Microscopa y coloraciones

Microscopia y coloraciones
Jorge L. Zuazo Silva

MICROSCOPIA
La microscopia es la ciencia que se ocupa de los usos y de las aplicaciones interpretativas de los microscopios, los cuales hacen posible que partculas muy pequeas sean percibidas por el ojo humano. La historia de la microbiologa va estrechamente ligada a la de la microscopia. La aparicin de las lentes, la observacin de protozoos y bacterias, y el desarrollo cientficotcnico en el campo de la microscopia, han ido marcando hitos de avance en el conocimiento de los organismos vivos imperceptibles por el ojo humano a simple vista. Segn Barrer, la microscopia tiene dos objetivos principales; el primero es la formacin de una imagen aumentada con la menor cantidad posible de defectos pticos y el segundo, lograr el contraste. En este captulo, que dedicamos a los principios bsicos de la microscopia y su aplicacin en los campos de la microbiologa y de la parasitologa mdicas, expondremos algunas definiciones y conceptos fundamentales, as como describiremos ciertas tcnicas de microscopia de fcil acceso, sealando sus aplicaciones, ventajas y limitaciones.

CONSIDERACIONES GENERALES
El poder de resolucin de un microscopio es la distancia que debe separar a dos fuentes luminosas puntiformes, si estas se han de ver como dos imgenes distintas. El ojo humano logra la resolucin cuando el ngulo visual es lo bastante amplio para que los rayos de luz, procedentes de dos puntos distintos, encuentren diferentes elementos receptores en la retina. De este modo la distancia lineal entre objetos o poder de resolucin del ojo humano desnudo es de aproximadamente 0,07 mm. Una de las propiedades ms importantes de la luz es la longitud de onda, representada por la letra griega lambda (). En la luz empleada para la observacin microscpica, dicha propiedad est estrechamente relacionada con la resolucin que puede obtenerse.

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El lmite de resolucin (d ) depende de la apertura numrica del objetivo (AN) y de la longitud de onda de la luz usada (), lo cual est definido por la frmula matemtica: dmin = AN Por lo tanto, la mejor resolucin (dmin ms pequea) se obtiene usando la menor longitud de onda y el lente objetivo de la mayor apertura numrica posible. La amplificacin til de un microscopio es aquella que permite observar las ms pequeas partculas susceptibles de resolucin. Es importante sealar que una mayor amplificacin no dara siempre una mejor resolucin de los detalles y conllevara la reduccin del rea de observacin, los llamados campos microscpicos.

MICROSCOPIOS MICROSCOPIOS LUMINOSOS

Son los microscopios que utilizan luz visible con el fin de hacer observable un espcimen. Entre estos microscopios se encuentran:

Microscopio luminoso simple

Est compuesto por una sola lente de aumento, de gran campo, que produce una imagen vertical. Su uso est limitado por su baja AN y su resolucin es de unos 10 m. Estas lentes son tiles para la diseccin, para las mediciones y para el examen de las reacciones de aglutinacin. En los laboratorios de microbiologa se utilizan en los contadores de colonias, donde aparecen adaptadas a una base e iluminacin apropiadas para el objetivo que se persigue con el equipo. Algunos de los problemas que se presentan con el uso de una sola lente, como el no poder colocar el campo total dentro del foco y la presencia de anillos coloreados alrededor de los objetos observados, se resuelven en la actualidad con el uso de varias lentes combinadas.

