S.

aureus (Bird-Parker Agar)

06/03/2014

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio.

Un medio de cultivo es material alimenticio en el que crecen los microorganismos. Este, adems de los nutrientes, debe reunir una serie de condiciones como la temperatura, el grado de humedad, la presin de oxgeno y la acidez o alcalinidad adecuados para su ptimo crecimiento. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. En cambio la Gelatina, otro agente solidificante, se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de carbono se adicionan para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y

no de otras. Un ejemplo es el Rojo Fenol que se usa como indicador, ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram-positivas.

Agua Bases nutritivas

Carbohidratos Sales Minerales Factores de crecimiento Otros

Peptonas, hidrolizados y digeridos Extractos, infusiones y dializados Azcares Almidones Otros Macroelementos: fsforo, azufre, sodio, cloro, hierro Microelementos: zinc, cobre Vitaminas Protenas Otros Colorantes e indicadores Antibiticos y lpidos

Estado fsico Naturales o complejos

Lquidos, solidos, semislidos Sustancias de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adicin de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos. Son los medios que tienen una composicin qumica definida cualitativa y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigacin.

Definidos o sintticos

Generales

Medios no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con sangre, suero, hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc). Formulas de moderada o de alta selectividad a las que se aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias y permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Una caracterstica importante es que se pueden variar las sustancias aadidas, el tipo y grado de selectividad del medio (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina). Medios diseados para retardar o suprimir el crecimiento de la flora competitiva normal y para potenciar el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K). Formulas nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos especficos de bacterias, ayudando a su identificacin (Lowenstein). Medios de cultivo especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiolgicas (nutricin y respiracin sobre todo) especficas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria (Oxidacin-Fermentacin).

Selectivos

Enriquecidos

Especializados

Diferenciales

AGAR SANGRE: Medio enriquecido estndar AGAR POLIVITEX (chocolate): Medio enriquecido para bacterias que no crecen en medios habituales y para atmsfera de CO2 MAC CONKEY: Selectivo para BGN. Lactosa+indicador MULLER-HINTON: medio slido estndar para antibiogramas con discos por difusin MULLER-HINTON/SANGRE : ATB bacterias que requieran sangre (Neumocos, Streptococos) MULLER-HINTON/CHOCO : ATB microorganismos que requieran factores (Haemophilus) THAYER-MARTIN: selectivo Neisserias patg. (N. lactamica, Gonococos/Meningococos) para atmsfera de CO2 SAB + Cloranfenicol y Actidione : Selectivo hongos patgenos TIOGLICOLATO: Medio lquido XLD: Selectivo Salmonella y Shigella SCHAEDLER: medio bsico enriquecido con sangre. Para ANA

SABOURAUD: Cultivo de hongos (incubar a T ambiente y a 37 C) TREE SUGAR-IRON: tubo en pico flauta (base larga, pico corto), para estudiar Oxid/Ferm de Gluc-Lact-Sac, produccin gas y SH2 CZAPEK: Medio para Hongos. Identificacin de Aspergillus SALMONELLA-SHIGELLA: medio altamente selectivo para Salmonella y Shigella SELENITO : Medio lquido de enriquecimiento selectivo para Salmonella-Shigella GARDNERELLA: Selectivo Gardnerella vaginalis. Contiene sangre humana para valorar hemlisis KANA-VANCO: Con Kanamicina y Vancomicina. Selectivo para Bacteorides y otros BGN anaerobios. Para atmsfera ANA CLED: Medio de recuento urinario. Indicador de fermentacin de Lactosa CIN: Selectivo Yersinia CAMPY: Medio para Campylobacter BBE: Bacteroides Bilis Esculina. Selectivo para Bacteorides. Para atmsfera ANA OXIDACION/FERMENTACION (GLUCOSA) : Estudio de utilizacin de Glucosa por los BGN

1. 2. 3. 4. 5.

NORMAS GENERALES Elegir el material que refleje el proceso patolgico. Evitar contaminacin con la flora del paciente. Obtener volumen suficiente para observacin microscpica y cultivo. Obtener la muestra, si es posible, antes de iniciar la terapia antimicrobiana. Transportar la muestra rpidamente al laboratorio.

