqueltico contiene 32 mg de pro-
tena por ml. Diez microlitros del extracto catalizaron una reaccin con una velocidad de
0,14 moles/min en condiciones ptimas en un ensayo patrn. Cincuenta ml del extrac-
to se fraccionaron por precipitacin con sulfato amnico. La fraccin que precipit entre
el 20% y 40% de saturacin se redisolvi en 10 ml. Esta solucin contena 50 mg de
protena/ml. Diez microlitros de esta fraccin purificada catalizaron la reaccin con una
velocidad de 0,65 moles/min. Calcular (a) el porcentaje de recuperacin de enzima en
la fraccin purificada, y (b) el grado de purificacin obtenido por el fraccionamiento.

12- Se purific una enzima obtenindose los datos que se indican a continuacin:

FRACCIN VOLUMEN
(ml)
ACTIVIDAD
(U/ml)
PROTENA
(mg/ml)
I 1800,0 0,23 12,5
II 75,0 3,00 14,0
III 20,0 5,00 1,0
IV 1,5 40,00 0,5

Construya una tabla de purificacin.

13- Con los siguientes datos confeccione una tabla de purificacin para una deshidro-
genasa indicando luego: (a) Cul es la purificacin total alcanzada?; (b) Cul es la
etapa individual que dio mayor purificacin? (c) Cul es el rendimiento total? (d) Anali-
ce la tabla obtenida y seale si todas las etapas empleadas estn justificadas. Funda-
mente su respuesta.

FRACCIN VOLUMEN
(ml)
AA/min PROTENA
(mg/ml)
4
Extracto crudo 1000,0 124 5
Sulfato de amonio 20,0 3100 10
CM-celulosa 100,0 496 2
Sephadex-G25 100,0 496 1

Coeficiente de absorcin a 340 nm =6,2 mM
-1
cm
-1.


14- La enzima gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (NADP
+
dependiente) cataliza la
siguiente reaccin:
1,3-bisfosfo-glicerato +NADPH +H
+
gliceraldehido-3-fosfato +NADP
+
+Pi
Al purificar esta deshidrogenasa de A. nidulans, se obtuvieron por sonicacin de clulas
enteras 120 ml de un extracto crudo conteniendo 25 mg/ml de protena y 20 U/ml de
actividad enzimtica. Posteriormente se realiz un fraccionamiento salino. La actividad
enzimtica se recuper en la fraccin 40-70 % de saturacin con sulfato de amonio, es-
ta fraccin se redisolvi en 40 ml dando una concentracin de protena de 20 mg/ml y
una actividad de 40 U/ml. Luego se realiz una cromatografa de afinidad con Rojo
Procin (anlogo de NADP
+
) donde la deshidrogenasa qued unida pudiendo ser elu-
da con 0,7 M NaCl, recuperndose as 5 ml con una actividad de 240 U/ml y una con-
centracin de protena 0,4 mg/ml. Finalmente se realiz una cromatografa de exclusin
molecular en Sephacryl-S300 donde se recuperaron 6 ml y 0,2 mg/ml de protena. La
actividad de la enzima fue medida como consumo de NADPH, cuyo coeficiente de ex-
tincin a 340 nm es 6200 M
-1
cm
-1
en un volumen de reaccin de 3 ml y una cubeta de
1cm de paso de luz. El agregado de 2 l de esta ltima fraccin produjo una disminu-
cin de absorbancia de 0,992 al cabo de 2 minutos. Construya la tabla de purificacin.
Indique cul es el rendimiento y la purificacin total alcanzados. Indique cul es la eta-
pa de mayor purificacin y cul la de mayor rendimiento. Indique si todos los pasos se
justifican fundamentando su respuesta.

15- La enzima malato deshidrogenasa NADP
+
dependiente cataliza la reaccin
malato +NADP
+
oxalacetato +NADPH +H
+

A partir de 500 g de hojas de espinaca se obtuvieron 1500 ml de un extracto crudo con
una concentracin de protena de 20 mg/ml. La actividad se determin con una alcuota
de 30 microlitros midindose por un mtodo continuo la aparicin de NADPH a 340 nm
(coeficiente de absorcin del NADPH=6200 M
-1
cm
-1
) en una cubeta de 3 ml y 1 cm de
camino ptico obtenindose una variacin de absorbancia para 10 minutos de 1,24. Se
realiz luego una cromatorafa en DEAE celulosa recogindose 180 ml que contenan
10 U/ml de actividad enzimtica y 12,5 mg/ml de protena. El paso posterior fue una
columna de hidroxilapatita recogindose 10 tubos de 4 ml c/u con actividad de
deshidrogenasa. La concentracin de protena en el conjunto fue de 0,94 mg/ml con
una actividad de 22,5 U/ml. Como ltimo paso se realiz una cromatografa en columna
de Sepharosa 6B y se recuper un volumen de 15 ml con una actividad de 50 U/ml y
una concentracin de protena de 2,1 mg/ml. En base a estos datos construya la tabla
de purificacin indicando adems (a) cul es la purificacin y el rendimiento total
alcanzados, (b) cul es la etapa individual de mayor purificacin y cul la de mayor
rendimiento, (c) seale si todas las etapas empleadas se justifican; fundamente su
respuesta.

16- A partir de un extracto libre de clulas se intenta purificar una enzima que cataliza
la reaccin:
M + N R + S
5
La actividad enzimtica se determina espectrofotomtricamente aprovechando la
propiedad del sustrato M de poseer un pico de absorbancia a 550 nm (coeficiente de
extincin =10,00 mM
-1
cm
-1
) que desaparece cuando se produce la reaccin. Esta se
realiza en cubetas de 1 cm de paso de luz, en un volumen de 2 ml. En una primera
etapa se realiz un fraccionamiento con sulfato de amonio. La enzima precipit entre el
60 y el 40 % de saturacin. El precipitado obtenido fue resuspendido en un buffer de
fosfato de potasio 100 mM y dializado contra el mismo. En el dializado se determin
actividad enzimtica obtenindose una variacin de absorbancia (AA/min) de 0,15. La
concentracin de protena fue de 3 mg/ml. El volumen total dializado (100 ml) fue
dividido en dos volmenes iguales. Una de las fracciones fue sometida a filtracin
molecular por Sephadex G-100 mientras que la otra fue sometida a una cromatografa
de intercambio inico en DEAE celulosa. Las fracciones activas provenientes de la
filtracin molecular rindieron una preparacin de 200 ml conteniendo 0,04 mg/ml de
protena. Del ensayo de actividad se obtuvo un AA/min= 0,03. En cambio, las
fracciones activas provenientes de la cromatografa de intercambio inico rindieron una
preparacin de 50 ml conteniendo 0,02 mg/ml de protena y el ensayo de actividad di
un AA/min= 0,02. En todos los casos se emplearon 0,01 ml de las preparaciones
correspondientes para el ensayo de actividad. (a) Calcule el rendimiento y la
purificacin para cada uno de los procedimientos alternativos empleados. (b) Cul de
los dos procedimientos (Sephadex o DEAE celulosa) elegira para purificar esta
enzima? Fundamente.

