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II.1 REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

La reaccin en cadena de la polimerasa, comnmente denominada PCR por
sus iniciales en ingls ("polymerase chain reaction"), fue desarrollada por Kary
Mullis a mediados de los aos 80, quien gan el Premio Nobel de Qumica en
1993 por este desarrollo.

Mediante esta tcnica es posible producir mltiples copias de un fragmento de
ADN, gracias a la capacidad de la ADN polimerasa para sintetizar una hebra de
ADN complementaria a otra ya existente. Para realizar esta sntesis es
necesario aportar nucletidos al medio de reaccin que son la materia prima
para sintetizar el ADN, y dos oligonucletidos (secuencia corta de ADN, menos
de 40 nt) que se unan a la regin que queremos copiar para que sirvan como
iniciadores (primers).


II.1.1 Pasos de la PCR
Bsicamente la PCR se desarrolla en los siguientes pasos (ver figura 1 y
video):
1. Primero la separacin (desnaturalizacin) por calor (92-97C) de las
dos hebras que forman la molcula de ADN que se quiere amplificar.
Cada una de estas hebras actuar como molde para sintetizar la
complementaria. La temperatura y el tiempo (entre 15 y 60 segundos)
para la desnaturalizacin dependen, en gran medida, de la proporcin
de G+C que tenga la hebra, como tambin del largo de la misma.
2. A continuacin se baja la temperatura para conseguir que cada primer
se hibride a su regin especfica (alineamiento) dentro de la hebra de
ADN. Para ello es necesario que la temperatura descienda a un valor
que generalmente se encuentra entre 45 y 65 durante 30 a 60
segundos. Este paso se debe optimizar en cada reaccin ya que
depende de la secuencia de los primers. Los primers actuarn como
lmites de la regin que va a ser amplificada.
3. El siguiente paso consiste en la sntesis (elongacin) de la hebra de
ADN complementaria por la ADN polimerasa. La polimerasa sintetiza
una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo
3
los dNTPs complementarios en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-
fosfato de los dNTPs con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de
ADN creciente. La temperatura para este paso depende de la ADN
polimerasa, para la Taq polimerasa (enzima que se utiliza
habitualmente) es de 72 C. El tiempo de extensin depende tanto de la
ADN polimerasa utilizada como de la longitud del fragmento de ADN
que se va a amplificar, generalmente vara entre 30 segundos y 2
minutos. Desde el punto de vista prctico se estima que la Taq necesita
1 minuto para polimerizar mil bases.
4. Cada una de las molculas de ADN hijas vuelven a entrar en el proceso
y sirven como molde para fabricar ms copias. As la PCR avanza
repitiendo los pasos 1, 2 y 3 que constituyen 1 ciclo. Tras 20 ciclos de
reaccin se pueden obtener hasta 1 milln de copias de la regin en
estudio. Una reaccin estndar tiene 30 ciclos. Este nmero est
limitado por el efecto "plateau" que es la prdida de eficiencia de la
reaccin por deplecin de los sustratos, alteracin de los componentes
del medio de reaccin, por la temperatura, inhibicin por acumulacin
del producto final, etc.
5. Elongacin final: etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de
72 C durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con este paso
se asegura que cualquier ADN de hebra simple, restante de los ciclos
de la PCR, sea totalmente convertida a doble hebra. En algunas PCRs
esta etapa puede no ser necesaria.
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Figura 1. Reaccin en cadena de la polimerasa: primero se desnaturaliza el
ADN por calor, luego la temperatura desciende para que los primers hibriden
(alineamiento), el tercer paso es la elongacin de los primers por la ADN
polimerasa. En los primeros 2 ciclos se obtendrn productos primarios (con 1
primer en un extremo) hasta que recin en el tercero aparecern los
segmentos que estn flanqueados por ambos primers.



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Figura 2. Grfico de temperatura vs tiempo del ciclo 1. El aumento de
temperatura desnaturaliza el ADN, el descenso posterior permite el annealing
(alineamiento) de los primers y el ascenso posterior hace que la Taq elongue
los primers.

II.1.2 Termociclador
La PCR est automatizada por un instrumento llamado termociclador, que
permite calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la temperatura de
cada etapa (ver figura 2).

