1.

Cromatografa
La cromatografa puede definirse como una tcnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase mvil (lquida o gaseosa) a travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser lquida o slida. Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan su movilidad entre s y con respecto a la fase mvil. La base de la separacin cromatografa ser, por tanto, la diferencia en la migracin de los mismos. Notas Histricas El botnico ruso Mijail Tswett estableci las ventajas de la tcnica, adopto la terminologa y defini los procedimientos experimentales bsicos para esta tcnica, se considera que es el Padre de la Cromatografa. En los aos 30 y 40 empez su desarrollo y aplicacin en diferentes procedimientos de experimentacin. Principios La palabra Cromatografa significa EscribirenColores, porque cuando fue desarrollada los componentes separados eran colorantes. Se define como una tcnica o mtodo fsico de separacin basado en las diferentes velocidades con que se mueven los solutos disueltos en un disolvente llamado eluente (fase mvil) a travs de un medio estacionario o fijo. Los componentes a separar se distribuyen entre la fase estacionaria y la fase mvil o fluido que pasa a travs o a lo largo de la fase estacionaria. Como los componentes de la mezcla presentan diferente ten de nci aa permanecer en cualquiera de las fases, la separacin se da por el movimiento de la fase mvil en relacin con la estacionaria y de la distribucin de las sustancias entre las dos fases. Las molculas que "prefieren disolverse" en la fase mvil sern eludas ms rpido que las que son preferencialmente solubles en la fase estacionaria y que tienden a quedar retenidas. En resumen se fundamenta en la separacin entre la fase estacionaria slida o liquida y la fase mvil liquida o gaseosa Los fenmenos rectores del proceso de retencin y separacin son la adsorcin y la absorcin. El primero queda delimitado a la superficie interfacial es decir se refiere a la fijacin o retencin de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se relaciona con fuerzas qumicas y fsicas que dependen de la naturaleza de la sustancia absorbida, temperatura, naturaleza del absorbente y concentracin. El segundo fenmeno determina la retencin de una especie qumica por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene sta a formar mezcla o reaccionar qumicamente con la misma.

Clasificacin de la Cromatografa Existen muchas maneras de clasificar los mtodos cromatogrficos, segn su fase mvil se clasifica en Cromatografa de gases que puede ser a travs de dos sistemas, gas- lquido y gas-slido y Cromatografa lquida donde el eluente es un lquido y puede ser lquido-liquido, liquido-slido. Por el mecanismo de retencinseparacin, es decir el tipo de equilibrio implicado en la transferencia de los solutos entre las fases se encuentra la Cromatografa de reparto, de adsorcin y de exclusin. Segn la forma de contacto entre las fases se denomina de columna o superficie plana. Tambin se puede clasificar teniendo en cuenta la fase estacionaria, la dimensionalidad, escala fsica y gradientes.

Tcnicas cromatogrficas
Segn el dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase mvil y la estacionaria, se distinguen dos tcnicas:

Columna Plana: El soporte es una placa plana o los intersticios de un papel

Se usa un tubo cilndrico Capa fina Papel (particin)

a) Cromatografa en capa fina. Por este mtodo se pueden analizar mezclas de aminocidos. La muestra para anlisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida en la superficie por la accin de fuerzas electrostticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes de hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los adsorbentes ms utilizados son gel de silica, alumina, tierra silcea, celulosa y poliamidas. Como soportes del adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plsticas o metlicas, algunas placas tienen indicador de fluorescencia : f254 f366. La placa seca se coloca en el tanque cromatogrfico o cmara, en el cual debe encontrarse saturado el eluente (Fase Mvil lquida).El eluente ascender o desplazara por capilaridad en la placa y arrastrar los componentes a lo largo de sta produciendo manchas que representan a los componentes, la separacin se da por migracin diferencial, es decir que la fase mvil arrastra a las substancias apolares y aquellas ms polares son retenidas por la fase estacionaria dando lugar a la separacin. Posteriormente se evapora el eluente y la placa se analiza por medio de mtodos qumicos en el que por inmersin o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes (Adicin de Ninhidrina a aminas, cido sulfrico para carbonizar compuestos orgnicos, etc), o por medio de mtodos fsicos pticos utilizando radiacin UV o luz visible. El anlisis es de tipo cualitativo,