Microscopio luminoso compuesto

Consta, por lo menos, de dos sistemas de lentes. El objetivo, de mltiples compartimentos con breves longitudes focales, que forma una diminuta imagen real invertida en el plano focal de otra lente; y la lente ocular, la cual magnifica la imagen para que el observador pueda resolverla. Estos microscopios pueden tener uno o dos lentes oculares, denominndose microscopio monocular o binocular respectivamente. El objetivo es el determinante ms importante de la calidad de la imagen producida por el microscopio y es necesario corregir en cada una de ellas una o ms aberraciones o errores. Adems del grado de correccin de una lente, la calidad de la imagen est determinada por su AN. Los microscopios compuestos tienen varios objetivos intercambiables, con diferentes poderes de amplificacin. El mecanismo de enfoque consta de un tornillo macromtrico, con el que se cambia rpidamente la distancia entre el objetivo y el espcimen, y de un tornillo micromtrico, para cambiar lentamente dicha distancia. Para la microscopia en campo luminoso de gran resolucin, los objetivos de inmersin (AN = 1,2 a 1,4 ) son muy tiles. El aceite que se emplea para la inmersin de estos objetivos es un lquido viscoso que no seca y es refractivamente estable, con un ndice de refraccin de 1,51.

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El aumento total de un microscopio luminoso se calcula multiplicando el poder de aumento del objetivo por el de la lente ocular. Ejemplo: ocular (10X) y objetivo (40X): 10 x 40 = 400 dimetros de aumento. Los microscopios usados en bacteriologa utilizan, por lo general , los objetivos de 90 o 100 dimetros de aumento con oculares de 10 dimetros, amplificando de 900 a 1 000 veces; por lo que una partcula observada de 0,2 m de dimetro puede ser amplificada hasta 0,2 mm, resultando claramente visibles. En los microscopios luminosos el poder de resolucin puede mejorarse mediante el uso de luz con longitud de onda ms corta, de aproximadamente 0,2 m, que permite una resolucin de partculas de 0,1 m de dimetro. La microscopia en campo iluminado o claro es la ms usada para la observacin de frotis coloreados, pero puede tambin emplearse para examinar caractersticas morfolgicas y la movilidad de los organismos en preparaciones denominadas gotas colgantes o en fresco (suspensin del microorganismo en una gota de lquido, colocada sobre lmina portaobjeto y cubierta con lmina cubreobjeto). Otro ejemplo de microscopio compuesto de gran utilidad en los laboratorios de microbiologa y parasitologa mdicas, es el microscopio estereoscpico, el cual combina dos microscopios compuestos que producen imgenes separadas para cada ojo a un ngulo ligeramente diferente. Pueden contar con uno o con dos objetivos. Puede utilizarse luz reflejada o luz transmitida, pero como no tiene condensador, el tipo y la intensidad de la iluminacin son factores limitantes. Estos microscopios son muy tiles para examinar las caractersticas de las colonias de bacterias, hongos, cultivos de tejidos y otros organismos parsitos.

MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASES

Se fundamenta en el hecho de que las ondas luminosas que pasan a travs de objetos transparentes, como las clulas, emergen en fases diferentes dependiendo de las propiedades de los materiales que atraviesan. En 1934, Zernike desarroll mtodos pticos para separar las ondas luminosas incidentes y difractadas, amplificando as la diferencia de fases entre ellas. Un sistema ptico especial convierte esta diferencia de fase en una diferencia de intensidad; de este modo, unas estructuras aparecen ms oscuras que otras. En el microscopio de contraste de fases, el condensador tiene un diafragma anular que produce un centro luminoso hueco y el objetivo est acondicionado para acentuar los cambios de fases producidos en la muestra. Una ventaja es la posibilidad de diferenciar las estructuras internas de clulas vivas, pues con el microscopio ordinario lo usual es la observacin de preparaciones de materiales muertos y teidos.

MICROSCOPIA EN CAMPO OSCURO

Se utiliza el mismo microscopio luminoso, empleando un condensador cuya apertura numrica es mayor que la del objetivo y bloquea los rayos de luz directos, as como desva la luz de un espejo al lado del condensador en un ngulo oblicuo. De esta manera se crea un campo oscuro que produce contraste contra los bordes destacados de los microorganismos y se origina cuando los rayos oblicuos son reflejados del borde del microorganismo hacia arriba, al objetivo del microscopio. Como los objetos luminosos contra fondo oscuro son percibidos por el ojo ms fcilmente, este tipo de iluminacin para observacin microscpica es til para visualizar flagelos bacterianos y bacterias espirilares mal definidas con la microscopia de campo claro y de contraste de fase.

