ANALISIS UKURAN KROMOSOM DAN POLA RESTRIKSI

Bacillus thuringiensis DENGAN ELEKTROFORESIS MEDAN

BERPULSA

ANDIKA SAPUTRA

PROGRAM STUDI BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
 ABSTRAK

ANDIKA SAPUTRA. Analisis Ukuran Kromosom dan Pola Restriksi Bacillus

thuringiensis dengan Elektroforesis Gel Medan Berpulsa. Dibimbing oleh I
MADE ARTIKA dan EDDY JUSUF.
Bacillus thuringiensis (BT) merupakan salah satu bakteri yang bermanfaat
bagi kehidupan manusia. B. thuringiensis memiliki keistimewaan mensintesis
protein δ-endotoksin yang spesifik terhadap serangga tertentu dan beberapa
nematoda perusak sehingga sering digunakan sebagai pestisida alami.
Laboratorium Biologi Mikroba, LIPI, memiliki beberapa koleksi bakteri BT lokal
yang diharapkan merupakan subspesies baru. Penelitian ini diharapkan dapat
memberikan studi awal dari galur-galur lokal BT di daerah sekitar Bogor dan juga
untuk memastikan kemungkinan adanya subspesies baru, maka dilakukan uji
genotipe dengan menggunakan Elektroforesis Gel Medan Berpulsa. Hasil
penelitian menunjukkan secara umum B. thuringiensis memiliki resistensi
terhadap antibiotik ampisilin. Isolasi DNA berhasil dilakukan dan dibuktikan
dengan elektroforesis. Metode isolasi DNA yang paling cocok untuk PFGE adalah
metode plug yang dikembangkan oleh Cantor. Analisis pita restriksi tidak dapat
dilakukan dengan baik karena proses restriksi enzim tidak memberikan pita yang
jelas tapi justru memberikan pita smear. Perkiraan genom total sementara untuk
galur standar berada pada 1800 - 2500 kbp sedangkan untuk galur lokal berada
pada 1100 - 2600 kbp. Perhitungan genom total secara nyata dan perkiraan
kekerabatan antar galur lokal tidak berhasil dilakukan.
 ABSTRACT

ANDIKA SAPUTRA. Chromosome Sizes and Restriction Patterns Analysis of

Bacillus thuringiensis by Pulsed Field Electrophoresis. Under the direction of I
MADE ARTIKA and EDDY JUSUF.
Bacillus thuringiensis (BT) represents one of worthwhile bacteria for
human life. B. thuringiensis is special in that it has ability to synthesize δ-
endotoxinprotein specific to certain insect and some nematodes so that often used
as a natural pesticide. The Biological Laboratory of Microbe, LIPI, has some
bacterium collection of local BT expected to represent new subspecies. This
research is intended as an early study of local BT strains around Bogor and also to
confirm the possibility of new subspecies, in the present study genotyping is
conducted using Pulsed Field Gel Electrophoresis. The results showed that in
general the B. thuringiensis show resistancy to ampicillin antibiotic. DNA
isolation was successfully conducted and proved by electrophoreses. The most
suited method for DNA isolation for PFGE is the plug method developed by
Cantor. Band analysis of restriction patterns cannot be carried out because
restriction process did not give clear bands but gave smearing bands. Estimation
of the total Genome for standard strains is 1800 - 2500 kbp while for local strains
is 1100 - 2600 kbp. Accurate calculation for total genome and relatedness
prediction for local strains could not be conducted.
ANALISIS UKURAN KROMOSOM DAN POLA RESTRIKSI
Bacillus thuringiensis DENGAN ELEKTROFORESIS MEDAN
BERPULSA

ANDIKA SAPUTRA

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Program Studi Biokimia

PROGRAM STUDI BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
Judul : Analisis Ukuran Kromosom dan Pola Restriksi Bacillus
thuringiensis dengan ElektroforesisMedan Berpulsa
Nama : Andika Saputra
NIM : G44103055

Disetujui

Dr. Ir. I Made Artika M. App. Sc Drs. Eddy Jusuf DES

Ketua Anggota

Diketahui

Dr. drh. Hasim, DEA

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Tanggal lulus :
 PRAKATA

Bismillahirrahmaanirrahim
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah
memberikan rahmat dan nikmat-Nya yang tiada terkira sehingga penulis dapat
menyelesaikan penulisan hasil penelitian ini. Bertempat di Laboratorium Biologi
Mikroba Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI-Cibinong Bogor, penulis telah
melaksanakan penelitian yang berjudul Analisis Ukuran Kromosom dan Pola
Restriksi Bacillus thuringiensis dengan Elektroforesis Gel Medan Berpulsa.
Penulis pada kesempatan ini ingin mengucapkan terimakasih dan
penghargaan kepada Drs. Eddy Jusuf DES dan Dr. I Made Artika M. App. Sc
selaku dosen pembimbing yang telah memberikan saran dan pengarahan sehingga
penulis dapat melaksanakan penelitiannya dengan baik dan menyelesaikan karya
ilmiah ini. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan untuk keluarga penulis,
dan sahabat-sahabat penulis yang telah banyak memberi support, teman satu lab,
Wisnu, Tutu, Wurian, dan Isra yang telah menemani penulis bekerja juga tak lupa
untuk Yanti yang membantu mengecek ulang hasil tulisan penulis dan memberi
dukungan moril bagi penulis.
Penulis menyadari dalam penulisan hasil penelitian ini masih jauh dari
sempurna, oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat
membangun dari berbagai pihak. Semoga hasil penelitian ini dapat memberikan
manfaat bagi kita semua.

Bogor, 18 Januari 2008

Andika Saputra
 RIWAYAT HIDUP

Penulis merupakan anak pertama dari pasangan Cecep Komarudin dan

Nurhadiyanti yang dilahirkan di Jakarta pada 30 Desember 1984 dan memiliki
empat saudara.
Tahun 1996 melanjutkan studinya di Sekolah Menengah Pertama Swasta
Setia Negara setelah tamat dari Sekolah Dasar. Tahun 1999 penulis melanjutkan
ke SMUN 1 depok dan lulus pada tahun 2002. Penulis sempat mengenyam
pendidikan di Universitas Indonesia sebelum akhirnya pindah ke Institut Pertanian
Bogor pada tahun 2003.
Selama masa kuliah penulis sempat menjadi asisten praktikum biokimia
umum pada tahun 2006/2007. Penulis juga aktif di organisasi kemahasiswaan dan
sempat menjadi Ketua Departemen Informasi, Komunikasi dan Kesekretariatan
CREBs Biokimia. Penulis mengikuti Praktik Lapang di Laboratorium Biologi
Mikroba, Bidang Biologi Molekular dan Mikrob, Pusat Penelitian Bioteknologi
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong, Bogor.
 DAFTAR ISI

Halaman
DAFTAR GAMBAR........................………………………………………….....viii
DAFTAR LAMPIRAN..........................................................................................viii
PENDAHULUAN........…………………………………………………….......... 1
TINJAUAN PUSTAKA
Bacillus thuringiensis ......…………………………………………......... 1
Gen dan Genom…………………………………………………............. 2
Kromosom…………………………………………………...................... 3
DNA sebagai Materi Genetik ......………………………………………. 3
Analisis Total DNA Genom ......………………………………………... 4
Enzim Retriksi Endonuklease ......………………………………………. 4
Elektroforesis Medan Berpulsa atau Pulsed-field Gel Electrophoresis
(PFGE).………………………................................................................... 5
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ..……………………………………………………....... 6
Metode .……………………………………………………………......... 6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Induksi Antibiotik....................................................................................... 7
Isolasi DNA Genom................................................................................... 7
Enzim Restriksi Sma I................................................................................ 8
Kondisi Optimal Elektroforesis.................................................................. 9
Analisis Hasil Elektroforesis...................................................................... 10
SIMPULAN DAN SARAN................................................................................... 12
DAFTAR PUSTAKA ...……………………………………………………....... 12
LAMPIRAN ......................................................................................................... 15
 DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Visualisasi Bacillus thuringiensis melalui mikroskop fase kontras .............. 1
2 Diagram skematik yang menunjukkan hubungan gen dengan struktur-
heliks ganda DNA dan sebuah kromosom...................................................... 2
3 Sebuah kromosom eukariot dalam keadaan terkondensasi............................. 3
4 Tipe pemotongan ”blunt end” dan tipe pemotongan ”sticky end” ................ 5
5 Hasil restriksi B. thuringiensis subsp. kurstaki dengan proses isolasi DNA
berbeda............................................................................................................ 8
6 Hasil restriksi 12 galur bakteri oleh Sma I pada tegangan 7,1 volt, 20 jam.... 9
7 Hasil restriksi 12 galur bakteri oleh Sma I pada tegangan 6 volt, 20 jam....... 9
8 Hasil restriksi 12 galur bakteri oleh Sma I pada tegangan 6 volt, 17 jam....... 9
9 Hasil elektroforesis galur-galur bakteri standar dan lokal yang tidak di
restriksi............................................................................................................ 11
10 Hasil elektroforesis galur-galur bakteri standar dan lokal yang direstriksi
dengan Sma I................................................................................................... 12

