UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

ESCUELA DE POST GRADO PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS

EFECTO ADYUVANTE DE LAS SAPONINAS DE Sapindus saponaria L. PARA ANTGENOS DE Leishmania braziliensis EN MSCULO ESTRIADO DE Rattus rattus var albinus

TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS BIOMEDICAS

Autor: M.Sc. Segundo Manuel Miranda Leyva semamile@hotmail.com Asesor: Dr. Ramn Piminchumo Carranza

TRUJILLO - PER 2013

Resumen Se llev a cabo un estudio comparativo en Rattus rattus var. Albinus para investigar el efecto coadyuvante de las saponinas de Sapindus saponaria L. (sapindussaponina) para los antgenos de Leishmania braziliensis. Con tal finalidad se inyect va intramuscular (IM) a 4 grupos de cinco ratas machos cada uno, en el msculo del muslo izquierdo solucin salina fisiolgica, antgenos de Leishmania braziliensis, sapindussaponina, y la asociacin sapindussaponina - antgenos de Leishmania braziliensis correspondientemente. Para evaluar los cambios en la frmula leucocitaria, a las 48 y 192 horas se tomaron muestras de sangre perifrica (cola) de los especmenes de cada grupo. Se prepararon los frotis y se realiz el conteo de glbulos blancos con microscopio ptico con lente de inmersin. Los resultados porcentuales fueron sometidos al anlisis de varianza ANOVA de un factor con la prueba post hoc t de Dunnett. Se concluye que la inyeccin de sapindussaponina y sapindussaponina antgenos de Leishmania braziliensis provoca cambios en la frmula leucocitaria; y que las variaciones de porcentaje de leucocitos: neutrfilos, eosinfilos, linfocitos y monocitos indican la respuesta celular a las saponinas y la asociacin saponinas fracciones antignicas de L. braziliensis. Palabras clave: Sapindussaponina, antgenos de L. braziliensis, inyeccin intramuscular, respuesta celular.

I. INTRODUCCION El hombre siempre ha estado interesado por conocer la naturaleza y aprovecharla para la solucin de diferentes problemas (Boege, n.d.) tales como la necesidad de a) alimentacin para una poblacin humana cada da mayor, b) nuevos medicamentos para las enfermedades que en la actualidad son incurables, y c) nuevas materias primas industriales; motivo por el cual, se ha empeado en investigar cientficamente las sustancias presentes en los seres vivos que le rodean, tanto plantas (Fitoqumica) como animales (Zooqumica). Los vegetales que contienen saponinas (Evans, 1989), hetersidos llamados saponinas (del latn sapo, jabn), se han utilizado profusamente en muchas partes del mundo por sus propiedades detergentes. Saponina es una sustancia capaz de formar espuma al ser agitada con agua o disuelta en alcohol. Las contienen plantas muy diversas (Evans, 1989), entre ellas la acacia, la saponaria o jabonera, el castao de indias y muchas otras. Las saponinas se han utilizado mucho, y an se utilizan en ocasiones, como agentes limpiadores de la contaminacin producida por vertidos txicos. Algunas presentan propiedades hipocolesterolmicas. Existen unas 6 familias de plantas que presentan grandes cantidades de saponinas, una de stas es Sapindaceas con la especie Sapindus saponaria. Las saponinas son glicsidos resultante de la unin de la sapogenina (aglicn) con uno o ms azcares. Las Saponinas aisladas (Tsuzuki et al., 2007) de Sapindus saponaria son las L-Hederina (sapindussaponinas): two pure triterpene acetylated saponins: 3-O-(4-acetyl--Dxylopyranosyl)-(13)--Lrhamnopyranosyl-(12)--L-arabinopyranosyl-hederagenin (1) and 3-O-(3,4-di-acetyl--D-xylopyranosyl)-(13)--L-rhamnopyranosyl-(12)-Larabynopyranosyl-hederagenin (2), la sapogenina es la L-Hederagenina y los azcares: rhamnosa y arabinosa. En nuestro pas, tenemos la especie Sapindus saponaria L. (choloque o boliche), de la que desde pocas precolombinas (Almenara, 1984) se ha utilizado el pericarpio del fruto maduro por su alto contenido de saponinas. Motivo por el cual los seis ltimos aos se ha 2