MICROSCOPIA POR FLUORESCENCIA

Este tipo de microscopio se basa en el principio de remocin de la iluminacin incidente por absorcin selectiva, transmisin de la luz absorbida por la muestra y reemitida con diferente longitud de onda.

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Los compuestos capaces de absorber luz de una determinada longitud de onda y de emitir luz de mayor longitud de onda, se denominan fluorocromos. Las longitudes de onda absorbidas y emitidas dependen de los fluorocromos utilizados. El rayo luminoso emitido desde la fuente pasa por un filtro de excitacin que elimina las longitudes de onda que no sirvan para excitar al fluorocromo utilizado. La luz que la muestra hace fluorescente se transmite a travs de un filtro de barrera que elimina del rayo a la longitud de onda incidente. De esta manera, slo la luz que ha interactuado con la muestra con un cambio de longitud de onda, contribuye a la intensidad en el plano de la imagen. Diferentes fluorocromos son empleados en la prctica, entre los cuales podemos mencionar la auramina y la naranja de acridina, de uso en la tincin directa de microorganismos. En los laboratorios de microbiologa mdica se utilizan para la deteccin de microorganismos en hemocultivos y para la observacin de bacilos acidorresistentes en frotis. Otros fluorocromos, tales como isotiocianato de fluorescena, pueden ser conjugados a anticuerpos y se emplean en los laboratorios en tcnicas conocidas como inmunofluorescencia, que nos permiten, con una alta sensibilidad y especificidad, localizar antgenos en una muestra dada. Dos tcnicas bsicas de inmunofluorescencia son usadas en microscopia: directa e indirecta. Con la tcnica directa, la muestra en estudio se fija a una lmina portaobjeto y se le adiciona un anticuerpo conjugado con isotiocianato de fluorescena. Si el antgeno correspondiente se encuentra presente en la muestra, el anticuerpo se le une. La lmina se observa al microscopio por fluorescencia y el fluorocromo unido a la inmunoglobulina y a su antgeno, emite luz de una longitud de onda visible. El observador la percibe con un color brillante en intenso contraste con los no coloreados y con el fondo de la preparacin. La inmunofluorescencia directa es muy utilizada en los laboratorios para identificar, de manera relativamente rpida, antgenos virales en clulas de especmenes clnicos (virus respiratorios, herpesvirus, etc.), y para el diagnstico de otros agentes microbianos tales como: Bordetella pertussis, Legionella pneumophila, Streptococcus pyogenes, Francisella tularensis, Chlamydia trachomatis, Cryptosporidium paarvum y Giardia lamblia, por citar algunos. Las tcnicas de inmunofluorescencia indirecta (IFA) se basan en tener un colorante fluorescente conjugado a un anticuerpo secundario (anticuerpo antiinmunoglobulina). El antgeno se puede encontrar en la muestra fijada sobre la lmina portaobjeto sobre la cual se hace reaccionar un anticuerpo conocido dirigido a localizar los antgenos en la muestra. Despus de realizar un lavado con el fin de remover el anticuerpo no fijado, se adiciona el conjugado formado por el anticuerpo antiinmunoglobulina y la fluorescena, el que se une al anticuerpo primario (inmunoglobulina) si est presente. El complejo formado por el antgeno, el anticuerpo primario y el anticuerpo secundario conjugado, puede ser visualizado de la misma manera que en el mtodo de inmunofluorescencia directa. Entre las ventajas de la tcnica indirecta se encuentran: su mayor sensibilidad, la posibilidad de utilizar el anticuerpo secundario conjugado para la deteccin de diferentes anticuerpos primarios y la probabilidad de poder cambiar la especificidad del anticuerpo secundario para detectar la clase de anticuerpo que est presente en una muestra. La desventaja es que su proceder tcnico lleva varios pasos, los cuales la hacen un poco ms larga que la prueba directa y al igual que esta, requiere personal tcnico bien adiestrado.

