Recomendaciones o guas

Evaluacin de la funcin plaquetaria

con agregometra
ngel Gabriel Vargas Ruiz
1
, Darinel Hernndez Hernndez
2
, Rosario Villa Mrquez
2
.
Resumen
La Agregometra plaquetaria por transmisin de luz (ATL) es el estndar de oro para el estudio de la funcin plaquetaria a pesar
del surgimiento de nuevas tecnologas como el Platelet Function Analyzer (PFA-100), el sistema Verify-Now y la Citometra de
flujo, entre otros. Su principal uso es el estudio de los pacientes que sangran por trombocitopata, sin embargo, recientemente
se le ha usado para estudiar a pacientes con trombosis y para vigilar el efecto de los frmacos antiplaquetarios. En este artculo
revisaremos los principios de la fisiologa plaquetaria que son indispensables para comprender los fundamentos, la tcnica y la
interpretacin de la Agregometra.
Palabras clave: Agregometra, platelets, funcin plaquetaria, trombocitopata
Abstract
The platelet light transmission aggregometry (LTA) is the gold standard for the study of platelet function despite the emergence of
new technologies such as the Platelet Function Analyzer (PFA-100), Verify-Now system and flow cytometry, among others. Its main
use is the study of patients who have bleeding thrombocytopathies, however, has recently been used to study patients with throm-
bosis and to observe the effect of antiplatelet drugs. This article reviews the principles of the platelet physiology that are essential
to understand the fundamentals, technique and interpretation of aggregometry.
Key words: Aggregometry, platelets, platelet function defect.
Revista de Hemostasia y Trombosis Volumen 3, Nm. 2, mayo-agosto 2010
29
I
ntroduccin
La Agregometra plaquetaria por transmisin de
luz (ATL) fue desarrollada en forma independiente por
Born
1
y por OBrien en 1962 y casi cinco dcadas des-
pus, sigue siendo el estndar de oro para el estudio
de la funcin plaquetaria
2
sin haber sido hasta ahora
desplazada por nuevas tecnologas como el Platelet
Function Analyzer (PFA-100), el sistema Verify-Now y
la Citometra de flujo, entre otros. Su principal uso es
el estudio de los pacientes que sangran por trombo-
citopata; sin embargo, recientemente se le ha usado
para estudiar a pacientes con trombosis y para vigilar
el efecto de los frmacos antiplaquetarios. A pesar de
dos publicaciones
3,4
con recomendaciones en cuanto
a la tcnica, su procedimiento no est estandarizado y
la metodologa cambia de acuerdo a cada laboratorio y
regin del mundo.
33
Fisiologa plaquetaria
Las plaquetas maduras que han sido liberadas de los
megacariocitos tienen una forma plana y discoidea, mi-
den aproximadamente 3 x 0.5 m y tienen un volumen
plaquetario medio de 6-10 fL. Su vida en la circulacin
es de 7 a 10 das. La apariencia exterior es rugosa por
las aberturas del sistema canalicular abierto (SCA), una
serie de tbulos revestidos de membrana que sirven
de comunicacin hacia el exterior y donde se libera
el contenido de los grnulos cuando las plaquetas se
activan.
5,8
La membrana celular de las plaquetas es el sitio
donde se llevan a cabo las reacciones de la coagu-
lacin (hemostasia secundaria) y es una bicapa de
fosfolpidos y colesterol, con diversas protenas que
representan molculas de adhesin y receptores para
diversos agonistas.
5
1. Coordinador de Hemostasia y Trombosis, Instituto Nacional
de Ciencias Mdicas y Nutricin Salvador Zubiran.
2. Laboratorio de Coagulacin, Instituto Nacional de Ciencias
Mdicas y Nutricin Salvador Zubiran
Correspondencia: ngel Gabriel Vargas Ruz. Instituto Nacio-
nal de Ciencias Mdicas y Nutricin Salvador Zubiran.
Vasco de Quiroga 15, Colonia Seccin XVI, Tlalpan D.F., CP
14000. Mxico DF
Correo electrnico. gelocoa@hotmail.com
Este artculo debe citarse como: Vargas RAG, Hernndez HD, Villa MR.
Evaluacin de la funcin plaquetaria con agregometra. Rev Hemost
Trombo 2010; 3(2): 29-38.
www.imbiomed.com.mx
Revista de Hemostasia y Trombosis Volumen 3, Nm. 2, mayo-agosto 2010
Vargas Ruiz G
30
Cuando las plaquetas se activan, cambian de su
forma discoidea a una forma irregular con mltiples
prolongaciones. Esto se debe a cambios en el esque-
leto contrctil (compuesto de actina, filamina, talina,
vinculina y otras protenas semirrgidas) y en el anillo
marginal de microtbulos (formado de tubulina).