semicuantitativo o cuantitativo. En el primero se hacen comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre otras. En el semicuantitativo se observa dimetro y comparacin visual e intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentracin conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisin a travs de la sustancia y medidas de emisin o medida de luz reflejada desde la sustancia, y espectrofotometra por fluorescencia. b) Cromatografa en papel. El proceso es bsicamente el mismo, solo que se usan tiras de papel cromatogrfico en el tanque cromatogrfico. c) Cromatografa en Columna. Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Almina (Al2O3), Slica u Oxido de Magnesio. La fase estacionaria esta constituida por un slido poroso, el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plstico o vidrio. La fase mvil se encuentra formada por la solucin que lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solucin que sale al final de la columna se reemplaza constantemente por nueva solucin que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna. La migracin de las sustancias de la mezcla a travs de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total, la separacin, y por tanto la resolucin, aumenta con la longitud de la columna. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos difusinales, disminuyendo por tanto la resolucin.

d) Cromatografa de gases. Se utiliza para la separacin de sustancias gaseosas. La Fase Mvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un slido (Cromatografa Gas-Slido) o una Pelcula de lquido de alto punto de ebullicin (Generalmente Polietiln-Glicol o Silicn) recubriendo un slido inerte (Cromatografa Gas-Lquido). El cromatgrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de inyeccin, una columna normalmente localizada en el interior de una cmara termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el cromatgrama.

La muestra se introduce a travs del sistema de inyeccin dentro de la columna que es el sitio donde ocurre la separacin. La columna de aluminio, acero inoxidable, vidrio o tefln contiene la fase estacionaria slida o lquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de slice. La fase mvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a travs de la columna, por esta razn debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusin gaseosa. Al final de la columna existe el detector que permite la deteccin y cuantificacin de las sustancias, midiendo conductividad trmica y electronegatividad de las sustancias eludas. Se produce una seal tipo elctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes. La salida de la sustancia se registra en un cromatgrama en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el rea del pico. f)Cromatografa Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC). Es una Cromatografa de alta presin es decir se aplica el flujo a presin (entre 1500 a 2200 psi). El tamao de partcula es entre 3 y 10 micras, la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar muestras proteicas. La reduccin del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusin de las bandas, aumentando por tanto la resolucin. El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que inyecte el lquido a la columna. Generalmente las columnas de slica requieren alta presin para que el flujo de lquido sea adecuado, la mezcladora se requiere para variar la proporcin de solvente en la fase mvil y el inyector permite la aplicacin de la muestra. A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorcin ultravioleta o de fluorescencia y si se desea recuperar las molculas que eluyen de la columna, se requiere un colector. En los sistemas modernos el anlisis de la informacin obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la cromatografa, identificar la naturaleza los picos eludos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan segn su "tiempo de retencin" con estndares, que permiten identificar los aminocidos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el rea la curva del pico correspondiente.

g) Cromatografa de intercambio inico. La Fase Estacionaria es una resina de intercambio inico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Mvil es generalmente una solucin amortiguadora de pH. En protenas la cromatografa de intercambio inico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga elctrica neta de las protenas a un valor de pH determinado. La afinidad de cada protena a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la concentracin de iones en solucin (concentracin salina) que compiten con la protena en la interaccin con la matriz. La separacin de la protena de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentracin salina de la fase mvil, de tal forma que se genere un gradiente de concentracin. h) Cromatografa por Permeabilidad en Gel. Es til para la separacin de protenas. La Cromatografa de exclusin molecular, tambin llamada de filtracin en gel, separa en funcin de su tamao. La matriz de la columna esta formada por un polmero entrecruzado con poros de tamaos determinados. Las protenas de mayor tamao migran ms deprisa a lo largo de la columna que las de pequeo tamao, debido a que son demasiado grandes para introducirse en los poros de las bolas de polmero y por tanto siguen una ruta ms corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. Las protenas de menor tamao, entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es ms lenta. i) Cromatografa de Afinidad. La Cromatografa de Afinidad permite la separacin de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unin a un

determinado ligando. En este caso, las protenas que se retienen en la columna son aquellas que se unen especficamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Despus de que las protenas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a travs de la columna, la protena de inters que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solucin que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interaccin entre el ligando y la protena.