MICROSCOPIO ELECTRNICO
El microscopio electrnico ha hecho posible resolver el detalle celular a nivel molecular y ha permitido a los cientficos poder observar las estructuras detalladas de las clulas procaritica y eucaritica. En el campo de la virologa ha constituido un instrumento muy valioso, pues permiti la observacin y la identificacin de virus. Este microscopio usa una corriente de electrones en lugar de rayos luminosos para producir la imagen magnificada de un objeto, lo cual le confiere una mayor resolucin, debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho ms corta que los fotones de la luz blanca.

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Electrones acelerados en un campo elctrico estn asociados con longitudes de ondas cortas. Por ejemplo, electrones acelerados en un campo de 100 kV tienen longitudes de onda de aproximadamente 0,004 nm . Una explicacin muy detallada de la microscopia electrnica escapa al alcance y objetivos de este captulo, por lo que sealaremos algunos principios generales y su aplicacin en la microbiologa. El microscopio electrnico de transmisin (MET) tiene muchas caractersticas en comn con el microscopio luminoso. Fue el primero de los microscopios electrnicos y emplea un rayo de electrones, dirigido o enfocado por un lente condensador electromagntico sobre una muestra delgada. Al chocar los electrones con la muestra, se diseminan de manera diferencial, algunos pasan a travs de la muestra y se renen y enfocan mediante lentes objetivos electromagnticos que presentan una imagen de la muestra al sistema de lentes proyectores, para una amplificacin posterior. La imagen se visualiza permitiendo que caiga en una pantalla que fluoresce cuando recibe el impacto de los electrones. Tiene un gran poder de resolucin, permite la observacin de partculas separadas por 0,001 m, con dimetros entre 0,001 y 0,2 m . En el microscopio electrnico de barrido (MEB), los electrones se enfocan mediante lentes en un punto muy fino y su interaccin con la muestra libera diferentes tipos de radiaciones (electrones secundarios) de la superficie del material, que son capturadas por un detector, amplificadas y luego transformadas en imgenes en una pantalla de televisin. Este microscopio tiene un poder de resolucin ms bajo que el MET y resulta muy til para la observacin tridimensional de objetos microscpicos. Las tcnicas convencionales ms usadas en la microscopia electrnica son: la tincin negativa, la microtoma y la congelacin. La tincin negativa ha tenido amplia aplicacin en el estudio de las macromolculas, virus y organelas bacterianas. Los otros dos mtodos ofrecen informacin sobre la morfologa de las subunidades de las estructuras celulares y se han usado con xito en el estudio de los antibiticos y su accin sobre las membranas de las bacterias y los hongos. Una tcnica importante en la microscopia electrnica es el uso del sombreado, consistente en el depsito de una capa delgada de metal pesado sobre la muestra, la que se coloca en la va del rayo de iones metlicos, en un vaco. Al obtener una impresin positiva de una imagen negativa, se logra un efecto tridimensional.

AUTORRADIOGRAFA
Se trata de un procedimiento que tiene gran utilidad para el estudio de la replicacin del ADN, que emplea timidina marcada con tritio como trazador especfico en el seguimiento del proceso de replicacin. El mtodo se basa en fijar en una lmina portaobjeto, las clulas a las que se han incorporado tomos radiactivos, se cubren con emulsin fotogrfica y se almacenan en la oscuridad por un perodo dado. En la pelcula revelada aparecen huellas que emanan de los sitios de desintegracin radiactiva. Si las clulas son marcadas con un emisor dbil como el tritio, las huellas resultan lo suficientemente breves como para mostrar la posicin del marcador radiactivo en la clula. Con el mismo principio del mtodo se ha usado sondas de cido nucleico marcado, conocido como hibridacin in situ, y que resulta til para detectar la presencia de cido nucleico viral, bacteriano y mictico en clulas y tejidos.