5,8,9
Las plaquetas contienen tres tipos de grnulos:
Grnulos densos (), son los menores en tama-
o y en nmero (4 a 24 por plaqueta). Contienen
agonistas que amplifican la activacin plaquetaria
actuando solo sobre plaquetas vecinas: Adenosn
difosfato (ADP), adenosin trifosfato (ATP), sero-
tonina y cationes divalentes como el calcio y el
magnesio.
5-8
Grnulos alfa (), son los ms numerosos (40
a 80 por plaqueta) y ms grandes. Contienen:
protenas adhesivas (Factor de Von Willebrand
FvW-, fibringeno, fibronectina, vitronectina y
trombospondina), agentes hemostticos (factor V,
protena S, PAI-1, etc.) y factores de crecimiento
(factor de crecimiento derivado de las plaquetas
PDGF-, el pptido activador del tejido conectivo
-CTAP III-, el factor de crecimiento transformante
beta, etc.).
5-8
Lisosomas, con enzimas hidrolticas. Su funcin
en las plaquetas no se conoce.
5
La unin de las plaquetas a los sitios de lesin vas-
cular se realiza a travs de los receptores de membra-
na para el FvW y para la colgena, que son la GP Ib/
IX/V y las GP Ia/IIa, GP IV y GP VI respectivamente. En
condiciones de alto flujo sanguneo la nica glucopro-
tena con capacidad de unirse al sitio de lesin es la GP
Ib, que establece una unin dbil con el FvW y la col-
gena subendotelial expuesta. Como esta unin inicial
de las plaquetas es dbil, el flujo sanguneo hace que
estas plaquetas rueden sobre la superficie vascular da-
ada hasta que una unin firme se establece entre los
receptores para la colgena (GP Ia/IIa y GP VI princi-
palmente) y la colgena subendotelial.
Despus de su unin a la colgena subendotelial
expuesta por la lesin, las plaquetas se activan adqui-
riendo seudpodos que les permiten unirse ms fuer-
temente entre si y liberan los agonistas contenidos en
los grnulos, permitiendo la agregacin plaquetaria
(unin entre plaquetas a travs de la GP IIb/IIIa usando
como puente al fibringeno). Todo esto resulta en la
formacin de un tapn plaquetario.
6,7
Un agonista es aquella sustancia capaz de unirse
a su receptor en la clula y provocar una respuesta.
En el caso de las plaquetas la respuesta consiste de
activacin, cambio de forma, degranulacin y agrega-
cin. Entre los agonistas plaquetarios se encuentran
el ADP (contenido en los grnulos densos), trombina
(que resulta de la activacin de la hemostasia secunda-
ria), colgena (presente en el subendotelio), adrenalina
(amina del plasma), acido araquidnico (liberado al ac-
tivarse las plaquetas) y serotonina (presente en los gr-
nulos densos) entre otros (Cuadro 2.1 y Cuadro 2.2).
6,7
La GP IIb/IIIa (tambin llamada integrina IIb3) es
el receptor plaquetario del fibringeno y es un recep-
tor indispensable para la agregacin plaquetaria. Es la
glucoprotena ms abundante sobre la superficie de
las plaquetas (50 a 80 mil por plaqueta). Al igual que
otras integrinas tiene una cadena alfa y otra beta, el
dominio extracelular de cada cadena tiene una regin
para la unin del ligando (extremo N terminal). Para
poder unirse al fibringeno, la GP IIb/IIIa requiere de
un proceso de activacin que le permita transformarse
de un receptor latente a un receptor activo. Esta acti-
vacin se produce despus de que un agonista activa
a la plaqueta.
11
Cuadro 1. Agonistas plaquetarios in vivo.
Agonista
plaquetario
Comentario
ADP (Adenosn
difosfato)
Liberado de los grnulos densos
Trombina (IIa)
Producto de la hemostasia secundaria. Es
el agonista ms potente.
Colgena Componente del subendotelio
Adrenalina
(Epinefrina)
Catecolamina presente en el plasma
Calcio (Ca)
Ion contenido en el sistema canalicular
denso
Acido araquidnico
(AA)
Liberado de las plaquetas activadas, se
transforma en tromboxano A2
Factor activador de
plaquetas (FAP)
Derivado de los fosfolpidos celulares con
actividad proinflamatoria
Cuaro 2. Receptores de adhesin y agregacin plaquetaria.
