REGULAMENTO (CE) N.O 440 - 2008 DA COMISSÃO

I
(Actos aprovados ao abrigo dos Tratados CE/Euratom cuja publicao obrigatria)

REGULAMENTOS
REGULAMENTO (CE) n.
o
440/2008 DA COMISSO
de 30 de Maio de 2008
que estabelece mtodos de ensaio nos termos do Regulamento (CE) n.
o
1907/2006 do Parlamento
Europeu e do Conselho relativo ao registo, avaliao, autorizao e restrio de substncias qumicas
(REACH)
(Texto relevante para efeitos do EEE)
A COMISSO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,
Tendo em conta o Regulamento (CE) n.
o
1907/2006 do
Parlamento Europeu e do Conselho, de 18 de Dezembro
de 2006, relativo ao registo, avaliao, autorizao e restrio
de substncias qumicas (REACH), que cria a Agncia Europeia
das Substncias Qumicas, que altera a Directiva 1999/45/CE e
revoga o Regulamento (CEE) n.
o
793/93 do Conselho e o
Regulamento (CE) n.
o
1488/94 da Comisso, bem como a
Directiva 76/769/CEE do Conselho e as Directivas 91/155/CEE,
93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE da Comisso (
1
), nomea-
damente o n.
o
3 do artigo 13.
o
,
Considerando o seguinte:
(1) Nos termos do Regulamento (CE) n.
o
1907/2006, devem
adoptar-se mtodos comunitrios para o ensaio de
substncias, sempre que tais mtodos sejam necessrios
produo de informaes sobre as propriedades intrnsecas
das substncias.
(2) A Directiva 67/548/CEE do Conselho, de 27 de Junho
de 1967, relativa aproximao das disposies legislativas,
regulamentares e administrativas respeitantes classifica-
o, embalagem e rotulagem das substncias perigosas (
2
)
estabelece, no seu anexo V, mtodos para a determinao
das propriedades fsico-qumicas, da toxicidade e da
ecotoxicidade das substncias e preparaes. O anexo V
da Directiva 67/548/CEE foi revogado pela Directiva 2006/
/121/CE do Parlamento Europeu e do Conselho, com efeitos
a partir de 1 de Junho de 2008.
(3) Os mtodos de ensaio constantes do anexo V da Directiva
67/548/CEE devem ser incorporados no presente regula-
mento.
(4) O presente regulamento no exclui a utilizao de outros
mtodos de ensaio, desde que a mesma seja conforme com
o n.
o
3 do artigo 13.
o
do Regulamento (CE) n.
o
1907/2006.
(5) Os princpios da substituio, reduo e aperfeioamento
da utilizao de animais em procedimentos devem ser
plenamente tidos em conta na concepo dos mtodos de
ensaio, nomeadamente sempre que se tornem disponveis
mtodos adequados, validados para substituir, reduzir ou
aperfeioar a experimentao com animais.
(6) As disposies do presente regulamento esto em confor-
midade com o parecer do Comit institudo pelo ar-
tigo 133.
o
do Regulamento (CE) n.
o
1907/2006,
ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:
Artigo 1.
o
Os mtodos de ensaio a aplicar para os fins do Regulamento (CE)
n.
o
1907/2006 so os estabelecidos no anexo do presente
regulamento.
Artigo 2.
o
A Comisso reexaminar, quando pertinente, os mtodos de
ensaio constantes do presente regulamento, com o objectivo de
substituir, reduzir ou aperfeioar os ensaios com vertebrados.
31.5.2008 PT Jornal Oficial da Unio Europeia L 142/1
(
1
) JO L 396 de 30.12.2006, p. 1. Rectificao no JO L 136 de
29.5.2007, p. 3.
(
2
) JO 196 de 16.8.1967, p. 1. Directiva com a ltima redaco que lhe
foi dada pela Directiva 2006/121/CE do Parlamento Europeu e do
Conselho (JO L 396 de 30.12.2006, p. 850). Rectificao no
JO L 136 de 29.5.2007, p. 281.
Artigo 3.
o
Todas as referncias ao anexo V da Directiva 67/548/CEE devem
entender-se como referncias ao presente regulamento.
Artigo 4.
o
O presente regulamento entra em vigor no dia seguinte ao da sua
publicao no Jornal Oficial da Unio Europeia.
aplicvel a partir de 1 de Junho de 2008.
Feito em Bruxelas, em 30 de Maio de 2008.
Pela Comisso
Stavros DIMAS
Membro da Comisso
L 142/2 PT Jornal Oficial da Unio Europeia 31.5.2008
ANEXO
PARTE A: MTODOS PARA A DETERMINAO DAS PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS
NDICE
A.1. TEMPERATURA DE FUSO/CONGELAO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
A.2. TEMPERATURA DE EBULIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
A.3. DENSIDADE RELATIVA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
A.4. PRESSO DE VAPOR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
A.5. TENSO SUPERFICIAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
A.6. SOLUBILIDADE EM GUA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
A.8. COEFICIENTE DE PARTIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
A.9. PONTO DE INFLAMAO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
A.10. INFLAMABILIDADE (SLIDOS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
A.11. INFLAMABILIDADE (GASES) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
A.12. INFLAMABILIDADE (CONTACTO COM GUA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
A.13. PROPRIEDADES PIROFRICAS DE SLIDOS E LQUIDOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
A.14. PROPRIEDADES EXPLOSIVAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
A.15. TEMPERATURA DE AUTO-IGNIO (LQUIDOS E GASES) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
A.16. TEMPERATURA DE AUTO-IGNIO RELATIVA PARA OS SLIDOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
A.17. PROPRIEDADES OXIDANTES (SLIDOS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
A.18. MASSA MOLECULAR MDIA EM FUNO DO NMERO DE MOLES E DISTRIBUIO DA MASSA
MOLECULAR EM POLMEROS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
A.19. TEOR EM POLMEROS DE BAIXA MASSA MOLECULAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
A.20. COMPORTAMENTO DOS POLMEROS DA DISSOLUO/EXTRACO AQUOSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
A.21. PROPRIEDADES DE COMBURNCIA (LQUIDOS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
A.1. TEMPERATURA DE FUSO/CONGELAO
1. MTODO
A maior parte dos mtodos descritos baseiam-se na publicao OECD Test Guideline (1) (normas de
procedimento para testes da OCDE). Os princpios fundamentais encontram-se descritos nas referncias (2) e
(3).
1.1. INTRODUO
Os mtodos e dispositivos descritos destinam-se a ser aplicados determinao da temperatura de fuso de
substncias, sem quaisquer restries no que diz respeito ao seu grau de pureza.
A seleco do mtodo depende da natureza da substncia que se pretende testar. Em consequncia, o factor
limitativo depender do facto de a substncia poder ser ou no ser facilmente pulverizada, pulverizada com
dificuldade, ou no poder ser mesmo pulverizada.
Para algumas substncias considera-se mais apropriado a determinao da temperatura de congelao ou de
solidificao, tendo as normas para estas determinaes sido englobadas tambm neste mtodo.
No caso de no se poder medir convenientemente nenhum dos parmetros anteriores devido existncia de
propriedades particulares da substncia, recomenda-se a determinao de um ponto de fluidez.
1.2. DEFINIES E UNIDADES
Define-se a temperatura de fuso como sendo a temperatura qual ocorre a transio de fase do estado slido
para o estado lquido presso atmosfrica, correspondendo idealmente essa temperatura temperatura de
fuso.
Uma vez que a transio de fase de diversas substncias ocorre num intervalo de temperaturas, associa-se-lhe
frequentemente um intervalo de fuso.
Converso de unidades (K para
o
C)
t = T 273,15
t: temperatura de Celsius, graus Celsius (
o
C)
T: temperatura termodinmica, Kelvin (K)
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNC1A
No necessrio utilizar substncias de referncia quando se est a investigar uma nova substncia. Essas
substncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, as caractersticas de execuo do mtodo e
para proporcionar a comparao com resultados obtidos com outros mtodos.
Na referncia (4) encontram-se enumeradas algumas substncias de calibrao.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DE ENSAIO
Determina-se a temperatura (intervalo de temperaturas) da transio de fase do estado slido para o estado
lquido ou do estado lquido para o estado slido. Na prtica, enquanto se aquece/arrefece uma amostra da
substncia ensaiada presso atmosfrica, determina-se as temperaturas da fase inicial de fuso/congelao e da
fase final de fuso/congelao. Descrevem-se cinco tipos de mtodos, designadamente o mtodo capilar, os
mtodos das fases quentes, as determinaes da temperatura de congelao, os mtodos de anlise trmica e a
determinao do ponto de fluidez (desenvolvido para os derivados oleosos do petrleo).
Em alguns casos pode ser conveniente medir a temperatura de congelao em vez de se medir a temperatura de
fuso.
1.4.1. Mtodo capilar
1.4.1.1. Dispositivos para a determinao da temperatura de fuso, com banho lquido
Coloca-se uma pequena quantidade da substncia finamente triturada num tubo capilar e compacta-se
fortemente. Aquece-se o tubo em simultneo com um termmetro e ajusta-se a subida de temperatura para um
valor inferior a 1 K/min durante a fuso efectiva. Determinam-se as temperaturas de fuso inicial e final.
