Anda di halaman 1dari 10

LAPORANPRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PEWARNAAN GRAM

UNTUK MEMENUHI TUGAS MATA KULIAH Mikrobiologi yangdibimbingoleh Bapak Agung Witjoro, S.Pd, M.Kes

1. 2. 3. 4. 5.

Oleh : Offering C/ Kelompok5 AtikaAnggraini (130341614798) Hanifa Fitria Ratri (130341614781) Herlizza Basyarotun A (130341614782) Karima Zakiyulfani (130341614843) Riska Nurlaili (130341614848)

UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI FEBRUARI 2014

A. Topik B. Tujuan

:Pewarnaan Gram :

Mahasiswadapat: 1. Melakukan prosedur pewarnaan gram. 2. Memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan gram. 3. Memahami reaksi-reaksi kimiawi yang terlibat didalam prosedur pewarnaan gram. 4. Membedakanbakteri gram positifdan negative denganmetodepewarnaan. 5. Mengetahuimacam-macamzatwarna yang digunakandalampewarnaan.

C. DasarTeori

1. PengertiandanTujuanPewarnaan Bakteri atau mikroba lainya dapat di lihat dengan mikroskop biasa tanpa yaitu dengan cara-cara khusus, misalnya dengan cara tetesan

bergantung, menggunakan kondensor medan gelap dan lain-lain. Tetapi pengamatan dari pewarnaan ini lebih sukar dan tidak di pakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti, karena sel bakteri dan mikroba lainya transparan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil untuk mengatasi hal tersebut maka di kembangkan suatu teknik pewarnaan bakteri ,sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah di amati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwijoseputro,2005). Menurut Waluyo (2008), tujuan dari pewarnaan adalah :

Memudahkan melihat microbe dengan mikroskop Memperjelas ukuran dan bentuk microbe Melihat struktur dalam bakteri , seperti dinding sel dan vakuola Menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia khas dari bakteri dengan zat warna

Menurut Volk (1992), pewarnaan gram pada tahun 1884 seorang dokter berkebangsaan Denmark Christian gram membuat zat pewarna khusus yang barang kali terpenting penggunaannya dalam bakteriologi. Zat pewarna tersebut adalah pewarna dieferensial, karena dapat membagi bakteri sejati menjadi 2 kelompok fisiologi, dengan demikian sangat memudahkan identifikasi jenis. 2. Macam dan Fungsi Pewarnaan Menurut Hadieotomo (1988), pewarnaan ini merupakan salah satu yang amat penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode ini, bakteri dapat dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok besar, yaitu : 1) organisme yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu Kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau ungu), disebut gram positive; 2) organisme yang kehilangan kompleks warna ungu Kristal pada waktu pembilasan dengan alcohol namun kemudian terwarnai oleh pewarna tandingan, safranin (sel-sel tampak merah muda), disebut gram negative. Menurut Volk (1992), pewarnaan mungkin merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Ada 5 macam pewarnaan, yaitu : 1)Pewarnaan sederhana, memungkinkan untuk melihat bakteri dengan jelas, tetapi tidak dapat membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda dalam morfologi yang sama, 2)Pewarnaan tahan asam, untuk pewarnaan bakteri yang mengandung sejumlah besar besar zat lipoid (berlemak) didalam dinding selnya yang menyebabkan tidak permeable terhadap zat warna yang umum, 3)Pewarnaan spora, untuk pewarnaan bakteri yang membentuk endospora yang tahan terhadap kondisi ekstrim sehingga dibutuhkan perlakuan yang keras, 4)Pewarnaan kapsul, 5) Pewarnaan negative, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya hitam gelap.

3. Perbedaan Gram Positif dan Negatif, beserta contohnya Menurut Hadioetomo (1988), diketahui bahwa komposisi dinding sel bakteri gram positive berbeda dengan bakteri gram negative. Dinding sel yang lebih yang tebal pada bakteri gram positive menyusul oleh perlakuan alcohol karena terjadi dehidrasi. Sedangkan sel-sel gram negative mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi padadinding selnyadan lipid pada umumnya larut dalam alcohol dan aseton. Contoh dari gram positive adalah Saureus dan gram negative adalah E.coli. Perbedaan struktur dinding sel bakteri gram positive dan gram negative sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pemucat. Sebagian besar dinding sel bakteri gram positive terdiri dari peptidoglikan, sedangkan dinding sel bakteri gram negative mempunyai kandungan lipida yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri gram negative (Lay,1994). 4. Mekanisme Penyerapan Zat Warna oleh Gram Positif dan Gram Negatif Ada kalanya, setelah suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer, maka semua zat warna terhapus. Ditinjau dari tujuan pewarnaan sudah barang tentu pewarnaan tersebut merupakan kegagalan. Tetapi ada juga preparat yang tahan asam encer, misalnya hasil basil TBC dan basil-basil yang berspora. Setelah zat warna yang pertama (ungu) terserap, maka sediaan dicuci dengan alcohol kemudian ditumpangi dengan zat warna yang berlainan, yaitu dengan zat warna merah. Jika sediaan itu kemudian kita cuci dengan air, lalu dengan alkohol, lalu dengan alkohol, maka dua kemungkinan dapat terjadi.Pertama, zat warna tambahan terhapus, sehingga yang Nampak ialah zat warna asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kitasebut gram positif. Kedua, zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli

tidak tampak. Dalam hal ini sediaan bakteri kita katakan gram negatif (Dwidjoseputro,1998). Menurut Hadioetomo (1988), dinding sel yang lebih tebal pada bakteri gram positif menyusut. 0leh perlakuan alcohol karena terjadinya dehidrasi, menyebabkan pori-pori dinding sel menutup sehingga mencegah larutnya kompleks ungu Kristal - iodium pada langkah pemucatan. Sedangkan sel-sel gram negative mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi padadinding selnyadan lipid pada umumnya larut dalam alcohol dan aseton. Larutan lipid oleh pemucat yang digunakan dalam pewarnaan gram diduga memperbesar pori-pori dinding sel dan inilah yang menyebabkan proses pemucatan pada sel-sel gram negative berlangsung lebih cepat. D. Alat dan Bahan :

Alat : Mikroskop cahaya, , kaca objek bersih,mangkok pewarna, pinset, bak pewarna, kawat penyangga, bunsen, pipet, lampu spiritus, botol pemyemprot, spiritus

Bahan : Aquades steril, Nutrisi agar padat, larutan ammonium oksalat kristal violet, kertas pengisap, korek api, alkohol 95%, lisosol, sabun cuci, larutan safranin, larutan iodium

E. Cara Kerja

Sediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan diatas nyala api lampu spiritus.

Teteskan setetes aquades steril diatas kaca benda tersebut

Secara aspetik ambillah inokulum bakteri yang akan diperiksa, lalu letakan diatas tetesan aquades itu. Kemudian ratakan perlahan-lahan

Buanglah kelebihan zat warna tersebut kedalam mangkuk dan bilaslah sediaan dengan air kran

Letakkan sediaan di atas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk pewarna. Lalu teteskan larutan ammonium oksalat kristal violet diatas sediaan tersebut . tunggulah selama 1 menit diatas nyala api

Lakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan tersebut diatas nyala api lampu spiritus dengan cepat

Teteskan larutan ioium diatas sediaan itu lalu tunggulah selama 2 menit

Buanglah Kelebihan larutan iodium kedalam mangkuk lalu bilaslah dengan air kran

Tetekan alkohol 95 % diatas sediaan , lalu biarkan selama 1 menit

Buanglah kelebihan larutan safranin itu kedalam mangkuk, lalu bilaslah dengan air kran

Teteskan larutan safranin diatas sediaan , lalu biarkan selama 30 detik

Buanglah sisa alkohol itu kedalam mangkuk dan bilaslah sediaan dengan air kran

Keringkan sediaan itu secara hati-hati dengan kertas penghisap, lalu periksalah dibawah mikroskop

Catatan : Jika teknik pewarnaan berhasil dengan baik, maka sel-sel bakteri yang bersifat gram positif akan berwana ungu, sedangkan sel-sel bakteri yang bersifat gram negatif akan berwarna merah muda atau merah. F. DATA
Perlakuan Ditetesi Kristal Violet Ditetesi iodium Ditetesi Alkohol Ditetesi Sapranin Pengamatan mikroskop Bakteri Koloni A Berwarna ungu Berwarna ungu Berwarna ungu Berwarna ungu Berwarna ungu Bakteri Koloni B Berwarna Ungu Berwarna ungu Berwarna ungu Berwarna ungu Berwarna ungu