Muchos termocicladores hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto
calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente elctrica.
Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina que favorece una buena
conductividad trmica, permitiendo que se alcance rpidamente el equilibrio
trmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que se encuentra en
la parte inferior de la tapa y que calienta la parte superior donde se encuentran
los tubos para evitar la evaporacin del medio de reaccin. Cuando los
termocicladores ms antiguos carecan de este sistema, era necesario
adicionar una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reaccin.

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II.1.3 Consideraciones generales
La PCR es una tcnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mnima
cantidad de ADN para obtener un gran nmero de copias, por esta razn
deben utilizarse procedimientos controlados para evitar contaminaciones.
Estas contaminaciones pueden evitarse con protocolos y procedimientos que
separen espacialmente las distintas etapas (extraccin de cidos nucleicos,
PCR, anlisis de productos de amplificacin) y la limpieza exhaustiva de las
reas de trabajo entre la realizacin de una PCR y la siguiente.
Los falsos positivos pueden resultar de la contaminacin con cidos nucleicos
de las muestras, o con amplicones, siendo esta ltima la ms grave y difcil
de eliminar.

Las siguientes recomendaciones pueden ayudar a minimizar la contaminacin
con amplicones:
a) separacin fsica de los procesos de pre- y post-amplificacin: estas tareas
deben realizarse en diferentes reas con diferentes materiales e instrumental
(centrfugas, juegos de pipetas, etc).
b) Todos los reactivos deben ser preparados, alicuotados y guardados en un
rea libre de amplicones. Deben ser fraccionados para minimizar el nmero
de usos de cada lote, evitando as la posible contaminacin o deterioro. Se
debe anotar el nmero de lote en uso ya que en el caso de existir
contaminacin se podr eliminar rpidamente el lote contaminado.
c) Se recomienda la utilizacin de tips con filtros y pipetas con dispositivos de
eliminacin automtica de los mismos.
d) Se deben seguir buenas prcticas de laboratorio: cambiar los guantes
frecuentemente, centrifugar los tubos antes de abrirlos, destapar y tapar los
tubos cuidadosamente para prevenir la formacin de aerosoles, minimizar el
manejo de las muestras y agregar los componentes de la reaccin (dNTPs,
primers, buffer, enzimas) antes de la adicin de ADN. Tapar cada tubo
inmediatamente despus de la adicin del ADN y antes de proceder con la
prxima muestra.


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II.1.4 Componentes de la PCR
II.1.4.1 ADN
Existen diferentes protocolos para el extraccin de cidos nucleicos
dependiendo del tipo de muestra (sangre, biopsias, necropsias, etc.).
Para la extraccin de ADN los mtodos ms antiguos se basan en la utilizacin
de solventes orgnicos (fenol/cloroformo), actualmente est muy difundida la
utilizacin de pequeas columnas de slica que retienen los cidos nucleicos
una vez que han sido liberados de las clulas.
Para una PCR de 25 l se utilizan unos 50-100 ng de ADN genmico humano.