1.4.1.2. Dispositivos para a determinao da temperatura de fuso, com bloco metlico
Conforme descrito em 1.4.1.1, com a excepo de o tubo capilar e o termmetro estarem num bloco metlico
aquecido e poderem ser observados atravs de aberturas existentes no bloco.
1.4.1.3. Deteco por clula fotoelctrica
A amostra no tubo capilar aquecida automaticamente num cilindro metlico. Dirige-se um feixe de luz atravs
da substncia, passando por uma abertura existente no cilindro, de modo a atingir uma clula fotoelctrica
calibrada com preciso. Quando da fuso, as propriedades pticas da maior parte das substncias variam de
opacas para transparentes. A intensidade da luz que atinge a clula fotoelctrica aumenta e envia um sinal de
paragem para o indicador digital, que procede leitura da temperatura de um termmetro de resistncia de
platina localizado na cmara de aquecimento. Este mtodo no adequado para algumas substncias
fortemente coradas.
1.4.2. Fases quentes
1.4.2.1. Barra quente de Kofler
O mtodo da barra quente de Kofler utiliza duas peas metlicas de condutividade trmica diferente, aquecidas
electricamente, sendo a barra concebida de tal modo que o gradiente de temperatura quase linear segundo o
seu comprimento. A temperatura da barra quente pode variar desde 283 at 573 K, existindo um dispositivo
especial de leitura da temperatura constitudo por um cursor com um ponteiro e uma escala, concebidos
especificamente para a barra. No sentido de se determinar uma temperatura de fuso, espalha-se a substncia
em camada fina directamente sobre a superfcie da barra quente. Decorridos alguns segundos surge uma linha
que separa as fases fluida e slida. L-se a temperatura nesta linha ajustando o ponteiro sobre ela.
1.4.2.2. Microscpio de fuso
Existem diferentes tipos de microscpios de placas quentes para a determinao das temperaturas de fuso,
utilizando-se quantidades muito pequenas de material. Na maior parte dos aparelhos mede-se a temperatura
com um termopar sensvel mas, por vezes, utilizam-se termmetros de mercrio. Existe um equipamento
tpico para a medio da temperatura de fuso pelo mtodo das placas quentes utilizando microscpio, o qual
possui uma cmara de aquecimento contendo uma placa metlica, sobre a qual se coloca a amostra numa
lmina. O centro da placa metlica contm um orifcio que permite a entrada de luz proveniente do espelho de
iluminao do microscpio. Durante a utilizao o compartimento fechado com uma placa de vidro para
eliminar o ar da zona da amostra.
O aquecimento da amostra regulado com um restato. Para as medies de elevada preciso das substncias
opticamente anisotrpicas, pode utilizar-se luz polarizada.
1.4.2.3. Mtodo do menisco
Este mtodo utilizado especificamente para as poliamidas.
A temperatura qual ocorre o deslocamento de um menisco de leo de silicone, encerrado entre uma placa
quente e um vidro de cobertura da amostra de poliamida testada, determinada visualmente.
1.4.3. Mtodo para determinar a temperatura de congelao
Coloca-se a amostra num tubo de ensaio especial e leva-se a um aparelho para a determinao da temperatura
de congelao. Agita-se a amostra suave e continuamente durante o arrefecimento e mede-se a temperatura em
intervalos adequados. Logo que a temperatura permanea constante durante algumas leituras considera-se que
esse valor (corrigido em funo do erro do termmetro) a temperatura de congelao.
Deve evitar-se o sobrearrefecimento, mantendo-se o equilbrio entre as fases slida e lquida.
1.4.4. Anlise trmica
1.4.4.1. Anlise trmica diferencial (ATD)
Esta tcnica regista a diferena de temperaturas existente entre a substncia e um material de referncia em
funo da temperatura, enquanto a substncia e o material de referncia so submetidos ao mesmo programa
de temperatura controlada. Quando a amostra sofre uma transio que implica uma variao de entalpia, essa
variao indicada por um afastamento endotrmico (fuso) ou exotrmico (congelao), relativamente linha
de referncia do registo de temperatura.
1.4.4.2. Calorimetria de explorao diferencial (CED)
Esta tcnica regista a diferena entre a absoro de energia por uma substncia e por um material de referncia
em funo da temperatura, enquanto a substncia e o material de referncia so submetidos ao mesmo
programa de temperatura controlada. Essa energia a necessria para estabelecer uma diferena nula de
temperatura entre a substncia e o material de referncia. Quando a amostra sofre uma transio que implica
uma variao de entalpia, essa variao indicada por um afastamento endotrmico (fuso) ou exotrmico
(congelao), relativamente linha de referncia do registo de fluxo de calor.
1.4.5. Ponto de fluidez
Este mtodo foi desenvolvido para ser utilizado com os derivados oleosos do petrleo e adequado para
utilizao apenas com substncias de baixas temperaturas de fuso.
Aps um aquecimento preliminar procede-se ao arrefecimento da amostra segundo um regime especfico e faz-
-se a observao das suas caractersticas de fluidez em intervalos de 3 K. A temperatura mais baixa para a qual se
observa movimento da substncia considerada como ponto de fluidez.
1.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
A aplicabilidade e a preciso dos diversos mtodos utilizados para a determinao da temperatura de fuso/
/intervalo de fuso encontram-se resumidas no quadro seguinte:
QUADRO: APLICABILIDADE DOS MTODOS
A. Mtodos capilares
Mtodo de medio
Substncias que
podem ser
pulverizadas
Substncias
dificilmente
pulverizadas
Intervalo de
temperaturas
Preciso
estimada (
1
)
Norma existente
Dispositivos com
banho lquido
Sim S para algu-
mas
273 a 573 K 0,3 K JIS K 0064
Dispositivos com
bloco metlico
Sim S para algu-
mas
293 a > 573 K 0,5 K ISO 1218 (E)
Deteco por clula
fotoelctrica
Sim Diversas com
dispositivos
de aplicao
253 a 573 K 0,5 K
(
1
) Dependente do tipo de instrumento e do grau de pureza da substncia.
B. Mtodos das fases quentes e de congelao
Mtodo de medio
Substncias que
podem ser
pulverizadas
Substncias
dificilmente
pulverizadas
Intervalo de
temperaturas
Preciso
estimada (
1
)
Norma existente
Barra quente de
Kofler
Sim No 283 a
> 573 K
1,0 K ANSI/ASTM D
3451-76
Microscpio de
fuso
Sim S para algu-
mas
273 a
> 573 K
0,5 K DIN 53736
Mtodo do menisco No Especifica-
mente para
poliamidas
293 a > 573
K
0,5 K ISO 1218 (E)
Mtodos da tempe-
ratura de congela-
o
Sim Sim 223 a 573 K 0,5 K por ex., BS
4695
(
1
C. Anlise trmica
Mtodo de medio
Substncias que
podem ser
pulverizadas
Substncias
dificilmente
pulverizadas
Intervalo de
temperaturas
Preciso
estimada (
1
)
Norma existente
Anlise trmica
diferencial
Sim Sim 173 a
1 273 K
at 600 K
0,5 K at
1 273 K
2,0 K
ASTM E 537-
-76
Calorimetria de
explorao diferen-
cial
Sim Sim 173 a
1 273 K
at 600 K
0,5 K at
1 273 K
2,0 K
ASTM E 537-
-76
(
1
D. Ponto de fluidez
Mtodo de medio
Substncias que
podem ser
pulverizadas
Substncias
dificilmente
pulverizadas
Intervalo de
temperaturas
Preciso
estimada (
1
)
Norma existente
Ponto de fluidez Para deriva-
dos oleosos
do petrleo e
para substn-
cias oleosas
Para deriva-
dos oleosos
do petrleo e
para substn-
cias oleosas
223 a 323 K 3,0 K ASTM D 97-66
(
1
1.6. DESCRIO DOS MTODOS
Os procedimentos de quase todos os mtodos de ensaio encontram-se descritos em normas internacionais e
nacionais (ver apndice 1).
1.6.1. Mtodos com tubo capilar
Quando submetidas a uma lenta subida de temperatura, as substncias finamente pulverizadas apresentam
normalmente as fases de fuso representadas na figura 1.
Figura 1
Durante a determinao da temperatura de fuso procede-se ao registo das temperaturas da fase inicial da fuso
e da fase final.
1.6.1.1. Dispositivos para a determinao da temperatura de fuso com aparelho de banho lquido
A figura 2 representa um tipo de aparelho normalizado para a determinao da temperatura de fuso, feito de
vidro (JIS K 0064); todas as especificaes so dadas em milmetros.
Figura 2
Lquido do banho:
Deve escolher-se um lquido adequado. A escolha do lquido depende da temperatura de fuso que se pretende
determinar; por exemplo, escolher-se- parafina lquida para temperaturas de fuso no superiores a 473 K,
leo de silicone para temperaturas de fuso no superiores a 573 K.
Para temperaturas superiores a 523 K pode utilizar-se uma mistura constituda por trs partes de cido
sulfrico e por duas partes de sulfato de potssio (em peso). Devero ser tomadas precaues adequadas no
caso de se utilizar uma mistura deste tipo.
Termmetro
Apenas devero ser utilizados termmetros que satisfaam as exigncias das normas indicadas a seguir ou
critrios equivalentes:
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.