17- Una enzima bacteriana que metaboliza la destruccin de un antibitico ha sido
estudiada en vas de obtener un mtodo de purificacin de la misma. La enzima
cataliza la destruccin del antibitico segn una reaccin que puede seguirse
espectrofotomtricamente a 540 nm con un coeficiente de extincin de 10 mM
-1
cm
-1
. La
actividad del extracto crudo se determin empleando una alcuota de 10 microlitros que
produjo la aparicin de 0,02 micromoles de producto en 5 minutos. Luego se intentaron
dos protocolos de purificacin a partir de un extracto crudo que tena una concentracin
de protena de 2 mg/ml en un volumen de 5 litros. La primera etapa, comn a los dos
protocolos, fue una precipitacin con sulfato de amonio, etapa en la que se obtuvo un
60% de rendimiento y una purificacin de 5 veces. El precipitado se redisolvi en 100
ml y con la mitad del material se realiz una cromatografa de afinidad seguida de una
filtracin por gel recogindose en esta ltima 25 ml con una actividad de 10 U/ml y una
concentracin de protena de 2 mg/ml (mtodo A). La otra mitad se someti a una
cromatografa de adsorcin seguida de una de intercambio inico obtenindose un
volumen de 5 ml con una actividad de 20 U/ml y una concentracin de protena de 1
mg/ml (mtodo B). Calcule la actividad inicial del extracto crudo y las actividades finales
obtenidas con cada mtodo de purificacin. Indique cul mtodo (A o B) empleara para
purificar la protena y por qu. Qu actividad recuperara a partir del volumen total
inicial?

18- Un grupo de investigadores que estn estudiando la enzima L-glutamato deshidro-
genasa de una bacteria deciden realizar la purificacin de la misma. Luego de varios in-
tentos disean un mtodo de purificacin. En la tabla que sigue se detallan los resulta-
dos obtenidos.


FRACCIN VOLUMEN
(ml)
ACTIVIDAD
(U/ml)
PROTENA
(mg/ml)
Extracto crudo 220 42,0 21,0
6
DEAE-celulosa 35 224,0 16,0
Sulfato de amonio 20 157,5 10,5
Sephadex-G50 60 50,0 2,5
Crom. de afinidad 10 279,8 1,6

(a) Complete la tabla. (b) Se decide omitir uno de los pasos de purificacin a partir de
los datos obtenidos, cul debera ser ese paso y por qu? Cul fue el paso que pro-
dujo la mayor purificacin y cul el de mejor rendimiento? (c) Dicha enzima reduce o-
oxoglutarato a glutamato asociado a la oxidacin de NADH a NAD
+
, lo que fue utilizado
para seguir espectrofotomtricamente la actividad de la enzima. En una preparacin
anterior 0,01 ml de enzima con una concentracin de 10 mg/ml de protena produjeron
una variacin de absorbancia de 0,125/min en condiciones ptimas. Qu actividad
especfica tena esa preparacin? Volumen del ensayo: 1 ml; c
340
NADH: 6,22 mM
-1
cm
-1
.

19- La asparaginasa cataliza la reaccin:
asparagina +H
2
O aspartato +H
3
N
Esta enzima es usada con fines teraputicos en caso de leucemia. Las clulas tumora-
les en rpida divisin necesitan cantidades mayores de asparagina que las normales.
La administracin de asparaginasa reduce los niveles de asparagina disponible en los
individuos enfermos, lo que reprime la viabilidad del tumor. Un laboratorio farmacutico
que desea comercializar asparaginasa le encarga que realice la purificacin de la en-
zima del hongo Boticamyces pharmaceae. A tal fin, parte de 200 ml de un extracto cru-
do libre de clulas conteniendo 20 mg/ml de protena. Para medir actividad enzimtica
incuba una alcuota de 10 l del extracto con el sustrato a 37C en 0,2 ml de medio de
reaccin, finalizndose sta a los 5 min directamente por el agregado de 1 ml de reacti-
vo de color para H
3
N. La lectura de absorbancia a 540 nm (descontando el blanco) en
una cubeta de 1 cm de camino ptico fue de 0,44 (c para la reaccin de color =2200 M
-
1
cm
-1
). Luego realiza un fraccionamiento salino, recuperando la asparaginasa en la
fraccin 40-80 % de sulfato de amonio. Al redisolver esta fraccin en 20 ml del buffer
de purificacin Ud. recupera el 95% de actividad enzimtica y 3800 mg de protena.
Luego realiza una cromatografa en columna de DEAE-celulosa y recupera 80 ml que
contenan 600 U de asparaginasa (U es la cantidad de enzima que produce 1 mol de
H
3
N por minuto en las condiciones de ensayo) purificada 20 veces respecto al extracto
crudo. Como ltimo paso realiza una cromatografa en columna de hidroxi-apatita de la
que recupera 20 ml conteniendo 0,12 mg/ml de protena y 17 U/ml de actividad enzim-
tica.
a- Construya la tabla de purificacin y analcela, indicando la purificacin y el rendi-
miento total alcanzados. Seale la etapa de mayor purificacin y la de mayor rendi-
miento.
b- Aconseja iniciar la preparacin de la asparaginasa en gran escala usando los mis-
mos pasos de purificacin o sugiere alguna modificacin? J ustifique su respuesta.

20- Se purific prcticamente a homoqeneidad la dUTPasa (deoxiuridinatrifosfatasa) de
Escherichia coli. Esta enzima hidroliza el dUTP a dUMP y PPi jugando un importante
rol en la biosntesis del dTTP para la replicacin de DNA, ya que provee el sustrato pa-
ra Ia timidilato sintetasa. Las etapas del procedimiento de purificacin se indican en la
siguiente tabla. Complete la tabla de purificacin.



7
FRACCIN VOLUMEN (ml) ACTIVIDAD
(U/ml)
PROTENA
(mg/ml)
I 1690,0 0,134 2350,0
II 340,0 0,503 6060,0
III 440,0 0,208 173,0
IV 196,0 0,224 4,0
V 19,0 2,420 10,5
I =sobrenadante del lisado celular, II =fraccionamiento con sulfato de amonio, III =
cromatografa en DEAE celulosa, IV =cromatografa en fosfocelulosa y V =filtracin en
Biogel P-150.

21- Se realiz la purificacin de la enzima glucosa-6-fosfatasa que cataliza la siguiente
reaccin:
glucosa-6-fosfato +H
2
0 glucosa +fosfato
Se parti de 200 g de hgado bovino obtenindose un extracto inicial de 1200 ml que
tena una concentracin de protena de 10 mg/ml. Para medir actividad enzimtica se
incub una alcuota de 50 microlitros con el sustrato a 30C en 1 ml de medio de reac-
cin, cortndose sta a los 10 min directamente por agregado de 2 ml de reactivo de
color para fosfato. La lectura de Abs a 740 nm en una cubeta de 1 cm de camino ptico
fue de 0,49 con un blanco de medida de 0,12 (el coeficiente de extincin para la reac-
cin de color es de 3700 M
-1
cm
-1
). Se realiza luego un corte con sulfato de amonio al
50 % rescatndose la fosfatasa en el precipitado. Este precipitado fue redisuelto en un
volumen de 80 ml, siendo la concentracin de protena de 21 mg/ml y la actividad 6,3
U/ml. Posteriormente se realiz una cromatografa en Sephadex G-200 recogindose
10 tubos de 12 ml c/u con actividad enzimtica. La concentracin de protena en el con-
junto fue de 10,8 mg/ml y la actividad de 3,36 U/ml. Como ltimo paso se realiz una
cromatografa de afinidad y se obtuvieron 20 ml de preparacin con una actividad de
7,2 U/ml y una concentracin de protena de 0,5 mg/ml. En base a estos datos constru-
ya la tabla de purificacin e indique:
a-Cul es la purificacin y el rendimiento alcanzado?
b-Cul es la etapa individual que proporcion mayor rendimiento y cul la de mayor
purificacin?
c- Seale si todas las etapas empleadas se justifican. Fundamente su respuesta.