Recogida

Volumen de la muestra Transporte Conservacin

Observaciones

HEMOCULTIVOS Desinfectar zona de extraccin con alcohol 70% y despus con alcohol yodado o povidona yodada. Esperar 1 minuto. Desinfectar los tapones de los frascos de hemocultivos con alcohol 70%. Cada toma supone 2 frascos: uno aerobio y otro anaerobio. Extraccin deseable en picos febriles. En general, 3 tomas espaciadas en 24 horas. En urgencia, 3 tomas cada 15 minutos de venas diferentes. En FOD, 6 tomas en 48 horas. Adultos y nios: 6-10 ml (3-5 ml por frasco). Neonatos: 2ml Envo al laboratorio lo antes posible. Mantener a 35-37C hasta su envio, si no es posible, a temperatura ambiente. Nunca refrigerar ni congelar. No son adecuadas las extracciones a travs de catteres y cnulas intravasculares. La relacin ideal de sangre: caldo de cultivo es de 1:10 a fin de diluir las sustancias bactericidas del suero.

Recogida

Volumen de la muestra Transporte Conservacin Observaciones

ORINA Limpieza de genitales, miccin espontnea. Parte media de la miccin. Sondaje, puncin suprapbica. Si se utiliza bolsa de plstico adhesiva, no se mantendr la misma ms de 30 minutos. La primera orina de la maana es la ms adecuada. 5-10 ml. Plazo no superior a 1 hora. A 4C, un mximo de 24 horas. Debe tenerse en cuenta las frecuentes contaminaciones. En general < 50000 colonias/ml de orina y ms de tres grmenes encontrados indican que la orina est contaminada. La investigacin de anaerobios debe hacerse en orinas obtenidas por puncin suprapbica. HECES Heces recin emitidas, eligiendo las zonas que contengan sangre, moco o pus. Heces formadas o pastosas: al menos 2 g. Heces lquidas: 5-10 ml. Enviarse en un perodo inferior a 30 minutos. Si no es posible, se utilizar medio de transporte que ser facilitado por el Servicio de Microbiologa. Heces preparadas con medio de transporte se mantendrn en nevera (4C) hasta su envo, no debiendo superar las 12-18 horas. Son inadecuadas las heces contaminadas con orina. La relacin ideal de medio de transporte y muestra es: 10 ml por gramo de heces.

Recogida Volumen de la muestra Transporte

Conservacin

Observaciones

Recogida

Volumen de la muestra Transporte Conservacin Observaciones

ESPUTOS Expectoracin voluntaria profunda. Procedimientos especiales. Mejor muestra, la matutina. Recipiente estril. 5-10 ml, si es posible. Antes de 2 horas desde la obtencin. En nevera (4C) hasta su procesamiento. Presencia de clulas epiteliales en el esputo equivale a contaminacin farngea. A todas las muestras se les efecta control de calidad por observacin microscpica.

HERIDAS, QUEMADURAS, ULCERAS Recogida Lavar cuidadosamente la superficie de la lesin. Aspirar con jeringa de la zona profunda. Si se realiza con hisopo, cargarlo bien de material purulento de la zona profunda siendo conveniente el envo de dos hisopos. Aspiracin: 1-10 ml. Hisopo: la mxima cantidad posible Antes de 2 horas. En caso de demora: Para aislamiento de aerobios refrigerar (4C). Para aislamiento de anaerobios enviar una segunda toma y mantenerla a temperatura ambiente. La recogida con hisopo no es muy eficiente sobre todo si no lleva medio de transporte.

Volumen de la muestra Transporte Conservacin

Observaciones

EXUDADOS Recogida Nasal: hisopo flexible de alginato o dacrn. Farngeo: hisopo convencional. tico: hisopo de pequeo tamao. Conjuntival: hisopo alginato clcico pequeo o dacrn. Vaginal: hisopo alginato clcico o dacrn. Uretral: hisopo especial. La mxima cantidad posible. Es conveniente el envo de 2 hisopos. Por regla general, debe ser inmediato. Todos los hisopos pueden mantenerse en medio de transporte a temperatura ambiente, salvo los farngeos que se conservarn en refrigeracin (4C). Muestra nasal est indicada para estudio de portadores de S. aureus y estudio de B. pertutis. En muestras farngeas, evitar el contacto del hisopo con mucosa oral, lengua o vula. Muestras ticas se tomarn a travs del otoscopio estril o procedimientos especiales. Muestra conjuntival debe obtenerse antes de aplicar anestsicos locales, colirios o antibiticos. Muestras vaginales y uretrales en medio de transporte, se mantendrn a 35-37C. Muestras uretrales deben tomarse, como mnimo, 1 hora despus de la ltima miccin

