Anda di halaman 1dari 5

Biogenik amina-asetilasi: fungsi tambahan dari N-asetiltransferase dari Fasciola hepatica Siaka 0. AISIEN * dan Rolf D.

WALTER Departemen Biokimia Parasitologi, Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine, Bernhard-Nocht-Strasse 74, 2000 Hamburg 36, Republik Federal Jerman Yang dijelaskan sebelumnya poliamina N-asetiltransferase dari Fasciola hepatica telah diamati memiliki tambahan fungsi, asetilasi amina biogenik. Kegiatan untuk amina biogenik, diamina dan poliamina berada di konstan rasio selama proses pemurnian. Amina biogenik ditemukan menjadi substrat untuk enzim termasuk tyramine, tryptamine,, - phenylethylamine dan histamin, dengan nilai Km dari 0,12 mM, 0,26 mM, 0,30 mM dan 0,76 mM masing-masing. Octopamine, - sebagai substrat, meskipun untuk tingkat yang lebih rendah. PH optimum untuk asetilasi biogenik- mina adalah 7,5, dan CoA adalah inhibitor untuk proses, dengan K, 5,5 # M. N-Asetilasi tampaknya memainkan peran utama dalam metabolisme amina trematoda ini. Kami menganggap bahwa asetilasi merupakan proses dimana parasit menginaktivasi kelebihan amina. pengantar Dalam beberapa cacing parasit, preparat enzim mampu asetilasi diamina (Wittich dan Walter, 1989, 1990), biogenik amina (Isaac et al., 1990, 1991), diamin dan polyamine (Aisien dan Walter, 1992) telah dilaporkan. Enzim ini dianggap memiliki peran Menonaktifkan kelebihan amina sebelum ekskresi. Sampai saat ini, secara umum Dianggap bahwa biogenik-amina dan poliamina asetilasi di cacing parasit, seperti pada mamalia jaringan, yang dikatalisis oleh dua enzim yang berbeda, yakni suatu arylalkylamine N-asetiltransferase dan poliamina N-asetiltransferase masing-masing. Hasil dari penelitian kami ini mengindikasikan sebaliknya. Dalam makalah ini, kami menyajikan data yang menunjukkan bahwa dilaporkan sebelumnya poliamina N-asetiltransferase dari Fasciola hepatica (Aisien dan Walter, 1992) juga bertanggung jawab untukasetilasi biogenik-amina dalam trematoda ini. EKSPERIMEN bahan [1-14C] Asetil-CoA (60 mCi / mmol) dibeli dari Amersham-Buchler, Braunschweig, Jerman. 3,3 '-Diaminodipropylamine (sym-norspermidine) diperoleh dari Aldrich, Steinheim, Jerman. Biru Sepharose CL 6B adalah produk dari Pharmacia, Freiburg, Jerman. DE-52 DEAE-selulosa diperoleh dari Whatman, Maidstone, Kent, UK 3Methylbutan- 1-ol dan Brij 35 berasal dari Merck, Darmstadt, Jerman. 6-Aminohexanoic asam-Sepharose 4B, amina biogenik dan lainnya biokimia yang dibeli dari Sigma, Deisenhofen, Jerman. N-Acetyltryptamine dengan baik disediakan oleh Dr Cyril Usifo, dari Institut Farmasi Kimia, Universitas dari Miinster, Miinster, Jerman. parasit Dewasa Fasciola hepatica dikumpulkan dari terinfeksi secara alami hati sapi yang diperoleh dari rumah pemotongan hewan lokal. Cacing yang dicuci