Ligando Receptor Otros nombres
Colgena
GP Ia/IIa
GP IV
GP VI
21, VLA-2
GP IIIb, CD 36
Fibringeno GP IIb/IIIa IIb3
Factor de
Von Willebrand
GP Ib/IX/V
Fibronectina GP Ic/IIa 51, VLA-5
Trombospondina
Receptor de la
vitronectina
V3
Laminina GP Ic/IIa 61, VLA-6
Revista de Hemostasia y Trombosis Volumen 3, Nm. 2, mayo-agosto 2010
Evaluacin de la funcin plaquetaria con agregometra
31
La GP Ib/IX/V es un complejo formado por GP Ib ,
Ib , GP IX y GP V con una relacin 2:2:2:1. La GP Ib
es la subunidad ms importante ya que es el sitio de
unin al FvW. El dominio intracitoplasmtico interacta
con el citoesqueleto (actina, filamina, etc.) y con la fos-
folipasa A2, lo que inicia la activacin y el cambio de
forma en las plaquetas.
5,6
La GP VI es un receptor para la colgena que per-
tenece a la familia de las inmunoglobulinas. Tiene la
habilidad de generar seales intracelulares gracias a
su asociacin con una segunda molcula, el receptor
Fc gama (FcR). El receptor Fc gama tiene en su cola
citoplasmtica motivos de tirosina (ITAM), que se rela-
cionan a otras tirosina cinasas como Syk, Lyn y Fyn que
activan numerosas vas de sealizacin a travs de la
formacin de 1,4,5-trifosfato de inocitol (IP3) y 1,2-dia-
cilglicerol (DAG).
5,6
Los agonistas que participan en la agregacin pla-
quetaria actan sobre receptores acoplados a prote-
nas G. Estos receptores se nombran as por que acti-
van a una familia de protenas GTPasa intracelulares
interruptoras (activas cuando estn unidas a guanosn
trifosfato GTP- e inactivas cuando estn unidas a gua-
nosn difosfato GDP-) que a su vez controlan la acti-
vidad de una protena efectora (por ejemplo adenila-
tociclasa o la guanilatociclasa). La fijacin del ligando
(1er mensajero) a su receptor conduce al aumento o
disminucin de ciertas molculas de sealizacin intra-
celular de peso molecular bajo denominados segundos
mensajeros. Estas molculas incluyen al 3,5-AMP c-
clico (AMPc), al 3,5-GMP cclico (GMPc), al 1,2-diacil-
glicerol (DAG) y al 1,4,5-inositol trifosfato (IP3). Otros
segundos mensajeros importantes son el calcio y di-
versos fosfoinositidos (Cuadro 1.3).
10
Los receptores unidos a protenas G estn consti-
tuidos por 7 regiones que atraviesan la membrana, con
su segmento N terminal en el exterior y el segmento
carboxi terminal en el citoplasma. El bucle C3 y C4
son los que estn implicados en la interaccin con las
protenas G. Entre los agonistas plaquetarios que tie-
nen receptores 7-transmembrana unidos a protenas G
estn la trombina, el ADP, el tromboxano A2 (TxA2) y
la adrenalina.
5,6,10
Los receptores celulares para la trombina son una
nica clase de receptores conocidos como PAR (re-
ceptores activados por proteasas), que son recepto-
res 7-transmembranales unidos a protenas G, pero
a diferencia de los dems, los PAR son activados por
escisin proteoltica de su primer asa extracelular. A
la fecha se han descrito 4 PAR, de los cuales el 1, el
3 y 4 son receptores para la trombina. El PAR1 es el
ms importante y el prototipo de los receptores para
trombina.
5,6,10
Los receptores para ADP presentes en las plaque-
tas son el P2Y1, P2Y12 y P2X1, los dos primeros son
receptores 7-transmembrana unidos a distintas prote-
nas G y el ltimo es un canal para calcio activado por
ATP. El ADP no es un agonista muy fuerte, sin embargo
es muy importante ya que viene en los grnulos densos
y amplifica la respuesta plaquetaria inducida por otros
agonistas. El receptor P2Y1 esta acoplado a la protena
Gq, que es responsable de la activacin de la fosfolipa-
sa C la cual transforma al 4,5-fosfatidilinocitol bifosfato
(PIP2) de la membrana celular a 1,4,5-trifosfato de ino-
citol (IP3) y 1,2-diacilglicerol (DAG). El IP3 libera calcio
y el DAG activa a la Proteincinasa C. El incremento en
la cantidad de Ca intracelular activa a la Fosfolipasa
A2, la cual libera cido araquidnico de los lpidos de
la membrana, y de este se sintetiza tromboxano A2
(TxA2) mediante la enzima ciclooxigenasa 1 (COX-1).
El receptor P2Y12 esta acoplado a la protena Gi, la
cual inhibe la formacin de AMPc (adenosn monofos-
fato cclico, que permite la activacin plaquetaria por
otras vas).
10
Los receptores para la adrenalina son los recepto-
res 2, que estn acoplados a la protena G inhibitoria
llamada Gz, que inhibe a la adenilatociclasa, reducien-
do los niveles de AMPc favoreciendo esto la activacin
plaquetaria.