II.1.4.2 Primers
Recomendaciones para el diseo de los primers:
1. Para una PCR estndar cada primer debe tener entre 18 y 30 nt que
deben hibridar en la zona que flanquea la secuencia que se quiere
amplificar. Esta longitud garantiza una buena especificidad en funcin
de la probabilidad de que los primers hibriden slo en la regin que se
quiere amplificar. Si son muy cortos la PCR puede no ser especfica, y
los que se excedan en longitud pueden disminuir el rendimiento de la
reaccin.
2. La proporcin entre bases pricas y pirimidnicas se debe aproximar a
1:1 y que comiencen y terminen con 1 2 bases pricas. El contenido
G+C debe estar entre 50-60%.
3. Otra caracterstica importante del primer es su temperatura de
annealing (Ta) que es aquella que se utiliza en la reaccin de PCR
para que los primers se unan a la secuencia blanco y est unos 5C por
debajo de la temperatura de melting (Tm), que es la temperatura a la
cual el 50% de los primers estn unidos a la secuencia blanco y el 50%
estn en solucin.
La Tm es dependiente de la concentracin de primer, la composicin de
la secuencia y del solvente. Los primers pequeos tienen una Tm inferior
que los grandes an teniendo la misma composicin; sin embargo,
cuando el tamao de los primers se aproxima a los 20 - 25 nt el efecto
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de la longitud sobre la Tm disminuye y el principal efecto viene dado por
su secuencia.
Existen en la literatura varias frmulas para el clculo de la Tm. El
mtodo ms simple y ms ampliamente utilizado se basa en asignar
2C por cada A T y 4C por cada G C.
Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
Aunque se consiguen buenas aproximaciones con esta frmula, la
precisin disminuye bastante cuando se incrementa la longitud del
primer (por ejemplo, la Tm para un primer de 20 nt con igual contenido
en A+T y G+C sera de 60C [(Tm = 4(5+5) + 2(5+5)], que se aproxima
bastante a la realidad; sin embargo, para uno de 40 nt de la misma
composicin, la Tm tendra un valor absurdo de 120 C.
Algunas veces es til probar un rango de T annealing para optimizar la
amplificacin. En caso de que se observen productos inespecficos, se
puede incrementar la temperatura para mejorar el resultado.
Los valores de Tm calculados de los dos primers de cada PCR deberan
ser lo ms prximos posible para evitar que uno se una a su secuencia
blanco con mayor afinidad que el otro en las mismas condiciones de
hibridacin. Aunque el rango puede ser ms amplio, es aconsejable
escoger primers con temperaturas ptimas de annealing entre 55C y
65C.
4. Con respecto a la composicin de bases deben evitarse :
a) las secuencias que producen auto-annealing (formacin de
horquillas o lazos)
b) las interacciones primer-primer ya que producen dmeros de primers
que son productos pequeos de PCR y que miden aproximadamente
igual que dos primers unidos uno a continuacin de otro. Incluso en
reacciones muy optimizadas, se pueden obtener pequeas cantidades
de estos artefactos, que en elevadas cantidades pueden disminuir la
sensibilidad de la reaccin al competir por los componentes de la
misma. Normalmente, los dmeros se pueden evitar eliminando la
complementariedad en los extremos 3' (aunque sea en un solo
nucletido) de los dos primers utilizados para la amplificacin
(especialmente si son residuos G-C).
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Actualmente existen softwares que permiten disear primers para una
determinada PCR (por ej: Primer 3, http://primer3.wi.mit.edu/). Para ello
debemos introducir la regin de ADN que deseamos amplificar (por ej. la
secuencia de un exn) y definimos los parmetros que nos interesan: tamao
aproximado del amplicn (por ej. 250 pb), longitud aproximada de los primers
(por. ej 18-22), rango de la Tm, el contenido de GC, etc. El software nos dar
la secuencia de los primers y el lugar donde hibridan en la secuencia que
hemos introducido. Estos softwares tienen la ventaja que cuando disean los
primers evitan las secuencias que puedan dar dmeros o estructuras
secundarias.


II.1.4.3 Polimerasas
En los ltimos aos han aparecido una gran cantidad de polimerasas
comerciales que se diferencian en la estabilidad trmica, la actividad
exonucleasa, la procesividad y la tasa de incorporacin de errores.
Como el primer paso de la PCR requiere temperaturas muy altas es necesario
utilizar una ADN polimerasa que resista las altas temperaturas de todo el
proceso. Habitualmente para las tcnicas estndares se utiliza la Taq
polimerasa, que se obtuvo inicialmente de la bacteria Thermus aquaticus que
vive en aguas termales y que mantiene su actividad a temperaturas superiores
a los 70C.
Las concentraciones de las diferentes polimerasas varan significativamente,
pero para la Taq por cada 25 L de reaccin, vara entre 1,0 y 2,5U (Unidades:
cantidad de enzima necesaria para catalizar la incorporacin de 10 nmoles de
dNTPs en 30 minutos a 74 C).
Los componentes de la mezcla de reaccin debern ajustarse a las exigencias
de nuestras enzimas por lo tanto la variacin de estos puede resultar til para
optimizar la PCR.



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II.1.4.4 Desoxirribonucletidos-trifosfato (dNTP)
Los 4 desoxirribonucletidos-trifosfato (dATP, dGTP, dTTP y dCTP) son los
sustratos para polimerizar nuevo ADN.
La concentracin ptima de dNTPs debe determinarse empricamente y
conjuntamente con la de Mg
++
. De forma general, la concentracin de dNTPs
estndar es de 200M, teniendo en cuenta que concentraciones demasiado
elevadas pueden originar una menor especificidad y concentraciones
demasiado bajas pueden provocar un bajo rendimiento de los productos de
amplificacin.