beberapa perubahan normal saline (0,9% NaCl) dan kemudian dibilas dengan saline steril sebelum stor. parasit Dewasa Fasciola hepatica dikumpulkan dari terinfeksi secara alami hati sapi yang diperoleh dari rumah pemotongan hewan lokal. Cacing yang dicuci beberapa perubahan normal saline (0,9% NaCl) dan Kemudian dibilas dengan saline steril sebelum penyimpanan pada - 79 C. Pemurnian N-asetiltransferase dari Fasciola hepatica Penyusunan ekstrak kasar, kromatografi pertukaran ion pada DEAE-selulosa dan kromatografi afinitas pada norspermidine-Sepharose seperti yang dijelaskan sebelumnya (Aisien dan Walter, 1992), kecuali bahwa ekstrak kasar secara ekstensif didialisis terhadap 50 mM Tris / HCl, pH 8,3, yang mengandung 1 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA, 0.020% Brij 35 dan 0,1 mM phenylmethanesulphonyl fluorida (buffer) sebelum aplikasi ke kolom DEAE-selulosa. Para eluat dari norspermidine- Kolom Sepharose teradsorpsi pada kolom Biru Sepharose (1 cm x 4 cm) diseimbangkan dengan 20 mM Tris / HCl, pH 8,7, yang mengandung 1 dithiothreitol mM, 1 mM EDTA, 0,020% Brij 35 dan 0,1 mM phenylmethanesulphonyl fluorida (buffer B). Kolom dicuci berturut-turut dengan penyangga B, 0,5 M NaCl dan 0,85 M NaCl dalam buffer yang sama dan kemudian dielusi dengan 0,85 M NaCl yang mengandung 1 mM CoA dalam buffer B. Kegiatan dalam 3 ml fraksi dikumpulkan diuji setelah mereka telah dibebaskan dari CoA oleh konsentrasi berturut-turut dan pengenceran dengan penyangga B menggunakan Centricon-10 microconcentrator (Amicon). Molekul massa enzim ditentukan dengan f.p.l.c. pada dikalibrasi HiLoad Superdex 200 kolom (1,6 cm x 60 cm) sebagai dijelaskan sebelumnya (Aisien dan Walter, 1992). Pengujian untuk biogenik-amina dan poliamina asetilasi Asetilasi biogenik amina-diuji dengan metode yang dijelaskan oleh Weissbach et al. (1961) dengan modifikasi. Sebuah standar 60, ul campuran inkubasi mengandung 50 mM Tris/HC1, pH 7,5, 5 mM tyramine atau disebutkan biogenik amina, 4,2 uM (25 nCi, 60 mCi / mmol) [1-14C] asetil-CoA, 1 mM dithiothreitol dan 1 mM EDTA. Campuran diinkubasi selama 5 menit pada 37 C, dan reaksi dihentikan dengan penambahan 0,1 ml NaClsaturated 0,5 M sodium borate penyangga (pH 10) dan pendinginan pada es. Produk asetat diekstraksi dengan 0,6 ml 3 - methylbutan-l-ol oleh pusaranpencampuran, diikuti dengan sentrifugasi pada 10000 g selama 3 menit. A 300, sebagian ul dari fase organik dipindahkan ke botol kilau mengandung 3 ml kilau koktail dan diuji untuk radioaktivitas. Pengujian untuk poliamina asetilasi dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Aisien dan

Satu unit enzim merupakan 1 nmol producUmin pada 37 OC.

Identifikasi produk-produk reaksi Sekitar. 1,5 ng protein enzim dari Blue Sepharosa Kolom diinkubasi dengan 5 mM biogenik amina, 50 mM Tris / HCl, pH 7,5, dan 16,8, M [1-14C] asetil-CoA (100 nCi) dalam volume akhir 240, 1 pada 37 'C selama 30 menit. Reaksi itu diakhiri dengan 24,1 u 2M HC104 dan campuran reaksi ditempatkan di atas es. The HClO4-endapan protein terendapkan oleh sentrifugasi pada 10000g selama 10 menit. Reverse-fase h.p.l.c. analisis yang dihasilkan supernatan dilakukan pada peralatan sebelumnya dijelaskan oleh Wittich et al. (1987). Pemisahan dicapai pada 250 mm x 4 mm kolom baja diisi dengan 5, um Spherisorb ODS II terhubung ke array detektor dioda (Kontron Instrumen) ditetapkan pada 280 nm. Produk berlabel yang dideteksi dengan monitor radioaktif (LB 506, Berthold). Itu fase gerak terdiri dari: pelarut A (90% ,1 M natrium asetat larutan yang mengandung 10 mM asam 1-octanesulphonic, pH 4,5, dan 10% metanol); pelarut B (90% dari BI larutan dan 10% metanol), Bi larutan yang terdiri dari 10 bagian (v / v) dari 0,2 M natrium asetat yang mengandung 10 mM asam 1-octanesulphonic, pH 4,5, dan 3 bagian (v / v) asetonitril. Program gradien, yang dikendalikan oleh Data Systems 450 instrumen (Kontron Instrumen) adalah sebagai berikut: 0-15 menit, 4-10% B, 15-35 menit, 10-100% B, 35-48min, 100% B, 48-52min, 00-4% B; 52-58 menit, 4% B. Penentuan Protein Konsentrasi protein ditentukan dengan metode Bradford (1976), dengan BSA sebagai standar. HASIL Purfflcatlon dari N-asetiltransferase Dalam tulisan kami sebelumnya (Aisien dan Walter, 1992), kami sebutkan terjadinya beberapa faktor penghambat mengganggu aktivitas ekstrak kasar. Dalam studi ini, kami memiliki menetapkan bahwa zat ini bisa dihilangkan dengan menundukkan ekstrak kasar untuk dialisis yang luas, diikuti dengan sentrifugasi untuk menghapus endapan terbentuk dalam proses. Seperti juga sebelumnya melaporkan, enzim tidak mengikat DEAE-selulosa, maka aliran-melalui fraksi yang mengandung aktivitas Acetylase dikumpulkan dan dimurnikan lebih lanjut. Kromatografi dari enzim pada Biru Sepharose terbukti menjadi langkah efektif dalam pemurnian prosedur. Enzim itu begitu kuat terikat matriks inilah pencucian sampai dengan 0,85 M NaCl gagal mengelusi enzim dari kolom. Namun, jumlah jejak aktivitas terdeteksi pada pencucian dengan konsentrasi garam tinggi. Akibatnya, kolom dicuci sampai dengan 0,85 M NaCl dan kemudian dielusi dengan 0,85 M NaCl yang mengandung 1 mM CoA. Elusi dari enzim dengan CoA di asosiasi dengan NaCl adalah penting, karena upaya untuk mengelusi enzim semata-mata dengan CoA terbukti tidak berhasil. Enzim bahan dari pemurnian ini langkah, ketika mengalami gel filtrasi, menghasilkan Acetylase sangat dimurnikan dengan spesifik kegiatan approx. 400 unit / mg protein sehubungan dengan tyramine. Dengan langkah pemurnian diringkas dalam Tabel 1, sebuah Faktor pemurnian keseluruhan 300 dan hasil approx. 20% adalah dicapai. Kegiatan amina-acetylating untuk tiga substrat tetap dalam proporsi konstan sepanjang prosedur pemurnian. Kromatografi dari enzim pada dikalibrasi Superdex 200 kolom menghasilkan pola elusi dengan profil kegiatan serupa bagi tyramine, spermidine dan putresin (Gambar 1). Massa molekul enzim adalah sekitar.