22- La piruvato carboxilasa (PCasa) es una enzima que usa biotina como cofactor cata-
lizando la reaccin:
piruvato +ATP +HC0
3
oxaloacetato +ADP +Pi
A fin de realizar la purificacin de la PCasa de Eschericia coli Ud. parte de 300 ml de un
extracto crudo libre de clulas conteniendo 1500 mg protena. La actividad enzimtica
se midi por un mtodo continuo determinando la produccin de oxaloacetato a 272 nm
( c
272
=920 M
-1
cm
-1
) a 30C y en un volumen final de 3 ml. Utilizando 10 l del extracto
crudo para medir la actividad Ud. obtiene un AA =0,46 luego de 5 min de reaccin
(medido en cubeta de 1 cm de camino ptico). Luego realiza un fraccionamiento salino,
recuperando la PCasa en la fraccin 30-50% de sulfato de amonio. Esta fraccin se re-
disolvi en 5 ml del buffer de purificacin que contenan 30 mg/ml de protena y el 90 %
de la actividad enzimtica. A continuacin realiza una cromatografa en columna de
Sephadex G-200, recuperando 30 ml que contenan 150 mg de protena y 270 U/ml (U
est expresada en mol/min) de actividad enzimtica. Como ltimo paso realiza una
cromatografa en columna de CM-celulosa de la que recupera 45 ml conteniendo 6750
U de PCasa purificada 900 veces respecto del extracto crudo. En base a estos datos
a- Construya la tabla de purificacin.
8
b- Analice la tabla indicando purificacin y rendimiento total alcanzados, as como el
paso de mayor purificacin y el de mayor rendimiento.
c- Indique si todos los pasos se justifican, explicando su respuesta

23- Durante la purificacin de la enzima ureasa (urea +H
2
O 2 NH
4
+
+CO
2
) se obtu-
vieron 900 ml de extracto crudo con una concentracin de protena de 3,33 mg/ml. Su
actividad se sigui midiendo la disminucin de absorbancia a 340 nm utilizando la reac-
cin acoplada NH
4
+
+o cetoglutarato +NADH

+H
+
glutamato +NAD
+
(c
NADH
=6200
M
-1
cm
-1
). El agregado de 20 l de extracto crudo a 1 ml de la mezcla de reaccin
produjo una AA =-0,800 en 4 minutos en una cubeta de 1 cm de paso ptico. Un corte
con sulfato de amonio dio lugar a un precipitado que se redisolvi en 150 ml de buffer.
De esta manera la ureasa se purific 10 veces con un rendimiento del 82,8 %. Esta
fraccin se cromatografi en una columna de Sephadex G25 recolectndose 80 ml de
eluato con el 90 % de la actividad de la etapa anterior conteniendo 45 mg de protena y
siendo la purificacin respecto del extracto crudo de 50. Su actividad se determin por
el metodo discontnuo ( NH
4
+
+fenol +hipoclorito azul de indofenol ) cuya curva de
calibracin de NH
4
+
present una pendiente de 0,6557 UA/mol NH
4
+
. Las condicio-
nes de la colorimetra fueron las mismas para la curva y la muestra.
a) Cul fue la absorbancia medida por este ltimo mtodo para la muestra si se em-
plearon 40 l de ureasa obtenida en la ltima etapa?
b) Realice la tabla de purificacin.

24- Su profesor de Bioqumica le ha asignado como trabajo prctico para aprobar la mate-
ria que determine la masa molecular de la |-lactamasa de Azospirillum lipoferum RG20.
Como material de partida le provee 25 ml de un extracto crudo obtenido por sonicacin de
un cultivo del microorganismo en fase logartmica de crecimiento.
Mediante una bsqueda bibliogrfica Ud halla la siguiente tabla de purificacin:

TABLA 1: Purificacin de la |-lactamasa de Azospirillum lipoferum RG20.

ETAPA
Actividad
especfica
(U/mg)
Actividad
total
(U)
Purificacin
(veces)
Rendimiento
(%)
Extracto crudo 4 3,349 1 100
Ppcin con sulfato de amonio 8 3,208 2 96
CM-Sephadex 1251 1,847 301 55
Chromatografa de afinidad 2155 1,373 518 41

La determinacin de la actividad enzimtica del extracto crudo empleando nitrocefina como
sustrato (c=16000 M
-1
cm
-1
) result en una variacin de absorbancia de 0,32 en dos minu-
tos cuando emplea 20 l de muestra (volumen de cubeta=1ml, camino ptico=1cm).
Para determinar la masa molecular de la enzima realiza una electroforesis en condiciones
desnaturalizantes y obtiene los resultados que se muestran. La calle A corresponde a la
enzima purificada y la B a los marcadores de masa molecular: albmina bovina srica (67
kDa), ovalbmina (43 kDa), anhidrasa carbnica (30 kDa), inhibidor de tripsina (20,1 kDa) y
o-lactalbmina (14,4 kDa).
a-Cual es la actividad del extracto crudo?
9
b-Cuntas unidades de enzima espera obtener luego de realizar la purificacin?Qu ac-
tividad especfica espera obtener?
c-Qu masa molecular informar?. Qu otro mtodo podra haber usado para realizar
esta determinacin?


A B


25- Se desea purificar una deshidrogenasa de planta (Punto Isoelctrico 3,1) a partir de
5 litros de extracto crudo. Con el propsito de poner a punto el mtodo de purificacin
se ensaya un protocolo que consta de tres etapas: fraccionamiento salino (etapa 1),
cromatografa de intercambio inico (etapa 2) y cromatografa de afinidad (etapa 3). Se
midi espectrofotomtricamente la actividad de muestras provenientes de cada etapa
empleando 5 l de muestra, en un volumen de reaccin de 1ml, durante 3 minutos a
25c (c
340
=6000 M
-1
.cm
-1
). Los valores de variacin de absorbancia obtenidos, la con-
centracin de protena y los volmenes totales se muestran en la tabla.

Etapa Volumen
(ml)
Protena
(mg/ml)
AA
(340nm)
Extracto crudo 50 3 0,09
1 7 10 0,45
2 10 0,5 0,225
3 2 0,05 0,675

a-Complete la tabla de purificacin.
b-Indique cul ser la cantidad de enzima (U totales) y la actividad especfica obtenida
si purifica la enzima a partir del resto de extracto crudo.
c-Explique brevemente el fundamento de la cromatografa de intercambio inico e indi-
que qu tipo (aninico o catinico) empleara para purificar la deshidrogenas del enun-
ciado y a qu pH lo hara.

