PDF

UNIVERSIDAD POLITCNICA DE MADRID ESCUELA TCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS INDUSTRIALES Departamento de Ingeniera Qumica Industrial y del Medio Ambiente
INGENIERA DE BIOCATALIZADORES Y BIOPROCESOS: p-GALACTOSIDASA DE Thermus sp., cepa T2.
Tesis Doctoral Benevides Costa Chitunda Pesseia
UNIVERSIDAD POLITCNICA DE MADRID ESCUELA TCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS INDUSTRIALES Departamento de Ingeniera Qumica Industrial y del Medio Ambiente
INGENIERA DE BIOCATALIZADORES Y BIOPROCESOS: p-GALACTOSIDASA DE Thermus sp., cepa T2.
Memoria presentada para optar al grado de Doctor en Ciencias Qumicas por Benevides Costa Chitunda Pessela
DIRECTORES: ALFONSO VICENTE CARRASCOSA SANTIAGO^^ JOS MANUEL GUISAN SEIJAS ^ " ALICIA LARENA PELLEJERO ^'
MADRID 2002 INSTITUTO DE FERMENTACIONES INDUSTRIALES (CSIC) ^' INSTITUTO DE CATLISIS Y PETROLEOQUMICA (CSIC)^
La realizacin de esta Tesis ha sido posible gracias a la concesin de una Beca por parte del Gobierno de la Repblica de Angola, en el programa de formacin de cuadros por parte del "Instituto Nacional de Bolsas de Estudos" adscrito al Ministerio de Educacin y
Cultura, bajo la direccin de los Doctores Alfonso Vicente Carrascosa Santiago, Jos Manuel Guisan Seijas y Alicia Larena Pellejero. Quiero agradecer al personal de la Embajada de Angola y en especial Su Embajador, Seor Pedro Sebastiao, por todas las facilidades dadas cuando la situacin lo requera. Al Departamento de Ingeniera Qumica Industrial y del Medio Ambiente, por permitir que esta Tesis sea presentada en el mismo. Muy especialmente, quiero agradecer a mis Directores, Dr. Alfonso Vicente
Carrascosa Santiago, Dr. Jos Manuel Guisan Seijas y Dr^. Alicia Larena Pellejero, por la oportunidad que me han dado de integrarme en sus grupos de investigacin as como, por la brillante direccin cientfica y amistad durante la realizacin de esta tesis. A los Profesores, Maria del Carmen Polo y Javier Soria, Directores del Instituto de Fermentaciones Industriales e Instituto de Catlisis y Petroleoqumica del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas respectivamente, estancia en estos centros. Al Dr. Jos Luis Garca, del Departamento de biologa molecular del Centro de Investigaciones Biolgicas del CSIC, por la forma tan amable, paciente y por las "mil variantes posibles" en la discusin y explicacin de muchos experimentos de esta memoria (para mi fue mas que un maestro). A los Doctores Rubns Lpez Garca, Ernesto Garca, Pedro Garca y Eduardo Das del Departamento de Biologa molecular del CIB, por todas las facilidades, consejos y sobre todo amistad prestada durante mis "molestas estancias" en su laboratorio. A los Doctores Alejandro Vian y Estrella Corts, por la forma paciente, amable y cariosa que han soportado mi complicada forma de ver y entender las cosas. Quiero tambin agradecer la amabilidad y predisposicin siempre mostrada por los Doctores Germn Rivas y Carlos Alfonso del servicio de ultracentrifugacin analtica del CIB, por toda la ayuda prestada. Al Dr. Roberto Fernndez-Lafuente, por sus consejos y por la forma clara, amable y paciente durante la discusin y redaccin de los resultados de esta tesis. A los Doctores Ramn Gonzlez, Jos "Pepe" Barcenilla, Rosario Muoz, Isidro Cornejo, Nieves Corzo, Agustn Olano, Alejandro Cifuentes paciencia y amistad. por sus innmeros consejos, por todas las facilidades prestadas durante mi
A los Doctores Flix Garca Ochoa y Miguel Ladero Galn, por haberme permitido estar en numerosas ocasiones en su laboratorio de investigacin, en el Departamento de Ingeniera Qumica de la Universidad Complutense de Madrid y por toda la ayuda prestada. Quiero tambin agradecer sinceramente primero al Doctor Eugenio Muoz Camacho y despus al Dr. Gabriel Pinto, por haber aceptado la tutora de esta Tesis. Un recuerdo muy especial para Teresa Prez de Prada, por su amistad, compaa y ayuda prestada, durante las largas y difciles jornadas de laboratorio. Mil gracias. Un recuerdo entraable para todos mis compaeros, que de forma directa o indirecta han hecho posible que esta tesis salga adelante; del Instituto de Fermentaciones Industriales, Felisa, Friki, gueda los Santos, Jos " el segoviano", los portugueses Luis Soares y Anabela Almeida, Adolfo, Javi, Juan Luis, Loli, Mariluz, la Dr^. Mar Villamel, Antonio, Alberto, el Dr. Guillermo Santamara, la Dra. Marta Calvo "la gallega por las charlas en portugus-gallego", Julin, Maria; de Qumica de Polmeros, Marisa Carrascoso, del Centro de Investigaciones Biolgicas, Auxi, Begoa, Blanca, Beatriz, Virginia, Chello, Manolo, Dani; del instituto de Catlisis y Petroleoqumica, "la Doctora" Gloria, Glorita, "el Esnortado" Palomo, "la ataca" Olga, "las tranquilas" Rosa y Mari Carmen Cenos, mi maestra del power point y de la presentacin de esta Tesis, a ella un especial Gracias; "las Uruguayas" Lorena y Valeria, los Chilenos
Lorena Wilson y Rodrigo, de Colombia, Claudia, las Italianas "la Berlus" Silvia y Tristana, "Don" Manuel de Salamanca, los Brasileos Celia Galvo y Paulo Tardioli, Carmen "Luisa" de Galicia y en especial Cesar Mateo, por las grandes discusiones de Ftbol, y por haber aprendido con l la poca soltura que tengo en la preparacin de soportes para inmovilizar y purificar protenas. Un recuerdo muy especial para toda mi familia, principalmente a mi madre, por haber soportado todos los sacrificios posibles para que hoy est donde estoy. A Carmen y a David un recuerdo entraable por estar siempre a mi lado en momentos buenos y tambin en los malos. Por ltimo, a mis compatriotas de Angola, Mario Brito, que conmigo ha compartido muchos momentos malos y buenos desde que los dos llegamos a este Pas, a Joo Luis por compartir conmigo muchos das duros en la direccin de los estudiantes de Angola en Espaa. A todos ellos les estar eternamente agradecido. Mil perdones a todas aquellas personas
amigas que por algn lapsus no aparecen en estas pginas. A TODOS GRACIAS.
ndice i
INTRODUCCIN GENERAL
1.- LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES DE UNA INDUSTRIA MAS SOSTENIBLE DE PROCESOS QUMICOS MAS COMPLEJOS 1
2.- LAS ENZIMAS EN LOS SERES VIVOS Y EN UN REACTOR QUMICO: LA INGENIERA ENZIMATICA.
3.- LAS ENZIMAS DE
TERMOFILO
COMO CATALIZADORES INDUSTRIALES
4.- PURIFICACIN DE ENZIMAS INDUSTRIALES RECOMBINANTES E TERMFILOS: CONSTRUCCIN DE PROTENAS CON COLAS DE POLI-HIS. 3
5.- HIDRLISIS DE LACTOSA EN LECHE
. 4 g
6.- p-GALACTOSIDASAS DE TERMFILOS
7.- LA BIOTECNOLOGA ENZIMATICA: UNA NUEVA Y COMPLEJA REA DE LA INGENIERA Y TECNOLOGA QUMICA PARA EL DESARROLLO DE NUEVOS PROCESOS QUMICOS INDUSTRIALES MS EFICACES, MS SELECTIVOS Y MS SOSTENIBLES. ^
OBJETIVOS GENERALES
CAPITULO 1. CLONACIN, FERMENTACIN Y EXTRACCIN DE LA PROTENA QUIMERA IMAC/p-GALACTOSIDASAS DE Thermus sp. CEPA T2. 1.1. INTRODUCCIN 1.2. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 1.3. MATERIALES Y MTODOS 1.3.1 .MATERIALES 1.3.1.1. CEPAS BACTERIANAS 1.3.1.2. PLSMIDOS 1.3.2. MTODOS 1.3.2.1. CONDICIONES DE CRECIMIENTO Y CONSERVACIN DE LAS CEPAS. 1.3.2.2. COLNAJE Y SECUENCIACIN 1.3.3. ENSAYOS ENZIMATICOS 1.3.4. INFLUENCIA DEL pH, Y LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA 17 16 16 17 ' 9 15 15 15 15 15 16
ndice i
1.4. RESULTADOS Y DISCUSIN 1.4.1. CONSTRUCCIN DEL PLSMIDO pBGT3 PARA PRODUCIR LA QUIMERA PROTEICA IMAC/p-GALACTOSIDASA. 1.4.2. FERMENTACIN Y EXTRACCIN DE LA PROTENA DE INTERS. 1.4.3. PROPIEDADES BIOQUMICAS DE LA PROTENA QUIMERA IMAC/pGALACTOSlDASA A.- Estudio de la actividad p-galactosidasa B.- Efecto del pH en la actividad enzimtica C - Efecto de la temperatura en la actividad p-galactosidasa D.- Termoestabilidad de la (3-gaiactosidasa de Thermus sp. cepa T2 nativa (BgaA) y de la protena quinnera (IMAC/p-galactosidasa). 1.5. CONCLUSIONES
18
18
22
23 23 23 24
25 26
CAPITULO 2. PURIFICACIN DE LA IMAC/p-GALACTOSIDASA DE Thermus sp. Cepa T2. 2. INTRODUCCIN 2.1. NECESIDAD DE PURIFICAR 2.2. PROTENAS QUIMRICAS O DE FUSIN 2.3. PROBLEMAS MS FRECUENTES EN LA PURIFICACIN DE PROTENAS POR CROMATOGRAFA IMAC. 2.3.1. CROMATOGRAFA DE PROTENAS NATIVAS Y DE PROTENAS DE FUSIN MONOMRICAS Y MULTIMRICAS. 2.4. OBJETIVOS DEL PRESENTE CAPITULO. 2.5. MATERIALES Y MTODOS 2.5.1. MATERIALES 2.5.2. MTODOS 2.5.2.1. Preparacin del extracto proteico. 2.5.2.2. Activacin de soportes agarosa con epiclorhidrina. Formacin de epoxi agarosa. 2.5.2.3. Valoracin de los grupos epxido 2.5.2.4. Preparacin de los Soportes Quelato-Epxido A.- Soporte Inminodiactico (IDA) Epxido. B.- Soportes IDA-Cu-epxido C - Soporte IDA-Co-epxido D.- Soporte IDA-Ni-epxido E.- Soporte IDA-Zn-epxido 2.5.2.5. PURIFICACIN DE LA IMAC/p-GALACTOSIDASA DE Thermus sp. CEPA T2. 2.5.2.5.1. Por mtodos fsicos. 36 36 34 35 35 35 35 36 36 36 32 33 34 34 34 34 31 27 27 28 28
ndice ii
2.5.2.5.2. Por cromatografa de afinidad a queiatos metlicos empleando soportes con baja densidad de grupos reactivos. 2.5.2.5.2.1. Adsorcin. 2.5.2.5.2.2. Desorcin. 2.5.2.5.2.3. Efecto de la desorcin del catin metlico del soporte en la actividad de la enzima purificada. 2.5.2.6. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN PROTEICA Y DE SU PESO MOLECULAR. 2.5.2.7. ENSAYOS EN LA ULTRACENTRIFUGACIN ANALTICA. 2.5.2.7.1. Equilibrio de Sedimentacin. 2.5.2.7.2. Velocidad de Sedimentacin. 2.6. RESULTADOS Y DISCUSIN 2.6.1. Purificacin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. cepa T2, por tratamiento trmico. 2.6.1.2. Purificacin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. T2, por cromatografa de afinidad a queiatos metlicos en soportes poco cargados. 2.6.1.3. Desorcin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. T2, adsorbida a soportes quelato. Purificacin en soportes inmovilizados con queiatos de cobre. 2.6.1.4. Purificacin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. 12, en soportes inmovilizados con queiatos de cobre y adsorcin selectiva con 25 mM de imidazoi. 2.6.1.5. Estudio del efecto del tiempo de incubacin en la adsorcin de la protena IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., 12. 2.6.1.6. Purificacin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., T2, en soportes inmovilizados con queiatos de cobalto y nquel. 2.6.1.7. Determinacin del coeficiente de extincin molar. 2.6.2. EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE LA PROTENA SOBRE SU ESTADO DE ASOCIACIN. 2.6.2.1. Equilibrio de sedimentacin. 2.6.2.2. Velocidad de sedimentacin. 2.7. CONCLUSIONES 49 49 49 50 46 47 45 44 44 43 42 37 38 38 40 42 37 36 36 37
CAPITULO 3.- INMOVILIZACIN Y ESTABILIZACIN DE IMAC/pGALACTOSIDASA DE Thermus sp. T2 3. INTRODUCCIN 3.1 . NECESIDADES DE LA INMOVILIZACIN 3.1.1. Inmovilizacin sobre soportes preexistentes 3.1.2. Inmovilizacin covalente 3.1.3. Epxidos 52 52 53 53 54 55
ndice iv
3.1.4. EPXIDOS MULTIFUNCIONALES 3.1.5. INMOVILIZACIN REVERSIBLE 3.2. ESTABILIZACIN DE LA ESTRUCTURA CUATERNARIA DE ENZIMAS MULTIMRICAS 3.2.1. UNIN COVALENTE MULTISUBUNIDADES 3.2.2. ENTRECRUZAMIENTO DE LAS DISTINTAS SUBUNIDADES DE ENZIMAS MULTIMRICAS INMOVILIZADAS POR UNIN COVALENTE MULTISUBUNIDADES. 3.3. OBJETIVOS DEL PRESENTE CAPITULO. 3.4. MATERIALES Y MTODOS 3.4.1. MATERIALES 3.4.2. MTODOS 3.4.2.1. PREPARACIN DE SOPORTES CON GRUPOS EPXIDO SUSTITUIDOS PARCIALMENTE. 3.4.2.1.1. Los soportes sepabeads IDA-epxido, sepabeads-IDAcobalto. 3.4.2.1.2. Soportes sepabeads-etilendiamina(EDA)-epxido 3.4.2.1.3. Soportes sepabeads-boronato epxido 3.4.2.2. PREPARACIN DE DERIVADOS SOBRE SOPORTES EPXIDO. 3.4.2.3. INMOVILIZACIN COVALENTE MULTIPUNTUAL. 3.4.2.4. BLOQUEO CON GLICINA 3.4.2.5. ESTABILIZACIN DE ENZIMAS MULTIMRICAS POR INMOVILIZACIN MULTISUBUNIDADES. ENTRECRUZAMIENTO CON DEXTRANO ALDEHIDO. 3.4.2.6. ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD TRMICA DE LOS DERIVADOS 3.4.2.7. NUEVOS SOPORTES FLEXIBLES PARA INMOVILIZACIN REVERSIBLE DE PROTENAS. ADSORCIN Y DESORCIN DE LAS PROTENAS 3.5. RESULTADOS Y DISCUSIN 3.5.1. Estudio de la estabilidad de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. T2 en las condiciones de inters para su inmovilizacin estabilizacin. 3.5.2. ESTABILIZACIN DE LOS DERIVADOS POR INMOVILIZACIN COVALENTE MULTIPUNTUAL. 3.5.3. DISEO DE ESTRATEGIAS PARA LA ESTABILIZACIN DE ENZIMAS MULTIMRICAS. 3.5.3.1. Estabilizacin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. 12, por inmovilizacin multisubunidades.
57 57
59 60
60 60 61 61 61
61
61 61 61
62 62 62
63
63
63 64
64
65
66
67
ndice v
3.5.3.2. Estabilizacin de la estructura cuaternaria de la IMAC/p-gaiactosidasa de Thermus sp. T2, por entrecruzamiento con dextrano aldeiido 3.5.3.2.1. Diseo de innnovilizados por tratamientos con dextrano aldehido 3.5.3.2.2. Caracterizacin del derivado sepabeads-boronato-epxido tratado con dextrano aldeiido y protegido con lactosa. 3.5.3.3. INMOVILIZACIN COVALENTE DE LA ENZIMA PURIFICADA. 3.5.3.4. PURIFICACIN, INMOVILIZACIN Y ESTABILIZACIN EN UN SOLO PASO EN SOPORTES SEPABEADS-IDA-Co-EPXIDO 3.5.4. INMOVILIZACIN NO-COVALENTE DE LA IMAC/p-GALACTOSIDASA DE Thermus sp. T2, EN SOPORTES REVERSIBLES. 3.6. CONCLUSIONES 73 76 71 69 71 67 67
CAPITULO 4. REACCIONES DE MAYOR INTERS INDUSTRIAL 4.- INTRODUCCIN 4.1. HIDRLISIS DE LACTOSA 4.1.1. Hidrlisis acida. 4.1.2. Leciies bajas en lactosa por expresin ectpica de galactosidasas intestinales en glndulas mamarias. 4.1.3. Principales fuentes de (3-galactosidasas. 4.1.4. PROBLEMAS CINTICOS DURANTE LA HIDRLISIS ENZIMATICA DE LACTOSA. 4.2. OBJETIVOS Y ALCANCE DEL TRABAJO. 4.3. MATERIALES Y MTODOS 4.3.1. Materiales 4.3.2. Mtodos 4.3.2.1. Preparacin de los derivados 4.3.2.2. Anlisis de la influencia de cationes metlicos en los rendimientos de hidrlisis. 4.3.2.3. Reacciones de hidrlisis 4.3.2.4. ESTUDIOS CINTICOS 4.3.2.4.1. Clculo de las constantes cinticas. 4.4. RESULTADOS Y DISCUSIN. 4.4.1. Influencia de cationes metlicos en el curso de las reacciones de hidrlisis de lactosa. 4.4.2. Anlisis cintico de inhibicin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. T2, soluble y de sus derivados (sepabeads-IDA-Co y sepabeadsboronato) |3-
78 78 80 80
81 81
83 84 85 85 85 85
85 86 87 87 87
87
88
ndice vi
4.4.3. Estudio de los cursos de iiidriisis de lactosa 4.4.3.1. Hidrlisis de lactosa en leche y en suero de quesera. 4.5. CONCLUSIONES CAPITULO 5. CONTROL TCNICO Y ECONMICO DE PROCESOS INDUSTRIALES QUE OPERAN CON p-GALACTOSIDASAS 92 89 90 91
5. INTRODUCCIN
5.1 CONSUMO 5.2 COMERCIO EXTERIOR 5.3 PRODUCCIN DE SUEROS DE QUESERA 5.4 OBJETIVOS Y ALCANCE DEL ANLISIS 5.5 Anlisis econmico de la subsitucin del proceso de produccin de lecfie baja en lactosa con lactasa libre, por un derivado inmovilizado de la misma enzima 5.5.1 Ventajas tecnolgicas de la utilizacin de lactasa de Thermus sp. T2 en la produccin de leches bajas en lactosa 5.6. Anlisis de mercado. Demanda del producto 5.6.1. Costes y precios 5.6.2. Descripcin del proceso productivo 5.6.2.1. Por cambio de tecnologa: Lactasa libre a derivados inmovilizados 5.7. Inversin total del proyecto 5.8. Ingresos por ventas de la leche producida con enzima libre 5.9. Produccin de leche baja en lactosa por hidrlisis con un derivado de lactasa inmovilizada a soportes slidos preexistentes 5.10 Viabilidad industrial y valoracin econmica 5.11 Produccin industrial de leche baja en lactosa, por sustitucin de un reactor con lactasa inmovilizada, por otro que opera con un enzima de mayores prestaciones tecnolgicas 5.12 CONCLUSIONES DISCUSIN GENERAL Y CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA
92
93 93 95 97
97
98 98 98 99 99 99 100
100 101
102 107 108 113
Abreviaturas
Resistencia a ampiciiina Kb lacl PCR LB X-Gal IPTG CECT ATCC v/v Epi IDA IMAC Miles de pares de bases Gen represor del opern lactosa Reaccin en cadena de la polimeraza Luria Bertani 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiransido lsoprpopil-p-D-1-tiogalactopiransido Coleccin Espaola de cultivos tipo Coleccin Americana de cultivos tipo volumen/volumen Epiclorhidrina cido Inmino dicetico Cromatografa de afinidad a quelatos metlicos orto-nitrofenii-p-D-galactosido orto-nitrofenil Kilodaltons Agarosa Beads Cross Linked Dodecil sulfato Sdico Soporte activado con epiclorhidrina con x jamles de quelatos metlicos por mlilitro de gel. His IFI CIB MAPA VAN TIR BgaA IMAC/p-galactosidasa DQO Histidina Instituto de Fermentaciones Industriales Centro de Investigaciones Biolgicas. Ministerio de Agricultura Pescas y Alimentacin Valor Actual Neto Tasa Interna de Retorno p-galactosidasa considerada nativa p-galactosidasa quimera con el dominio IMAC Demanda Qumica de Oxgeno
ONPG
ONP KD Ag BCL SDS Epi-x-IDA-Me
Introduccin General 1
1.- LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES DE UNA INDUSTRIA MAS SOSTENIBLE DE PROCESOS QUMICOS MAS COMPLEJOS.
La posibilidad de que toda la humanidad (mas de 6.000 millones de personas) tengan acceso a nuevos y mejores frmacos de bajo coste, a alimentos mejores y mas abundantes, a una agricultura mucho mas eficiente, a sistemas analticos mas precisos etc., necesidad cada da mas acuciante. Para es una
poder aspirar a alcanzar este sueo es
imprescindible la puesta a punto de tecnologas mas sencillas y de menor coste energtico para llevar a cabo nuevas transformaciones qumicas mas complejas en condiciones medioambientales muy benignas. Esta nueva qumica super-fina, limpia y barata es uno de los grandes retos de la industria qumica actual y precisa urgentemente de la bsqueda y optimizacin de nuevos y mejores catalizadores.
Las enzimas son catalizadores de origen biolgico que parecen cumplir muchos de los requisitos necesarios para impulsar esta nueva industria qumica: i.-son catalizadores muy activos en medios acuosos y en condiciones muy suaves de temperatura, presin, pH, etc. 11.-son catalizadores muy especficos: pueden modificar un nico substrato en una mezcla de substratos muy similares e incluso pueden discernir entre dos ismeros de una mezcla racmica de un compuesto quiral, iii.- son catalizadores muy selectivos: pueden modificar un nico enlace o un nico grupo funcional en una molcula que tenga varias estructuras modificables. As pues, las enzimas parecen en principio muy tiles para un gran numero de procesos de enorme inters social e industrial.
2.-
LAS ENZIMAS EN LOS SERES VIVOS Y EN UN REACTOR QUMICO: LA
INGENIERA ENZIMTICA
A pesar de esas excelentes
propiedades catalticas y sus enormes y variadas
posibilidades de utilizacin industrial, las enzimas han ido evolucionando por la presin de seleccin natural a travs del tiempo para cumplir mejor las necesidades fisiolgicas de los seres vivos y no para ser utilizadas en reactores qumicos industriales. As las enzimas son catalizadores solubles, generalmente muy inestables y que sufren inhibiciones por substratos y productos. Adems muchas veces no tienen todas las propiedades ideales (actividad, selectividad, etc) cuando queremos que catalizen procesos distintos de los naturales (p.e. sntesis en lugar de hidrlisis) sobre substratos no naturales y en condiciones experimentales no convencionales (p.e. disolventes orgnicos no-txicos). La descripcin, a ESCALA LABORATORIO, de nuevas enzimas y nuevos procesos de posible inters industrial es realmente "espectacular" pero no es suficiente para que ese proceso se convierta en una realidad industrial. Para ello, es preciso disear estas biotransformaciones en condiciones donde se obtengan velocidades de reaccin muy altas, rendimientos termodinmicos cuantitativos y todo ello, en condiciones medio-ambientales
benignas donde los biocatalizadores sean estables durante muchos ciclos de reaccin y los substratos tengan una elevada solubilidad, etc. Esta conversin de INTERESANTES PROCESOS POSIBLES en REALIDADES INDUSTRIALES SOSTENIBLES es un problema realmente apasionante, pues nos obliga a optimizar procesos qumicos difciles (p.e.
(regioselectivos, esteroespecficos, etc) sobre compuestos qumicos poco manejables
substancias bioactivas lbiles y difciles de disolver) y catalizados por bio-macromolculas a su vez lbiles y muy complejas (las enzimas).
As pues, parece bastante obvia la necesidad de mejorar enormemente las propiedades de las enzimas y los sistemas de reaccin antes de que se pueda explotar masivamente su enorme potencial industrial.
3.- LAS ENZIMAS DE TERMFILOS COMO CATALIZADORES INDUSTRIALES.
Siguiendo los criterios de la evolucin natural de las enzimas de organismos termfilos se han ido haciendo termo-resistentes. En este caso el criterio de seleccin biolgica coincide en principio con los intereses de la industria qumica. Adems la termoresistencia de las enzimas de termfilos esta muchas veces asociada con una mayor resistencia a otros agentes inactivantes diferentes del calor, pe., los disolventes orgnicos. En principio las enzimas de termfilos parecen excelentes candidatos como catalizadores industriales. En numerosas ocasiones, las enzimas de termfilos muestran un extrao
comportamiento de actividad con la temperatura, presentando muy baja actividad a temperaturas bajas o moderadas (pe. temperatura ambiente). Por ello a pesar de su gran estabilidad, las enzimas de termfilos presentan tambin algunas limitaciones de aplicacin industrial. El estudio de este complejo comportamiento actividad-temperatura y su posible solucin constituye uno de los hitos mas interesantes de la biotecnologa enzimtica pues permitira el uso masivo de estas enzimas, con una excelente termo-resistencia, en todo tipo de aplicaciones analticas e industriales. Sin embargo, muchos procesos enzimticos industriales pueden o deben realizarse a temperaturas altas (reacciones con substratos hidrofbicos para aumentar su solubilidad, qumica de alimentos para prevenir contaminaciones y para acoplarse a procesos de esterilizacin, etc). En estos casos las enzimas de organismos termfilos pueden ser una excelente solucin como biocatalizadores industriales. Muchas enzimas de termfilos de inters industrial son enzimas minoritarias dentro organismos difciles de crecer y por ello hasta hace unos pocos aos su aplicabilidad industrial era bastante improbable. Hoy en da, gracias a las tcnicas de ingeniera gentica, estas enzimas minoritarias de termfilos se pueden super-expresar en organismos hospedantes muy fciles de crecer y se pueden obtener en muy grandes cantidades susceptibles de ser aplicadas como catalizadores industriales.
4.-
PURIFICACIN
DE
ENZIMAS
INDUSTRIALES
RECOMBINANTES
TERMFILOS: CONSTRUCCIN DE PROTENAS CON COLAS DE POLI-HIS.
La super-expresin
de enzimas de termfilos
recombinantes
como
protenas
extracelulares en hospedantes mesfilos podra simplificar mucho su extraccin y purificacin. Estas protenas recombinantes extracelulares podran ser extradas con un elevado grado de pureza a partir del sobrenadante del tanque de fermentacin. Posteriormente estas enzimas de termfilos expresadas en organismos mesfilos, se podran purificar posteriormente por tratamiento trmico: las protenas de mesfilos precipitaran mayoritariamente durante el tratamiento trmico y en cambio las enzimas de termfilos lo resistiran con facilidad. Este mtodo de purificacin es muy sencillo y de bajo coste, podra ser muy til para purificar enzimas industriales de uso en qumica orgnica donde la purificacin total de la enzima no suele ser necesaria. Sin embargo, si nuestra enzima recombinante es intracelular o si ha de utilizase en qumica de alimentos, qumica analtica etc. necesitamos mejorar mucho mas la purificacin, hasta obtener enzimas 100 % puras y al mismo tiempo con un precio muy asequible. Por ejemplo, los alimentos son mezclas complejas de muchsimas substancias y necesitamos estar seguros de que la nica enzima presente en los birreactores de tratamiento sea la enzima de inters. La presencia de otras enzimas con otras actividades catalticas (p.e. proteasas, esterasas, lipasas, oxidasas, etc) podra modificar la estructura de otros componentes del alimento y modificar sus propiedades de un modo que nosotros no queremos modificar. La adicin de una cola de 6 His en uno de los extremos de una enzima de inters industrial puede ser un mtodo muy interesante de preparar la enzima recombinante para una purificacin total por cromatografa de afinidad sobre quelatos metlicos. La adicin de una pequea cola de 6 His es una modificacin muy pequea de la enzima recombinante y en principio no debiera producir cambios importantes en su estructura y su funcin {actividadestabilidad, etc). Sin embargo esta cola de 6 His (si queda suficientemente expuesta al exterior de la protena recombinante) va tener una alta afinidad hacia columnas cromatogrficas de quelatos metlicos. En principio, una afinidad mucho mayor que las que poseen las protenas naturales producidas por el organismo hospedante. As, a escala laboratorio podramos
adsorber tanto las protenas naturales como la protena recombinante a matrices de quelatos metlicos comerciales. Posteriormente se iran eluyendo, p.e., con un gradiente de imidazol, primeramente las protenas naturales y posteriormente las protenas recombinantes con un muy elevado grado de pureza. En la presente Tesis Doctoral discutiremos, en uno de sus captulos, la optimizacin de estos procesos cromatogrficos, pensando en su posible utilizacin industrial e intentando lograr tambin la selectividad en el primer proceso de adsorcin de la enzima recombinante y las protenas naturales sobre matrices cromatogrficas diseadas a medida.
5.- HIDRLISIS DE LACTOSA EN LECHE
La lactosa es un azcar que se encuentra en elevadas concentraciones en la leche (por encima del 5%). En el mundo existen numerosos sectores de poblacin con deficiencias para metabolizar lactosa. Cuando la actividad de la p-galactosidasa intestinal es deficiente, la mayor parte de la lactosa ingerida pasa al intestino grueso, donde se convierte en un excelente nutriente para las bacterias presentes. Estas descomponen el azcar en cido lctico, hidrgeno, dixido de carbono y metano (Aurisicchio, 1994). Adems la presencia de lactosa en el intestino atrae agua, provocando un cuadro diarreico que puede llegar a ser muy agudo. Este cuadro provoca la imposibilidad de la persona intolerante al consumo de productos con lactosa, con unos severos sntomas que pueden incluso conducir a la muerte del consumidor. Por otro lado, incluso una asimilacin solo parcial de este producto provoca una serie de serios problemas que hace difcil el consumo de leche por el paciente. La industria lctea tambin se ve dificultada por la presencia de lactosa, producto de solubilidad limitada que dificulta la produccin de helados, leche condensada, y otros productos lcteos. La hidrlisis de la leche previa a su fermentacin en procesos de produccin de quesos tambin ofrece ventajas, al acelerar el proceso de maduracin y evitar que los sueros sean muy contaminantes (la lactosa es un azcar muy reductor) La solucin ideal, es la hidrlisis previa de la lactosa en glucosa y galactosa, de esta forma adems de dar un cierto sabor dulce a la leche se evitan los problemas de intolerancia y de cristalizacin. Para los problemas de intolerancia agudos, la leche debe de llevar tan solo muy pequeas trazas de lactosa. Dado que la leche es un producto complejo, donde adems de la lactosa hay protenas, vitaminas, grasas, etc que no se desean modificar, el mtodo de hidrlisis debe de ser altamente especfico. La solucin ideal es la bsqueda de enzimas capaces de hidrolizar este producto, y las p-galactosidasas son la respuesta. Estas enzimas hidroiizan de forma especfica enlaces 1-4 pglicosdicos, siendo el grupo aceptor la galactosa, dejando inalterado el resto de los componentes de la leche. Las enzimas se encuentran disponibles comercialmente de muy distintas fuentes.
A pesar del inters de esta reaccin, la baja estabilidad de las preparaciones comerciales y la fuerte inhibicin que se produce por los productos (que llega a evitar hidrlisis totales de la lactosa) estn limitando su aplicacin industrial. Un ltimo problema de la hidrlisis de lactosa en leche es que convierte a la leche en un producto que se contamina muy rpidamente, por lo que debe de realizarse sobre leche ya esterilizada o pasteurizada para evitar su deterioro. Por ello la produccin de una preparacin de p-galactosidasa muy estable y con bajos niveles de inhibicin adquiere una especial relevancia.
6.- p-GALACTOSIDASAS DE TERMFILOS
En este contexto, la bsqueda de nuevas p-galactosidasas que sern posiblemente nnuy activas y estables a elevadas temperaturas, y que quizs pudieran presentar menores niveles de inhibicin por los productos, tendra una especial relevancia. La hidrlisis de lactosa podra realizarse directamente a la salida del esterilizador, a temperaturas de unos 55-60C, evitando la contaminacin microbiana y manteniendo estril tanto la leche como el derivado, logrando elevadas velocidades de reaccin y prolongados periodos de utilizacin del derivado.
7.- LA BIOTECNOLOGA ENZIMATICA: UNA NUEVA Y COMPLEJA REA DE LA INGENIERA Y TECNOLOGA QUMICA PARA EL DESARROLLO DE NUEVOS PROCESOS
QUMICOS
INDUSTRIALES MS EFICACES, MS SELECTIVOS Y MS SOSTENIBLES.
Las enzimas catalizan procesos qumicos y su posible utilizacin industrial para el diseo de nuevos procesos qumicos ms efectivos y ms sostenibles constituye uno de los retos ms apasionantes de la Ingeniera Qumica actual. Sin embargo el origen biolgico de las enzimas y las enormes posibilidades que ofrecen las modernas tcnicas de biologa molecular y bioqumica para mejorar las propiedades de las enzimas como catalizadores de procesos qumicos industriales hace que esta nueva rea de la ingeniera qumica tenga que desarrollarse forzosamente desde un enfoque muy integral y un desarrollo complejo y
multidisciplinar. De hecho, es muy significativo el hecho de que hoy en da los Departamentos de Ingeniera Qumica mas importantes de mundo, cuenten con muy buenos laboratorios de Biologa Molecular (POR, ADN recombinante) y de este modo pueden abordar con mayores posibilidades de xito en el diseo de estos nuevos procesos qumicos industriales catalizados por enzimas. La presente Tesis Doctoral pretende incluirse dentro de este esquema de trabajo, nuestro objetivo principal es un problema eminentemente qumico: la hidrlisis especfica y selectiva de lactosa en leche (modificando solo la lactosa y dejando intactos todos los dems componentes de la leche y produciendo nicamente glucosa y galactosa evitando la formacin de subproductos txicos). Sin embargo para resolver este problema qumico, o al menos para proponer diferentes soluciones a este problema, hemos de utilizar una serie de disciplinas cientficas en principio y hasta hace unos aos muy distantes entre si: a.- la utilizacin de tcnicas de ADN recombinante para mejorar la produccin y purificacin del catalizador en forma soluble, b.- el diseo de nuevas fases estacionarias cromatogrficas para mejorar la purificacin de las enzimas, c - el diseo de nuevos y mejores protocolos de inmovilizacin y estabilizacin de estos catalizadores basados en el conocimiento de su reactividad qumica, as como de sus caractersticas estructurales y funcionales.
As pues, esta Tesis, dirigida esencialmente a la solucin de un problema de Ingeniera Qumica precisa de la utilizacin multidisciplinar de tcnicas de Microbiologa, Biologa Molecular, Ciencia de Materiales, Bioqumica, Biofsica, Qumica de Protenas, Enzimologa, etc, imprescindibles para efectuar un planteamiento mas efectivo de este "problema de
ingeniera qumica" y lograr unos resultados mas prometedores.
Objetivos Generales 7
OBJETIVOS GENERALES El objetivo central de esta Tesis Doctoral es el diseo de diferentes alternativas para la posible hidrlisis industrial de lactosa en leche y derivados lcteos catalizada por derivados inmovilizados, muy activos y muy estables, de una nueva p-galactosidasa de Thermus sp., de la Cepa 12. Este objetivo se puede dividir en cinco sub-objetivos multidisciplinares que
teniendo una cierta entidad propia, se ensamblan perfectamente para la consecucin del objetivo central. Por este motivo, esta Tesis Doctoral, se presenta en forma de cinco Captulos diferentes pero perfectamente relacionados entre s. A continuacin se describen brevemente los cinco sub-objetivos de la presente Tesis y posteriormente se discutir cada uno de ellos con mayor profundidad en cada uno de los Captulos.
a.- Produccin de una |3-galactosidasa quimrica con propiedades ptimas para su posterior purificacin por cromatografa de afinidad.
Se efecta la insercin de un dominio de 6 histidinas en uno de los extremos de la secuencia de la enzima (pe. amino terminal). Se estudiarn la actividad y estabilidad de la enzima quimrica para evaluar si la construccin efectuada tiene efectos negativos sobre la aplicabilidad industrial de la enzima.
b.- Purificacin de la enzima: diseo de fases estacionarias y protocolos de cromatografa "a medida" para facilitar la purificacin de la protena quimrica.
Se estudia el diseo de tcnicas sencillas y de fcil implementacin industrial para la purificacin de la enzima quimrica. Por un lado intentamos aprovechar la termo-estabilidad de la enzima para lograr una semi-purificacin mediante un simple tratamiento trmico del extracto enzimtico que provoque la precipitacin de las enzimas mesofilas. Por otro lado, se disearn soportes cromatogrficos (quelatos metlicos) a medida, para la completa purificacin de la enzima teniendo en cuenta dos parmetros de notable relevancia industrial: i.- la adsorcin selectiva de la enzima sobre los soportes para reducir el volumen de las columnas cromatogrficas utilizadas y para reducir al mnimo el tiempo de contacto entre la enzima y las proteasas presentes en el extracto crudo, ii.- la reduccin de las posibilidades de adsorcin multi-subunidades de esta enzima multimrica para simplificar al mximo el proceso final de desorcin selectiva de la enzima quimrica del soporte cromatogrfico.
c - Desarrollo de protocolos sencillos de inmovilizacin y estabilizacin adicional de la IMAC/|3-galactosidasa de Thermus sp.. Cepa T2.
Se estudian diferentes alternativas para la preparacin de derivados inmovilizados de posible utilizacin industrial:
Objetivos Generales 8
i.- Protocolos de inmovilizacin covalente multipuntual y multisubunidades para lograr que la enzima una vez inmovilizada sobre el soporte sea ms estable que la enzima nativa.
ii.- Protocolos de estabilizacin completa de la estructura cuaternaria de la enzima, para intentar aumentar la estabilidad trmica de la enzima y en todo caso, evitar cualquier liberacin de subunidades de la enzima al alimento tratado (lectie).
iii.-
Diseo de protocolos
combinados
para
la
purificacin,
inmovilizacin
estabilizacin de esta enzima multimrica utilizando una nica tcnica de inmovilizacin sobre soportes heterofuncionales quelato metlico- epxido.
iv.- Diseo de protocolos de inmovilizacin y estabilizacin por adsorcin fsica multisubunidades de la enzima sobre soportes muy rgidos recubiertos de una pelcula polimrica de poli-etilenimina. Aprovechando que esta enzima termfila ya tiene "per se" una estabilidad trmica muy interesante, disearemos este nuevo tipo de inmovilizaciones que presentan una importante ventaja econmica, ecolgica y tecnolgica: los soportes se pueden reutilizar indefinidamente sin producir ningn residuo industrial indeseable. Aliora, la enzima, aunque no se desorba de los mismos soportes durante su utilizacin industrial, si se podra desorber en condiciones moderadamente drsticas (inocuas para el soporte) una vez que alcanzado los niveles de actividad mnimos para su utilizacin industrial.