spesifisitas substrat N-asetiltransferase dari Fasciola hepatica yang diamati mengkatalisis asetilasi sejumlah alami amina biogenik (Tabel 2). Di antaranya, substrat terbaik adalah tyramine, dengan Km jelas 0,12 mM. fl-Phenylethylamine dan tryptamine adalah substrat sama-sama diterima untuk enzim. Berbeda dengan fl-isomer, a-Phenylethylamine memiliki sangat sedikit afinitas untuk Acetylase tersebut. Histamin, octopamine dan 5-hydroxytryptamine juga dapat diterima sebagai substrat, meskipun untuk tingkat yang lebih rendah derajat. Dopamin dan noradrenalin yang tidak aktif, sedangkan adrenalin, etilamin dan butylamine memiliki tingkat reaksi kurang dari 5%. The Km untuk asetil-CoA adalah 4,5, uM. CoA ditemukan menjadi penghambat untuk asetilasi biogenik-amina, dengan penghambatan konstan 5,5 uM (Gambar 3). Reverse-fase h.p.l.c. analisis produkproduk reaksi dari tryptamine dan 5-hydroxytryptamine. PH optimal untuk asetilasi biogenik amina- Seperti ditunjukkan dalam Gambar 2, pH optimal untuk biogenik aminaasetilasi adalah 7,5-8. Tes yang, bagaimanapun, dilakukan nilai Km yang sangat tinggi dari 10 mM diperoleh untuk senyawa ini. Sedangkan nilai Km diperoleh untuk biogenik tersebut amina jatuh antara yang diperoleh untuk putresin / spermidine dan spermine, masing-masing (Aisien dan Walter, 1992), ini nilai-nilai, namun, dalam berbagai hasil yang diperoleh untuk ini senyawa dengan hati merpati arylamine-N-asetiltransferase (Andres dkk., 1983). Tampaknya ada beberapa hubungan antara struktur dan aktivitas dari beberapa substrat. Untuk Misalnya, tyramine dan tryptamine adalah substrat yang sangat baik untuk enzim. Hidroksilasi senyawa ini secara drastis menurun kesesuaian mereka sebagai substrat. Ini menjadi jelas ketika kegiatan amina ini dibandingkan dengan orang-orang derivatif terhidroksilasi mereka, yaitu opamin dan octopamine dari tyramine dan 5-hydroxytryptamine dari tryptamine. Demikian pula, penurunan aktivitas dari suatu-isomer Phenylethylamine mungkin karena halangan sterik yang dihasilkan dari kelompok metil terikat pada atom karbon primer. The trematoda Acetylase jelas berbeda dari mamalia poliamina hati N-asetiltransferase dan isofunctional enzim dari duodenum ayam (Della Ragione dan Pegg, 1983; Shinki dan Suda, 1989). Sedangkan ini acetylases lainnya katalis hanya asetilasi poliamina, N-asetiltransferase dari F. hepatica menerima kisaran yang agak luas substrat. Sekarang dalam hal ini mirip dengan arylalkylamine N-asetiltransferase dari hati mamalia, yang, meskipun dilaporkan memiliki luas spesifisitas substrat (Weber, 1971), adalah namun tidak diketahui mengkatalisasi poliamina asetilasi. Selain itu, enzim trematoda juga berbeda dari arylalkylamine N-asetiltransferase dilaporkan di beberapa nematoda parasit (Isaac et al., 1990, 1991), dalam hal tidak mampu asetilasi dopamin. Berbeda dengan sel ofmammalian N-asetiltransferase nuklir, hal itu tidak mampu asetilasi histon (Libby, 1978; Blankenship dan Walle, 1977, 1978). dan karena itu perlu Penjelasan. Dalam metabolisme polyamine dari sel mamalia, N-asetilasi adalah tingkat membatasi langkah interkonversi jalur (Bolkenius dan Seiler, 1981;. Pegg et al, 1981; Seiler et al, 1981a, b).. Sel juga dikenal untuk menonaktifkan kelebihan amina dengan proses ini, sehingga meningkatkan transportasi mereka dan ekskresi (Weber, 1971; Seiler, 1981, 1987). Terperinci Bukti memberikan alasan untuk percaya bahwa N-asetilasi memainkan Peran terakhir dalam cacing parasit. Di Ascaris Suum dan Onchocerca volvulus, sebuah Acetylase baru yang terlibat dalam degradasi poliamina, melepaskan N-