COLORACIONES
Un colorante biolgico es una molcula que es capaz de unirse a una estructura de la clula y darle color. Los colorantes se emplean tambin en la constitucin de los medios de cultivo, como indicadores o como inhibidores. En microbiologa, las coloraciones tienen diferentes objetivos: demostrar los microorganismos y algunas otras clulas en diferentes especmenes; poner de manifiesto algunas caractersticas morfolgicas y estructuras microbianas tales como: esporas, flagelos, grnulos, cpsulas, etc., y diferenciar los microorganismos segn su comportamiento tintorial.

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Los colorantes que se extraen de productos vegetales o animales se denominan colorantes naturales, entre los que se encuentran: el carmn, el tornasol, el ndigo y la hematoxilina. Otros, como los extrados del alquitrn de hulla, son anilinas sintticas. En la actualidad, el trmino colorante de anilina se est abandonando porque muchos de los colorantes sintticos en uso, no derivan de la anilina. Los cidos y las bases libres son, en general, poco solubles, por lo que en microbiologa se utilizan casi exclusivamente las sales de los cidos y de las bases colorantes. Los llamados colorantes bsicos contienen un catin coloreado unido a un anin incoloro y los cidos constan de un catin incoloro unido a un anin coloreado. Los bsicos son los ms usados en bacteriologa, debido a que las bacterias, ricas en cidos nucleicos, portan cargas negativas en forma de grupos fosfatos, los que se combinan con los colorantes cargados positivamente. Entre los colorantes bsicos, los ms empleados son: tionina, azul de toluidina, azul de metileno, fucsina, violeta cristal, violeta de genciana, verde metilo, safranina y verde de malaquita. Entre los cidos podemos citar: naranja G, cido pcrico, fucsina cida y eosina. Los colorantes cidos se utilizan en tcnicas especiales, coloraciones negativas o en mtodos para estudiar algunas estructuras bacterianas, fundamentalmente citoplasmticas. Existe un grupo de sustancias, cuya base y cido tienen carcter colorante, y son denominadas colorantes neutros . Entre ellos se encuentra el grupo de los eosinatos: eosinato de azul de metileno, de azul de toluidina, de violeta de metilo. El primer paso de cualquier coloracin es la preparacin del frotis, el que puede realizarse a partir de las colonias, de cultivos en caldo y de las muestras o productos patolgicos que se examinan. En la preparacin de los frotis es necesario seguir el mtodo establecido, cuyos pasos fundamentales consisten en extender el material sobre la lmina portaobjeto, secar al aire o con ligero calor y fijar con calor. Algunos frotis pueden fijarse con metanol, alcohol absoluto o cloroformo. El frotis debe ser preparado de manera tal que al realizar la observacin microscpica, los microorganismos se encuentren con la separacin adecuada que permita la ptima visualizacin de cada uno, lo que se logra al hacer una preparacin cuidadosa, que no sea demasiado gruesa, evitando las masas de microorganismos. El objeto de toda coloracin es fijar el colorante sobre la materia a teir con una intensidad tal que un lavado con el solvente que sirvi para preparar el bao de tintura, no la decolore. Las soluciones colorantes que se emplean en bacteriologa son, en general, acuosas. Cuando los microorganismos se tien por simple inmersin en el bao colorante, se denominan coloraciones directas, y cuando se tien tras la accin de un mordiente, se nombran coloraciones indirectas o por aplicacin de un mordiente. Las coloraciones simples utilizan una sola sustancia colorante. En las coloraciones diferenciales, combinadas o compuestas se hacen actuar simultnea o sucesivamente varios colorantes con el fin de demostrar diferencias entre las estructuras de las clulas. En microbiologa mdica se usan con mucha frecuencia dos mtodos de coloraciones compuestas o diferenciales, la coloracin de Gram y la coloracin de Ziehl-Neelsen.