d.- Estudio del proceso de hidrlisis de lactosa por los diferentes derivados inmovilizados de la IMAC/p-ga!actosidasa de Thermus sp., T2.
Se estudia el proceso de hidrlisis de lactosa por diferentes derivados inmovilizados de esta p-galactosidasa termfila. Se estudiar la hidrlisis de disoluciones modelo de lactosa y de diferentes derivados lcteos (leche, suero de queseras, etc.). En todos los casos se prestar especial atencin a la inhibicin de la hidrlisis enzimtica por los productos de la reaccin (galactosa y glucosa). Se evaluarn estos efectos inhibitorios en la enzima soluble y en los diferentes derivados inmovilizados de la enzima. Una inhibicin muy fuerte (similar a la que se produce con las p-galactosidasas comerciales existentes) limitara la aplicabilidad industrial de la enzima en estos procesos ya que hace muy difcil la eliminacin total de la lactosa.
e.- Escalado econmico comparativo de procesos industriales que operan con lactasas libres y procesos que operan con derivados inmovilizados de lactasas. Se estudia la viabilidad del cambio de procesos tradicionales que operan con lactasas libres por otros que lo "deben" hacer con derivados inmovilizados de la enzima de termfilo. Se analizan parmetros econmicos que puedan predecir la viabilidad o no de su aplicacin. Se hace un pequeo estudio de los costes de inversin que deben acompaar este cambio.
Capitulo 1 - Extraccin 9
CLONACIN, FERMENTACIN Y EXTRACIN DE LA PROTENA QUIMERA IMAC/p-GALACTOSIDASA DE Thermus sp. CEPA T2.
1.1. INTRODUCCIN En este captulo se describe el trabajo realizado dentro del marco de la presente tesis doctoral, consistente en el empleo de tcnicas de microbiologa molecular e ingeniera gentica para la produccin de la quimera proteica IMAC/p-galactosidasa en el microorganismo mesfilo Escherchia co//cepa MC 1116, a partir de la p-galactosidasa (EC 3.2.1.23) del microorganismo termfilo Thermus sp. 12.
El gen de la p-galactosidasa de Thermus sp. T2 liaba sido clonado y expresado con anterioridad en Escherchia coli por otros autores, con fines cientficos y no comerciales (Koyama y col., 1990). Este antecedente permita augurar el xito en la produccin de diclio enzima de un termfilo en un mesfilo, lo cual fue tenido muy en cuenta por nosotros para los trabajos posteriores realizados con l, incluidos en la presente memoria. Adems, este hectio permitira reducir costes de produccin de la enzima, caso de que la experimentacin se desarrollase con xito ya que la incubacin de Escherchia coli MC 1116 es ms sencilla por no tiacerse a 70C, que es la temperatura ptima de crecimiento de Thermus sp. 12, y por no requerirse medios de cultivo microbiolgicos especiales para dicha cepa. La cepa de la que provena dicfio gen, Thermus sp. 12, fue aislada con anterioridad por otros autores en aguas termales del Parque Nacional de Yellowstone, mostr una temperatura ptima de crecimiento de 70C, en agitacin y pH 7,7 y actividad p-galactosidsica, con un ptimo a 80G y pH 5 (Ulricii y col., 1972). La cepa, por sus caractersticas morfolgicas y de cultivo, fue en principio adscrita a la Thermus aquaticus, en principio nica especie reconocida de este gnero segn Brock (1984). Recientemente ha sido propuesta su adscripcin a la especie Thermus oshimai" (Ishiguro, M. y col. 2001), en base al estudio comparativo de la
secuencia del ARN 16S. La cepa Thermus sp., 12 se encuentra depositada en la Coleccin Americana de Cultivos Tipo (ATCC 27737).
El gen de la p-galactosidasa de Thermus sp. 12 (Koyama y col., 1990), fue empleado para desarrollar un procedimiento para producir la p-galactosidasa de Thermus sp. T2 en E. coi, y purificaria en un solo paso cromatogrfico (Vin y coi., 1998). As se pens resolver al mismo tiempo las dificultades tecnolgicas que, como hemos mencionado anteriormente, tienen las p-galactosidasas comerciales en el sentido de su falta de pureza.
Para llevar a cabo el desarrollo del sistema anterior se estudi la secuencia de nucletidos que codifica para la produccin de la p-galactosidasa de Thermus sp. 12. Se parti del plsmido pOS103. Como ya ha sido comentado, previamente se saba que el plsmido
pOS103 codificaba para la enzima p-galactosidasa de Thermus sp T2 (Koyama y col., 1990). La secuencia del fragmento de ADN de Thermus sp T2 contenido en el plsmido pOS103 inclua tres pautas abiertas de lectura (ORF) con un total de 3159 nucletidos (deposito en el GenBank con el nmero Z93773), y su ORF3, en comparacin con otras secuencias conocidas en los bancos de datos internacionales (Gen Bank/EMBL), codificaba para una protena de 645 aminocidos (77 KDa) que presentaba una homologa con las p-gaiactosidasas de, entre otros, Haloferax alicanteiy Bacillus stearofhermophilus, (Tabla 1.1), por lo que se concluy que dicho gen era el de la p-galactosidasa de Thermus sp. T2 (Vin y col., 1998).
Tras conocer que el inserto del plsmido pOS103 contena varias ORF, y en principio varios genes, se planteo la necesidad de crear nuevos plsmidos que tuviesen un inserto que contuviese solamente la secuencia de I p-galactosidasa de Thermus sp. T2, con el fin de producir dicha enzima pura, el gen bgaA, por lo que se realiz la construccin del plsmido pBGTI (Figura 1.1). Dicho plsmido, que provena de vector plN-lll-/pp'' 5-A3 (Inoue e Inoue, 1995), con el inserto del gen bgaA se introdujo mediante transformacin en el hospedador heterlogo Escherichia coli DH 5a (Sambrook y col., 1989)
Producto Gen gnico aa/Kda ofr3 bgaA 645/73.6 Polipptido similar (aa) P-galactosdasa(665) Bga 1 (672)
%
Organismos
Nmero de acceso
identidad similardad
41 32
65 58
Haloferax alicantei Bacillus stearotherrnophillus
U70664 P19668
Bga A (675) Bga B (690) ORF80(676) (3-galactosidasa sozyme 12 (637)
30 30 30 23
59 55 58 42
Bacillus circulans Bacillus circulans
L03424 L03425
Clostridium perfringens D49537 Artrobacter sp. strain 87 U17417
Tabla 1.1. Comparacin de los polipptidos putativos codificados en la 0RF3 del inserto del plsmido pOS103.
La actividad p-galactosidasa de E. coli DH5a (pBGT1) se midi a 30C y 70C. Un resultado positivo en el ultimo caso confirm que la p-galactosidasa segua siendo termoestable. La actividad medida en clulas permeabilizadas de E. coli DH5a (Sambrook y col. 1989) (pBGTI) a 70C durante diez minutos por el mtodo de Miller (1972) fue de 12000 unidades (Van y col 1998).
Con la construccin del plsmido pBGT1 y su expresin en el hospedador mesfilo heterlogo E. coli DH5a (Sambrook y col., 1989) se haban resuelto tan slo parcialmente los problemas tecnolgicos planteados anteriormente, ya que la cepa transformada produca otros enzimas propios. Se haca necesario purificar dicha enzima. En este sentido es conocido que una de las maneras ms eficaces para la purificacin de una protena es el empleo de las
tcnicas de afinidad (Sassenfeid, 1990). Para ello es necesario encontrar un soporte cromatogrfico que permita la unin y/o elucin de forma selectiva de la proteina de inters. Dicho soporte cromatogrfico ta de contener una molcula o ligando de reconocimiento para dicia protena, de tal manera que la interaccin entre el ligando y la protena sea lo
suficientemente especfica y fuerte como para permitir la citada elucin selectiva de la protena. Por otra parte, es conocido que las tcnicas de ingeniera gentica permiten la obtencin de protenas modificadas mejorando sus propiedades. As se han desarrollado diferentes sistemas para modificar la estructura de una protena de tal manera que la modificacin introducida permita la purificacin por afinidad de la protena modificada (Sil y Sadana, 1991; Narayanan y Crane, 1990; Scouten, 1991; Sassenfeid, 1990). En esencia estas modificaciones consisten en fusionar a la protena un polipptido que posea propiedades especficas de interaccin con un determinado soporte cromatogrfico y que por lo tanto confiera a la protena de fusin la capacidad para ser purificada por cromatografa de afinidad.
Aunque la obtencin de protenas de fusin para mejorar las propiedades de purificacin es en principio una tcnica sencilla y eficaz, su mayor inconveniente radica en el hecho de que la modificacin de una protena en su estructura primaria conlleva cambios que pueden tener un reflejo importante en sus estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria. Estos cambios de estructura pueden afectar a la protena hasta el punto de que pierda su funcionalidad total o parcialmente, convirtindola en una protena inservible para la funcin que se haba previsto. Por ello, la obtencin de una protena de fusin conlleva siempre una gran incertidumbre ya que el resultado final es en gran medida impredecible y sobre todo cuando se realiza el primer experimento de fusin, es decir, cuando no se conoce el resultado de fusiones anteriores. Es en esta incertidumbre que el resultado final en lo que radica la novedad del proceso de obtencin de una protena de fusin. Hoy en da no es posible predecir con certeza lo que va a suceder cuando se realiza un experimento de fusin de protenas.
Uno de stos mtodos utiliza el vector plasmdico pCUZI, que tiene el dominio ChBD ("choline-binding domain") de la autolisina de Streptococcus pneumoniae, lo que le posibilita unirse con alta afinidad a DEAE-celulosa o soportes equivalentes (Snchez-Puelles y col., 1992). Este mtodo, protegido bajo patente de Invencin espaola con el ttulo "Procedimiento para la inmovilizacin y/o purificacin en un solo paso de protenas de fusin de inters biotecnolgico" (Snchez-Puelles y col., 1991), y posteriormente publicado (Snchez-Puelles y col., 1992), haba dado buenos resultados con otras p-galactosidasas de mesfilos, sin que se hubiera probado para protenas de termfilos. La relacin con el laboratorio originario de dicha tecnologa, el de Microbiologa Molecular del Centro de Investigaciones Biolgicas del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas, y el reto cientfico que supona trabajar con l para hiperproducir la enzima abordara dicha tarea. p-galactosidasa de Thermus sp. T2 fue lo que determin que se
Tomada la decisin, el trabajo comenz utilizando el plsmido pBGT1 que inclua el gen bgaA, que codifica para la sntesis de la p-galactosidasa de Thermus sp. 12. Dicho gen se clon en el vector de expresin denominado pAV104, dando lugar al plsmido pAV104BGT. El vector pAV104 es un derivado del vector plN-lll-omp/A-3 (Ghrayeb e Inouye, 1984), igual a l salvo que es resistente a tetraciclina en lugar de serlo a ampicilina. A partir de este ltimo plsmido y del vector pCUZ1 (Snchez-Puelles y col., 1992), se elabor el plsmido pBGT2 (Figura 1.1), que se utiliz para transformar E. co//JM109 (Sambrook y col., 1989), hospedador mesfilo heterlogo elegido en este caso. Los transformantes de E. co//JM109 (Sambrook y col., 1989) con pBGT2 se seleccionaron por presentar reaccin positiva con X-Gal y ser resistentes a ampicilina. La actividad p-galactosidasa de E. co//JM109 (pBGT2), medida en clulas permeabilizadas a una temperatura de 70 C durante 10 minutos por el mtodo de Miller (1972), fue de 5.500 unidades (Vinycol., 1998).
El plsmido pBGT2 (Figura 1.1) presentaba la ventaja de codificar para una protena de fusin que se puede purificar en un slo paso cromatogrfico, como se ha sealado con anterioridad. El plsmido pBGT2, consistente en el vector pCUZI (Snchz-Puelles y col., 1992), con el gen de la p-galactosidasa de Thermus sp. T2, serva para hiperproducir una mutena de la enzima p-galactosidasa de Thermus sp. T2 purificable por cromatografa de afinidad en un solo paso. Las clulas de E.co//JM109 (pBGT2), se cultivaron y posteriormente se rompieron pasndolas por prensa de French. El extracto enzimtico se aplic a una columna cromatogrfica de DEAE-celulosa siguiendo las indicaciones descritas previamente (SnchzPuelles y col., 1992). La elucin de la protena de fusin se realiz aplicando cloruro de colina en la resina. El resultado final fue la obtencin de la protena quimrica ChBD/p-galactosidasa, que se recupera de forma electroforticamente pura y muestra una movilidad en geles de poliacrilamida desnaturalizantes (SDS-PAGE) acorde con el peso molecular esperado (88000 Daltons), (Vin y col. 1998).
bgaA
Ipp tac
Figura 1.1.- Esquema del mtodo seguido para construir los plsmidos expresan, en un hospedador heterologo mesoflo (JM109), el gen estructural galactosidasa del microorganismo termoflo Thermus sp., cepa T2.
pBGT1 y pBGT2, que se que codifica para la fi-
As mismo se realiz el ensayo de actividad p-galactosidasa de la protena quimrica CliBD/(3-galactosidasa obtenida en el paso anterior. La actividad enzimtica se midi utilizando o-nitrofenil-p-D-galactsido (ONPG) como sustrato a 70 C segn ei procedimiento descrito por IVliller (1972). La actividad hidroltica de la enzima sobre ONPG fue de 312.000 unidades, y sobre lactosa de 13300 unidades (una unidad es igual a un tiidrolizado/minuto por mg de enzima) (Vin y col., 1998). ^moi de sustrato
Las propiedades bioqumicas de la protena quimrica CliBD/p-galactosidasa de Thermus sp T2 fueron los siguientes (Vin y coi. 1998):
1. Sustratos: Hidroliz ONPG con una actividad especfica de 312.000 unidades a pH 7.0 y a 70C. Hidroliz lactosa con una actividad especfica de 13.300 unidades. 2. pH de la reaccin: El pH ptimo de la hidrlisis fue 5.0, CON oNPG como sustrato (4mg/ml). Se detect claramente actividad en un rango de pH de 4,5 a 7,5. 3. Temperatura ptima: 90 C a pH 7 4. Termoestabilidad: Se conserv el 50% de la actividad despus de 60 minutos a 80C y el 75% de actividad despus de 60 minutos a 70C (valores a pH 7).
5. Inhibicin por productos de reaccin: Se conserv hasta un 75 % de la actividad de la enzima en presencia de 100 mM de glucosa. La galactosa en una concentracin de 50 mM disminuy la actividad en un 80%.(Km entre 4 y 6mM). 6. Conservacin. La enzima se pudo conservar a 4C en el propio tampn en que se eluy de la columna empaquetada con DEAE-celulosa durante por lo menos tres meses sin prdida apreciable de actividad. Los resultados de todo este trabajo hasta aqu resumido, a modo de introduccin, previo al de la actual tesis doctoral, permitieron al Consejo Superior de Investigaciones Cientficas realizar la solicitud de patente de invencin titulada "Un procedimiento para producir pgalactosidasa de Thermus sp. T2 en clulas hospedantes, y purificarla en un slo paso cromatogrfico" (Vin y col., 1997). Con este trabajo se haban solucionado dos problemas que comentbamos al inicio de ste captulo: el de la termolabilidad de las p-galactosidasas comerciales, y el de las impurezas que presentan, producindose adems la p-galactosidasa de Thermus sp. 12, en un microorganismo mesfilo, con lo que dicho sistema comportara un ahorro energtico al abordar la produccin a nivel industrial.
A continuacin se nos plante el hecho de que, pensando en una futura aplicacin para la hidrlisis de lactosa en el mbito alimentario, ciertos aspectos de la protena quimrica ChBD/p-galactosidasa de Thermus sp. T2 deberan ser modificados. Se trataba concretamente de que la protena quimrica ChBD/p-galactosidasa de Thermus sp. T2 tena parte de la secuencia del dominio ChBD, proveniente de Streptococcus pneumoniae, que es un microorganismo patgeno. Adems, tratar de modificar cualquier sustrato alimentario con una protena soluble hara costoso el proceso, ya que la enzima sera difcilmente recuperable, con lo que el gasto en la misma sera demasiado elevado. Adems, aportara con su presencia cambios en la formulacin del alimento, que podran verse desaconsejados por la legislacin vigente. Todo ello nos llev a considerar la posibilidad de realizar otra construccin que permitiese evitar ambos problemas: debamos encontrar un nuevo sistema de fusin, y
adems tenamos que desarrollar un sistema que nos permitiese realizar la hidrlisis de la lactosa con la enzima de fusin inmovilizada, para evitar que la enzima se encontrase en el alimento despus de realizar su funcin. Una de estas posibilidades consista en fusionar a la protena en cuestin, en sustitucin del dominio ChBD, una secuencia de 6 histidinas que permiten la purificacin e inmovilizacin posterior por cromatografa de afinidad a iones metlicos ("Ion metal affinity chromatography", IMAC) (Arnols, 1991; Hochuli y col., 1988). Esto permitira adems la construccin de una protena ms parecida a la enzima nativa ya que el dominio ChBD es de mayor tamao (13 kDa) que el fragmento de polihistidina. Para ello se realiz la construccin del plsmido pBGT3, con vistas a producir la quimera IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., T2 en el hospedador heterlogo Escherchia coli, dado el xito habido en trabajos realizados con anterioridad.
Seguidamente se realizara la produccin y obtencin de extractos enriquecidos en pgalactosidasa de Thermus sp., T2, en forma de quimera iMAC/|3-galactosdasa, y se estudiara su actividad p-galactosidasa en distintas condiciones. Ese es el trabajo que recogemos a continuacin.
1.2- OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
El objetivo fundamental del presente captulo es la
caracterizacin de los genes,
plsmidos y vectores para llevar a cabo todas las tareas para desarrollar esta memoria. Para ello cubriremos los siguientes objetivos:
1.- Construccin del plsmido pBGT3, con vistas a producir la quimera proteica MAC/j3-galactosidasa de Thermus sp. T2 en el hospedador heterlogo Escherichia coH MC1116 2.- Fermentacin y obtencin de extractos enriquecidos en p-galactosidasa de Thermus sp. (Cepa T2), en forma de quimera proteica IMAC/p-galactosidasa 3.- Caracterizacin molecular de la quimera proteica IMAC/p-galactosidasa y
comparacin con la correspondiente protena nativa 4.- Caracterizacin cintica: Efecto del pH Efecto de la temperatura Estabilidad con la temperatura
1.3-MATERIALES Y MTODOS 1.3.1-MATERIALES 1.3.1.1.-CEPAS BACTERIANAS Las cepas bacterianas utilizadas para el desarrollo de la experimentacin incluida en este captulo pertenecieron todas a la especie Escherichia coli. Las cepas fueron E. coli DH5a (Sambrook y col., 1989), con el plsmido pBGTI. Adems se utiliz E. coli MC 1116
(Casadaban y col., 1983). Esta cepa fue la que se emple para ser transformada con el plsmido pBGT3, que contendra la quimera proteica IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. (Armisn y
potencialmente purificable por cromatografa de afinidad a quelatos metlicos
col. 1999), que es el objeto principal de esta tesis. El aspecto ms importante de su genotipo es que porta una delecin completa del opern lee.
1.3.1.2 PLSMIDOS Los plsmidos que se utilizaron para la realizacin del trabajo de investigacin recogido en el presente captulo fueron construidos especficamente para este trabajo por el Dr. Alejandro Vin, en el Departamento de Microbiologa del Instituto de Fermentaciones
Captulo 1 - Extraccin 16
Industriales del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas en Madrid, y se especifican a continuacin: pBGTJ: Este plsmido inclua el gen bgaA, que codifica para la sntesis de la de Thermus sp. T2, proveniente del plsnnido pOS103 (J-galactosidasa
(Koyama y col., 1990). Se utiliz para
transformar Escherichia coli DH5a (Sambrook y col., 1989). El plsnriido consista en el clonaje de dicho gen en el vector pIN-lll-lpp'^ 5-A3 (inouye e Inouye, 1985). Se utiliz para transformar E col DH5-a. Los transformantes son resistentes a ampicilina, y sus colonias se ponen de color azul al incubarlas en un medio de cultivo con el sustrato X-Gal.
pTrcHisB: Este vector de expresin es un plsmido comercial (lnVitroGen,Leek, Holanda). Permite expresar protenas de fusin para su purificacin posterior en columnas con afinidad a quelatos metlicos (IMAC), que incluye seis restos de histidina en la protena quimera, permitiendo as su purificacin por cromatografa de afinidad a quelatos metlicos (Armisn y col., 1999). En este vector se clonar el gen bgaA de Thermus sp. 12. Se utilizar para la construccin del plsmido pBGTS, que incluir el gen bgaA, y servir para transformar clulas de la cepa E.coli MC1116, y los transformantes se seleccionarn gracias a su resistencia a ampicilina y a la coloracin azul que presentan las colonias al incubarlas con el sustrato X-Gal. Los dems reactivos fueron de grado analtico. Para la rotura celular tras la fermentacin de los cultivos se emple una prensa a alta presin (French Press, 1100 psi)
1.3.2-MTODOS 1.3.2.1 CONDICIONES DE CRECIMIENTO Y CONSERVACIN DE LAS CEPAS. Para la expresin de los plsmidos mencionados en las cepas enumeradas se llev a cabo su crecimiento 37C durante el tiempo necesario en cada caso, en el medio de cultivo Luria-Bertani (LB), (Sambrook y col. 1989), lquido o slido mediante adicin de agar bacteriolgico (Difco) en una concentracin del 2%), suplementado con ampicilina (100 mg/L) para las cepas E. coli DH5-a (pBGTI), y con ampicilina (125 mg/L) para la cepa E. coli MC 1116(pBGT3). Al final, una vez obtenido los clones, se guardaron en giicerol (Schariau) al 10% en congelador a -80 O, listos para iniciar los ciclos de fermentacin a escala para producir la enzima de inters.
1.3.2.2 CLONAJE Y SECUENCIACIN
Los mtodos utilizados fueron segn protocolos convencionales (Sambrook y col., 1989). La secuenciacin del DNA se realiz con un kit de secuencia PRISM de la casa Applied Biosystems, y un secuenciador automtico modelo 377 de la misma marca, utilizando plsmidos de doble cadena como moldes, y oligonucletidos universales o especficos como cebadores. Las enzimas de restriccin empleadas para cortar el ADN por sitios especficos, y la
ligasa del fago T4 para unir fragmentos del mismo por sus extremos, se obtuvieron de Roche Molecular Diagnostics. Para la purificacin de fragmentos de ADN a partir de las electroforesis de ADN en geles de agarosa, se emple el kit basado en la P-agarasa de New England Biolabs. El X-Gal {5-Bromo-4-cloro-3-indol-(3-D-galactopiransido) y el IPTG (isopropii-(3-D-1tiogalactopiransido), necesarios para la seleccin de transformantes, casa Sigma. El oligonucletido sinttico OBGT-6 (5'-GACAGTAGCAGCGCACG-3') fue utilizado para comprobar el correcto clonaje del gen bgaA en el vector pTrcHisB. Se sintetiz por encargo, en el servicio de Qumica de Protenas del Centro de Investigaciones Biolgicas del CSIG, en Madrid. Su secuencia se sita a unas 250 pb del ATG, hacia la zona 3' del gen bgaA silvestre, extendindose desde las posiciones 1561 1545 de la secuencia publicada en la que se incluye el gen bgaA de Thermus sp.T2 (Vian y col., 1998). De este modo se pudo comprobar la secuencia de los primeros 200 nucletidos del gen y la presencia de la zona que codifica para los seis restos de histidina en fusin traduccional con el anterior. Para llevar a cabo la comprobacin se realiz la amplificacin de dicho oligonucletido (OBGT-6, 0.25 \iM) por PCR, para lo que se utilizaron 0.5 U de Taq DNA polimerasa (Perkin-Elmer), 10 ng del plsmido pBGT3, 0.25 aM de cada dideoxinuclesido trifosfato, y 2mM MgCla en el tampn recomendado por el fabricante. La amplificacin se llev a cabo con 30 ciclos de 0.5 minutos de desnaturalizacin a 95C, 0.5 min de hibridacin, y 2.5 min de extensin con la polimerasa a 72C, ms una extensin adicional de 72C durante 7 minutos con un termociclador Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer). La seleccin de transformantes se hizo en agar LB con ampicilina, X-Gal e IPTG, incubndose a 37 C. Se escogi una colonia azul. se adquirieron de la
1.3.3. ENSAYOS ENZIMTICOS
La actividad p-galactosidsica se midi con ensayos frente a
o-nitrofenil-y^D-
galactopiransido (ONPG, 4 mg/mL) a 70 C en tampn NOVO pH 6,5 con la siguiente composicin: (citrato sdico 2,7 mM; cido ctrico 7,91 mM; bifosfato potsico 2,99 mM; monofosfato potsico 10,84 mM; hidrxido potsico 19,43 mM; cloruro de magnesio 4,08 mM; cloruro calcico 5,1 mM; carbonato sdico 3,33 mM), usando el extracto crudo o clulas impermeabilizadas segn el mtodo de Miller (1972). La concentracin de protena fue
estimada mediante el mtodo Bradford (1976), usando suero de albmina bovina como patrn.
1.3.4 INFLUIENCIA DEL pH Y LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.
La influencia del pH sobre la actividad de la protena quimrica IMAC/ (3-galactosidasa fue determinada utilizando tampones tipo citrato y fosfato en un rango de 5 a 9. La influencia de la temperatura sobre la actividad de la protena se determin ensayando alcuotas de extracto en tampn NOVO a pH 6,5 a temperaturas comprendidas entre los 40 y 97C. La actividad residual se determin mediante la incubacin del extracto en
ausencia de sustrato a 70, 80, y 90 C para diferentes intervalos de tiempo. Los ensayos de actividad se realizaron a 70C durante 10 minutos.
1. 4 RESULTADOS Y DISCUSIN 1.4.1 CONSTRUCCIN DEL PLSMIDO pBGT3 PARA PRODUCIR LA QUIMERA
PROTECA IMAC/p-GALACTOSIDASA
Se construy el pismido pBGT3 empleando tcnicas de DNA recombinante habituales y que se pueden estudiar con detalle en el texto de Sambrook y col. (1989), partiendo del pismido pBGT1 y del vector de expresin pTrcHisB (Figura 1.2). Por imperativos de la construccin, los aminocidos 2 y 3 estn cambiados con respecto a la protena silvestre deducida por la secuencia de nucletidos.
ATG (His)j Xhol Hind III
laclan
PTi-cHisB 4,4 kb
i ^p , ;i
Xhol \ Hlnd III
Sal Hind I
Purificacin fragmento grande
Purificacin fragmento 2,3 Kb
Ligasa
I
Transformcin. E. C 0 / / M C I I I 6 ApRXgallPTG Xho l/Sal I destruidos
ATG (His) 5 [Xhol/SalI\
lac!''
Figura 1.2.- Esquema del mtodo seguido para construir el pismido pBGT3 que expresa, en un hospedador hetrlogo mesflo, el gen estructural que codifica para la ^galactosidasa del microorganismo termfilo Thermus sp. T2. Se indican los orgenes de replicacin (or), el gen de resistencia a ampicilina (Ap"), el gen represor lac (alelos laclo lac f). El mdulo que permite la purifcacin por afinidad se ha sealado como ATG (His)e. Para detalles, consultar texto.
En la figura 1.3, presentamos
la secuencia de nucletidos del gen hbrido
sobreexpresado en pBGTs y la secuencia de aminocidos de la quimera correspondiente. En ella, el mdulo aadido en la zona N-terminal de la p-galactosidasa, procedente del vector
pTrcHisB, tiene varios elementos adems de los seis restos de histidina, como un sitio de
reconocimiento para un anticuerpo especfico y un sitio de reconocimiento para el corte con enteroquinasa. La protena final resultante tiene una masa molecular relativa predicha, segn secuencia, de 73,220 kDa. Los plsmidos, (Figura 1.1) no estn dibujados a escala, pero se expresa su tamao en kb (kilobases). Para detalles, ver el texto del pie de la figura 1.2. Slo se indican los sitios de
restriccin y las estructuras ms importantes para poder comprender mejor la figura. Se indican los orgenes de replicacin {or), el gen de resistencia a ampicilina (Ap^), el gen represor del opern lac (alelos lad o lacf). Las flechas grandes indican los promotores: trc^ en pTrcHisB y los dos promotores en serie Ipp'' y lac'''' en pBGTI. El mdulo que permite la purificacin por IMAC se ha sealado como ATG (Hs)6.
ATGGGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAA M G G S H H H H H H G M A S M T G G N N
6O
ATGGGTCGGGATCTGTACGACGATGACGATAAGGATCCGAGCTCGACCGTTTGTTACTAC M G R D L Y D D D D K D P S S T V C Y Y
12 0
CCGGAGCATTGGCCTGAAGAACGTTGGGAAGAGGACTTTAAGGCCATGCGGGCTCTGGG P E H W P E E R W E E D F K A M R A L G
18 0
CTCCGCTATGTGCGCCTGGGGGAGTTTGCCTGGAGCGCCCTCGAGCCCACCCCAGGTGC L R Y V R L G E F A W S A L E P T P G A
24 0
CTCCGCTGGGGTTGGCTGGATCGGGTTCTGGATCTGGCGCAGAAGGAGGGCCTAGCCGT L R W G W L D R V L D L A Q K E G L A V
300
GTCCTCGGTACCCCCACCGCTACCCCCCCCAAGTGGTTGGTGGACCGGTACCCGGAGAT V L G T P T A T P P K W L V D R Y P E I
360
CTCCCTGTGGACCGGGAGGGGCGGAGGCGGAACTTTGGTGGGCGGCGGCACTACTGCTT L P V D R E G R R R N F G G R R H Y C F
42 0
TCCAGCCCCGCCTACCGGGAAGAGACTGCCCGCATCGTGGCCCTTCTAGCGGAGCGTTA S S P A Y R E E T A R I V A L L A E R Y GGCCGCCACCCCGCGGTGGTAGGGTTCCAGGTGGACAACGAGTTTGGCTGTCACGGCAC G R H P A V V G F Q V D N E F G C H G T
48 0
54 0
GTGCGCTGCTACTGTCCCAACTGTCGTGAGGCCTTCCGGGGCTGGTTGAGGGCTAAGTA V R C Y C P N C R E A F R G W L R A K Y
600
GGGACGATTGACGCGCTGAACGCCGCCTGGGGAACGGTCTTTTGGAGCCAAACGTACCG G T I D A L N A A W G T V F W S Q T Y R
660
GATTTCGGTGAGGTGGAGCTTCCTCACCTCACCGTGGCCGAGGCCAACCCCAGCCACCT D F G E V E L P H L T V A E A N P S H L
720
CTGGACTACTACCGTTTCGCATCAGACCAGGTGCGGGCCTACAATCGTTTCCAAGTGGA L D Y Y R F A S D Q V R A Y N R F Q V D
780
CTCCTTCGGGATAATGCTCCTGGCCGGTTCATTACCCATAACTTCATGGGGTTTTTCAC L L R D N A P G R F I T H N F M G F F T GATCTGGACCCCTTTGCCTTGGCCGAGGACCTGGATTTTGCCGCCTGGGACAGCTACCC D L D P F A L A E D L D F A A W D S Y P TTGGGCTTCACCGACCTGATGCCCCTTCCCCAGGAGGAGAAGGTTCAGTGGGCCCGCAC L G F T D L M P L P Q E E K V Q W A R T
84 0
900
960
GGCCACCCCGATGTGGCCGCCTTCCACCACGACCTTTACCGGGGGGTAGGGCGGGGGCG G H P D V A A F H H D L Y R G V G R G R
1020
TTTTGGGTCATGGAGCAGCAGCCGGGTCCCGTGAACTGGGCCCCCCACAATCCAAGCCC F W V M E Q Q P G P V N W A P H N P S P
10 80
GCGCCCGGGATGGTACGCCTTTGGACTTGGGAGGCCATAGCCCATGGGGCAGAGGTGGT A P G M V R L W T W E A I . A H G A E V V
1140
TCCTACTTCCGCTGGCGCCAAGCGCCCTTTGCCCAAGAGCAGATGCAAGCGGGGTTCAA S Y F R W R Q A P F A Q E Q M Q A G F N
1200
CGTCCAGATTTCCAGCCGGAAGTGGCCTTTTTTGAAGTGCAGCGCGTAGCAGAGGAGCT R P D F Q P E V A F F E V Q R V A E E L
126 0
TCCGCCCTCCCCCTTCCTCCCGCAGGGTGTGCCCCCGTGGCTTTGGTTTATGATTCCGA S A L P L P P A G C A P V A L V Y D S E
13 2 0
GCGGCTTGGGTGTTTGAGATCCAGCCCCAAGGGGCCGAGTGGAAATACCTGACCCTGGT A A W V F E I Q P Q G A E W K Y L . T L V
13 80
TTTTCCTTTTATAGCGTTTTCCGGCGCCTAGGGTTGGAAGTGGACATTTTTAAGCCCGG F S F Y S V F R R L G L E V D I F K P G
144 0
GCAGAATTGGGCGGGTATGGCCTGGTGGTGGTTCCCAGCCTGCCCATTGTGCGTAAGGA A E L G G Y G L V V V P S L P I V R K E
1500
GCCCTCGAGGCCCTTTCCCAGGCGGACGGCCTGGTAATTGTCGGACCCCGTTCGGGGAG A L E A L S Q A D G L V I V G P R S G S
1560
AAAACGGAGAAATTCCAGATCCCCCCCGAAATCCCTCCGGGCGCGCTCCAAGCCCTCCT K T E K F Q I P P E I P P G A L Q A L L
162 0
CCCCTTAAGGTAGTGCGGGTGGAGAGCCTGCCCCCGGGGCTTTTGGAGGAGGCCGAAGG P L K V V R V E S L P P G L L E E A E G
168 0
CCCTGGGGCCGCTTTGCCTTCGGGGTTTGGCGGGAGTGGGTGGAGACCGATCTTCCCCC P W G R F A F G V W R E W V E T D L P P
174 0
TTGCTCCGTTTTACGGATGGTGGGGGAATCCTTTTCCGCAGGGGTCGCTACCTGTACCT L L R F T D G G G I L F R R G R Y L Y L
1800
GCGGCTTGGCCCAGCCCAGAACTTCTCTTTGCCCTTTGCCAGTCCTTGGCCGAGGAGGC A A W P S P E L L F A L C Q S L A E E A
1860
GGCTTGCATCCCCGCTTCCTCCCTGAGGGCCTGCGTTTACGGAGACGGGGCCCGTTGGT G L H P R F L P E G L R L R R R G P L V
192 0
TTTGCCTTTAACTATGGCCCCGAGGTGGTGGAGGCACCTGCCCCTCCAGGGGTGCGGTT F A F N Y G P E V V E A P A P P G V R F
198 0
CTCTTGGGGGATAGGCGTATTCCCCCCCATGACCTTGCCGTGTGGGAGGAGACATG L L G D R R I P P H D L A V W E E T -
2037
Figura 1.3.-Secuenca nucleotdica del gen que codifica para la secuencia aminoacdica de la protena IMAC//3-galactosidasa (Se recoge en negrita la secuencia aminoacdica que proviene del vector pTrcHisB, correspondiente al mdulo IMAC propiamente dicho).
La masa molecular relativa de la quimera es de 73.000 Da. El mdulo aadido en la zona N-terminal de la p-galactosidasa, procedente del vector pTrcHisB, denominado IMAC, tiene varios elementos adems de los seis restos de histidina, como un sitio de reconocimiento para un anticuerpo especfico y un sitio de reconocimiento para el corte con enteroquinasa, y aporta la posibilidad de purificacin mediante IMAC. En la figura 1.4, se recoge el resultado del anlisis por electroforesis en geles de
poliacrilamida, de los extractos celulares de los clones utilizados, y de la p-galactosidasa recombinante purificada por cromatografa de afinidad a quelatos metlicos. Para este ltimo caso, se dan mas detalles en el capitulo 2 de esta tesis.
94000 67000Hiswm
-{3- gaiactosidasa de Thermus sp.T2
20100 14000
Figura 1.4.- Anlisis por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS/PACE), al 12 %, de los extractos celulares y la IMAC/fi-galactosidasa de Thermus spT2 producida en E. coli MC1116 (pBGT3). Calles: 1- Patrones de peso molecular. 2- Extracto transformado de la cepa E.coli MC1116 con el vector pTrcHisB 3- Extracto de la cepa E.coli MC1116 con el plsmido pBGT3 4- Sobrenadante del extracto MC1116 (pBGT3) purifcado por IMAC.
En la calle 2, se presenta el extracto celular de la cepa de E. Coli. MC1116 transformada con el vector comercial pTrcHisB, donde se observa que no aparece la banda caracterstica de la p-galactosidasa de Thermus sp, cepa T2, como era de esperar y en cambio, en la calle 3, se puede apreciar claramente la aparicin de la banda caracterstica de la
protena quimera y en la calle 4 se observa ntidamente la aparicin de una sola banda con el tamao molecular esperados, aproximadamente 70-73 kDa.
1.4.2. FERMENTACIN Y EXTRACCIN DE LA PROTENA DE NTERES.
Seguidamente se realiz la produccin y obtencin de extractos enriquecidos en pgalactosidasa de Thermus sp. (Cepa T2), en forma de quimera proteica IMAC/p-galactosidasa. Las clulas de E. coli MC1116 (pBGT3) se cultivaron en un medio previamente seleccionado que contena fuentes de carbono y nitrgeno y sales minerales, a una temperatura de 30 C, durante 18 horas. Las clulas se recogieron por centrifugacin y se rompieron mediante una prensa tipo French. El extracto tratado se centrifug, obtenindose un sobrenadante caro y enriquecido en actividad p-galactosidasa termoestable.
Por una cuestin de simplificacin, todos los pasos llevados a cabo en los procesos de fermentacin y extraccin de la protena, los hemos resumido en el diagrama 1.1. Como el vector que contiene el gen bgaA, posee un marcador de resistencia a ampicilina, adems de estabilizar la produccin, se evita la contaminacin del medio de cultivo con microorganismos indeseables y elimina tambin las cepas que por haber perdido el vector recombinante, por cualquier motivo, han dejado de producir la protena de inters.
cultivos stock -80C
Placa petri LB + ampicilina
Estufa 37C 24 horas
Matraz lOOml lOmlLB + ampicilina 0,157 ;ig/ml
37C 200rpm. 8-9 horas
Matraz 1L LB + ampicilina
37''C200rpm. 12 horas
Centrifugar GS3 15minutos 15-20"'C Hielo
I
^
Resuspender en T. Fosfato pH 7 50mM . Hielo
FRENCH PRESS: 1100psi T* ambiente
Hielo Sobrenadante: Hielo Ensayo actividad Bradford Electroforesis
Desechar sedimento
Centrifugar: SS34 15 minutos 15-20''C
Diagrama 1.1.- Representacin galactosidasa de Thermus sp., cepa T2.
general
del proceso
de fermentacin
y extraccin
de la
IfAACIfi-
1.4.3 PROPIEDADES BIOQUMICAS DE LA PROTENA QUIMERA GALACTOSIDASA
IMAC/p-
A.- Estudio de la Actividad p-qalactosidasa Se realiz el ensayo de actividad p-galactosidasa termoestable de la enzima
recombinante liVIAC/p-galactosidasa, obtenida en el paso anterior. Tal actividad se midi a 25 y 70 C durante 10 minutos utilizando 2-nitrofenii-p-D-galactopiransido (ONPG) como sustrato. En la tabla 1.2, se resumen los datos ms significativos obtenidos tras la fermentacin y extraccin de la P-galactosidasa de Thermus sp., T2.
EXTRACTO BgaA IMAC-BgaA
PROTEINA (mg /mL) 14,5 17
ACTIVIDAD (U/ml) 70 C 25 C 196400 464400 8,53 19,2
ACTIVIDAD ESPECIFICA 70 OQ 13545 27318 (U/mg) 25 C 0.58 1.13