acetylputrescine sebagai produk ekskretoris, telah dijelaskan oleh Wittich dan Walter (1990). lebih lanjut bukti yang mendukung temuan ini baru-baru ini diberikan oleh Muller dan Walter (1992). Ini peneliti mengamati bahwa, dalam kontras dengan situasi di sel mamalia, oksidase polyamine di A. Suum adalah bertanggung jawab untuk poliamina interkonversi, dengan putresin N-asetiltransferase yang melayani inaktivasi dan fungsi ekskretoris. Oleh karena itu kami menganggap bahwa N-asetilasi melayani tujuan yang sama di F. hepatica dan trematoda lainnya PEMBAHASAN Dalam tulisan kami sebelumnya kami menunjukkan adanya Acetylase mampu asetilasi poliamina dan diamina di F. hepatica (Aisien dan Walter, 1992). Hasil dari kita sekarang studi dengan jelas menunjukkan bahwa enzim yang sama bertanggung jawab untuk asetilasi biogenik-amina dalam trematoda ini. Kenyataan bahwa kita tidak dapat mencapai pemisahan biogenik amina, -dan poliamina kegiatan diamina-acetylating setelah pemurnian pada matriks kolom menggunakan prinsip adsorpsi berbeda menunjukkan fakta bahwa kegiatan ini amina-acetylating adalah penduduk pada protein enzim tunggal. Hasil ini didukung oleh proporsi konstan diamati antara tingkat asetilasi tyramine, spermidine dan putresin selama pemurnian, dan fakta bahwa puncak tunggal aktivitas yang diperoleh untuk ini substrat pada Superdex 200. Kegiatan ini puncaknya, yang berhubungan 50 kDa, dalam perjanjian dengan sebelumnya nilai yang ditentukan untuk poliamina-dan diamina-acetylating kegiatan di F. hepatica (Aisien dan Walter, 1992). Perlu dicatat bahwa nilai Km 4,5, uM untuk asetil-CoA dan nilai Ki dari 5,5, uM untuk CoA diperoleh dengan tyramine juga nilai-nilai diperoleh dengan spermidine sebagai akseptor asetil (Aisien dan Walter, 1992). Enzim tyramine mudah asetat,, Jphenylethylamine, tryptamine dan histamin, dengan nilai-nilai Km dalam kisaran 0,1-0,7 mM. Oleh karena itu diragukan jika 5-hydroxytryptamine merupakan substrat fisiologis untuk enzim, dalam pandangan . menunjukkan Produk berlabel tunggal untuk setiap substrat. Ini produk yang diidentifikasi sebagai N-acetyltryptamine dan N-asetil-5hydroxytryptamine masing-masing, dengan membandingkan retensinya kali dengan orang-orang dari standar otentik (Gambar 4). Sebuah single Produk berlabel adalah sama diperoleh untuk tyramine (hasil tidak ditunjukkan). Produk ini tidak dapat meyakinkan diidentifikasi, untuk Tidak adanya standar yang otentik untuk Nacetyltyramine.