Anda di halaman 1dari 9

1. TEKNIK PEMINDAHAN MIKROORGANISME SECARA ASEPTIK.

PENDAHULUAN Mikroorganisme terdapat di mana-mana, oleh karena itu mikroorganisme luar yang tidak dikehendaki dapat masuk ke dalam biakan murni melalui aliran udara, kontak tangan yang tercemar, atau melalui tersentuhnya media atau permukaan tabung bagian dalam oleh benda yang belum disterilkan (Wilda, 2009) Untuk mencegah mikroorganisme luar yang tidak dikehendaki masuk ke dalam biakan murni, perlu digunakan teknik aseptik, dimana semua peralatan maupun media pertumbuhan yang akan digunakan pada teknik ini harus dalam keadaan steril/aseptik (Wilda, 2009). Ada beberapa metode untuk memindahkan biakan murni dari satu wadah ke wadah yang lain secara aseptik (Wilda, 2009) : a. metode streak/gores b. metode spread/sebar c. metode pour plate/cawan tuang Pada praktikum ini akan dipelajari langkah demi langkah cara memindahkan biakan murni dengan teknik aseptik. Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri dari satu spesies tunggal (Wilda, 2009). BAHAN-BAHAN Kultur Rak tabung reaksi, tabung reaksi, media nutrient broth (NB), media nutrient agar (NA) (Wilda, 2009). Alat Jarum ose/lup inokulasi, batang kaca bentuk L untuk metode sebar spread, api bunsen/spiritus, alcohol, aluminium foil (Wilda, 2009). PROSEDUR PERCOBAAN A. Metoda Streak/gores pada tabung agar miring 1. Menyiapkan jarum ose/lup inokulasi dari kawat nikrom, panjang kawat 6-10 cm, pada ujung kawat terdapat lingkaran dengan diameter antara 2-4 mm (Wilda, 2009).

2. Menyiapkan 3 tabung reaksi yang disumbat kapas, 1 tabung reaksi berisi biakan murni bakteri, 1 tabung reaksi berisimedium padat NA/agar miring steril, 1 tabung berisi media cair NB steril (Wilda, 2009). 3. Memegang 2 tabung reaksi di tangan kiri (1 tabung berisi biakan murni bakteri dan 1 tabung reaksi berisi medium cair NB) dan jarum ose di tangan kanan (Wilda, 2009). 4. Memanaskan jarum ose di atas pembakar spiritus sampai seluruh kawatnya pijar, kemudian menggerakkan dengan cepat ose tersebut kearah bawah di atas api sehingga sebagian tangkai jarum ose ikut terpanasi, biarkan jarum ose mendingin selama + 20 detik sebelum dipakai, untuk mencegah matinya bakteri yang akan dipindahkan (Wilda, 2009). 5. Mengangkat sumbat kapas ke dua tabung reaksi satu demi satu, mulai dengan sumbat tabung yang terdekat dengan tangan kanan yaitu tabung reaksi yang berisi biakan bakteri, dengan cara melingkarkan jari kelingking di sekitar sumbat kapas (Wilda, 2009). 6. Mengangkat sumbat kapas tabung yang berisi media steril dengan jari manis, gerakan memutar biasanya memudahkan lepasnya sumbat dari mulut tabung (Wilda, 2009). 7. Memanaskan mulut kedua tabung reaksi yang tidak bersumbat dengan cara melakukannya bolak-balik sebanyak dua kali di atas api. Kemudian menjaga agar sudut kemiringan tabung tidak melebihi 45 bila tidak tersumbat (Wilda, 2009). 8. Memasukkan lup pada tabung yang berisi bakteri untuk dipindahkan ke dalam tabung yang berisi media cair steril (Wilda, 2009). 9. Memanaskan kembali mulut kedua tabung tersebut seperti semula (Wilda, 2009). 10. Mengembalikan sumbat masing-masing tabung seperti sediakala, tutup dengan alumunium foil (Wilda, 2009). 11. Mengulangi pemindahan aseptic untuk memindahkan sejumlah kecil bakteri kedalam tabung berisi agar miring NA steril. Cara inokulasi agar miring dimulai dengan meletakkan lup ysng mengandung bakteri pada dasar kemiringan agar, lalu ditarik ke atas dengan gerakan zig-zag (Wilda, 2009). 12. Setelah mulut tabung dipanaskan dan disumbat kembali dengan kapas dan alumunium foil, kemudian menyimpan tabung ke rak tabung (Wilda, 2009). 13. Memberi etiket pada semua tabung yang baru diinokulasi, meletakkan tabung diruang yang disediakan untuk diinkubasi selama 48 jam pada suhu kamar (Wilda, 2009). 14. Pada kegiatan praktikum berikutnya, mengamati tabung-tabung tersebut, bila teknik pemindahan secara aseptic dilakukan dengan baik maka tabung NB akan