Volumen de la muestra Transporte Conservacin

Observaciones

CATETERES Recogida Desinfectar la zona de piel correspondiente a la entrada del catter con alcohol 70%, despus con alcohol yodado o povidona yodada, esperar un minuto. Retirar el catter con la mxima asepsia. Con pinzas y tijeras estriles, cortar los 5 cm distales del catter que corresponden a la zona intravascular. Introducirlo en frasco estril. 5 cm de la porcin ms distal. Envo antes de 30 minutos. Mantener en nevera a (4C) el menor tiempo posible. Las sondas de Foley no deben enviarse, salvo que se quiera comprobar la esterilidad de las no utilizadas. ABSCESOS Recogida Volumen de la muestra Transporte Conservacin Desinfectar la piel con alcohol 70%, despus con alcohol yodado o povidona yodada. Esperar un minuto. 5-10 ml. Inmediatamente, una vez se haya expulsado el aire del interior de la jeringa y pinchado la aguja en un tapn de goma estril. Inyectar 1-5 ml de la muestra en medio de transporte para anaerobios, dejndolo a temperatura ambiente. Inyectar una parte de la muestra en un frasco de hemocultivo anaerobio y mantener a 35-37C o a temperatura ambiente. Aunque sea posible el uso de hisopos, debe evitarse. Los tapones de goma estril los suministrar el Servicio de Microbiologa.

Volumen de la muestra Transporte Conservacin Observaciones

Observaciones

LCR Recogida Volumen de la muestra Transporte Conservacin Puncin lumbar. Estricta asepsia. 1-10ml. En tubos estriles, antes de 30 minutos. Si no es posible el envo, debe: Mantener a 35-37C. Parte del L.C.R. puede inyectarse en un frasco de hemocultivo y mantener a 35-37C o a temperatura ambiente de no disponer estufa. Nunca refrigerar ni congelar. SANGRE (SEROLOGIA) Recogida Volumen de la muestra Transporte Conservacin Observaciones Extraer sangre perifrica en tubo vacutainer de tapn rojo (suero) o de tapn verde (plasma). Como mnimo 5 ml. Tan pronto como sea posible, en el tubo de extraccin. En nevera (4C), evitando la congelacin. LCR para el estudio de antgenos y anticuerpos se conservar en nevera y no en estufa (volumen: 1-3 ml).

Observaciones

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes bsicos o por simple rehidratacin de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, adems de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.

A continuacin se enlistan los materiales que se emplearan en la preparacin de los medios e cultivo: Medio de cultivo deshidratado Cajas de Petri o tubos de ensayo con tapa de rosca Autoclave u olla de presin Matraces Erlenmeyer Balanza granataria Abatelenguas Gasas Algodn Agua bidestilada Papel encerado Mechero Bunsen, estufa o planta de calentamiento Barras magnticas de agitacin (opcional) Cinta testigo Asas bacteriolgicas Guantes de asbesto o carnasa

Despus de tener todo lo anterior a la mano realiza los siguientes pasos: 1. Mide el volumen que cabe en cada caja de Petri (2/3 de su llenado) y multiplicarlo por el nmero de cajas que se van a preparar. 2. Pesar el polvo de medio de cultivo (sobre papel encerado) necesario para el volumen anterior y colocarlo en el matraz que contiene el agua bidestilada. Checar la proporcin en la etiqueta del frasco. 3. Hervir el agar por unos segundos, moviendo constantemente para evitar que se pegue. Al termino colocar tapn de algodn y gasa y sobre ste una tira de cinta testigo. 4. Esterilizar por 15 min a una atmosfera de presin. Sacar el medio de cultivo y en rea estril servir las cajas de Petri antes de que solidifique el medio. 5. Dejar solidificar y guardar en refrigerador hasta ser usadas.

Qu podemos sembrar? Urocultivo, coprocultivo, secreciones conjuntivales o muestras respiratorias. 6. Cuando estn listos los medios de cultivo, en rea estril, realiza el sembrado de la muestra en estra para aislamiento.

7. Etiqueta e incuba a 26C por 18-24 horas. Revisa la morfologa colonial (macroscpica) de la siembra y realiza un frotis de una de las colonias aisladas para determinar sus caractersticas microscpicas.

8. Registra las caractersticas encontradas y con ellas procede a la identificacin de los microorganismos cultivados.

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm http://es.scribd.com/doc/8614571/Manual-de-Medios-de-Cultivo http://www.ecured.cu/index.php/Medio_de_cultivo_(Microbiolog%C3%ADa)