Procedimento:
Pulveriza-se finamente a substncia seca utilizando um almofariz e coloca-se no interior do tubo capilar, selado
numa das extremidades, de tal modo que a altura do enchimento seja aproximadamente 3 mm aps boa
compactao. Para se obter uma amostra compacta uniforme o tubo capilar dever cair verticalmente de uma
altura de aproximadamente 700 mm atravs de um tubo de vidro e sobre um vidro de relgio.
Depois de cheio coloca-se o tubo capilar no banho, de tal modo que a parte mdia da ampola de mercrio do
termmetro toque no tubo capilar na parte onde se encontra a amostra. Normalmente o tubo capilar
introduzido no aparelho a uma temperatura cerca de 10 K inferior temperatura de fuso.
Aquece-se o lquido do banho de tal modo que o aumento da temperatura seja aproximadamente 3 K/min. O
lquido dever ser agitado. Quando se atingir uma temperatura cerca de 10 K inferior temperatura de fuso
esperada, ajusta-se a subida da temperatura para um valor mximo de 1 K/min.
Clculo:
O clculo da temperatura de fuso efectua-se do modo seguinte:
T = T
D
+ 0,00016 (T
D
T
E
) n
em que:
T = temperatura de fuso corrigida, em K;
T
D
= leitura da temperatura no termmetro D, em K;
T
E
= leitura da temperatura no termmetro E, em K;
n = nmero de graduaes na linha do mercrio no termmetro D na parte emergente da haste.
1.6.1.2. Dispositivos para a determinao da temperatura de fuso, com bloco metlico
Aparelho:
Este constitudo por:
um bloco metlico cilndrico, cuja parte superior oca e forma um compartimento (ver figura 3),
uma tampa metlica, com duas ou vrias aberturas, para permitir a montagem de tubos no bloco
metlico,
um sistema de aquecimento para o bloco metlico, que pode ser, por exemplo, uma resistncia elctrica
encerrada no bloco,
um restato para regular a potncia de entrada no caso de se utilizar aquecimento elctrico,
quatro janelas de vidro resistente ao calor situadas nas paredes laterais do compartimento, dispostas
diametralmente segundo ngulos rectos relativamente umas s outras. Em frente de uma destas janelas
monta-se um culo para observao do tubo capilar. As outras trs janelas so utilizadas para iluminar o
interior do compartimento, por meio de lmpadas,
um tubo capilar, em vidro resistente ao calor e fechado numa extremidade (ver 1.6.1.1).
Termmetro
Ver as normas referidas em 1.6.1.1. Tambm se podem utilizar dispositivos de medio termoelctrica, de
preciso equivalente.
Figura 3
1.6.1.3. Deteco por clula fotoelctrica
Aparelho e procedimento:
O aparelho constitudo por um compartimento metlico com um sistema de aquecimento automtico.
Procede-se ao enchimento de trs tubos capilares conforme descrito em 1.6.1.1, os quais so depois colocados
na estufa.
Utilizam-se vrias variaes lineares de temperatura para calibrar o aparelho e ajusta-se electricamente o
aumento de temperatura adequado, segundo uma razo linear e constante pr-seleccionada. Os registadores
mostram a temperatura efectiva da estufa e a temperatura da substncia nos tubos capilares.
1.6.2. Fases quentes
1.6.2.1. Barra quente de Kofler
Ver apndice.
1.6.2.2. Microscpio de fuso
Ver apndice.
1.6.2.3. Mtodo do menisco (poliamidas)
Ver apndice.
O esquema gradual de aquecimento prximo da temperatura de fuso dever ser inferior a 1 K/min.
1.6.3. Mtodos para a determinao da temperatura de congelao
Ver apndice.
1.6.4.1. Anlise trmica diferencial
Ver apndice.
1.6.4.2. Calorimetria de explorao diferencial
Ver apndice.
1.6.5. Determinao do ponto de fluidez
Ver apndice.
2. RESULTADOS
Em alguns casos necessrio efectuar uma correco devida ao termmetro.
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio dever conter, se possvel, a informao seguinte:
mtodo utilizado,
especificao exacta da substncia (identificao e impurezas) e fases de purificao prvias no caso de
existirem,
uma estimativa da preciso.
Considera-se como temperatura de fuso a mdia de peio menos duas medies efectuadas no intervalo de
preciso estimado (ver quadros).
Se a diferena entre a temperatura na fase inicial e a temperatura na fase final da fuso estiver entre os limites de
preciso do mtodo, considera-se como temperatura de fuso o valor observado na fase final da fuso; caso
contrrio sero indicadas as duas temperaturas.
No caso de a substncia se decompor ou sublimar antes de atingir a temperatura de fuso, indicar-se- a
temperatura para a qual se observa esse efeito.
Todas as informaes e notas relevantes para a interpretao dos resultados devero ser descritas, especialmente
no que diz respeito s impurezas e ao estado fsico da substncia.
4. REFERNCIAS
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final.
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II,
p. 803-834.
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed.,
Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure
and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 505-515.
Apndice
Para pormenores tcnicos adicionais possvel consultar, por exemplo, as normas seguintes:
1. Mtodos capilares
1.1. Dispositivos de medio da temperatura de fuso com banho lquido
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the
melting range of organic chemicals
BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products
1.2. Dispositivos para a determinao da temperatura de fuso com bloco metlico
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen
ISO 1218 (E) Plastics polyamides determination of melting point
2. Fases quentes
2.1. Barra quente de Kofler
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric power coatings
2.2. Microscpio de fuso
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststof-
fen.
2.3. Mtodo do menisco (poliamidas)
ISO 1218 (E) Plastics polyamides determination of melting point
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion
materials
NF T 51-050 Rsines de polyamides. Dtermination du point de fusion. Mthode du
mnisque
3. Mtodos para a determinao da temperatura de congelao
BS 4633 Method for the determination of crystallizing point
BS 4695 Method for Determination of Melting Point of Petroleum Wax (cooling curve)
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und
Motorenbenzolen
ISO 2207 Cires de ptrole: dtermination de la temprature de figeage
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsuren
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines
NF T 20-051 Mthode de dtermination du point de cristallisation (point de conglation)
ISO 1392 Method for the determination of the freezing point
4. Anlise trmica
4.1. Anlise trmica diferencial
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods
of differential thermal analysis
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
4.2. Calorimetria de explorao diferencial
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods
of differential thermal analysis
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
5. Determinao do ponto de fluidez
NBN 52014 chantillonnage et analyse des produits du ptrole: point de trouble et point
d'coulement limite Monsterneming en ontleding van aardolieproducten:
Troebelingspunt en vloeipunt
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils
ISO 3016 Petroleum oils Determination of pour point
A.2. TEMPERATURA DE EBULIO
1. MTODO
A maior parte dos mtodos descritos baseia-se nas normas de ensaio da OCDE (1). Os princpios fundamentais
encontram-se descritos nas referncias (2) e (3).
1.1. INTRODUO
Os mtodos e dispositivos aqui descritos podem ser aplicados a lquidos e a substncias de baixo ponto de
fuso, desde que no sofram uma reaco qumica para os valores da temperatura de ebulio (por exemplo:
auto-oxidao, rearranjo, degradao, etc.). Os mtodos podem ser aplicados a substncias lquidas puras e
impuras.
D-se maior importncia aos mtodos que utilizam a deteco por clula fotoelctrica e aos mtodos de anlise
trmica uma vez que esses mtodos permitem a determinao das temperaturas de fuso e tambm das
temperaturas de ebulio. Alm disso, as medies podem ser efectuadas automaticamente.
O mtodo dinmico possui a vantagem de tambm poder ser aplicado determinao da presso de vapor e
de no ser necessrio corrigir o valor da temperatura de ebulio para a presso normal (101,325 kPa) uma vez
que a presso normal pode ser ajustada durante a medio utilizando um manmetro.
Observaes
A influncia das impurezas na determinao da temperatura de ebulio depende bastante da natureza dessas
impurezas. No caso de existirem na amostra impurezas volteis que possam afectar os resultados, a substncia
deve ser purificada.
Define-se a temperatura de ebulio normal como sendo a temperatura para a qual a presso de vapor de um
lquido de 101,325 kPa.
No caso de a temperatura de ebulio no ser medida presso atmosfrica normal, a dependncia da presso
do vapor em funo da temperatura pode ser descrita pela equao de Clausius-Clapeyron:
log p =
H
v
2,3RT
const:
em que:
p = presso de vapor da substncia em pascal
H
v
= calor de vaporizao em J mol
-1
R = constante universal dos gases perfeitos = 8,314 J mol
-1
K
-1
T = temperatura termodinmica em K
A temperatura de ebulio especificada tendo em considerao a presso ambiente durante a medio.
Converses
Presso (unidades: kPa)
100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa
(bar ainda uma unidade permitida mas no recomendada)
133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr
(as unidades mm Hg e Torr no so permitidas)
1 atm = atmosfera padro = 101,325 Pa
(a unidade atm no permitida)
Temperatura (unidades: K)
t = T 273,15
t: temperatura de Celsius, graus Celsius (
o
C)
T: temperatura termodinmica, kelvin (K)
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
No necessrio utilizar as substncias de referncia em todos os casos quando se investiga uma nova
substncia. Elas devero servir essencialmente para aferir, periodicamente, o mtodo e para permitir a
comparao com resultados obtidos com outros mtodos.
Nos mtodos enumerados no apndice possvel encontrar algumas substncias utilizadas para calibrao.