26- Su profesor de Bioqumica le ha asignado como trabajo prctico que purifique la |-
lactamasa de Azospirillum lipoferum RG20 y determine su masa molecular. Como material
de partida le provee 25 ml de un extracto crudo obtenido por sonicacin de un cultivo del
microorganismo en fase logaritmica de crecimiento con una actividad de 8 U/ml y una con-
centracin de protena de 2 mg/ml.
Mediante una bsqueda bibliogrfica Ud halla un mtodo de purificacin que arroja los da-
tos de la siguiente tabla.
10

ETAPA Actividad
especfica
(U/mg)
Actividad
total
(U)
Purificacin
(veces)
Rendimiento
(%)
Extracto crudo 4 3,349 1 100
Ppcin con sulfato de amonio 8 3,208 2 96
CM-Sephadex 1251 1,847 301 55
Cromatografa de afinidad 2155 1,373 518 41

Ud realiza todos los pasos de purificacin y obtiene 8 ml de enzima purificada. La determi-
nacin de la actividad enzimtica de la protena purificada empleando nitrocefina como
sustrato (c=16000 M
-1
cm
-1
) result en una variacin de absorbancia de 0,48 en dos minu-
tos cuando emplea 3 l de muestra (volumen de cubeta =1ml, camino ptico =1cm) siendo
la concentracin de protena 0,002 mg/ml .
La determinacin de masa molecular la realiza mediante una cromatografa de filtracin
molecular empleando una columna previamente calibrada segn se indica en la siguiente
tabla:

Protena marcadora Volumen de elucin (ml)) Masa molecular (kDa)
Ribonucleasa 250 13,7
Quimotripsingeno 230 25,0
Ovoalbmina 210 43,0
Albmina 195 67,0
Aldolasa 165 158,2
Catalasa 150 231,9

El volumen de elucin de la protena en estudio fue de 220 ml, el volumen total de la co-
lumna fue de 260 ml y el volumen de exclusin de 100 ml.
a-Cual es la actividad especfica de la enzima por Ud. purificada?
b- Cual es el rendimiento y la purificacin obtenidas por Ud. con respecto a los publicados?
c-Qu masa molecular informar? (determinacin por mtodo grfico) Cmo determinar-
a si se trata de una enzima monomrica o no?


RESPUESTAS:

1- a) Las mismas. B) K
eq
=[A B]/ [A] [B] =0,67/mM

2- Cubeta: 8 x 10
-3
U/ml ; 3,3 x 10
-3
U/mg
Muestra: 8 x 10
-2
U/ml ; 3,3 x 10
-3
U/mg

3- a) 6 x 10
-2
mM/min
b) 30 nanomoles/min ml
c) 0,06 U/ml 3 U/ml (ext)
d) 0,15 U/mg

11
4- a) 5,2 moles (Se deben verificar condiciones de linealidad)
b) 6 segundos

5- a) 720 s
-1
; 43200 min
-1
b) 0,0014 s

6- a) 500 U/mg; 4,6 x 10
10
U/mol
b) 46000 min
-1

c) 1,3 x 10
-3
s

7- a) debe diluir
b) agregar glicerol, gelatina , albmina bovina srica, etc. Otra forma es aumen-
tar la concentracin de sustrato en el medio de reaccin.

8- 22 U/ml ; 1100 U/mg

9- 271 s
-1

10- a) R=88,5 %
b) P=2,94

11- a) 93%
b) P=3

12- R
t
=14%
P
t
=4347

13- a) 20
b) II
c) 40 %
d) No. Se puede eliminar la etapa III

14- R
t
=30 %; P
t
=750; Etapa de mayor purificacin=III; Etapa de mayor rendimien-
to=III; se eliminara la etapa IV

15- a) P
t
=240; R
t
=25 %
b) la de mayor purificacin es la etapa III, la de mayor rendimiento la IV
c) No. Se podra eliminar la etapa IV

16- a) Filtracin molecular: R=80 %, P=15
Intercambio inico: R=13 %, P=20

17- Actividad extracto crudo=0,4 U/ml
Actividades finales: Mtodo A=10 U/ml
Mtodo B=20 U/ml
Empleara B
Actividad recuperada=200 U
T


18- b) el paso omitido debera ser III y IV
Mayor purificacin=paso V
Mayor rendimiento=paso IV
12
c) 0,2 U/mg

19- a) P
t
=592; R
t
=35 %
Mayor purificacin=IV
Mayor rendimiento=II
b) se eliminara la etapa II

20- P
t
=4044; R
t
=20 %

21- a) P
t
=240; R
t
=20 %
b) Mayor rendimiento=paso III
Mayor purificacin=paso IV
c) No. Se eliminara la etapa III (podra dejarse para desalar la muestra)

22- b) P
t
=900; R
t
=75 %
Mayor rendimiento=paso II
Mayor purificacin=paso IV

23- a) Abs=0,34
b) P
t
=50; R
t
=75 %

24- a) 0,5 U/ml
b) 5125 U 2155 U/mg
c) 31000 Filtracin molecular

25- 4950 U totales; 150 U/mg

26- a) 2500 U/mg
b) rendimiento 20 % - menor; purificacin 625- mayor
c) 31000

13
CINTICA ENZIMTICA

PROBLEMAS:

1- Utilizando la ecuacin de Michaelis-Menten demuestre que v =V
mx
/2 cuando
[S]=K
m
.

2- Estudiando el efecto del pH sobre la actividad de una enzima se trabaj de acuerdo
a dos protocolos diferentes. En uno de ellos (A) se preincub la enzima a distintos pHs
y luego se midi la actividad de la misma a pH 7. En el otro caso (B) se determin la
actividad de la enzima a distintos pHs. Los resultados obtenidos se muestran a
continuacin.


pH
ACTIVIDAD
Protocolo A Protocolo B
4.0 7,9 1,0
4.5 8,1 1,9
5.0 8,0 3,2
5.5 8,2 4,9
6.0 7,8 7,3
6.5 8,0 9,0
7.0 8,0 8,0
7.5 8,1 6,3
8.0 4,0 2,5
8.5 2,0 1,0
9.0 0,2 0,0

Explique el comportamiento enzimtico en cada caso .

3-Una enzima posee la curva de actividad versus pH que aparece en la figura:



p H
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
%

A
c
t
i
v
i
d
a
d
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0






(a) Explique este comportamiento
(b) Como probara su hiptesis?
(c) Suponga que se inform que un
residuo de Asp es el responsable de
una parte de esta curva de pH,
cmo explicara este
comportamiento ?


14

p H
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
%

A
c
t
i
v
i
d
a
d
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0


4- En la figura se muestra el comportamiento de la actividad de una enzima en funcin
del pH. Qu aminocidos del sitio activo seran los responsables del comportamiento
observado? No tenga en cuenta el efecto de la falta de ionizacin causada por el medio
hidrofbico.













5- La actividad de una enzima se determin a diferentes temperaturas obtenindose los
valores que se indican a continuacin.