trabajado en nuestros laboratorios con la cscara del fruto maduro, para desarrollar una tecnologa de obtencin de un extracto concentrado de saponinas. Ahora es necesario encontrar aplicaciones cientfico-tecnolgicas que a futuro demanden la produccin industrial y la industrializacin del producto. Se ha reportado (Bonnin y Llorens, 2011) que del Castao de indias (Aesculus hippocastanum L.), se usan las hojas y la corteza porque contienen escina, mezcla de saponinas triterpnicas, que le confieren propiedades como venotnico y vitamnico P. En forma de cpsulas en mezcla con extractos de otras plantas se usa en la terapia de la lipoesclerosis. En Colombia estn formulando productos cosmticos que incluyen extracto de saponinas de Ruscus (Pizano, 2009) para estimular el metabolismo celular, la multiplicacin celular y micro circulacin cutnea. Investigadores del Centro de Investigaciones de Energa Solar en Santiago de Cuba (Morris et al., 1999), destacan las amplias posibilidades que ofrecen los productos naturales, especialmente polisacridos de diversas fuentes, en la tamizacin de sustancias con propiedades inmunoestimulantes y reportan que las saponinas estn siendo utilizadas como adyuvantes inmunolgicos en el campo de la salud veterinaria. En ciudad de La Habana, Cuba; luego de una evaluacin cientfica de plantas medicinales con accin antileishmanial, se ha reportado (Monzote, n.d.) que la saponina hederacolchisida A, purificada de Hedera colchica, ha mostrado una potente actividad in vitro frente a promastigotes (IC50=1.2 M) y amastigotes (IC50=0.053 M) de L. infantum. Otras dos saponinas purificadas de Hedera helix, y -Hederina; tambin han mostrado una actividad significativa contra esta misma especie de Leishmania, mostrando una inhibicin media del crecimiento menor de 14 M frente a promastigotes y menor de 0.4 M frente a amastigotes. Yuccasaponina MC3, saponina purificada de Yucca filamentosa 5 g/mL, ha mostrado un 100% de inhibicin del crecimiento de promastigotes de Leishmania mexicana amazonensis. Experimentos llevados a cabo por citometra de flujo, revelan que estos compuestos actan sobre el parsito mediante una unin inespecfica con la membrana que provoca la muerte celular. Segn datos anteriores, las saponinas interactan con el ergosterol presente en las membranas, induciendo prdida de su integridad o alteracin en la porcin hidrocarbonada cargada negativamente. En la Pontificia Universidad Catlica de Chile, en 2002 se anunci (Rosso, 2002) la creacin de una industria para la extraccin y comercializacin de saponina s, que en la actualidad muestra interesantes perspectivas de desarrollo por su aplicacin en el proceso de refinacin del cobre. La oferta de productos para la firma del Tratado de Libre Comercio (TLC Per EEUU); entre tantos otros productos naturales, incluye saponinas. As tambin, en la Lista Arancelaria de Colombia12 para el TPD (Colombia-USA), estn las saponinas. En el marco de la investigacin inmunolgica actual y con la finalidad de proponer como fuente de sustancias con propiedades inmunoestimulantes a Sapindus saponaria L. Choloque es necesario explicar cientficamente el mecanismo de la actividad de las saponinas de esta especie vegetal. Los resultados permitirn un mejor enfoque cientfico, tecnolgico y ecolgico de promocin de su cultivo. Adyuvante es una sustancia distinta de un antgeno que potencia la activacin de los linfocitos T al favorecer la acumulacin y activacin de otros leucocitos (Abbas et al., 2004), denominados clulas accesorias, en el lugar de exposicin al antgeno. En las clulas accesorias, los adyuvantes aumentan la expresin de coestimulantes y citocinas que activan a los linfocitos T y pueden prolongar tambin la expresin de complejos pptido-CPH en la superficie de las CPA. 3