Existem cinco mtodos para a determinao da temperatura de ebulio (intervalo de ebulio) que se baseiam
na medio da temperatura de ebulio, e existem dois mtodos que se baseiam na anlise trmica.
1.4.1. Determinao utilizando o ebulimetro
Os ebulimetros foram originariamente desenvolvidos para a determinao do peso molecular por elevao da
temperatura de ebulio, mas tambm so adequados para as medies exactas da temperatura de ebulio.
Existe um aparelho muito simples que se encontra descrito na norma ASTM D 1120-72 (ver apndice). O
lquido aquecido nesse aparelho, sob condies de equilbrio presso atmosfrica, at entrar em ebulio.
1.4.2. Mtodo dinmico
Este mtodo implica a medio da temperatura de recondensao do vapor por meio de um termmetro
apropriado no refluxo, mantendo-se a ebulio. Neste mtodo possvel variar a presso.
1.4.3. Mtodo da destilao para a determinao da temperatura de ebulio
Este mtodo compreende a destilao do lquido, a medio da temperatura de recondensao do vapor e a
determinao da quantidade do destilado.
1.4.4. Mtodo de Siwoloboff
Aquece-se uma amostra num tubo de ensaio, que imerso num lquido num banho aquecido. Mergulha-se no
tubo de ensaio um tubo capilar fechado, contendo uma bolha de ar na parte inferior.
1.4.5. Deteco por clula fotoelctrica
Utilizando o princpio de Siwoloboff efectuam-se medies automticas por clula fotoelctrica das bolhas
ascendentes.
1.4.6. Anlise trmica diferencial
Esta tcnica regista a diferena existente entre as temperaturas da substncia e do material de referncia, em
funo da temperatura, quando a substncia e o material de referncia so submetidos ao mesmo programa de
temperatura controlada. Quando a amostra sofre uma transio que implica uma variao de entalpia, essa
variao indicada por um afastamento endotrmico (ebulio) em relao linha de referncia do registo de
temperaturas.
1.4.7. Calorimetria de explorao diferencial
Esta tcnica regista a diferena de absoro de energia existente entre uma substncia e um material de
referncia, em funo da temperatura, quando a substncia e o material de referncia so submetidos ao mesmo
programa de temperatura controlada. Essa energia representa a energia necessria para estabelecer uma
diferena nula de temperatura entre a substncia e o material de referncia. Quando a amostra sofre uma
transio que implica uma alterao da entalpia, essa alterao indicada por um afastamento endotrmico
(ebulio), em relao linha de referncia do registo do fluxo do calor.
A aplicabilidade e a preciso dos diferentes mtodos utilizados para a determinao da temperatura de ebulio/
/intervalo de ebulio encontram-se resumidas no quadro 1.
Quadro 1
Comparao dos mtodos
Mtodo de medio Preciso estimada Norma existente
Ebulimetro 1,4 K (at 373 K) (
1
) (
2
)
2,5 K (at 600 K) (
1
) (
2
)
ASTM D 1120-72 (
1
)
Mtodo dinmico 0,5 K (at 600 K) (
2
)
Processo de destilao (intervalo de
ebulio)
0,5 K (at 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/
/71
Mtodo de Siwoloboff 2 K (at 600 K) (
2
)
Deteco por clula fotoelctrica 0,3 K (at 373 K) (
2
)
Anlise trmica diferencial 0,5 K (at 600 K)
2,0 K (at 1 273 K)
ASTM E 537-76
Calorimetria de explorao dife-
rencial
0,5 K (at 600 K)
2,0 K (at 1 273 K)
ASTM E 537-76
(
1
) Esta preciso apenas vlida para um dispositivo simples, como, por exemplo, o descrito na norma ASTM D 1120-72;
pode ser melhorada com ebulimetros mais sofisticados.
(
2
) Vlido apenas para substncias puras. A utilizao noutras circunstncias dever ser justificada.
Os procedimentos de alguns destes mtodos encontram-se descritos em normas internacionais e nacionais (ver
apndice).
1.6.1. Ebulimetro
Ver apndice.
Ver o mtodo de ensaio A.4 para a determinao da presso de vapor.
Regista-se a temperatura de ebulio observada para um valor da presso aplicada de 101,325 kPa.
1.6.3. Processo da destilao (intervalo de ebulio)
Ver apndice.
1.6.4. Mtodo de Siwoloboff
Aquece-se a amostra num aparelho para a determinao da temperatura de fuso num tubo de ensaio com um
dimetro de aproximadamente 5 mm (figura 1).
A figura 1 representa um tipo de aparelho normalizado para a determinao das temperaturas de fuso e de
ebulio (JIS K 0064) (o material vidro e todas as especificaes so em milmetros).
Figura 1
Coloca-se no tubo de ensaio um tubo capilar (capilar para a determinao do ponto de ebulio), o qual se
encontra fechado a cerca de 1 cm acima da sua extremidade inferior. Adiciona-se a substncia que se pretende
testar de modo a que a parte fechada do capilar fique abaixo da superfcie do lquido. O tubo de ensaio que
contm o capilar para a determinao do ponto de ebulio preso ao termmetro com uma fita de borracha
ou fixado lateralmente com um suporte (ver figura 2).
Figura 2
Princpio de Siwoloboff
Figura 3
Princpio modificado
Escolhe-se o lquido do banho de acordo com a temperatura de ebulio. Para temperaturas at 573 K
possvel utilizar leo de silicone. A parafina lquida apenas pode ser utilizada at 473 K. O aquecimento do
lquido do banho deve ser ajustado de modo a que a subida de temperatura seja de 3 K/minuto inicialmente. O
lquido do banho deve ser agitado. Quando a temperatura atinge cerca de 10 K abaixo da temperatura de
ebulio esperada, reduz-se o aquecimento de tal modo que o aumento de temperatura no ultrapasse 1 K/
/minuto. Ao aproximar-se a temperatura de ebulio, observa-se a formao de bolhas que emergem
rapidamente do capilar utilizado para a determinao do ponto de ebulio.
A temperatura de ebulio a temperatura para a qual, face a um arrefecimento momentneo, cessa a corrente
de bolhas e o fluido inicia repentinamente a subida no capilar. A leitura correspondente efectuada no
termmetro a temperatura de ebulio da substncia.
De acordo com o princpio modificado (figura 3) determina-se a temperatura de ebulio num capilar para a
determinao da temperatura de fuso. O capilar distendido at se obter uma ponta fina com cerca de 2 cm
de comprimento (a) e aspira-se uma pequena quantidade da amostra. Fecha-se por fuso a extremidade aberta
do capilar de tal modo que na extremidade fique uma pequena bolha de ar. Enquanto se aquece o aparelho para
a determinao da temperatura de fuso, a bolha de ar expande-se (b). A temperatura de ebulio corresponde
temperatura para a qual o tampo dessa substncia atinge o nvel da superfcie do lquido do banho (c).
1.6.5. Deteco por clula fotoelctrica
A amostra aquecida num tubo capilar no interior de um bloco metlico aquecido.
Pelos orifcios existentes no bloco, enviado um feixe de luz atravs da substncia para uma clula fotoelctrica
calibrada com preciso.
Durante o aumento da temperatura da amostra emergem bolhas de ar simples provenientes do capilar de
ebulio. Ao atingir-se a temperatura de ebulio o nmero de bolhas aumenta fortemente. Isto provoca uma
alterao na intensidade da luz registada pela clula fotoelctrica, que envia um sinal de paragem transmitido
para o indicador que efectua a leitura da temperatura num termmetro de resistncia de platina localizado no
bloco.
Este mtodo especialmente til, uma vez que permite determinaes de valores inferiores temperatura
ambiente e at 253,15 K ( 20
o
C) sem qualquer modificao no aparelho. Apenas necessrio colocar o
instrumento num banho de arrefecimento.
1.6.6.1. Anlise trmica diferencial
Ver apndice.
1.6.6.2. Calorimetria de explorao diferencial
Ver apndice.
2. RESU LTADOS
Para pequenos desvios em relao presso normal (mximo 5 kPa), as temperaturas de ebulio so
corrigidas para o valor T
n
pela equao de converso de Sidney Young:
T
n
= T + (f
T
p)
em que:
p = (101,325 p) [ateno ao sinal]
p = presso medida em kPa
f
T
= taxa de variao da temperatura de ebulio com a presso em K/kPa
T = temperatura de ebulio medida em K
T
n
= temperatura de ebulio corrigida para a presso normal, em K
Os factores para a correco da temperatura, o valor f
T
e as equaes para a sua aproximao esto descritos nas
normas internacionais e nacionais anteriormente referidas para diversas substncias.
Por exemplo, o mtodo DIN 53171 refere as seguintes correces aproximadas para solventes incorporados em
tintas:
Quadro 2
Temperatura factores de correco f
T
Temperatura T (K) Factor de correco f
T
(K/kPa)
323,15 0,26
348,15 0,28
373,15 0,31
398,15 0,33
423,15 0,35
448,15 0,37
Temperatura T (K) Factor de correco f
T
(K/kPa)
473,15 0,39
498,15 0,41
523,15 0,44
548,15 0,45
573,15 0,47
3. RELATRIO
mtodo utilizado,
especificao exacta da substncia (identificao e impurezas) e fases prvias de purificao, se for caso
disso,
uma estimativa da preciso.