Temperatura () 0 10 20 25 30 40
Actividad (U/ml) 5 10 21 30 20 10

Cuando la enzima se preincub a cada una de las temperaturas anteriores y su
actividad se ensay a la temperatura ptima se obtuvieron los mismos valores de
velocidad, excepto para las alcuotas de enzima provenientes de la incubacin a 30C y
40C , las que fueron significativamente menores. Con los datos anteriores, indique:
a) Cul es la temperatura ptima de reaccin? b)Por qu la actividad enzimtica
cuando se ensay a la temperatura ptima no fue constante para todas las muestras
previamente incubadas a distintas temperaturas?

6- La K
m
para el etanol de la alcohol deshidrogenasa de levadura es de 1,3.10
-2
M. Si la
concentracin de alcohol en el medio de reaccin es de 59,2 g/ml qu proporcin de
enzima estar libre y que proporcin estar combinada con el sustrato?, cuando la
velocidad de reaccin sea igual a V
max
,qu valores tomarn estas proporciones?

7- Calcular qu velocidad se obtendr en una reaccin enzimtica si la velocidad
mxima es igual a 100 mol/min y la concentracin de sustrato es a) 10 K
m
y b) K
m
/3.

8- Calcular qu concentracin de sustrato expresada en funcin de la K
m
nos dar una
velocidad de reaccin enzimtica igual al 60 % de la V
max
.

9- Una disolucin al 1% de almidn se digiere a pH 6,7 mediante 15 g de amilasa (PM
=152000). La velocidad inicial mxima de liberacin de maltosa es de 8,5 mg/min.
Calcular el nmero de recambio de dicha enzima.

10- Una enzima tiene un peso molecular de 60000 y 6 sitios activos por mlecula. La
velocidad inicial de la reaccin que cataliza es 12 moles de sustrato cada 12 min en
15
presencia de 18 g de enzima. Calcule la actividad molecular por centro cataltico de la
enzima.

11- Los datos de velocidad y concentracin que se muestran en la tabla se obtuvieron
para una enzima que cataliza una reaccin S P.
a- Calcular K
m
y V
mx
.
b- Comprobar que la enzima sigue una cintica de saturacin hiperblica


[Sustrato]
M
velocidad
nmol/l.min
2,5 10
-6
24
3,3 10
-6
30
4,0 10
-6
34
5,0 10
-6
40
1,0 10
-5
60
2,0 10
-5
80
4,0 10
-5
96
1,0 10
-4
109
2,0 10
-3
119
1,0 10
-2
120

12- Una enzima con un K
m
de 2,4 10
-4
M se ensay con las siguientes concentraciones
de sustrato: (a) 2,0 10
-7
M, (b) 6,3 10
-5
M, (c) 1,0 10
-4
M, (d) 2,0 10
-3
M y (e) 5,0 10
-2
M.
La velocidad observada a 5,0 10
-2
M fue de 128 nmol/l/min. Calcular las velocidades
iniciales con las otras concentraciones de sustrato.

13- Si la concentracin de enzima del problema anterior se aumentara 5 veces, cul
sera la velocidad inicial a cada una de las concentraciones dadas? y si se aumentara
la concentracin de sustrato cinco veces?

14- Se hicieron diez mezclas de reaccin. Cada una contena la misma concentracin
de enzima, a varias concentraciones de sustrato, y las velocidades iniciales se
determinaron como se muestra en la tabla. Utilizando la ecuacin de Lineweaver-Burk,
determine grficamente el K
m
y la V
mx
. Observe que uno de los factores crticos en la
exactitud de esta determinacin son las escalas seleccionadas para la ordenada y la
abcisa. Cules son los intervalos de concentraciones de sustrato son ms tiles para
estas determinaciones?
[Sustrato]
M
velocidad
nmol/min
[Sustrato]
M
velocidad
nmol/min
1,0 10
-3
65,0 2,0 10
-5
27,0
5,0 10
-4
63,0 1,0 10
-5
17,0
1,0 10
-4
51,0 5,0 10
-6
9,5
5,0 10
-5
42,0 1,0 10
-6
2,2
3,0 10
-5
33,0 5,0 10
-7
1,1

15- Se hicieron varias mezclas de reaccin que contenan concentraciones iguales de
una enzima, a las concentraciones de sustrato indicadas en la tabla y se determinaron
las velocidades de reaccin iniciales. Utilizando la ecuacin de Eadie-Hofstee, (v =
f(v/S)determine grficamente la K
m
y la V
mx
. Cul es la ventaja de este tipo de grfica
sobre la de Lineweaver-Burk?
16

[Sustrato]
M
velocidad
nmol/min
4,0 10
-4
130,0
2,0 10
-4
110,0
1,0 10
-4
89,0
5,0 10
-5
62,0
4,0 10
-5
53,0
2,5 10
-5
38,0
2,0 10
-5
32,0

16- Dos estudiantes A y B aislaron independientemente la enzima lactato
deshidrogenasa de msculo de caballo que cataliza la reduccin de piruvato siguiendo
los mismos pasos de purificacin. Una vez obtenida una solucin concentrada de
enzima midieron actividad en funcin de la concentracin de sustrato obteniendo los
siguientes datos:

Sustrato] (M) 2,0 10
-6
5,0 10
-6
1,0 10
-5
5,0 10
-5
1,0 10
-4
2,0 10
-4
1,0 10
-3
V
A
mol.min.mg
-1
16 33 50 83 90 95 100
V
B
mol.min.mg
-1
25 50 75 125 136 143 150

a- Sin graficar haga una estimacin aproximada de K
m
y V
mx
observando los datos de
A y B. J ustifique.
b- Intente una explicacin para la discrepancia observada entre los parmetros
cinticos de A y B.
c- Qu variables graficara para obtener K
m
y V
mx
. J ustifique.

17- A partir de un experimento de inhibicin se obtuvieron los datos de la tabla. Median-
te una grfica de Lineweaver-Burk. Determine si el compuesto en estudio es un inhibi-
dor competitivo o no competitivo. Determine Ki (la concentracin del inhibidor es 1M)

[ Sustrato ]
(moles/l)
v sin inhibidor
(mol/min)
v con inhibidor
(mol/min)
0,50.10
-4
0,42 0,17
0,67.10
-4
0,50 0,20
1,00 10
-4
0,60 0,24
1,30 10
-4
0,66 0,27
2,70 10
-4
0,80 0,32
5,30 10
-4
0,88 0,36

18- Calcule el K
m
y la V
mx
de la enzima E y de la enzima E en presencia del compuesto
I a partir de los datos que se indican en la siguiente tabla:

[S] (mM) 0,100 0,125 0,250 0,500 0,750 1,000
v
control
(U/mg) 0,154 0,185 0,250 0,345 0,370 0,400
v
con inhibidor
(U/mg) 0,065 0,081 0,133 0,217 0,263 0,294

Indique qu tipo de inhibidor es el compuesto agregado.

17
19- Sobre una enzima que cataliza la reaccin S P se prueba el efecto de dos inhibi-
dores X e Y obtenindose los datos de velocidad que se muestran en la tabla. Determi-
nar qu tipo de inhibidor es cada uno de ellos. Calcule K
m
y V
mx
.

[S] (mM) sin agregado [x]=12M [I]=60M
2,00 66,67 40,00 22,22
2,50 71,40 45,45 23,81
3,33 76,92 52,63 25,64
4,00 80,00 57,14 26,67
5,00 83,33 62,50 27,77
Los datos de velocidad de estn expresados en U/ml.