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
1 Asal Isolat bakteri Bacillus thuringiensis yang digunakan............................ 16
2 Tahapan kerja analisis DNA Genom ............................................................ 17
3 Peremajaan bakteri pada media antibiotik………………………………... 18
4 Proses penyiapan DNA total …..………………………………………... 19
5 Proses fragmentasi DNA genom dengan enzim restriksi Sma I ................... 20
6 Proses elektroforesis dengan PFGE ............................................................. 20
 PENDAHULUAN
Bakteri Bacillus thuringiensis (BT) sudah
sejak lama dikenal sebagai bahan aktif paling
umum yang digunakan dalam pembuatan
pestisida hayati maupun sebagai sumber gen
dalam proses rekayasa tanaman transgenik
tahan hama. B. thuringiensis memiliki
keistimewaan karena dapat mensintesis protein
δ-endotoksin yang spesifik terhadap serangga
dan nematoda. Jenis bakteri ini memiliki lebih
dari 70 subspesies atau varietas yang berbeda,
yang dibedakan oleh perbedaan sifat serologi
dari antigen flagelanya, dan menghasilkan lebih
dari 300 tipe protein Cry.
Studi genom di Indonesia masih jauh
tertinggal dari negara-negara tetangga. Oleh
karena itu, karakterisasi dari organisasi
keseluruhan genom bakteri ini dapat
memberikan pendekatan yang baik untuk
mempelajari jenis-jenis, varietas, dan galur BT
lokal secara akurat dan memungkinkan
pemberdayaan galur-galur lokal lebih lanjut.
Elektroforesis medan berpulsa atau dikenal
sebagai Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)
merupakan teknik paling baik untuk
mempelajari ukuran dan organisasi genom-
genom bakteri. Proses identifikasi spesies
dicoba dengan menggunakan enzim pemotong
jarang yang diikuti oleh pemisahan fragmen-
fragmen menggunakan PFGE. Teknik ini telah
berhasil diterapkan pada penetapan galur-galur
virulen Pseudomonas sp.
Penelitian bertujuan untuk mengukur ukuran
molekul DNA genom galur-galur bakteri
Bacillus thuringiensis dan membandingkan pola
restriksi yang dihasilkan untuk lebih memahami
hubungan filogenetik antara galur lokal yang
diisolasi dari berbagai tempat di sekitar Bogor
dengan galur bakteri standar yang ada dalam
koleksi Puslit Bioteknologi LIPI.
Penggunaan PFGE dalam identifikasi semua
molekul DNA dalam berbagai ukuran hasil
pemotongan enzim restriksi lebih baik dari
teknik elektroforesis konvensional. Probabilitas
terdapatnya isolat-isolat lokal yang saling
identik cukup besar dan diharapkan terdapat
hubungan filogenetik yang erat dengan
beberapa galur standar yang tersedia.
Penelitian bermanfaat untuk menetapkan
kesamaan maupun perbedaan genotip BT hasil
pengucilan dari tanah di wilayah Bogor dengan
galu-galur standar yang telah diketahui
fenotipnya. Hal ini dilakukan untuk memastikan
bahwa isolat-isolat yang didapat memiliki
identitas. Sehingga pemberdayaan isolat-isolat
galur lokal sebagai salah satu kekayaan
mikrobial Indonesia dapat terwujud.
TINJAUAN PUSTAKA
Bacillus thuringiensis
Seorang ahli biologi dari Jepang, Shigetane
Ishiwatari pertama kali mengisolasi bakteri
Bacillus thuringiensis (BT) pada tahun 1901
ketika menyelidiki penyebab penyakit sotto
yang membunuh sebagian besar populasi ulat
sutra. Sepuluh tahun kemudian, Ernst Berliner
mengisolasi bakteri yang telah membunuh larva
Mediterranean flour moth pada tahun 1911 dan
menemukan tipe bakteri yang sama dengan
sebelumnya kemudian dinamakannya B.
thuringiensis (Gambar 1), mengambil nama
sebuah kota Jerman Thuringia tempat serangga
tersebut ditemukan. Ishiwatari telah menamakan
bakteri ini B. sotto pada tahun 1901 namun
nama itu kemudian dinyatakan tidak sah lagi.
Pada tahun 1915, Berliner melaporkan
keberadaan kristal di dalam BT, namun aktivitas
kristal ini belum diketahui hingga beberapa
tahun berikutnya.
Tahun 1956, beberapa peneliti, Hannay,
Fitz-James dan Angus menemukan bahwa
aktivitas antiserangga terhadap serangga dari
jenis Lepidoptera (ngengat) yang paling besar
adalah pada saat pembentukan parasporal kristal
yang mengandung δ-endotoksin. Penemuan ini
menyebabkan munculnya ketertarikan terhadap
struktur kristal, reaksi biokimia dan aktivitas
kristal dari BT. Penelitian-penelitian baru
mengenai bakteri BT dimulai dengan cepat dan
pesat sehingga penggunaan bakteri sebagai
pestisida hayati mengalami peningkatan.
Bakteri BT tergolong dalam bakteri Gram
positif yang terdapat di permukaan tanah. B.
thuringiensis adalah bakteri berbentuk batang
berspora, bersifat anaerob, dan menghasilkan
protein kristal selama masa sporulasi yang
bersifat toksik terhadap larva serangga serta
mempunyai suhu pertumbuhan minimum 10-15
o
C, suhu maksimum 40-45 oC dan suhu
optimum 28-30 oC.
Gambar 1 Visualisasi Bacillus thuringiensis
melalui mikroskop fase kontras

Hingga 1977, hanya tiga belas galur bakteri
ini yang telah dideskripsikan. Ketiga belas
subspesies hanya bersifat toksik kepada
beberapa jenis spesies dari larva Lepidoptera.
Tahun 1977 subspesies pertama yang bersifat
racun (toksik) terhadap spesies serangga Diptera
(lalat) ditemukan dan diikuti oleh penemuan
strain toksik pertama untuk spesies Coleoptera
(kumbang) pada tahun 1983.
Gen dan Genom
Gen adalah sebuah segmen polinukleotida
yang mengandung informasi yang diperlukan
untuk sintesis satu rantai polipeptida. Gen dapat
di artikan sebagai unit-unit warisan. Gen-gen
tersebut mengandung bagian regulasi yang
mengatur pada kondisi seperti apa produk dari
gen tersebut diproduksi, bagian-bagian
tertranskripsi yang mengatur struktur dari
produk, dan/atau bagian-bagian sekuen
fungsional (Pearson H 2006). Gen-gen
berinteraksi satu sama lain untuk mempengaruhi
perkembangan fisik dan tingkah laku. Gen
terdiri dari sebuah pita panjang DNA (RNA
pada beberapa virus) yang mengandung sebuah
promotor, pengkontrol aktivitas gen-gen, dan
sebuah sekuen penyandi, yang menentukan
produk dari gen tersebut. Sekuen penyandi akan
digandakan saat gen pada keadaan aktif dalam
sebuah proses yang disebut transkripsi,
menghasilkan RNA yang mengandung
informasi dari gen tersebut. RNA tersebut
kemudian mengarahkan proses sintesis protein
via kode genetik. RNA juga dapat digunakan
secara langsung, misalnya sebagai bagian dari
ribosom. Molekul-molekul yang dihasilkan dari
proses ekspresi gen, RNA atau protein, dikenal
sebagai produk gen.
Kebanyakan gen mengandung daerah non-
coding yang tidak menyandi produk-produk
gen, namun meregulasi proses ekspresi gen.
Gen dari organisme eukariot (Gambar 2) dapat
mengandung daerah non-coding yang disebut
intron, yang akan dihilangkan dari mRNA
melalui sebuah proses yang dikenal sebagai
splicing (penggabungan). Bagian yang
sesungguhnya menyandi produk gen dikenal
sebagai ekson. Sepotong gen dapat
menyebabkan sintesis beberapa protein melalui
pengaturan yang berbeda dari ekson-ekson oleh
proses penggabungan alternatif.
Total dari keseluruhan gen pada sebuah
organisme atau sel dikenal sebagai genom.
Dalam biologi genom dari sebuah organisme
adalah keseluruhan informasi turunan yang
dimilikinya dan disandikan dalam DNA (atau
RNA pada beberapa virus). Keseluruhan genom
ini termasuk gen-gen dan sekuen-sekuen yang
11
tidak menyandi (non-coding) pada DNA. Istilah
ini ditemukan pada tahun 1920 oleh Hans
Winkler, seorang profesor botani dari
Universitas Hamburg, Jerman, sebagai sebuah
penghubung kata gen dan kromosom
(Lederberg J & McCray AT 2001). Secara
lebih tepat genom dari sebuah organisme adalah
sebuah sekuen DNA lengkap dari satu set
kromosom. Kebanyakan mahluk hidup yang
lebih kompleks dari virus terkadang atau selalu
membawa material genetik tambahan yang
berada dalam kromosom-kromosom mereka.
Dalam beberapa konteks, seperti sekuensing
genom dari mikroba patogen, ”genom” berarti
melibatkan material tambahan yang dibawa
pada plasmid-plasmid. Sehingga pada keadaan
seperti itu, maka genom dijelaskan sebagai
semua gen dan DNA yang tidak mengkode yang
memiliki potensi untuk ada.
Ukuran genom pada sebuah organisme
tergantung pada kerumitan organisme tersebut,
prokariot seperti bakteri dan arkea secara umum
memiliki genom yang lebih kecil, baik pada
pasangan basanya maupun jumlah gennya, dari
sebuah sel eukariot. Namun demikian, genom
terbesar yang diketahui merupakan sebuah sel
mikroba Amoeba dubia, dengan lebih dari 6
milyar pasang basa (Cavalier-Smith T 1985).
Densitas dari gen pada sebuah genom diukur
dari jumlah gen per sejuta pasang basa (disebut
sebagai megabase, Mb); genom prokariot
memiliki densitas gen lebih tinggi dari eukariot.
Ilmu yang mempelajari keseluruhan genom
dari suatu organisme dikenal dengan istilah
genomik. Genomik dapat dikatakan telah
muncul sejak tahun 1980-an dan baru
menghasilkan pada tahun 1990-an bersamaan
dengan munculnya Proyek Genom .
Gambar 2 Diagram skematik menunjukkan
hubungan gen dengan struktur
heliks ganda DNA dan sebuah
kromosom eukariot.