Estabelece-se que a temperatura de ebulio a mdia de pelo menos duas medies situadas no intervalo de
preciso estimada (ver quadro 1).
As temperaturas de ebulio medidas e os seus valores mdios devero ser especificados e os valores da presso
para os quais se efectuaram as medies devero ser apresentados em kPa. Preferencialmente a presso dever
ser prxima da presso atmosfrica normal.
Todas as informaes e notas relevantes para a interpretao de resultados devero ser apresentadas,
especialmente no que diz respeito s impurezas e estado fsico da substncia.
4. REFERNCIAS
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II.
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, 3rd ed.,
Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.
Apndice
Para pormenores tcnicos adicionais possvel consultar, por exemplo, as normas seguintes:
1. Ebulimetro
1.1 Dispositivos de medio da temperatura de fuso com banho lquido
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes
2. Processo de destilao (intervalo de ebulio)
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)
BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products
BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics
DIN 53171 Lsungsmittel fr Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes
NF T 20-608 Distillation: dtermination du rendement et de 1'intervalle de distillation
3. Anlise trmica diferencial e calorimetria de explorao diferencial
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of
differential thermal analysis
DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe
A.3. DENSIDADE RELATIVA
1. MTODO
Os mtodos descritos baseiam-se nas Normas de Ensaio da OCDE (1). Os princpios fundamentais encontram-
-se na referncia (2).
1.1. INTRODUO
Os mtodos descritos para a determinao da densidade relativa so aplicveis a substncias slidas e a
substncias lquidas, sem qualquer restrio no que diz respeito ao seu grau de pureza. Os diversos mtodos
utilizveis encontram-se resumidos no quadro 1.
A densidade relativa D
20
4
de um slido ou de um lquido a razo entre a massa de um determinado volume da
substncia que se pretende testar, temperatura de 20
o
C, e a massa de igual volume de gua, temperatura de
4
o
C. A densidade relativa no tem dimenses.
A densidade, p, de uma substncia o quociente entre a massa, m, e o seu volume, v.
A densidade, p, dada, em unidades do SI, em kg/m
3
.
1.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA (1) (3)
No necessrio utilizar substncias de referncia em todos os casos quando se est a investigar uma nova
substncia. Essas substncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibrao do mtodo e
1.4. PRINCPIO DOS MTODOS
Recorre-se utilizao de quatro classes de mtodos.
1.4.1. Mtodos de flutuao
1.4.1.1. Hidrmetro (para substncias lquidas)
possvel efectuar determinaes rpidas e suficientemente exactas de densidade utilizando hidrmetros de
flutuao, os quais permitem obter a densidade de um lquido a partir da profundidade de imerso por simples
leitura de uma escala graduada.
1.4.1.2. Balana hidrosttica (para substncias lquidas e slidas)
Pode recorrer-se diferena entre o peso de uma amostra testada medido ao ar e num lquido adequado (por
exemplo gua) para se determinar a sua densidade.
No caso dos slidos, a densidade medida apenas representativa da amostra particular utilizada. Para a
determinao da densidade de lquidos pesa-se primeiro ao ar um corpo de volume conhecido, v, e depois pesa-
-se mergulhado no lquido.
1.4.1.3. Mtodo do corpo imerso (para substncias lquidas) (4)
De acordo com este mtodo determina-se a densidade de um lquido a partir da diferena entre os resultados da
pesagem do lquido antes e aps a imerso, nesse lquido, de um corpo de volume conhecido.
1.4.2. Mtodos do picnmetro
Tanto para os slidos como para os lquidos possvel utilizar picnmetros de configuraes diversas e com
volumes conhecidos. Calcula-se a densidade a partir da diferena em peso entre o picnmetro cheio e vazio e
pelo conhecimento do seu volume.
1.4.3. Picnmetro por comparao ao ar (para slidos)
Pode medir-se a densidade de um slido de qualquer configurao, temperatura ambiente, utilizando o
picnmetro de comparao de gases. Mede-se o volume de uma substncia ao ar ou num gs inerte, usando um
cilindro de volume calibrado varivel. Para se calcular a densidade efectua-se uma medio de massa depois da
medio de volume.
1.4.4. Densmetro oscilante (5) (6) (7)
possvel medir a densidade de um lquido utilizando um densmetro oscilante. Utiliza-se um oscilador
mecnico com a forma de um tubo em U o qual se faz vibrar frequncia de ressonncia do oscilador, a qual
depende da sua massa. A introduo de uma amostra altera a frequncia de ressonncia do oscilador. O
aparelho tem de ser calibrado utilizando duas substncias lquidas de densidades conhecidas. Essas substncias
devero ser preferencialmente escolhidas de tal modo que as suas densidades relativas cubram o intervalo que
se pretende medir.
A aplicabilidade dos diversos mtodos utilizados para a determinao da densidade relativa encontra-se
resumida no quadro.
As normas apresentadas como exemplos, que devem ser consultadas para obteno de pormenores tcnicos
adicionais, esto mencionadas no apndice.
Os testes devem ser efectuados temperatura de 20
o
C e devero ser realizadas pelo menos duas medies.
2. RESULTADOS
Ver normas.
3. RELATRIO
mtodo utilizado,
especificao exacta da substncia (identificao e impurezas) e fases prvias de purificao, se as houver.
A densidade relativa D
20
4
dever constar do relatrio conforme definido em 1.2, em conjunto com o estado
fsico da substncia ensaiada.
No relatrio devem constar todas as informaes e notas relevantes para a interpretao dos resultados,
especialmente no que diz respeito a impurezas e ao estado fsico da substncia.
Quadro
Aplicabilidade dos mtodos
Mtodo de medida
Densidade
Viscosidade
dinmica mxima
possvel
Normas existentes
Slido Lquido
1.4.1.1. Hidrmetro Sim 5 Pa s ISO 387,
ISO 649-2,
NF T 20-050
Mtodo de medida
Densidade
Viscosidade
dinmica mxima
possvel
Normas existentes
Slido Lquido
1.4.1.2. Balana hidrosttica
a) slidos Sim ISO 1183 (A)
b) lquidos Sim 5 Pa s ISO 901 e 758
1.4.1.3. Mtodo do corpo
imerso
Sim 20 Pa s DIN 53217
1.4.2. Picnmetro ISO 3507
a) slidos Sim ISO 1183 (B),
NF T 20-053
b) lquidos Sim 500 Pa s ISO 758
1.4.3. Picnmetro por com-
parao ao ar
Sim DIN 55990 parte 3,
DIN 53243
1.4.4. Densmetro oscilante Sim 5 Pa s
4. REFERNCIAS
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(8l) 30 final.
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed.,
Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part l.
(3) IUPAC, Recommended reference materiais for realization of physico-chemical properties, Pure and
applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 508.
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flssigkeiten, Technisches Messen tm,
1979, vol. ll, p. 427-430.
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, p. 297-302.
(6) Baumgarten, D., Fllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen Verfahren zur Dichtebestim-
mung bei flssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975,
vol. 37, p. 717-726.
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976,
vol. 9, p. 253-255.