20- El salicilato inhibe la accin cataltica de la glutamato deshidrogenasa
a) Determine el tipo de inhibicin mediante el anlisis grfico de los datos de la tabla. b)
Calcule la K
m
para el sustrato.
Suponga que la concentracin de salicilato se mantiene constante y es de 40 mM.

[Sustrato]
(mM)
V (mg de producto/min)
sin salicilato con salicilato
1,5 0,21 0,08
2,0 0,25 0,10
3,0 0,28 0,12
4,0 0,33 0,13
8,0 0,44 0,16
16,0 0,45 0,18

21- A partir de los siguientes datos obtenidos al estudiar el efecto de un inhibidor sobre
una reaccin enzimtica, determine el tipo de inhibicin y la K
m
para el sustrato.

[Sustrato]
(mM)
V (g de producto/min)
[inhibidor] =0mM [inhibidor]=6mM
2,0 139 88
3,0 179 121
4,0 213 149
10,0 313 257
15,0 370 313

22- Se determinaron los parmetros cinticos de una enzima en ausencia y en
presencia de una serie de compuestos, algunos de los cuales se supone podran ser
inhibidores de la misma. Los resultados obtenidos con la enzima sin agregados se
detallan en la tabla 1. En la tabla 2 se presentan los valores de V
mx
y de K
m
obtenidos
en presencia de los compuestos en estudio.
a- Calcule los valores de V
mx
y de K
m
a partir de los datos de la tabla 1.
b- Indique qu tipo de inhibidor es cada uno de los compuestos agregados.

TABLA 1
[S]
(M)
Act.
(mol/min/mg)
2,0 0.029
2,5 0.032
18
3,3 0.037
5,0 0.043
10,0 0.053
50,0 0.063
100,0 0.063

TABLA 2
V
max
(mol/min/mg) Compuesto K
m
(M)
0,033 A 2,5
0,065 B 5,0
0,064 C 2,4
0,033 D 1,3

23- Al estudiar el efecto de una serie de compuestos sobre la enzima hexoquinasa
(Glc + ATP Glc-6-P + ADP) se observ que es inhibida por piruvato. La tabla
muestra los valores de actividad en mol/min obtenidos cuando se vara la
concentracin de sustrato y/o de piruvato.

[I] (mM) [S]=1,00 mM [S]=1,82 mM [S]=2,50 mM [S]=10,00mM
0,0 1,25 2,00 2,50 5,00
0,2 0,83 1,33 1,67 3,33
0,4 0,63 1,00 1,25 2,50
0,6 0,50 0,80 1,00 2,00
0,8 0,42 0,67 0,83 1,67
1,0 0,36 0,57 0,71 1,43
En base a estos datos indique:
a- qu tipo de inhibidor es piruvato
b- el valor de K
m

c- el valor de V
mx

d- el valor de K
i
.

24- Para estudiar el efecto de una serie de compuestos sobre la actividad de una
enzima se incuba la misma con los mismos durante 5 min. Luego se agrega el sustrato
en la misma cubeta y se determina la velocidad inicial de la reaccin. Se obtienen los
siguientes resultados:


Preincubacin
con
V
i
(M/min)
- 10,10
A 12,5
B 9,8
C 5,30
D 0,50

Qu efecto ejerce c/u de los compuestos sobre la enzima? Cmo puede determinar
si la interaccin en cuestin es reversible o irreversible?

25- Se ha determinado que dos compuestos B y C son inhibidores irreversibles de la
enzima E. Con el objeto de caracterizar la inactivacin se realiz lo siguiente:
19
a- Se incub la enzima con distintas concentraciones del compuesto en estudio durante
distintos tiempos.
b- Se tom una alcuota de la mezcla anterior y se midi la actividad enzimtica. Se
obtuvieron los siguientes resultados:

CONTROL
Tiempo (min) V
i
(U/ml)
0 1,89
1 1,87
2 1,90
5 1,88
10 1,86
20 1,89

COMPUESTO B

[B]=20M
t (min)V
i
(U/ml)
[B]=30M
t (min)V
i
(U/ml)
[B]=50M
t (min)V
i
(U/ml)
[B]=70M
t (min)V
i
(U/ml)
[B]=100M
t (min)V
i
(U/ml)
1 1,78 1 1,74 1 1,63 1 1,55 1 1,47
5 1,34 5 1,25 2 1,40 2 1,23 2 1,17
10 0,98 10 0,83 5 0,89 5 0,72 5 0,57
15 0,70 12 0,57 7 0,65 7 0,49 7 0,36
20 0,50 20 0,37 10 0,41 10 0,26 10 0,17

COMPUESTO C

Tiempo
(min)
V
i
(U/ml)
[C]=5M
V
i
(U/ml)
[C]=10M
V
i
(U/ml)
[C]=20M
V
i
(U/ml)
[C]=50M
V
i
(U/ml)
[C]=100M
V
i
(U/ml)
[C]=200M
0,5 1,68 1,59 1,55 1,51 1,47 1,45
1,0 1,47 1,34 1,29 1,21 1,15 1,13
2,0 1,17 0,96 0,89 0,76 0,72 0,66
3,0 0,89 0,68 0,60 0,49 0,44 0,41
4,0 0,72 0,49 0,42 0,32 0,27 0,25

De acuerdo a los datos obtenidos qu mecanismo de inactivacin puede postularse
para cada uno de los compuestos? Calcule las constantes de velocidad y de equilibrio
involucradas.

26- La accin teraputica de la mayora de las drogas actualmente utilizadas est
basada en la inhibicin que estas causan sobre determinadas enzimas. La
quimioterapia moderna tuvo sus comienzos con el uso de las sulfas, compuestos que
han sido ampliamente usados para tratar infecciones bacterianas. Las bacterias no
pueden absorber cido flico (AF) del medio y deben sintetizarlo ya que este
compuesto es escencial para el crecimiento celular porque es una coenzima de
diversas vas metablicas. La sntesis de AF involucra una serie de reacciones, entre
ellas la catalizada por la enzima dihidropteroato sintetasa (DHPT STasa). La accin de
las sulfas se basa en que inhiben la DHPT STasa y la bacteria queda privada de AF no
pudiendo crecer y dividirse. Ya que las clulas del individuo infectado obtienen AF de la
dieta (el AF es vitamina para el hombre) la sulfa no es txica en las dosis usadas. Al
20
estudiar el efecto de la dimetilsulfanilamida (DMSF) sobre la actividad de la DHPT
STasa se obtuvieron los siguientes resultados:
i- La incubacin de la enzima con DMSF, seguida de dilisis por 6 horas no afect la
actividad enzimtica.
ii- El ensayo de actividad usando concentraciones variables de PABA (el otro sustrato
se mantiene fijo y saturante) y diferentes concentraciones de DMSF resultaron los
valores de velocidad que muestran en la tabla.