En el marco de la investigacin inmunolgica actual y con la finalidad de proponer como fuente de sustancias con propiedades inmunoestimulantes a Sapindus saponaria L. Choloque es necesario explicar cientficamente el mecanismo de la actividad de las saponinas de esta especie vegetal. Los resultados permitirn un mejor enfoque cientfico, tecnolgico y ecolgico de promocin de su cultivo. En tal perspectiva se plante el problema Cul es el efecto adyuvante de las saponinas de Sapindus saponaria L. para antgenos de Leishmania braziliensis en msculo estriado de Rattus rattus var albinus? La hiptesis de trabajo fue: Las saponinas de Sapindus saponaria L. actuando como adyuvantes en el msculo estriado de Rattus rattus var albinus, favorecen la acumulacin y activacin de clulas accesorias en la zona de depsito; potenciando las respuestas celular y humoral para los antgenos de Leishmania braziliensis. Dado que en nuestro pas subsiste el problema de la leishmaniasis estos resultados pueden representar una esperanza para desarrollar una vacuna para L. braziliensis que permita solucionar en parte la urgencia de atencin de salud en las zonas endmicas como los valles interandinos occidentales y la selva peruanos.

II. MATERIAL Y MTODO Material de estudio Rattus rattus var albinus: 20 especmenes machos con peso entre 300 400 g; divididos al azar en cuatro grupos, un testigo y tres grupos ensayo de 5 especmenes cada uno. Materiales de prueba: Concentrado de Saponinas de Sapindus saponaria L. purificadas en el laboratorio de Anlisis Instrumental, suspensin de fracciones antignicas aisladas de Leishmania braziliensis preparada en el laboratorio de Toxicologa, suero fisiolgico, reactivos para microscopia ptica. Material de vidrio de uso corriente en el Laboratorio. Equipos: Columna de fraccionamiento de espuma, espectrofotmetro UV/Vis HP 8452A, microscopio ptico binocular, balanza analtica. Mtodos y tcnicas Diseo experimental: Diseo clsico Los grupos de Rattus rattus var albinus testigo y experimentales, fueron inyectados va intramuscular con suero fisiolgico (grupo T), suspensin de antgenos de Leishmania braziliensis en solucin salina fisiolgica (grupo A), saponinas en solucin salina fisiolgica (grupo B) y saponinas - suspensin de fracciones antignicas solucin salina fisiolgica (grupo C). Se tomaron muestras de sangre perifrica (cola) de los especmenes de cada grupo, a las 48 y 192 horas. Extraccin de saponinas por maceracin. Cada vez se seleccion una muestra 25 frutos secos de Sapindus saponaria L. Se cort la cscara por el dimetro peciolar, se registr el peso de cscaras en balanza sensible al 0,01 g. Se macer las cscaras en 250 mL de agua por 24 horas. Se filtr el extracto a travs de torunda de algodn. El filtrado acuoso se deposit en el baln del Equipo de fraccionamiento de espuma con 70 cm de columna, a velocidad mnima. Se realiz el fraccionamiento de espuma hasta completar 100 mL de escurrido, el que fue sometido a ebullicin por 5 minutos. Se determin la concentracin de las saponinas mediante la ecuacin de la curva de calibracin respectiva.

Preparacin de los antgenos de Leishmania braziliensis El cultivo de Leishmania braziliensis se realiz en frascos Roux con medio BHI agar enriquecidos con sangre total de conejo, con penicilina 100 UI/mL, estreptomicina 100 UI/mL, solucin salina fisiolgica. Se sembr e incub por 15 das a 20 C, se cosech con solucin salina fisiolgica estril, se centrifug durante 10 minutos a 3000 rpm. Se desech el sobrenadante, se resuspendi el precipitado en solucin salina fenolada 0,25% y nuevamente se centrifug. Se elimin el sobrenadante y se agreg solucin salina fisiolgica fenolada; se esteriliz a 121 C por 15 minutos a 15 atmsferas de presin y se conserv a -20 C. Ensayo inflamatorio Un estudio comparativo en ratas se llev a cabo para investigar las reacciones locales y los cambios hematolgicos despus de la inyeccin de una dosis intramuscular de sapindussaponina (19,59 mg), y de vacuna de L. braziliensis sapindussaponina (19,59 mg 0,25 mL suspensin). Los efectos fueron comparados con los causados por suero fisiolgico y por la vacuna de L. braziliensis (0,25 mL suspensin). Grupos de cinco ratas machos fueron inyectados en el msculo del muslo izquierdo con 0.25 mL de la solucin de prueba a 0 das. A las 48 y 192 horas se tomaron muestras de sangre perifrica (cola) de los especmenes de cada grupo. Se prepar los frotis y se realiz el conteo de glbulos blancos con microscopio ptico con lente de inmersin. Anlisis estadstico Se realiz el ANOVA (Walpole et al., 1999) con las prueba de MSD y Dunnett para determinar si existe o no diferencia significativa entre las respuestas grupo experimental y testigo, mediante el software (Prez, 2001) SPSS v 16. III. RESULTADOS Los resultados se presentan en los siguientes TABLAS