5,6
Los receptores para el tromboxano A2 llamados
TP y TP (al igual que el receptor P2Y1 del ADP) es-
tn acoplados a las protenas G12 y G 13, las cuales
activan a Rho, una tirosina cinasa que favorece el cam-
bio de forma de las plaquetas al activar al esqueleto
de actina.
5,6,10
Cuadro 3. Receptores plaquetarios.
Agonista Receptor
Protenas G (Res-
puesta)
Trombina
PAR1, PAR2 y PAR3
G12 y G13 (activacin
del citoesqueleto)
Gq (aumento de IP3 y
DAG)
ADP P2Y1 y P2Y12
Gi (Disminucin de
AMPc)
Gq (aumento de IP3 y
DAG)
Adrenalina Alfa 2
Gz (disminucin de
AMPc)
Tromboxano A2 TP alfa y TP beta
G12 y G13 (activacin
del citoesqueleto)
Gq (aumento de IP3 y
DAG)
7-transmembranales unidos a protenas G.
Revista de Hemostasia y Trombosis Volumen 3, Nm. 2, mayo-agosto 2010
Vargas Ruiz G
32
Agregometra plaquetaria
Desarrollada desde 1962 por Born, es un mtodo in
vitro para valorar la funcin plaquetaria. En un tubo de
vidrio un Plasma Rico en Plaquetas (PRP) es agitado, lo
que obliga a sus plaquetas a entrar en contacto. La adi-
cin de un agonista al PRP activa a las plaquetas que se
agregan en presencia de fibringeno. La agregacin es
medida con el principio turbidimtrico de Born que se
basa en la diferencia en la transmisin de la luz en el
PRP comparndolo con el plasma pobre en plaquetas
(PPP).
12,13,32
Descripcin del agregmetro
Desde el punto de vista ms simple, el agregmetro
consiste de una fuente de luz, cuyos haces atraviesan
el tubo que contiene el plasma a estudiar. La intensi-
dad de la luz es captada por una fotocelda que enva
los datos a un procesador electrnico computarizado
para elaborar un registro grfico. El tubo que contiene
la muestra de plasma lleva en su interior una barra
de hierro que por magnetismo gira para obligar a las
plaquetas de la muestra a entrar en contacto unas con
otras. Las reacciones se llevan a cabo a 37C, tempe-
ratura que es mantenida por un sistema trmico (Fig.
1).
12,13
El registro grfico resulta de dibujar el grado de
transmisin de la luz a travs de la muestra de plasma
rico en plaquetas (en el eje vertical o de las ordenadas)
en funcin del tiempo (en el eje horizontal o de las
abscisas). La transmisin de la luz por el plasma pobre
en plaquetas representa el punto mximo de transmi-
sin de la luz (ya que el PPP no es turbio por la falta de
plaquetas), mientras que la transmisin de la luz por el
plasma rico en plaquetas representa el punto mnimo
de transmisin de la luz (ya que el PRP es turbio en
ausencia de agonista). Cuando el agonista es agregado
al PRP, inicia un trazo similar al de la figura 2, donde
la lnea basal es interrumpida por una pequea espiga
que indica el momento en que se agrego el agonista a
la muestra, seguido de una onda negativa por disminu-
cin de la transmisin de la luz al ocurrir el cambio de
forma en las plaquetas activadas. Despus se dibuja un
trazo positivo que dependiendo del agonista empleado
podr en forma normal tener una o dos curvas, donde
la transmisin de la luz incrementa al paso del tiempo
por la agregacin de las plaquetas (es decir, el PRP
pierde turbidez y se aclara permitiendo el paso de mas
luz a medida que las plaquetas van agregando).
13,14
Condiciones preanalticas y procesado de la muestra
Para la prueba de Agregometra solicitamos al paciente
al menos seis horas de ayuno. El paciente debe estar
libre de medicamentos que puedan interferir con la
funcin plaquetaria (por ejemplo AINEs, aspirina, algu-
nos antidepresivos y antihipertensivos), a menos que
lo que se quiera evaluar sea precisamente el efecto de
algn frmaco antiagregante en el paciente. Se ocupa
sangre obtenida de una puncin no traumtica, a tra-
vs de una aguja al menos de calibre 21G en adultos
y calibre 23G en nios. El anticoagulante empleado
debe ser el citrato de sodio al 3.2%. Con 30 a 40 mL
de sangre es suficiente.
3,12,13
El PRP es obtenido por centrifugacin de la san-
gre anticoagulada con citrato de sodio por 10 min a
1000 rpm. Este es separado en un tubo de plstico
con ayuda de una pipeta de transferencia (tambin de
plstico). El sobrante se vuelve a centrifugar por 10
Figura 1. Agregmetro. Figura 2. Trazo de la agregometra.