[PABA]
(mM)

[DMSF] =0
Velocidad (U/mg)
[DMSF] =16 M

[DMSF]=50 M
0,10 1,67 1,00 0,60
0,15 2,00 1,25 0,70
0,20 2,50 1,67 1,00
0,40 3,33 2,50 1,67
0,80 4,00 3,33 2,50

En base a estos datos:
a- Determine qu tipo de inhibidor es DMSF y postule el modelo de inhibicin
correspondiente.
b- Determine el K
m
para PABA, la V
max
de la DHPT STasa y el K
i
para DMSF.
c- Indique si los niveles de PABA en la clula bacteriana afectan la efectividad de la
sulfa como medicamento. J ustifique la respuesta.

27- Se estudia el efecto de un compuesto I sobre la actividad de una enzima. Para ello
se midi la actividad de la enzima preincubada a distintos tiempos con distintas concen-
traciones del compuesto obtenindose los resultados de la tabla:
[I]=1M [I]=2M [I]=5M [I]=10M
t (min) V
i
/V
0
t (min) V
i
/V
0
t (min) V
i
/V
0
t (min) V
i
/V
0

0 1,00 0 1,00 0 1,00 0 1,00
2 0,92 2 0,86 1 0,83 1 0,69
4 0,85 4 0,75 2 0,68 2 0,47
10 0,68 10 0,50 4 0,45 3 0,32
15 0,56 15 0,35 7 0,25 4 0,22
20 0,46 20 0,24 10 0,45 5 0,15
a- Calcular las constantes de pseudo primer orden k.
b- A partir del anlisis del comportamiento de k en funcin de [I] de los resultados obte-
nidos, indique qu mecanismo puede postular para la inhibicin.

28- Se estudia el efecto de un compuesto I sobre la actividad de una enzima. Para ello
se midi la actividad de la enzima preincubada a distintos tiempos con distintas concen-
traciones del compuesto obtenindose los resultados de la tabla:

[I]=1M [I]=2M [I]=4M [I]=8M [I]=14M
t (min) V
i
/V
0
t (min) V
i
/V
0
t (min) V
i
/V
0
t (min) V
i
/V
0
t (min) V
i
/V
0

0 1,00 0 1,00 0 1,00 0 1,00 0 1,00
1 0,95 1 0,90 1 0,80 1 0,65 1 0,56
2 0,91 2 0,80 2 0,69 2 0,40 2 0,30
4 0,82 4 0,63 4 0,46 3 0,25 3 0,10
9 0,64 9 0,34 9 0,17 4 0,06 4 0,005
14 0,50 14 0,19
21

a- Calcular las constantes de pseudo primer orden k.
b- A partir del anlisis del comportamiento de k en funcin de [I] de los resultados obte-
nidos indique que mecanismo puede postular para la inhibicin.

29- Una de las enzimas ms importantes de la va de biosntesis de cido flico (coen-
zima indispensable en la sntesis de purinas y pirimidinas) es la dihidrofolato reductasa.
Se purific esta enzima a partir de leucocitos humanos obtenindose un extracto alta-
mente purificado (concentracion de protena: 0,1 mg/ml ) al que se le midi la actividad
espectrofotomtricamente ( Coeficiente de extincin: 6220 M
-1
cm
-1
) empleando distintos
volmenes del mismo (1 l, 2 l y 3 l) en una cubeta de reaccin de 1 ml y 1 cm de
camino ptico. Se obtuvieron las variaciones de absorbancia en el tiempo que se
muestran a continuacin:

Explique las formas de las curvas observadas en
los distintos ensayos. Cul elige para calcular la
actividad de la enzima y por qu? Calcule la acti-
vidad especfica de la enzima purificada.
El metotrexato se emplea en el tratamiento de ni-
os con leucemia, ya que se trata de un potente
inhibidor de la enzima mencionada. Con el objeto
de conocer cul es el mecanismo de inhibicin se
ha determinado la velocidad de reaccin de la en-
zima a distintas concentraciones de sustrato en
presencia de distintas concentraciones del inhibi-
dor obtenindose los resultados que se indican en
la tabla.

[S] mM v (nM/min)
[I]=0
v (nM/min)
[I]=0.2 nM
v (nM/min)
[I]=0.4nM
v (nM/min)
[I]=0.6nM
0,1 1,25 0,83 0,58 0,50
0,2 2,00 1,42 1,04 0,91
0,4 2,86 2,22 1,72 1,54
0,8 3,63 3,07 2,56 2,35
1,2 4,00 3,53 3,05 2,85
1,6 4,21 3,81 3,38 3,20
2,0 4,35 4,00 3,62 3,44
2,4 4,44 4,14 3,79 3,63

Indique cul es el mecanismo de inhibicin, calcule el K
i
para el metotrexato. Consi-
dera que el nivel de dihidrofolato en la clula es capaz de alterar el efecto del meto-
trexato?

30- La hidroxiurea (U-OH) es un medicamento utilizado para el tratamiento de tumores.
El uso de esta droga est basado en que es un inhibidor reversible de la enzima ribo-
nucletido reductasa (RRasa), la que cataliza la sntesis de deoxirribonucletidos
(dNDP) a partir de los ribonucletidos (NDP) correspondientes segn la reaccin:
NDP +tiorred red dNDP +tiorred ox
As, la U-OH inhibe la proliferacin de clulas tomorales ya que disminuye considera-
blemente la sntesis de los dNDP necesarios para la replicacin del DNA. Al estudiar la
inhibicin reversible de la U-OH sobre la RRasa se midi actividad enzimtica a con-
Tiempo (s)
0 20 40 60 80 100 120 140
V
a
r
i
a
c
i
o
n

d
e

a
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
22
centraciones variables de NDP (el otro sustrato se mantuvo fijo y saturante) en ausen-
cia o presencia del inhibidor.

[NDP]
(M)

[U-OH] =0
Velocidad (U/mg)
[U-OH] =4 M

[U-OH]=12 M
6,25 0,80 0,40 0,20
8,30 1,00 0,50 0,25
12,50 1,33 0,67 0,33
25,00 2,00 1,00 0,50

Esta tabla muestra los resultados obtenidos. En base a ellos:
a- Determine que tipo de inhibidor es U-OH, indicando el modelo de la reaccin de in-
hibicin.
b- Determine K
m
y V
max
para NDP de la RRasa y el K
i
para U-OH.
c- Indique si los niveles de NDP en la clula tumoral afectan la efectividad de la U-OH
como medicamento. J ustifique su respuesta.

31- El compuesto I es un inhibidor irreversible de la enzima E. Se preincub E con dis-
tintas concentraciones de I tomndose, a distintos tiempos muestra en las que se de-
termin la actividad residual. A todas las concentraciones de I ensayadas se observ
un decaimiento exponencial simple de la actividad, lo que permiti calcular las constan-
tes de pseudo-primer orden (k
obs
) mostradas en la tabla. En base a estos datos postule
un mecanismo para la inactivacion observada y calcule las constantes cinticas y/o de
equilibrio correspondientes.