Apndice
Para obteno de pormenores tcnicos adicionais possvel consultar, por exemplo, as normas seguintes:
1. Mtodos de flutuao
1.1. Hidrmetro
DIN 12790, ISO 387 Hidrmetro; instrues gerais
DIN 12791 Parte I: Hidrmetros de densidade; sua construo, ajustamento e utilizao
Parte II: Hidrmetros de densidade; dimenses normalizadas, designao
Parte III: Utilizao e teste
ISO 649-2 Objectos de vidro laboratoriais: hidrmetros de densidade para fins gerais
NF T 20-050 Produtos qumicos para utilizao industrial Determinao da densidade de
lquidos Mtodo areomtrico
DIN 12793 Objectos de vidro laboratoriais: hidrmetros de resoluo varivel
1.2. Balana hidrosttica
Para as substncias slidas
ISO 1183 Mtodo A: Mtodos para a determinao da densidade e para a determinao da
densidade relativa de plsticos excluindo os plsticos celulares
slidos que no sejam ps e de produtos celulares Mtodo da balana
hidrosttica
ASTM-D-792 Determinao do peso especfico e da densidade de plsticos por deslocamento
DIN 53479 Testes de plsticos e de elastmeros; determinao da densidade
Para substncias lquidas
ISO 901 ISO 758
DIN 51757 Testes de leos minerais e de materiais afins; determinao da densidade
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 e ASTM D 1481-62
ASTM D 1298 Densidade, peso especfico ou densidade relativa IPA (indicador de posio
atmosfrico) do petrleo bruto e de produtos derivados de petrleo lquido pelo
mtodo do hidrmetro
BS 4714 Densidade, peso especfico ou densidade IPA (indicador de posio atmosfrico) do
petrleo bruto e de produtos derivados de petrleo lquido pelo mtodo do
hidrmetro
1.3. Mtodo do corpo imerso
DIN 53217 Testes de tintas, de vernizes e de materiais de revestimentos anlogos; determinao
da densidade; mtodo do corpo imerso
2. Mtodos picnomtricos
2.1. Para substncias lquidas
ISO 3507 Picnmetros
ISO 758 Produtos qumicos lquidos; determinao da densidade temperatura de 20
o
C
DIN 12797 Picnmetro de Gay-Lussac (para lquidos no volteis que no sejam muito
viscosos)
DIN 12798 Picnmetro de Lipkin (para lquidos com uma viscosidade cinemtica inferior a
100,10
-6
m
2
s
-1
temperatura de 15
o
C)
DIN 12800 Picnmetro de Sprengel (para lquidos conforme a norma DIN 12798)
DIN 12801 Picnmetro de Reischauer (para lquidos com uma viscosidade cinemtica inferior a
100,10
-6
m
2
s
-1
temperatura de 20
o
C, aplicvel em particular tambm aos
hidrocarbonetos e s solues aquosas e bem assim aos lquidos com uma presso
de vapor superior, aproximadamente 1 bar temperatura de 90
o
C)
DIN 12806 Picnmetro de Hubbard (para lquidos viscosos de todos os tipos e que no
possuam uma presso de vapor demasiadamente elevada, aplicvel particularmente
tambm para tintas, vernizes e betumes)
DIN 12807 Picnmetro de Bingham (para lquidos, conforme a norma DIN 12801)
DIN 12808 Picnmetro de Jaulmes (em particular para a mistura de etanol e gua)
DIN 12809 Picnmetro com termmetro incorporado e tubo lateral capilar (para lquidos que
no sejam muito viscosos)
DIN 53217 Testes de tintas, de vernizes e de produtos anlogos; determinao da densidade
com picnmetro
DIN 51757 Ponto 7: Testes de leos minerais e de materiais afins; determinao da densidade
ASTM D 297 Seco 15: Produtos de borracha anlise qumica
ASTM D 2111 Mtodo C: Compostos orgnicos halogenados
BS 4699 Mtodo para a determinao do peso especfico e da densidade de produtos
derivados do petrleo (mtodo do picnmetro bicapilar graduado)
BS 5903 Mtodo para a determinao da densidade relativa e da densidade de produtos
derivados do petrleo recorrendo ao mtodo do picnmetro de capilar fechado
slidos convertidos em p e de lquidos Mtodo picnomtrico
2.2. Para substncias slidas
ISO 1183 Mtodo B: Mtodo para a determinao da densidade e da densidade relativa dos
plsticos com excluso dos plsticos celulares
slidos convertidos em p e de lquidos Mtodo picnomtrico
DIN 19683 Determinao da densidade de solos
3. Picnmetro por comparao ao ar
DIN 55990 Parte III: Prfung von Anstrichstoffen und hnlichen Beschichtungsstoffen;
Pulverlack; Bestimmung der Dichte
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prfung
A.4. PRESSO DE VAPOR
1. MTODO
A maior parte dos mtodos descritos baseiam-se na publicao da OCDE (1). Os princpios fundamentais
encontram-se descritos nas referncias (2) e (3).
1.1. INTRODUO
Considera-se til possuir informaes preliminares sobre a estrutura, a temperatura de fuso e a temperatura de
ebulio da substncia para se efectuar este teste.
No existe nenhum procedimento de medio nico aplicvel a todo o intervalo de presses de vapor. Em
consequncia, recomendam-se diversos mtodos utilizveis para a medio da presso de vapor para valores
compreendidos entre < 10
-4
e 10
5
Pa.
Normalmente as impurezas afectam a presso de vapor. O grau dessa influncia depende muito do tipo das
impurezas.
No caso de existirem na amostra impurezas volteis que possam afectar o resultado, a substncia deve ser
purificada. Tambm se considera apropriado referir a presso de vapor para o material tcnico.
Alguns dos mtodos aqui descritos utilizam aparelhos com partes metlicas; deve tomar-se este facto em
considerao no caso de se testarem substncias corrosivas.
Define-se a presso de vapor de uma substncia como sendo a presso de saturao exercida sobre uma
substncia slida ou lquida. Para uma situao de equilbrio termodinmico, a presso de vapor de uma
substncia pura, apenas funo da temperatura.
A unidade de presso do SI que se deve utilizar o pascal (Pa).
As unidades antigamente utilizadas e os seus factores de converso so:
1 Torr (- 1 mm Hg) = 1,333 10
2
Pa
1 atmosfera = 1,013 10
5
Pa
1 bar = 10
5
Pa
A unidade de temperatura do SI o kelvin (K).
A constante universal dos gases perfeitos R = 8,314 J mol
-1
K
-1
A dependncia da presso de vapor em funo da temperatura descrita pela equao de Clausius-Clapeyron:
log p =
H
v
2,3RT
const:
em que:
p = presso de vapor da substncia em pascal
H
v
= calor de vaporizao da substncia em J mol
-1
R = constante universal dos gases perfeitos em J mol
-1
K
-1
T = temperatura termodinmica em K
No necessrio utilizar substncias de referncia em todos os casos quando se est a investigar uma nova
substncia. Essas substncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibrao do mtodo e
para proporcionar a comparao dos resultados obtidos com outros mtodos.
Para a determinao da presso de vapor propem-se sete mtodos que podem ser aplicados em diferentes
intervalos de presso de vapor. Para cada um desses mtodos determina-se a presso de vapor para vrias
temperaturas. Num intervalo de temperaturas limitado, o logaritmo da presso de vapor de uma substncia
pura uma funo linear do inverso da temperatura.
No mtodo dinmico mede-se a temperatura de ebulio referente a uma presso especfica.
Intervalo recomendado:
10
3
at 10
5
Pa
Este mtodo tem sido recomendado tambm para a determinao da temperatura de ebulio normal e til
at temperatura de 600 K.
1.4.2. Mtodo esttico
No processo esttico, determina-se a presso de vapor estabelecida num sistema fechado em equilbrio
termodinmico, para uma temperatura especfica. Este mtodo adequado para slidos e lquidos de um s
componente e de multicomponentes.
10 at 10
5
Pa
Este mtodo tambm pode ser utilizado no intervalo de 1 a 10 Pa, com as devidas precaues.
1.4.3. Isoteniscpio
Este mtodo normalizado tambm um mtodo esttico mas normalmente no adequado para sistemas
multicomponentes. Existe informao adicional na publicao ASTM, mtodo D-2879-86.
desde 100 at10
5
Pa
1.4.4. Mtodo de efuso: balana de presso de vapor
Determina-se a quantidade de substncia que sai de uma clula, por unidade de tempo, atravs de uma abertura
de dimenses conhecidas, sob condies de vcuo, de forma que o retorno da substncia clula seja
desprezvel (por exemplo, medindo o impulso exercido sobre uma balana sensvel, pela aco de um jacto de
vapor, ou medindo a perda de peso de clula).
10
-3
at 1 Pa
1.4.5. Mtodo de efuso: por perda de peso ou por captao do vaporizado
O mtodo baseia-se na estimativa da massa da substncia de teste que se escoa por unidade de tempo numa
clula de Knudsen (4) na forma de vapor, atravs de um micro-orifcio, sob condies de ultravcuo. Pode
obter-se a massa efundida de vapor determinando a perda de massa da clula ou condensando o vapor a baixa
temperatura e determinando a quantidade de substncia volatilizada, recorrendo-se anlise cromatogrfica.
Calcula-se a presso de vapor aplicando a relao de Hertz-Knudsen.
10
-3
a 1 Pa
1.4.6. Mtodo de saturao de gs
Faz-se passar sobre a substncia uma corrente de gs portador inerte, de tal modo que este fique saturado com
o vapor daquela. A quantidade de material transportado por uma quantidade conhecida daquele gs inerte
susceptvel de ser medida por recolha num colector adequado ou por recurso a uma tcnica analtica. Utiliza-se
depois esse material para calcular a presso de vapor a uma determinada temperatura.
10
-4
a 1 Pa
Tambm se pode utilizar este mtodo no intervalo de 1 a 10 Pa, com as precaues adequadas.
1.4.7. Rotor giratrio
No manmetro de rotor giratrio, o elemento de medio real uma pequena esfera de ao que colocada em
suspenso num campo magntico e que gira a uma velocidade elevada. Calcula-se a presso de gs, a partir da
diminuio de velocidade da esfera de ao, a qual depende da presso.
10
-4
at 0,5 Pa
Os diversos mtodos para a determinao da presso de vapor so comparados pelas suas caractersticas de
aplicao, repetitividade, reprodutibilidade, intervalo de medio, normas existentes. Essa comparao
encontra-se resumida no quadro que se segue.
Quadro
Critrios de qualidade
Mtodo de medio
Substncias
Repetitividade
estimada (
1
)
Reprodutibili-
dade estimada
(
1
)
Intervalo
recomendado
Norma existente
Slido Lquido
1.4.1. Mtodo din-
mico
Baixo
ponto
de
fuso
Sim At 25 % At 25 % 10
3
Pa at 2
10
3
Pa
1 a 5 % 1 a 5 % 2 l0
3
Pa
at 10
-5
Pa
1.4.2. Mtodo est-

tico
Sim Sim 5 a 10 % 5 a 10 % 10 Pa at
10
5
Pa (
2
)
NFT 20-048
(5)
1.4.3. Isoteniscpio Sim Sim 5 a 10 % 5 a 10 % 10
2
Pa at
10
5
Pa
ASTM-D
2879-86
1.4.4. Mtodo de
efuso:
balana de
presso de
vapor
Sim Sim 5 a 20 % At 50 % 10
-3
Pa at
1 Pa
NFT
20-047 (6)
Mtodo de medio
Substncias
Repetitividade
estimada (
1
)
Reprodutibili-
dade estimada
(
1
)
Intervalo
recomendado
Norma existente
Slido Lquido
1.4.5. Mtodo de
efuso: perda
de peso
Sim Sim 10 a 30 % 10
-3
Pa at
1 Pa
1.4.6. Mtodo de
saturao de
gs
Sim Sim 10 a 30 % At 50 % 10
-4
Pa at
1 Pa (
2
)
1.4.7. Mtodo do
rotor girat-
rico
Sim Sim 10 a 20 % 10
-4
Pa at
0,5 Pa
(
1
) Dependente do grau de pureza.