Proyek untuk beberapa spesies biologi
khususnya manusia. Cabang utama genomik
masih melibatkan proses sekuensing dari
beberapa macam organisme.
Kromosom
Kromosom adalah sebuah makromolekul
besar DNA, dan membangun bentuk fisik
terorganisasi dari DNA di dalam sel. Kromosom
merupakan bagian DNA (satu molekul DNA)
yang kontinyu dan sangat panjang, yang
mengandung banyak gen, elemen-elemen
regulator, dan sekuen-sekuen nukleotida lain
yang terkait. Definisi kromosom lebih luasnya
juga termasuk protein-protein pengikat DNA
yang bekerja untuk mengatur dan melindungi
DNA. Kata kromosom sendiri berasal dari
Yunani yaitu χρῶμα (chroma, warna) dan σῶμα
(soma, tubuh) karena kemampuannya untuk
dapat dengan kuat diwarnai oleh pewarna vital
dan supravital.
Kromosom sangat bermacam-macam pada
organisme-organisme yang berbeda. Molekul
DNA yang dimiliki dapat berbentuk melingkar
(circular) atau lurus (linear), dan dapat
mengandung berapapun dari puluhan kilo
pasang basa hingga ratusan mega pasang basa.
Pada kebanyakan eukariot, sel memiliki
kromosom-kromosom besar yang linear dan sel
prokariot memiliki kromosom melingkar yang
lebih kecil, walaupun banyak sekali
pengecualian pada aturan ini. Sel-sel dapat
memiliki lebih dari satu tipe kromosom; sebagai
contoh mitokondria pada kebanyakan eukariot
dan kloroplast pada tanaman juga memiliki
kromosom sendiri sebagai tambahan dari
kromosom inti sel eukariot (Gambar 3).
Kromosom pada prokariot (Bakteri)
biasanya berupa sebuah rantai DNA tunggal
berbentuk melingkar dan tidak terikat dengan
protein sepertihalnya pada eukariot, tapi banyak
variasi yang ada. DNA bakteri juga hadir
sebagai plasmid-plasmid, miniatur kromosom,
yang berupa DNA melingkar kecil dan siap
berpindah diantara bakteri. Perbedaan antara
plasmid dan kromosom masih kurang
dijelaskan, walaupun ukuran dan tingkat
kebutuhan penggunaan keduanya telah
diperhitungkan. Kromosom prokariot pada
umumnya memiliki sebuah titik awal dimana
replikasi berawal, titik ini disebut sebagai titik
ori ( origin of replication ). Gen-gen pada
prokariot terorganisasi dalam operon-operon
dan tidak mengandung intron seperti pada
eukariot. Kromosom bakteri sepertinya terikat
pada membran plasma dari bakteri. Dalam
aplikasi biologi molekuler, kromosom dapat
diisolasi dengan sentrifugasi bakteri yang lisis.
12
Gambar 3 Sebuah kromosom eukariot dalam
keadaan terkondensasi.
DNA Sebagai Materi Genetik
Materi genetik mahluk hidup terletak pada
kromosom. Kromosom tersusun atas dua tipe
molekul besar, yaitu protein dan asam nukleat.
Asam nukleat adalah molekul pembina
kehidupan yang terdiri dari DNA (Deoxyribosa
Nucleic Acid) dan RNA (Ribonucleic Acid).
DNA merupakan unit struktural gen dan
terdapat di dalam inti sel. Gen merupakan utas
molekul DNA yang membawa sandi untuk
pembentukan satu molekul protein. Keseluruhan
gen-gen dalam suatu organisme disebut juga
sebagai genom. DNA merupakan gudang
informasi dari suatu mahluk hidup dan
informasi-informasi ini akan diturunkan oleh
mahluk hidup tersebut dari satu generasi ke
generasi berikutnya dan akan terus diturunkan
pada generasi selanjutnya.
DNA dan RNA terbentuk dari bersatunya
beberapa monomer nukleotida. Nukeotida
sendiri merupakan ester dari nukleosida dengan
asam fosfat. Neukleosida merupakan suatu N-
glikosida (dalam bentuk ribosa ataupun
deoksiribosa) dan basa purin maupun pirimidin.
Watson dan Crick pada tahun 1953
mengemukakan struktur tiga dimensi dari DNA
yaitu berupa rantai heliks ganda. Ciri utama
model DNA menurut Watson dan Crick yaitu,
DNA terdiri dari dua untai polinukleotida yang
berpilin untuk menghasilkan bentuk heliks
ganda dua, kemudian kedua untaian DNA
tersebut memiliki arah yang berlawanan (5' - 3'
dengan 3' - 5'), lalu DNA juga memiliki tulang
punggung gula-fosfat dengan ikatan fosfodiester
dan pada bagian tengahnya terdapat pasangan-
pasangan basa A-T dan C-G yang terikat oleh
ikatan hidrogen, dupleks DNA berdiameter 20
Ao dan pasangan basa tersusun pada jarak 3,4 o
antara satu dengan lainnya, serta yang terakhir

satu putaran heliks berjarak 34 Ao dan
mengandung 10 basa.
Bakteri memiliki keistimewaan karena
memiliki DNA tidak hanya di kromosom
namun juga terdapat pada plasmid yang umum
disebut sebagai minikromosom. Satu sel bakteri
Bacillus thuringiensis dapat memiliki 1-12
plasmid dan diantaranya berukuran 30-70 MDa
yang membawa gen cry (Gonzales & Carlton
1980). Jumlah plasmid tiap bakteri berbeda-
beda, bergantung pada jenis subspesies dan
galurnya.
Analisis Total DNA Genom
Schizotyping DNA genom merupakan salah
satu cara yang dapat digunakan untuk
mempelajari keragaman genetika. Schizotyping
adalah analisis profil DNA genom total
berdasarkan pola pita DNA yang dihasilkan
setelah DNA genom utuh dipotong dengan
enzim restriksi yang memotong dengan jarak
situs pemotongan tidak berdekatan (rare-cutting
endonuclease) dan dipisahkan dengan
elektroforesis gel medan berpulsa. Keuntungan
teknik ini ialah cara pengerjaannya yang relatif
mudah dan sangat akurat karena pita-pita DNA
yang dihasilkan membentuk pola yang khas dan
unik sehingga merupakan schizotype, yaitu
suatu bentuk sidik jari dari DNA organisme
yang bersangkutan (Suwanto et al. 1995).
Metode schizotyping terdiri atas tiga tahapan
yaitu isolasi DNA genom utuh dalam matriks
agarosa, pemotongan DNA genom utuh dengan
enzim restriksi endonuklease dalam matriks
agarosa dan pemisahan molekul DNA dengan
elektroforesis sehingga menghasilkan pita-pita
DNA yang jelas setelah pewarnaan dengan
ethidium bromida dan diamati di bawah sinar
UV. Pemisahan yang dilakukan pada tahap
akhir dengan elektroforesis pada medan
berpulsa menurut Suwanto (1994) akan
memberikan gambaran profil DNA yang
menyeluruh, menampilkan peta fisik genom dan
hasil elektroforesis dapat langsung dianalisis.
Enzim Restriksi Endonuklease
Enzim restriksi (atau restriksi endonuklease)
adalah enzim yang dapat memotong utas ganda
DNA pada daerah sekuen khusus yang khas.
Enzim ini membuat dua bukaan, satu ke setiap
tulang punggung fosfat dari heliks ganda tanpa
merusak basanya. Ikatan kimia yang dibuka
oleh enzim restriksi endonuklease dapat
dibentuk kembali oleh enzim lain yang dikenal
sebagai enzim ligase, sehingga fragmen restriksi
DNA yang didapat dari kromosom atau gen lain
dapat digabungkan bersama jika ujung-ujung
untainya saling komplementer. Kebanyakan dari
13
prosedur-prosedur rekayasa genetik dan biologi
molekuler bergantung pada kemampuan enzim-
enzim restriksi. Istilah dari restriction sendiri
berasal dari fakta bahwa enzim ini pertama kali
ditemukan pada strain E. coli yang tampaknya
berfungsi membatasi (restricting) infeksi oleh
bakteriofage tertentu sehingga enzim restriksi
dipercaya sebagai suatu mekanisme pertahanan
diri hasil evolusi pada bakteri untuk bertahan
dari serangan virus dan untuk membantu
menghilangkan sekuen DNA atau RNA dari
virus yang menempel.
Enzim restriksi tidak memotong DNA
secara acak, namun hanya memotong segmen
heliks ganda yang mengandung sekuen
nukleotida tertentu, dan hanya akan melakukan
pemotongan diantara sekuen tersebut
(recognition sequence, sekuen pengenalan)
selalu dengan cara yang sama. Beberapa enzim
melakukan pemotongan untai segera menuju
bagian berlawanan dari untai dihadapannya,
membentuk “blunt end” atau ujung tumpul
fragmen DNA. Kebanyakan enzim membuat
pemotongan yang sedikit menjorok ke dalam,
menghasilkan “sticky ends” atau ujung lengket,
modus pemotongan fragmen DNA “blunt end”
dilakukan oleh enzim restriksi endonuklease
Sma I (Gambar 4).
Enzim restriksi diklasifikasikan menjadi
empat tipe secara biokimia, yaitu tipe I, tipe II,
tipe III, dan tipe IV. Sistem tipe I dan III, pada
sistem ini aktivitas metilase dan restriksi
dilakukan oleh sebuah kompleks besar enzim.
Walaupun enzim ini mengenali sekuen-sekuen
DNA spesifik, namun situs pemotongan yang
sebenarnya berada pada jarak yang bervariasi
dari situs-situs pengenalan (recognition sites),
dan bisa berjarak ratusan basa. Keduanya butuh
ATP untuk menjalankan fungsi pemotongan.
Sistem tipe II, pada sistem ini enzim restriksi
berada terpisah dari metilase, dan pemotongan
terjadi pada situs yang sangat spesifik yang
terdapat di dalam atau dekat dari sekuen
pengenalan. Kebanyakan dari enzim restriksi
yang diketahui adalah tipe II, dan enzim tipe ini
yang paling banyak kegunaannya sebagai
pembantu kegiatan laboratorium sedangkan
untuk sistem tipe IV, diklasifikasikan bagi
enzim restriksi yang mempunyai target hanya
DNA termetilasi.
Enzim restriksi dinamai berdasarkan bakteri
asalnya, tempat enzim tersebut diisolasi dengan
ketentuan sebagai berikut, sebagai contoh EcoR
I berdasarkan E, Escherichia untuk genusnya,
co, coli untuk speciesnya, R dari RY13 untuk
strainnya dan I yang berarti pertama kali
diidentifikasi untuk keterangan urutan
penemuan enzim dalam bakteri tersebut.