G. ANALISIS DATA Bakteri koloni A diletakkan pada kaca preparat dan ditetesi dengan amonium oksalat, setelah itu dibiarkan selama 1 menit, kemudian dibilas dengan air kran, warna bakteri berubah menjadi ungu. setelah itu ditetesi dengan iodium dan ditunggu selama 2 menit, setelah itu dibilas lagi dengan air kran, bakteri tetap berwarna ungu. Setelah itu ditetesi dengan alkohol 95% dan ditunggu selama 1 menit dan dibilas dengan air kran, bakteri tetap berwarna ungu. Kemudian bakteri ditetesi dengan sapranin ditunggu selama 30 detik lalu dibilas dengan air kran, warna bakteri tetap ungu dan kemudian dikeringkan dengan tisu. Setelah itu diamati dengan mikroskop elektron, terlihat bakteri berwarna ungu. Perlakuan untuk pengecatan bakteri koloni B sama dengan perlakuan pengecatan bakteri koloni A, pertama bakteri koloni B diletakkan di kaca preparat lalu ditetesi dengan amonium oksalat lalu ditunggu selama 1 menit kemudian dibilas dengan air kran, koloni bakteri B sama seperti koloni bakteri A yaitu

berwarna ungu, kemudian ditetesi dengan iodium dan ditunggu selama 2 menit setelah itu dibilas lagi dengan air kran, bakteri tetap berwarna ungu. Setelah itu ditetesi dengan alkohol 95% dan ditunggu selama 1 menit dan dibilas dengan air kran, koloni bakteri A tetap berwarna ungu, setelah itu bakteri ditetesi dengan sapranin ditunggu selama 30 detik lalu dibilas dengan air kran warna bakteri tetap berwarna ungu dan kemudian dikeringkan dengan tisu. Setelah itu diamati dengan mikroskop elektron, terlihat warna bakteri berwarna ungu dan sedikit merah muda. H. PEMBAHASAN Hasil percobaan pengecatan gram pada bakteri koloni A dan bakteri

koloni B diperoleh hasil yang sama. Prosedur pertama dalam pengecatan gram adalah bakteri diberi setetes kristal ovalet lalu dibilas dengan air kran, pada proses ini bakteri berubah warna menjadi ungu, karbol ungu kristal diserap dalam dinding sel dan protoplasma bakteri sehingga koloni bakteri menjadi berwarna ungu (Jeneng, 1998) Prosedur kedua adalah bakteri ditetesi dengan iodium, dan kemudian dibilas dengan air kran, bakteri tetap berwarna ungu. Kompleks ungu kristal iodium terbentuk didalam sel, sel tetap berwarna ungu (Pelczar, 2008). Prosedur ketiga adalah pencucian bakteri dengan alkohol 95%, tujuan pencucian dengan alkohol adalah agar terjadi deferensiasi dari dua macam bakteri (Agus, 2012). Pada bakteri gram positif dinding sel mengalami dehidrasi, poripori menciut, daya rembes dinding sel dan membran menurun, ungu kristal iodium tak dapat keluar dari sel, sel tetap ungu, sedangkan pada bakteri gram negatif lipid terekstraksi dari dinding sel, pori-pori mengembang, kompleks ungu kristal iodium keluar dari sel, sel menjadi tidak berwarna (Pelczar, 2008). Prosedur terakhir adalah ditetesi dengan warna merah sapranin, tujuan pemberian sapranin adalah pemberian sapranin berguna untuk mewarnai kuman yang kehilangan warna bila ditetesi dicuci dengan alkohol. pada bakeri gram positif sel tidak terpengaruh, tetap ungu. Sedangkan pada bakteri gram negatif sel menyerap zat pewarna menjadi merah (pelczar, 2008).

Pada saat pengamatan dengan mikroskop elekteron, warna sel bakteri adalah ungu. Sehingga bakteri koloni A dan bakteri koloni B adalah jenis bakteri gram positif. Bakteri gram positif mempertahankan zat pewarna ungu kristal dan karenanya tampak ungu tua (pelczar, 2008) I. KESIMPULAN Pada percobaan pengecatan gram pada bakteri koloni A dan bakteri koloni B tersebut dapat disimpulkan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri gram positif. hal ini ditandai dengan hasil perlakuan yang dilakukan tidak mempengaruhi warna dari bakteri, bakteri tesebut tetap mempertahankan warna ungu. J. SARAN 1. Pada saat pengecatan harus sesuai dengan prosedur yang ditentukan 2. Pada waktu penetesan reagen usahakan jangan sampai melampaui waktu yang telah ditentukan atau kurang dari waktu yang ditentukan

Daftar Pustaka : Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-DasarMikrobiologi. Jakarta :Djambatan. Hadioetomo. 1988. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta :PT Gramedia Lay dan Hartono.1992. Mikrobiologi. Jakarta : Rajawali Pers. Pelczar, Michael J. & Chan, E. C. S. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press Syachrurachman, Agus. Dkk. 2012.Mikrobiologi Kedokteran.Tangerang : Binarupa Aksara Tarigan, Jeneng. 1998. Pengantar Mikrobiologi. Jakarta : Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jendral Volk, Wheter. 1992. Mikrobiologi Dasar. University Of Southern Maine. Waluyo. 2008. Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press