COLORACIONES SIMPLES
Usan un solo colorante, no distinguen por lo tanto, organismos ni estructuras con reacciones tintoriales diferentes. Se emplean para la observacin del tamao, forma y agrupacin de las clulas. El proceder consiste en dejar actuar, durante un tiempo, la solucin colorante sobre el frotis. Los colorantes ms empleados son: azul de metileno, fucsina diluida, tionina fenicada, azul de toluidina, safranina y cristal violeta.

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COLORACIONES COMPUESTAS O DIFERENCIALES Coloracin de Gram

En 1884, Hans Christian Gram desarroll un mtodo de tincin bacteriana que coloreaba algunas clulas de color azul-violeta y otras que se decoloraban, se tean con el color de la solucin colorante empleada como contraste. En el procedimiento para la coloracin de Gram se usan cuatro reactivos diferentes. El primero es una solucin de cristal violeta (cloruro de hexametil-p-rosanalina), que tie todas las clulas de color azul-violeta. El segundo reactivo es una solucin de Lugol (yodo-yoduro de potasio). El yoduro remplaza al cloruro en la molcula de cristal violeta y el complejo formado se vuelve insoluble en agua. Todas las clulas reaccionan de igual forma. La adicin de un tercer reactivo, decolorante (acetona y etanol), remueve solamente el colorante de las clulas gramnegativas. Con el fin de explicar esta manera de actuar se han planteado diversas causas, entre ellas, diferentes uniones al magnesio, a las ribonucleasas o al cido nucleico. Tambin se sealan diferencias en la permeabilidad, que sugiere que el alcohol decolora la membrana externa de las bacterias gramnegativas, las cuales permiten la salida del complejo cristal violeta-Lugol. La safranina, colorante de contraste y cuarto reactivo empleado en el mtodo, hace visible las clulas gramnegativas al teirlas de color rojo. Se ha demostrado que la estructura de la pared bacteriana es la base de la reaccin diferencial frente a la coloracin de Gram. Las bacterias teidas de azul-violeta, llamadas grampositivas, poseen grandes cantidades de cido teicoico en sus paredes celulares; y las teidas en rojo, bacterias gramnegativas, contienen lipopolisacridos. Se han descrito diferentes modificaciones al mtodo original de Gram, entre las que podemos citar: La modificacin de Hucker, que recomienda la utilizacin de una solucin de cristal violeta en lugar de la violeta genciana empleada por Gram. Otra modificacin es la que emplea carbolfucsina como colorante de contraste y se recomienda para el estudio de bacilos anaerobios gramnegativos y de las especies del gnero Legionella. La modificacin de Kopeloff se recomienda para una mejor visualizacin de las bacterias anaerobias y consiste en adicionar a la solucin de cristal violeta, colocada sobre el frotis, unas gotas de una disolucin de NaHCO3 al 5 %.

COLORACIN DE MICROORGANISMOS ACIDORRESISTENTES

Las especies del gnero Mycobacterium, las nocardias, algunos actinomicetos y los criptosporidios, retienen los colorantes aun despus de los procesos de decoloracin con cidos, o con soluciones de cido-alcohol o cido-acetona, por lo que son denominados microorganismos acidorresistentes. Dicho carcter es atribuido a un componente lipdico (cido miclico) en las paredes bacterianas de las especies del gnero Mycobacterium y otros organismos relacionados. En el caso de los criptosporidios y de las endosporas se le atribuye a factores de impermeabilidad. Los componentes y factores antes mencionados hacen ms difcil la penetracin del colorante en la clula microbiana, por lo que los procederes para estas coloraciones necesitan de la ayuda del calor, de solventes orgnicos o de detergentes. Entre los mtodos de coloracin para demostrar la acidorresistencia se encuentran el mtodo de Ziehl-Neelsen, el de Kinyoun y el que utiliza colorantes de fluorocromo; en este ltimo es necesaria la observacin en un microscopio de fluorescencia. La coloracin de Ziehl-Neelsen es una modificacin de un mtodo descrito por Paul Ehrlich en 1882 y consiste en cubrir el frotis con una solucin de carbolfucsina que se calienta hasta que emita vapores, se decolora con alcohol-cido (cido clorhdrico al 3 % en