tampak keruh, sedangkan pada agar miring NA tampak zig-zag koloni bakteri (Wilda, 2009). 15. Menunjukkan hasil praktikum pada Dosen/asisten yang bertugas (Wilda, 2009). B. Metoda streak/gores pada agar cawan petri 1. Bagian bawah cawan petri yang berisi Nutrient Agar dibagi menjadi 4 bagian dengan mengggunakan spidol (Wilda, 2009). 2. Membuka tutup cawan petri dengan mulutnya didekat api Bunsen (Wilda, 2009). 3. Memijarkan ujung lup, kemudian didinginkan (Wilda, 2009). 4. Memasukkan lup pada tabung yang berisi bakteri (Wilda, 2009). 5. Ujung lup yang berisi bakteri digoreskan di atas cawan petri dimulai dari bagian 1, melanjutkan ke bagian 2, kemudian bagian 3 dan terakhir bagian 4. Memperhatikan selama menggores dari bagian 1 sampai bagian 4, ujung lup yang mengandung bakteri tidak boleh keluar dari dalam cawan petri (Wilda, 2009). 6. Menutup cawan petri, kemudian memberi isolasi sekeliling cawan, sehingga cawan tertutup rapat (Wilda, 2009). 7. Memberi etiket pada semua tabung yang baru diinokulasi, meletakkan tabung diruang yang disediakan untuk diinkubasi selama 48 jam pada suhu kamar (Wilda, 2009). 8. Pada kegiatan praktikum berikutnya, mengamati tabung-tabung tersebut, bila teknik pemindahan secara aseptic dilakukan dengan baik maka tabung NB akan tampak keruh, sedangkan pada agar miring NA tampak zig-zag koloni bakteri (Wilda, 2009). 9. Menunjukkan hasil praktikum pada Dosen/asisten yang bertugas (Wilda, 2009). C. Metoda spread/sebar 1. Mengambil 0,1 ml biakan murni bakteri dengan pipet volume (Wilda, 2009). 2. Membuka tutup cawan petri yang berisiagar nutrient dengan mulutnya didekat api Bunsen (Wilda, 2009). 3. Mengambil 0,1 ml biakan bakteri dan diteteskan di atas media padat dengan menggunakan popet volume (Wilda, 2009). 4. Kemudian menyebarkan/Spread dengan alat spread dari gelas bentuk L secara merata (Wilda, 2009).

5. Menutup cawan petri, kemudian memberi isolasi sekeliling cawan, sehingga cawan tertutup rapat. 6. Memberi etiket pada semua tabung yang baru diinokulasi, meletakkan tabung diruang yang disediakan untuk diinkubasi selama 48 jam pada suhu kamar (Wilda, 2009). 7. Pada kegiatan praktikum berikutnya, mengamati tabung-tabung tersebut, bila teknik pemindahan secara aseptic dilakukan dengan baik maka tabung NB akan tampak keruh, sedangkan pada agar miring NA tampak zig-zag koloni bakteri (Wilda, 2009). 8. Menunjukkan hasil praktikum pada Dosen/asisten yang bertugas (Wilda, 2009).

D. Metode pour plate/cawan tuang 1. Mengambil 1 ml biakan murni bakteri dengan pipet volume (Wilda, 2009). 2. Membuka tutup cawan petri kosong yang sudah steril dengan mulutnya didekat api Bunsen (Wilda, 2009). 3. Memasukkan 1 ml biakan bakteri tersebut di atas cawan petri kosong (Wilda, 2009). 4. Kemudian menuang larutan nutrient agar yang masih cair temperatut 40C (dapat di coba dengan menempelkan labu Erlenmeyer yang berisi NA cair, jika di pipi sudah tidak terasa tidak terlalu panas siap digunakan) kedalam cawan petri yang berisi bakteri tersebut (Wilda, 2009). 5. Menutup cawan petri , memutar-mutar 3 kali ke kiri dan 3 kali ke kanan (Wilda, 2009). 6. Membiarkan di suhu ruang sampai agarnya membeku dan diberi isolasi sekitar cawan. Membiakkan lalu disimpan diinkubator sesuai dengan suhu dan waktu yang dibutuhkan untuk pertumbuhannya (Wilda, 2009). 7. Memberi etiket pada semua tabung yang baru diinokulasi, meletakkan tabung diruang yang disediakan untuk diinkubasi selama 48 jam pada suhu kamar (Wilda, 2009). 8. Pada kegiatan praktikum berikutnya, mengamati tabung-tabung tersebut, bila teknik pemindahan secara aseptic dilakukan dengan baik maka tabung NB akan tampak keruh, sedangkan pada agar miring NA tampak zig-zag koloni bakteri (Wilda, 2009). 9. Menunjukkan hasil praktikum pada Dosen/asisten yang bertugas (Wilda, 2009).