(
2
) Estes mtodos tambm podem ser utilizados no intervalo 1 a 10 Pa, com as precaues adequadas.
1.6.1. Medio dinmica
1.6.1.1. Equipamento
O equipamento tpico de medida constitudo por um recipiente de ebulio ao qual est associado um sistema
de arrefecimento de vidro ou de metal (figura 1), instrumentos para a medio da temperatura e instrumentos
para regular e medir a presso. Na figura representa-se um equipamento tpico de medio de vidro, resistente
ao calor e composto por cinco partes:
O tubo grande com parede parcialmente dupla constitudo por uma junta normalizada, um sistema de
arrefecimento, um recipiente de arrefecimento e uma entrada.
O cilindro de vidro, com uma bomba Cottrell, montado na seco de ebulio do tubo e possui uma
superfcie rugosa de vidro fragmentado para evitar ressaltos durante o processo de ebulio.
A temperatura medida com um sensor de temperatura adequado (por exemplo, um termmetro de
resistncia, ou um termopar) imerso no interior do equipamento at ao ponto de medida (n.
o
5 da figura 1)
atravs de uma entrada adequada (por exemplo, junta normalizada macho).
Efectuam-se as necessrias ligaes ao equipamento de regulao e de medio da presso.
A ampola, que funciona como um separador volumtrico, ligada ao equipamento de medida por meio de um
tubo capilar.
Aquece-se o recipiente de ebulio utilizando um elemento de aquecimento (por exemplo, um calorfero de
cartucho) inserido no equipamento de vidro pela parte inferior. Liga-se a corrente de aquecimento necessria e
regula-se atravs de um termopar.
A presso de vcuo necessria, compreendida aproximadamente entre 10
2
Pa e 10
5
Pa, produzida com uma
bomba de vcuo.
Utiliza-se uma vlvula adequada para admisso de ar ou de azoto para regular a presso (intervalo de medio
compreendido aproximadamente entre 10
2
e 10
5
Pa) e para ventilao.
Mede-se a presso com um manmetro.
1.6.1.2. Procedimento de medio
Mede-se a presso de vapor determinando a temperatura de ebulio da amostra para diversas presses
especficas compreendidas, grosso modo, entre 10
3
e 10
5
Pa. A existncia de uma temperatura estvel sob uma
presso constante significa que se atingiu a temperatura de ebulio. As substncias espumosas no podem ser
submetidas a este mtodo de medio.
Coloca-se a substncia num recipiente limpo e seco. possvel que surjam problemas com slidos no
pulverizados mas esta questo pode ser resolvida frequentemente aquecendo a gua da manga de
arrefecimento. Depois de se ter enchido o recipiente, veda-se o equipamento na flange e eliminam-se os
gases da substncia. Ajusta-se seguidamente a presso para o valor mais baixo desejado e liga-se o aquecimento.
Simultaneamente liga-se o sensor de temperatura a um registador.
Atinge-se o equilbrio quando se regista uma temperatura de ebulio constante a uma presso constante. E
necessrio tomar precaues para evitar a instabilidade durante a ebulio. Alm disso pode ocorrer
condensao total no sistema de arrefecimento. No caso de se determinar a presso de vapor de slidos de
baixo ponto de fuso necessrio tomar precaues para evitar o bloqueio do condensador.
Depois de se ter registado este ponto de equilbrio ajusta-se a presso para um valor superior. Repete-se este
processo at se atingir a presso de 10
5
Pa (aproximadamente 5 a 10 pontos de medio na totalidade). Para
verificao, os pontos de equilbrio devero ser repetidos para valores decrescentes da presso.
1.6.2. Medio esttica
O equipamento constitudo por um recipiente para a amostra, um sistema de aquecimento e um sistema de
arrefecimento para regular a temperatura da amostra e um aparelho para medio da temperatura. O
equipamento incorpora tambm instrumentos para ajustar e medir a presso. As figuras 2a e 2b ilustram os
princpios bsicos envolvidos.
A cmara da amostra (figura 2a) ligada num dos lados a uma vlvula prpria para alto vcuo. Ao outro lado
liga-se um tubo em U contendo um fluido manomtrico adequado. Uma das extremidades do tubo em U
ramifica-se e vai ligar-se bomba de vcuo, botija de azoto ou vlvula de ventilao, e a um manmetro.
possvel utilizar um manmetro com um indicador de presso em vez de um tubo em U (figura 2b).
No sentido de se regular a temperatura da amostra, coloca-se o recipiente da amostra com a vlvula e com o
tubo em U ou com o manmetro num banho que mantido a uma temperatura constante 0,2 K. As
medies de temperatura so efectuadas na parede exterior do recipiente que contm a amostra ou no prprio
recipiente.
Para fazer o vcuo no equipamento utiliza-se uma bomba de vcuo com um sistema de arrefecimento.
No mtodo 2a mede-se a presso de vapor da substncia indirectamente, utilizando um indicador de zero. Este
mtodo leva em considerao o facto de a densidade do fluido no tubo em U se alterar no caso de a
temperatura variar muito.
Os lquidos a seguir indicados so adequados para utilizao como indicadores de zero para o tubo em U,
dependendo do intervalo de presso e do comportamento qumico das substncias testadas: mercrio, leos de
silicone, ftalatos. A substncia testada no deve dissolver-se perceptivelmente ou reagir com o fluido do tubo
em U.
Para o manmetro o mercrio pode ser utilizado no intervalo compreendido entre a presso atmosfrica
normal e 10
2
Pa, ao passo que os leos de silicone e os ftalatos so adequados para utilizao no intervalo
compreendido entre 10 Pa e 10
2
Pa. Os manmetros de membrana aquecvel podem ser utilizados
eventualmente para valores inferiores a 10
-1
Pa. Existem ainda outros manmetros susceptveis de serem
utilizados para valores inferiores a 10
2
Pa.
1.6.2.2. Procedimentos de medio
Antes da medio todos os componentes do equipamento representado na figura 2 devem ser completamente
limpos e secos.
Para o mtodo 2a, enche-se o tubo em U com o lquido escolhido, o qual deve ser desgaseificado a temperatura
elevada, antes de se fazer qualquer leitura.
Coloca-se a substncia testada no equipamento o qual depois fechado e reduz-se a temperatura o suficiente
para remover os gases. A temperatura deve ser suficientemente baixa para garantir a remoo do ar mas, no
caso das amostras com vrios componentes, o seu valor no deve alterar a composio do material. Se
necessrio pode-se estabelecer o equilbrio mais rapidamente por agitao.
A amostra pode ser sobrearrefecida, por exemplo, com azoto lquido (precaues: condensao do ar, fluido da
bomba) ou com uma mistura de etanol e gelo seco. Para medies a baixa temperatura utiliza-se um banho de
regulao da temperatura ligado a um sistema ultracriognico.
Estando aberta a vlvula sobre o recipiente da amostra, aplica-se o sistema de suco durante diversos minutos
para se efectuar a remoo do ar. Depois fecha-se a vlvula e reduz-se a temperatura da amostra para o mais
baixo nvel desejado. Se necessrio, dever repetir-se diversas vezes a operao de desgaseificao.
Ao aquecer-se a amostra a presso de vapor aumenta. Isto altera o equilbrio do fluido no tubo em U. Para se
compensar este fenmeno permite-se a entrada de azoto ou de ar no aparelho atravs de uma vlvula, at que o
indicador de presso de fluido marque novamente zero. A presso necessria para conseguir isto pode ser lida
com um manmetro de preciso temperatura ambiente. Esta presso corresponde presso de vapor da
substncia para esse valor especfico da temperatura medida.
O mtodo 2b idntico mas a presso de vapor lida directamente.
A dependncia da presso de vapor em funo da temperatura determinada para pequenos intervalos
adequados (aproximadamente 5 a 10 pontos de medio na totalidade) at se alcanar o mximo desejado. Para
verificao devero ser repetidas as leituras com os valores de temperatura a baixar.
No caso de os valores obtidos na repetio das leituras no coincidirem com a curva obtida para os valores
crescentes da temperatura, pode ser devido s razes seguintes:
1. A amostra ainda contm ar (por exemplo, no caso dos materiais de alta viscosidade) ou contm
substncias de baixo ponto de ebulio, as quais so libertadas durante o aquecimento e podem ser
removidas por suco seguindo-se novamente um sobrearrefecimento.
2. A temperatura de arrefecimento no suficientemente baixa. Nesse caso utiliza-se azoto lquido como
agente de arrefecimento.
Se estivermos perante o caso 1 ou 2, os ensaios devero ser repetidos.
3. A substncia sofre uma reaco qumica no intervalo de temperatura pesquisado (por exemplo,
decomposio, polimerizao).