TABLA 1. FORMULA LEUCOCITARIA EN Rattus rattus var albinus PORCENTAJE DE CLULAS

Grupo Testigo Testigo Testigo Testigo Testigo A A A A A B B B B B C C C C C Testigo Testigo Testigo Testigo Testigo A A A A A B B B B B C C C C C Horas 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 192 Neutrfilos 32 32 34 33 35 32 33 32 34 32 44 43 45 46 44 42 42 43 42 44 33 32 34 32 33 33 31 32 34 32 35 36 36 35 34 35 34 36 35 34 Eosinfilos 5 6 4 3 6 6 5 5 3 4 4 3 3 2 4 3 2 2 3 2 6 4 5 4 6 6 5 4 6 6 3 3 2 2 3 3 3 2 2 2 Basfilos 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Linfocitos 58 56 56 58 55 58 58 58 57 58 45 47 44 46 46 48 49 48 48 47 55 58 55 59 56 56 59 59 54 56 57 56 57 58 57 57 57 56 58 59 Monocitos 4 5 5 5 3 4 4 4 5 5 7 7 7 6 6 6 6 6 7 7 5 5 5 4 4 4 4 4 5 5 4 4 4 4 5 4 5 5 4 4

TABLA 2. FORMULA LEUCOCITARIA Rattus rattus var albinus Anlisis de varianza ANOVA de un factor Sum of Squares neu
1

df 7 32 39 7 32 39 7 32 39 7 32 39 7 32 39

Mean Square 113,429 1,000 8,114 0,800 0,457 0,100 115,082 1,700 4,796 0,350

F 113,429

Sig. 0,000

Between Groups Within Groups Total

794,000 32,000 826,000 56,800 25,600 82,400 3,200 3,200 6,400 805,575 54,400 859,975 33,575 11,200 44,775

eos

Between Groups Within Groups Total

10,143

0,000

bas

Between Groups Within Groups Total

4,571

0,001

lin

Between Groups Within Groups Total

67,695

0,000

mon

Between Groups Within Groups Total

13,704

0,000

1; neu, neutrfio; eos, eosinfilo; bas, basfilo; lin, linfocito; mon, monocito

IV. DISCUSIN La hiptesis de trabajo planteaba que las saponinas de Sapindus saponaria L. actuando como adyuvantes en el msculo estriado de Rattus rattus var albinus, favorecen la acumulacin y activacin de clulas accesorias en la zona de depsito; potenciando las respuestas celular y humoral para los antgenos de Leishmania braziliensis. Se pas entonces a tomar las muestras de sangre para evaluar los cambios hematolgicos mediante el conteo de clulas blancas (frmula leucocitaria). Luego de la inyeccin de saponinas y saponinas asociadas a fracciones antignicas de L. braziliensis, el porcentaje de neutrfilos se incrementa a las 48 horas y disminuye muy poco a las 192 horas; las pruebas estadsticas indican con 95% de seguridad que tal variacin es significativa. No hay variacin estadsticamente significativa por inyeccin de las fracciones antignicas de L. braziliensis. Se conoce que en los seres humanos (Rodrguez et al., 1993), un aumento del porcentaje de neutrfilos puede deberse a inflamaciones y ciertas enfermedades infecciosas agudas. A las 48 horas hay una disminucin estadsticamente significativa de eosinfilos en los grupos que recibieron saponinas y saponinas ms fracciones antignicas de L. braziliensis; esta condicin se mantiene a las 192 horas. Cuando la persona tiene ciertas reacciones alrgicas, infecciones u otras afecciones mdicas (Gersten et al., n.d.), los eosinfilos se vuelven activos. Estas clulas conforman solamente un 7