Gambar 4 Tipe pemotongan ”blunt end” oleh
Sma1
Daya kerja enzim restriksi endonuklease
tergantung pada kemurnian DNA yang
dihasilkan, macam dan ketepatan larutan
penyangga, dan kondisi suhu, beberapa enzim
juga memerlukan adanya tambahan senyawa
tertentu seperti bovin serum albumin atau
dithiotheretiol. Menurut Sambrook et al. (1989)
selain hal-hal diatas konsentrasi garam yang
tinggi juga dapat menghambat daya kerja enzim
endonuklease.
Elektroforesis Medan Berpulsa atau
Pulsed-field Gel Electrophoresis
(PFGE)
Analisis DNA makrorestriksi menggunakan
enzim restriksi yang memotong DNA genom
sangat jarang dan menghasilkan sejumlah kecil
fragmen restriksi (biasanya 10-20). Fragmen-
fragmen ini biasanya terlalu besar untuk
dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa
konvensional. Elektroforesis gel konvensional
merupakan suatu metode yang relatif mudah
dan dapat dipercaya untuk analisis DNA dan
RNA. Namun metode ini pada praktiknya tidak
dapat menyelesaikan pemisahan fragmen DNA
yang lebih besar dari 50 kilo base pairs (kbp).
Molekul DNA tidak melewati gel menurut
ukurannya pada kondisi ini, tapi mereka
bergerak dengan mengubah bentuk dan
ukurannya sehingga sesuai dengan pori-pori
dari gel. Semakin besar pori-pori gel maka
semakin besar pula molekul DNA yang mampu
melewati gel tanpa reptasi. Walaupun gel
dengan konsentrasi 0,1-0,2 % dapat dipenuhi
untuk melakukan separasi molekul DNA besar
namun cara ini bukanlah solusi yang
memuaskan karena kesulitan yang didapat
untuk mempertahankan keutuhan gel dengan
konsentrasi 0,1-0,2 % sangat tinggi.
Permasalahan ini kemudian secara efektif
diselesaikan melalui sebuah proses yang
biasanya disebut sebagai Elektroforesis Medan
Berpulsa atau pulsed-field gel electrophoresis
(PFGE), dikembangkan pada tahun 1984 untuk
memisahkan DNA kromosom khamir. PFGE
14
memfasilitasi migrasi yang berbeda dari
fragmen DNA besar melewati gel agarosa
dengan secara konstan mengubah arah medan
listrik selama proses elektroforesis berlangsung.
PFGE mampu memisahkan DNA dengan
ukuran 5000 kbp. Pemisahan molekul-molekul
DNA menggunakan teknik PFGE dipengaruhi
oleh beberapa faktor, yaitu konsentrasi gel
agarosa yang digunakan, suhu running, waktu
pulsa, kekuatan medan listrik, bentuk medan
listrik dan topologi DNA (Matthew et al. 1988).
Pemisahan molekul-molekul DNA yang baik
pada teknik elektroforesis ini dapat
dikembangkan dengan mengaplikasikan
kombinasi antara konsentrasi gel agarosa yang
lebih tinggi dengan waktu elektroforesis yang
lebih lama. Waktu pulsa dan kekuatan medan
listrik juga berpengaruh pada pemisahan
molekul-molekul DNA. Molekul DNA yang
lebih besar akan memerlukan waktu pergerakan
yang lebih lama jika dibandingkan dengan
molekul DNA yang lebih kecil.
Menurut Matthew et al. (1988), mobilitas
molekul-molekul DNA selama running pada
teknik ini sangat sensitif terhadap perubahan
suhu. Mobilitas DNA akan meningkat dengan
peningkatan suhu dari 15 oC sampai 20 oC.
Percobaan terhadap posisi elektroda telah
dilakukan oleh Cantor et al. (1988), hasil
percobaan menunjukkan bahwa konfigurasi
elektroda dengan sudut lebih besar dari 110 o
memberikan hasil yang efektif dalam
pemisahan. Topologi DNA yang berbeda akan
memerlukan waktu yang berbeda untuk
menghasilkan pemisahan molekul-molekul
DNA yang baik (Matthew et al. 1988).
Teknik ini memberikan kemudahan untuk
menentukan ukuran genom (Holloway 1993).
Namun pita-pita yang dihasilkan dari
pemotongan enzim restriksi dan dipisahkan
dengan PFGE tidak dapat memberikan
perbedaan antara pita yang berasal dari DNA
kromoson dengan pita yang berasal dari DNA
plasmid dan hanya memberikan ukuran
keseluruhan dari kandungan DNA.
Walaupun demikian PFGE juga memiliki
beberapa keterbatasan, antara lain memakan
waktu, membutuhkan keterampilan tingkat
tinggi, tidak selalu berhasil untuk semua hal
(contoh: pola klonal), pola yang dihasilkan bisa
berbeda dari tiap orang peneliti, tidak dapat
mengoptimalkan pemisahan pada tiap bagian
gel di waktu yang bersamaan, pada PFGE pita
adalah pita dan bukan sekuen, tidak benar-benar
mengetahui apakah pita dengan ukuran yang
sama adalah bagian DNA yang sama, pita tidak
mandiri, perubahan pada satu situs restriksi
dapat berarti perubahan lebih dari satu pita,