IMAC/fi-
Tabla 1.2.- Actividad galactosidasa (IMAC-BgaA).
jB-galactosidasa de la protena nativa (BgaA) y la quimera proteica
Analizando los valores de actividad en las condiciones de anlisis, observamos que la protena IMAC/p-gaiactosidasa registr una actividad ligeramente superior a la correspondiente protena nativa. Por ello pensamos que el dominio IMAC no altera dramticamente la estructura de la proteina. Un hecho similar, tambin con la p-galactosidasa de Thermus sp. 12, fue puesto en evidencia con anterioridad por otros autores al comprobar que la unin de la misma con el dominio de unin a colina (ChBD) de streptococcus pneumoniae no solo aumentaba la actividad especifica de la enzima nativa, si no que la situaba por encima de las de otros termofilos (Vian y col. 1998)
B.- Efecto del pH en la actividad enzimtica.
Se realiz un barrido de pH, para encontrar el ptimo de la reaccin de hidrlisis. Se ha estudiado desde pH 3 a 8 (Figura 1.5), encontrndose que, tanto por encima como por debajo del pH ptimo la actividad residual fue ligeramente superior en el caso de la IMAC/pgalactosidasa, amplindose la zona de pH ptimo ligeramente, tambin respecto a la quimera ChBD-BgaA (Vin y col. 1998). No obstante lo dicho, el ptimo de la protena nativa (Ulrich estudio. y col. 1972), result ser prcticamente el mismo al observado para la quimera en
100
^
T3 T3
75
50 25
> <
J
pH
Figura 1.5.- Efecto del pH en la actividad /3-galactosidasa de Thermus sp., cepa T2 de la protena nativa (BgaA) ( ) y de la correspondiente protena quimera IMAC/jS-galactosdasa. ( M) Las reacciones se han realizado en tampones acetato sdico (pH 3-5), y tampn fosfato sdico (pH 6 - 8).
C - Efecto de la temperatura en la actividad p-galactosidasa. Se analiz en un rango de temperaturas comprendidas entre 40C y 97 C en las condiciones de ensayo definidas con anterioridad. Se observ un incremento continuo de para la IMAC/p-galactosidasa, y despus un descenso
actividad hasta los 80C
particularmente brusco a partir de los 90C (Figura 1.6). Este comportamiento es similar al descrito para otras p-galactosidasas de trmofilos (Berger, J.L y col 1995). El ptimo fue inferior no solo a la enzima nativa estudiada en el mismo ensayo, sino tambin inferior al registrado para la quimera proteica ChBD/ p-galactosidasa estudiada con anterioridad por otros autores {Viny col. 1998).
40
50
60
70
80
90
100
Temperatura ("C)
Figura 1.6.- Efecto de la temperatura en la actividad j-galactosidasa de Thermus sp, cepa T2 nativa (4) y de la protena quimera IMAC/^galactosidasa ( M). Las reacciones tuvieron lugar en tampn Novo pH 6,5.
D.- Termoestabidad de la (3-gaactosidasa de Thermus sp., cepa T2 nativa (BgaA), y de la protena quimera IMAC/B-galactosidasa.
El estudio relacionado con la estabilidad de las protenas de Thermus sp., cepa T2, nativa (BgaA) e
p-galactosidasa
IMAC/p-galactosidasa se llev a
cabo estudiando en las condiciones estandarizadas, considerando el rango de temperaturas de 60 a 90 C, y desde 5 a 120 minutos. Los resultados se recogen en la Figura 1.7. Son varios los ensayos en los que se observ cierta activacin trmica de las enzimas, del mismo modo a lo referido por otros autores al estudiar otras quimeras proteicas de esta enzima (Vin y col. 1998). El caso ms espectacular fue el de la enzima IMAC/p-galactosidasa que, tras dos horas de mantenimiento a 60C, mantuvo su actividad por encima del 100%. Este efecto de activacin trmica tambin se observ en la p-galactosidasa termoestable de Solfulobus solfatarcus (Pisan, F.M., y coi. 1990). Han sido varias las propuestas tericas dadas para la explicacin de estos fenmenos (Coolbear y col. 1992), todas ellas relacionadas con propiedades intrnsecas de las enzimas termoresistentes. La protena quimrica IMAC/pgalactosidasa perdi el 100% de su actividad tras 30 minutos a 90C. (Figura 1.7).
nr<--^
20 40 60 80 100 120 o 20 Tiempo {minutos) 40 60 80 Tiempo (minutos) 100
"^
120
--60C -4~70C
-80c --acc
Figura 1.7.- Estabilidad de la ^galactosidasa de Thermus sp., cepa 72, frente a varias temperaturas. En el panel A se seala la protena nativa (BgaA) y en el panel B, se seala el mismo efecto en la proteina quimera IMAC/fi-galactosIdasa. Reacciones en tampn Novo pH 6,5.
Todos estos hechos sirven para poner en evidencia que la galactosidasa producida en Escherichia coli retuvo su capacidad cataltica y
psu
termoestabidad. Adems sirven para concluir que no la temperatura de crecimiento utilizada para la produccin, ni el dominio aadido, impiden que se realice la conformacin de la
enzima. Incluso se pudo observar cierta actividad por debajo de los 30C suficientes para explicar el fenotipo de las clulas recombinantes de E. coli en placas con X-gal en medio mnimo con lactosa como nica fuente de carbono. Esta actividad residual pudo facilitar, varios millones de aos atrs, la colonizacin de nichos ms fros por bacterias hipertermfilas (Moore, J.B.ycol.1994).
Las propiedades bioqumicas de la enzima quimrica no fueron esencialmente distintas de la salvaje producida en E. coli. Esta enzima adems de ser interesante para su aplicacin a la hidrlisis de sustratos lcteos, puede ser de inters tanto para disear integradores tiles en
procesos trmicos, sntesis de oligosacaridos y mareajes no radioactivos de cidos nucleicos (Viny col. 1998).
1.5. CONCLUSIONES
1.- Se ha desarrollado un procedimiento para la produccin de la p-galactosidasa de Thermus sp., cepa T2, en clulas iiospedantes, aislando el ADN que codifica para dicha protena y clonndolo a partir del plsmido recombinante pBGT3, que se construyo partiendo del plsmido pBGT1, construido con anterioridad (Vian y col. 1998), con el vector de expresin comercial pTrcHisB, para facilitar, posteriormente, la purificacin de la protena a travs de columnas inmovilizadas con quelatos metlicos.
2.- A travs de un anlisis electrofortico se ha podido demostrar, tras llevar a cabo todas las transformaciones necesarias, que la cepa de E.coli MC1116 fue transformada con xito con el plsmido pBGTS, resultado de la unin del vector pTrcHisB, portador de la secuencia que codifica para el dominio de las histidinas, con el inserto que contena el gen de la enzima nativa de Thermus sp., Cepa T2. Tambin se comprob mediante la secuenciacin de dicho plsmido
3.- Se han podido cultivar las clulas hospedantes transformadas en un medio de cultivo adecuado y en unas condiciones que nos han permitido producir la IMAC/pgalactosidasa y recuperar una enzima pura con unas caractersticas bioqumicas similares a las de la enzima nativa (en trminos de estabilidad, dependencia de la actividad con la Temperatura el pH, y las constantes cinticas kcat y KM), pero producindola en un microorganismo msofilo.
Capitulo 2 - Purificacin 27
PURIFICACIN DE LA IMAC/(3-GALACTOSIDASA DE Thermus sp. Cepa T2
2.- INTRODUCCIN La cromatografa de afinidad a quelatos metlicos desarrollada por Porath (Porath, J. 1975), se basa fundamentalmente en la interaccin entre determinados residuos en la superficie de las protenas, como, cistenas, histidinas, triptfanos etc., y cationes de metales de transicin que se encuentran formando quelatos con ligandos policarboxlicos (Yip, T.T. y col. 1994). El ion metlico acta como aceptor de electrones, pero el centro de la adsorcin no implica slo el metal sino que se forma un complejo en el que participa el complejo ligandometal. Antes de la interaccin el complejo se encuentra coordinado con molculas de agua, pero la interaccin de protenas tiene lugar fundamentalmente por la sustitucin de estas molculas de agua por residuos (no contiguos) de histidinas (Anspach, F.B 19994; Armisn 1999), que actan como donadores de electrones (compartidos por toda la estructura). (Figura 2.1).
HÔ 0 0 CH 2
(oj
^
/ H2O
^
OH,
co
HjO^^''^
Figura.- 2.1 Caractersticas estructurales de resinas IMAC. Las resinas del tipo EPI-IDA-Me , contienen como ligando el cido iminodiactico (IDA) que presenta tres sitios disponibles para quelar cationes metlicos divalentes.(ver en mtodos, activacin de soportes agarosa con epiclorhidrina (EPI)).
Cuando el ligando es el cido iminodiactico (IDA), el metal queda coordinado por 3 sitios, dejando los restantes sitios de coordinacin del metal disponibles para unir con el nitrgeno desprotonado del grupo imidazol de la His, formndose un complejo ternario entre el IDA, que mantiene unido el ion metlico y la protena. Las protenas adsorbidas pueden ser eludas usando un cido de Lewis (H"", Zn^"") que compite con el metal por la protena o bien con una base de Lewis (imidazol) que compite con la protena por el metal (Hochuli y col. 1988; Alonso, J. 2000). De esta manera, protenas que tengan en su superficie residuos de His con diferente densidad y distribucin interaccionarn con diferente intensidad con estos geles. As, tanto por adsorcin selectiva, como por desorcin controlada con concentraciones crecientes de un agente competitivo como por e.g., el imidazol o mediante un gradiente de pH, podran
separarse las protenas retenidas con diferente grado de afinidad en el soporte IMAC (Porath, J. Y col.; Luong, C. B. H., 1992; Andersson, L. y col. 1985; Armisn, P. 1997).
2.1. - NECESIDAD DE PURIFICAR La utilizacin de enzimas a nivel industrial se ve simplificada en gran medida si se pueden utilizar enzimas puras por varias razones: - Se evitan reacciones colaterales no deseadas. Por ejemplo, en el caso de p-
galactosidasas utilizadas para la hidrlisis de lactosa en leche, la presencia de proteasas podra provocar la hidrlisis no deseada de protenas lcteas, otras enzimas (e.g., oxidasas) podran afectar a las vitaminas de la leche, etc. - Se consigue inmovilizar una mayor cantidad de la enzima deseada por unidad de volumen de catalizador, con lo que podemos aumentar la velocidad de reaccin. - Se disminuyen los riesgos de liberacin de protenas (o subunidades de las mismas) que pueden ser perjudiciales para la salud del consumidor del producto final. Sin embargo, los protocolos convencionales de purificacin suelen conllevar muchas etapas y consumir mucho tiempo, adems de ofrecer rendimientos relativamente bajos, por lo que muy pocas enzimas puras tienen un coste final adecuado a su utilizacin industrial a pesar de las ventajas anteriormente descritas. En este contexto, las tcnicas de cromatografa de afinidad tienen un especial inters, ya que en principio podran permitir la purificacin en un solo paso de la enzima deseada. Estas tcnicas se basan en la adsorcin selectiva de la enzima deseada sobre soportes activados con compuestos para los que la protena diana tiene una elevada afinidad. Estos grupos pueden ser inhibidores competitivos, anlogos de sustrato, o cualquier efector o molcula de reconocimiento capaz de reconocer estructuras especficas de la enzima. Tambin entraran dentro de esta categora los soportes con anticuerpos anti-enzima. Adems, podemos incluir soportes que no se utilicen como herramientas en la cromatografa de afinidad pero resultan tener una muy alta especificidad hacia ciertas protenas debido a alguna caracterstica estructural de esta ltima. Este es el caso de los soportes hidrofbicos que resultan altamente especficos para lipasas. Esto se debe a que estas enzimas poseen una afinidad natural por superficies hidrofbicas dada la naturaleza hidrofobica que rodea su centro activo. Actualmente existen estrategias que facilitan la incorporacin en la estructura proteica de dominios de alta afinidad que permiten la purificacin de molculas, que de otra forma sera muy difcil aislar.
2.2. PROTENAS QUIMRICAS O DE FUSIN. Se denominan protenas quimricas a aquellas que se producen in vitro mediante la fusin de genes de dos especies distintas. Los grandes avances de la biologa molecular hacen que la construccin de estas enzimas quimricas sea algo relativamente sencillo, pudiendo realizarse como tcnicas de rutina en laboratorios bsicos de biologa molecular.
En los aos ochenta ha tenido lugar el desarrollo definitivo de la ingeniera de protenas pudindose preparar protenas de fusin por unin de genes de dos protenas, de una protena y un poli-pptido, etc (Ljungquist, C. 1989). En general, la metodologa de fusin de protenas para facilitar su purificacin o inmovilizacin se fundamenta en la afinidad especifica que muestran ciertos dominios proteicos o pptidos por un determinado ligando. La fusin de este tipo de dominios en uno de los extremos o en un regin interna de la protena diana le confiere la caracterstica de reconocer especficamente un determinado ligando y puede incluso combinarse con la fusin se secuencias de secrecin y/o de insercin en la pared o un tipo especfico de membrana celular (Uhin y col. 1990). La fusin de un determinado polipptido a la protena diana tambin ha servido para modificar alguna de sus propiedades (p.e distribucin de carga, solubilidad, coeficiente de distribucin, etc.), lo que tambin ha permitido mejorar el resultado de su purificacin. Tal es el caso de la urogastrona humana, un potente inhibidor de la secrecin gstrica y tambin promotor de la proliferacin de las clulas epiteliales, donde la fusin de una secuencia poli-Arg en su extremo carboxilo-terminal le confiri un extremo carcter bsico que permiti simplificar mucho su purificacin (Sassenfeld y col. 1984). Otro ejemplo reciente de este tipo de aplicacin ha sido la purificacin en un solo paso del pptido M5 perteneciente de la regin central del antgeno de la malaria Pfl55/RESA. Mediante la fusin a dicho pptido del dominio de afinidad ZZ, derivado de la protena A de Staphilococcus aureus se obtuvo una protena de fusin con un punto isoietrico relativamente bajo, lo que facilit la unin a una resina de intercambio aninico a un pH de 5,5 en el cual, la mayora de las protenas de E. coli no son retenidas (Hansson y col. 1994). La obtencin de una protena quimrica mediante la fusin de un dominio de afinidad debe ser evaluada de forma global, integrando eficientemente las diferentes etapas unitarias que constituyen dicho proceso para lograr la mxima reduccin de los costes de fermentacin y recuperacin de la protena. Los diferentes sistemas para la creacin de protenas de fusin se muestran en la Tabla 2.1,
Capitulo 2 - Purificacin
30
Tabla 2.1 SISTEMAS MAS COMUNES PARA PREPARAR PROTENAS DE FUSIN Tipo de interaccin Ligando
Interacciones protena-protena Protena A Protena G IgG Albmina
Interacciones enzima-sustrato P-galactosidasa Glutation S-transferasa Cloranfenicol acil transferasa Arginina C-terminal I nteracciones anticuerpo-antqeno RecA Pptido Flag P-galactosidasa Poliaminocidos Arg Asp His Phe Gis Trp Protenas de unin a carbohidratos Protena de unin a maltosa Dominio de unin a celulosa Dominio de unin a galactosa Otras interacciones Dominio de unin a colina Dominio de unin a biotina Represor Lac DEAE (*) Biotina Operador Lac Maltosa Celulosa Galactosa Intercambiador inico Intercambiador inico IMAC HIC Cromatografa covalente Sistema bifsico Anti-RecA Anti-pptido Flag Anti-p-galactosidasa APTO Glutation Cloranfenicol Anhidrotripsina
Referencias: Uhln y col.1994; Nygren y col.1994 , (*). Sanches Puelles y col.1992. Abreviaturas: APTG, p-aminofenil-p-D-tiogalactsido; HIC, cromatografa de
interacciones hidrofbicas; IgG, inmunoglobulina G; IMAC, cromatografa de afinidad a quelatos metlicos.
His - His - His - His - His - His His
Protenas fusionadas
NH
Me^
Protenas nativas
His'
Figura 2.2.-Afndad de protenas hacia quelatos
metlicos.
En este contexto, la fusin de protenas en el amino o carbonilo terminal con colas de 6 u 8 His, tiene un especial inters. Los cambios producidos por esta tcnica, tanto en la estructura como en las funciones proteicas, si es que los hiay, son mnimos Por ello en la actualidad, muchas enzimas de importancia industrial se producen de forma fusionada, consiguindose preparados purificabies fcilmente en un solo paso, por cromatografa de afinidad a quelatos metlicos (Paborsky y col. 1996). (Figura 2.2).
2.3 PROBLEMAS MS FRECUENTES EN LA CROMATOGRAFA IMAC.
PURIFICACIN DE PROTENAS POR
Dado que los soportes
IMAC se disearon inicialmente para la purificacin de
protenas naturales, la mayora de los soportes comerciales para la cromatografa IMAC, estn diseados para adsorber una gran variedad de protenas a travs de interacciones de varios residuos histidinas con varios residuos quelato del soporte. De hecho, la metodologa convencional para purificar protenas fusionadas con colas de poli-histidinas se basa en la adsorcin simultnea de la enzima diana junto con muchas protenas del extracto, desorbiendose posteriormente de forma selectiva ya que se asume que la protena fusionada ser la que muestre una adsorcin ms fuerte. Sin embargo si se consiguiera una adsorcin selectiva de la enzima quimrica, se lograran una serie de ventajas muy significativas pensando en el gran escalado: - Se reduciria el tamao de la columna que debemos utilizar, ya que toda la superficie del soporte estar ocupado tan solo por la enzima diana. - Se evitaran que protenas contaminantes que puedan dar lugar a uniones muy fuertes (a travs de varios grupos quelatos en el soporte) contaminen la preparacin final. - Se acelerara el proceso ya que se evitaran los pasos de desorcin. - Disminuiramos el tiempo de contacto entre la protena quimrica y posibles proteasas. Se puede considerar que la adsorcin de enzimas con colas de poli-histidinas sobre soportes de cromatografa IMAC se produce por interaccin entre un solo residuo del soporte
con varios residuos del pptido poli histidina, mientras que las protenas naturales se adsorben va interacciones de varias histidinas dispersas con varios grupos quelato del soporte (Anspach, F.B. y col. 1994; Armisn, P. y col. 1999; Hochuli, E. y col. 1987 y 1988). Teniendo en cuenta todas las ventajas previamente mencionadas se eligi la cromatografa por unin a quelatos metlicos como estrategia para la purificacin de la pgaiactosidasa de Thermus sp. 12. Para ello se activ agarosa (un soporte casi ideal para el diseo de soportes IMAC), introduciendo grupos epxido que luego reaccionarn con ligandos quelantes (e.g. IDA), y estos a vez, con metales de transicin para formar el soporte AgarosaIDA-Metal, (Esquema 2.1), (Sundberg, L. y col. 1974; Hemdan, E. S. y col.1985).
0
/ / / / /
Cl OH
CHj
CH
\CHj ^
/ / / /
'*~~"'*~'"~~~"""~~
Activacin Epclorhidrjna
/_
CHj
CH
CHj
Soporte activado con 12 j moles de epxidos /mi Gel
1
t 1 /'CH^ COOH
1 NH I \cHj
COOH
/ / / / /
/ / / / /
OH 1 0 C H j - CH CHj N ^CHj /-CH,
1
0 CH, OH j CH /-CHj CH, N ^CH, COOH COOH
Reacciones con metales
-coo^
Me
i [cusoj [Zncy [Nicy [Cocy
-coc^
Quelato Epi-IDA-12 Con gran afinidad a Hs, Cys, Try, etc.
Esquema2.1.- Activacin de soportes agarosa para cromatografa IMAC.
2.3.1. CROIVIATOGRAFA DE PROTENAS NATIVAS Y DE PROTENAS DE FUSIN MONOMRICAS Y MULTIMRICAS.
La interaccin de los quelatos metlicos puede tener diferentes requerimientos dependiendo del tipo de protenas a purificar. Las protenas nativas podrn adsorberse ms o menos dependiendo de la densidad de ligandos, de la longitud del brazo espaciador y del catin empleado para la preparacin del quelato. La variacin de estos parmetros podra permitir optimizar tanto la adsorcin como la desorcin selectiva de estas protenas, favoreciendo el diseo de diferentes protocolos de purificacin. En el caso de las protenas monomricas fusionadas con una nica cola de histidina aadida a unos de sus extremos (ya sea, el extremo N-terminai o el C-terminal) para su
purificacin, podra ser interesante reducir al mximo la adsorcin de protenas nativas, para lograr que el primer proceso de adsorcin sea ya lo ms selectivo posible. Si se tratan de protenas multimricas, la adsorcin en soportes IMAC podra
implicar varias subunidades con colas de poliHis lo que podra permitir la adsorcin a travs de varias de estas colas al soporte IMAC, provocando una fuerza de adsorcin de la enzima tan fuerte que dificulte su desorcin en condiciones suaves. /Adsorcin uni-puntual de protenas multimricas fusionadas con colas de pol-histidnas
^^^-irr-
''H.
Esto puede provocar desde inactivaciones de las enzimas debidas a distorsiones generadas por la adsorcin de varias subunidades, a la inactivacin de las mismas durante la desorcin debido a que se deberan de utilizar concentraciones mayores de imidazol, pH ms bajos, etc. Para evitar este tipo de problemas, las estrategias a seguir seran similares a las descritas en el apartado anterior: favorecer la adsorcin unipuntual con respecto a la adsorcin multipuntual. Para ello se utilizarn soportes con metales de moderada afinidad por His, con bajo grado de activacin y brazo espaciador corto. Todo esto permitira mejorar la selectividad y la adsorcin de las protenas de inters.
2.4. OBJETIVOS DEL PRESENTE CAPITULO.
En este capitulo nos proponemos la purificacin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., T2, mediante cromatografa de afinidad a quelatos metlicos. Para ello se tratar de disear y optimizar un soporte para IMAC que permita la adsorcin y desorcin selectiva de la protena de inters. Nuestros estudios, se centrarn en la utilizacin de soportes tipo agarosa, ya que se trata de un soporte inerte e hidrofiico.
As, El objetivo primordiai que nos proponemos en este capitulo, es conseguir la purificacin de la enzima mediante adsorciones lo ms selectivas posibles, evitando al mximo todo tipo de adsorciones inespecficas de otras protenas al soporte.
2.5. MATERIALES Y VIETODOS 2.5.1. MATERIALES
IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., cepa 12, fusionada en el dominio de polihistidinas. Agarosa 4 y 6 BCL proporcionados por Hispanagar. cido Iminodiactico (IDA), Epiclorhidrina, Periodato sdico de SIGMA. Dextranos proporcionados por Fluka. Los dems reactivos fueron de grado analtico. Ultracentrfuga Analtica Beckman ptima XL-A y Rotores AnSOTi y AnSOTi
2.5.2 MTODOS 2.5.2.1. Preparacin del extracto proteico.
El extracto crudo de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., 72, se diluy en un tampn recomendado por la casa Novo Nordisk que reproduce la composicin mineral de la leche. Su composicin y concentracin se detalla a continuacin: Citrato sdico 2,7 mM, cido ctrico 7,91 mM, Bifosfato potsico 2,99 mM, Monofosfato
potsico 10.84 mM, Hidrxido potsico 19,43 mM, Cloruro magnsico 4,08 mM, Cloruro calcico 5,1 mM, Carbonato sdico 3,33 mM y hidrxido de sodio hasta alcanzar un pH de 6,5.
2.5.2.2. Activacin de soportes agarosa con epiclorhidrina. Formacin de epoxi agarosa. Se realiz segn Armisn 1997. A 100 mi de una disolucin bsica de hidrxido de sodio 1 N termostatizada a 4C se le aaden 6mg/ml de NaBH4. Por otro lado, a 50 mi de agarosa (6BCL), previamente lavada con agua destilada se le adicionan 50 mi de agua destilada. Se prepara una disolucin enfrindola a 4C. Finalmente, se aade la disolucin de borohidruro de sodio, previamente preparado en compuesta por 28,5 mi de Epiclorhidrina y 57 mi de acetona,
simultaneo con la disolucin de hidrxido de sodio la agarosa agitando suavemente en campana. La mezcla epiclorhidrina-acetona se va aadiendo lentamente. La reaccin
transcurre durante 2 horas, tras las cuales se lava abundantemente el ge! con agua destilada. Para que se consiga el grado de activacin deseado, es necesario tener un control estricto de los tiempos y de la temperatura de reaccin.
2.5.2.3. Valoracin de los grupos epxido.
En primer lugar, se llev acabo una hidrlisis acida del soporte obtenido por activacin con epiclorliidrina. Se prepar una disolucin acida de cido sulfrico 0,5 N, para lo que se resuspende 1ml de agarosa activada 6BCL en 10 mi de dicha solucin y se mantiene la suspensin a 25 C con agitacin (agitador de hlices), durante una hora. Tras este tiempo se lava el soporte con abundante agua destilada. Este soporte activado e hidrolizado posee los grupos gliceril procedentes de la fase de activacin y los introducidos durante el proceso de entrecruzamiento. La hidrlisis de la agarosa provoca la apertura de los epxido introducidos en el proceso de activacin. La medida del consumo de periodato por el soporte de agarosa 6BCL activado-hidrolizado proporciona los jumles de grupos gliceril/ml de gel. Estos grupos gliceril proceden de: .- Grupos gliceril introducidos en la activacin de agarosa 6BCL con epiclorhidrina. .- Grupos gliceril generados por la apertura de epxido introducidos en la activacin. .- Grupos gliceril que posee la agarosa entrecruzada (6BCL), que se emplea en la activacin. La cuantificacin de los grupos epxido introducidos en la activacin, vendr dada por la diferencia entre los ^moles de agente oxidante consumidos por la agarosa 6BCL activadahidrolizada y los consumidos por la agarosa 6BCL activada, (Armisn, P. 1997).
2.5.2.4. Preparacin de los Soportes Quelato-Epxido
A los soportes agarosa-epxido activados con epiclorhidrina se les hizo reaccionar con una sal del cido iminodiactico (IDA, C4H5NNa04.H20) y finalmente al producto resultante reacciona con sales de algunos metales de transicin (Cobre sulfato, y cloruros de Cobalto, Nquel o Zinc) para la formacin del soporte agarosa-queiato metlico correspondiente. A continuacin se detallan los pasos seguidos para la preparacin de los distintos soportes.
A.- Soporte Iminodiactico (IDA) Epxido: Se prepar una disolucin 2M de IDA (49,5 mi de tampn bicarbonato sdico 0,1 M pH 11 ms 4,8 g de la sal sdica de IDA), para una activacin total del soporte con grupos IDA. La reaccin transcurri durante
aproximadamente 18 horas con agitacin a 25 C. Pasado el tiempo de reaccin se filtr y lav el soporte con abundante agua destilada. As, se obtuvo un soporte agarosa idneo para la preparacin de soportes IDA-quelatos-metal de transicin. De esta forma obtuvimos el soporte Agarosa Epi-12-IDA). Cuando se necesit una activacin parcial, se us tampn borato 0,1 M pH 8,5 y la reaccin trascurri durante 2 horas.
B.- Soportes IDA-Cu-epxido: A 2 g del soporte preparado en A, se le aadi una solucin compuesta por 8,7 g de CUSO4 y 200 mi de agua destilada. La suspensin se dej en
agitacin suave durante 2 horas a 25 C, transcurridas las cuales el soporte se lav con abundante agua destilada.
C - Soporte IDA-Co-epxido: A 2 g del preparado en A, se le aadi una solucin constituida por 70 mg de C0C2 y 14 mi de tampn fosfato sdico 50 mM, cloruro de sodio 1M, pH 6, dejndola en agitacin a 25 C durante 2 horas, tras las cuales se lavan los soportes con abundante agua destilada.
D.- Soporte IDA-Ni-epxido : A 2 g del soporte preparado en A, se le aadi una solucin constituida por 70 mg de NiCb en 14 mi de tampn fosfato sdico 50 mM, cloruro de sodio 1M, pH 6, dejndola en agitacin a 25 C durante 2 horas, tras las cuales se lavan, los soportes con abundante agua destilada.
E.- Soporte IDA-Zn-epxido: A 2 g de soporte preparados en A, se le aadi una solucin constituida por 70 mg de ZnCl2 en 14 mi de agua destilada, dejndola en agitacin durante 2 horas, tras las cuales la solucin se lav con abundante agua destilada. La cuantificacin de grupos IDA presentes en los soportes se llev a cabo segn los mtodos desarrollados por Armisn P. (1997) y Mateo C. (2001).
2.5.2.5 PURIFICACIN DE LA IMAC/p-GALACTOSIDASA DE Thermus sp., Cepa T2. 2.5.2.5.1 Por mtodos fsicos.
Siendo probable que la enzima de inters se encuentre presente en el medio de extraccin solamente en una proporcin mnima frente al total de protenas, es importante que en las primeras etapas de la purificacin enzimtica deban encaminarse a la eliminacin de gran parte de sus protenas contaminantes. Idealmente podra efectuarse sacando partido de alguna faceta particular de la estabilidad de la enzima bajo condiciones adversas. Para el caso de la p-galactosidasa de Thermus sp., cepa T2, puede ser muy efectivo el calentar la muestra en condiciones extremas de temperatura, ya que se trata de una protena proveniente de un microorganismo termfilo. Aprovechndonos de esta caracterstica, al extracto recin centrifugado y rico en (3-galactosidasa se ie aplic un choque trmico de 70C durante 30 minutos. Se centrifug durante 20 minutos a 13000 rpm (SS34), quedando el sobrenadante rico en p-galactosidasa, desechndose el sedimento.
2.5.2.5.2 Por cromatografa de afinidad a queiatos metlicos empleando soportes con baja densidad de grupos reactivos. 2.5.2.5.2.1. Adsorcin.
A 2 g de cada uno de los soportes IDA-quelato-metal, preparados en los apartados B, C, D y E del epgrafe anterior, se le aadi una solucin 4:2 (v/v), del extracto crudo de la
liVIAC/p-galactosidasa de Thermus sp., cepa T2 (concentracin total de protena 7,5 mg / mi), en tampn Novo pH 6,5. La reaccin transcurre a 25 C con agitacin constante. A intervalos cortos de tiempo, se tomaron pequeas alcuotas del sobrenadante. El curso de la adsorcin se control por medida de actividad p-galactosidasa en el sobrenadante. Se asumi el 100% de la adsorcin cuando no se detect actividad en el sobrenadante (medida en espectro a 405 nm).
2.5.2.5.2.2 Desorcin.
La desorcin de la enzima se logr por incubacin del soporte quelato con soluciones crecientes de imidazol (desde 10 mM hasta lOOmM), a intervalos de 10 minutos para cada concentracin e a temperatura ambiente. La desorcin se sigui por medida de actividad frente a ONPG y protena (Bradford, 1976), en el sobrenadante. La enzima as desorbida es dializada contra tampn fosfato sdico 50mM, pH 7, para eliminar el exceso de imidazol. Cuando se purifican protenas multimricas, como es el caso de la p-galactosidasa de Thermus sp., cepa T2, en quelatos con una densidad de grupos reactivos muy elevada, se pueden producir adsorciones mas o menos intensas entre las distintas subunidades del extracto y los mltiples grupos reactivos del soporte. Las principales consecuencias que se producen debido a ese fenmeno, son que, por un lado, la velocidad de adsorcin se ralentiza enormemente y por otro lado la imposibilidad de desorber la misma del soporte por las fuertes interacciones protena-soporte establecidas. Para subsanar estos inconvenientes, una nueva tcnica y una nueva generacin de soportes se ha diseado. (Mateo y col 2001).
2.5.2.5.2.3 Efecto de la desorcin del catin metlico del soporte en la actividad de la enzima purificada.
Una vez purificada la IMAC/|3-galactosidasa de Thermus sp., T2, se tomaron alcuotas de 1 mi en 5 viales eppendorff de 2 mi de capacidad. En cada uno le aadimos 20 ^1 de diluciones de soporte en el tapn Novo pH 6,5. De los diferentes quelatos metlicos preparados se dejaron agitndose aproximadamente durante 30 minutos a temperatura ambiente (cada uno de ellos), midindose espectrofotmetricamente a suspensin. 405 nm el sobrenadante y la
2.5.2.6
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN PROTEICA Y DE SU PESO
MOLECULAR.
La determinacin de la cantidad de protena se llev a cabo en primer lugar por el mtodo de Bradford (1976), y en segundo lugar por medida espectrofotmetrica de la absorbancia a 280 nm.
2.5.2.7 ENSAYOS EN LA ULTRACENTRIFUGA ANALTICA.
La ultracentrifugacin analtica es un poderoso mtodo para la determinacin del tamao y forma aproximada de protenas, as como para la caracterizacin tanto cualitativa como cuantitativa de las asociaciones de las mismas (Laue y col. 1992; Ralston, 1993). El flujo de sedimentacin de una protena sometida a un campo centrfugo viene dado por la ecuacin de Lamm:
J^sc'rw-D
^ 9w
(1)
dr
Siendo J, el flujo de sedimentacin en unidades de masa/ rea/ tiempo; co, es la velocidad angular aplicada; r, la posicin radial y w, la concentracin del soluto en peso. Los Coeficientes de sedimentacin (s) y de difusin (D) vienen dados por las expresiones (2 y 3).
-\
l-V/7
M s^
:. .
(2)
D=^
(3)
Siendo v, el volumen especfico parcial; p, la densidad del solvente; M, la masa molecular; T, la temperatura absoluta; R, la constante de los gases ideales; / , el coeficiente de friccin translacional y NA, el nmero de Avogadro.
2.5.2.7.1. Equilibrio de Sedimentacin.
Si centrifugamos una disolucin ideal con una velocidad angular oo, el soluto tiende a sedimentar a lo largo del tiempo. El proceso de difusin se opondr al proceso de sedimentacin y despus de un perodo de tiempo, ambos procesos se igualarn, alcanzndose el equilibrio. En estas condiciones, el flujo total ser nulo (J = 0; ecuacin 1), de forma que se obtendr un gradiente de concentracin que se caracteriza por ser independiente del tiempo. Este gradiente aumentar exponencialmente hacia el fondo de la celda, de acuerdo con la expresin siguiente:
dlnw _?^ d-r^ ~
-Mil-y-p) 2R-T
Donde M, es la masa molecular del soluto (g / mol); w, es la concentracin expresada en peso (mg / mi); oo, es la velocidad angular del rotor; v, es el volumen especfico parcial ( cm^ / g ); p, es la densidad del solvente y r, es la posicin radial.
i.- Procedimientos experimentales.
Los experimentos se realizaron en una ultracentrfuga analtica Beckman ptima XL-A equipada con un dispositivo de absorcin ptica UV visible, usando rotores AN50T y An60Ti. La velocidad usada fue de 8000 rpm y se tomaron medidas de absorcin radiales de 0.001 cm, 5 medidas promedio) a (a incrementos
longitud de onda de 235 y 266 nm
respectivamente. Se usaron piezas centrales estndar de Epon-charcoal de 6 canales (12 mm de paso ptico). El experimento de equilibrio de sedimentacin se realiz en columna corta (70 n\) de protena IMAC/p-galactosidasa, en un intervalo de diluciones desde 0,3 hasta 0,0375 a 20 C. Las muestras se diluyeron en tampn fosfato sdico 50mM y pH 7,0.
i.- Anlisis de datos experimentales.
A).- Determinacin de masas moleculares promedio
Las masas moleculares promedio de flotacin
(Mw,a). se determinaron a partir del
ajuste del gradiente de sedimentacin experimental, a la ecuacin que representa el gradiente de concentracin en el equilibrio de sedimentacin para un soluto ideal (Ec. 6), usando como programas de calculo XLAEQ y EQASSOC ( Minton, 1994.).
w(r) = w(rQ) exp
'Ka^\r'-r)
2RT
(5)
Donde la masa molecular de flotacin es equivalente a M w,a= M(1-v p); w, es la concentracin expresada en peso (mg/ml); v, es el volumen especfico parcial, p, es la densidad del solvente; ro, es la posicin radial de referencia y r, es la posicin radial. La masa molecular de la protena (M), se determina teniendo en cuenta el volumen especfico parcial de la protena que se calcula a partir de la secuencia de aminocidos (Laue ycol.1992).
B).- Diagnstico de asociacin
Si el gradiente de concentracin de la protena en el equilibrio se ajusta la ecuacin del equilibrio de sedimentacin para una especie ideal (EC. 5), con una distribucin de residuos
aleatoria (Figura 2.3 A), ello nos indica que la protena sedimenta como una especie molecular nica, cuya masa molecular es invariable con la concentracin de la protena.
0.02 0.00
CP
r>
^
I I I I
CDO
I l i l i
-0.02
7.00
7.04
7.08
7.12
7.16
Figura 2.3A.- Distribucin de residuos de un sistema de protenas en equilibrio de sedimentacin.
Por el contrario, si el gradiente de concentracin de la protena no obedece la mencionada ecuacin, y la distribucin es la indicada en la figura 2.3B, estamos en un caso de un sistema en agregacin; ello indica que la protena sedimenta como una mezcla de especies moleculares.
0.03
,-0
0.00
-0.03
1 1
l i l i
1 1 1 1
1 1 1
6.52
6.56
6.60
6.64
Figura 2.3B.- Distribucin de residuos de un sistema de protenas en fase de agregacin.
Si la mezcla est en equilibrio, la masa
molecular promedio aumenta con la ecuacin 6. (6)
concentracin de la protena y la masa se calcula empleando la