Revista de Hemostasia y Trombosis Volumen 3, Nm. 2, mayo-agosto 2010
Evaluacin de la funcin plaquetaria con agregometra
33
min a 3000 rpm, para obtener el PPP. Algunos autores
recomiendan llevar el nmero de plaquetas en el PRP
a 200-300 x 109/L adicionando PPP15 aunque algu-
nos autores sealan que este paso no es necesario (en
nuestro laboratorio no realizamos este ajuste).
16,17
Las muestras trombocitopnicas son difciles de
trabajar, ya que no juntan el nmero necesario de pla-
quetas para el PRP. Un PRP con menos de 100 x 109
/L no puede usarse para Agregometra. Se recomienda
que el paciente tenga en sangre perifrica un nmero
de plaquetas de al menos 75 a 100 mil/L para llevar
a cabo el estudio.
12,13
Los plasmas lipmicos o ictricos no pueden traba-
jarse por que no permiten el paso de la luz.
Despus de la preparacin del PRP, las plaquetas
estn hipo reactivas, esto al parecer por la liberacin
de ADP de los eritrocitos despus de la centrifugacin.
Hay que esperar 15 minutos para trabajar la Agrego-
metra y evitar este periodo de hiporreactividad tran-
sitorio. El PRP puede trabajarse en las siguientes 3-4
horas.
15
En el agregmetro, 1 mL del PRP es colocado en
una cubeta que tiene una barra agitadora que por un
mecanismo se encuentra girando y la transmisin de
la luz es registrada por un fotmetro inicindose el re-
gistro.
12
En nuestro laboratorio, por cada estudio de Agrego-
metra a un paciente, realizamos a la par un estudio de
agregometra a un testigo sano (no familiar del pacien-
te), esto con fines de comparar los resultados ante la
falta de un control comercial para tal fin.
Agonistas utilizados
Los agonistas ms comunes son: Adenosn difosfato
(ADP), Adrenalina (ADR), colgena (Col), acido araqui-
dnico (AA) y ristocetina (Ri). Otros agonistas son: el
ionforo de calcio, el pptido mimtico del TxA2 co-
nocido como U46619, y el TRAP (pptido activador
del receptor de trombina) conocido como SFLLRN.
3
La
trombina como tal no se puede usar por que estimula
la coagulacin del plasma, no solo la agregacin pla-
quetaria.
12,13
Las concentraciones de trabajo varan con el labo-
ratorio.
33-35
Nosotros en el laboratorio de coagulacin
del INCMNSZ usamos las concentraciones que se se-
alan en el cuadro 4.
Valoracin de las curvas de agregacin
Desde el punto de vista del estudio de Agregome-
tra plaquetaria, existen dos tipos de agonistas (Fig.
3):
15,18
Agonistas fuertes, como la colgena, el cido
araquidnico y la trombina que directamente in-
ducen la agregacin, la produccin de TxA2 y la
degranulacin, dibujando una respuesta con una
sola onda de agregacin.
Agonistas dbiles, como el ADP y la adrenalina
que inicialmente inducen una pequea onda de
agregacin (onda primaria, que es reversible) y
despus de un cierto grado de agregacin alcan-
zan un umbral donde estimulan la liberacin de
TxA2. El tromboxano A2 causa la liberacin de
los grnulos densos, liberando ADP, el cual junto
con el tromboxano A2 causa una onda de agrega-
cin secundaria, ms grande e irreversible.
A la curva de agregometra se le estudian los si-
guientes elementos (Fig. 2):
14,19,20
a) Porcentaje de agregacin (normal se considera
si es mayor al 50%).
b) Forma del trazo, que comprende:
- Latencia (tiempo que transcurre entre la adi-
Cuadro 4. Concentraciones de trabajo de los agonistas
Agonista Concentracin de trabajo
Epinefrina (Epi) 10 M
Adenosn difosfato (ADP) 4 y 8 M
cido araquidnico (AA) 1 mM
Colgena (Col) 2 g/mL
Ristocetina (Ri) 0.6 y 1.2 mg/mL
Figura 3. Agonistas fuertes y dbiles.
Revista de Hemostasia y Trombosis Volumen 3, Nm. 2, mayo-agosto 2010
Vargas Ruiz G
34
cin del agonista y el inicio de la respuesta)
- Cambio de forma (onda negativa inicial cau-
sada por el cambio de forma de las plaquetas
al ser activadas por el agonista)
- Onda primaria (primer onda positiva que se
distingue con los agonistas dbiles, causada
por la unin del agonista a sus receptores y
el inicio de la agregacin)
- Onda secundaria (segunda onda positiva
que se distingue con los agonistas dbiles,
causada por un incremento en la agregacin
plaquetaria al inhibirse la sntesis de AMPc,
estimularse la sntesis de TxA2 y degranular-
se las plaquetas, liberando agonistas como el
ADP)
- Pendiente (grado de inclinacin que dibuja la
curva)
c) Concentracin mnima del agonista requerida
para inducir respuesta (la presencia de agrega-
cin a concentraciones muy bajas de un ago-
nista sugiere hiperagregabilidad).
d) Presencia de agregacin espontanea (agrega-
cin sin agonista, sugiere hiperagregabilidad).