PEMBAHASAN Pekerjaan memindahkan mikrobe dari medium lama ke medium yang baru harus dilaksanakan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat alat yang sangkut paut dengan medium dan pekerjaan inokulasi ( penanaman ) itu benar benar streil. Hal ini untuk menghindarkan kontaminasi, yakni masuknya mikroorganisme yang tidak kita inginkan. Beberapa langkah pada pekerjaan inokulasi dan isolasi mikrobe adalah sebagai berikut (Wilda, 2009) : 1. Menyiapkan Ruangan Ruang tempat inokulasi harus bersih, dan bebas angin. Dinding ruang yang basah menyebabkan butir butir debu menempel. Pada waktu mengadakan inokulasi, baik sekali bila meja tempat inokulasi didasari dengan kain basah. Pekerjaan inokulasi dapat dilakukan di dalam suatu kotak berkaca ( ent- kas ). Di laboratorium untuk membuat vaksin, serum, dan lain sebagainya, udara yang masuk ke dalam ruangan dilewatkan saringan yang disinari dengan sinar ultra ungu (Wilda, 2009). 2. Pemindahan dengan Kawat Inokulasi Ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau dari nikrom. Ujung kawat boleh lurus, boleh juga kolongan yang berdiameter 1- 3 mm. Lebih dahulu ujung kawat ini dipijarkan, sedang sisanya sampai tangkai cukup dilewatkan nyala api saja. Setelah dingin kembali, ujung kawat itu disentukan suatu koloni. Mulut tabung tempat pemiaraan itu dipanasi juga setelah sumbatnya diambil. Setelah pengambilan inokulum ( sampel bakteri ) selesai, mulut tabung dipanasi lagi kemudian disumbat seperti semula. Ujung kawat yang membawakan inokulum tersebut digesekkan pada medium baru atau pada suatu kaca benda. (Wilda, 2009). Komponen komponen yang harus disterilkan yaitu (Wilda, 2009): a. Alat alat yang akan digunakan, seperti : cawan petri , pipet volume, ose. b. Lingkungan, yaitu meja tempat kita bekerja disemprot alkohol. c. Person yaitu dengan menyemprot tangan dengan alkohol serta dapat juga memakai masker. d. Media 3. Teknik Biakan Murni Di alam bebas tidak ada mikrobe yang hidup tersendiri terlepas dari spesies lain. Seringkali mikrobe patogen kedapatan secara bersama sama dengan mikrobe saproba ( saprobakteri ). Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari luar. Medium untuk membiakkan mikrobe haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran ( kontaminasi ) dari luar terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. Teknik biakan murni untuk suatu spesies dikenal dengan beberapa cara, yaitu (Wilda, 2009) : a. Cara Penggesekan Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan keterampilan yang diperoleh dari latihan. Penggoresan yang sempurna akan mengahsilkan koloni yang terpisah. Tetapi kelemahan cara iniadalah bakteri bakteri anaerob tidak dapat tumbuh (Wilda, 2009). Bakteri yang mempunyai flagel seringkali membentuk koloni yang menyebar terutama bila digunkan lempengan agar yang basah. Untuk mencegah hal ini harus digunakan lempengan yang benar benar kering. Untuk mendapatkan koloni yang terpisah sewaktu melakukan goresan harus memperhatikan, antara lain (Wilda, 2009.