M,., =
w,.
Z^/
Donde Mes la masa molecular de cada especie y w, su concentracin. La dependencia de la masa molecular aparente (M,a) con la concentracin de proteina se calcul a partir de las pendientes de datos transformados (In w versus r^; ver ecuacin 4), empleando el programa MWPLOTZ (suministrado por el Dr. Alien Minton, National Institute of Health, Bethesda, MD).
2.5.2.7.2 Velocidad de Sedimentacin.
En un experimento de velocidad de sedimentacin, la solucin de protena es sometida a una velocidad angular suficientemente alta de forma que se produce una rpida
sedimentacin del soluto hacia el fondo de la celda generando una deplecin del soluto cerca del menisco y la formacin de un frente entre la regin depieccionada y la concentracin uniforme de soluto sedimentado. Esto permite determinar el coeficiente de sedimentacin, s, el cual es directamente proporcional a la masa de las partculas (Ecuacin 2) y viene dado por la ecuacin 7.
(7)
Y operando se llega a la ecuacin
In
\^m J
= s-w'-t
(8)
Donde x es la posicin del frente de sedimentacin respecto al eje de rotacin y rm, es la posicin del menisco.
i.- Procedimientos experimentales.
Los experimentos de velocidad de sedimentacin se realizaron en una ultracentrfuga analtica Beckman ptima XL-A equipada con un sistema ptico de medida UV-visible, usando rotores An60Ti y AnSOTi. Se us una velocidad de 30000 rpm, tomando medidas de absorcin a 292 nm. Se emplearon piezas centrales de doble sector y paso ptico de 12 mm. El experimento de velocidad se realiz en columna larga (400 \i\) de protena p-galactosidasa de Ttiermus sp., 12, en un intervalo de diluciones 0,3-0,0375 a 20C, diluidas en tampn fosfato 50mMypH7.
ii.- Anlisis de datos experimentales.
Los datos experimentales de velocidad de sedimentacin se analizaron con los programas XLAVEL ( Beckamn-Coulter ) y SVEDBER ( Philo, 1997). El primero calcula los coeficientes de sedimentacin aparentes a partir de la velocidad de movimiento del frente de soluto ( ecuaciones 7 y 8 ), el segundo mtodo emplea una aproximacin de la ecuacin de Lamm de transporte (ecuacin 1), para ajusfar globalmente los perfiles de sedimentacin a una o varias especies moleculares. Los valores de coeficientes de sedimentacin fueron corregidos a las condiciones estndar del agua a 20 C con el programa SEDNTERP, suministrado por el Dr. John Philo, Amgen USA; (Laue y col. 1992), obtenindose as el correspondiente Sao.w ( van Holde, 1985).
2.6. RESULTADOS Y DISCUSIN. 2.6.1 Purificacin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., cepa T2, por tratamiento trmico.
Los resultados obtenidos tras el calentamiento de los extractos de las protenas quimera y nativa de la p-galactosidasa de Thermus sp., T2, a 70 C durante 30 minutos se muestran en la tabla 2.1 donde se puede ver que son muy similares, ya sea con el extracto de la protena nativa como, con el extracto de la protena quimera. Los rendimientos alcanzados pueden considerarse buenos, ya que cerca del 80% de actividad de la enzima de inters se conserva, consiguindose unos factores de purificacin superiores a 2. Los anlisis por SDSPAGE de las diferentes preparaciones confirmaron, los excelentes resultados obtenidos (Figura 2.4).
Actividad Etapa (Prtena) BgaA sin calentar BgaA calentada IMAC-BgaA sin calentar IMAC-BgaA calentada 9,3 7,3 23,3 17,7 11,5 4,2 13 3,8 (U/ml) Prot. mg/ml Rendimiento U.recuperadas A.especfica Factor de purificacin (U/mg)
(%)
100 81 100 79
as
1,74 1,79 4,7
i
2,1 1 2,6
Tabla 2.1.- Purificacin de la IMAC/fi-galactosidasa de Thermus sp. T2, nativa (BgaA) y de la proteina quimera IMAC/j3-galactosidasa de Thermus sp., T2, (IMAC-BgaA) aplicando un choque trmico de 70C durante 30 minutos. Los datos de actividad corresponden a unidades de (fjmoles de enzima/min) frente a ONPG (13,3 mM) a pH 6,5 y 25 "C.
Sin embargo, el grado de pureza conseguido an poda ser mejorado de forma significativa. Para ello se abordaron otras alternativas de purificacin que consisten en la utilizacin de soportes inmovilizados con quelatos metlicos, aprovechando que la protena quimrica lleva una cola de poli His en su extremo N-terminal que facilita su purificacin por este mecanismo.
Captulo 2 - Purificacin 43
94000 67000
43000 30000 IMAC / P-galactosidasa d e Thermus sp. T2
rtm
1 2 3 4
Figura 2.4.- Anlisis por SDS/PAGE, al 12 % del proceso de purificacin de los extractos nativo y de la quimera de la IMAC/fi-galactosIdasa de Thermus sp., cepa T2 por tratamiento trmico como se describe en mtodos. Los nmeros a la izquierda representan los pesos moleculares en daltons. Calle 1: Patrn de PM, Calle 2: Extracto BgaA sin calentamiento, Calle 3: Sobrenadante BgaA calentado. Calle 4: Extracto IMAC-BgaA sin calentamiento. Calle 5: Sobrenadante IMAC-BgaA calentado.
2.6.1.2. Purificacin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. T2, por cromatografa de afinidad a quelatos metlicos en soportes poco cargados.
Se estudi la cintica de adsorcin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., 12, en los soportes quelatos con bajo grado de activacin (12 fimoies de grupos reactivos /mi de gel). Los resultados de este experimento se muestran en la tabla 2.2, donde observamos que la velocidad de adsorcin de la protena es muy alta siendo mucho mayor en el quelato de cobre con relacin a los quelatos de nquel y cobalto, donde se han alcanzado velocidades de adsorcin muy similares. Sin embargo, en el quelato de zinc fue donde se encontr la de
velocidad de adsorcin ms baja, adsorbindose el 86% de la protena tras 24 horas
reaccin. Como las mejores velocidades de adsorcin se han alcanzado con el quelato de cobre, seleccionamos este soporte para llevar a cabo los ensayos de purificacin.
A d s o r c i n de la protena al s o p o r t e (%) T i e m p o (min) Ag-IDA-Cu Ag-IDA-NI Ag-IDA-Co Ag-IDA-Zn
0 5 10 30 60 150 1440
0 85 100 -
0 65 88 100 -
0 73 92 100 -
0 10 24 25 34 37 86
Tabla 2.2.- Cintica de adsorcin de la IMAC/^galactosidasa de Thermus sp., cepa T2, sobre soportes quelato activados con cobre, nquel, cobalto y zinc con el mismo grado de activacin. Las condiciones de incubacin de la protena estn descritas en el apartado 2.5.2.5..2.1 de mtodos.
Durante el proceso de adsorcin, se adsorba el 100 % de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp,. T2, pero cerca de un 70 % de otras protenas del extracto tambin se adsorban inespecficamente al soporte.
2.6.1.3. Desorcin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., T2, adsorbida a soportes quelato. Purificacin en soportes inmovilizados con quelatos de cobre.
100 -1 O 100
/
SS
XI IQ
5? - 80 60 - 40
ni TI
f
80 60 -
^-^
' j
m o
ni
m. o
/
40 200 C^
r //
a n ^
/ /
I 1 1
ca
m 9)
- 20
>
20
40
60
80
'
n - u
100
5 <
[Imidazol(mM)]
Grfica 2.1.- Desorcin de la IMAC/fi-galactosidasa de Thermus sp., T2, adsorbida al soporte quelato de cobre. Las condiciones de la reaccin estn descritas en el apartado 2.5.2.5.2.2 de mtodos. ( 0) Protenas totales. ( 0) Actividad ^galactosidasa.
Se encontr que, usando concentraciones de imidazol hasta 50 mM, se desorba hasta un 80 % de protenas sin actividad (3-galactosidasa y cuando esa concentracin de imidazol se subi a 60 mlVI, se desorbi solo un 8% de la enzima IMAC/p-galactosidasa y casi el 100% de otras protenas.
2.6.1.4. Purificacin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., T2 en soportes inmovilizados con quelatos de cobre y adsorcin selectiva con 25 mM de imidazol.
Comprobamos que al usar 25 mM de imidazol durante la adsorcin, el 100 % de la IMAC/p-galactosidasa se uni al soporte mientras menos del 30 % del total de protenas lo hicieron. Tras la adsorcin se lav el soporte con 50 mM de imidazol, y se pudo observar que habamos eliminado todas las protenas contaminantes que se haban unido ai soporte.
Seguidamente, la enzima de inters se desorbi directamente con una solucin 100 mM de imidazol, con un rendimiento del 100 % comprobndose un marcado incremento de la actividad especifica (factor de purificacin entorno a 30). Estos datos se recogen en la tabla 2.3, y la figura 2.5 recoge los resultados de la purificacin con el mismo soporte analizados por SDSPAGE.
uapituio - \-'urmcacion
4a
Actividad Etapa IMAC-BgaA crudo Ag-IDA-Cu (U/ml) 17,4 15,84
Protena (mg/ml) 7,5 0,255
Rto. U.recuperadas (%) 100 91
Act.Espc. (U / mg) 2,32 62,1
Factor purificacin 1 26
Tabla 2.3.- Purificacin de la IIVIAC//3-galactosdasa de Ttiermus sp., T2 con el soporte quelato de cobre cuando se aplic una solucin de imidazol 25 mM durante la adsorcin. La reaccin transcurri a 25 C con agitacin en tampn Novo pH 6,5 como se describi en mtodos.
Con esto, el protocolo optimizado de purificacin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., T2, se puede resunnir de la siguiente manera: Adsorcin en presencia de 25 mM de imidazol, seguido de un lavado con una solucin 50 mM de imidazol y finalmente una desorcin con 100 mM de imidazol.
94000 - 67000 -
i-i} -
\m I te*-
. IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp.T2
30000 2010014000 *
'^wv^
1.-PPM 2.- extracto crudo 3.- extracto crudo + 25inM imidazol 4.- soporte con la proteina adsorbida 5.-3-galactosidasa purificada
< .,-
t t
Figura 2.5.- Anlisis por SDS-PAGE del proceso de purificacin de la IMAC/fi-galactosidasa de Thermus sp., T2, sobre soportes quelatos de cobre. Las muestras se aplicaron a un gel de poliacrilamida al 12 %, y tras su separacin, se tieron con azul de coomassie.
2.6.1.5. Estudio del efecto del tiempo de incubacin en la adsorcin IMAC/p-gaiactosidasa de Thermus sp., cepa T2.
de la protena
Estudiamos cual era el efecto, que podra tener el hecho de incubar la protena adsorbida sobre soportes IDA-Cobre durante un perodo de tiempo antes de su desorcin. Los resultados se resumen en la tabla 2.4, donde observamos que cuando los tiempos de desorber toda nuestra enzima en las
incubacin fueron de slo 30 minutos, no se pudo
condiciones estandarizadas (100 mM de imidazol). El problema se incrementaba al prolongar el tiempo de incubacin. An cuando estas concentraciones se doblaron, no se logr resorber toda la protena, lo que podra ser debido a posibles interacciones multisubunidades entre las colas de las distintas sub-unidades de la enzima con el soporte, (Armisn y col 1998). Para evitar este problema, el proceso de purificacin tendra que llevarse a cabo de manera muy rpida lo que a nivel industrial no sera lo ms factible.
U a p i I U l O . - KL
Tiempo de adsorcin 5 minutos 30 minutos " "
[Imidazol] para desorber 100 mM 100 mM 200 mM 250 mM
p-galactosidasa desorbida (%) 100 15 23,5 28,9
Jab]a 2.4.- Influencia del tiempo de adsorcin en la interaccin proteina-soporte, durante el proceso de purificacin de la IMAC//9-galactosidasa de Thermus sp., T2 con quelatos de cobre. Las condiciones de la reaccin estn descritas en el epgrafe 2.6.1.5 en resultados.
Por otro lado, cuando analizamos la actividad de la enzima purificada por esta tcnica y almacenada durante 24 horas a 4C, encontramos que habamos perdido cerca del 65% de actividad de la enzima (Tabla 2.5).
SISTEMA Tampn Fosfato Sdico Ag-IDA-Zn Ag-IDA-Ni Ag-IDA-Co Ag-IDA-Cu
ACTIVIDAD P-GALACTOSIDASA RESIDUAL (%) 100 ( 2) 100 (2) 100 (2) 100 (2) 25 (2)
Tabla 2.5.- Desorcin de trazas de cationes metlicos de los distintos soportes quelato, usados durante la purificacin de la IMAC/figalactosidasa de Thermus sp. T2 y su efecto en la actividad enzimtica. Las condiciones de la reaccin estn descritas en el apartado 2.5.2.5.2.3. en mtodos.
Para estudiar el motivo de la enorme perdida de actividad IMAC/p-galactosidasa en los extractos purificados con el quelato de cobre, se incubaron distintos soportes IDA-Me^"" con la enzima purificada, donde podra haber desorcin de los diferentes metales. Encontramos que la actividad de la enzima haba cado aproximadamente un 75 % usando el soporte IDA-Cu ^'', mientras que no se apreciaban cada de actividad con los otros 3 cationes (Tabla 2.5). Esto se debe a que la enzima es susceptible al cobre que se ha podido desprender del soporte, lo que concuerda con los datos de la literatura cientfica que explica el efecto inhibidor en la actividad de este metal con un nmero importante de enzimas. Por eso motivo, se decidi cambiar el soporte de cobre por soportes de cobalto y nquel, activados ambos con 12 amles / mi de gel, e intentar establecer un protocolo de purificacin an mejor, de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., 12.
2.6.1.6.
Purificacin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., T2, en soportes
inmovilizados con quelatos de cobalto y nquel.
La tabla
2.6
muestra
los
resultados
obtenidos
durante
la
purificacin
por
cromatografa de afinidad de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., cepa T2, cuando se usaron soportes activados con quelatos de cobalto y nquel.
Actividad Etapa IIVlAC-BgaA-crudo Ag-IDA-N Ag-IDA-Co
Protena
Rto. U.recuperadas
(%)
A.E (U/mg) 2,3 48,3 44,5
Factor purificacin 1 21,2 20
(U/mi)
17,1 15,8 16,2
(mg/ml)
7,5 0,33 0,36
100 92 93,2
Tabla 2.6.- Purificacin de la IMAC/^galactosidasa de Thermus sp. T2, en soportes de Nquel y Cobalto. Los datos de actividad corresponden a unidades (/anales de enzima/ mini) frente a ONPG (13,3 mM) en tampn Novo pH 6,5 y a 25 "C, como se ha descrito en mtodos.
Se comprob
que usando los dos quelatos se obtienen resultados muy parecidos,
consiguiendo rendimientos entorno al 90 % con un factor de purificacin del orden de 20 y actividad especfica entorno a 45. El protocolo optimizado de purificacin en soportes con 12
umoles / mi de gel con quelatos de cobalto y nquel, quedo establecido como: adsorcin en presencia de imidazol 25 mM y desorcin directa con 100 mM de imidazol (sin previo paso de lavado con 50mM de imidazol, al ser estos metales ms selectivos que el cobre). En la figura 6, se recoge la electroforesis en SDS-PAGE del proceso de purificacin de la IMAC/p-
galactosidasa de Thermus sp. 12, en soportes quelato activados con cobalto y nquel.
94000 67000 43000 30000 20100-
, ^ f S # -~(w
IMAC/p- galactosidasa de Thermus sp. T2
rrrt t t t t
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Figura 2.6.- Anlisis del proceso de purificacin, con quelatos de cobalto y nquel, de la IMAC//}galactosidasa de Thermus sp., T2 por SDS-PAGE. Las muestras se aplicaron en gel de policrilamda al 12% y tras su separacin se tieron con azul de Coomassie. En las diferentes calles se muestran los patrones de peso molecular 1; 2 extracto crudo; 3 gel adsorcin con Co; 4 gel desorcin con Co; 5 absorcin/desorcin con Zn; 6 gel absorcin con Ni; 7 gel desorcin con Ni; 8 protena pura con Co; 9 protena pura con Ni. Las condiciones de adsorcin fueron descritas como aparecen en mtodos.
2.6.1.7 Determinacin del coeficiente de extincin molar.
Para el
caso de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp, 12, en las condiciones
ptimas de anlisis, se han encontrado los siguientes coeficientes de extincin molar: s(M"^ Cm" ^);pH7y25C.
E''P''"":
gtirosina
5,690
. ^ ^gO
fenilalanina: r\ -jr\
0,70
Captulo 2 - Purificacin 48
Aplicando la ley de Lamber-Beer,
C=
V
Abs
y aplicando ios respectivos coeficientes, esta
s )
ecuacin se transforma como la ecuacin siguiente
A280 = C. [X ( s ^""'^ 5,690) + y { 8 "^'"^
1,290)+ z(e''"""'"'"^ 0,70)] (*)
En la tabla 2.7, resumimos la cantidad total de aminocidos que contribuyen en la absorcin de la protena en las condiciones de reaccin, deducidas de la respectiva secuencia de aminocidos (figura 1.3 del capitulol).
AMINOCIDO
CANTIDAD
PORCENTAJE
Pheniialanina Triptfano Tirosina
41 23 24
6,4 3,6 3,8
Tah\a 2.7.- Composicin cuantitativa de aminocidos que contribuyen espectrofotometrica de la IMAC/jS-galactosidasa de Ttiermus sp., cepa T2 a 280 nm.
en
la
adsorcin
Se determin el coeficiente de extincin molar de la protena, deducida de la secuencia de aminocidos a partir de un valor de absorbancia de 0,8 (Grfica 2.2) calculado a 280 nm.
4,5 4,0 3,53,0 w 2,5
n
"^ 2,0]
1 , 5 1,0] 0 , 5 0 , 0 150 200 250 300 350 400

X (nm)
Purificacin con IDA-Co Purificacin con IDA-Ni
Grfica 2.2.- Espectros de absorcin de la IMAC/jS-galactosidasa de Ttiermus sp., T2 purificada, sobre soportes quelato de cobalto y nquel, analizados a 280 nm.
Aplicando la ley de
Lamber-Beer calculamos inicialmente el nmero de moles
posteriormente calculamos la masa de nuestra protena. En este caso, la masa molar de la protena deducida de la secuencia de aminocidos fue de 77131,71 g / mol, y la masa de
protena (miligramos de protena), calculada en el extracto purificado fue de 0,284 mg / mi, valor muy parecido al encontrado cuando se aplic el mtodo de Bradford.
2.6.2. EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE LA PROTENA SOBRE SU ESTADO DE ASOCIACIN. 2.6.2.1. Equilibrio de sedimentacin.
Se estudi mediante equilibrio de sedimentacin el efecto que tiene la concentracin de la protena sobre su estado de asociacin. La muestra se diluy en tampn fosfato sdico 50 mM y pH 7 en un rango de concentraciones entre 0,3 mg a 0,04 mg analizndose
posteriormente a velocidades de rotacin a 8000 rpm. En la figura 2.7, se observa como la relacin Mw/Mi no vara al aumentar la concentracin (medida de absorbanciaa 280 nm) de protena (Programa MWAVCALC, Alien Minton, 2000).
^-^ c
>o 'o ra 'o o
(A 0) T3 O T5
' T
1
12 !
1 ^=1
ff j i;
! d-
5 -
*
^
i '
^-^ 5
& D)
re
^
1.2 j -ae
=
-0? -04 02 0.(1
s s
^ 1
-,1
log signal
Figura 2.7.- Perfil del equilibrio de sedimentacin de la IMAC/^galactosidasa de Thermus sp., T2, en tampn fosfato sdico 50 mM pH 7. Los experimentos se realizaron a 20C y a una velocidad de 8000 rpm como se ha descrito en el epgrafe 2.5.2.7.1,resumido en mtodos. MJM-,: Grado de asociacin. Logiosignal : absorbancia.
El gradiente de concentracin experimental se corresponde con el de
especies
moleculares de muestras polidispersas no en equilibrio. Al aumentar la concentracin la masa molecular promedio no vara, lo que demuestra que el parmetro concentracin no influye en el estado fsico de la protena. Cuando se realiz este mismo experimento con un extracto puro de la IMAC/(3-galactosidasa almacenada, se observaron los mismos efectos anteriores,
aunque mas del 50 % de la enzima precipit al serle aplicado una velocidad de rotacin inicial de 6000 rpm confirmando as el efecto que tiene el almacenaje en la agregacin de la enzima.
2.6.2.2. Velocidad de sedimentacin.
Se realizaron experimentos de velocidad de sedimentacin para intentar confirmar los problemas encontrados durante el equilibrio de sedimentacin. En la figura 2.8 se presenta el perfil de velocidades de sedimentacin obtenido en las condiciones de reaccin 0,3-0,0375 mg /mi de protena en tampn fosfato sdico 50 mM, pH 7. Los resultados obtenidos, confirmaron los datos encontrados en los experimentos de equilibrio de sedimentacin. Se observa tambin
que el comportamiento de la protena, se corresponde con la coexistencia de varias especies moleculares en disolucin.
Figura 2.8.- Velocidades de sedimentacin de la IMAC/J^galactosidasa de Thermus sp., T2. Datos experimentales adquiridos en funcin del tiempo a intervalos de tiempo de 10 minutos. Las condiciones de la reaccin estn descritas en mtodos epgrafe 2..5.2.7.1.
Durante la migracin de las especies se observ que io hacan como una mezcla de tres o ms especies de alta masa molecular.
2.7 CONCLUSIONES
1.- Debido a la termoestabilidad de la enzima, se ha podido establecer un mtodo de semi-purificacin sencillo aplicando al extracto un tratamiento trmico (30 minutos a 70C) con un rendimiento superior al 80% y un factor de purificacin de 2,1.
2.- El uso de soportes IMAC muy poco activados (12 [imoles por mililitro de soporte) con quelatos de cobre permiti purificar casi a homogeneidad la IMAC/p-galactosidasa factor de purificacin de 26. Esto se logr en un solo paso en batch, con rendimientos superiores al 90% cuando la purificacin se realizaba en tan solo 5 minutos. Sin embargo, si el proceso se alargaba en el tiempo (incluso solo a 30 minutos), la desorcin se hacia mas difcil (por unin multisubunidades de la enzima sobre varios grupos quelato) y la enzima se inactivaba por la accin del cobre bajando el rendimiento a menos del 30%). Los problemas se acentuaban a medida que se alargaba el proceso.
3.- Los problemas anteriores se solucionaron utilizando soportes IMAC activados con quelatos de Nquel o Cobalto, aunque la adsorcin de la enzima en estos soportes es mas lenta (aproximadamente por un factor de 3)
4.- La cromatografa IJVIAC, diseada de forma adecuada, nos permite purificar la enzima quimrica en un solo paso por adsorcin selectiva sobre soportes activados con 12 limles de grupos Ni o Co, a travs de una sola subunidad. La adsorcin se realiz
con 25 mlVI de imidazol y la desorcin con 100 mM de imidazol, consiguindose rendimientos de purificacin cercanos al 95% y factores de purificacin del orden de 20. 5.- Estudios en la ultra-centrfuga analtica indican que la enzima pura y concentrada tiende a formar oligmeros (de ms de 12 subunidades) que pueden dificultar su manipulacin posterior.
Captulo 3 - Inmovilizacin 52
INMOVILIZACIN Y ESTABILIZACIN DE LA IMAC/p-GALACTOSIDASA DE Thermus sp. CEPA T2
3. INTRODUCCIN
La inmovilizacin de enzimas
es una tcnica que se viene estudiando desde Inace
mucfio tiempo. Si nos remontamos al ao 1916, encontramos que, dos cientficos, Nelson y Griffin utilizaron preparaciones de invertasa inmovilizada por adsorcin a carbn activo. Pero la iiistoria ms reciente de la utilizacin de estas tcnicas se remonta all por los aos 50, cuando Grubhofer y Schleith inmovilizaron pepsina, carboxipeptidasa, ribonucleasa y diastasa en poliaminoestireno diazotizado. En 1956, Mitz emple la unin inica de catalasa a DEAECelulosa y ms tarde, en 1963, se intentan inmovilizar los primeros compuestos por atrapamiento, por Bernfeld y Wan que realizaron preparaciones de tripsina, papana, amilasa y ribonucleasa inmovilizadas en geles de poliacrilamida. En 1971, Gregoriadis inmoviliz
amiloglucosidasa sobre liposomas (Battaner 1998.). Varios cientficos, han estudiado muy a fondo todo tipo de interacciones que se establecen entre la enzima y el soporte, el tipo de grupos que se encuentran involucrados y las caractersticas ms importantes de las mismas (Guisan y col. 1993). Se han desarrollado muchas tcnicas covalente, adsorcin, unin inica, atrapamiento, 1980; Oysejeviycol. 1998). A pesar de esta larga evolucin, aun no hay metodologas generales que permitan inmovilizar en cualquier slido cualquier enzima de una forma rpida, sencilla y cualitativa. Las propiedades de una enzima inmovilizada varan con, respecto a su correspondiente soluble, fundamentalmente en parmetros como Km, Vm y Kcat, y la causa de estos cambios puede ser debida a factores como: 1.- Efectos de conformacin. La accin de las enzimas depende de la arquitectura molecular de las mismas, el hecho de la inmovilizacin, puede dar lugar a alteraciones de inmovilizacin como son la fijacin
encapsuiacin, etc (Bullock, 1989; Royer
conformacionales, que implican en la actividad enzimtica.
2.- Efectos esfricos. La unin de la enzima al soporte o el atrapamiento de la misma pueden dificultar el acceso del sustrato al centro activo, como consecuencia de la orientacin que adquiere la enzima despus de su inmovilizacin.
3.- Efectos de Micro-ambiente. La presencia del soporte puede alterar el microambiente del centro activo de la enzima con respecto a la enzima soluble, provocando el acercamiento al centro activo de grupos qumicos del soporte que pueden alterar su accin cataltica.
Capitulo 3-Inmovilizacin
53
4.- Efectos de difusin.- El acceso a la enzima inmovilizada presenta dos barreras de difusin: una externa causada por la interfase entre el soporte y el fluido, y una barrera interna en el interior de la matriz a la que est unida la enzima, fenmenos muy comunes en las enzimas inmovilizadas por encapsulacin o atrapamiento.
3.1. NECESIDAD DE LA INMOVILIZACIN
Como ya hemos discutido anteriormente, las enzimas son biocatalizadores con excelentes propiedades para su utilizacin como catalizadores industriales, pero presentan algunos problemas. Uno de estos problemas es que son molculas solubles, con lo que, su separacin de los medios de reaccin y su posterior reutilizacin puede ser complicada. Por ello se hace conveniente la inmovilizacin de la enzima previa a su utilizacin. La inmovilizacin de las enzimas simplifica la recuperacin y reutilizacin del soporte, evitando la contaminacin de los productos por la enzima (muy importante sobre todo en tecnologa de alimentos), permite simplificar el diseo y control de los reactores, etc.
Hay miles de protocolos para la inmovilizacin de enzimas, cuya clasificacin y descripcin puede encontrarse en numerosas revisiones dirigidos a permitir la recuperacin y reutilizacin de los biocatalizadores (Mosbach y col. 1976; Jancsik y col. 1982; Guisan y col.1997; Alvaro y col.1991; Armisn y col.1997; Batista-Vieira y col.1988). En esta tesis, tratamos de convertir la necesidad de inmovilizar enzimas en una
herramienta que permita mejorar las propiedades de las enzimas. Si diseamos protocolos de inmovilizacin que permitan controlar la intensidad de la interaccin entre la enzima y el soporte, la orientacin de la enzima respecto a la superficie del soporte, etc, podremos conseguir mejorar las propiedades de las enzimas. Por ejemplo, la unin covalente multipuntual ha sido descrita como una estrategia general de estabilizacin de enzimas contra cualquier agente distorsionante (calor, disolventes orgnicos, urea, etc), (Fernndez-Lafuente y col. 1998 y 1999; Guisan, JM y col. 1993; Mateo y col. 2000 A; Royer, 1980; Klivanov, 1983). En el contexto de esta tesis, dos son las estrategias de inmovilizacin que vamos a discutir: la inmovilizacin covalente y la adsorcin fsica de enzimas sobre soportes preexistentes.
3.1.1. Inmovilizacin sobre soportes preexistentes
La inmovilizacin de enzimas y protenas sobre soportes preexistentes presenta ciertas ventajas. Al utilizar slidos preexistentes, las propiedades mecnicas finales del biocatalizador no tendrn ningn tipo de dependencia con el protocolo de inmovilizacin, siendo mucho mas sencillo el control y diseo del proceso de inmovilizacin. Estas propiedades mecnicas podrn seleccionarse en funcin del reactor que se pretenda utilizar segn el slido elegido (rgido, compresible, etc).
54
3.1.2. Inmovilizacin covalente
Existen numerosos ejemplos de protocolos para la inmovilizacin covalente de enzimas a escala de. laboratorio, aunque muchos de ellos requieren tiempos de mezcla desde la hidratacin del soporte hasta su mezcla con la enzima de unos pocos minutos antes de la inactivacin de los grupos reactivos del soporte, los soportes no son fciles de almacenar hasta su uso, etc. El problema es ms complejo si se pretende asociar la inmovilizacin con una cierta rigidificacin de la estructura de la enzima. Aunque la mera inmovilizacin de una enzima dentro de los poros de un slido la protege de fenmenos intermoleculares (autolisis, proteolisis, agregacin), la inmovilizacin covalente de una enzima no tiene porqu provocar una rigidificacin de la estructura tridimensional de la enzima.
Inactivacin de enzimas por interaccin con interfas
Las enzimas inmovilizadas no pueden interaccionar con interfases externas
De hecho, hay algunos casos en los que los derivados resultantes de la inmovilizacin son incluso menos estables que la enzima soluble. Sin embargo, si se consigue unir por varios puntos la enzima a un soporte a travs de brazos espaciadores cortos, garantizamos que estos grupos de la enzima no puedan variar su distancia relativa durante ningn cambio conformacional, estabilizando de forma global la estructura tridimensional de la enzima.
Capitulo 3 - Inmovilizacin 55
Interaccin multipuntual a travs de brazos espaciadores largos: Efecto en la movilidad estructural de la protena
w^^^&^^^^
SS^sElJ3ife'tSS.'S?Bis;a^
La distancia entre los residuos involucrados en la inmovilizacin no es fija. Movilidad enzimtica similar a la de la enzima soluble. LOS EFECTOS EN LA ESTABILIDAD ENZIMTICA PODRAN VERSE REDUCIDOS
Interaccin multipuntual a travs de brazos espaciadores cortos: Efecto en la movilidad estructural de la protena
Estos enlaces dolarn se rotos para permitir el movimiento de la protelna
las interacciones entre los 'residuos involucrados en la inmovilizacin se mantienen durante cualquier cambio conformacional, inducido por un agente desnaturalizante. LOS EFECTOS EN LA ESTABILIDAD ENZIMTICA DEBERN SER IVIUY SIGNIFICATIVOS
Sin embargo, el problema de la unin covalente multipuntual es muy complejo, ya que pretendemos hacer reaccionar dos estructuras rgidas y no complementarias, por lo que la eleccin del sistema de inmovilizacin y las condiciones de reaccin deben de ser aquellas que permitan minimizar los problemas; tiempos largos, pH donde los grupos reactivos sean reactivos, pocos impedimentos estricos, etc, ( Roberto-Fernnde-Lafuente y col. 1998; IVIateo C. 2001; Alvaro G. 1990; Blanco y col.1989B; Chivata y col1976). En este capitulo nos proponemos disear sistemas que renan los requisitos para la estabilizacin de enzimas por unin covalente multipuntual a nivel industrial (reacciones con periodos de tiempo largos, sin utilizar reactivos txicos o peligrosos, etc). En este contexto, los soportes activados con grupos epxido podran ser sistemas casi ideales.
3.1.3. Epxidos
Los grupos epxido tienen una serie de caractersticas que los convierten en grupos ideales para la inmovilizacin industrial de enzimas: l.-Los grupos epxido son muy estables deshidratados o en soluciones acuosas neutras. 2.- Pueden reaccionar con muchos grupos de las protenas: cistenas, tirosinas, usinas, etc 3.- Estos grupos pueden estar unidos a la superficie del soporte a travs de brazos espaciadores muy cortos (p.e., soportes activados con epiclorhidrina, resinas de glicidol metacrilato, etc). 4.- Se pueden conseguir grande densidad superficial de grupos reactivos. 5.-La reaccin entre los grupos reactivos de la protena y los grupos epxidos apenas tienen impedimentos estricos.
6.- La interaccin enzima-soporte puede detenerse fcilmente mediante el bloqueo de los grupos epxido con compuestos como mercaptoetanol, etanolamina, glicina, etc. De hecho, estos soportes son normalmente utilizados a escala industrial para la inmovilizacin de enzimas, aunque normalmente siguiendo protocolos standard.
El mecanismo de inmovilizacin de protenas sobre soportes epxido sigue un mecanismo en dos pasos. Los grupos epxido son demasiado poco reactivos para poder inmovilizar directamente enzimas solubles, por lo que, primero hay que forzar la adsorcin fsica de las protenas sobre el soporte. Todos los soportes-epxido comerciales recomendados para la inmovilizacin de enzimas son moderadamente hidrofbicos, realizando la
inmovilizacin a alta fuerza inica para as, forzar la adsorcin hidrofbica de las protenas. Despus, dada la proximidad de los grupos reactivos de la protena y del soporte (por aumento en gran medida, de la concentracin efectiva de estos grupos) se produce la reaccin covalente, Melander y col. 1983; Samalla y col. 1988; Wethaley y Schimid, 1993 y 1999; Mateo y col, 2000 A y 2000 B).
INMOVILIZACIN DE ENZIMAS EN SOPORTES EPXIDO
L
_A /
_A
HS i-
Inmovilizacin covalente muy lenta
pH 7.0 , 4 - 25 "C 1IVI Fosfato
Adsorcin fsica suave y una rpida interaccin covalente intramolecular
Adsorcin a travs de bolsillos hidrofbicos
En cualquier caso, hay datos en la literatura que demuestra la utilidad de estos sistemas tanto para la inmovilizacin como la estabilizacin por unin covalente multipuntual de este tipo de soportes, (Guisan 1988; Guisan y col.
ATAQUE COVALENTE MULTIPUNTUAL SOBRE SOPORTES EPXIDO
Et ataqua co*>lnt* muRI punta I Dificultado por la b>J rMCllvklad dalullilnsiyotros grupas raictvos
El itiqu* covaltnt* MuKlpunluil *> Ahora posibl* dabldo al aumento d* li r* actividad D* las llslrtaa y otroi gnipoa ra activos
Esquema 3.1.- Inmovilizacin de enzimas sobre soportes epxido.
1991; Alvaro y col. 1993; Guisan y col. 1997; Blanco y col. 1998; Femndez-Lafuente 1995), (Esquenna3.1).
3.1.4. EPXIDOS MULTIFUNCIONALES Hemos utilizado el mecanismo de inmovilizacin en dos etapas de las protenas sobre soportes epxido para disear nuevos soportes epxido heterofuncionales, donde se introducen nuevos grupos capaces de adsorber fsicamente protenas en condiciones menos drsticas (grupos amino o carboxilo, boronato, quelatos metlicos, etc), (Otero y col. 1991; Femndez-Lafuente y col 1995; Guisan y col. 1997), (Esquema 3.2).
ACTIVACIN DE SOPORTES EPXIDO: INMOVILIZACIN ORIENTADA
COO" CUSO4 /^
Esquema 3.2.- Inmovilizacin de enzimas en soportes epxido multifuncionales .
De esta forma, las enzimas se adsorbern a los soportes por diferentes razones ya sean, zona de mayor carga negativa o positiva, zona con mayor densidad o exposicin de las Histidinas etc, que podran permitir la orientacin de la enzima sobre el soporte, antes de su inmovilizacin covalente. De esta manera, podremos conseguir implicar reas de la protena mas o menos sensibles a la inactivacin consiguiendo derivados con diferentes propiedades. 3.1.5. INMOVILIZACIN REVERSIBLE La inmovilizacin covalente puede tener ciertas ventajas cuando se trata de mejorar las propiedades de las enzimas, pero tiene como principal inconveniente que, tras la inactivacin de las mismas hay que eliminar tanto la enzima como el soporte que puede constituir un contaminante medio- ambiental. La inmovilizacin reversible podra ser una alternativa para enzimas cuyas propiedades no se quiera o no se pueda mejorar por unin covalente, siempre que la unin fuera
Captulo 3 - Inmovilizacin 58
suficientemente fuerte como para evitar la liberacin de las enzimas al medio durante el curso de la reaccin. Es de esperar que cada da haya ms tcnicas que permitan conseguir enzimas con unas propiedades suficientemente buenas para su aplicacin directa, de forma que el desarrollo de estas tcnicas de unin reversible sera muy interesante. De hecho, la adsorcin inica de enzimas a soportes activados con grupos inicos ha sido uno de los primeros protocolos de inmovilizacin de enzimas aplicados a nivel industrial, (Royer 1980; Klivanov 1983; Rosevear 1984; Gupta 1991; Katchaiski-Katzir 1993). Sin
embargo, en la mayora de los casos los soportes estn diseados para su uso en cromatografa, de forma que la fuerza de unin no es muy fuerte y existen riesgos de desorcin de la enzima. Para evitar este problema, proponemos el uso de soportes recubiertos de polmeros poli-inicos, como por ejemplo polcatinicos (polietilenimina). Este tipo de soportes tendrn una concentracin muy superior de grupos ionizables, y ser flexible, de forma que el polmero se podr adaptar a la enzima en vez de forzar a la enzima a adaptarse al polmero, pudiendo originar una adsorcin muy fuerte pero no distorsionante de la enzima sobre el soporte, como se ilustra en el esquema 3.3 Inmovilizacin Fuerte y Reversible de Enzimas Sobre Soportes Activados con Polietilenimina
p La adsorcin es mucho mas fuerte que en los soportes catinicos convencionales I La adsorcin es menos distorsionante (la estructura del policatin es flexible
Esquema
3.3.-
Inmovilizacin
reversible
de
enzimas
sobre
soportes
activados
con
p o l i e t i l e n i m i n a (PE).
En un trabajo previo se ha descrito la optimizacin de este tipo de soportes y como la fuerza de unin de las protenas al mismo es muy superior a la que se consigue con soportes convencionales, (Cesar Mateo y col. 1999). Sin embargo, despus de la inactivacin de la enzima, es posible desorber al enzima y reutilizar el soporte utilizando condiciones mucho ms drsticas de las normalmente utilizadas en una reaccin (lavados con guanidina, o a pH muy cido, etc)
59
3. 2. ESTABILIZACIN DE LA ESTRUCTURA CUATERNARIA DE ENZIMAS MULTIMRICAS
Cada da se descubren una mayor cantidad de enzimas con muy buenas propiedades y formadas por una estructura multimrica. La inactivacin de este tipo de enzimas suele iniciarse por la disociacin de la estructura multimrica, ya que el monmero asociado presenta cierta estabilizacin por la suma de las interacciones multipuntuales que estabilizan la estructura multimrica, (Torchilin y col. 1983).
Por ello, para estabilizar este tipo de enzimas hay que elaborar estrategias que incidan en la unin de todas las subunidades de forma que la disociacin se haga imposible. Nuestro laboratorio ha elaborado una estrategia que se basa en la unin covalente multisubunidades seguida (si es necesario) de un entrecruzamiento con polmeros
polifuncionales. (Esquema 3.4)
NUEVAS ESTRATEGIAS PARA LA ESTABILIZACIN DE ENZIMAS MULTIMRICAS