2.ELECTROFORESIS
La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa. Fue empleado por primera vez por en el ao 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los aos cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separacin de materiales en un campo elctrico en presencia de algn tipo de soporte; aunque este termino se limito originalmente al anlisis de

coloides y partculas submicroscopicas , se ha convertido en estos ltimos aos en una metodologa aplicada a sustancias de bajo peso molecular. 1. Fundamento. Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las molculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el nodo (el polo positivo). El movimiento de las molculas esta gobernado tambin por dos fuerzas adicionales; inicialmente la friccin con el solvente dificultar este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las molculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energa cintica propia denominado difusin. La energa cintica de las molculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusin. La suma de todas estas fuerzas provoca que las molculas no migren de una manera homognea, de tal manera que, si las molculas son colocadas en un cierto lugar de solucin, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo. Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las molculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho movimiento. Una forma comn de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polmero soluble de muy alto peso molecular que atrapa molculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migracin electrofortica de las molculas ser mas lenta, pero el ensanchamiento del frente se vera reducido tambin. 2 Mtodos electroforeticos zonales. Son los ms comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son tiles para lograr la separacin de mezclas complejas. Se aplican pequeas cantidades de la disolucin de protenas a un soporte slido, que se impregna con una solucin tampn. Los soportes son en general polmeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las molculas a travs del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de conveccin del solvente. Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidn, poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre otros. Este mtodo tiene gran poder resolutivo por que se aplica una cantidad pequea de protena a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho mayor que la zona de aplicacin. El equipamiento requerido es

simple, fuente de poder, cubeta vertical u horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos Los ms utilizados son: a) Electroforesis en gel de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida se forman por polimerizacin de la acrilamida por accin de un agente entrecuzador, es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante un tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada en el tamao del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad. b) Electroforesis en geles de gradientes. El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentracin de archilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamao del poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. En un gel en gradiente la protena migra hasta alcanzar una zona donde el tamao de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el limite del poro no se produce una migracin apreciable aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones mas estrechas, adems de incrementar el rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentracin fija. (Diapositiva n 9) c) Electroforesis en geles de agarosa. La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos.

d) Electroforesis capilar. La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las tcnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnologa distinta que nos permiten obtener una serie de ventajas al respecto, Esta separacin de pptidos realizada sobre un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire. La corriente electroendosmtica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del lquido que contrasta con el frente parablico de la cromatografa lquida de alta resolucin . La ventaja de esta tcnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventaja a travs de ella que permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualizacin es on-line. Con esta tcnica descripta es posible separar cationes, aniones, protenas, macromolculas y sustancias no cargadas en forma simultnea. f) Isoelectroenfoque. Esta tcnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. Las molculas amfotricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH . La regin del nodo es cida y la del ctodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las molculas que se han de separar tenga su punto isoelctrico dentro del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas positivamente y migraran hacia el ctodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH ms bajos que su punto isoelctrico tendrn carga negativa y migraran hacia el nodo. La migracin les conducir a una regin dnde el pH coincidir con su punto isolctrico, tendrn una carga neta nula y se detendrn. De esta forma las molculas amfotricas se

sitan en estrechas bandas donde coincide su punto isoelctrico con el pH. g) Electroforesis bidimensional. La electroforesi s bidimension al se basa en separar las protenas en una mezcla segn sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensin. El procedimien to ms usado se basa en la separacin en una primera dimensin mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensin segn peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida. 3 Fuentes de error en la electroforesis. La electroforesis es una tcnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales, como la temperatura durante la polimerizacin y la corrida del gel, velocidad de la polimerizacin, niveles de catalizador, pureza del reactivo, tiempo de corrida y preparacin de las muestras.

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