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etanol) y finalmente se aplica un colorante de contraste, azul o verde (azul de metileno de Lffler o verde de malaquita). Los microorganismos que retienen el color rojo del primer colorante son los acidorresistentes y los que no los retienen, son los no acidorresistentes, y toman el color del colorante de contraste. La coloracin de Kinyoun no requiere la aplicacin del calor y utiliza colorantes similares al mtodo de Ziehl-Neelsen. El mtodo que aplica rodamina-auramina no utiliza el calor y emplea como colorante de contraste una solucin de permanganato de potasio o de naranja de acridina.

COLORACIONES NEGATIVAS
Son coloraciones que se emplean fundamentalmente para la observacin de estructuras bacterianas que se tien con dificultad con otros mtodos. Se fundamenta en hacer resaltar las clulas sin teir, sobre un fondo teido; para lograrlo se utiliza tinta china o colorantes cidos (ejemplo: la nigrosina).

COLORACIONES PARA DEMOSTRAR ESTRUCTURAS DE LOS MICROORGANISMOS Coloracin de cpsulas

Los mtodos ms usados para poner de manifiesto las cpsulas bacterianas son las coloraciones negativas o sus modificaciones. Un mtodo de tincin de la cpsula es el que trata las bacterias con una solucin caliente de cristal violeta seguido por un lavado con solucin de sulfato de cobre, con el fin de remover el exceso de colorante, ya que el lavado con agua disolvera la cpsula. El sulfato de cobre tambin imparte color al fondo. A la observacin microscpica, la clula y el fondo aparecen teidos en color azul oscuro y la cpsula de color azul plido. La coloracin de Anthony-Hiss emplea las mismas soluciones colorantes antes descritas, pero en el momento de realizar el frotis, los microorganismos se suspenden en un lquido proteico (leche, suero). Despus de la aplicacin de los colorantes, el cristal violeta se fija a la protena y destaca la cpsula de la clula; el sulfato de cobre tie la cpsula.

Coloracin de flagelos
Cuando los flagelos se tratan con suspensiones coloidales inestables de sales de cido tnico, pueden ponerse de manifiesto y conocerse su disposicin en la clula. El fundamento del mtodo est dado por la formacin de un grueso precipitado que se deposita sobre la pared celular y los flagelos, aumentando el dimetro de los mismos, de manera tal que al aplicar fucsina bsica se hacen visibles en el microspio ptico (coloracin de Leifson). El mtodo de Leifson fue modificado por Ryu y utiliza el cristal violeta en lugar de la fucsina, que hace ms estables los reactivos a la temperatura ambiente. Otro mtodo para la coloracin de estas estructuras es la coloracin con plata, que emplea, entre otras, una solucin de nitrato de plata y aplicacin de calor. Los flagelos se visualizan al microscopio como lneas oscuras. En los casos de bacterias con muchos flagelos, se pueden agrupar en haces durante el movimiento y es posible observarlos al estudiar la clula viva mediante la microscopia de campo oscuro o de contraste de fases.

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Coloracin de esporas
En observaciones microscpicas de preparaciones de bacterias sin teir, las esporas se observan como cuerpos refringentes intracelulares y si las clulas bacterianas estn teidas con los mtodos habituales, se aprecian como zonas incoloras en su interior. Para la tincin de las esporas, habitualmente se utiliza el carbolfucsina o el verde de malaquita. El primero, en el mtodo de Ziehl-Neelsen ya descrito, y el segundo, en el mtodo de Schaeffer-Fulton. En el mtodo de Moeller se aplican los mismos colorantes que en el procedimiento de Ziehl-Neelsen, pero se fija el frotis con alcohol absoluto y cloroformo. Por la impermeabilidad de la pared de la espora se requiere calentar la preparacin con el fin de que el colorante penetre. Al emplear suficiente cantidad de alcohol que permita la decoloracin de la clula vegetativa, la impermeabilidad de la pared no permite la decoloracin de la espora. En los mtodos de tincin de las esporas antes sealados, se utilizan colorantes de contraste para la clula vegetativa. Cuando teimos la espora con verde de malaquita, utilizamos safranina como colorante de contraste; y cuando la espora se tie con carbolfucsina, la clula vegetativa se tie con azul de metileno.