INMOVILIZACIN COVALENTE MULTISUBUNIDAD
ENTRECRUZAMIENTO DE SUBUNIDADES POR MOLCULAS POLIFUNCIONALES
^"
?" G H O
HO CHO Polialdehldos
Esquema 3.4.- Estabilizacin de enzimas multimericas por entrecruzamiento multisubunidades.
3.2.1. UNIN COVALENTE MULTISUBUNIDADES Las caractersticas del sistema y la idea se asemejan a la unin covalente multipuntual de la enzima sobre el soporte, con ia nica diferencia de que en este caso la orientacin de la enzima sobre el soporte es crtica, si la enzima se inmoviliza por un vrtice opuesto al plano formado por las diferentes subunidades, solo una de las subunidades se podr unir. En cualquier caso, cualquiera que sea el sistema utilizado, habr casos en los que la unin simultnea de todas las subunidades al soporte pueda ser muy difcil por problemas geomtricos (por ejemplo, enzimas tetradricas donde una subunidad siempre estar orientada en un plano opuesto a| formado por las otras 3 subunidades), por lo que habr que buscar soluciones alternativas.
3.2.2.
ENTRECRUZAMIENTO
DE
LAS
DISTINTAS
SUBUNIDADES
DE
ENZIMAS
MULTIMERCAS INMOVILIZADAS POR UNIN COVALENTE MULTISUBUNIDADES.
En este caso el objetivo no es aumentar la rigidez, sino implicar en la modificacin qumica al menos a dos subunidades de la enzima, por lo que la utilizacin de polmeros polifuncionales de tamao mas o menos grande es sumamente ventajosa, (Esquema 3.4): - Su gran volumen impide una competencia entre modificacin qumica unipuntual y entrecruzam lento - Su tamao facilita que se impliquen varias subunidades. - Al presentar muchos grupos reactivos no es difcil que dos de ellos se encuentren a la distancia correcta para poder generar un entrecruzamiento - Se puede recubrir la superficie de la protena con un pequeo grado de modificacin qumica. De entre los polmeros disponibles, en esta tesis hemos utilizado el dextrano-aldehdo, al poder disponer de muy diferentes tamaos, capaces de reaccionar con grupos lisina muy frecuentes en la superficie de las protenas, muy hidroflicos pero sin carga, convirtindose en un poliol inerte tras reduccin con borohidruro, (IVIateo y col 2000 A; Mateo y col.
2000Fernndez-Lafuente 1999).
3.3. OBJETIVOS DEL PRESENTE CAPITULO.
El principal objetivo de este capitulo se cierne al desarrollo de nuevas herramientas dirigidas a encontrar mecanismos que permitan llevar a cabo procesos de inmovilizacin controlada de extractos de protenas en soportes pr-activados. Estas tcnicas deben conducirnos a encontrar mecanismos sencillos de activacin de soportes de uso prctico y sencillo a escala industrial.
61
Conseguir que ios protocolos usados para preparar estos soportes, sean universales, es decir, que no se cierren solamente, al uso de una determinada protena sino, que sirvan para usar en una amplia gama de protenas y enzimas. La obtencin de nuevos derivados, muy activos y muy estables, para su uso en procesos tecnolgicos complejos, capaces de soportar condiciones de reaccin drsticas. Desarrollo de mecanismos para estabilizar toda la estructura conformacional de las protenas, para su aplicacin en procesos industriales de la manera ms asptica posible. As, el desarrollo de todos estos procesos se centrarn en el aprovechamiento de las buenas cualidades de los soportes epxido, como su gran estabilidad, (la facilidad que tienen de permitir que algunos de estos grupos sean sustituidos por otros), con lo que se consigue inmovilizar la protena de inters por la orientacin que posibilite dar mayores rendimientos de inmovilizacin, actividad y estabilidad.
3.4. MATERIALES Y MTODOS 3.4.1 MATERIALES La mayor parte de los materiales aplicados para el desarrollo de este captulo, fueron descritos en el apartado de materiales del captulo anterior. Los soportes sepabeads, usados para la inmovilizacin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., T2, fueron amablemente donados por Resindion S.R.L. (Mitsubishi Chemical Co.)
3.4.2 MTODOS 3.4.2.1. PREPARACIN PARCIALMENTE: DE SOPORTES CON GRUPOS EPXIDO SUSTITUIDOS
Como se ha hecho referencia anteriormente, los soportes sepabeads se modificaron parcialmente con distintos grupos, para permitir establecer interacciones protena-soporte por diversos puntos de la protena (suponemos) y de esta manera, conseguir biocatalizadores inmovilizados muy activos y estabilizados multipuntualmente.
3.4.2.1.1.- Los soportes sepabeads IDA-epxido, sepabeads-IDA-Metal: Fueron desarrollados como se ha descrito en el epgrafe 2.5.2.4, apartados A, B y C del capitulo anterior ( Armisn y col.1999; Mateo, C. 2001).
3.4.2.1.2.- Soportes sepabeads-etilendiamina (EDA)- epxido: 3,5 g de resina, se le adicionan 20 mi de una solucin al 2% de EDA, pH 8,5. Se dejan reaccionando en agitacin a 25 C durante 1 hora, tras la cual, lavamos el preparado con abundante agua destilada.
3.4.2.1.3.- Soportes sepabeads-boronato epxido: a 3 g de resina le aadimos 10 mi de una solucin al 2% de cido aminofenilboronico pH 8 en tampn borato 100 mM. El cido debe ser disuelto en acetonitrilo al 20 %. La reaccin transcurre a 25 C, durante 7 horas con agitacin.
62
Tras este tiempo, se lava, primero con tampn borato 500mM y pH 7, para eliminar los restos del cido en el medio de reaccin y finalmente lavamos abundantemente con agua destilada. La cuantificacin de los grupos introducidos en la modificacin de los soportes epxido se llev a cabo segn Mateo 2000.
3.4.2.2. PREPARACIN DE DERIVADOS SOBRE SOPORTES EPXIDO.
A 7 g de soporte resuspendemos 40 mi de una dilucin compuesta por la protena de inters y tampn fosfato sdico 50 mM, pH 7, donde la concentracin mxima de protena no excedi los 5 mg /mi. Para inmovilizar hidrofbicamente, usamos 1 M de concentracin salina. La reaccin transcurre con agitacin suave a temperatura ambiente, a intervalos de tiempo establecidos se van tomando pequeas alcuotas del sobrenadante midindose actividad
enzimtica remanente. Una vez adsorbida aproximadamente el 100 % de la protena, los derivados se lavan y se incuban en 50 mi de tampn bicarbonato 100 mM, pH 10.05, para facilitar las interacciones covalentes multipuntuales, durante 24 horas, tras las cuales se lavan abundantemente con agua destilada. (Mozhave y col. 1990; Guisan 1988, Fernndez-Lafuente y col. 1995; Mateo 2001). Una vez transcurrido el tiempo de inmovilizacin e incubacin, los derivados fueron bloqueados con glicina evitando la interaccin inespecfica de grupos epxido no sustituidos covalentemente.
3.4.2.3.- INMOVILIZACIN COVALENTE MULTIPUNTUAL.
Para comprobar que las interacciones que se hallan podido establecer entre los distintos residuos de la protena y el soporte, eran de tipo covalente, se tomaron aproximadamente de cada derivado 2 mi de suspensin, incubndolos en las condiciones de cada reaccin, para probar la desorcin o no de la protena. As, standard se diluy unas 10 veces con agua destilada y del sobrenadante espectrofotmetricamente. El derivado sepabeads-boronato-epxido, se incub con manitol 0,5 M. El derivado con EDA se incub con 0,5 M de cloruro de sodio y finalmente el derivado con IDA se incub con 150 mM de imidazol. Las reacciones transcurren a temperatura ambiente durante 30 minutos aproximadamente, midindose la actividad p-galactosidasa espectrofotmetricamente a 405 nm, los respectivos sobrenadantes. el derivado sepabeads
directamente se analiz la actividad
3.4.2.4.- BLOQUEO CON GLICINA.
Una disolucin 3 M de glicina pH 8,5 se le aade al soporte en una proporcin glicina / derivado, (v/v) 4ml/ml se incuba a 25 C durante 24 horas con agitacin. Pasado este tiempo, se lava el derivado con abundante agua destilada y se guardan a 4C.
3.4.2.5.-
ESTABILIZACIN
DE
ENZIMAS
MULTIMRICAS
POR
INMOVILIZACIN
MULTISUBUNIDADES. ENTRECRUZAMIENTO CON DEXTRANO ALDEHIDO.
Se aadieron 5 m de dextrano-aldehdo, de distinto peso molecular, en tampn fosfato sdico 100 mlVl y pH 7 oxidados al 100 %, a 0,113 mi de cada derivado (Fernndez-Lafuente y col. 1999 A). Se deja esta suspensin en agitacin a 25 C, Incubando durante
aproximadamente 16 horas, transcurridas las cuales, se duplica el volumen de la disolucin con tampn bicarbonato sdico 100 mM y pH 10 y aadimos borohidruro de sodio, para una concentracin final de Img / mi en el reactor la mezcla se mantiene en agitacin durante 30 minutos a 25 C con el reactor destapado (para facilitar el desprendimiento de hidrgeno por la accin del borohidruro). Transcurrido este tiempo la mezcla se lava con tampn fosfato sdico 50 mM y pH 6,3.
3.4.2.6. ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD TRMICA DE LOS DERIVADOS
Para estudiar la estabilidad de los derivados obtenidos, se aadieron 10 U de enzima /mi de soporte, en 10 mi de tapn Novo pH 6,5 y se incubaron en un bao de agua a 70 C durante un tiempo. A intervalos de tiempo establecido, se tomaron alcuotas de suspensin y/o sobrenadante y se analizaron espectrofotmetricamente a 405 nm actividad enzimtica.
3.4.2.7. NUEVOS SOPORTES FLEXIBLES PARA INMOVILIZACIN REVERSIBLE DE PROTENAS. ADSORCIN Y DESORCIN DE LAS PROTENAS.
Se aadi 40 g de polletilenimina en 1 litro de tampn bicarbonato sdico 10 mM, ajustndose, posteriormente el pH a 11. Seguidamente al preparado anterior, se le aadi 40 g del soporte glioxil agarosa 4BCL. La reaccin transcurre a 25 O durante 3 horas en agitacin constante. Pasado este tiempo, la mezcla se reduce por adicin de borohidruro de sodio 1 mg /mi, dejndose nuevamente que la reaccin transcurra durante al menos 2 horas en agitacin. Posteriormente, el soporte se lava primero con tampn acetato sdico 100 mM y pH 4, seguido de otro lavado con tampn borato sdico 100 mM pH 9 y finalmente se lava con abundante agua destilada para eliminar restos de polietiienimina no unida al soporte. La adsorcin de la protena tanto en el soporte PE, (Peso molecular 25000) como en el soporte comercial DEAE-agarosa, se llevo a cabo en tampn Novo pH 6,5 a 25 C. Para prevenir problemas de difusin la carga mxima de protena ofrecida a los soportes en ambos casos fue de 3mg/ml .Durante la adsorcin se tomaron muestras de sobrenadante y suspensin y se analiz la actividad enzimtica espectrofotmetricamente a 405 nm. Posteriormente los derivados se lavaron abundantemente con agua destilada y guardado a 4G. Los experimentos para estudiar la desorcin de las protenas del soporte, los derivados enzimticos se suspendieron en un volumen equivalente al usado durante la adsorcin. Se
aadieron posteriormente concentraciones crecientes de cloruro de sodio y se incub durante 30 minutos, tras los cuales se analizo actividad enzimtica en el sobrenadante.
3.5. RESULTADOS Y DISCUSIN 3.5.1. Estudio de la estabilidad de la IMAC/p-gaiactosidasa de Thermus sp. T2 en las condiciones de inters para su inmovilizacin-estabilizacin.
Aunque el objetivo de esta tesis se centra al desarrollo de nuevas metodologas para la preparacin de biocatalizadores inmovilizados de la IMAC/p-galactosidasa Thermus sp, T2, es preciso conocer los mrgenes de condiciones que podemos utilizar (es decir, los mrgenes de estabilidad de la enzima) para realizar los diversos protocolos de inmovilizacin y
estabilizacin que pretendemos aplicar (Mateo 2001). En este caso, los pH de inters son 7 (donde tiene lugar la inmovilizacin de la enzima) y pHs alcalinos (p.e., 10), para conseguir una intensa interaccin multipuntual entre los grupos reactivos de la protena y los del soporte. La grfica 3.1 muestra que esta enzima es sumamente estable en todo el rango de condiciones estudiadas.
12 Tiempo (horas)
18
24
Grfica 3.1.- Influencia del pH en la estabilidad de la IMAC/fi-galactosidasa de Thermus sp. T2 (extracto crudo), en las condiciones estandarizadas de inmovilizacin. El extracto se incub en tampn fosfato pH 7 (^), y en tampn bicarbonato pH 10 (^. La reaccin se llev a cabo a 25 "C durante 24 horas, con medidas de actividad enzimtica frente a ONPG en las condiciones descritas en mtodos.
B
a
60
i o
6040 20O - - suspensin sobrenadante
io
-suspensin
-sobrenadante
12 Tiempo (horas^
18
12 Tiempo (tioras)
18
1 ^
= 40 20 O 12 Tiempo (horas) 18 12 Tiempo (horas) 18 H-suspensin ^ -sobrenadante - suspensin ^- sobrenadante
<
Figura 3.1.- Inmovilizacin del extracto crudo de la IMAC/jS-galactosidasa de Thermus sp, T2, sobre los diferentes soportes epxido. Soporte estndar (A), Soporte IDA-Co-epxido (B), Soporte boronato-epxido (C) y Soporte EDA-epxido (D). Las inmovilizaciones se realizaron a pH 7 y a temperatura ambiente como se describe en mtodos, epgrafe 3.4.2.2.
Todos los soportes permitan rendimientos de inmovilizacin casi cuantitativos exceptuando el caso del soporte Sepabeads-epxido-standard, donde se inmoviliz solamente entorno al 40 % del total de la protena ofrecida despus de 24 horas. (Figura 3.1A). El soporte que ms rpidamente inmovilizaba la enzima fue el IDA-Co-epxido Sepabeads, seguido por el boronato-epxido y el EDA-epxido. Sin embargo, es destacable que todos los derivados eran ms estables que la enzima soluble (recordemos que esta enzima soluble era mucho ms estable que las p-galactosidasas comerciales disponibles hasta el momento) (Ver capitulo 1) Por otro lado, la actividad de las molculas de enzima inmovilizadas se mantena casi intacta (actividad recuperada fue de mas del 95% de la actividad inmovilizada para todos los derivados).
3.5.2. ESTABILIZACIN DE LOS DERIVADOS POR INMOVILIZACIN COVALENTE WIULTIPUNTUAL.
Para estudiar las posibilidades de conseguir mejorar el grado de interaccin covalente multipuntual entre la enzima y el soporte, y de esta forma mejorar la estabilidad del biocatalizador, se incub el derivado IDA-Co-epxido a pH 10,05 (Mateo y col. 2000 C; Mateo C. 2001, Tesis Doctoral). Este tratamiento no tena efectos significativos sobre la actividad de la enzima. La grfica 3.2, muestra el efecto estabilizante de este tratamiento, que sugiere una cierta unin covalente multipuntual entre la enzima y el soporte. Dados estos resultados, este mismo tratamiento se aplic a todos los derivados preparados, observndose siempre un
moderado aumento en la actividad de los derivados.
estabilidad como vemos en la grfica 3.3, sin perdidas
en la
De entre todos los derivados preparados, el preparado sobre boronato-epxidosepabeads fue el ms estable, manteniendo casi el 100 % de actividad tras una incubacin durante 60 horas a 80 C, mientras que los menos estables fueron el EDA-epxido-sepabeads y el Sepabeads-epxido, siendo el IDA-Co-Sepabeads-epxido un caso intermedio.
100 ?,^m 80 ^
15 g 60 't
0)
ra
40 -
1 20 0 -1
' 1 ^' - = 1
()
20
40
60
Tiempo (horas) Grfica 3.2.- Inactivacin trmica de la IMAC/J-galactosidasa de Thermus sp. T2, inmovilizada covalentemente sobre el soporte sepabeads-IDA-Co-epxido. La protena fue inmovilizada como se ha descrito en el aparatado 3.4.2.2 como se detall en mtodos. Los experimentos de inactivacin se realizaron incubando el derivado en tampn Novo pH 6,5 y a 80 C. ( M) actividad residual del derivado sepabeads IDACo pH 7; (*) actividad residual del mismo derivado a pH10; (, ) actividad residual de la pro tena soluble. 100 s 80 a 10
""'v
'''
T3 60 -
>
140 20 -
1
0
'''^V^
20
40 Tiempo (horas)
60
Grfica 3.3.- Inactivacin trmica de los derivados de la IMAC/^galactosidasa de Thermus sp. T2 tras su incubacin a pH 10 y bloqueo con glicina como se ha descrito en mtodos en los epgrafes 3.4.2.2, 3.4.2.3 y 3.4.2.4. Los experimentos de inactivacin se realizaron incubando los derivados en tampn Novo pH 6,5 y a 80 C. (ff) actividad residual del derivado estndar; (M) actividad residual del derivado sepabeads-EDA-epxido; (*) actividad residual del derivado sepabeads-boronato-epxido; (s> ) actividad residual del derivado sepabeads-IDA-Co-epxido y (;J J extracto soluble de la IIVIAC/p-galactosidasa de Thermus sp., T2.
3.5.3
DISEO
DE
ESTRATEGIAS
PARA
LA
ESTABILIZACIN
DE
ENZIMAS
MULTIMERICAS. Una vez obtenidos y seleccionado aquellos derivados que presentan mejores
propiedades (ms estables y ms activos), fueron sometidos a un tratamiento de desorcin, liirvindolos durante 30 minutos en presencia de SDS y mercaptoetanol para determinar el grado de unin de todas las subunidades del extracto al soporte. Dado que, al soporte se
uniran covalentemente todas las protenas del extracto a travs de enlaces que eran capaces, a priori, de suportar este tratamiento ( Fernndez-Lafuente y col. 1999 A), toda protena detctabe en el sobrenadante podra corresponder a una subunidad del extracto no unida de forma covalente al soporte (caso tpico de protenas multimricas).
3.5.3.1. Estabilizacin de la IMAC/f3-galactosidasa de Thermus sp. T2, por inmovilizacin multisubunidades.
97000 -+ 66000 - ' '

45000 -* 30000 ~* 20100 - '-m ''""^
p-galactosidasa de Thermus sp. T2
14400 -*'
t
1
t
2
Figura 3.2.- Anlisis por SDS-PAGE al 12% de las subunidades de la IMAC/fi-galactosidasa de Thermus sp. T2, no unidas de forma covalente al soporte sepabeads-boronato-epxido tras su inmovilizacin segn se ha descrito en mtodos. Calles: 1.- PPM; 2.- Subunidades desorbidas del derivado sepabeads.boronato.epxido.
En primer lugar, se estudio si la inmovilizacin de la enzima sobre el soporte que haba dado los mejores valores de estabilidad (sepabeads-boronato-epxido), era suficiente para implicar todas las subunidades de la enzima en la unin covalente al soporte. Sin embargo, al hervir el derivado en presencia de SDS vimos que se liberan todava algunas sub-unidades (ver Figura 3.2, calle 2), mostrando que no todas las sub-unidades de la enzima estaban covalentemente unidas al soporte. Por lo tanto, hemos procedido al diseo de la segunda etapa de la estrategia de estabilizacin de enzimas multimricas desarrollado en nuestro laboratorio, que consiste en el uso de polialdehdos optimizados (en tamao y nmero de grupos), para estabilizar toda la estructura cuaternaria.
3.5.3.2.
Estabilizacin de la estructura cuaternaria de la IMAC/p-galactosidasa de
Thermus sp. T2 por entrecruzamiento con dextrano aldehido.
3.5.3.2.1.Diseo de inmovilizados por tratamientos con dextrano aldehido.
La incubacin del derivado sepabeads-boronato-epxido con dextrano aldehido de peso molecular 18,3 KD durante 6 horas, parece que estabiliza totalmente la estructura cuaternaria de la enzima, (Figura 3.3). Sin embargo, este tratamiento ha provocado una gran cada de la actividad (entorno al 80%), como se aprecia en la figura 3.4 A.
97000 66000 "-'- ^-^ 45000 vv^30000 20100 >14400 N '.
MAC/fi- galactosdasa de Thermus sp. T2
t t t
1 2 3
Figura 3.3.- Anlisis por SDS-PAGE en geles de acrilamida al 12% de la estabilizacin de las subunidades de la IMAC/^galactosidasa de Themus sp. T2, del derivado sepabeads-boronato-epxido, tras su incubacin con dextrano aldehido de peso molecular 18300 daltons. La reaccin ha transcurre como se dercribe en mtodos apartado 3.4.2.6. Calles: 1.- PPM ; 2.- Subunidades desorbidas del derivado sepabeads boronato ; 3.- Subunidades del derivado sepabeads boronato-epxido no desorbidas tras su estabilizacin con dextrano aldehido.
A
100 1 ? 80
B
t
-s-
\ \
----.-.-.J, ^
.,.,, ^,
<
IMAC/fiâlactosidasa de Thermus sp. T2
3 60 40o
ca
1 20-
2 Tiempo (horas)
;
1 2
Figura 3.4.- Incubacin del derivado sepabeads-boronato-epoxido con dextrano aldehidos.- A.- Efecto en la actividad del derivado. ('-) Derivado sepabeads.boronato-epxido sin entrecruzar con dextrano aldehido; (M) Derivado sepabeads-boronato-epxido entrecruzado con dextrano aldehido. B.- Anlisis en geles de poliacrilamida en SDS-PAGE al 12% de la estabilizacin de las subunidades de la IMACZ/^galactosidasa de Thermus sp. T2. La reaccin transcurri como se ha descrito en el apartado 3.4.2.6. de mtodos. Calles: 1.- PPM ;; 2.- Subunidades desorbidas del derivado sepabeads boronato ; 3.Subunidades del derivado sepabeads boronato-epxido no desorbidas tras su estabilizacin con dextrano aldehido.
Para solventar esta cada de la actividad de la enzima, probamos el uso de compuestos que podan proteger su centro activo como, el sustrato natural de la enzima y un inhibidor competitivo, durante la modificacin qumica con dextrano aldehidos. Los dos compuestos usados en este experimento, mostraron un efecto protector satisfactorio (Grfica 3.4), encontrando que, la mejor recuperacin de actividad se encontr cuando se us lactosa como se puede ver en la tabla 3.1.
100 ^^.
?::.
"3
80 -
V) 0)
60 40 -
nj a
20-
"v"^
1
'
&
<
0 -1
0
'
'
'
Tiempo (horas)
Grfica 3.4.-Curso de la estabilidad del derivado sepabeads-boronato.epxido, incubado con dextrano aldehido de peso molecular 18300 daltons con y sin proteccin de su centro activo. La reaccin se dio en tampn Novo pH 6,5. () Proteccin con 1 M de lactosa; () Proteccin con 1 M de galactosa; (^) Sin efecto protector.
Una vez estudiado el efecto protector de la lactosa, nos propusimos estudiar mejorar las condiciones de la reaccin. Variamos el tamao del dextrano, la temperatura de
incubacin y por ltimo, los tiempos de reaccin. Los resultados de estos experimentos se resumen en la tabla 3.1, donde se puede ver que, en las reacciones a 4 C se han obtenido ios mayores valores de recuperacin de actividad. Tambin se comprob que, cuando se usaron dextranos de mayor tamao, la recuperacin de la actividad fue superior en el derivado sealado con el numero 2, por lo que escogimos este para analizar su estabilidad.
DEXTRANO (peso molecular) 6KD (4) 6KD (5) 6KD (6) 71,4 KD(1) 71,4KD(2) 71,4KD(3)
Tiempo de lncubacin{horas) 3 6 6 3 6 6
Temperatura de incubacin (C) 25 25 4 25 4 25
Actividad residual (%) 37,4 29 75 46 90 88
Tabla 3.1.- Estudio del efecto de la temperatura, del tiempo y del tamao del dextrano aldehido , en la actividad del derivado sepabeads-boronato, protegido con lactosa 1M.
3.5.3.2.2.
Caracterizacin
del
derivado
sepabeads-boronato-epxido
tratado
con
dextrano aldehido y protegidos con lactosa.
Finalmente se analiz la estabilidad trmica del derivado inmovilizado, tras aplicar las distintas modificaciones con dextrano aldehido. En la grfica 3.5, se puede ver que el derivado sealado con el nmero 2 es con el que se obtiene mejor estabilidad.
100 ^
B
IMAC/fi-galactosidasa de Thermus sp. T2
S
o
o a
80 -
40
1 <
20-
10 Tiempo (horas)
15
20

1 2
3
Grfica 3.5.- Efecto de las modifciones con dextrano aldehido protegidos con lactosa 1 M en la actividad del derivado sepabeads-boronato-epxido. A.- Curso de la estabilidad trmica del derivado. B.- Anlisis en geles de poliacrilamida en SDS-PAGE al 12% de la estabilizacin de las subunidades de la IMAC/fi-galactosidasa de Thermus sp. T2. La reaccin transcurri como se ha descrito en el apartado 3.4.2.6. de mtodos. Calles: 1.- PPM ; ; 2.- Subunidades desorbidas del derivado sepabeads boronato ; 3.Subunidades del derivado sepabeads boronato-epxido no desorbidas tras su estabilizacin con dextrano aldehido.
As, el protocolo general de estabilizacin de la estructura cuaternaria de la IMAC/pgalactosidasa de Thermus sp., T2, qued establecido como: entrecruzamiento con dextrano aldehido de peso molecular 71,4 KD, reaccin a 4C con agitacin durante 6 horas y protegido con lactosa 1M. La figura 3.5, muestra como el derivado inmovilizado y entrecruzado en las condiciones ptimas tena totalmente estabilizada su estructura cuaternaria (Figura 3.5 B), con lo que su aplicabilidad en tecnologa de alimentos se vea favorecida al garantizar que no se podran contaminar los productos con restos de protena, no solo de la enzima en estudio, sino de los distintos contaminantes del extracto de E. coli. Por otro lado la estabilidad trmica de este derivado era muy superior a la de la enzima soluble, aunque no provocaba un efecto positivo sobre la estabilidad de la enzima inmovilizada, (Figura 3.5 A).
A
100 > 80 5? m " 60 w S 40 "rvS
B
. . . .
'''^:^;;
>i
""-
-ra-...^ ^ ,
^_^^
.4
IMAC/fi-galactosidasa de Thermus sp. T2
-o
120.
1
()
1 2 T i e m p o (horas) 3 4
Figura 3.5A.- Efecto de la proteccin con lactosa 1M, en la estabilidad trmica del derivado sepabeads-boronato-epxido incubados con dextrano aldeido, tras las condiciones ptimas de reaccin analizadas en la tabla 3.1. (<&) Derivado sepabeads-boronato-epxido sin entrecruzar con dextrano aldehido (^ Derivado sepabeads-boronato-epxido estabilizado tras incubacin con dextrano aldehido y protegido con 1 M de lactosa. B.- anlisis en SDS-PAGE idntica a la figura 3.5 B.
3.5.3.3 INMOVILIZACIN COVALENTE DE LA ENZIMA PURIFICADA.
La grfica 3.6 muestra que al inmovilizar la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp.,T2 inmediatamente despus de su purificacin (mg/ml soporte), se alcanzaron rendimientos de inmovilizacin similares a cuando se utilizaba protena impura (en torno al 90 %). Sin embargo, cuando se inmoviliz la enzima almacenada a 4C durante 24 horas tras su purificacin, los rendimientos de inmovilizacin caan significativamente.
100
80 60 40 20 O >,
-^.!S-?yrp'v ^
18 20 Tiempo (horas)
24
D Protena Pura y almacenada D Protena Recin Purificada
Grfica 3.6.-lnmovlzacn de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. T2, en soportes sepabeadsboronato-epxido tras su purifcacin por IMAC. Efecto del almacenaje de la protena en la inmovilizacin en soportes sepabeads-epxido.
Este fenmeno dificultaba alcanzar el objetivo inicial de preparar un biocatalizador estable y muy activo de la enzima en condiciones de inters industrial, ya que a gran escala, no sera viable realizar procesos de purificacin e inmovilizacin en muy cortos perodos de tiempo. Por lo tanto, nos vimos obligados a buscar nuevas rutas alternativas para subsanar este inconveniente.
3.5.3.4. PURIFICACIN, INMOVILIZACIN Y ESTABILIZACIN EN UN SOLO PASO EN SOPORTES SEPABEADS-IDA-Co-EPXIDO.
Para solucionar el problema de la imposibilidad de inmovilizar la enzima purificada, se procedi al diseo de nuevas estrategias que permitieran la inmovilizacin y purificacin de la enzima quimrica sobre el soporte IDA-metal-epxido. Basndonos en los resultados
obtenidos en el captulo 2 (purificacin), se opt por utilizar soportes epxido con 12 |jnoles de grupos IDA-Co/ml de soporte. Anteriormente se analizo que en reacciones de adsorcin con otros metales se encontraron inconvenientes como perdida de actividad y otros, como la adsorcin de forma inespecfica de todas las protenas del extracto. Para evitar los inconvenientes referidos, realizamos las adsorciones con cobalto y as evitar las interacciones inespecficas de todas las protenas con el soporte. Este hecho demostr que la adsorcin
con cobalto era ms selectiva, y que las interacciones nnas fuertes se ciaban "principalnnente" entre las colas de histidina y los grupos quelatos, imposibilitando as la adsorcin de otras protenas del extracto. La grfica 3.7, muestra la cantidad mxima de enzima {66 mg / mi) que se inmoviliza cuando usamos un soporte quelato de cobalto-epxido y cuando se us un soporte sepabeadsboronato-epxido (con enzima recin purificada es exactamente la misma). Sin embargo cuando se usa enzima purificada y almacenada, la capacidad de carga cae drsticamente en los dos casos (unos 11 mg/ml de soporte). Al utilizar preparaciones muy impuras de la enzima (extracto crudo) y el soporte sepabeads-IDA-Co-epxido, la capacidad de carga del mismo era muy similar a la obtenida utilizando preparaciones recin purificadas (mas de 60 mg/ml). Este estudio ha permitido establecer un protocolo de purificacin, inmovilizacin y estabilizacin de la enzima en un solo paso, con lo cual, todos los problemas relacionados con la agregacin de la enzima encontrados durante su manipulacin son superados.
_ 100 -|
f
1
S
(0
80 60-
// --'
? 40- !t:1 20O