keterkaitan harus digunakan sebagai petunjuk
dan bukan ukuran filogenetik sesungguhnya.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Mikroorganisme yang digunakan adalah
berbagai galur bakteri Bacillus thuringensis.
Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah agar
(Sigma), agarosa (Sep RateTM-DNA,
Amersham), asam borat (Merck), BSA
(Biolabs), bufer EC, bufer ESP, bufer restriksi,
bufer TBE 0,5X, enzim restriksi Sma I
(Biolabs), mid range PFG marker (New
England Biolabs), dan Yeast Chromosomes,
Saccharomyces cereviseae, Strain YNN295,
EDTA, ethidium bromida, larutan BSA, larutan
PIV, lisozim (Nacolai Tesque-Japan), media
sintetik Luria Bertani, PMSF 1,5 mM,
Proteinase-K (Boehringer Mannheim), RNA-
ase (Boehringer Mannheim), T10E1, dan T10E100.
Alat-alat yang digunakan adalah tabung
reaksi, labu takar, gelas piala, labu erlenmeyer,
cawan petri, botol Schott, autoklaf, cetakan
Agarosa (Bio-Rad), Inkubator statis (Heraeus,
Germany), inkubator shaker (series 25, New
Jersey-USA), kamera digital, lampu spritus,
mikropipet, microtube, microwave (National
NN-9835, Osaka-Japan), neraca analitik, ose,
parafilm, penangas air (Cambridge-England),
pH meter, pinset, pipet volumetrik, pisau
scapel, sarung tangan, CHEF-DR® III Pulse
Field Electrophoresis System (Bio-Rad),
biofuge dengan rotor tetap #3324 dan r sebesar
5,55 cm (fresco, Haraeus Germany), syringe
(Terumo, Tokyo-Japan), spektrofotometer,
sudip, UV Transilluminator, Vaccum
Milliphore (Nalgene), dan kertas Miliphore 0,22
µm (Nalgene).
Metode
Kondisi Kultur dan Galur Bakteri
Galur bakteri yang digunakan pada
penelitian ini terdiri dari isolat lokal dan galur
standar (Lampiran 1). Bakteri ditumbuhkan
secara aerob pada media Luria Bertani cair
dengan antibiotik pada suhu 37oC hingga
dicapai nilai OD 0,4-0,6 pada λ 610 nm.
Penyiapan DNA pada Blok Agarosa
Sebanyak 1,5 mL suspensi bakteri
dipindahkan ke dalam mikrotube lalu
disentrifugasi selama 10 menit pada suhu 4 oC
dan 7000 rpm. Supernatan dibuang, sedangkan
pelet dicuci dengan 1,5 mL larutan PIV (10 mM
Tris.HCl pH7,5 dan 1 M NaCl) tiga kali,
15
kemudian pelet ditambahkan dengan 0,5 mL
PIV 0,5 M, divorteks dan diinkubasi pada 37
o
C. Selanjutnya suspensi pelet ditambahkan 0,5
mL larutan agarosa 0,8 % dalam 0,5 M PIV.
Campuran agarosa dan biakan dicetak pada
cetakan balok agarosa (Bio-Rad, Richmond,
Calif) menggunakan syringe, cetakan kemudian
dibiarkan membeku membentuk blok gel
agarosa (250 µL/blok).
Blok gel yang telah beku dikeluarkan dan
dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 5
mL larutan pelisis (6 mM Tris HCl pH 7,5;
1mM NaCl; 100 mM EDTA pH 7,5; 0,5% Brij-
58; 0,22% deoxycholate; 0,5% sarkosyl; 2
mg/mL lisozim dan 20 µg/mL RNA-ase) dan
dinkubasi semalam pada suhu 37 oC, kemudian
blok gel dicuci 2 kali dengan 10 mL larutan
TE10/1 (10 mM Tris.HCl pH 8,0 dan 1 mM
EDTA), lalu gel direndam pada 5 mL larutan
deproteinase (100 mM EDTA pH 9,5; 0,5%
sarkosyl dan 200 µg/mL proteinae-K) dishaker
pada inkubator shaker selama 48-72 jam pada
suhu 55 oC dan 60 rpm. Blok agar kemudian di
cuci dengan T10E100 dan larutan PMSF 1 mM
dan diinkubasi selama 1 jam pada temperatur
ruang. Gel kemudian dicuci 2 kali dengan
larutan T10E1, gel lalu dimasukkan ke dalam
mikrotube yang berisi 1 mL larutan penyimpan
(EDTA 0,5 M, pH 8,0) dan disimpan pada 4 oC.
Fragmentasi Molekul DNA dengan Enzim
Retriksi Endonuklease
Enzim restriksi yang digunakan adalah Sma
I, sepertiga blok gel dipotong tipis dan dicuci
dua kali dengan TE10/1 selama 30 menit
kemudian dimasukkan ke dalam mikrotube
yang berisi 200 µl bufer restriksi lalu dibiarkan
selama 2 jam pada suhu 25 oC. Blok agar
kemudian dimasukkan kedalam bufer restriksi
baru yang telah tersedia dengan enzim 10 s.d.
20 unit Sma I lalu diinkubasi pada suhu 25 oC
selama satu malam. Kemudian blok agar di cuci
T10E1 sebelum elektroforesis.
Elektroforesis pada Medan Berpulsa
Elektroforesis dilakukan menggunakan
sistem Bio-Rad CHEF-DRII. Untuk running
gel, digunakan agarosa dengan konsentrasi 1%
(w/v). Potongan-potongan blok gel dimasukkan
ke dalam sumur-sumur running gel dan ditutup
dengan 0,5% agarosa. Running gel selanjutnya
dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang
telah diisi dengan bufer TBE 0,5x untuk
dilakukan proses elektroforesis dengan alat
PFGE pada suhu 14 oC, waktu pulsa 5 detik,
tegangan listrik 6 Volt/cm, dan voltase sebesar
180 Volt selama 24 jam. Marker yang
digunakan ialah mid range PFG marker, dan
 16

Kromosom Saccharomyces cereviseae, Strain Tabel 1 Hasil induksi antibiotik pada BT

YNN295. Hasil elektroforesis dilihat pada UV standar dan pada isolat lokal.
transilluminator setelah proses staining dengan Resistensi
ethidum bromida. Ukuran fragmen ditentukan No. B. thuringiensis
Antibiotik
dengan membandingkan hasil foto pola fragmen
1. daendrolinus HD-7 Ap
DNA dan marker.
2. kurstaki Ap
3. entomocidus HD-973 Ap, Tc
4. aizawai HD-137 Ap
HASIL DAN PEMBAHASAN 5. tolworthi HD-537 Ap
6. darmstadiensis T 495 Ap
Induksi Antibiotik 7. dakota HD-511 Ap
Beberapa bakteri memiliki kecenderungan 8. israeliensis HD-500 Ap, Sm
untuk kehilangan kualitas dirinya setelah 9. finitimus HD-3 Ap
mengalami peremajaan berkali-kali pada media 10. entomocidus HD 937 Ap
dengan kandungan nutrisi yang berlimpah. 11. aizawai san 415-2 Ap
Umumnya bakteri akan kehilangan plasmidnya 12. kurstaki HD-1 s Ap
karena tuntutan untuk mempertahankan dirinya 13. Isolat 3a Ap
lebih rendah dari kondisi alaminya. Plasmid 14. Isolat 3l Ap, Tc
merupakan elemen ekstrakromosom yang 15. Isolat 3n Ap, Tc
umumnya berfungsi menyandi metabolit- 16. Isolat 4q Ap
metabolit sekunder yang digunakan untuk 17. Isolat 5k Ap
bertahan hidup. Oleh karena itu BT diremajakan 18. Isolat 6c Ap
dalam media dengan penambahan antibiotik, 19. Isolat 6l Ap
sehingga diharapkan BT dapat tumbuh dengan 20. Isolat 7e Ap
mengeluarkan seluruh potensi hidupnya atau 21. Isolat Dd Ap
dengan kata lain dikondisikan untuk
Keterangan :
mengaktifkan kembali mekanisme pertahanan
Ap: Ampisilin Tc: Tetrasiklin
hidupnya dan diharapkan memunculkan
Sm: Streptomisin
plasmid-plasmid yang hilang. Keberadaan
plasmid dibutuhkan untuk mendapatkan ukuran
Keberadaan plasmid pada BT sangat penting
genom total secara tepat dan akurat.
untuk membedakannya dengan B. subtilis yang
Hasil dari proses induksi antibiotik dapat
merupakan kerabat dekatnya. Karena hasil
dilihat pada Tabel 1. Isolat maupun standar
penelitian Berry et al. (2002) menyebutkan
terlebih dahulu diujikan pada enam antibiotik
bahwa gen cry penyandi δ-endotoksin yang
yang umum digunakan dalam biologi molekuler
berada pada plasmid yang sebagian besar diapit
untuk menginduksi plasmid bakteri. Antibiotik
oleh gen penyandi resistensi antibiotik. Oleh
yang digunakan untuk menginduksi plasmid
karenanya induksi antibiotik ini berperan dalam
pada penelitian ini antara lain ampisilin,
penentuan genom total dari BT.
streptomisin, kanamisin, tetrasiklin, kloram-
fenikol, dan asam nalidiksat. Hasil yang didapat
Isolasi DNA Genom
menunjukkan adanya kesamaan resistensi
DNA Genom diisolasi dengan metode yang
terhadap antibiotik ampisilin untuk semua BT,
dikembangkan oleh Cantor et al. (1988) yang
isolat maupun standar. Namun ada juga bakteri
telah mengalami modifikasi untuk
yang resisten lebih dari satu antibiotik yaitu
menyesuaikan keadaan. Metode ini
subspesies entomocidus HD 973 (Ap dan Tc),
menggunakan gel agaros untuk memerangkap
subspesies israeliensis HD 500 (Ap dan Sm),
DNA dengan membentuk plug-plug gel agaros
isolat 3l (Ap dan Tc), dan isolat 3n (Ap dan Tc).
berisi biomassa bakteri untuk selanjutnya
Isolat maupun standar yang memiliki resistensi
mengalami perlakuan-perlakuan enzim untuk
terhadap lebih dari satu antibiotik diharapkan
memurnikan DNA dari protein-protein yang
dapat memiliki plasmid lebih dari satu. Namun
dapat mengganggu proses restriksi. Metode ini
tidak menutup kemungkinan bahwa BT tersebut
juga memberikan hasil konsentrasi DNA lebih
hanya memiliki satu plasmid dengan dua gen
tinggi dari metode lain, dan melindungi DNA
penyandi resistensi antibiotik. Induksi
dari degradasi oleh Dnase lebih lama.
diperlukan agar plasmid dapat tetap
Keutuhan DNA Genom dalam proses
dipertahankan di dalam sel dan induksi juga
elektroforesis ini sangat penting. DNA yang
dapat meningkatkan jumlah plasmid (Sambrook
telah mengalami degradasi akan menghasilkan
1989). Hasil Induksi menunjukkan bahwa BT
pita elektroforesis yang tidak akurat, fragmen
paling sedikit memiliki satu resisten antibiotik.