pequeo porcentaje del nmero total de clulas blancas, pero son una parte importante de la respuesta inmunitaria del cuerpo, pues liberan histamina y otras sustancias qumicas que actan sobre los vasos sanguneos cuando la respuesta inmunitaria es activada. A las 192 horas se registra una disminucin estadsticamente significativa de basfilos en los grupos que recibieron saponinas y saponinas asociadas a fracciones antignicas de L. braziliensis. Los basfilos conforman solamente un pequeo porcentaje del nmero total de clulas blancas (Dugdale et al. n.d.); pero son una parte importante de la respuesta inmunitaria del cuerpo, pues liberan histamina y otras sustancias qumicas que actan sobre los vasos sanguneos cuando la respuesta inmunitaria es activada. El basfilo es una clula preponderantemente sangunea (Bords, n.d.), acude a los tejidos durante el proceso inflamatorio y supone un refuerzo en la liberacin de mediadores ya que se activa por los mismos mecanismos que el mastocito y libera mediadores equivalentes a los de esta clula. El porcentaje de linfocitos disminuye a las 48 horas en los grupos que recibieron saponinas y saponinas asociadas a fracciones antignicas de L. braziliensis. A las 192 horas la diferencia no es estadsticamente significativa. A las 48 horas los grupos que recibieron saponinas y la combinacin saponinas antgenos de L. braziliensis experimenta una disminucin estadsticamente significativa en el porcentaje de monocitos; pero a las 192 horas el porcentaje tiende a su valor normal. Los monocitos colaboran con otros glbulos blancos en la eliminacin de tejidos muertos o daados, en la destruccin de clulas cancerosas y en la regulacin de la inmunidad contra las sustancias extraas. Al igual que otros glbulos blancos, los monocitos se originan en la mdula sea y luego entran en el flujo sanguneo. En unas horas, emigran a los tejidos donde se convierten en macrfagos, y constituyen las clulas defensivas (fagocitos) del sistema inmunitario. Estos hechos pueden ser explicados en parte por la dinmica del proceso inflamatorio presentado por Bords (n.d.). La inflamacin es un proceso tisular constituido por una serie de fenmenos moleculares, celulares y vasculares de finalidad defensiva frente a agresiones fsicas, qumicas o biolgicas. Los aspectos bsicos que se destacan en el proceso inflamatorio son en primer lugar, la focalizacin de la respuesta, que tiende a circunscribir la zona de lucha contra el agente agresor. En segundo lugar, la respuesta inflamatoria es inmediata, de urgencia y por tanto, preponderantemente inespecfica, aunque puede favorecer el desarrollo posterior de una respuesta especfica. En tercer lugar, el foco inflamatorio atrae a las clulas inmunes de los tejidos cercanos. Las alteraciones vasculares van a permitir, adems, la llegada desde la sangre de molculas inmunes. Esquemticamente la inflamacin tiene cinco etapas: 1. Liberacin de mediadores. Son molculas, la mayor parte de ellas, de estructura elemental que son liberadas o sintetizadas por el mastocito bajo la actuacin de determinados estmulos. 2. Efecto de los mediadores. Una vez liberadas, estas molculas producen alteraciones vasculares y efectos quimiotcticos que favorecen la llegada de molculas y clulas inmunes al foco inflamatorio. 3. Llegada de molculas y clulas inmunes al foco inflamatorio. Proceden en su mayor parte de la sangre, pero tambin de las zonas circundantes al foco. 4. Regulacin del proceso inflamatorio. Como la mayor parte de las respuestas inmunes, el fenmeno inflamatorio tambin integra una serie de mecanismos inhibidores tendentes a finalizar o equilibrar el proceso. 5. Reparacin. Fase constituida por fenmenos que van a determinar la reparacin total o parcial de los tejidos daados por el agente agresor o por la propia respuesta inflamatoria. 8