Q. ni
*
1 1
0 -) C
40 80 Tiempo (horas)
120
Grfica 3.7.- Capacidad de carga de la IMAC//-galactosidasa de Thermus sp. T2 sobre soportes sepabeads IDA-Co-epxido muy poco cargado y sepabeads-boronato-epxido. La reaccin tuvo lugar durante 24 horas a temperatura ambiente y la cantidad mxima de proteina ofrecida en todos los casos fue de 72 mg. (^) Sepabeads-IDA-Co con extracto crudo, (ti Sepabeads-IDA-Co con enzima recin purificada, C-*j Sepabeads-IDA-Co con enzima pura y almacenada durante 24 horas, ( ff) Sepabeads- boronato con enzima recin purificada.
En la grfica 3.8, presentamos el resultado del anlisis de
la
estabilidad trmica
alcanzada por el derivado sepabedas-IDA-Co-epxido cuando los procesos de purificacin, inmovilizacin y estabilizacin tuvieron lugar simultneamente. Se pudo observar que se ha obtenido un catalizador muy activo y estable, con la mxima capacidad de carga de la enzima de inters, manteniendo ms del 80% de su actividad inicial tras 60 horas de incubacin a 80C. El uso de estos derivados podra permitir obtener catalizadores muy cargados con enzima de inters y muy estables industrialmente son excelentes, ya que va a permitir acondicionar reactores de muy pequeo tamao / volumen.
Grfica 3.8.- Estabilidad del derivado sepabeads-IDA-Co-epxido, tras purificacin, inmovilizacin y estabilizacin en un solo paso. Detalles ver apartado 3.5.3.4. El derivado se incub en lampn Novo pH 6,5 y la reaccin se dio a 80 "C. (M) Derivado sepabeads-IDA-Co-epxido, obtenido tras purificacin-inmovilizacin y estabilizacin en un solo paso. (&) IMAC/^galactosidasa de Thermus sp. T2 soluble.
3.5.4. INMOVILIZACIN NO-COVALENTE DE LA IMAC/p-GALACTOSIDASA DE Thermus sp. T2, EN SOPORTES REVERSIBLES.
En la grfica 3.9, se dan ios porcentajes de innnoviiizacin de la enzima de inters alcanzados cuando se utiliz agarosa recubierta con polietiienimina, donde observamos que la velocidad de inmovilizacin es sumamente rpida, (en 10 minutos se inmoviliz casi el 100 % de la protena), siendo un excelente derivado ya que industrialmente permite su reutilizacin in situ.
\ .-. 3? 80 - \ \ \ \
1*
^^
60 40-
!
c a > c
\ \ \ ^ ^-
1
a.
0 i 0
20-
&~~
1
4
1
--
1
4 Time (minl.)
10
Grfica 3.9.- Inmovilizacin de extracto crudos de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp,. T2, en soportes agarosa recubiertos con poliaminas (PE). Las condiciones de reaccin estn descritas en el epgrafe 3.4.2.6 de mtodos. ( M) Suspensin (^) Sobrenadante.
En la grfica 3.10, mostramos los resultados del estudio de la estabilidad trmica alcanzados con el derivado agarosa-PEI-IMAC/p-galactosidasa, incubndos en tampn Novo
pH. 6,5 en un bao de agua a 70 C. Se pudo observar que el derivado PE es mucho ms estable que la proteina soluble, en las condiciones en que se han analizado.
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Tiempo (horas)
Grfica 3.9.- Estabilidad de la IMAC/j^galactosidasa de Thermus sp. T2, inmovilizada en soportes recubiertos con PE. El derivado fue incubado en tampn Novo pH 6,5 y analizado a 70 "C como est descrito en mtodos. ( ) Derivado Agarosa-PEI; ( 3) IMAC/jS-galactosidasa de Thermus sp. T2 soluble.
Para estudiar la fuerza de unin entre la protena y el soporte agrosa-PEl, se imoviiiz la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. T2 en el soporte comercial DEAE-agarosa en las mismas condiciones que en el derivado PE (Grfica 3.9), y se compar esta propiedad (fuerza de unin), entre los dos derivados por la desorcin de la enzima cuando se aplic un gradiente de NaCI. La grfica 3.11, resume los resultados obtenidos con este experimento.
100 S 80 6040 -
<
%
m ffl a c
i
o
vt
200
o Q
()
50
100
--
150
200
250
'
"
300
350
'
400
[ClNa]mM
Grfica 3.11.- Desorcin de la IMAC//3-galactosidasa de Thermus sp.T2 En soportes catinicos. Los derivados fueron incubados en presencia de concentraciones crecientes de CINa. La reaccin se hizo a T' ambiente, tras la inmovilizacin del 100% de la protena en ambos soportes. ( 0) Porcentaje de protena desorbida del soporte DEAE agarosa. ( M) Porcentaje de protena desorbida del soporte PE agarosa.
Se comprob que en el derivado comercial DEAE-Agarosa, cerca del 70% de la enzima fue desorbida del mismo cuando se le aplic 400 mM de NaCI, en cuanto que, en el derivado PEI-Agarosa apenas se observ desorciones de la enzima. La grfica 3.11, recoge la estabilidad de los diferentes derivados inmovilizados de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., 12, preparados en este capitulo y el derivado
inmovilizado de p-gaiactosidasa comercial de la casa Recordat, que simplifican las respuestas de los problemas planteados durante su desarrollo.
100 - Co-
80 -
1
10
60 40-
""---fe...
^"-~i,.
S D re
1 2o
1
5
^'".
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Tiempo (horas)
<
0-
c)
Grfica 3.12.- Estudio comparativo entre los derivados Sepabeads Boronato e IDA-Co y los derivados Agarosa PE, Agarosa Recordatti y la IMAC/fi-galactosidasa soluble de Thermus sp. T2. La reaccin transcurri a YCC en tampn Novo pH 6,5. (^) Derivado-sepabeads-boronato (sif) Dervado-sepabeds-IDA-Co-epoxido (^ Derivado comercial agarosa-recordati ( ^) Derivado-Agarosa-PEI (s) IMAC/JS-galactosidasa soluble.
3.6. CONCLUSIONES 1.- Se han establecido diferentes protocolos para la inmovilizacin y estabilizacin por unin covalente multipuntual de la MAC/p-galactosidasa de Thermus sp. T2 sobre nuevos soportes epxido multifuncionales. Los mejores resultados se obtuvieron utilizando soportes boronatoepxido, siendo el rendimiento de inmovilizacin y la actividad intrnseca cercana al 100%, aumentando la estabilidad de la enzima cientos de veces.
2.- A pesar de los valores de estabilizacin conseguidos, no todas las subunidades de la enzima estaban unidas al soporte. Esto podra provocar perdida de actividad si se usa en continuo, contaminacin del producto, etc. Usando tcnicas originales de estabilizacin de enzimas muitimricas (unin covalente multisubunidades mas entrecruzamiento con dextranoaldehdo), hemos conseguido estabilizar la estructura cuaternaria de todas las protenas contenidas en la preparacin, incluida la IMAC/p-galactosidasa. En un principio, la modificacin causada por el dextrano provocaba la inactivacin casi total de la enzima. La optimizacin de las condiciones de reaccin y la adicin de galactosa al medio permiti mantener ms de un 80% de actividad tras la modificacin qumica.
3.- Debido a la tendencia a agregar de la enzima pura, no era posible preparar derivados con la mxima carga (es decir, conteniendo solo enzima pura) siguiendo una estrategia en dos pasos: purificar primero e inmovilizar despus. Por ello, se diseo un nuevo protocolo que permita la purificacin, inmovilizacin y estabilizacin en un solo paso de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. T2, utilizando soportes IDA-quelato-epxido. Se consegua de esta forma que mas del 95% de la enzima inmovilizada fuera la de inters, con una recuperacin de actividad cercana al 100% y una ganancia de estabilidad con respecto a la enzima soluble de cientos de veces (solo ligeramente inferior a la obtenida con soportes boronato epxido).
4.- Se prepar un derivado de la enzima por adsorcin inica muy fuerte y poco distorsionante de la enzima sobre soportes PE. Esta inmovilizacin reversible permita recuperar el soporte tras la inactivacin de la enzima y provocaba tambin una significativa estabilizacin de la enzima (posiblemente por estabilizar su estructura cuaternaria). Tambin se comprob, que la fuerza de unin del derivado PE era muy grande, superior a la obtenida usando soportes convencionales tipo el derivado comercial (DEAE-Agarosa).
5.- De esta forma, se han desarrollado estrategias de inmovilizacin de la enzima de inters que dan respuesta a diferentes situaciones tecnolgicas (que sern funcin de los requerimientos de cada empresa y proceso en concreto), pasando desde derivados con mxima estabilizacin funcional o estructural, hasta derivados con mxima actividad enzimtica, o derivados en los que el soporte puede recuperarse tras la inactivacin de
la enzima. Este margen de soluciones nos hace ser optimistas a la hora de pensar en la aplicabilidad de esta enzima a nivel industrial.
Captulo 4 - Reacciones de Inters 78
REACCIONES DE MAYOR INTERS INDUSTRIAL
4. INTRODUCCIN Gomo hemos descrito a lo largo de esta tesis, las p-galactosidasas tienen un especial inters en tecnologa de alimentos, en la iidrlisis de lactosa tanto en leche (para conseguir derivados deslactosados) como de sueros lcteos (disminuyendo su poder contaminante o simplificando su posible utilizacin), (Figura 4.1).
CH,OH HO \OH / KOH -O OH H\ / OH -O OH
n ' I
CH,OH
HA
0H
H \' n / / OH
P-gaiactosidasa
/ ' "
\0H HO\
HY_/H
OH
HY_/H
OH
\0H / HNL__/H OH
*"
Figura 4.1. Esquema de la hidrlisis Enzimtica de lactosa.
La lactosa es el azcar principal encontrado en la leche y en los sueros de quesera y su procesado por hidrlisis se hace necesario desde distintos puntos de vista. En primer lugar, al ser un disacrido de gran masa molecular, su adsorcin directa al intestino es deficiente, por lo que su hidrlisis en azucares ms sencillos es fundamental para mejorar su
aprovechamiento metablico. Esta hidrlisis tiene lugar principalmente por accin de enzimas con actividad p-galactosidasa. Aunque la mayora de los mamferos (los seres humanos entre ellos) tienen niveles adecuados de la p-galactosidasa durante la infancia, en estado adulto la insuficiencia intestinal en p-galactosidasas de grandes grupos de poblaciones en el mundo se traduce en una incapacidad para digerir leche u otros productos de origen lcteo, provocando grandes trastornos intestinales, la conocida intolerancia a lactosa. En el intestino delgado existe un gradiente de actividad de la p-galactosidasa media en el duodeno, aumenta en el yeyuno, alcanza el mximo valor en la parte prxima del leo y desciende distalmente. Hay tambin diferencias segn su ubicacin en la vellosidad intestinal, siendo mnima la actividad en la cripta y mxima en el pice de la vellosidad (Careddu, 1977). Cuando la actividad de la lactasa (p-galactosidasa) es deficiente, la mayor parte de la lactosa ingerida pasa al intestino grueso, donde se convierte en un excelente nutriente para las bacterias presentes. Estas descomponen el azcar en cido lctico, hidrgeno, dixido de carbono y metano (Aurisicchio, 1994). Adems la presencia de lactosa en el intestino atrae agua. Este cuadro provoca la imposibilidad de la persona intolerante al consumo de productos con lactosa, con unos severos sntomas que pueden incluso conducir a la muerte del consumidor. Por otro lado, incluso la metabolizacin no adecuada de este producto presenta una serie de serios problemas para el consumidor de leche deficiente en las intestinales i.-la incapacidad de usar este disacrido como fuente de energa; (la lactosa representa el 30% de las caloras que aporta la leche entera y el 60% de la aportacin de la leche desnatada); p-galactosidasas
Capitulo 4 - Reacciones de Inters 79
i.-la mala utilizacin de las protenas de la leche que son convertidas en energa en lugar de constituir un aporte proteico esencial para el organismo, por ser de gran valor biolgico; iii.-la disminucin de la adsorcin de calcio y magnesio (Galrraga y Rocandio, 1997). La deficiencia de p-galactosidasa se clasifica como: 1Primaria o hipolactasia: heredado como rasgo autsmico recesivo. Los primeros sntomas se dan en la adolescencia o en la edad adulta temprana. En los individuos de raza negra comienza a manifestarse antes, hacia los tres aos de vida. Secundaria o adquirida: la deficiencia de p-galactosidasa es debida a
daos en la mucosa intestinal por infecciones gastrointestinales, ciertos medicamentos o algunas enfermedades intestinales crnicas. Congnta o alactasia: este error metablico innato es muy infrecuente. Desde el nacimiento hay ausencia de enzima en la vellosidad intestinal. Se manifiesta por enfermedad diarreica severa y deshidratacin. En la tabla 4.1, se representan los datos ms relevantes referentes a ios niveles de tolerancia de lactosa, en los principales grupos de poblacin en el mundo.
En la tabla 4.1, se presenta el cuadro que resume la prevalencia de la intolerancia a lactosa en el mundo.
Poblaciones con alto nivel de tolerancia a lactosa
Poblaciones con bajo nivel de tolerancia lactosa
Daneses Suecos Finlandeses Blancos americanos Blancos australianos Blancos canadienses Beduinos rabes
98% 99% 87-88% 75-90% 94-100% 94% 86%
Chinos Japoneses Indonesios Tailandeses Esquimales Groenlandia Mayora grupos de frica Negros americanos rabes Sirios rabes Jordanos Ceilaneses Iranes
0-20% 0-27% 9% 0-4% 12% 0-20% 22-25% 5% 0-27% 29% 14%
Poblaciones con niveles intermedios de tolerancia a lactosa Italianos Griegos Mestizos colombianos Mexicanos americanos Judos Indes 0-70% 33-62% 75% 50% 26-46% 7-100%
Tabla 4.1.- Prevalencia de la intolerancia a lactosa en la poblacin mundial. (Fuente: The Panum Institute, Universidad de Copenliague).
Por otro lado, la preparacin de derivados lcteos (p.e., helados) se ve muy dificultada por causa de la baja solubilidad de la lactosa, que hace que la lactosa cristalice muy fcilmente, produciendo problemas en las propiedades textuales del producto final. Otro aspecto importante a tener en cuenta es la presencia de este disacrido
extremadamente reductor en el suero de leche, (p.e., subproducto en la elaboracin de quesos), generando un enorme problema de contaminacin medio ambiental. Este problema se ve acentuado por las enormes cantidades de este subproducto, que se producen (unos 10 L de suero por kg de queso) y por la enorme demanda bioqumica de oxigeno que produce (en muchos casos, por encima de 400). La hidrlisis anterior o posterior al cuajo del queso podra suponer un freno a esos problemas, Incluso si se produce la hidrlisis de la lactosa anterior al cuajo del queso, se favorecera una aceleracin en la maduracin de los quesos. Una manera atractiva de la utilizacin del suero lcteo es su hidrlisis para la produccin de hidrolizados de glucosa y galactosa. Esto podra ser empleado para la produccin de jarabes edulcorantes, como productos para la industria confitera, como aditivos de algunos refrescos, en la produccin de helados, aditivos en pienso animal, preparacin de medios de cultivo para el crecimiento de levaduras de uso en panadera (Vassilis Gekas y Lpez-Leiva, 1985) o produccin de protenas, etc. De esta forma, pasaramos de un producto con efectos perniciosos en el medio ambiente y que debe de ser eliminado (con un coste determinado) a un producto que se podra utilizar con un cierto valor comercial. La termolabilidad y las impurezas son los principales problemas que presentan las p-
galactosidasas comerciales en su empleo para el procesado de suero de lechera, originado durante la elaboracin de queso, y del que slo se procesa a nivel mundial la mitad del producido, pasando el resto a constituir un importante problema ambiental cuya causa ltima es la presencia de lactosa (Pivarnik y col., 1995), como ya se discuti anteriormente. A partir
del permeado rico en lactosa obtenido como subproducto de la elaboracin de suero seco, se produce mediante hidrlisis con p-galactosidasas jarabe de glucosa-galactosa (Mahoney, 1985) que se utiliza como edulcorante (heladera, bebidas), sustrato microbiano (cervecera, enologa, panadera) o agente empardecedor (confitera) (Short, 1975).
4.1. HIDRLISIS DE LACTOSA 4.1.1. Hidrlisis acida. La hidrlisis acida se caracteriza por reacciones en condiciones muy severas de pH (12) y temperatura (100-150 C), consiguindose un grado alto de hidrlisis en un periodo de tiempo muy corto, siendo un mtodo muy simple y barato. Por ejemplo, Nickerson y Lin llevaron a cabo experimentos de hidrlisis acida de una solucin de lactosa al 30% y de un concentrado de permeado de suero con 20-50% de slidos totales con cido sulfrico 2 N. (Pain 1978,
Lin y Nickerson 1976, Langdon 1980). Actualmente su uso, est autorizado en pases como Irlanda, donde se produce para los mercados ingleses e irlands. Las principales desventajas del uso de este mtodo consisten fundamentalmente en:
1.- No es posible su uso en la hidrlisis de leche y solucin de protenas conteniendo lactosa (e.g. sueros de quesera), por la desnaturalizacin de las protenas, que ocurre a alta temperatura y bajo pH, con lo que, su uso se limita a hidrolizar permeados. 2.- La presencia de ciertas sales en los sueros provoca la neutralizacin del cido, por consiguiente, una desmineralizacin entorno al 90-95% es necesaria para utilizar esta tcnica con el consiguiente incremento del coste. 3.- Las elevadas temperaturas provocan la caramelizacin del azcar, con la aparicin de un color marrn en los productos hidrolizados, que hace necesaria una etapa de decoloracin posterior. 4.- Debido a las drsticas condiciones empleadas, es preciso utilizar materiales especiales (e.g., titanio) con lo que se encarecen plantas. los costes en la construccin de estas
4.1.2. Leches bajas en lactosa por expresin ectopica de |3-galactosidasas intestinales en glndulas mamarias.
Se ha investigado en los ltimos aos un mtodo de produccin de leche baja en lactosa basado en la creacin de animales trangnicos, insertando genes hbridos con promotores para su expresin a nivel de las glndulas mamarias. Esos animales trangnicos, seran capaces de expresar la protena (p-galactosidasa), durante el periodo de produccin de leche. La enzima sintetizada por este mtodo provoca un significativo decrecimiento en el contenido de lactosa (entre 50-85%), sin apenas cambios en la fraccin grasa y en
concentracin proteica de la misma leche (Bernard Jost y col. 1999). Sin embargo, existe un cierto recelo en los consumidores a la utilizacin de animales trangnicos en alimentacin y todava no se ha conseguido la eliminacin total de la lactosa por este mtodo. Por ello, el mtodo que actualmente constituye el grueso de las investigaciones, lo constituye, el mtodo enzimtico basado en la aplicacin de p-galactosidasas, tema central desarrollado durante el transcurso de esta tesis.
4.1.3. Principales fuentes de |3-galactosidasas.
Las preparaciones de |3-galactosidasa que se aplican al procesado de alimentos con el fin de hidrolizar la lactosa, provienen fundamentalmente de mohos de las especies Aspergillus niger y A. oryzae, y de levaduras de las especies Kluyveromyces lactis, K. fragilis y Candida pseudotropicalis (Kuntz, 1993; Lopez-Leyva, 1985; Ladero, M. 1999). Todas ellas efectan la hidrlisis de la lactosa a lo sumo a 40 C, son termosensibles y tienen como impurezas en su composicin otras protenas. Las protenas contaminantes que presentan las preparaciones de P-galactosidasas comerciales (proteasas, lipasas, etc.) inciden desfavorablemente tanto sobre su vida til (inactivacin por protelisis de la enzima) como sobre la calidad organolptica de la leche (al afectar a las protenas de la leche). En conjunto, las limitaciones del uso de dichas
enzimas comerciales vienen dadas por su termolabilidad y por las impurezas que presentan (Mahoney, 1985; Gekas y col.1985).
Albaricoque, almendras, bayas de caf, granos de Plantas rganos animales Kfir, melocotn, semilla de alfafa, varios tipos de rosas silvestres Intestinos, tejidos de la piel y sesos Brettanomyces pseudotropicalis, Levaduras anmalas, Candida
Kluyveromyces(Saccharomyces)
lactis y fragilis, Wingea roberstii Bacillus circulans, Bacillus stearothermophillus,
bacillus megaterium, Escherichia coli, Lactobacillus bulgaricus y helvetcus, Lactobacillus sporogenes, Bacterias Streptococcus aquaticus Aspergillus flavas, Apergillus foetdus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Alternara alternara, Alternara palmi, Curvularia Hongos inaegualis, Fusarum moniliforme, Mucor miehie, Mucor pucillus, Neurosporas crasa, Scopuloriopsis. lactis y termophilus, Thermus
Tabla 4.2-. Principales fuentes de j3-galactosdasas.
La termolabilidad obliga a utilizar estas enzimas con posterioridad al tratamiento trmico aplicado para la higienizacin de la lectie, ya sea pasterizacin en sus diversos mtodos (UHT, etc.), ya sea esterilizacin. Utilizarlas con anterioridad a dicho tratamiento no es posible ya que, por provenir de microbios mesfilos, el ptimo de temperatura de las
p-galactosidasas comerciales se sita en torno a 37C, el mismo que el de la prctica totalidad de los microbios patgenos y alterantes presentes en la leclie fresca tras su ordeo. Su empleo despus del tratamiento trmico slo es factible en condiciones de mxima asepsia e incubando a temperaturas subptimas, para reducir al mnimo la posibilidad de contaminacin, todo lo cual encarece enormemente la leche hidrolizada as obtenida. Contar con enzimas termoestables y puras permitira simultanear la pasterizacin u otros tratamientos trmicos antimicrobianos con la eliminacin de la lactosa, y preservara al sustrato de modificaciones indeseables ocasionadas por impurezas tales como proteasas, lipasas, etc. Con ello se reduciran costes de produccin y se evitaran riesgos de contaminacin bacteriana en el procesado. Las propiedades de las p-galactosidasas dependen de la fuente y tambin de las diferentes preparaciones comerciales (Gekas, 1985; Broome 1983). Los principales preparados comerciales se relacionan en la tabla 4.3
Captulo 4 - Reacciones de Inters 83
FUENTE
CASA COMERCIAL Baxter Laboratory, Chicago, II, Usa. Dairyland Food Labs, Waukesha, Wi. USA Kyowa Hakko Kogyo C e , Japan Societ Rapidase, Seclln, France.
Aspergillus
Nger
Wallerstein Co., Morton Grove, II. USA GB Fermentation Industries, I n d i . USA Gist-Brocades, Holland, (Maxillat). Nutritional Biochemicals Co.Ltd. Cleveland, USA
Kluyveromyces o Saccharomyces lactis
Tokyo Tanabe Co. Ltd. Japan. Kyowa Hakko kogyo Co., Japan
Kluyveromyces o Saccharomyces fragUis
Sigma Chemicals Co., St. Louis, USA. Novo A/S, Denmark (Lactozym). CF Boeringer GmbH, Mannheim, Alemania Worthington Biochemical Corp., Freehold, USA
Escherchia coli
Tabla 4.3.- Principales preparados de fi-galactosidasas (lactasas) comerciales.
4.1.4. PROBLEMAS CINTICOS DURANTE LA HIDRLISIS ENZIMATICA DE LACTOSA.
A pesar de las buenas perspectivas de la hidrlisis enzimtica de lactosa, adems de los problemas de estabilidad del biocatalizador, existen varios problemas que estn dificultando la implantacin industrial del proceso. El principal problema es la elevada inhibicin provocada por los dos productos de la reaccin, glucosa (normalmente inhibidor no competitivo) y la galactosa (normalmente inhibidor competitivo). Dada la gran concentracin de lactosa inicial, los efectos inhibitorios llegan a ser muy significativos en las ltimas etapas de la reaccin, dificultando que la reaccin pueda llegar a progresar hasta el 100% de hidrlisis (totalmente imprescindible si se pretende suministrar a personas intolerantes a lactosa). La inhibicin competitiva es difcil de prevenir, ya que habra que actuar sobre el propio centro activo de la enzima esperando un aumento de esta constante mayor que el causado en la KM., con lo que apenas se conseguira algn efecto significativo en el curso de reaccin. Si el efecto inhibitorio se basa en algn cambio conformacional de la enzima o en la unin a un lugar alejado de la enzima, la inmovilizacin multipuntual de la enzima sobre un soporte rgido podra ser suficiente para disminuir e incluso anular este efecto inhibitorio (ya sea por bloquear el acceso del inhibidor al centro de reconocimiento o por evitar los cambios conformacionales consiguientes).
Por ese motivo, tras disear biocatalizadores con una gran estabilidad, nos fiemos planteado estudiar su comportamiento cintico durante la reaccin de hidrlisis de lactosa en distintos productos de inters (leche, suero)
4.2. OBJETIVOS Y ALCANCE DEL TRABAJO.
El objetivo principal de este capitulo es el estudio de los fenmenos cinticos (inhibiciones fundamentalmente) que pueden dificultar durante la reaccin de hidrlisis de lactosa catalizada por IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp, tanto en fase soluble como
inmovilizadas. Asi se estudiaran los siguientes aspectos:
1.- La cintica de las reacciones de hidrlisis de oNPG (como primera aproximacin ms sencilla) y de lactosa catalizada por la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., 12, soluble e inmovilizada.
2.- La influencia que pueda tener la presencia o no de ciertos cationes metlicos en los sustratos que se utilizaran en las reacciones de hidrlisis.
3.- Hidrlisis de lactosa en leche y en sueros de quesera.
Para estudiar las cinticas de reaccin de hidrlisis, se usaran como base, mecanismos cinticos de Michaelis-Menten, considerando la posible inhibicin por sustrato o por producto, pudiendo ser esta ltima competitiva, acompetitiva, no competitiva o mixta. Se analizarn estos mismos parmetros en el comportamiento de la protena soluble y en la inmovilizada (ventajas de una con respecto a otra).
4.3. MATERIALES Y MTODOS 4.3.1. Materiales
Los tampones utilizados durante el desarrollo de este capitulo, fueron descritos en el apartado mtodos, del capitulo 2 (purificacin). Se usaron lactosa y oNPG, de grado analtico de la casa Sigma (concentraciones de lactosa 139, 556 y 834 mM; en cuanto que para oNPG, se usaron concentraciones comprendidas entre 1y 30 mM). Los rendimientos de hidrlisis se midieron usando el kit "Glucosa Trinder 100" de Sigma diagnostics y por cromatografia liquida de alta eficacia (HPLC), en un equipo: Kontron Instruments, 360 Autosampler con horno termostatizador de columna de Perkin Elmer LC 100 Detector: Light Scattering modelo SEDERE 45 (dispersin de luz) Columna: Nucieosil-NHa-lOO, 250x4,0 mm, 5îl de Sugelabor. Flujo constante: Iml/mini y fase mvil acetonitrilo / agua en proporcin 25/75%. Enzimas y derivados utilizados: p-galactosidasa de Thermus sp., T2 soluble e inmovilizadas (Derivados sepabeads-boronato y sepabeads-IDA-Co), como reportamos en el capitulo 3 (inmovilizacin), de esta memoria. Leche comercial ( Feiraco) semisdesnatada. Sueros y permeados de F.E.R.M.O, SA, amablemente donados por Cristina Samayoa.
4.3.2. Mtodos 4.3.2.1 Preparacin de ios derivados.
Los protocolos optimizados para la preparacin de los derivados objeto de estudio en este capitulo, estn reportados en el apartado de mtodos del capitulo 3 (inmovilizacin), de esta memoria.
4.3.2.2. Anlisis de la influencia de cationes metlicos en los rendimientos de hidrlisis.
Como los sustratos de uso ms frecuente en la hidrlisis de lactosa (Lactosa de la leche, lactosa de sueros y permeados etc), tienen en su composicin algunos metales, se realiz un estudio para determinar la influencia que estos compuestos pueden tener en la actividad de la protena (ya sea soluble o inmovilizada) para evitar errores de determinacin del grado de hidrlisis en todos los casos. As, preparamos disoluciones de varias sales de metal y se aadieron a pequeos reactores (viales eppendorff) conteniendo 1 mi de p-galactosidasa soluble hasta concentracin de esta sal en el reactor de 5mM. Las muestras se incubaron en baos termostatizados a las temperaturas de ensayo (hidrlisis), tras las cuales se midieron actividad remanentes frente a un blanco que no contena sales de ningn tipo.
4.3.2.3. Reacciones de hidrlisis.
Las reacciones de hidrlisis se llevaron a cabo en matraces de 100 mi de capacidad revestidos de una camisa exterior por donde el agua poda recircular. Como el oNPG es un sustrato sinttico de las P-galactosidasas que, al ser hidrolizados rinde una molcula de galactosa y otra de oNP (orto-nitroplnenyl). El oNP da coloracin amarilla, siendo la absorbancia 405-420 nm proporcional a la concentracin de dicho producto. Se incubaron 10 mi de (solucin de lactosa, leche y / o suero, segn el caso) con 0,3 g de derivado (aproximadamente 3 unidades), durante el tiempo necesario para la hidrlisis total del sustrato en estudio, midindose el grado de hidrlisis en intervalos cortos de tiempo. Cuando la reaccin se llev a cabo con la protena soluble, la reaccin fue detenida aadiendo 100 |al de HCI 1M y neutralizado con 100 jil de hidrxido de sodio 1M (cuando se midi el grado de hidrlisis con el reactivo de Trinder) (Trinder, 1969), midindose espectrofotmetricamente a 505 nm, tras 18 minutos. Cuando se midi por HPLC, la reaccin se detuvo aadiendo a 100 ( ^ 1 de muestra, 100 |il de sulfato de bario 0,1 M y 100 al de cloruro de zinc 0,1 M, seguida de centrifugacin en microcentrifuga e inyeccin al espectro, 20 |il del sobrenadante en la dilucin que sea. La cuantificacin de los azucares (en hidrlisis por HPLC), se llev a cabo determinando el rea bajo el pico. Para conocer ia relacin entre el rea del pico y la concentracin del analito y los tiempos de retencin de cada analito se realizaron calibrados tanto para el reactivo como para los productos, usando se sacarosa como patrn interno, al ser el detector muy sensible a este analito, se logra una separacin entre azucares muy interesantes. As, la sacarosa se us en todos los casos, en muestras y en patrones a una concentracin constante de 1,88 g/L. Para la recogida de datos, el HPLC dispone de un ordenador provisto de un software que recoge la seal que va midiendo el detector integrando los picos del cromatograma. Con el rea bajo el pico se calcula, mediante uso de calibrados, la concentracin de cada analito (Ladero, M. 1999).
600-
saca'esa
5DD-
400-
>
S 300to
o "^
200frente de dfso.Vent
100-
! \
0) 5
; u v^
10 t . 15 fm\r)
1 \
20 25
1 \
i \
Figura 4.2.- Cromatograma tpico de azucares, durante la hidrlisis de lactosa, analizadas por HPLC en columnas Kromasil-NHz.
Todas las reacciones de hidrlisis tuvieron lugar, en pequeos reactores (matraces) en discontinuo, sumergidos en baos termostatizados con agitacin constante.
4.3.2.4. ESTUDIOS CINTICOS: 4.3.2.4.1. Clculo de las constantes cinticas.
Los ensayos para determinar las constantes cinticas se llevaron a cabo con disoluciones de oNPG en tampn Novo a pH 6,5 (Ver composicin en el apartado de mtodos del capitulo 2, purificacin de esta memoria), usando concentraciones desde 1mM liasta 30 mM, dada su facilidad de manipulacin. Las reacciones tuvieron lugar a 70C en baos de agua termostatizados. Se usaron soportes-IDA-Co y sepabeads-boronato muy poco cargados (aproximadamente con 2 U/ml, para prevenir posibles problemas de difusin). Para calcular las constantes cinticas (Km, Vmax y Ki) se utiliz el procedimiento de Lineaweaver-Burk y Cabaille y Combs, (1995). Los modelos cinticos se ajustaron segn Ladero, M. (1999).
4.4. RESULTADOS Y DISCUSIN. 4.4.1. Influencia de cationes metlicos en el curso de las reacciones de hidrlisis de lactosa.
La figura 4.3, representa el estudio del efecto que tiene la presencia de diferentes sales de metales en la reaccin de inidrlisis de lactosa. Se observ de manera general, que la presencia de distintos cationes apenas ejerce efecto en la actividad P-galactosidasa, con lo que es de suponer que, se podrn alcanzar unos rendimientos de hidrlisis satisfactorios. El nico caso en el que se detect un efecto negativo significativo fue cuando se analiz la influencia del cobre en la actividad enzimtica, encontrando perdidas de actividad por encima del 70 %. Este era un resultado esperado, a tenor de los resultados encontrados durante ia purificacin de la proteina usando quelatos de cobre.
120
Figura 4.3,- Estudio del efecto de la presencia de varios cationes metlicos en la actividad de la enzima IMAC/^galactosidasa de Thermus sp., T2, durante las reacciones de hidrlisis de lactosa. La reaccin se llev a cabo en las condiciones de hidrlisis, tampn Novo pH 6,5 y a 70C.
Capitulo 4 - Reacciones de inters 88
4.4.2. Anlisis cintico de inhibicin de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. T2 soluble y de sus derivados (sepabeads-IDA-Co y sepabeads-boronato).
En los estudios cinticos para la determinacin de todas las constantes se utiliz oNPG como sustrato, atendiendo a la facilidad de su manipulacin durante los experimentos. En la tabla 4 se presentan ios resultados del clculo de las constantes obtenidas (Km, Vmax y Ki), tanto para la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. T2 soluble y de los derivados sepabeadsIDA-Co y sepabeads-boronato.
Protena/soporte
Vmax.
Km
Ki
N o c o m p e t i t i v a Glucosa)
KI
Competitiva(galactosa)
(U/mg) (mM) 48 45 47 3,1 7,7 6,6
(mM) 49,9 61,1 99,1
(mM) 3,1 11,7 12,5
Soluble Sepabeads-IDA-Co Sepabeads-boronato
Tabla 4.4.- Valores de las constantes cinticas para la IMAC/jS-galactosidasa de Thermus sp., T2 y de sus derivados sepabeads-boronato-epxido y sepabeads-IDA-Co-epxido. Los derivados se realizaron con enzima pura. Para ms detalles epgrafe 4.3.2.4.1 de mtodos.
La
ecuacin
de
velocidad
de
la
hidrlisis
de
lactosa
por
la
IMAC/(3-galactosidasa de Thermus sp., T2, se representa segn la ecuacin siguiente (Ladero 1999).
' r ''G/ucosa K 1+"^ V V K\ j
V max.Cof,pG ^ ^ r
ÔNPG I Galactosa (ly , z-' \
J + -^^V^+ÔNPG)
Para un estudio con ms pormenor, se decidi estudiar de manera individualizada los parmetros que afectan la cintica de reaccin como especificamos a continuacin. Los valores de la Km hallados para la enzima soluble se sitan dentro de los limites reportados en la bibliografa (Vian y col.1998), para (3-gaiactosidasas de microorganismos termfilos, en cualquier caso, mucho menores que las concentraciones de lactosa en leche (en torno a 130 mM). Mientras que la Vmx. era muy similar para las diferentes preparaciones, se aprecia un aumento de la Km en los derivados inmovilizados (aproximadamente por un factor de 2 en los dos derivados), sugiriendo que el centro activo ha sido ligeramente modificado en cuanto a su afinidad por los distintos ligandos. Los resultados calculados para todas las constantes de inhibicin coinciden con los modelos propuestos por (Ladero y col.2001), donde se observ una inhibicin (p-galactosidasa de Thermus sp. 12), de tipo Michaelis-Menten, NO COMPETITIVA POR GLUCOSA:
'^
v =
^ B-Galaclosidasa
ÔNPG Glu eos a
K^m'^
ÔNPG ) '
1 + c, -
K:
e inhibicin COMPETITIVA POR GALACTOSA k-C

V =
/-Calactosidasa
.r
ÔNPG
Galactosa
K:
+ C, ONPG
La constante de inhibicin connpetitiva por galactosa es nnuy baja en la enzima soluble, del orden de la Km, por lo que su relevancia cintica debera de ser muy significativa. Se observa claramente que en los derivados sepabeads-boronato y sepabeads-IDA-Co, la constante de inhibicin aumenta de forma notable. La inhibicin no competitiva por glucosa presentaba una constante mucho mayor, pero dada las grandes concentraciones de sustrato iniciales se puede esperar que tenga una gran incidencia en las etapas finales de la reaccin. Esta inhibicin se vea fundamentalmente disminuida en el caso del derivado Sepabeads-boronato. En cualquier caso, ambos derivados parecen tener unas propiedades cinticas mejores que la enzima de partida.
4.4.3. Estudios de los cursos de hidrlisis de lactosa:
100
tf
A
^^TT^^'
B _
(A
ff
100 n 80 60 40 20 0 ;/
^
X^^
' y^^^ ^'^'
80-
yy
'-,
'
o
o
6040 20 01
/ ^
A-'^
^ ^ '
_ ,
^
13 X
Xy"
g/
yV"
^ji^'*
S S
s s
^/^^
"
50 100 150 200 250
20
40
60
80
100
t (mini)
t (mini)
Grfica 4.1.- Cursos de hidrlisis de lactosa con la IMAC/fi-galactosidasa de Thermus sp., T2, soluble y sus derivados sepabeads-IDA-Co-epxido y sepabeads-boronato-epxido. A- reaccin a 50C; B- reaccin a 70C. Las diluciones de lactosa al 5% se realizaron en tampn Novo pH 6,5 y en ambas reacciones se adicion la misma actividad enzimtica. (Jl) Derivado sepabeads-boronato-epxido; (-f) Derivado sepabeads-IDA-Coepxido; (^) IMAC/j^galactosidasa de Thermus sp., T2, soluble.
En un primer momento se estudiaron los cursos de hidrlisis de lactosa pura disuelta en tampn Novo. Las grficas 4.1 A y 4.1 B muestran que, independientemente de la temperatura de hidrlisis, y partiendo de las mismas condiciones iniciales, se alcanz el 100% de hidrlisis del 5% de lactosa cuando se usaron los derivados sepabeads-boronato y sepabeads-IDA-Co y sin embargo para el caso de la protena soluble se alcanz una hidrlisis
Capitulo 4 - Reacciones de inters 90
de solo 85%, con una intensa curvatura en los cursos de hidrlisis a partir de rendimientos moderados de hidrlisis (70-75%). Dada la gran estabilidad de la enzima, y la similitud de los cursos a dos temperaturas distintas, este comportamiento hace pensar en el efecto inhibitorio de la glucosa y galactosa anteriormente descrito, en el que el efecto de la inmovilizacin sobre las constantes de inhibicin se traduce en una mejora muy significativa de los cursos de hidrlisis, pudiendo llegarse a hidrolizar la prctica totalidad de la lactosa. De hecho, el mejor derivado pareca ser el realizado sobre epxido-boronato, derivado en el que las constantes de inhibicin haban sido ms incrementadas.
4.4.3.1. Hidrlisis de lactosa en leche y en suero de quesera.
Grfica 4.2.- HidrUsis de lactosa en leche semidesnatada comercial y en sueros de quesera por la accin del derivado sepabeads-boronato de la IMAC/^galactosidasa de Thermus sp., T2. Contenido en lactosa en ambos sustratos: 5%. La reaccin tuvo lugar a / C C . En ambos casos se adicionaron las mismas unidades. (B) Leche semidesnatada comercial ('#) Suero de quesera
Se estudi el comportamiento del derivado sepabeads-boronato en la reaccin de hidrlisis de una leche semidesnatada comercial y de una muestra de sueros de quesera conteniendo aproximadamente el 5% de lactosa (grfica 4.2), donde se observ que en las mismas condiciones de anlisis, se alcanz el 100% de hidrlisis al cabo de aproximadamente de 12 minutos, cuando se trat la leche, en cuanto que con el suero solamente se consigui la hidrlisis total cuando haban transcurridos cerca de 25 minutos. Diferentes valores en el pH de reaccin deberan de ser la explicacin de este diferente comportamiento.
4.5. CONCLUSIONES. 1.- La enzima soluble presenta unos niveles de inhibicin por galactosa (competitiva) y por glucosa (no competitiva) que ralentiza la reaccin de hidrlisis de soluciones concentradas de lactosa, dificultando su hidrlisis total en leche o en suero lcteo (p.e., a partir del 90% de hidrlisis de soluciones al 5% de lactosa se aumenta la reaccin esta casi totalmente parada). 2.- La inmovilizacin de la enzima sobre soportes epxido-IDA-Cobalto provocaba una mejora significativa del curso de la reaccin. Anlisis de las constantes cinticas demostraron que la Vmax. quedaba prcticamente inalterada, mientras que la KM lo aumentaba de 3.1 a 7.7 mM , la Ki competitiva por galactosa aumentaba de 3.1 a 11.7 y la K no competitiva por glucosa 49.9 a 61.1. La mejora de la tasa Kw/Kigaiactosa podra explicar el mejor curso de reaccin. Sin embargo, este derivado aun mostraba una ralentizacin en ios cursos de hidrlisis a valores superiores al 95%. 3.- Los derivados de la enzima preparados sobre soportes boronato-epxido
mostraban el curso de reaccin mas lineal, alcanzando a hidrolizar el 100% de la lactosa contenida en leche de forma casi lineal. Se pudo asociar este comportamiento a un mejor balance de la las constantes cinticas: un incremento menor de la KM (hasta 6.6. mM), y un mayor incremento de la Kigaiadosa (hasta 12,5) y de la Kigiucosa (hasta 99,1). 4.- La preparacin de diferentes derivados permite alterar en mayor o menor medida las constantes cinticas de las enzimas, pudiendo mejorarse de forma muy significativa los cursos de reaccin utilizando el derivado ms idneo. 5.- El derivado preparado sobre soportes boronato-epoxido no solo es el ms estable, sino que es el que se inhibe menos durante los cursos de hidrlisis de lactosa permitiendo su hidrlisis total en leche o sueros lcteos.
Capitulo 5 - Anlisis Econmico 92
CONTROL TCNICO Y ECONMICO DE PROCESOS INDUSTRIALES QUE OPERAN CON p-GALACTOSIDASAS.
5. INTRODUCCIN
Espaa es de los pases Europeos con una produccin enorme de leche, siendo, aproximadamente un tercio del total de esta produccin dedicada a la fabricacin de quesos, aunque esta tiende a aumentar debido al incremento del consumo de comidas rpidas, tipo pizzas y otros platos preparados en base a este producto. En la tabla 5.1, mostramos la produccin total de leche en Espaa durante los aos 1997, 1998 y 1999. (En toneladas).
(*) Entera
1997 2.355,0
1998 2.248,9 829,4 627,8
1999 2,110 892 643 750.000 Litros / ao, es un dato muy fluctuante.
Semidesnatada 709,9 Desnatada

(Fuente IPARLAT)
612,2
Semidesnatada (UHT) Baja en lactosa
PRODUCCIN DE LECHE Y PRODUCTOS LCTEOS (TN) TABLA 5.1 PRODUCTO LECHE RECOGIDA Vaca Oveja Cabra LECHE DE CONSUMOD Pasterizada Esterilizada UHT LECHE CONCENTRADA Condensada LECHE EN POLVO Entera Semidesnatada Desnatada OTROS PROD. EN POLVO Nata de Consumo directo IVIANTEQUILLA QUESOS Pennsula y Baleares 1997 6.025.936 5.479.836 277.000 269.100 3.677.100 140.100 558.500 2.978.500 61.700 52.200 15.700 2.400 1.300 12.000 5.000 61.300 29.300 1998 6.017.300 5.482.000 264.400 270.900 3.706.000 125.400 541.400 3.039.200 62.000 59.700 12.900 4.100 1.000 7.800 700 73.100 30.700 86.000 36.500 7.800 12.400 1999 6.281300 5.685.400 278.200 317.700 3.645.400 126.400 492.700 3.026,300 52.000
20.200
De Vaca Fresco Blanco pasterizado Blando.semi y duro De Oveja De Cabra De mezcla Total de quesos (ex.fundido) Fundidos Leche acidificada (yogur y otras) Natural Otros (sabores, frutas..) LECHE lcteos) LECHE AROMATIZADA (Batidos) GELIFICADA (Postres
100.000 69.000 7.300 23.700 21.000 9.100 110.500 240.600 36.100 472.800 155.300 317.500 214.700
110.200 72.500 7.700 30.000 27.000 4.900 103.800 245.700 32.700 531.000 191.600 339.400 274.300
118.600 79.500 9.300 29.800 24.700 8.800 110.000 262.100 31.700 581.600 230.500 351.000 242.000
122.100
135.600
152.000
5.1. CONSUMO El consumo de productos lcteos en Espaa fue calculado en base a una poblacin estimada de 39.394.000 habitantes, y los datos se resumen en la tabla 5.2.
TABLA 5.2
CONSUIVIO PER CAPiTA DE LECHE Y PRODUCTOS LCTEOS 1999 108kg/hab. ao 0,9 kg / liab. ao 1,2kg/hab. Ao 5,53 kg / hab. ao 0,43 kg / liab. ao 0,21 kg / hab. ao 2,14 kg/hab. ao 0,92 kg / hab. ao 9,23 kg / hab. ao 16,2 kg/hab. ao 0,47 kg / hab. ao
LECHE DE CONSUMO LECHE EN POLVO LECHE CON DENSADA QUESO DURO-SEMIDURO QUESO BLANDO QUEZO AZUL QUESO FRESCO QUESO FUNDIDO TOTAL QUESOS YOGUR Y LECHES FERMENTADAS MANTEQUILLA NATA
2,3 kg / hab. ao
5.2. COMERCIO EXTERIOR En la tabla 5.3, presentamos los datos relativos a las exportaciones e importaciones de productos lcteos durante el ao de 1999, entre Espaa y el resto de pases del mundo con relaciones comerciales con Espaa. (Datos en toneladas).
TABLA 5.3 Leche de vaca en pequeos envases Leche de oveja y otras leches en pequeos envases Nata en pequeos envases Leche de vaca a granel Leche de oveja y otras a granel Nata a granel Leche en polvo desnatada en pequeos envases Leche en polvo desnatada a granel Otras leches en polvo en pequeos envases
IMPORTACIONES 254.084
EXPORTACIONES 73.009
2.102 7.435 74.001 8.243 3.354
266 2.130 65.272 11.363 16.268
429 30.917
995 18.708
2.698 Otras leches en polvo a granel Leches evaporadas Leches concentradas Leches condensadas Yogur Otras leches fermentadas Mantequilla Quesos frescos Quesos rallados o en polvo Quesos fundidos Otros quesos 10.50 3.506 9.798 4.421 94.388 25.597 9.237 11.781 6.647 8.286 84.148
5.609 6.894 0 9,565 8.809 15.041 18.381 8.477 12.049 252 5.885 17.913
Segn el MAPA, durante el ao 2000, parece ser que estos volmenes de negocio aumentaran considerablemente, porque si comparamos la cantidad de cada producto y los valores monetarios obtenidos, se observa un espectacular crecimiento, comparndolos con los datos de 1999, donde las transacciones se efectuaron no solo entre Pases de la Unin Europea, si no, con Paises de otros Continentes. En la tabla 5.4, se presenta el volumen de negocios relacionados con el intercambio de productos lcteos entre Espaa y el resto de Pases de la Unin Europea, durante el ao del 2000.
TABLA 5.4
IMPORTACIONES Miles de TN Euros
EXPORTACIONES Miles de TN Euros
Leche de vaca en pequeos envases 305.214 Leche de oveja y otras leches en pequeos envases Nata en pequeos envases Leche de vaca a granel Leche de oveja y otras a granel Nata a granel Leche en polvo desnatada en pequeos envases 511 1319,57 2.031 7531,9 2.312 6.172 113.200 5.426 4.067 3406,48 11457,2 43647,037 3468,12 8103,98 19 1.900 83.956 9.917 15.496 42,107 6970,85 35343,88 12669,89 29258,056 111047,86 83.737 31166,4
Leche en polvo desnatada a granel 35.762 Otras leches en polvo en pequeos envases 3.683 Otras leches en polvo a granel Leches evaporadas Leches concentradas Leches condensadas Yogur Otras leches fermentadas Mantequilla Quesos frescos Quesos rallados o en polvo Quesos fundidos Otros quesos 7.948 3.497 12.156 2,369 135.365 35.543 7.906 14.239 7.351 10.111 76.517 6171,74 22276,73 4945,26 13809,78 4889,59 119571,45 34268,3 23369,52 34739,61 28387,78 47597,97 27745,87 103 3.328 0 9.553 6.800 21.823 13.545 15.240 9.473 210 3.372 13.484 324,12 639,044 0 14976,96 6633,3 19518,65 19112,57 45080,87 19200,78 849,74 9995,94 55268,52 83728,62 12.211 26643,4
Fuente: Federacin Nacional de Industrias Lcteas, y MAPA.
Obs: Los volmenes de exportacin e importancia de la leche baja en lactosa, es nulo, en este momento, al ser un producto de reciente incorporacin al mercado nacional (Fase de localizacin y fdelizacin de clientes)
5 . 3 . PRODUCCIN DE SUEROS DE QUESERA.