yang dihasilkan mungkin bukan fragmen yang
sesungguhnya. Nilai total genom yang
didapatkan juga merupakan nilai total genom
bukan sebenarnya.
Penelitian ini juga menggunakan metode
isolasi DNA konvensional atau yang umum
digunakan, hasil elektroforesis yang didapat
tidak berbeda dengan hasil elektroforesis yang
didapat dari DNA plug dari metode Cantor
(Gambar 5A). Namun setelah masa
penyimpanan selama satu minggu (Gambar 5B),
hasil isolasi DNA konvensional tidak
menunjukkan adanya DNA sedangkan DNA
plug tetap memberikan hasil yang kurang lebih
sama dengan hasil-hasil sebelumnya. Dari hasil
pengamatan ini terbukti bahwa DNA yang
dihasilkan oleh metode isolasi DNA
konvensional mengalami degradasi oleh DNase.
Sehingga untuk penyimpanan dalam jangka
waktu yang lama metode isolasi konvensional
kurang baik.
Gambar 5 Hasil restriksi B. thuringiensis subsp.
kurstaki dengan enzim restriksi Sma I
pada kondisi pemisahan DNA yang
sama dengan proses isolasi DNA
berbeda. Marker Saccharomyces
cerevisiae (M Sc) dan Mid range
PFG marker (M Mid). (A) Pemisahan
dilakukan setelah isolasi DNA
dilakukan. (B) Pemisahan dilakukan
setelah DNA disimpan selama 1
minggu.
17
Enzim Restriksi Sma I
Proses analisis DNA genom menggunakan
metode Schizotyping membutuhkan enzim
restriksi yang sesuai, sehingga diharapkan
dapat memberikan hasil elektroforesis dengan
potongan pita DNA yang besar dan nyata.
Penetuan enzim restriksi yang sesuai dapat
mempermudah proses analisis. Penentuan enzim
restriksi ini dikemukakan oleh Smith dan
Condaime (1990) yaitu berdasarkan (i)
persentase molekul (G+C) DNA genom bakteri;
(ii) jumlah basa yang dikenali oleh enzim
restriksi; (iii) situs enzim restriksi yang
memotong kodon awal atau kodon akhir.
Persentase molekul (G+C) DNA genom BT
dilaporkan oleh Sneath (1994) antara 33.8-34.5
%. Oleh karena itu situs pengenalan enzim
restriksi yang kaya akan nukleotida Guanin (G)
dan Sitosin (C) akan memotong dengan jarang
DNA bakteri BT. Semakin banyak basa yang
dikenali oleh enzim restriksi maka semakin
sedikit situs yang dikenalinya pada DNA
genom, sehingga semakin sedikit pita-pita yang
dihasilkan. Enzim-enzim dengan situs
pemotongan heksanukleotida (6 basa)
diharapkan dapat memberikan hasil
pemotongan lebih baik dari enzim
oktanukleotida (8 basa) dan tetranukleotida (4
basa). Enzim-enzim oktanukleotida akan
memotong DNA sangat jarang karena basa yang
dikenalinya lebih banyak, sebaliknya enzim-
enzim tetranukleotida memotong DNA sangat
banyak karena basa yang dikenali oleh enzim-
enzim ini lebih sedikit.
Perbedaan dalam metilasi DNA juga
merupakan salah satu faktor yang mepengaruhi
perbedaan penyebaran situs pemotongan enzim
restriksi. Pernyataan tersebut disebabkan oleh:
(i) enzim restriksi merupakan produk
pertahanan bakteri terhadap invasi DNA faga
dari bakteriofaga, enzim restriksi akan
mendegradasi DNA faga sebelum bakteriofaga
bereplikasi dan membentuk faga baru namun
enzim restriksi yang dihasilkan tidak
mendegradasi DNA bakteri sendiri karena DNA
bakteri tersebut mengalami proses metilasi yang
mencegah pemotongan oleh enzim restriksi
yang dihasilkan oleh bakteri itu sendiri; (ii)
adanya hasil pemotongan dari enzim restriksi
yang sulit untuk dijelaskan. Beberapa hal lain
yng dapat mengakibatkan perbedaan
pemotongan antara lain menurunnya aktivitas
dari enzim restriksi itu sendiri yang dipengaruhi
oleh perubahan suhu, konsentrsi buffer dan
kemurnian enzim tersebut.
Beberapa enzim restriksi yang telah umum
digunakan dalam elektroforesis medan berpulsa
memenuhi kriteria penentuan enzim restriksi
 18

yang telah disebutkan diatas. Enzim-enzim

tersebut memiliki situs pemotongan yang kaya
akan sitosin (C) dan guanin (G), enzim-enzim
tersebut antara lain: Apa I (GGGCC*C), Bss
HII (G*CGCGC), Xma III (C*GGCCG), Sac II
(CCGC*GG), Nae I (GCC*GGC), Nar I
(GG*CGCC), Not I (GC*GGCCGC), dan Sma I
(CCC*GGG).
Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa
enzim Sma I memotong DNA bakteri BT lebih
baik dari enzim lain sehingga pola pita DNA
Gambar 6 Hasil restriksi 12 galur oleh Sma I.
yang dihasilkan lebih baik sehingga pada
1% MP agaros, 0.5 X larutan
penelitian ini digunakan enzim Sma I. Enzim
penyangga TBE, suhu 14 oC, waktu
restriksi Sma I merupakan jenis enzim restriksi
pulsa (Pt) 5-50 detik, waktu running
heksanukleotida dengan situs pemotongan
(Rt) 20 jam, tegangan sebesar 7,1
CCC/GGG, fakta yang mendukung pernyataan
volt/cm dan menggunakan Mid
sebelumnya dimana enzim dengan situs
range PFG marker (M Mid).
pengenalan kaya akan basa Sitosin (C) dan
Guanin (G) akan memotong dengan jarang
DNA yang kaya akan Sitosin (C) dan Guanin
(G). Namun hasil yang diberikan oleh enzim
Sma I pada penelitian ini tidak dapat diproses
lebih lanjut karena pita yang dihasilkan smear.
Hal ini mungkin karena dalam produksinya Sma
I banyak terkontaminasi nuklease nonspesifik
(Smith & Condemine 1990) atau pada proses
penyimpanan enzim yang kurang baik sehingga
enzim kehilangan kemampuannya merestriksi
DNA dengan sempurna.

Kondisi Optimal Elektroforesis Gambar 7 Hasil restriksi 12 galur oleh Sma I.

Kondisi optimal elektroforesis diperlukan 1% MP agaros, 0.5 X larutan
untuk mendapatkan hasil yang baik dan mudah penyangga TBE, suhu 14 oC, waktu
dianalisis. Untuk itu penentuan kondisi optimal pulsa (Pt) 5-50 detik, waktu
diawali dengan me-running DNA BT pada tiga running (Rt) 20 jam, tegangan
kondisi yang berbeda (Gambar 6, Gambar 7, sebesar 6 volt/cm dan
dan Gambar 8). Matriks gel agaros pertama menggunakan Mid range PFG
menghasilkan pita smear di bagian bawah marker (M Mid).
matriks gel agaros, menunjukkan bahwa DNA
bakteri-bakteri (sesuai dengan nomor urut pada
tabel) telah sebagian atau semua keluar dari gel
agaros sehingga tidak dapat dianalisis. Matriks
pertama di-running pada kondisi: Running time,
Rt, 20 jam; Pulse time, Pt, 5-50 detik; dengan
Voltase, V, 7,1 volt/cm. Matriks gel kedua di-
running pada kondisi: Rt = 20 jam; rt = 5-50
detik; dan V = 6 volt/cm. DNA pada matriks ini
juga mengalami hal yang sama dengan matriks
sebelumnya yaitu berada pada batas akhir
matriks sehingga menyulitkan proses analisis
pada matriks gel agaros.
Hasil yang didapat memberi kesimpulan Gambar 8 Hasil restriksi 12 galur oleh Sma I.
bahwa waktu running selama 20 jam masih 1% MP agaros, 0.5 X larutan
terlalu panjang sehingga pada kedua uji coba penyangga TBE, suhu 14 oC, waktu
sebelumnya DNA masih berada pada batas pulsa (Pt) 1-20 detik, waktu running
akhir matriks gel agaros. Pada uji coba ketiga (Rt) 17 jam, tegangan sebesar 6
matriks gel agaros di-running dengan kondisi: volt/cm dan menggunakan Mid
Rt = 17 jam; Pt = 1-20 detik; dan V = 6 volt/cm. range PFG marker (M Mid).