Respuestas a diversos agonistas plaquetarios
ADP
El ADP es un agonista dbil. A dosis bajas, entre
1-4 M, el ADP causa nicamente una onda primaria,
incompleta y reversible (un 18 % de la poblacin nor-
mal tiene ausencia de respuesta a estas concentracio-
nes).
12,13
A concentraciones un poco mayores, 8 M,
la onda primaria no es reversible y va seguida de una
onda secundaria que es irreversible (y que depende de
la liberacin de TxA2, la degranulacin y la liberacin
de ADP). En altas concentraciones (10 M o ms) las
2 ondas se fusionan y solo se ve una nica onda, muy
parecida a lo que se ve con colgena o trombina (Fig.
4).
15,21,22
En la figura 5 se muestran los eventos intracelula-
res que ocurren en respuesta al ADP: Durante la onda
primaria ocurre unin del ADP a sus receptores P2Y1
y P2Y12, formacin de IP3 y DAG y activacin a la GP
IIb/IIIa para que pueda iniciarse la agregacin plaque-
taria. Durante la onda secundaria ocurre formacin de
TxA2 y degranulacin que libera ms agonistas, estos
ltimos eventos, junto con la inhibicin de la adenilato-
cilasa (y la disminucin de AMPc) hacen irreversible la
agregacin.
14,18,19,20,23
Epinefrina
La epinefrina, al igual que el ADP es un agonista d-
bil. Usada entre 5 y 10 M las plaquetas agregan muy
parecido al ADP, con una onda primaria y secundaria,
pero sin cambio de forma inicial (Fig. 5). La adrenalina
es el agonista menos uniforme en sus respuestas, 10
a 15% de los individuos sanos puede tener falta de
respuesta con este agonista12,13.
Como se observa en la figura 5, los eventos fisiolgi-
cos que ocurren durante la onda primaria son la unin
de la adrenalina a su receptor 2 acoplado a protenas
G, estimulacin de la protena Gq que promueve la for-
macin de IP3 y DAG, lo que activa a la GP IIb/IIIa para
que pueda iniciar la agregacin plaquetaria. Durante la
onda secundaria, el incremento de IP3 ocasiona snte-
sis de TxA2 y degranulacin, con liberacin de otros
agonistas como el ADP. El ADP y el TxA2 liberados en
esta etapa, activan a las plaquetas vecinas y todo esto
hace que la agregacin en esta etapa sea irreversible.
La estimulacin de la protena Gz por parte del recep-
tor 2 culmina en la inhibicin de la adenilatociclasa y
la reduccin de los niveles de AMPc lo que incrementa
an ms la activacin plaquetaria.
14,15,19,20,22
cido araquidnico
El cido araquidnico no tiene receptor. En forma
fisiolgica es liberado desde los fosfolpidos de las
Figura 4. Graficas normales con los distintos agonistas.
1. Basal; 2. Agonista; 3. Cambio de forma; 4. Onda primaria; 5.
Onda secundaria; 6. Onda nica y 7. Sin respuesta
Revista de Hemostasia y Trombosis Volumen 3, Nm. 2, mayo-agosto 2010
Evaluacin de la funcin plaquetaria con agregometra
35
membranas celulares y cuando se usa como agonista
en el estudio de Agregometra difunde al interior de las
plaquetas donde es convertido a TxA2 por efecto de
la ciclooxigenasa (COX1). Es el TxA2 el que sale de la
plaqueta y acta sobre los receptores TP y TP de la
propia plaqueta activada y de las plaquetas vecinas es-
timulando a la protena Gq y la protena G12. El resul-
tado es la formacin y liberacin de IP3 y DAG, aumen-
to del calcio intracelular y estimulacin del esqueleto
contrctil (Fig. 5).
15,19,22
En el registro de la agregacin,
el cido araquidnico muestra una curva de cambio de
forma seguido de una onda nica de agregacin (no
tiene onda primaria y secundaria, figura 4).
12,13
La aspirina al inhibir a la COX1 inhibe la formacin
de TxA2, lo que resulta en falta de agregacin plaque-
taria.
22
El agonista U46619 es un pptido mimtico del re-
ceptor TP que puede causar agregacin como el cido
araquidnico, pero sin necesidad de ser metabolizado
por la COX1, as que puede ocasionar agregacin aun
en presencia de aspirina.