Coloraciones de grnulos metacromticos

Los grnulos de volutina en el interior del citoplasma bacteriano, constituyen una fuente de adenosina trifosfato (ATP) y tienen la caracterstica de ser grnulos metacromticos, o sea, que aparecen teidos de diferente color al resto de la clula. Se tien intensamente con los colorantes de anilina. Se han descrito diferentes mtodos de coloracin para ponerlos de manifiesto, entre ellos: la coloracin de Albert, la modificacin de Christensen, la coloracin de Neisser y las coloraciones de azul de metileno para grnulos y bacterias, as como la coloracin con azul de metileno alcalino.

Coloracin de ncleo
Los ncleos se pueden teir con los colorantes especficos para ADN. Ejemplo: coloracin de Feulgen.

OTRAS COLORACIONES UTILIZADAS EN MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA MDICAS

Los mtodos citados a continuacin y otros, sern tratados en los captulos correspondientes a cada uno de los microorganismos:

En bacteriologa
Naranja de acridina. Se emplea para distinguir entre las bacterias y las clulas humanas, como en el caso de la sangre y el lquido cefalorraqudeo. Tambin puede usarse para la tincin de Mycoplasma sp . y de algunos parsitos. Coloracin de Brown-Hopes-Gram. Recomendada para distinguir bacterias en cortes de tejidos. Coloracin de Warthin-Stary. Se emplea para la observacin de espiroquetas y en la tincin de biopsias de tejidos para la deteccin de rickettsias. Coloraciones de Giemsa, Machiavello y Castaeda. Permiten la deteccin de rickettsias con el empleo del microscopio luminoso. Las clamidias, que tienen propiedades tintoriales similares a las rickettsias, son detectadas mediante las coloraciones de Giemsa y Machiavello.

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En micologa
Lactofenol azul de algodn. Para la deteccin de elementos de los hongos. Coloracin de Schiff. cido peridico, de gran aplicacin en la deteccin de clulas levaduriformes y de hifas de hongos en tejidos. Coloraciones de Giemsa y de Wright. Muy usadas para la identificacin de Histoplasma capsulatum. Coloracin rpida de Gomori (metenamina-nitrato de plata). Se emplea en la observacin de hongos. De gran utilidad en la histopatologa de las lesiones producidas por hongos (ejemplo: micetomas) y en la deteccin de Pneumocystis carinii. El empleo del fluorocromo calcoflor blanco facilita la visualizacin de estructuras fngicas al ser observadas al microscopio de fluorescencia. De gran utilidad en la deteccin de Pneumocystis carinii.

En parasitologa
La modificacin de Wheatley de la coloracin tricrmica de Gomori y el uso de hematoxilina frrica en el examen de las heces fecales; las coloraciones de Giemsa, de Wright, de Field, de Leishman y de hematoxilina de Delafield, en la deteccin de parsitos de la sangre.

En virologa
Inmunofluorescencia directa e indirecta y coloraciones para la deteccin de cuerpos de inclusin que, por lo general, muestran afinidad por los colorantes cidos como la eosina.

RESUMEN
Se describen diferentes tipos de tcnicas microscpicas pticas y electrnicas, indicando sus ventajas y limitaciones, sealando su aplicacin en los laboratorios de microbiologa y parasitologa mdicas. Se presentan consideraciones generales sobre los mtodos de coloracin de los microorganismos y los colorantes ms usados. Se analiza la utilidad de diferentes mtodos de coloraciones empleados en los laboratorios de microbiologa y parasitologa mdicas, con nfasis en fundamentos, usos y modificaciones.

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