[I] (M) k
obs
(min
-1
)
2,5 0,050
3,3 0,067
5,0 0,100
10,0 0,200
20,0 0,400

32- Se estudi el efecto de un medicamento sobre la actividad de una enzima oli-
gomrica. Para este estudio se midi actividad de la enzima frente a este reactivo, ob-
tenindose los siguientes resultados:
Concentracin de sus-
trato (mM)
Velocidad control (U/ml) Velocidad frente a reac-
tivo 1 mM (U/ml)
0,2 2,0 0,02
0,3 2,9 0,08
0,4 3,8 0,3
0,8 7,4 3,9
1,0 9,1 9,1
5,0 33 98
10,0 50 99
Explique como acta este medicamento y que efecto produce sobre la actividad de la
enzima. Se podra utilizar en terapias, suponiendo que los productos de la actividad
enzimtica son cancergenos? (Se sabe que la concentracin intracelular de sustrato
es aproximadamente 9 mM).
Por otro lado se tomaron 0,2 ml de solucin de enzima y se la incub con un inhibidor
reversible. Se dej pasar el tiempo que aparece en la tabla, se tom una alcuota de
23
0,02 ml y se midi actividad enzimtica en 1 ml de un medio adecuado. Lo mismo se
hizo con otros 0,2 ml, pero en presencia de otro inhibidor, en este caso irreversible.
Anote en la tabla siguiente (con nmeros arbitrarios) los valores esperados de actividad
enzimtica, sabiendo que la actividad de la enzima no inhibida a tiempo 0 es 5 U/ml.
1 min 3 min 5 min 10 min
Inh reversible
Inh irreversible

33- Los siguientes datos se obtuvieron para una reaccin catalizada enzimticamente.
Determinar si la enzima sigue una cintica hiperblica o sigmoidea y calcular o estimar
las constantes cinticas apropiadas ( K
m
y V
max o
o K', [S]
0,5
, n
ap
y V
max
)

Concentracin inicial de sustra-
to (M 10
-4
)
Velocidad inicial
( mol l
-1
min
-1
)
6,25 1,54
12,5 5,88
25,0 20,00
50,0 50,00
100,0 80,00
200,0 94,12
400,0 98,46
800,0 99,61


34- Cul es el valor de n
ap
de una enzima si [S]
0,9
/[S]
0,1
es 9?

35- Calcular la proporcin [S]
0,9
/[S]
0,1
de una enzima alostrica en el que n
ap
=4.

36- Ud. est caracterizando el efecto de un frmaco X sobre una enzima clave de un
camino metablico. En la tabla se muestra el efecto de la concentracin de sustrato so-
bre la actividad en presencia y en ausencia del frmaco X. Sabiendo que la concentra-
cin intracelular de sustrato de la enzima es 0,5 mM, describa el efecto del frmaco y
calcule los parmetros cinticos de la enzima en presencia y en ausencia de X.

Sustrato
(mM)
Control
(U/mg)
Frmaco X
(U/mg)
0,0 0,0 0,0
0,1 2,85 0,05
0,2 4,90 0,23
0,4 7,60 1,02
0,8 10,50 4,00
1,0 11,40 5,70
2,0 13,70 12,00
4,0 15,20 15,70




RESPUESTAS:
1- consultar clases de teora
2- ver curvas de actividad y de estabilidad enzimticas
24
3- a) Un residuo de His no protonado (pK
a
=6) y un grupo oamino terminal protona-
do (pK
a
alrededor de 8) o un grupo sulfidrilo (pK
a
=8,1), necesarios para la acti-
vidad enzimtica, seran los responsables, respectivamente, de las partes as-
cendentes y descendentes de la curva. b) Cristalografa de rayos X c) Un medio
no polar suprime la ionizacin de los grupos cargados. Tal efecto podria elevar el
pKa del grupo carboxilo del Asp a pH 6
4- ver aminocidos cuyos pKa de grupo R estn entre 6 y 8.
5- dem respuesta preg. 2
6- 9 % combinada, 91 % libre; 100 % combinada
7- a) 91 mol/min
b) 25 mol/min
8- [s]=1,5 Km
9- 253.333 min
-1
o 4168 s
-1

10- 555 min
-1
o 9 s
-1

11- Km =1,0 x 10
-5
M; Vmx=120 nmol/l/min
12- a) 0,1 mmol/l/min; b) 27 mmol/l/min; c) 38 nmol/l/min; d) 114 mmol/l/min
13- a) 0.5 mmol/l/min; b) 73 mmol/l/min; c) 86 mmol/l/min; d) 125 mmol/l/min; e) au-
mentara 5 veces la V
0.

14- 0,33 S <Km < 2,0 S
15- Km=7,5 x 10
-5
M; Vmx=154 nmol/min. La grfica de Eadie-Hofstee puede
desplazar los datos en un intervalo mayor de concentraciones de sustrato. De este
modo, los datos que se presentan lineales en una grfica de Lineweaver-Burk, al-
gunas veces exhiben desviaciones significativas de la linealidad con la grfica de
Eadie-Hofstee.
16- consultar teora
17- Km= 0,67 x 10
-4
moles/l; Vmx= 0,99 mol/min; Km
i
= 0,68 x 10
-4
moles/l;
Vmx
i
=0,40 mol/min; Inhibidor no competitivo
18- Km=0,21 mM; Vmx=0,48 U/mg; Km
i
=0,63 mM; Vmx
i
=0,48 U/mg; Competiti-
vo.
19- Km=1 mM; Vmx=100 U/ml; Km
x
=3 mM; Vmx
x
=100 U/ml; Km
y
=1 mM;
Vmx
y
=33 U/ml; x competitivo; y no competitivo.
20- a) Inhibidor no competitivo
b) Km=2,4 mM
21- Inhibidor competitivo
Km=5,2 mM
22- a) Km=2,55 M; Vmx=0,065 mol/min/mg
b) A: no competitivo
B: competitivo
C: no tiene efecto
D: acompetitivo
23- a) no competitivo
b) Km=5 mM
c) Vmx=7,5 mol/min
d) K
i
=0,385 mM
24- ver clases de teora
25- B: mec. 1; C: mec 2
B: K
1
=3 10
-3
M; C: K
i
=5 M, K
2
=0,54 min
-1

26- a) competitivo
b) Km=0,21 mM; Vmx=5,26 U/mg; K
i
=16,5 M
c) Afecta
27- k
1
=0,038 M; mecanismo 1
25
28- k
1
=0,053 M
29- Competitivo; K
i
=0,25 nM
30- a) no competitivo
b) Km=26 M, Vmx=4 U/mg, K
i
=3,9 M
c) no afecta
31- Mec n 1 k
1
=0,02 M
32- El medicamento produce un cambio en la cintica de la enzima, convirtindola
de hiperblica en sigmoidea. No se podra utilizar ya que a la concentracin intracelular
de sustrato la velocidad de formacin de producto es mayor con el reactivo que sin el.
Inh reversible: (arbitrario) 5,5,5,5
Inh irreversible: (arbitrario) 4,3,2,1
33- K=25 mM, Vmx=100 mol/l/min, [S]
0,5
=5 mM
34- 2
35- 3
36- El frmaco produce un cambio en la cintica de la enzima, convirtindola de
hiperblica en sigmoidea.
Sin frmaco: V
max
=18,2 U/mg; K
m
= 0,59 mM.
Con frmaco: n
ap
=2 ; [S]
0,5
=1,58 mM ; K=2,51 mM



Grficas de Lineaweaver Burk



Inhibidor reversible competitivo



Inhibidor reversible no competitivo

Inhibidor reversible acompetitivo
26









Grficas de Dixon Grficas de Cornish-Bowden








27










Inhibicin irreversible