Es muy importante la Fase tarda. Llegada de clulas 1. Basfilo. Contribuye, junto con el mastocito, a la liberacin de mediadores. 2. Neutrfilo. Es de las primeras clulas en llegar al foco inflamatorio. Elimina al germen mediante fagocitosis o liberando factores txicos que contiene en sus grnulos citoplasmticos y producindole, as, una muerte extracelular. 3. Monocito/Macrfago. Procedente de la sangre el monocito, y de los tejidos cercanos el macrfago, llegan al foco ms tardamente. El monocito, en los tejidos, se diferencia en macrfago. Esta clula presenta idnticas funciones a las sealadas para el neutrfilo. Acta adems, como clula presentadora del antgeno a las clulas especficas T y B, iniciando, de esta forma, la respuesta especfica. El macrfago sintetiza un pptido inespecfico, la interleucina 1 (IL-1), que es una autntica hormona del Sistema Inmune, ya que pasando a la sangre produce efectos sobre distintas partes del organismo. Determina la aparicin de fiebre, probablemente induciendo la sntesis de PGE en las clulas endoteliales que revisten los vasos sanguneos del hipotlamo; a su vez la PGE acta sobre el centro termorregulador. Sobre la mdula sea favorece la produccin y liberacin de neutrfilos, con la consiguiente neutrofilia. En el hgado incrementa la sntesis de protenas de la fase aguda. A nivel local, la IL-1 activa la proliferacin y diferenciacin de las clulas T y B contribuyendo, as a la respuesta especfica. Tambin activa la proliferacin de fibroblastos y produccin de colgeno, fenmenos incluidos en la fase de reparacin de la inflamacin. 4. Linfocitos T y B. Potenciados por el macrfago inician la respuesta especfica. Las clulas B procedentes de los tejidos linfoides asociados a tejidos o mucosas sintetizan IgE, que unidas al mastocito o basfilo pueden potenciar la inflamacin. Por otra parte, las clulas T comienzan a producir linfoquinas que prolongan la inflamacin en una respuesta inmune ms elaborada. 5. Eosinfilo. Aunque es una clula citotxica en las infecciones parasitarias, parece adems tener en la inflamacin una funcin reguladora, por lo que ser estudiada en el siguiente apartado. Pero tambin la REGULACIN DE LA RESPUESTA INFLAMATORIA Como la mayor parte de las respuestas inmunes, el fenmeno inflamatorio se encuentra estrechamente regulado, evitando, as una respuesta exagerada o perjudicial. Algunos de los mediadores que producen activacin, al variar su concentracin o actuar sobre distintos receptores, van a producir inhibicin, consiguiendo, de esta forma, un equilibrio o modulacin de la respuesta inflamatoria. Los siguientes factores intervienen en esta regulacin: 1. Histamina. Actuando sobre receptores H2, induce en el mastocito y basfilo una inhibicin de la liberacin de mediadores, inhibe la actividad del neutrfilo, inhibe la quimiotaxis y activa las clulas T supresoras. 2. PGE. Produce en el mastocito y basfilo una inhibicin de la liberacin de mediadores y sobre los linfocitos una inhibicin de la proliferacin y diferenciacin. 3. Agonistas autonmicos. El mastocito y basfilo parecen presentar receptores y adrenrgicos y -colinrgicos que sugieren que la liberacin de mediadores podra estar sometida a una regulacin autonmica. La activacin del receptor -adrenrgico produce una inhibicin, mientras que la activacin del -adrenrgico y -colinrgico inducen la estimulacin 4. Heparina. Inhibe la coagulacin y la activacin de los factores del complemento. 9

5. Eosinfilo. Esta clula, atrada por el ECF-A, acude al foco inflamatorio donde libera una serie de enzimas que degradan determinados mediadores potenciadores de la inflamacin. La histaminasa acta sobre la histamina, la arilsulfatasa sobre los leucotrienos y la fosfolipasa sobre el PAF.

V. CONCLUSIONES De acuerdo a los resultados se concluye: 1. La inyeccin de saponinas y saponinas - antgenos de L. braziliensis provoca cambios en la frmula leucocitaria. 2. las variaciones de porcentaje de leucocitos: neutrfilos, eosinfilos, linfocitos y monocitos indican la respuesta celular a las saponinas y la asociacin saponinas fracciones antignicas de L. braziliensis.

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M.Sc. Q.F. Segundo M. Miranda Leyva

VB _____________________________ Dr. Ramn Piminchumo Carranza

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