La produccin de queso en Espaa est prxima a las 300.000 Tm/ ao, lo que comporta una disponibilidad de lactosuero, de cerca de los 2,5 millones de Tm. Sin un dato que lo confirme de forma actualizada, cerca de la mitad de esta cantidad podra ser vertida, generalmente en los cauces de los ros, conllevando un enorme problema medio ambiental. Se suele expresar el poder contaminante del agua residual por su Demanda Qumica de Oxgeno (DQO), cantidad de oxgeno en mg, necesaria para oxidar completamente por mtodos qumicos, toda la materia orgnica de 1 litro de muestra. En el suero la DQO oscila entre 50.000 y 100.000 m g / L . As, una quesera que procese cerca de 100.000 L de leche / da genera como suero, tanta contaminacin como la de una poblacin de 55.000-65.000 habitantes. (Mara Isabel Verruga, 2001. Mayor aprovechamiento y diversificacin a partir de subproductos lcteos. ILE. 271, 2001). En la figura 5.1, se muestran esquemticamente algunas de las posibilidades de aprovechamiento del suero de quesera.
LACTOSA -Alimentos i n f c n l i l c s , otros ollmenTos Medicamentos -Derivados de loctoso; Lcctulosa, L o c l i t o l . Esteres de locTio!, Sol-OS, ."(cido loctobidnico, Loctosil-urea
A U M E N T A a N HUMANA Sebidos, QLieso Alimentos infantiles Productos Lcteos Productos Crnicos
Panadera
Otros
AUMENTAadN ANIMAL Piensox Bebidos
R E T E DO r PROTENAS WPC. W P I . W P T , WPP a-LccIoolbmina. ^Loctoglobulina, Loctoperoxidoso, Loctof errino, CMP I 9 . 8SA
O B T E N a N DE DIVERSOS PRODUCTOS POR B I O C O N V E R S I N
-Aprovchamlonto del a
Figura 5.1.- Representacin queseras a escala industrial
esquemtica
de los procesos
de aprovechamiento
de sueros de
La aplicacin ms sencilla del suero es como fertilizante, para riegos de terrenos agrcolas, pero la cantidad aplicada por unidad de superficie y la frecuencia de aplicacin deben ser muy controladas para evitar una excesiva salinizacin de los suelos. Pero una de las aplicaciones que est en auge, es su utilizacin en alimentacin animal y en preparados para la confeccin de productos de confitera y en microbiologa, principalmente como medio de cultivo. Una de la formas mas recientes de aprovechamiento del suero, en fase muy inicial, es la utilizacin de lactasas, ya sean libres o inmovilizadas para la produccin de productos de un elevado valor aadido, como son los llamados Oiigosacaridos (OS), muy importantes para la produccin de bfidos activos para las industrias farmacutica y alimentara.
E S Q U E M A D E L P R O C E S A D O DE S U E R O L C T E O C O N L A C T A S A S DE T H E R M U S J N M O V I L I Z A D A S
vCV
ULTRAFILTRACIN OSMOSIS INVERSA
KM
IStptricMnpstmambrtnHl C ^
PEBMCADO WPC
(Uclcx (K) 10.000 L / h <I3
(Lactosa 18%|
PRODUCCIK OE uaosACARiDos y OTHOS COMPUESTOS
CENTRIFUCACIH RIFUCACIH
COHCE. COHCENTRACIN
i
EN POLVO
I
EH POLVO SUERO R O L I R
Figura 5.2.- Representacin galactosidasas inmovilizadas
esquemtica
del proceso
industrial
de tiidrlisis
de lactosa con p-
En cuanto a la transformacin de sueros de quesera, en Madrid, la empresa pionera es FERMO SA. con capital 100 % Espaol, y con una produccin media anual de unos 7.000 Toneladas, distribuidos como aparece en la tabla 5.5.
Producto Concentrado de protenas Lactosa Sueros y derivados
Produccin anual (TN) 1.320 2.670 3.010
Precio / kg (euros) 0.42 0.60 1.20
Tabla 5.5.- Produccin anual de los principales productos y su valor de mercado (Fuente: FERMO,S.A).
Segn la empresa FERMO. SA, la aplicacin de lactasas est en la fase de prospeccin de mercado, y con unos niveles de produccin y ventas de productos como, protenas, suero dulces en polvo para pienso etc, con rendimientos muy elevados. Con eso, una de las aplicaciones que en la industria esta ganando enteros, es la aplicacin de lactasas, ya sean, para la produccin de derivados lcteos con bajo porcentaje de lactosa (leche, yogures y otros postres lcteos), fundamentalmente para individuos con cierto nivel de intolerancia a la lactosa y en la industrial lctea, ya sea para producir productos de alto valor aadido (refirase OS), y por otro lado, disminuir el enorme poder contaminante de lactosa en los mismos , para los volmenes de sueros excedentarios.
5.4. OBJECTIVO Y ALCANCE DEL ANLISIS.
El objetivo esencial de este capitulo, es fundamentalmente realizar un pequeo anlisis de la factibilidad o no, en trminos tcnicos y econmicos de la sustitucin de un equipo para hidrolizar lactosa que funciona con lactasas libres por uno que funcione con lactasas inmovilizadas. Por otro lado, se pretende estudiar la viabilidad de sustituir un reactor industrial que este funcionando con un tipo de lactasa inmovilizada comercial, por el derivado sepabeads boronato epxido de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp.. Cepa T2.
5.5. Anlisis econmico de la sustitucin del proceso de produccin de leche baja en lactosa con lactasa libre, por un derivado inmovilizado de la misma enzima.
En este epgrafe se van analizar la prefactibilidad econmica de operar con lactasas inmovilizadas, en vez del proceso tradicional (lactasas libres). Al tratarse de un nuevo producto, realizamos un pequeo estudio de su cambio. Se asume que la inversin del nuevo proceso se realizar con fondos propios de la empresa y los dems gastos inherentes al proceso (luz, agua, operario) no se tengan en cuenta en los costes del proceso, una vez que estn amortizados desde la inversin inicial de todo el proceso industrial). La inversin inicial total de la planta fue de unos 60 millones de euros , 500 puestos de trabajo y una produccin anual de unos 400 millones de euros y unas ventas anuales entorno a los 180 millones de euros, con lo que el cambio se considera asumible amortizable talvez en menos de 1 ao. por la empresa y
Capitulo 5-Anlisis Econmico 98
5.5.1. Ventajas tecnolgicas de la utilizacin de la lactasa de Thermus sp, T2 en la produccin de leches bajas en lactosa.
La gran ventaja de la JMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., T2 en este proceso, es que, al ser una enzima termoestable, facilitar su aplicacin simultanea en los proceso de tratamiento trmico (pasterizacin y tratamiento microbiolgico) y el proceso de hidrlisis de lactosa de lectie. Al poseer, el derivado un tiempo de vida media muy superior la enzima soluble, tcnica e econmicamente reviste una importante ventaja, ya que la productividad del proceso se incrementa espectacularmente, ya que, los niveles de produccin se incrementan
considerablemente con el mismo dispendio de enzima soluble. Los costes adicionales relativos a la adquisicin de filtros (al ser todos los preparados enzimticos de p-galactosidasas comerciales impuros, se eliminan inmovilizndolas, ya que solamente inmovilizamos la totalidad de enzima de forma pura "en el soporte" con lo que, la cantidad de enzima en el reactor es mxima (volumtricamente, el tamao del reactor es muy pequeo). Ver grfica 3.11, capitulo 3. Con la utilizacin del derivado inmovilizado, se consiguen casi siempre una hidrlisis total de leche (al estar al derivado menos inhibido por los productos de la reaccin, que la enzima soluble (Ki por galactosa de K. Lactis, 43 mM; A.orizae 10,2 mM, (Mateo 1997, Tesina de Grado); en cuanto que el derivado boronato de la enzima de Thermus sp., T2, presenta una Ki por galactosa de 12,5 casi parecido al de la enzima de A.orizae (Ver tabla 4.3, del capitulo 4, de esta memoria).
5.6. Anlisis de mercado. Demanda del producto. La demanda actual de leches bajas en lactosa, est muy reducida, atendiendo al nmero todava incipiente de potenciales clientes. La produccin de este producto en Espaa es de muy reciente implementacin (aproximadamente, desde 1998), con lo que, todava no se dispone de capacidad logstica para satisfacer posibles volmenes de exportacin, siempre teniendo en cuenta los volmenes de exportacin de productos lcteos analizados en la tabla 4.4. Se puede catalogar este producto como en fase de crecimiento continuo.
5.6.1. Costes y precios
Como hicimos referencia al inicio de este capitulo, los nicos costes que asumiremos sern solamente aquellos relacionados con la adquisicin de la enzima, porque los dems costes propios del proceso se tendrn en cuenta como inherentes al mismo proceso industrial, (Ya sean, agua, electricidad, personal, y otros costes amortizables en el conjunto inicial de la inversin total de la planta.
Captulo 5 - Anlisis Econmico 99
As, el nico coste reseable, es el relacionado con el precio de la enzima y de los filtros para la purificacin de la misma. El precio medio de lactasas en el mercado rondan actualmente los 52 euros / L. 5.6.2. Descripcin del proceso productivo 5.6.2.1. Por cambio de tecnologa: Lactasa libre a derivados inmovilizados
La leche se recibe en camiones cisternas propios de la empresa, se almacena en tanques con capacidad de 5.000 litros, para su tamizado. Durante esta etapa la leche se somete a baja pasterizacin (65 C durante 15 segundos), seguida de la separacin de la leche de la nata. Con este tratamiento, se consigue igualmente un pequeo tratamiento microbiolgico. Una vez este pequeo tratamiento y separada por su contenido en grasas, se guarda en silos de gran capacidad, lista para entrar en el proceso industrial. De estos silos, la leche que no necesita aditivos especiales, va directamente a la seccin de tratamientos trmicos (UHT) y otra parte se trasvase en tanques con capacidad aproximada de 1500 litros cada uno para la produccin de leches especiales (con adicin de calcio, vitaminas etc). La lnea de produccin que no necesita aditivos y/ otros sistemas especiales, pasa directamente al proceso de UHT DIRECTO (inyeccin de vapor a 145 C). El volumen de leche destinado a leches especiales y leche enriquecidas, pasa por otros canales y finalmente al proceso UHT INDIRECTO (la leche pasa por cilindros calientes a temperatura de 145 C. Una vez que la leche deje la seccin del UHT, va directamente al sector de envasado, a excepcin de la leche para produccin de BAJA EN LACTOSA. Para producir leche baja en lactosa, la leche va directamente a una nueva seccin donde se le inocula un volumen aproximado de 100 |iL / L de enzima, tras ser filtrada en filtros de membrana con un dimetro de 0,2 [xm (de la marca PALL). la leche se almacena a temperatura ambiente durante
Posteriormente,
aproximadamente una semana para que el proceso de hidrlisis sea completo. La leche que pasa por el UHT DIRECTO, tras este paso, pasa por campanas extractoras o de vaco para retira el vapor caliente sometido durante su procesado.
5.7. inversin total del proyecto.
En la tabla 5.6, se presentan los costes totales adicionales de inversin. Asumiremos que toda la produccin realizada durante un ao, se venda a nivel nacional.
Insumos Lactasas libres Filtros Soportes**
cantidad /ao 10,5 kg 75 3*
Euros /kg 52 20 15
Euros /ao 546 1500 45
Tabla 5.6.- Coste anual de materias primas. *. La cantidad de soporte requerida depende esencialmente de las caractersticas mecnicas del mismo y de las propiedades qumicas de la enzima. **. Cuando de usa lactasa inmovilizada.
Las cantidades referidas en la tabla anterior, dependen del volumen de leche baja en lactosa producida durante un ao y que se supone que se venda el total de lo producido. La produccin anual de leche baja en lactosa usando lactasa libre, es de aproximadamente 750.000 litros (por cada litro de leche producido se consume 100 ^1 de enzima, y por cada 100 litros de leche producidos se gasta 1 filtro). Los costes totales de produccin al ao, ascienden a 2046 Euros. (Enzima + filtros)
5.8. Ingresos por ventas de la leche producida con enzima libre
Como el volumen de produccin no es significativo para el mercado mundial, se asume la venta del 100% de la produccin anual.
Produccin Producto anual
Precio /L (euros)
Ingresos anuales (euros)
Leche baja en lactosa Total Total de ingresos y gastos
750,000 litros
0,92
690.000 690.000
(690.000-2046 euros) total: 687.954 Euros
Tabla 5.7.- Ingresos anuales por costes del proyecto
5.9. Produccin de leche baja en lactosa por hidrlisis con un derivado de lactasa inmovilizada a soportes slidos preexistentes.
El primer factor a tener en cuenta para el cambio de proceso analizado anteriormente, es fundamentalmente la estabilidad del derivado con la temperatura, su tiempo de vida media y la cantidad de enzima que se pueda inmovilizar por cada mililitro de soporte. En la grfica 5.1, se puede observar que nuestro mejor derivado es completamente estable en las condiciones ensayadas: 70 C y pH 6,5, condiciones casi idnticas a las de la leche en proceso de pasterizacin. De los estudios realizados se ha inferido que el mismo pueda llegar a tener un vida media de casi 2 aos de uso. Como al procesar este derivado, se realizaron ensayos de capacidad de carga, vimos que el soporte admita casi el 100 % de la enzima ofrecida (aproximadamente 66 mg / mi de soporte), con lo cual, se han hecho derivados muy cargados enzimticamente y muy activos.
Este hecho permite, a la hora de su aplicacin, construir reactores muy pequeos (al ser muy activos, cargados y estables), con lo cual el ahorro en soporte es enorme.
Insumos Lactasas libres Soportes**
cantidad /ao 0,5 kg 3*
Euros /kg 52 15
Euros /ao 26 45
Tabla 5.8.- Coste inmovilizadas.
anual
de materias
primas,
cuando
se sustituye
el proceso
por
lactasas
Como comentamos, las propiedades tanto de la enzima como el propio soporte, permiten obtenerse derivados con 3 kilogramos de soporte y inmovilizada con 0,5 litros de lactasa. Si nuestro derivado tiene un tiempo de vida media de aproximadamente dos aos, la produccin anual se mantendra en 750.000 litros / ao. Como este derivado puede seguir funcionado durante dos aos aumentamos la productividad de nuestro producto.
Produccin Producto anual
Precio /L (euros)
Ingresos anuales (euros)
Leche baja en lactosa
1500,000 litros*
0,92
1.380.000 Total: 1.379.000
Total de Ingresos y gastos (1.380.000 - 74 euros)
Tabla 5.9.- Ingresos y gastos anuales durante la produccin de leche baja en lactosa usando un derivado estabilizado de sepabeads boronato y lactasa de Thermus sp., T2.
* La produccin anual de leche baja en lactosa, se duplica y consecuentemente los ingresos, al usar un derivado con una vida media de aproximada de 2 aos, al ser ei precio de lactasa soluble en el mercado idntico en todos los procesos.
5.10. Viabilidad industrial y valoracin econmica
Vamos a suponer que no existe riesgo de aplicar este proyecto, considerando que los potenciales clientes de este producto, estn debidamente fidelizados por la empresa, siendo as, el coste de oportunidad sera la rentabilidad alternativa obtenida, en caso de haber invertido esta cantidad monetaria en un activo sin riesgo durante el mismo tiempo de anlisis. Como criterio de evaluacin del proyecto se calculan los indicadores econmicos VAN (Valor Actual Neto) y TIR (Tasa Interna de Retorno), encontrando para ambos parmetros los valores de: Si consideramos el flujo de caja inicial (FCQ = 2046 euros y FCi_ flujo de caja despus de las ventas anuales, 687954 euros), y una tasa de actualizacin del 5%, el valor neto actualizado se determinara como: (Para el caso en que se debe decidir el proceso de lactasa inmovilizada ai proceso con lactasa inmovilizada).
VAN = FCo + FCi / 1 + r lo que implica que : VAN = - FCQ + F C I / 1 + r VAN (5%) = 653.148 Euros TIR = 96% Como se aprecia, la implementacin del proceso es completamente factible.
La figura 5.3 muestra el diagrama simplificado de un proceso industrial, que opera con lactasas (Thermus sp., T2) inmovilizada.
ESQUEMA DEL PROCESADO DE LECHE CON 6.GALACT0SIDASA DE THERMUS INMOVILIZADA
CISTERNAS PARA TAMIZADO
^^ BAJA PASTEURIZACIN ( 65*C)
ESTABILIZACIN
^^
LECHE OESNATADA LECHE SEMIDESNATADA LECHE ENTERA
s
s
I
LECHES SESP ESPECIALES {pequeos tanqucts capacidad 1500 L)
Enriquecidas con calck). Vitaminas...ate
7\"
procesado UTH
Figura 5.3. Procesado industrial de leche baja en lactosa por hidrlisis con lactasas (Sistema a implementar).
inmovilizadas
5.11. Produccin industrial de leche baja en lactosa, por sustitucin de un reactor con lactasa inmovilizada, por otro que opera con un enzima de mayores prestaciones tecnolgicas.
Se pretende estudiar la viabilidad econmica y tecnolgica, de un posible cambio de catalizador enzimtico que opera con lactasas inmovilizadas, por otro de idnticas caractersticas, pero con la diferencia de que es mas activo, ms estable (opera en condiciones de temperatura ms drsticas etc) y pos un tiempo de vida media superior al catalizador industrial de uso habitual. La cntrale de latte de Miln (Italia) utiliza un catalizador inmovilizado con lactasa de A.orizae confeccionado por la tambin casa comercial Italiana RECORDATI. Segn datos de la misma empresa, este derivado opera a 45 C , en un proceso de hidrlisis de lactosa en leche, teniendo un tiempo de vida til de aproximadamente 30 das. La grfica 5.1 representa el proceso de estabilidad
del derivado de la casa Recordati
comparado con el mejor derivado inmovilizado con la
IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., T2.
::$
80 -
1 60'
o
D D 40
ra > 20
t <
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Tiempo (horas) Boronato --- Recodati/Centrale de Latte de Miln
Grfica 5.1.- Estudio de la estabilidad de los derivados boronato y el derivado comercial en tampn Novo pH 6,5 a 70''C
(Recordati)
Se infiere que, nuestro mejor derivado llega a ser unas decenas de veces ms estable que el derivado de la casa comercial, con lo cual, es de suponer que, econmicamente, la utilizacin del derivado ms estable y con mayor tiempo de vida media, econmicamente los rendimientos sern mayores cuando se utilice el derivado boronato en relacin al comercial. Tambin se ta comprobado que los niveles de inhibicin, al operar con este derivado, eran mayores, con lo cual nunca se han podido alcanzar el 100 % de hidrlisis de lactosa, (Grfica 5.2). Partiendo de esta permisa y teniendo en cuenta que, el precio de las enzimas solubles en el mercado, tienen un precio mas o menos idntico (aproximadamente 52 Euros), es de suponer que la productividad de la operacin con el derivado sepabeads sea unas 23 veces superior al derivado comercial, siendo este mismo parmetro idntico al traducirlos en costes e ingresos econmicos. La grfica 5.2, representa el proceso de la reaccin de hidrlisis de lactosa al 5% cuando usamos, por un lado, el derivado sepabeads boronato , la reaccin alcanz el 100% de hidrlisis entorno a los 12 minutos (en las condiciones ptimas
de ensayo: 3 U de enzima / mi). En cambio, cuando se us el derivado comercial, en las condiciones ptimas para el mismo (3U /mi) y 35 C, al cabo de 30 minutos la reaccin se detuvo entorno al 89 % de hidrlisis.
100
Derivado Boronao
10
20
30
t (mini)
Grfica 5.2.- Estudio de la reaccin de hidrlisis de lactosa en una muestra de leche comercial (semidesnatada) con los derivados boronato (70C, tampn Novo pH 6,5) y derivado comercial (Recordati), (40C, tampn Novo pH 6,5)
En caso de que los productos obtenidos se tengan que aplicar al consumo de individuos con un alto valor de intolerancia, habra que encontrar mecanismos tendentes a completar la reaccin de hidrlisis, con el consecuente incremento en los costes de produccin. En el ejemplo siguiente, presentamos un pequeo anlisis de un ciclo de produccin de leche baja en lactosa a partir de las condiciones que se describen inicialmente. Si tomamos como punto de partida la ecuacin general de la velocidad del proceso de hidrlisis (capitulo 4), analizando todos los parmetros que estn implicados en el proceso qumico, (constantes de inhibiciones), tendramos: Inhibicin competitiva por el producto (P1).
E+
PÊP\
K=
E.S ES
E=
K.ES
K\ = ^^ÊPl EP\
= E. =^ EP\ = Kl
K.. S K\
E inhibicin competitiva por el producto (P2).
E + SÊSÊ
+P
K=
E.S ES = E.^ K2
E + P2^
EP2
K2 = ^ÊP2 EP2
ES +
P2ÊSP2
K'^ ^ ^ ^ => EP2S = EP2. EP2S K EP2S = E P2 K2
EP2 +
SÊP2S
KT^
ES.P2 EP2S
Por integracin de las ecuaciones anteriores, llegamos a la ecuacin general del proceso de iiidrlisis que, que tiene en cuenta, todos los parmetros implicitos en el proceso qumico.
^.X^^.^-\n{l-X)-So[^ K KKl 2
Haciendo uso
\K\
+ -^\x Kiy
+ \n{l-X) = ^ ^ (l-exp(-^J)) ' KKd