Uji coba ketiga menghasilkan pita yang
berada di area tengah matriks gel agaros
sehingga memudahkan proses analisis. Pada
umumnya peningkatan waktu pulsa akan
meningkatkan pemisahan DNA di bawah 1 Mb.
Namun DNA yang berukuran 1 Mb ke atas akan
mengalami smear pada saat di-running dengan
waktu pulsa yang tinggi.
Elektroforesis dilakukan pada kondisi suhu
yang sama yaitu 14 oC, pada suhu ini
diharapkan menginaktifasi kerja enzim-enzim
pada DNA. Suhu juga memiliki pengaruh yang
sama pada semua sistem elektroforesis,
peningkatan suhu juga diikuti dengan kenaikan
mobilitas DNA dalam sistem, oleh karena itu
sangat penting untuk menjaga suhu dalam sitem
elektroforesis tetap atau konstan (Cantor 1988).
Analisis Hasil Elektroforesis
Ukuran DNA genom total dari PFGE dapat
diketahui dengan mengukur panjang setiap
potongan DNA hasil elektrforesis dengan
membandingkan pada marker yang di gunakan
yaitu Midrange PFG marker dan Yeast
chromosomes marker sebagai standar ukuran
DNA yang digunakan, kemudian panjang setiap
pita DNA hasil elektroforesis tersebut
dijumlahkan sehingga didapat nilai keseluruhan.
Setiap potongan yang dihasilkan oleh restriksi
enzim yang berbeda pada DNA genom yang
sama akan memberikan nilai total yang kurang
lebih sama. Sehingga terkadang digunakan
beberapa enzim yang berbeda untuk mengetahui
nilai total genom yang lebih baik.
Tanskanen et al. Menyebutkan bahwa ada
beberapa kemungkinan yang bisa menjadi
sumber kesalahan dalam penentuan ukuran
genom dari hasil fragmen DNA yang
dielektroforesis. Pertama, kesalahan yang
terjadi dalam mengukur ukuran fragmen DNA
dari pergerakannya dalam gel dengan
membandingkan pada pergerakan standar
ukuran molekuler. Kedua, fragmen DNA yang
berukuran lebih kecil dari 8 kbp seringkali tidak
terdeteksi setelah proses PFGE, namun sumber
kesalahn kedua ini masih bisa diabaikan karena
tidak mempengaruhi nilai total genom secara
signifikan. Ketiga, kesalahan yang disebabkan
oleh kehadiran plasmid yang tidak memiliki
situs pemotongan Sma I, karena mobilitas
plasmid yang tidak terestriksi berbeda dengan
mobilitas molekul DNA linear yang memiliki
ukuran molekul yang sama. Biasanya sebuah
plasmid sirkular terbuka tidak meninggalkan
sumur setelah elektroforesis (Beverley SM
1988), namun kehadiran lebih dari satu plasmid
yang bergerak dengan pergerakan yang berbeda
dapat menyebabkan penghitungan ukuran
19
genom yang lebih besar dari seharusnya
(Beverley & Cantor 1988).
Hasil elektroforesis dari proses restriksi
yang dilakukan pada penelitian ini tidak dapat
dianalisis seperti yang dikehendaki. Namun ada
beberapa hal yang masih dapat menjadi bahan
pembahasan pada penelitian ini. Hasil restriksi
oleh enzim Sma I memberikan pita smear yang
tidak dapat diketahui ukurannya secara tepat
saat dibandingkan dengan marker kromosom S.
cerevisiae dan mid range PFG marker, sehingga
hampir tidak mungkin untuk menentukkan nilai
total genom DNA yang diinginkan. Walaupun
demikian hasil elektroforesis ini dapat
memberikan kisaran ukuran genom DNA yang
telah diujikan dan masih dapat menunjukkan
adanya proses restriksi yang berbeda pada DNA
BT yang berbeda. Kedua hal tersebut dapat
memberikan sedikit petunjuk adanya perbedaan
ataupun kemiripan antara isolat-isolat BT lokal
dan pembandingnya yaitu galur-galur BT
standar.
Elektroforesis di bagi menjadi dua bagian
yaitu yang pertama merupakan elektroforesis
DNA isolat-isolat lokal maupun galur-galur
standar tanpa proses restriksi oleh enzim Sma I
dan elektroforesis isolat-isolat lokal dan galur-
galur standar dengan melakukan proses restriksi
oleh enzim Sma I terlebih dahulu. Dari hasil
elektroforesis dapat dapat dilihat bahwa proses
restriksi yang dilakukan oleh enzim Sma I tidak
sempurna sehingga yang dihasilkan adalah pita
yang smear.
Gambar 9A menunjukkan hasil
elektroforesis dari 12 galur standar yang tidak
direstriksi oleh enzim Sma I. Hasil
elektroforesis menunjukkan bahwa pita-pita
DNA kedua belas galur standar berada pada
kisaran nilai 1800- 2500 kbp (kilobase pair).
Hal yang sama juga ditunjukkan pada gambar
9B, yaitu hasil elektroforesis dari DNA galur
BT lokal yang tidak mengalami perlakuan
restriksi oleh enzim Sma I. Pita-pita isolat-isolat
lokal tersebut juga berada pada kisaran yang
hampir sama dengan galur-galur standar kecuali
pada DNA nomer 15 yaitu isolat 3n yang
menghasilkan pita berada pada 1100 kbp (Tabel
2). Namun nilai yang didapatkan tanpa proses
pemotongan ini tidak akurat sehingga tidak
dapat dijadikan sebagai acuan nilai total genom
DNA dari bakteri BT. Gunderson dan Chu
melaporkan bahwa hambatan utama dalam
memisahkan DNA berukuran besar adalah
adanya proses entrapment (penjebakan) dalam
satu bentuk maupun bentuk lain. Fenomena ini
semakin signifikan saat ukuran DNA yang
dipisahkan jauh lebih besar dari karakter
dimensi yang diciptakan oleh matriks gel.
 20

A B
Gambar 9 Hasil elektroforesis galur standar dan lokal pada kondisi: 1% MP agaros, 0.5 X larutan
penyangga TBE, suhu 14 oC, waktu pulsa (Pt) 1-20 detik, waktu running (RT) 17 jam,
tegangan sebesar 6 volt/cm, menggunakan marker Saccharomyces cerevisiae (M Sc) dan
Mid range PFG marker (M Mid). (A) galur-galur standar tidak direstriksi. (B) galur-galur
lokal tanpa melalui proses restriksi. Nomor urut bakteri-bakteri sesuai dengan nomor urut
pada tabel.

Bentuk pertama penjebakan terjadi di dari jenis yang sama. Masih banyak hal yang
sumur-sumur tempat DNA dimasukkan dan dapat dioptimalkan dari penelitian ini, masih
terjadi saat kekuatan medannya terlalu besar. banyak yang bisa diperbaiki, namun peneliti
Hambatan ini dapat diperkecil dengan yakin bahwa analisis genom total merupakan
melakukan prerun dengan menggunakan waktu metode yang sangat tepat untuk menganalisis
pulsa yang lebih pendek maupun dengan kekerabatan antar spesies.
menggunakan medan berkekuatan rendah.
Bentuk kedua dari penjebakan terjadi setelah Tabel 2 Perkiraan ukuran pita DNA yang
DNA masuk kedalam matriks gel agaros. belum direstriksi
Kenaikan lebih lanjut dari kekuatan medan Ukuran
pertama-tama akan menyebabkan DNA No. B. thuringiensis
pita (Kb)
membentuk pita smear, diikuti dengan DNA
yang bergerak sangat pelan dari tiap pitanya, 1. daendrolinus HD-7 2250
hingga kegagalan total untuk bermigrasi. 2. kurstaki 2200
Sedangkan pada gambar 10A dan 10 B 3. entomocidus HD-973 2350
dapat dilihat hasil elektroforesis dari galur-galur 4. aizawai HD-137 1750
standar maupun dari isolat-isolat lokal yang 5. tolworthi HD-537 1800
telah mengalami proses restriksi oleh enzim 6. darmstadiensis T 495 2450
7. dakota HD-511 2455
Sma I. Pita-pita yang dihasilkan tidak dapat
dianalisis lebih dalam karena berbentuk pita 8. israeliensis HD-500 2550
smear, sehingga tidak dapat diketahui secara 9. finitimus HD-3 2500
10. entomocidus HD 937 2455
pasti ukuran dan pola pemotongan dari enzim
11. aizawai san 415-2 1900
restriksi Sma I terhadap DNA tiap isolat dan
12. kurstaki HD-1 s 1855
galur yang diisolasi. Tidak terdapatnya pola
potongan pita dan ukuran genom dari isolat 13. Isolat 3a 2200
maupun standar yang digunakan menyebabkan 14. Isolat 3l 2500
proses analisis kekerabatan antar isolat dan 15. Isolat 3n 1100
galur tidak mungkin dilakukan. Namun 16. Isolat 4q 2350
demikian hasil pemotongan oleh enzim restriksi 17. Isolat 5k 2455
18. Isolat 6c 2550
Sma I ini secara kasat mata memberikan profil
yang berbeda untuk tiap DNA yang berbeda 19. Isolat 6l 2600
yang dapat menjadi sebuah awal pembuktian 20. Isolat 7e 2600
bahwa isolat-isolat yang diujikan bukan berasal 21. Isolat Dd 2550
 21

A B
Gambar 10 Hasil elektroforesis galur standar dan galur lokal pada kondisi: 1% MP agaros, 0.5 X
larutan penyangga TBE, suhu 14 oC, waktu pulsa (Pt) 1-20 detik, waktu running (RT) 17
jam, tegangan sebesar 6 volt/cm, menggunakan marker S. cerevisiae (M Sc) dan Mid
range PFG marker (M Mid). (A) galur-galur standar yang telah di restriksi Sma I. (B)
galur-galur lokal direstriksi dengan menggunakan enzim Sma I. Nomor urut bakteri
sesuai dengan nomor urut pada tabel.

SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA

Hasil penelitian menunjukkan bahwa secara
umum B. thuringiensis memiliki resistensi
terhadap antibiotik ampisilin. Isolasi DNA
berhasil dilakukan dan dibuktikan dengan
elektroforesis tanpa proses restriksi oleh enzim.
Metode isolasi DNA yang paling cocok untuk
PFGE adalah metode plug yang dikembangkan
oleh Cantor, karena hasil isolasinya dapat
bertahan lebih lama dari isolasi DNA
konvensional. Analisis pita restriksi tidak dapat
dilakukan dengan baik karena proses restriksi
enzim tidak memberikan pita yang jelas tapi
justru memberikan pita smear. Perkiraan genom
total sementara untuk galur standar berada pada
1800 -2500 kbp sedangkan untuk isolat lokal
berada pada 1100 – 2600 kbp. Perhitungan
genom total secara nyata dan perkiraan
kekerabatan antar galur lokal tidak berhasil
dilakukan.
Penelitian pendahuluan guna menentukan
kondisi optimum untuk mendapatkan profil pita
DNA B. thuringiensis yang lebih tajam perlu
dilakukan. Penggunaan enzim restriksi baru
untuk menghindari munculnya faktor kegagalan
yang disebabkan oleh penurunan kinerja enzim-
enzim restriksi sangat direkomendasikan.
Pengunaan enzim restriksi kaya C dan G lain
sebaiknya di lakukan pada penelitian lanjutan
sebagai pembanding profil pemotongan enzim.
Armstrong JL, Rohrmann GF, Beaudreau GS.
1985. Delta endotoxin of Bacillus
thuringiensis subsp. israelensis. J Bacteriol
161: 39-46.
Bery C et al. 2002. Complete sequence and
organization of pBtoxis, the toxin-coding
plasmid of Bacillus thuringiensis subsp.
israelensis. J Bacteriol 68: 5082-5095.
Beverley SM. 1988. Characterization of the
‘unusual’ mobility of large circular DNAs
in pulsed field-gradient electrophoresis.
Nucleic Acids Res 16: 925-939.
Cantor CR, Smith CL, Matthew MK. 1988.
Pulsed field gel electrophoresis of a very
large DNA molecules. Ann Ref Biohys
Chem 17: 287-304.
Carlton, Gonzales. 1986. Biocontrol of Insects
Bacillus thuringiensis. Amsterdam:
Martinus Nijhaff.
Cavalier-Smith T. 1985. Eukaryotic gene
numbers, non-coding DNA, and genome

size. pada Cavalier-Smith T, ed. The
Evolution of Genome Size. Chichester: John
Wiley.
Chu G, Gunderson. 1989. Pulsed field
electrophoresis in contour-clamped
homogeneous electric fields for the
resolution of DNA by size or topology.
Electrophoresis 10: 290-295.
Colton, L., Clark JB. 2001. Comparison of
DNA isolation methods and storage
conditions for successful amplification of
Drosophila genes using PCR. Dros Inf Ser
84: 180-182.
Deacon J. 2000. Microbial World: Bacillus
thuringiensis. Edinburgh: Institute of Cell
and Molecular Biology.
Glare TR, M O'Callaghan. 2006. Bacillus
thuringiensis: animal safety.[terhubung
berkala]. http://www.bt.ucsd.edu/bt_safety.
html [25 sep 2006].
Glare TR, M O'Callaghan. 2006. Bacillus
thuringiensis: history of Bt.[terhubung
berkala]. http://www.bt.ucsd.edu/bt_history
.html [25 sep 2006].
Gunderson K, Chu G. 1991. Pulsed-field
electrophoresis of mega base-sized DNA.
Mol. Cell. Biol 11: 3348-3354.
Helmiah. 2000. Analisis profil DNA genom
beberapa galur Bacillus thuringiensis
dengan elektroforesis gel medan berpulsa.
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Holloway BW, Morgan AF. 1993. Genome
organization in Pseudomonas. Annu Rev
Microbiol 40: 79-105.
Lederberg J, McCray AT. (2001).”'Ome sweet
'Omics -- a genealogical treasury of
words”. The Scientist 15 : 7.
Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia.
Thenawijaya M, Penerjemah; Jakarta:
Erlangga. Terjemahan dari:Principles Of
Biochemistry.
22
Matthew et al. 1988. High resolution and
accurate size determination in PFGE of
DNA. Biochemistry 27: 9210-9226.
Pearson H. 2006. "Genetics: what is a gene?".
Nature 441 (7092): 398-401.
Sambrook J et al. 1989. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Ed ke-3. New York:
Cold-Spring Harbor Laboratory Press.
Shaheduzzaman SM, Akimoto S, Kuwuhara T,
Kinouchi T, Ohnishi Y. 2000. Genome
analysis of Bacteroides by pulsed field gel
electrophoresis : chromosome sizes and
restrictrion petterns. DNA research 4: 19-
25.
Skov MN, Pedersen K, Larsen JL. 1995.
Comparison of pulsed-field gel
electrophoresis, ribotyping, and plasmid
profiling for typing Vibrio anguillarum
serovar O1. J Bacteriol 61: 1540-1545.
Smith CL, Condemine G. 1990. Mini review:
new approach for physical mapping of
small genome. J Bacteriol 172: 1167-1172.
Suwanto A, Rosana L, Budi T, Edi G. 1995.
Analisis DNA genom Xanthomonas
campestris menggunakan pulsed field gel
electrophoresis. [thesis] Bogor: Pusat Antar
Universitas Bioteknologi, Institut Pertanian
Bogor.
Suwanto A. 1994. Pulsed field gel
electrophoresis: a revolution in microbial
genetics. Mol Biol Biotechnol 2: 78-85.
Suzuki K, Iwata K, Yoshida K. 2001. Genome
analysis of Agrobacterium tumefaciens :
construction of physical maps for linear and
circular chromosomal DNAs, determination
of copy number ratio and mapping of
chromosomal virulances genes. DNA
research 8: 141-152.
Tanskanen et al. 1990. Pulsed-field gel
electrophoresis of Sma I digests of
lactococcal genomic DNA, a novel method
of strain identification. Appl. Environ.
Microbiol 56: 3105-3111.
 23

Wikimedia foundation. 2006. Bacillus

thuringiensis.[terhubung berkala].
http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_thurin
giensis.html [1 Agu 2006].
 24

LAMPIRAN
 25

Lampiran 1 Galur-galur bakteri Bacillus thuringiensis yang digunakan

Resistensi
No. B. thuringiensis Asal
Antibiotik
1. daendrolinus HD-7 Ap National Center for Agricultural
Utilization Reasearch
2. kurstaki Ap American Type Culture Collection, USA
3. entomocidus HD- Ap, Tc National Center for Agricultural
973 Utilization Reasearch
4. aizawai HD-137 Ap National Center for Agricultural
Utilization Reasearch
5. tolworthi HD-537 Ap National Center for Agricultural
Utilization Reasearch
6. darmstadiensis T Ap Thailand Institute for Science and
495 Technology, Bangkok
7. dakota HD-511 Ap National Center for Agricultural
Utilization Reasearch
8. israeliensis HD-500 Ap, Sm Lausanne University
9. finitimus HD-3 Ap National Center for Agricultural
Utilization Reasearch
10. entomocidus HD Ap National Center for Agricultural
937 Utilization Reasearch
11. aizawai san 415-2 Ap Lausanne University
12. kurstaki HD-1 s Ap Thailand Institute for Science and
Technology, Bangkok
13. Isolat 3a Ap Tanah rerumputan-Cibining, Bogor
14. Isolat 3l Ap, Tc Tanah rerumputan-Cibinong, Bogor
15. Isolat 3n Ap, Tc Tanah rerumputan-Cibinong, Bogor
16. Isolat 4q Ap Tanah di bawah pohon jambu-Cibinong,
Bogor
17. Isolat 5k Ap Tanah di bawah pohon jambu-Cibinong,
Bogor
18. Isolat 6c Ap Lumpur air selokan-Cibinong, Bogor
19. Isolat 6l Ap Lumpur air selokan-Cibinong, Bogor
20. Isolat 7e Ap Bangkai larva-Cibinong, Bogor
21. Isolat Dd Ap Tanah pinggir jalan-Pamijahan, Bogor
 26

Lampiran 3 Analisis DNA Genom

Peremajaan Bakteri

Penyiapan DNA total

Fragmentasi Molekul DNA

dengan Enzim Restriksi
Endonuklease

Pemisahan Molekul DNA

dengan Elektroforesis pada
Medan Berpulsa

Analisis Data
 27

Lampiran 4 Peremajaan bakteri pada media antibiotik.

Dengan antibiotik

Dengan antibiotik
 28

Lampiran 5 Penyiapan DNA total

5 ml
 29

Lampiran 6 Fragmentasi DNA genom dengan enzim restriksi Sma I

Lampiran 7 Elektroforesis dengan PFGE