12
Colgena
La colgeno, usada a 1 a 5 g/mL tiene una carac-
terstica fase de latencia que puede durar hasta 1 mi-
nuto. Despus viene el cambio de forma y finalmente
una nica onda de agregacin irreversible que depen-
de de la formacin de TxA2 y de la degranulacin (Fig.
5). La colgena tiene varios receptores en la plaqueta
(GP Ia/IIa, GP IV, GP VI, etc.), pero es la unin a la GP
VI la que genera la serie de reacciones intracelulares
que llevan a la agregacin: la GP VI esta acoplada al
receptor Fc, el cual fosforila protena cinasas de la
familia SYK que generan IP3 y DAG. Estos son los se-
gundos mensajeros que promueven el aumento en la
concentracin de Calcio, la sntesis de TxA2, la secre-
cin de grnulos, y la activacin de la GP IIb/IIIa para
la agregacin plaquetaria (Fig. 5).
14,15,19,20,22
Figura 5. Mecanismos intracelulares de respuesta a los agonistas.
Frmacos como la AAS inhiben la onda secundaria. El clopidogrel tambin causa una selectiva inhibicin de la
agregacin con este agonista.
23
Revista de Hemostasia y Trombosis Volumen 3, Nm. 2, mayo-agosto 2010
Vargas Ruiz G
36
La aspirina, al bloquear la formacin de TxA2 impi-
de la agregacin en respuesta a la colgena22.
Ristocetina
La ristocetina es un antibitico obtenido de Amyco-
latopsis lurida que se usaba para tratar infecciones por
estafilococo. Ahora se encuentra fuera de uso en la
clnica debido a su toxicidad y solo se usa en el labo-
ratorio de hemostasia debido a que causa aglutinacin
plaquetaria mediante la interaccin del FvW con la GP
Ib/IX/V. No activa ningn receptor o va intracelular.
Es usado en altas y bajas concentraciones. A bajas
concentraciones (0.6 mg/mL) normalmente no debe
haber respuesta, mientras que a altas concentraciones
(1.2 mg/mL) dibuja una onda nica de agregacin (que
en realidad es solo aglutinacin de las plaquetas (Fig.
4).
12,13
La falta de respuesta a dosis altas indica EvW o Sn-
drome de Bernard-Soulier. La respuesta a dosis bajas
es propia de la EvW tipo 2b (RIPA) o de la EvW tipo
plaquetario.
15,19
Interpretacin de la Agregometra
El mejor uso de la Agregometra plaquetaria es el es-
tudio de las trombocitopatas que originan hemorragia
y debe sospecharse enfermedad cuando hay respues-
tas anormales con dos agonistas (excepto Adrenalina
10M y/o ADP 4 M con los que hasta en un 15%
de los individuos sanos puede no haber respuesta), o
bien, falta de respuesta al agonista ADP en dos con-
centraciones diferentes.
15,19,20,25
En un estudio se en-
contr que una respuesta normal a Adrenalina 10 M
y ADP 4 M tiene un valor predictivo negativo (VPN)
de 95% para trombocitopata,
24
por lo que si la res-
puesta a estos agonistas est presente y es normal, se
descarta en forma razonable un defecto en la funcin
plaquetaria como causa de sangrado. En el cuadro 5 se
resumen los patrones de alteracin en la agregometra
que son caractersticos de alguna patologa, existen
muchas otras alteraciones que son inespecficas.
31
Otros usos de la Agregometra
Con menor frecuencia se utiliza la agregometra para
valorar un estado de trombofilia conocido como sn-
drome de las plaquetas pegajosas (sticky platelet syn-
drome) en el cual las plaquetas manifiestan hiperagre-
gabilidad. Para su diagnstico se busca agregacin con
agonistas dbiles a concentraciones ms bajas que
aquellas usadas para estimular a las plaquetas norma-
les (Adrenalina 0.5 M o el ADP 0.25 M), el tipo I
del sndrome tiene hiperagregabilidad con Adrenalina
y ADP, y el tipo II solo tiene hiperagregabilidad con
Adrenalina.