II.1.4.5 Iones
Una solucin amortiguadora (buffer) mantiene el pH adecuado para el
funcionamiento de la ADN polimerasa.
Se suele usar magnesio Mg
++
, agregado comnmente como cloruro de
magnesio MgCl
2
que acta como cofactor de la polimerasa.
El aumento de Mg
++
genera uniones inespecficas de los primers y por lo
tanto disminuye la especificidad de la reaccin; las bajas concentraciones de
Mg
++
pueden originar una pobre eficiencia de la reaccin porque disminuye la
actividad de la Taq polimerasa.
La concentracin Mg
++
debe calcularse como funcin de la concentracin de
nucletidos; para la mayora de protocolos, debe probarse un rango entre 0,5 y
3,0 mM por encima de la concentracin de nucletidos. Puesto que las
soluciones de MgCl
2
tienden a precipitar despus de los ciclos de congelacin-
descongelacin, la solucin stock de MgCl
2
debe mantenerse a 4C y aadirse
a la reaccin justo antes de la amplificacin.

II.1.4.6 Aditivos
Varios aditivos y agentes potenciadores pueden ser incluidos en las
amplificaciones de PCR para aumentar el rendimiento, la especificidad y la
reproducibilidad. Estos agentes son: dimetilsulfxido (DMSO), trimetilglicina
(betana), formamida, glicerina, detergentes no inicos, albmina bovina,
polietilenglicol y cloruro de tetrametilamonio. Estos aditivos tienen efectos
beneficiosos en algunas amplificaciones por PCR, sin embargo, a veces no es
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posible predecir cul de estos agentes podra ser til para una PCR en
particular.
La formamida, betaina y el DMSO, que se utilizan para mejorar las
amplificaciones de secuencias ricas en G+C, probablemente facilitan la
separacin de las hebras y por lo tanto mejoran la accesibilidad de los primers
y la polimerasa.
El efecto del glicerol en la mejora del rendimiento de las PCR no se conoce con
exactitud, pero, presumiblemente, ayuda a estabilizar la Taq polimerasa.

II.1.5 Controles
a) Se deben largar controles positivos.
b) Se deben realizar controles negativos con ADN sin la secuencia blanco
y sin ADN. Son muy tiles para descartar contaminaciones de los
componentes de la reaccin de PCR.
c) Siempre es recomendable utilizar controles internos. Estos controles
permiten asegurar que la ausencia de amplificacin efectivamente se
debe a la ausencia de la secuencia blanco y no a una inhibicin de la
reaccin por productos contaminantes que en general provienen de la
muestra.
Como control interno de PCR puede utilizarse la amplificacin paralela
de una secuencia de ADN que sabemos que siempre est presente en
el material analizado. Debe asegurarse que esta amplificacin no
interfiera con aquella utilizada para la secuencia bajo anlisis. El
producto de ambas amplificaciones debe ser diferenciable en el sistema
de anlisis (por ej. si utilizamos electroforesis en geles de agarosa, las
diferencias entre fragmentos tendr que ser al menos el 10% de sus
tamaos).
Tambin podemos generar un control interno mediante el agregado de
un fragmento de ADN (o ARN) antes de iniciar la reaccin de PCR, en la
muestra o durante la extraccin del cido nucleico.




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II.1.6 Anlisis de los productos de amplificacin
Una de formas ms sencillas de analizar amplicones es la electroforesis en
geles de agarosa y tincin con colorantes fluorescentes que se unen al ADN,
como el bromuro de etidio.
La electroforesis es utilizada en biologa molecular para la separacin y
caracterizacin de cidos nucleicos o protenas. Esta tcnica se basa en el
desplazamiento de molculas con cargas, por accin de un campo elctrico.
Las molculas aninicas (con carga negativa) migran hacia el nodo (+) y las
molculas catinicas (carga positiva) migran hacia el ctodo (-).
El ADN es una molcula con carga negativa (grupo fosfato) que migrar hacia
el nodo. Las molculas ms pequeas se desplazan ms fcilmente en el gel
y migran ms lejos mientras que las ms grandes quedan ms cerca de los
pocillos de sembrado.
Los amplicones se observan como una banda neta cuando se irradia el gel con
luz ultravioleta. Es importante analizar el tamao del producto amplificado para
descartar posibles errores. El tamao del producto se estima por comparacin
con marcadores de tamao molecular (ladder) que son sembrados en paralelo.
El bromuro de etidio es un importante mutgeno, por lo que se deben utilizar
protecciones para evitar contacto directo y proteccin de los ojos cuando se
observa el gel con luz ultravioleta. En la actualidad el uso del bromuro de etidio
est siendo reemplazado por colorantes fluorescentes no txicos como el Gel
Red.