Gunakan ose yang telah dingin untuk menggores permukaan lempengan agar. Sengkelit yang panas akan mematikan mikroorganisme, sehingga tidak terjadi pertumbuhan pada bekas goresan. Sewaktu menggores, sengkelit dibiarkan meluncur diatas permukaan lempengan. Agar yang luka akan menganggu pertumbuhanmikroorganisme, sehingga sulit diperoleh koloni yang terpisah. Sengkelit harus dipijarkan setelah menggores suatu daerah, hal ini dengan tujuan mematikan mikroorganisme yang melekat pada mata ose dan mencegah pencemaran pada penggoresan berikutnya. Menggunakan tutup cawan petri untuk melinduingi permukaan supaya terhindar dari pencemaran. Membalikkan lempengan agar untuk mencegah air kondensasi jatuh diatas permukaan sehingga dapat terjadi penyebaran koloni. b. Cara spread atau sebar Pengenceran sampel sama seperti pada cara penuangan. Dengan memipet sebanyak 0,1 ml cairan dari botol pengencer dan biarkan cairan mengalir ke atas permukaan agar. Cairan sampel disebarkan dengan penyebar yang terbuat dari gelas berbentuk huruf L. Pada teknik ini sterilisasi penyebar dilakukan dengan mencelupkan ke dalam alkohol dan kemudian dipanaskan sampai alkohol terbakar habis. Penyebar didinginkandahulu sebelum digunakan untuk menyebar cairan sampel pada permukaan agar. Penyebaran cairan contoh ( sampel ) dilakukan dengan memutar agar lempengan tersebut (Wilda, 2009). c. Cara Pour plate atau tuang Isolasi dengan menggunakan medium cair dengan cara penuangan. Prinsip melakukan penuangan adalah menurunkan jumlah mikroorganisme sehingga suatu saat hanya ditemukan suatu sel dalam tabung. Metode ini pertama kali dilakukan oleh Robert Koch 1843 1905 (Wilda, 2009). Terkadang masih terjadi kontaminasi pada medium biakan yang kita buat. Hal ini dikarenakan oleh (Wilda, 2009): 1. Sterilisasi media dan alat kurang sempurna 2. Kontak langsung dengan permukaan atau tangan kita tercemar 3. Terentuhnya media ataupermukaan tabung bagian dalam oleh benda benda yang belum disterilkan 4. Melalui udara KESIMPULAN 1. Metode pemindahan biakan murni secara aseptik, antara lain (Wilda, 2009). a. Metode streak atau gores Penggoresan sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Kelemahannya adalah bakteri anaerob tidak dapat tumbuh. Alat yang utama yaitu ose. b. Metode spread atau sebar Alat utamanya yaitu gelas berbentuk L c. Metode pour plate atau tuang Alat utama yang digunakan yaitu pipet volume

2. Tujuan pemindahan bakteri ke media adalah untuk merefresh bakteri agar bakteri bereproduksi lebih banyak dan sempurna.

2. TAHAPAN PEMEMBUAT MEDIA


Penimbangan, penggunaan pelarut dan wadah Media yang akan dibuat selain yang siap pakai, artinya untuk membuatnya tinggal menimbang dengan jumlah tertentu kemudian melarutkannya, ada pula yang harus diramu dengan komposisi yang ditentukan (Anonymous, 1982 dan 1994) . Timbangan yang praktis dipakai adalah timbangan "top loading" Sartorius yang mempunyai angka 2 atau 3 desimal (2 atau 3 angka dibelakang koma) . Untuk menghindari adanya bahan-bahan yang dapat mempengaruhi kelarutan (solubilitas) zat yang digunakan, merubah warna media jika kena panas, meracuni (bakterisidal) atau dapat menghambat pertumbuhan bakteri dalam pembuatannya digunakan air suling (aquadest) sebagai pelarutnya . Sedangkan untuk wadah tempat melarutkan, jika jumlahnya sedikit dipakai alat-alat gelas seperti erlenmeyer atau gelas piala, jika pembuatannya dengan jumlah banyak dipakai ember yang terbuat dari stainless . Wadah dari tembaga atau seng tidak digunakan untuk menghindari terjadinya kelarutan pada kedua metal tersebut, karena keduanya diketahui mudah teroksidasi dan korosif. Jumlah sekecil apapun dari kedua metal ini jika terlarut dalam media akan bersifat sebagai bakterisidal (Collin dan Patricia, 1987) . Pengukuran derajat keasaman (pH) Pengukuran derajat keasaman atau eksponen hidrogen (pH) media sangat penting. Jika terlalu asam atau basa, maka pertumbuhan bakteri akan dihambat . Hampir semua bakteri tumbuh pada media pH 7 .00 - 7 .50, dan hanya beberapa saja yang tumbuh pada media yang pH nya dibawah 7 .0, misalnya Mycobakterium, yaitu bakteri tahan asam yang tumbuh pada media pH 6 .8 . Pengukuran pH hendaknya dilakukan pada suhu kamar, untuk menghindari penyimpangan/kesalahan . Pengukuran bias dilakukan dengan : kertas penunjuk (indikator), pH meter elektrik dan zat penunjuk . Untuk memperoleh pH media yang kehendaki, jika terlalu rendah dipakai tetesan larutan NaOH I N, sebaliknya jika terlalu tinggi diturunkan dengan tetesan larutan HCL' 1 N. Zat penunjuk dipakai khususnya pada media diferensial yang mengandung karbohidrat atau unsur karbon lain, digunakan untuk mempelajari sifat-sifat bakteri . Jika penunjuk yang dipakai adalah phenol red, maka warna media adalah merah, karena pH 7 .0 - 7.5 . Kemudian jika terjadi fermentasi karbohidrat oleh bakteri, maka media. akan berubah menjadi asam, pH nya akan turun yang menyebabkan warna . mediaberubah menjadi kuning . Bermacam-macam zat penunjuk yang biasa dipakai serta jarak perubahan warnanya dapat dilihat pada Tabel 1 . Pengisian dan Sterilisasi Pengisian media yang sudah diukur pH nya kedalam tabung/botol sebaiknya jangan terlalu penuh untuk menghindari tumpah atau pecah jika disterilkan .. Untuk bentuk padat yang mengandung 2% agar-agar atau bentuk semi solid yang mengandung 0,2% - 0,5% agar-agar, sehelum diisikan harus dipanaskan dahulu supaya agarnya larut dan homogen. Sedangkan untuk pembuatan media agar plat. dimasukan kedalam erlenmeyer yang kemudian ditutup dengan kapas/alumunium foil . Media dalam tabung, botol atau erlenmeyer, kemudian disterilkan dengan uap air jenuh bertekanan (autoclave) . Pada proses ini ada hubungan antara suhu yang diinginkan dengan tekanan uap airnya (Tabel 2) . Dengan sterilisasi sel-