15
Recientemente se ha usado a la agregometra como
una herramienta para diagnstico de resistencia a los
antiagregantes plaquetarios. A este respecto no hay
valores universalmente aceptados para definir resis-
Cuadro 5. Interpretacin de la agregometra
Defecto PLT ADP Epi Col Ri AA Observaciones
SBS y grandes N N N 0 N Citometra de flujo para CD42b/CD42a
TG o
Anti-IIb/IIIa
N 0 0 0 N 0 Citometra de flujo para CD41/CD61
Deficiencia de GP Ia/IIa o
GP VI
N N N 0 N N Citometra de flujo
Clopidogrel o deficiencia
de P2Y1 y P2Y12
N 1/0 1/0 N/R N N/R
Aspirina, deficiencia de COX1
o dficit de TP y TP
N 1 1 R N R
El dficit de COX1 y efecto de aspirina
responden a U46619, el dficit de TP o
TP no responde
SPD (dficit de grnulos densos) N 1 1 0/R N R/0
Realizar reaccin de liberacin de ATP y
microscopia electrnica
EvW N N N N 0 N Determinar FvW Ag y Cof Ri
Dficit de 2 N N 0 N N N
15% de los individuos sanos tiene esta
respuesta
Sndrome de la plaqueta gris
(dficit de grnulos )
Grises 1 N/1 R N N
Respuesta reducida a trombina, hacer
microscopia electrnica
Sndrome de las plaquetas
de Quebec
N 1 0 R N N
PLT=Plaquetas; ADP=Adenosn difosfato; ADR=Adrenalina; Col=Colgena; Ri=Ristocetina; AA=cido araquidnico; SBS=Sndrome de Bernard Soulier; =Disminuido;
N=Normal; 0=Sin respuesta; 1=Slo onda primaria reversible; R=Respuesta reducida; TG=Trombastenia de Glanzman; COX1=Ciclooxigenasa 1; SPD=Enfermedad del pool
de depsito; ATP=Adenosn trifosfato; EvW=Enfermedad de Von Willebrand; FvW Ag=Factor de Von Willebrand antignico; Cof Ri=Cofactor de ristocetina.
Revista de Hemostasia y Trombosis Volumen 3, Nm. 2, mayo-agosto 2010
Evaluacin de la funcin plaquetaria con agregometra
37
tencia a la aspirina o al clopidogrel,
21,26,27
pero los
estudios clnicos en este campo definen resistencia a
aspirina como la agregacin > 20% con cido araqui-
dnico (1 mM) y/o > 70 % con ADP (10 M) en pacien-
tes que usan dosis antiagregantes diarias de aspirina.
La resistencia a clopidogrel se ha definido como la
agregacin > 70% con ADP (5 a 10 M) en pacientes
que usan dosis diarias de Clopidogrel.
22,23,28,29,30
Variantes de la Agregometra Plaquetaria
La agregometra tambin puede realizarse en sangre
entera anticoagulada.
19
La agregometra en sangre en-
tera tiene como ventajas que ocupa menos muestra de
sangre (ya que no se requiere preparar un plasma rico
en plaquetas), que la muestra no se manipula (evitan-
do la activacin plaquetaria), y que pueden trabajarse
muestras ictricas o lipmicas.
La agregometra en sangre entera no trabaja con
luz, trabaja con impedancia (oposicin al paso de la
corriente alterna entre los dos electrodos). Las plaque-
tas de la muestra recubren dos electrodos de platino
y despus de que se agrega el agonista, las plaquetas
activadas se unen a las plaquetas que ya estaban uni-
das a los electrodos. Esto aumenta la impedancia y es
registrado grficamente.
12,19
Lumiagregmetro. Un complemento de la Agrego-
metra por transmisin de luz es la Lumiagregometra
(tambin conocida como prueba de liberacin de ATP).
El objetivo de la lumiagregometra es evaluar la libe-
racin de ATP desde los grnulos densos al mismo
tiempo que se registra la agregacin plaquetaria en
respuesta a un agonista. El ATP es detectado con un
reactivo conocido como Luciferin-luciferasa que pro-
duce luz y color al contacto con ATP. La luciferina y la
luciferasa existen en la naturaleza y participan en las
reacciones de bioluminiscencia, es decir, la produc-
cin de luz por organismos vivos, como las lucirna-
gas, medusas, bacterias, etc. La luciferina es oxidada
a oxiluciferina en presencia de oxigeno y con la luci-
ferasa catalizando la reaccin. El ATP es la fuente de
energa para esta reaccin, la cual genera luz, as, a
mas ATP ms luz generada.
15,18
En la lumiagregometra se registra la agregacin
plaquetaria con algn agonista y mediante la adicin
de luciferin-luciferasa se grafica la luz producida por
el ATP liberado de los grnulos densos. La cantidad
de ATP liberado se mide de acuerdo a la luminosidad
generada. Esta tcnica fundamentalmente sirve para
el diagnostico de la enfermedad del pool de depsito
(deficiencia de los grnulos densos) donde hay dficit
de la liberacin de ATP.
12,15,18
Conclusin
La agregometra plaquetaria constituye una herramien-
ta til para establecer diagnsticos de alteraciones
plaquetarias, as como para el monitoreo de la tera-
pia antiagregante plaquetaria, sin embargo, a pesar de
valor como prueba diagnstica deben de efectuarse
controles de calidad a efecto de garantizar un resulta-
do confiable.
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