M L CP CN
1000pb

500pb


250pb




50pb
Figura 3. Gel de agarosa teido con bromuro de etidio. L: ladder marcador
permite estimar la longitud en nt del amplicn, CP: control positivo, CN: control
negativo, M: muestra.
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II.1.7 Tipos de PCR
II.1.7.1 PCR nested o anidada
Es una tcnica de PCR en la que el producto de una amplificacin es utilizado
como molde para realizar una segunda amplificacin con primers que se ubican
dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy
especfica y sensible.

Figura 4. PCR nested: una primer PCR genera un amplicn que es amplificado
nuevamente con un juego de primers (cebadores) que hibridan dentro de la
primera secuencia amplificada.


II.1.7.2 PCR in situ
La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o
clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de
amplificacin. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos.
En esta PCR se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y luego
deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas de ADN/ARN.
Esta tecnologa es de gran utilidad para amplificar especficamente secuencias
que se encuentran solo en algunas clulas de la poblacin celular analizada.



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II.1.7.3 PCR mltiplex
PCR en la cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin.
Emplea un juego de primers por cada secuencia que se va a amplificar. Es
decir se combinan en una nica reaccin todos los pares de primers de las
secuencias que queremos amplificar simultneamente, junto con el resto de los
reactivos de la reaccin en cantidades suficientes.
Sus ventajas: se obtiene la informacin de varios loci en una sola reaccin con
menor cantidad de ADN molde y menor cantidad de reactivos.

II.1.7.4 PCR con retrotranscripcin (RT-PCR)
Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez
de ADN, y emplea una transcriptasa inversa para realizar la sntesis de un ADN
complementario (ADNc) al ARN. La enzima MMLV (Murine Leukemia Virus)
posee la actividad ADN polimerasa dependiente de ARN y es una de las ms
utilizadas. Esta enzima tambin necesita primers para realizar la
retrotranscripcin. El ADNc obtenido se utiliza para realizar la PCR estndar.
Este tipo de PCR es muy utilizada para genomas virales a ARN y cuando se
quiere medir la expresin de determinados genes (el ARNm se retrotranscribe
a ADNc).












Figura 5. RT-PCR: El ARN se utiliza como molde para la sntesis de ADNc por
la enzima MMLV que necesita de un primer especfico o un oligo de 12 a 20
timinas que hibridan en la cola de poli-A o de random primers que son una
mezcla de primers de 6 nt de diversas secuencias que hibridan al azar sobre el
ARN. El ADNc obtenido se utiliza como molde para realizar una PCR estndar.
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II.1.7.5 Hot-start PCR
Esta modificacin trata de evitar que, durante el tiempo que los tubos se
encuentren a baja temperatura luego que todos los componentes de la reaccin
son agregados y antes de ser colocados en el termociclador, se produzcan
amplificaciones, especialmente en sitios donde el primer no debera hibridar a
la temperatura correcta.
Existen diferentes opciones:
a) Una de ellas consiste en iniciar el calentamiento del tubo de PCR sin la
enzima y agregarla cuando ste llegue a la temperatura de 95C. Desde
este momento se inicia el ciclado programado.
b) Otra forma es la utilizacin de polimerasas recombinantes o algunas que
contienen un anticuerpo monoclonal unido. Estas enzimas slo muestran
actividad polimerasa por encima de determinadas temperaturas,
asegurando as la amplificacin slo en caliente. Al no amplificar
inespecficamente se aumenta el rendimiento de la reaccin y, adems,
se pueden amplificar fragmentos de mayor tamao.

II.1.7.6 Touchdown PCR
Durante los primeros ciclos se utilizan temperaturas mayores a las ptimas.
Esto le confiere mayor especificidad a la PCR pero con baja amplificacin. En
los ciclos sucesivos se baja la temperatura mejorando la amplificacin una vez
que se ha enriquecido el medio con productos especficos.