informtico, podemos simular el
de un pequeo
desarrollo
comportamiento de nuestro reactor, en las condiciones que se dan a continuacin: Concentracin del sustrato de partida: 146 mM Rendimiento de hidrlisis que se quiere alcanzar: 90% Concentracin de enzima requerida: 2000000 Ul =>120000 mmoles / hora El tiempo en horas El Volumen del reactor sera de: 1000 L Km= 6.6 mM K(1)=99mM K(2)=12.5mM K= 1(constant cataltica) Kd= 0.0003209 (considerando tiempo de vida media del derivado de 90 das El resultado de la operacin de nuestro reactor se resume en la tabla a continuacin.
Tiempo para cada Ciclos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ciclo (horas) 0.96 0.96 0.96 0.96 0,96 0.96 0.96 0.96 0.96 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96
Actividad enzimtica residual en el reactor (%) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Tiempo consumido en cada ciclo (horas) 0.96 1,92 2,88 3,84 4,80 5.76 6,72 7,68 8,64 9,60 10,56 11,52 12,48 13,45
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
0,96 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97 0,97
100 100
99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99
14,41 15,37 16,34 17,30 18,26 19,23 20,19 21,16 22,12 23,09 24,05 25,02 25,99 26,95 27,92 28,89 29,85 30,82 31,79 32,76 33,73 34,70 35,67 36,64 37,61 38,58 39,55 40,52 41,49 42,45
Atendiendo a esta consideracin, nuestro reactor funcionando ininterrumpidamente durante casi 42,5 horas (44 ciclos de produccin), producira un volumen de producto de aproximadamente 44 000 litros y una actividad residual del 99 % en el reactor. Esto tiene una enorme repercusin econmica en la cuenta de resultados de la empresa, ya que al aumentar la productividad a estos niveles y junto a los niveles de actividad enzimtica residual en el reactor, conllevara a un ahorro importante en materia prima con la consecuente ganancia en el volumen de negocios del este proyecto empresarial.
5.12. CONCLUSIONES
1.- Se ha realizado un pequeo estudio econmico, para determinar la viabilidad econmica y tcnica para el cambio del proceso tecnolgico, pasando de iactasa libre a
derivados inmovilizados, y segn los valores obtenidos (VAN y TIR), se pudo comprobar que el proceso es proclive al cambio.
2.- Tambin se ha podido corroborar estas mismas hiptesis, comparando los dos procesos en cuanto a estabilidad y actividad.
3.- Estos mismos parmetros han permitido realizar un pequeo estudio, para determinar la conveniencia del cambio en un proceso industrial que opera con catalizador inmovilizado comercial, por otro de mejores caractersticas tecnolgicas y consecuentemente econmicas.
4.- El desarrollo de este capitulo, ha permitido estudiar y comprender conceptos interesantes relacionados con temas econmicos, poder entenderlos mejor, relacionarlos con cuestiones meramente de reaccin qumica y con ellos poder decidir el tratamiento tcnico a dar en un proceso industrial.
5.- Tcnicamente se pueden seguir estudiando la improbable toxicidad de los soportes que se puedan romper a la hora de aplicarlos en procesos industriales. Un estudio futuro e interesante, sera estudiar nuevos sistemas para clonar esta protena en organismos considerados GRAS, (Una vez que, la aplicacin de protenas clonadas en E. coli, puedan conllevar a dudas de su aplicacin en la industria alimentara).
6.- En el futuro, se pueden realizar estudios de mejoras en las propiedades qumicas y bioqumicas de la protena, aplicando tcnicas de mutagnesis dirigida o al alzar y / clonando en microorganismos considerados GRAS. Esto conllevara a una mejora econmica del proceso, ya que la enzima obtenida tendr mejores prestaciones en trminos de estabilidad trmica.
7.- Un aspecto que pueda repercutir muy favorablemente en el cambio de tecnologa de los proceso actuales de produccin para el nuevo proceso que opera con lactasas inmovilizadas y mas estables, radica en que, los actuales procesos, requieren un tiempo de aproximadamente 7 das de almacenamiento de la leche, para completar el proceso de hidrlisis, repercutiendo enormemente en los costes econmicos (de almacenaje).
Discusin General y Conclusiones 108
DISCUSIN GENERAL Y CONCLUSIONES
EL CARCTER MULTI E INTER-DISCIPLINAR DE LA INGENIERA ENZIMATICA.
El desarrollo de diferentes posibilidades para la puesta a punto de un proceso industrial de qumica de alimentos requiere, desde el punto de vista de su aplicabidad final, un
planteamiento bastamente complejo y enormemente multidisciplinar como el que hemos intentado abarcar en la presente Tesis Doctoral. As pues hemos de buscar en la naturaleza nuevas enzimas con mejores posibilidades para el desarrollo del proceso qumico final, hemos de modificar, mediante tcnicas de biologa molecular, estas enzimas para que se puedan manejar y purificar mas fcilmente, hemos de disear diferentes protocolos de purificacin de la enzima para adaptarnos a las tecnologas existentes en las empresas destinatarias, hemos de disear diferentes protocolos de
inmovilizacin que nos permitan diferentes alternativas tecnolgicas (mejorar mas la estabilidad de la enzima, purificar e inmovilizar la enzima en un solo paso, reusar los soportes, etc, etc.), hemos de hacer un estudio integral de la reaccin de inters industrial. De este modo, an siendo esta qumica enzimtica de alimentos un problema exclusivo de qumica industrial su desarrollo conlleva el empleo integrado de multitud de tcnicas y disciplinas cientficas: desde la microbiologa hasta la ingeniera qumica convencional pasando tambin por el empleo de tcnicas cromatogrficas, de tcnicas de interaccin enzima soporte, tcnicas de modificacin qumica de enzimas inmovilizadas, estudios de inactivacin y estabilizacin de enzimas, ingeniera de la reaccin enzimtica (actividad, inhibiciones, estabilidad, efecto del
biocatalizador..), etc.
As pues esta Tesis ha incluido un porcentaje importante de multidisciplinaridad todo ello enfocado al diseo de nuevos y mejores procesos de hidrlisis enzimtica de lactosa en leche y suero de queseras. Para ello en esta Tesis hemos trabajado en :
a.- construccin de nuevos plsmidos e insercin en Escherchia coH b- optimizacin de la produccin de la enzima en Escherchia coli c- purificacin de enzimas recombinante por tcnicas de cromatografa I MAC d.- anlisis de protenas por tcnicas de ultracentrifugacin analtica e.- inmovilizacin covalente de enzimas sobre una gran variedad de soportes f.- estabilizacin de enzimas por inmovilizacin covalente multipuntual g.- estabilizacin de enzimas multimricas por entrecruzamiento con dextrano-aldehdos h.- inmovilizacin no covalente de enzimas sobre nuevos intercambiadores inicos i.- purificacin, inmovilizacin y estabilizacin de enzimas recombinantes en un nico proceso j . - hidrlisis total de altas concentraciones de lactosa k.- cintica de la hidrlisis de lactosa por p-galactosidasas: inhibicin por los productos de la reaccin
I.- relacin entre ingeniera de la reaccin e ingeniera de biocatalizadores
Incluso cada una de las diferentes tcnicas multidisciplinares a emplear en Ingeniera Qumica de Procesos Catalizados por Enzimas (Biotecnologa Enzimtica) requiere a su vez un importante planteamiento interdisciplinar. Cada experimento individual implica una planificacin donde intervienen simultneamente muy diferentes disciplinas cientficas. A modo de ejemplo, en esta Tesis nos hemos planteado el desarrollo de una nica tcnica que nos permita purificar, inmovilizar y estabilizar nuestra enzima de inters industrial. Para ello hemos tenido que ser capaces de:
a.- determinar la tendencia a la agregacin de la enzima pura por ultracentrifugacin analtica, b.- modificar una enzima por ingeniera gentica, c - disear nuevos soportes heterofuncionales, d.- discriminar entre el mecanismo de adsorcin de protenas naturales y protenas recombinantes (6His) sobre matrices con quelatos metlicos, e.- conocer el mecanismo de inmovilizacin multipuntual entre una enzima y un soporte con grupos epxido, h.- bloquear correctamente un soporte hidrofbico.
LA INGENIERA Y TECNOLOGA ALIMENTOS
ENZIMTICA
EN LA INDUSTRIA QUMICA DE
La aplicacin industrial de un proceso enzimtico puede variar notablemente de una factora a otra. Las facilidades tecnolgicas existentes o las no-existentes pueden modificar notablemente las condiciones y los sistemas donde ha de prepararse el biocatalizador y realizarse la reaccin. Por otro lado, un biocatalizador (lactasa inmovilizada y altamente estabilizada) como el aqu propuesto y diseado puede tener aplicabilidad en un gran nmero de procesos: hidrlisis de lactosa en leche, hidrlisis de lactosa en suero de queseras, reacciones de transglicosilacin para la obtencin de prebiticos (pe. Galactooligosacaridos, etc). Incluso cada uno de los procesos (pe., la hidrlisis de lactosa en leche) no tiene por qu hacerse de un modo idntico en diferentes factoras: la hidrlisis de lactosa en leche ha de acoplarse a un proceso global de produccin industrial de leche que incluye etapas de homogenizacin, centrifugacin, esterilizacin, envasado, etc. Como cada factora tiene las plantas diseadas de un modo diferente, la introduccin de un biocatalizador de pgalactosidasa para hidrolizar la lactosa de un porcentaje de la produccin de leche en una factora posiblemente tenga que realizarse de un modo diferente para cada de ellas.
Por todos estos motivos esta Tesis ofrece una variedad de posibilidades de produccin de la enzima, de purificacin, de inmovilizacin, de modificacin adicional, etc para que finalmente cada factora y cada proceso puedan ser individualizados del modo mas conveniente..
Finalmente y a modo de resumen quisiera exponer las principales conclusiones de la presente Tesis Doctoral:
1.- Se han diseado experimentos de ingeniera gentica para producir, utilizando Escherichia coH como microorganismo fiospedante, una enzima p-galactosidasa originaria de un micro-
organismo termfilo {Thermus sp., cepa T2) conteniendo una cola de 6 His adicionadas en su extremo amino terminal para facilitar su posterior purificacin e inmovilizacin.
2.- Para ello se ha construido un nuevo plsmido pBGT3 que contena el vector de expresin comercial, pTrcHisB a partir del plsmido pBGT1 que haba sido diseado con anterioridad (Vian y col, 1998) y que contenia el gen que codificaba la expresin de la enzima pgalactosidasa de Thermus sp., cepa 2.
3.- El nuevo plsmido se secuenci y despus de comprobar que contena tanto la secuencia de pTrHisB como la de pBGT1 se insert en clulas transformadas de la cepa Escherichia cof\ MC1116 para sobre-producir la enzima recombinante de inters.
4.- A causa de su termoestabilidad, la (B-galactosidasa recombinante se poda semi-purificar parcialmente por simple tratamiento, a alta temperatura, del extracto de protenas de E.coli MC1116 transformada. Este protocolo de purificacin es muy sencillo y aunque no promueve la purificacin total es muy til para algunas aplicaciones industriales de la enzima, cuando no se requieren niveles elevados de purificacin.
5.- La purificacin total de la enzima se consigui utilizando la cromatografa de afinidad sobre quelatos metlicos (CROMATOGRAFA IMAC). Las mejores purificaciones (las mas sencillas y mas eficaces) se lograron utilizando matrices cromatogrficas y protocolos de purificacin diseados a medida. De este modo evitamos tanto la adsorcin inespecfica de las protenas naturales contenidas en el extracto celular como la adsorcin demasiado fuerte de nuestra enzima de inters (una enzima multimrica con varias colas de His por molcula de enzima). Las nuevas matrices contenan una baja densidad de quelatos de nquel o de cobalto y la adsorcin selectiva de nuestra enzima se lograba aadiendo 25 mM de imidazol en la solucin de adsorcin. En estas condiciones solo la enzima de inters se adsorba sobre la columna de purificacin. La eluccin de esta enzima casi completamente pura se realizaba lavando la matriz con una disolucin que contena una concentracin de imidazol de 100 mM.
6.- Estudios por Ultracentrifugacin Analtica de la enzima pura demostraron la formacin de olgomeros de muy alto peso molecular que dificultaban en gran media su posterior proceso de inmovilizacin en soportes porosos para su utilizacin industrial.
7.-
Se disearon diferentes protocolos de inmovilizacin y estabilizacin de la enzima
p-galactosidasa por inmovilizacin multipuntual sobre diferentes soportes epxido heterofuncionales. Los mejores derivados (en trminos de actividad y estabilidad) se obtuvieron cuando la enzima se inmovilizaba sobre soportes conteniendo una gran concentracin de grupos epxido y una pequea concentracin de grupos boronato capaces de dirigir la primera inmovilizacin de la enzima sobre el soporte. Estos derivados de p-galactosidasa sobre resinas epxido-boronato conservaban el 100% de actividad cataltica despus de 75 horas de incubacin a 70 C y pH 6.5. Por el contrario la enzima soluble pura tenia una vida media (50 % de actividad residual) de menos de 10 horas y los derivados comerciales de otras p-galactosidasas perdan mas del 90 % de actividad despus de 1 hora de incubacin en esas mismas condiciones experimentales.
8.- A pesar de esta interesante estabilizacin los mejores derivados de esta p-galactosidasa termo-resistente no tenan la estructura cuaternaria completamente estabilizada y de hecho liberaban subunidades cuando se hervan en presencia de SDS. Para estabilizar la estructura cuaternaria se disearon modificaciones qumicas de la enzima inmovilizada adicionales con dextranos y de este modo logramos estabilizar completamente la estructura cuaternaria de nuestra enzima y la de cualquier traza de cualquier otra protena de Escherichia coH que pudiese estar inmovilizada sobre los mismos soportes. Estos derivados no provocaran, en ninguna condicin experimental la liberacin de ninguna subunidad de ninguna protena en los alimentos que estn siendo tratados por estos biocatalizadores. Incluso en el caso de que algn fragmento de derivado se incorporara al alimento, al estar las protenas dentro de un slido poroso y ser los enlaces de la enzima y el soporte y el polmero amino secundarios, no se podr producir la liberacin de subunidades ni al alimento ni al consumidor.
9.- Teniendo en cuenta los problemas de hiper-agregacin que presenta la enzima pura y concentrada, diseamos un nuevo protocolo de inmovilizacin que nos permiti purificar, inmovilizar y estabilizar la enzima en un solo proceso a partir de extractos diluidos e impuros. Para ello utilizamos soportes epxido hetero-funcionales conteniendo una pequea
concentracin de quelatos metlicos y una gran concentracin de grupos epxido.
10.- Teniendo en cuenta la elevada termo-estabilidad de la enzima nativa diseamos tambin protocolos de inmovilizacin no covalente por adsorcin de la enzima sobre soportes rgidos (resinas epoxi-acrilicas) recubiertos de una pelcula de poli-etilenimina que contena una elevadsima concentracin de aminos ionizados (hasta 1000 Êqs./ml). La enzima se adsorba
muy fuertemente sobre estos soportes e incluso mostraba una termoestabilidad bastante mayor que la enzima soluble.
11.- Se estudi la hidrlisis de lactosa en agua, en leclie y en suero de queseras utilizando tanto la enzima soluble como diversos derivados inmovilizados. Al utilizar la enzima soluble como biocatalizador, el curso de la reaccin se ralentizaba mucho a medida que aumentaba el grado de hidrlisis debido a la fuerte inhibicin de la enzima por los productos de la reaccin (fundamentalmente galactosa y en menor medida glucosa). Afortunadamente, algunos derivados presentaban problemas de inhibicin mucho menores y nos permitan alcanzar muy fcilmente la hidrlisis total de lactosa tanto en leche (pH 6.5) como en suero de queseras (pH 5.0).
12.- A partir de las propiedades qumicas y bioqumicas de la IMAC/p-galactosidasa, se ha realizado un pequeo estudio econmico, en cuanto a la viabilidad de posibles cambios tecnolgicos en proceso industriales que operan con lactasas comerciales libres (cambio de procesos con lactasas libres procesos que operen con lactasas inmovilizadas). Los parmetros de rentabilidad econmica obtenidos, indicaron la factibilidad de estos mismos cambios.
Bibliografa 113
Andrew P. Bakken; Charles G. Hill, Jr and Clyde H. Amundson. 1992. Hydrolysis of Laclse in Skim Milk by Inmobilized p-galactosidase {Bacillus Circulans). Biotechnology and
Bioengineering, Vol 39, 408-417.
Anspach, F.
B.
1994. Silica-based metal chelate affinity
sorbents.
Preparation
and
characterlzation of iminodiacetic acid affinity sorbents prepared va different immobilization techniques. Journal of Chromatography, A 672, 35-49.
Application of Yeast Lactases- a Reviw. Novo Nordisk Bioindustrial S.A. April 1979.
Aragn, J. J.; Caada, F. J.; Fernndez-Mayoralas, A.; Lpez, R.; Martn-lomas, M. y Villanueva, D., 1995. Procedimiento enzimtico de obtencin de p-D-galactopiranosil-D-xilosas utilizables para la evaluacin diagnstica de lactasa intestinal. Patente Espaola n 9502185.
Armisn P.;
Mateo C ; Corts E.; Jos L. Barredo, Francisco Salto, Bruno Diez, Lorenzo
Rods; Garca, J.L.; Fernndez-Lafuente R.; Guisan J.M. 1999. Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acyiase on tailor-made metal chelate supports. Journal of Chomatography A, 848,61-70.
Bahl, O. M. P, and
AgrawaI, K.M.L. Glycosidases of Aspergillus niger. Purification and 1969.The
Characterization of a- and p-galactosidases and p-N-Acetyl-Glucosaminidase. Journal of Bioiogical Chemistry., Vol. 244, N.11., 2970-2978.
Bassilis Gekas and Miguel Lpez - Leyva.1985. Hidrlisis of Lactose: A literature Review. Divisin of Food Engineering. University of Lund. Alnarp. Sweden. Process Biochemistry.
Berger, J.L; Lee, B.H.; and Lacroix, C. Identification of new enzyme activities of several strains of Thermus species. 1995. Appl. Microbioiogy Biotechnoi., 45, 81-87 .
Berger, J.L.; Lee, B.H.; and Lacroix, C. 1997. Purification , properties and characterization of a high-molecular-mass p-galactosidase isoenzime from Thermus aquaticus YT-\. Biotechnology Applaied Biochemystry, 25, 29-41.
Birge, S. J.; Keutmann, H. T.; Cuatrecases, P. and Whedon, G. D. 1963. Osteoporosis, intestinal lactase deficiency and low dietary calcium intake. N. Eng!. Journal . Med. 276, 445448.
Boon, M.A; Janssen, A.E.M;. van 't Riet, K.1999. Eeffect of temperature and enzyme origin on the enzymatic synthesis of oligosaccharides. Enzyme and Microbial Tecnhology, 26, 271-281.
Bibliografa 114
Bradford, M. M. 1976. A rapid and semsitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding. Anal. Biochem.72. 248-254.
Brealey, R. A. and Myers, S. C. 1998. Fundamentos de financiacin empresarial, Me Graw Hill.
Bullock, L. 1989. Immobilization enzymes. Education in chemistry, Nov., 179-182.
Cabaille, D. and Combes, D. 1995. Characterization of p- galactosidases from Kluyveromyces lactis. Biotecnol. Appl. Biochem, 22, 55-64.
Caredu, P. 1977. Aplicazioni del latte di idrolizato in pediatra. Latte, 2, 523-527.
Chakraborti, S.; Sani, R.K;
Banerjee,
U.C. and Sobti, R.C. 2000. Purification and
characterization of a novel p-galactosidase from Bacillus sp MTCC 3088. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 24, 58-63.
Chen, Josiane; Annie Brevet; Mary Lapadat-Tapoisky; Sylvian Blanquet; and Pierre Plateau. 1994. Properties of the Lysyl-tRNA Synthetase Gene and Product from the Extreme Thermophile. Thermus thermophilus. Journal of Bacteriology,May.1994, Vol 176, N9, 26992705.
Chong, S. R.; Merscha, F. B.; Comb, D. G.; Scott, M. E.; Landry, D.; Vence, L. M.; Perler, F. B.; Benner, J.; Kucera, R. B.; Hirvonen, C. A.; Pelletier, J. J.; Paulus, H.; and Xu, M. Q. 1997. Single-column purification of free recombinant proteins using a self-cleavable affinity tag derived from a protein splicing element. Gene, 192, 271-281
Ghrayeb, J. e Inouye, M. 1984. Secretion cloning vectors in Escherichia coli. EMBO J. 3, 24372442.
Coolbear, T.; Daniel, R. M;
and Morgan, H.W, 1992. The Enzymes from Extreme
Thermophiles: Bacterial Source, Thermostabilities and Industrial Relevance. Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, Vol.45,58-98.
Cowan, D.A. Daniel, R.M.; Martin, A.M and Morgan, H.W. 1984. Galactosidase from an Extreme thermophilic VoLXXVI, 1141-1145.
Some Properties of p-
Bacterum. Biotechnology and Bioengineering,
Cummings, J. H.; Roberfroid, M. B.; and members of Pars Carbohydrate Group. Andersson, H.; Barth, C ; Ferro-Luzzi, A.; Ghoos, Y.; Gibney, M.; Hermonsen, K.; James, W.P.T.; Korver,
Bibliografa 115
O.; Larion, D.; Pascal, G.; and Voragen A.G.S.1997. A new look at dietary carbohydrates : chemistry, physiology and health. European Journal of Clinical Nutrition, 51, 417-423.
Cupples, C.G.; Miller, J.H. and Huber, R.E.1990. Determination of the roles of Glu-461 in pgaiactosidase (Escheriachia col) using site-specific mutagenisis. Biol. Chem. 265, (10), 55125518.
Daniel, R.M; 1996. The upper limits of enzynne thermal stability. Enzyme and Microbial Technology, 19, 74-79
Demchenko, A. P. 1996. Ultraviolet Spectroscopy of Protens. Springer- Vertang, Berln.
DIGuan, C ; Li, P.; Riggs, P. D.; and Inouye, H. 1988. Vectors that faciltate the expression and purfcation of foreign peptides n Escherichia coli hy fusin to maltose-bnding proten. Gene , 67,21-30
Donald E. Trmbur;
Kevn R. Gutshall;
Prema, P.; and Jean E. Brenchiey. 1994.
Characterization of a Psychrotrophic Arthrobacter Gene and Its Cold-Active p-galactosidase. Applied and Environmental Microbology, Dec. 1994, Vol 60 N12, .4544-4552.
Durrant, I.; and McFarthng, K. G., 1990. The applcation of enhanced chemlumniscence to menbrane- based nunlec acd detecton. Botechnques, 8, 564-570.
Edwards, R. A.; Cupples, C.G; and Huber, R.E., 1990. Site specfic mutants of
p-
galactosdase show that tyr-503 s unmportant in Mg^* bndng but that Glu461 is very mportant and may be a ligand to Mg^*. Bochem. Biophys. Res. Commun.171,33-37
Estrada, P.; IVIata, I.; Domnguez, J.M.; Castilln, M.P.; and Acebal, C. 1990. Kinetics mechansm of p-Glucosidase from Trchoderma reesei QM 9414. Bochimica et Bophysca Acta, 1033,298-304.
Extremo, R.J.; Garca, M.J.; Olavaria, M.S.; Pelez, M.T. y Casado P. 1992. Leches lquidas modificadas .Modificaciones de los contenidos en protenas, lactosa y minerales. Master en Tecnologa Lechera del Departamento de qumica de la universidad de Cantabria. ILE. Mayo 1992.
Fanning, S., Madeine Leahy and David Sheehan. 1994. Nucleotide and deduced amino acid sequences of Rhzobium melHoti 102F34 lacZ gene: comparison with prokariotic pgalactosidasse and human p-glucuronidase. Gene, 141, 91-96.
Bibliografa 116
Fernndez Lorente, G. Hidrlisis Enantio-Regioselectiva de Esteres Quirales y Poliesters Catalizada por Lipasas Adsorbidas a Soportes Hidrofbicos. Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad Complutense Madrid 2000.
Fernndez-Lafuente, R. Cowan, D. A. and Word, A. P. P. 1995 A. Hyperstabiization of a thermophilic sterase by multipoint covalent attacment. Enzyme Microb. Technol. , 17, 366-372.
Fernndez-Lafuente, R.; Rosell, C. M.; Rodrguez, V.; and Guisan, J. M. 1995 B. Strategis for enzyme stabiiization by intramolecular crossiinking with bifuntional reagents. Enzyme Microb. Technol., 17,517-523.
Fernndez-Lafuente, R. and Guisan, J.M. 1998. Enzyme and proten enginniering via immobilization and post-immobilization techniques. Recent Res. Devel. And Bioeng, 1.
Fernndez-Lafuente, R.; Rodrguez V.; and Guisan, J.M. 1998. The coinmobilization of D-amino acid oxidase and catalyse enables the quantitative transformation of D-amino acids
(D-phenyalanine) into a-Keto acids (phenylpyruvic acid) 1998. Enzyme and Microbial Technology , 23 , 28-33.
Fernndez-Lafuente, R.; Rodrguez, V.; Mateo, C ; Penzol, G.; Hernndez-Justiz, O.; Irazoqui, G.; Villarno, A.; Ovsejevi, K.; Francisco Batista; Guisan. J.M. 1999. Stabiiization of multimeric enzimes via immobilization and post-immobilization techniques. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 7, 181-189.
Frangois Morgan; Gwnaie Henry ; Yvon Le Grat; Daniel Moll. 1999. Resstanse of plactoglobulin-bound lactose to the hydrolysis by p-galactosidase. International Dairy Journal, 9, 813-816.
Gibson, G. R.; and Roberfroid, M.B. 1995. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. Journal of Nutrtion,125, 1401-1412.
Grigoriy Chaga; Dmitry E. Bochkariov; George G. Jokhadze; Jennifer Hopp; Paul N.; 1999. Natural poly-histidine tag affinity for purification of recombinant proteins on cobalt(ll)carboxymethylsapartate crossiinked agarose. Journal of Chromatography A, 864. 247-256.
Guisan, J.M.; Bastida, A.; Cuesta, C ; Fernndez-Lafuente, R.; and Rosell, C.M. 1991. Immobilization-stabilization of chymotrypsin by covalent attachment to aldehyde agarose gels. Biotechnol. Bioeng. 39, 75-84.
Bibliografa 117
Guisan, J.M.; Penzo, G.; Armisn, P.; Bastida, A.; Blanco, R.M.; Femndez-Lafuente, R.; Garcia-Junceda, E. 1997. immobilization of enzymes actino on macromoiecuiar substrates: reduction of steric problems. En: Bicl<erstaff, G.F.(ED). Metliods in Biotechnoiogy 1, immobilization of enzymes and calis. Humana Press, Totowa, NJ. 261-276.
Guisan, J.M.; Bastida, A.; Balnco, R.M.; and Fernndez-Lafuente, R. 1997 A. Immobilization of enzymes on gioxil-agarose: Strategies for enzyme stabilization by multipoint attachment. En: immobilization of Enzymes and cells. 1, 277-287. (Ed: Gordon, F.) Editorial: Bickerstaff. Humana Press Inc.
Guisan J.M:; Polo, E.; Agudo, J.; Romero, M.D.; Alvaro, G. and Guerra, M.J. 1997 B. Immobilization-stabiiization of termolysin onto activated agarose gels. Biocatal. Biotransf. 15, 159-173.
Guisan J.M.; Gregorio Alvaro; Arturo Tagliani.1993.
Fernndez-Lafuente R.; Cristina M. Roseil; Garca, J.L. and of Heterodimeric Enzime by Multipoint Covaient
Stabilization
Immobilization: Penicillin G Acylase from Kluyvera citrophila. Biotechnoiogy and Bioengineerin. 42, 455-464.
Guisan, J.iVI. 1998. Aldehide-agarosa geis as activated supports for Immobilization-stabiiization of enzymes . Enzyme and Microbial Technology, 10, 375-382.
Gupta, M.N., 1991. Thermostabilization of proteins. Biotechnol. Appl. Biochem. 14,1-11.
Gutshall, K.R.; Donald E.; Trimburg, Jodie J. Kasmir and Jean E. Brenchley.1995. Analysis of a Novel Gene and p-galactosidase Isozyme from a Psychrotrophic Arthrobacter isolate. Journal of Bacterology, Apr.1995, 1981-1988
Gutshall, K.R.; Karen Wang; and Jean E. Brenchley. 1997. A Novel Arthrobacter
p-
galactosidase with Homology to Eucaryotic p-galactosidases. Journal of Bacteriology , May 1997,3064-3067.
Hemdan, E.S.; y Porta, J. 1985. Development of immobilized Metal Affinity Chromatography. II. Interacin of amino acids w/ith immobilized nickel iminodiacetate. Jouranl of Chromatography, 323, 255-264.
Herrchenm, M.; and Legler, G. 1984: Identification of an esential carboxylate group atthe active site of lacZ p-galactosidase from Escherschia coli. Eur. Journal of Biochemystry, 138, 30843095.
Bibliografa 118
Hirata, H.; Fukazawa, T.; Negoro.S.; and Okada, H., 1986. Structure of a p-galactosidase gene of Bacillus sterarothermophilus. Journal of Bacteriology,166, 722-727.
Hirayama.M.; Sum, N.; and Hidaka, H.1989. Purification and properties of a fructooligosacaride-producing p-fructo-furanosidase from Aspergillus niger ATCC 20611. Agricultural Biological Chemistry, 53,667-673.
Hochuli, E.; y col. 1988. Blo/Tecnhology 6., 1321.
Hochuli, E.; Bannwarth,W.; Dobeli.H.; Gentz.R.; and Stuber, D.1988. faciltate purification of recombinant BioteTchnology , 6 , 1321-1325.
Genetic approach to adsorbent.
proteins with a novel metal chalate
Hocliuli, E.; Dbell, H.; and Schaclier, A. 1987. New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine-residues. Juornal of Chromatography. 411, 177-184.
Inoye, S. e Inoye, M. 1985. Up-promoter mutations in Ipp gene of Escherchia coli. NucleicAcids. 13,3101-3110.
irazoqui, G.; Villarino, A.; stability of Escherchia
Francisco Batista-Viera and Beatriz M. Brea. 1998. Activity and coli p-galactosidase in cosolvent systems.1998.Biotectinoiogy
Teciiniques, Vol 12, N12, 885-888.
Ishiguro, M.; Kaneko, S.; Kuno, A.; Koyama, S.; Park, G.G.; Sakakibara, Y.; Kusakabe, I.; Kobayashi, H. 2001. Purification and Characterization of ttie recombinant Thermus sp. Strain T2 alpha-galactosidase expressed in Escherchia. Coli. "Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology" N.R. Krieg (Ed) Vol.1, 333-337.
Jadwiga Maciu'nska; Beata Czyz and Jzef Synowiecki. Isolation and some properties of pgalactosidase from the ttiermophilic bacterium Thermus thermophilus. 1998. Food Chemistry, Vol. 63., 4, 441-445.
Janknecht, R.; de Martynoff, G.; Lou, J.; Hispskind, R. A .; Nordheim , A.; and Stunnenberg, H. G.1991. Rapid and efficient purification of native histidine-tagged protein expressed by recombinat vaccinia virus. Proc. Nati. Acad. Sci. USA,88, 8972-8976.
Jenness, R. and Koops, J. 1962. Preparation and Properties of a Sait Solution which Simulates Milk Ultrafiltrate. Nederlands Melk- en Zuiveltijdschrift. The Netherlands Milk and Dairy Journal. Vol 16., 3.
Bibliografa 119
John B. Moore; Peter Markiewicz and Jeffrey H. Miller.1994. Identification and sequencing of the Thermotoga martima lac Z gene, part of a divergently transcribed operon.Gene, 147, 101106.
Jost, Bernard; Jean-Luc ViJotte; Isabeiie Duluc; Jean-Luc Rodeau ; and Jean Noel Freund. 1999. Production of low-lactose milk by ectopic expression of intestinal Jactase in the mouse mannmary gland.1999. Nature Biotechnology, 17, 160-164.
Katchaiski-Katzir, E. 1993. Immobilized enzymes ieaming from past successes and failures. TIBTECH. 11,471-478.
Karen R. Silver; Kenneth C. Keiler; and Rober T. Sauer. 1992. Tsp: A Tail-specific protease the selectively degrades proteins with nonpolar C termini. Proc. Nati. Acad. Sai.USA. Vol, 89, 295-299, January 1992. Biochemistry.
Karin Piller;
Roy M. Daniel;
Helen H. Petach. 1996. Properties and stabilizatlon of an
extracellular a-glucosidase from the extremely thermophiiic archaebacteria Thermococcus strain AN1: enzyme activity at 130C. Biochimica et Biophysica Acta 1292, 197-205
Kess L. M. C. Franken; Hoebert S. Hiemstra; Krsta E. van Meijgaarden; Yanri Subronto; J. den Hartigh; Tom H. M. Ottenhoff; and Jan W. Dhjfhout. Purificaton of His-Tagged Proteins by Immobilized Chelate Affinity Chromatography: The benefits from the use of organic sovent. 2000. Protein Expression and Purification, 18, 95-99.
Kitahata, Simuo; Koji Har; Koki Fujita; Hirofumi Nakano; Nobuhiro Kuwahara; and Kyoko Koizumi. 1992. Acceptor Specificity of Cyclodextrin Glicosyltransferase from Bacillus
stearothermophilus and Synthesis of a-D-Glucosyl Bioscienc. Biotechnology Biochemycal, 56, 1386-1391.
0-p-D-galactosyl-(1->4)-p-D-glucoside.
Klivanov, A.IVI. 1983. Immobilized enzymes and cells as practical catalysts. Science 219, 722727.
KotwaI, S. M.; Gote, M. M.; Sainkar, S. R; Khire, J. M. 1997. Production of a-galactosidase by thermophiiic fungus Humicola sp. In soid-state fermentation and its application in soyamilk hydrolysis.Process Biochemistry Vol.33, N3, 337-343.
Koyama, Y.; Hoshino,T.; Tomizuka, N; and Furukawa, K. 1986. Genetic Transformation of the Extreme Thermophile Thermus thermophilus and the other thermus spp. Journal of Bacteriology ,166,338-340.
Bibliografa
120
Koyama, Y.; Okamoto, S.; and Furukawa, K. 1990. Cioning of a y p-galactosidase genes from an extreme thermophile, Thermus strain T2, and their expression in Thermus Applied Environmental Microbiology., 56, 2251-2254. thermophilus.
Kristina Khier; Andrs Veide and Sven-Olof Enfors. 1991. Partition of p-galactosidase fusin proteins in PEG/potassium phosphate aqueous two-phase systems. Enzyme Microb. Techno!., 1991, Vol.13, 204-209.
Kuntz, L. A . 1993. Dairy enzymes : " The biochemical benefit". Food Prod. Des. 3, 59-72
Kurt, G.l. Niisson; disaccharide
Anna Eliasson; Hefeng Pan and Mattias Rotiman.1998. Synthesis of p-N-acety-D-hexosaaminidase, p-D-galactosidase and
empioying
p-D-glucurondase. Blotechnology Letters, 2 1 : 1 1 - 1 5 .
Ladero, M. 1999. Hidrlisis de lactosa con p-gaiactosidasas de Kluyveromyces
fragilis y de
Escherichia coli. Tesis doctoral. Facultad de Qumica. Universidad Complutense de Madrid.
Lasa I.; and Berenguer, J. 1993. Tliermophilic enzimes and tfneir bioteclnnological potential. MICROBIOLOGA SEM 1993, 77-89, MINIREVIEW.
Lasa, I.; De Grado, M.; De Pedro, M.A., and Berenguer, J. 1992. Development of Escherichia Shuttie Vectors and Their Use for Expresin of the Clostridium
Thermusce/A
thermocellum
Gene in Thermus thermophilus.
Journal of Bacterioogy, Oct.1992, 6424-6431.
Laue,
T.
M.;
Shah,
B.
D.;
Ridgeway,
T.
M.;
and
Pelletier,
S.
L.
1992.
Analytical Chemistry.
Utracentrfugacn in Biochemistry and Poymer Science . Roya Society of Cambridge, Harding, S.E. Rowe, A.J. and Horton,J.C.editores.
Legler, G.; and Herrchen, M.; 1981. Active site-directed inhibition of galactosidases by conduritol C epoxides(1,2-anhydro-epi and neo-inositol). FEBS LetL1981, 135 (1), 139-144
Lehninger, A.L. Las Bases Moleculares de la Estructura y Funcin Celular. Bioqumica. Segunda Edicin. Ediciones Omega, S.A. Barcelona, 1982.
Linko, S.; Enwaid, S.; Y-H Zhu,; and Myr-Mkinen, A. 1998. Production of p-galactosidase by Streptococcus salivaus subsp thermophilus 11F. Journal of Industrial Microbiology and
Blotechnology, 20, 215-219.
Bibliografa 121
Ljungquist, C ; Breitholtz, A.; Brink-Nilsson, H.; IMoks, T.; Uhin, M.; y Nisson, B.1989. Immobilization and affinity purification of recombinant proteins using peptide fusions. European Journal of Biochemsistry, 186, 563-569.
Loveiand, J.; Kevin Gutshall; Jodie Kasmir;
Prema, P.; and Jean E. Brenhley. 1994.
Characterization of Psychrotrophic Microorganisms Producing p-galactosidase Activities. Applied and Environnriental IVlicrobioiogy, Enero. 1994, 12-18
Luisa, M. F.; De Pedro, M.A.; and Berenguer, J. 1991. Cloning and Expresin in Escherchia coli of tfie Structura Gene Coding for the IVlonomeric Protein of tlie S Layer of Thermus thermophilus HB 8. Journal of Bacteriology, Sept. 1991, 5346-5351.
Mationey, R.R.; and
Adamchuk, C. 1980. effect of iVlilk Constituents on the Hydroiyiis of
Lactose by Lactase From Kluyveromyces fragilis. Journal of food Science, Vol. 45, 962-968.
Mahoney, R.R.; and WInitake, J.R. 1978. Purification and Physicochemical Propertis of P-galactosidase From Kluyveromyces fragilis. Journal of Food Science, Vol.43, 584-591.
Manan, D.M.A; Abd Karim; Kit, A. W. K. 1999. Lactose content of modified enzyme-treated "dadili". Food Chemistry, 65, 439-443.
Manzanares, P.; Leo H. De Graaff; and Jaap Visser. 1998. Characterization of galactosidases from AsperglHus Nfger: Purification of a novel a-galactosidase activity. Enzime and Microbial Technology , 22, 383-390.
Martinez-Bilbao, M.; Holdsworth, R. E.; Eduards, L. A.; and Huber, R. E.; 1991. A highiy reactive p-galactosidase {Escherchia col) resulting from a substitution of an aspartic acid for Gly-794. Journal of Biologycal and Chemystry. 266, 4979-4986.
Mateo C ; Abian, O.; Fernndez-Lafuente, R.; Guisan, J.M. increase in conformational stability of enzimes immobililized on epoxy-activated supports by favoring additional multipoint covalent attachment 2000 A. Enzyme and Microbial Technology, 26, 509-515.
Mateo, C. Control de la Multiinteracin Protena-Soporte: Purificacin, Inmovilizacin y Estabilizacin de Enzimas industriales. Tesis Doctoral. Facultad de Ce. Biolgicas. Universidad Autnoma de Madrid, 2001.
Mateo, C ; Abian O.; Fernndez-Lafuente, R.; and Guisan, J.M. 1999. Reversible Enzyme Immobilization via a Very Strong and Nondistorting lonic Adsorption on SupportPolyethylenlmine Composites. Biotechnology and Bioengineerin, vol. 68, N 1, April 2000.
Bibliografa 122
Mateo, C ; Femndez-Lorente, G.; Benevides C.C.Pessela; Van, A.; Carrascosa, AV.; Garca, J.L.; Fernndez-Lafuente, R.; Guisan, J.M. 2001. Affinlty chomatography of polyfistidine tagged enzimes. New dextran-coated immobilized metal ion affinity chromatography matrices for prevention of undesired multipoint adsorptions Journal of Chromatography A .1, 915, 97106.
Mateo, C ; Femndez-Lorente, G.; Abian, O.; Fernndez-Lafuente, R.; and Guisan, J.M. 2000 C. Multifunctionai Epoxi Suports. A New Too! To Improve the Covalent Immobiiization of Proteins. The Promotion of Physical Adsorptions of Proteins on the Supports before ther Covalent Linkage. Biomacromoleculas 1, 739-745
Melander, W.; Corradini, D.; and Hoorvath, C. 1984. Salt-medlated retention of proteins in hydrophoblc-interaction chomatography. Aplication of solvophobic theory. J. Chomatogr. 317, 67-85.
Melissa L. Hoimes; Robert K. Scopes; Robert L. Moritz; Richard J. Simpson; Christoph Englert; Felicitas Pfeifer; Michael L. Dyall-Smith. 1997.Purficaton and analysis of an extremely halophic p-galactosidase from Haloferax alicantei. Biochimica et Biophysica Acta, 1337, 276286.
Michael R. King; Dinesh A. Yernool; Thermostable a-galactosidase from
Douglas E. Eveleigh and Bruce M. Chassy. 1998. Thermotoga neapolitana: cloning, sequencing and
expression. FEMS. Microbiology Letters, 163, 37-42.
Mller,.J.I-l. 1972. Experimenta in Molecular Genetics. CSHL Press, Cold Spring Harbor, New Yorl<.
Minton, A. P.; 1994. Modern Analytical Ultracentrifugation. Schuster, T.M.; and Laue, T.M.; editores 81-93, Birkhuser, Boston, M.A.
Minton, A.P.; 2000. Quantitative charcterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction. Experimental and Molecular Medicine, Vol. 32, N 1, 1,1-5.
Moks, T.; Abrahmsen, L.; Holmgren, E.; Bilich, M.; Olsson, A.; Uhlen, M.; Pohl, G.; Sterky, C ; Huitberg, H.; and Josephson, S. 1987. Expression of human insulin-like growth factor I in bacteria: Use of optimized gene fusin vectors to faciltate protein purification. Biochemistry, 26, 5239-5244.
Bibliografa 123
iVIoore, J.B.; Marl<ievicz, P.; and Miller, J.H. 1994. Identification and secuencing of the Thermotoga martima lacZ gene, part of a divergently transcribed operan. Gene 147,101-196.
Naider, F.; Boha!<, Z.; and Yariv, J. 1972. Reversible alkylation of a methiionyl residue near the active site of p-gaiactosidase. Biochemistry, 11, 3202-3208.
Ni Hung, Ming and Byong H. Lee. Cloning and expression of p-galactosidase gene from Bifidobacterum infantis into Escherchia coli. 1998. Biotechnology Letters, 20, N7, 659-662.
Nieves Corzo, M. Snchez. 1988. Modificacin e Interacciones de la lactosa durante el tratamiento trmico de la leche. Tesis Doctoral. Facultad de Farmacia. Departamento de
Nutricin y Bromatologia. Universidad Complutense de Madrid.
Ohtsu, Naomi; Hidemasa Motoshima; Kenji Goto; Fuji Tsukasaki; and Hiroshi Matsuzawa. Thermostable p-galactosidase from an Extreme Thermophile, Thermus sp. A4: Enzyme Purification and Characterization, and Gene Cloning and Sequencing. 1998. Biosci. Biotechnol. Biochem.,62 , 1539-1545.
Olafur Fridjonsson; Hildegard Watziawick; Axel Gehweiler; Ralf Mattes.1999. Thermostable agalactosidase from Bacillus stearothermophilus NUB 3621: cloning, sequencing and
characterization. 1999. FEMS. Microbiology Letters, 176, 147-153.
Glano, A.;
Calvo M. M.; and
Reglero G.; Anlisis
of Free Carbohydrates in Milk Using
Micropacked Columns. 1986. Chromatography . Vol 21 N 9 .1986.
Ordaz, E. A; Garrido-Pertierra, M. G.; and
Puyet, A. 2000.
Covalent and Metal-Cheiate
Immobilization of a Modified 2-Haloacid Dehalogenase for the enzymatic Resolution of Optically active ChIoropropionic Acid. Biotechnol. Prog.16. 287-291.
Otero, C ; Ballesteros, A.; and Guisan J.M. 1991. Immobilization/stabilization of Upase from Candida rugosa. Appl. Biochem. Biotechonol. 19, 163-175.
Ovsejevi,
K.;
Graz
V.;
and
Francisco
Batista-Viera.
1998.
p-galactosidase
from
Kluyveromyces lactis immobilized on to thiolsulfinate/ thiolsulfonate supports for lactose hydrolysis in milk and dairy products. Biotechnology Techiques . 12, 143-148.
Paborsky, L. R.; Dunn, K. E.; Gibbs C.S.; and Dougherty, J. P. 1996. A nickel chelate Microtiter Pate Assay for Six-Histidine-Containing Proteins. Analytical Biochemistry, 234, 60-65
Bibliografa 124
Palumbo, M.S.; Smith, P.W.; Strange, D.E.; Van Hekken, D.L.;Tunick, M.H.; and Holsinger, V.H. 1995. Stability of p-galactosidase from Aspergillus orzae and Kluyveromyces lactis in Dry Milk Powders. Journal of Food Science, 60, N1, 117-119. Paul R. Oswaid; Rachel A. Evans; William Henderson; Roy M. Daniel, and Cenan J. Fee. 1998. Properties of a thernnostable (3-glucosidase immobiiized using tris(hydroxymethyl) phosphine as a highiy effective coupling agent. 1998. Enzyme and Microbial Technology , 23, 14-19.
Phillips, M. C ; and Briggs, G. M. 1975. Milk and its role in the American diet. Journal of Dairy Science, 58, 1751-1763.
Philo, J.S. 1997. An improved function for fitting sedimentation velocity data for low-molecularweight solutes. Biophysical Journal 72, 435-444.
Pineda, Manuel; Crdenas Jacobo. Espectroscopia
Ultravioleta-Visible de Compuestos
Biolgicos. Publicaciones Del Monte De Piedad Y Caja De Ahorros De Crdoba. Crdoba, 1988.
Pisan, F.M.; Relia, C.A.; Raya, C; Rozzo, R.; Nucci, A.; Gambacorta, M.; De Rosa and Rossi, M. 1990. Thermostable p-galactosidase from archaebactrium Solfulobus solfatarius. Purification and properties. Eur. J. Biotechonol. 187, 321-328.
Pivarnik, L. F.; Senecal, A.G.; y Rand, A.G. 1995. Hydrolytic and transgalactosylicactivities of comercial p-galactosidases in food processing. Adv. Food Nutrit.Res. 38, 1-102.
Porath, J.; Carlisson, J.; OIsson, I.; and Belfrage, G.
1975. Metal chalate
affinity
chomatography, a new appoach to protein fractionation . Nature, 258, 598-599.
Prickett, K. S.; Amberg, D.C.; and Hopp, T. P.; 1989. A Calcium dependent antibody for Identification and purification of recombinant proteins. BioTechniques, 7, 580-589
Rech, R.; Cassini, F.C.; Secchi, A.; and MAZ Ayub. 1999. Utilization of protein-hydrolyzed cheese whey for production of p-galactosidase by Kluyveromyces marxianus. 1999. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 23, 91-96.
Rickenberg, H.V. 1959. The Effect of metal lons and Proteins on the Stability of the p-galactosidase of Escherischia coli. Biochim. Biophys. Acta 35: 122-129
Bibliografa 125
Ring, M.; Armitage,
I. M.; and
Huber,
R.
E.
1985.m-Fluorotyrosine
substitution in
p-galactosidase: evidence for the existence of a catalitically active tyrosine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 131, 675-680.
Ring, VI.; Bader, D. E.; and Huber, R. E. 1988. Site-directed mutagenisis of p-galactosidase E.coli reveis that tyr-503 is esential for activity. Biochem. Biophys. Res.Commun. 152, 10501055.
Roberfroid, MB.; 1998. Prebiotics and synbiotics: concepts and nutritiona! properties. British Journal of Nutrition, 80 ( 2): S197-202.
Roberfroid, MB.; 1999. Concepts in functional foods: the case of inulin and oligofructose. British Journal Nutr, 129, 1398S-1410S
Robinson, R.K.; Modern Dairy Tchnology. Vol.1, Advances in Milk Processing. Second Edition. 1986. Editorial : CHAPIVIAN AND HALL.
Royer, G. P.; 1980. Immobilized enzyme catalysis. Reviews, 1978. Catalysis Reviuwes. Science and Engineering, 22/1, 29-73
Rosevear, A., 1984. Immobilized biocatalysts- a critical review. J. Chem. Technol. Biotechnoi., 34B, 127-150.
Sambrool<, J.; Fritsch, E.F.; and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: a laboratory manual, 2"'' ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
Santos, A.; Ladero, M.; and Garca- Ochoa, F. 1998. Kinetic modeling of lactose hydrolysis by a p-galactosidase from Kluyveromices fragilis. Enzyme and Microbial Technology, 22, 558-567.
Sassenfeld, H.M. 1990. Trends Biotechnology. 8, 88.
Schatz, P. J.; 1993. Use of peptide labrarles to map the substrate specificity of a peptidemodifying enzyme: A 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli. BioTechnology, 11, 1138-1143.
Schmitt, J.; Hess, H.; and Stunnenberg, H. G.; 1993. Affinity purification of histidine-tagged proteins. Mol. Biol. Rep. 18, 223-230. Seerv W. M. Kengen; Evert J. Luesink; Alfons J. M. Stams and Alexander J. B. Zehnder. 1993. Purification and characterization of an extremely thermostable p-glucosidase from the
Bibliografa 126
hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus. Europpean Journal of Biochemystry, 213, 305-312. Shendereov B.A.; Manvelova M.A.; Stepanchuk I.B.; Skiba NE.; 1997. Prebiotics and funtional food. Antibiot Khimioter. 42 ( 7 ) : 30-34.
Short, J. L. 1975. propects for the utilization of deproteinated whey in New Zeland. A reviw. N.Z.J. Dairy Sci. Technol. 13, 181-194.
Shukia, Himakshi and Martin Chaplin. 1993. Noncompetitive inhibition of |3-galactosidase (A. Oryzae) by galactose. Enzyme Microb. Technol., Vol. 15, 297-299.
Smalla, K.; Turkova, J.; Coupek, J.; and Hermn, P. 1988. Influence of salts on the covalent immobilization of proteins to modified copolymers of 2-hydroxiethyl methacrylate with ethylene dimetacrylate. Biotechnol. Appl. Biochem., 10, 21-31.
Smith, D.B.; and Johnson, K.S.; 1988. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusin with glutathione S-transferase. Gene, 67, 31-40
Stefan IVlenzier; Hasan Seker; Markus Gschrey and IVlanfred Wiessier. 1997. p-galactosidase catalysed synthesis of branched oligosaccharide analogues. Biotechnology Letters, Vol 11, N 2, Februay 1997, 269-272.
Stephenson, G.J.; and lardaroa, M. J.; 1994. Recombinant proteins attached to a nikel-NTA coiumn: Use in affinity purification of antibodies. Biotechniques ,17 , 257-262.
Suikowsky , E.1995. Purification of proteins by IIVIAC. Trends Biotechnology, 3 , 1-7.
Sundberg, L.; and Porath, J.; 1974. Preparation of adsorbents for biospecific Affinity Chomatography. I. Attachment of group containing ligands to insoluble polymers by means of Bifunctional Oxiranes. Journal of Chomatography, 90, 87-98.
Tanaka, R.; Takayama, H.; Morotomi, M.; Kuroshima, T.; Ueyama, S.; Matsumoto, K.; Kuroda, A.; and Mutai, M.; 1983. Effects of administration of TOS and bifidobacterium breve 4006 on the human fecal flora. Microbial Ecology in Health and Disease, 5, 43-50.
Tenisi, E. 1997. In industry extremophiles begin to make their mark. Science 276; 705-706
Bibliografa 127
Tomoyuki Sako; Keisuke Matsumoto; Ryuichiro Tanaka. 1999. Recent progress on research and appiications of non-digestible gaiacto-oligosaccharides. International Dairy Journal, 9, 6980.
Trinder, P.; 1969. Determination of glucosa in blood using glucose oxidase with an alternativa oxygen aceptor. Biochenn. 6,24.
Uhm, T.B; Baek, N.l; Jhon, D.Y; Kim, D.M.; Hwang, K.T.; and Ryu, E. J.; 1999. Synthesis of new ogosaccharides from raffinose by Aspergillus niger fructosyitransferase. Biotechnology Techniques 13, 169-171.
Ulrich, J. T.; Mcfeters G.A.; and Temple, K. L.; 1972. Induction and Characterization of P-gaiactosidase in an Extreme Tharmophile. Journal of Bacteriology, May. 1972. 691-698
Van J.; Cummings J.;
Delzenne N.; 1999. Functiona! food properties of non-digestible
oligosaccharides: a consensus report from the ENDO projact (DGXII ARII-CT94-1095). British Jouranlof Nutrition, 81, 121-132.
Vian, A.; Carrascosa, A.V.; Garca J.L y Corts, E. 1997. Un procedimiento para producir P-gaiactosidasa de Thermus sp. (Cepa T2) en clulas hospedantes y purificarla en un solo paso cromatogrfico. Patente espaola. Numero de solicitud 9701759. Consejo Superior de Investigaciones cientficas. Madrid 1997.
Van,
A.;
Carrascosa,
A.V;
Garca,
J.L.
and
Corts,
E.;
1998
.Structure
of the
P-galactosidase gene from Thermus sp 12: Expression in Escherchia coli and Purification in a Single Step of an Active Fusin Protein. Applied and Environmental Microbiology, Vol.64, N6, 2187-2191.
Vittoria Cubellis, M.; Carla Rozzo; Piercarlo Motecucchi and Mos Rossi. 1990. Isolation and sequencing of a new p-galactosidase-encoding archaebacteral gene. Gene, 94, 89-94.
Waish, M.K. and Swaisgood, H. E. 1993. Characterization of a chemically conjugated p-galactosidase bioreactor. Journal of Food Biochmeystry, 17: 283-292.
Wheatley, J.B.; and Scmidt, D.E.; 1993. Sait induced immobilization of proteins on a higthperfomance liquid chromatographic epoxid affinity support. J. Chromatogr. 644, 11-16. Wheatley, J. B.; and Schimidt, D.E.; 1999. Salt induced immobilization of affinity ligands onto epoxide-activated supports. J. Chromatogr. A. 849, 1-12.
Bibliografa 128
Williams, S.G; Greenwood, S.; and Jones, C. W.; 1992. Molecular analysis of the lac operon enconding the binding-protein-dependent Jactse transport system and p-galactosidase in Agrobacten'um radiobacter. Molecular Microbioiogy ,6, (13), 1755-1768. Xiaolin L. Huaang; Marie K. Waish; and Harold E. Swaisgood. 1996. Simultaneo isolation and immobilization of srepaw'd/n-p-galactosidase: Some kinetic characteristics of the immobilized enzyme and regeneration of bioreactors. Enzyme and Microbial Technology, 19: 378-383.
Yang, S. T.; and Silva, E. M. 1995. Novel Products and New Technologies for use of a familiar Carbohydrate Milk Lactose .Journal Dairy Sci. 78: 2541-2562.
Yoshimi Yamamoto; Cynthia A. Hake; Brian M. Martin; Keith A. Kretz; Amelia J. AhernRindell; Susan L. Naylor; Micha! Mudd; and John S. O'brien. 1990. Isolation, Characterizatlon, and Mapping of a Human Acid p-galactosidase cDNA. DNA Number2, 1990, 119-127. and CELL BIOLOGY. Voi 9,
Zarate, S.; and Lpez-Leiva M.H.; 1990. Oigosaccharide Formation During Enzymatic Lactose Hydroisis: A Literature Review. Journal of Food Protection, Voi. 53, N3, 262-268.

PDF

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

PDF

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

UNIVERSIDAD POLITCNICA DE MADRID ESCUELA TCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS INDUSTRIALES Departamento de Ingeniera Qumica Industrial y del Medio Ambiente

INGENIERA DE BIOCATALIZADORES Y BIOPROCESOS: p-GALACTOSIDASA DE Thermus sp., cepa T2.

Tesis Doctoral Benevides Costa Chitunda Pesseia

INGENIERA DE BIOCATALIZADORES Y BIOPROCESOS: p-GALACTOSIDASA DE Thermus sp., cepa T2.

3.- LAS ENZIMAS DE

COMO CATALIZADORES INDUSTRIALES

5.- HIDRLISIS DE LACTOSA EN LECHE

6.- p-GALACTOSIDASAS DE TERMFILOS

102 107 108 113

poder aspirar a alcanzar este sueo es

LAS ENZIMAS EN LOS SERES VIVOS Y EN UN REACTOR QUMICO: LA

A pesar de esas excelentes

propiedades catalticas y sus enormes y variadas

(regioselectivos, esteroespecficos, etc) sobre compuestos qumicos poco manejables

3.- LAS ENZIMAS DE TERMFILOS COMO CATALIZADORES INDUSTRIALES.

TERMFILOS: CONSTRUCCIN DE PROTENAS CON COLAS DE POLI-HIS.

5.- HIDRLISIS DE LACTOSA EN LECHE

6.- p-GALACTOSIDASAS DE TERMFILOS

INDUSTRIALES MS EFICACES, MS SELECTIVOS Y MS SOSTENIBLES.

ingeniera qumica" y lograr unos resultados mas prometedores.

Haloferax alicantei Bacillus stearotherrnophillus

Bga A (675) Bga B (690) ORF80(676) (3-galactosidasa sozyme 12 (637)

Bacillus circulans Bacillus circulans

Clostridium perfringens D49537 Artrobacter sp. strain 87 U17417

pBGT1 y pBGT2, que se que codifica para la fi-

1.2- OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

El objetivo fundamental del presente captulo es la

caracterizacin de los genes,

potencialmente purificable por cromatografa de afinidad a quelatos metlicos

(Koyama y col., 1990). Se utiliz para

1.3.2.2 CLONAJE Y SECUENCIACIN

1.3.3. ENSAYOS ENZIMTICOS

La actividad p-galactosidsica se midi con ensayos frente a

1.3.4 INFLUIENCIA DEL pH Y LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.

Xhol \ Hlnd III

Purificacin fragmento grande

Purificacin fragmento 2,3 Kb

ATG (His) 5 [Xhol/SalI\

En la figura 1.3, presentamos

la secuencia de nucletidos del gen hbrido

CTCCTTCGGGATAATGCTCCTGGCCGGTTCATTACCCATAACTTCATGGGGTTTTTCAC L L R D N A P G R F I T H N F M G F F T GATCTGGACCCCTTTGCCTTGGCCGAGGACCTGGATTTTGCCGCCTGGGACAGCTACCC D L D P F A L A E D L D F A A W D S Y P TTGGGCTTCACCGACCTGATGCCCCTTCCCCAGGAGGAGAAGGTTCAGTGGGCCCGCAC L G F T D L M P L P Q E E K V Q W A R T

-{3- gaiactosidasa de Thermus sp.T2

1.4.2. FERMENTACIN Y EXTRACCIN DE LA PROTENA DE NTERES.

cultivos stock -80C

Placa petri LB + ampicilina

Estufa 37C 24 horas

Matraz lOOml lOmlLB + ampicilina 0,157 ;ig/ml

37C 200rpm. 8-9 horas

Centrifugar GS3 15minutos 15-20"'C Hielo

Resuspender en T. Fosfato pH 7 50mM . Hielo

FRENCH PRESS: 1100psi T* ambiente

Hielo Sobrenadante: Hielo Ensayo actividad Bradford Electroforesis

Centrifugar: SS34 15 minutos 15-20''C

Diagrama 1.1.- Representacin galactosidasa de Thermus sp., cepa T2.

1.4.3 PROPIEDADES BIOQUMICAS DE LA PROTENA QUIMERA GALACTOSIDASA

EXTRACTO BgaA IMAC-BgaA

PROTEINA (mg /mL) 14,5 17

ACTIVIDAD (U/ml) 70 C 25 C 196400 464400 8,53 19,2

ACTIVIDAD ESPECIFICA 70 OQ 13545 27318 (U/mg) 25 C 0.58 1.13

Tabla 1.2.- Actividad galactosidasa (IMAC-BgaA).

jB-galactosidasa de la protena nativa (BgaA) y la quimera proteica

B.- Efecto del pH en la actividad enzimtica.

actividad hasta los 80C