sel vegetatif dan spora bakteri akan mati . Jika media tersebut mengandung bahan-bahan yang tidak bias disterilkan dengan autoclave, dapat disterilkan dengan uap air yang mengalir, suhunya 100C (steam) . Lama sterilisasi dengan steam bervariasi antara 10 - 30 menit, tergantung bahan yang disteril, media yang mengandung selenit atau tetrationat cukup 10 menit, dan untuk karbohidrat 30 menit (Cowan, 1975) . Untuk mensterilkan bahanbahan yang tidak tahan terhadap panas, misal serum, beberapa macam vitamin dilakukan sterilisasi dengan menggunakan saringan, yaitu mengunakan kertas saring ashes (SEITZ EK), dengan bantuan pompa vakum yang bisa menyedot atau menekan udara . Sedangkan untuk mensterilkan alat-alat gelas, dipakai sterilisasi panas kering (hot air open), suhunya 160C selama I jam atau 170C selama 40 menit (Collin dan Patricia, 1987) . Pada pengisian kedalam cawan-cawan petri dilakukan secara aseptic didalam "biohazard" atau dekat nyala api bunsen untuk menghindari kontaminan dari udara . Pada pembuatan media agar slope (agar miring), media dalam tabung/botol yang masih panas/cair dimiringkan dan diganjal dengan tabung kaca, lalu diatur sedemikian sehingga ujung media tidak terlalu dekat dengan leher botol/tabung . Pengisian media kedalam tabung/botol dan cawan petri yang biasa digunakan dapat dilihat pada Tabel 3 . Kontrol sterilitas, uji pertumbuhan dan penyimpanan Setiap batch media yang dibuat sebelum digunakan harus dikontrol dahulu sterilitasnya, yaitu dengan menyimpan didalam inkubator pada suhu 37"C selama 24 jam . Media yang terkontaminasi harus dibuang . Beberapa sampel media yang sudah dikontrol sterilitasnya diuji pertumbuhannya dengan bakteri yang cocok untuk penggunaan media tersebut, misal untuk media agar Brilian green (BRG) digunakan bakteri Salmonella, dan untuk agar Mac Conkey (MCC) digunakan bakteri E.coli . Media yang baik adalah apabila media BRG dengan pertumbuhan Sabnonella harus berubah warna menjadi merah, dan media MCC dengan pertumbuhan E.coli harus berubah menjadi merah . Media-media yang sudah dikontrol sterilitas dan uji pertumbuhannya selaina belum digunakan harus disimpan didalam lemari pendingin (cool room) suhu 5"C-8C . Beberapa contoh media siap pakai dapat dilihat pada gambar 1 .

DAFTAR PUSTAKA

Wilda, 2009. TEKNIK PEMINDAHAN MIKROORGANISME SECARA ASEPTIK. http://wildablog.blogspot.com. Diakses pada hari rabu 09 oktober 2013 pukul 18.43 WITA. HIDAYAT YUSUF, 1999. TEKNIK PEMBUATAN MEDIA BAKTERI. http://repository.ubaya.ac.id. Diakses pada hari rabu 09 oktober 2013 pukul 18.56 WITA.