1.6.3. Isoteniscpio
Na referncia 7 encontra-se uma descrio completa deste mtodo. Na figura 3 mostra-se o princpio de
funcionamento deste dispositivo de medio. Analogamente ao mtodo esttico descrito em 1.6.2, o
isoteniscpio apropriado para fazer uma investigao do tipo descrito em slidos ou lquidos.
No caso dos lquidos, a prpria substncia serve como fluido no manmetro auxiliar. Coloca-se no
isoteniscpio uma quantidade do lquido, suficiente para encher a ampola e o segmento curto da seco do
manmetro. Liga-se o isoteniscpio a um sistema de vcuo, procede-se evacuao do isoteniscpio e enche-se
depois com azoto. Repete-se duas vezes a evacuao e a purificao do sistema para garantir a remoo do
oxignio residual. Coloca-se o isoteniscpio cheio em posio horizontal de tal modo que a amostra se espalhe
segundo uma camada fina na ampola da amostra e na seco do manmetro (parte em U). Reduz-se a presso
do sistema para 133 Pa e aquece-se suavemente a amostra at ela iniciar a ebulio (remoo de gases estveis
dissolvidos). Depois coloca-se o isoteniscpio de tal modo que a amostra regresse ampola e ao segmento
curto do manmetro, ficando os dois assim completamente cheios com lquido. Mantm-se a presso tal como
para a desgaseificao; aquece-se com chama fraca a extremidade de sada da ampola da amostra at que o
vapor libertado pela amostra se expanda suficientemente para deslocar parte da amostra da parte superior da
ampola e do brao do manmetro para o interior da seco do manmetro do isoteniscpio, originando um
espao livre de azoto e cheio de vapor.
Depois coloca-se o isoteniscpio num banho a temperatura constante e ajusta-se a presso do azoto at que o
seu valor seja igual ao da amostra. O equilbrio entre presses indicado pela seco do manmetro do
isoteniscpio. Em situao de equilbrio, a presso de vapor do azoto igual presso de vapor da substncia.
No caso dos slidos, dependendo da presso e do intervalo de temperaturas, utilizam-se os lquidos
manomtricos enumerados em 1.6.2.1. O lquido manomtrico isento de gases utilizado para encher uma
protuberncia existente no segmento longo do isoteniscpio. Depois coloca-se na ampola o slido que se est a
estudar e desgaseifica-se a uma temperatura elevada. Depois disso inclina-se o isoteniscpio de tal modo que o
lquido manomtrico possa fluir para o interior do tubo em U. A medio da presso de vapor em funo da
temperatura efectua-se de acordo com 1.6.2.
1.6.4. Mtodo de efuso: balana de presso de vapor
Encontram-se descritas na literatura vrias verses de equipamento (1). O equipamento aqui descrito ilustra o
princpio geral do mtodo (figura 4). A figura 4 mostra os componentes principais do equipamento,
consistindo num recipiente de vidro ou de ao inoxidvel para alto vcuo, equipamento para produzir e medir
presso de vcuo e componentes incorporados para medir a presso de vapor numa balana. O equipamento
possui os seguintes componentes incorporados:
um forno evaporador com flange e entrada giratria. O forno evaporador um recipiente cilndrico feito,
por exemplo, de cobre ou de uma liga quimicamente resistente e de boa condutividade trmica. Tambm
se pode utilizar um recipiente de vidro com uma parede de cobre. O forno possui um dimetro de
aproximadamente 3 a 5 cm e entre 2 e 5 cm de altura. Existem entre uma e trs aberturas de dimenses
diferentes para a corrente de vapor. O forno aquecido utilizando uma placa de aquecimento colocada
por baixo ou uma espiral de aquecimento em torno da superfcie exterior. Para se evitar que o calor seja
dissipado na placa de base, liga-se o calorfero placa de base utilizando um metal de fraca condutividade
trmica (nquel/prata ou ao de crmio-nquel), por exemplo um tubo de nquel/prata ligado a uma
entrada rotativa no caso de se utilizar um forno com diversas aberturas. Este sistema possui a vantagem
de permitir a introduo de uma barra de cobre. Isto permite o arrefecimento exterior utilizando um
banho de arrefecimento,
no caso de a tampa do forno de cobre possuir trs aberturas de dimetros diferentes situadas a 90
o
umas
das outras, possvel abranger diversos intervalos de presso de vapor dentro do intervalo total de
medio (aberturas com dimetros compreendidos aproximadamente entre 0,30 e 4,50 mm). Utilizam-se
as aberturas maiores para valores da presso de vapor menores e vice-versa. Rodando o forno pode
seleccionar-se a abertura desejada ou uma posio intermdia da presso de vapor (abertura do forno/
/blindagem/campnula de balana) e a corrente de molculas libertada ou deflectida pela abertura do
forno sobre a balana. No sentido de se medir a temperatura da substncia coloca-se num ponto
adequado um termopar ou um termmetro de resistncia,
sobre a blindagem existe uma campnula pertencente a uma microbalana altamente sensvel (ver
adiante). O dimetro da campnula da balana de aproximadamente 30 mm. O alumnio revestido a
ouro o material adequado,
consoante o tipo de balana, assim existem aberturas para o travesso da balana e uma abertura na
blindagem para a corrente de molculas garantindo-se a condensao completa do vapor na campnula
da balana. A dissipao do calor para o exterior garantida, por exemplo, por uma barra de cobre ligada
a uma caixa de refrigerao. A barra aplicada atravs da placa de base e termicamente isolada desta, por
exemplo, com um tubo de ao de crmio-nquel. Mergulha-se a barra num balo de Dewar contendo
azoto lquido existente sob a placa da base ou faz-se circular azoto lquido pela barra. Deste modo a caixa
de refrigerao mantida aproximadamente temperatura de 120
o
C. A campnula da balana
arrefecida exclusivamente por radiao o que satisfatrio para o intervalo de presses que se pretende
pesquisar (arrefecer aproximadamente 1 hora antes do incio das medies),
a balana fica colocada sobre a caixa de refrigerao. As balanas adequadas so, por exemplo, as
balanas electrnicas de dois braos altamente sensveis (8) ou instrumentos de bobina mvel altamente
sensveis (ver OCDE Test Guideline 104, Edio de 12 de Maio de 1981),
a placa da base incorpora tambm ligaes elctricas para termopares (ou para termmetros de
resistncia) e para as resistncias de aquecimento,
uma presso de vcuo no recipiente utilizando uma bomba de vcuo parcial ou uma bomba de alto
vcuo (a presso de vcuo necessria de aproximadamente 1 a 2 10
-3
Pa, obtida aps 2 horas de
bombagem). Regula-se a presso com um manmetro de ionisao adequado.
Enche-se o recipiente com a substncia testada e fecha-se a tampa. A blindagem e a caixa de refrigerao
deslizam, ficando colocadas sobre o forno. Fecha-se o aparelho e ligam-se as bombas de vcuo. A presso final
antes de se iniciarem as medies dever ser de aproximadamente 10
-4
Pa. O arrefecimento da caixa de
refrigerao tem incio a 10
-2
Pa.
Uma vez alcanado o vcuo necessrio, inicia-se o processo de calibrao para o mais baixo valor da
temperatura necessria. Ajusta-se a abertura correspondente na tampa, passando a corrente de vapor
directamente atravs da blindagem por cima da abertura e atingindo a campnula da balana arrefecida. A
campnula da balana deve ser suficientemente grande para garantir que toda a corrente conduzida atravs da
blindagem a atinja. O jacto da corrente de vapor actua como uma fora contra a campnula da balana e as
molculas condensam na sua superfcie arrefecida.
O jacto e a condensao simultnea produzem um sinal no aparelho de registo. A avaliao dos sinais fornece
duas informaes:
1. No equipamento agora descrito a presso de vapor determinada directamente a partir do jacto aplicado
campnula da balana [no necessrio conhecer o peso molecular (2)]. Ao fazer-se a avaliao das
leituras devero ser tomados em considerao factores geomtricos tais como a abertura do forno e o
ngulo da corrente de vapor.
2. Pode medir-se simultaneamente a massa do condensado podendo calcular-se a partir da a velocidade de
evaporao. Tambm se pode calcular a presso de vapor a partir da velocidade de evaporao e do peso
molecular recorrendo equao de Hertz (2)
p = G
2 RT 10
3
M
_
em que:
G = velocidade de evaporao (kg s
-1
m
-2
)
M = massa molar (g mol
-1
)
T = temperatura (K)
R = constante universal dos gases perfeitos (J mol
-1
K
-1
)
p = presso de vapor (Pa)
Depois de se ter alcanado o vcuo necessrio inicia-se a srie de medies a partir da mais baixa temperatura
de medio desejada.
Para as outras medies, aumenta-se a temperatura gradualmente at se atingir o valor da temperatura mxima
desejada. Depois arrefece-se novamente a amostra e pode registar-se uma segunda curva de presso de vapor. Se
os valores da segunda experincia no coincidem com os valores obtidos na primeira experincia, ento
possvel que a substncia possa ter sofrido decomposio no intervalo de temperatura que se est a medir.
1.6.5. Mtodo de efuso por perda de peso
O equipamento de efuso constitudo pelas partes bsicas seguintes:
um tanque que pode ser termostatado e esvaziado e no qual esto localizadas as clulas de efuso,
uma bomba de alto vcuo (por exemplo, uma bomba de difuso ou uma bomba turbomolecular) com
manmetro de vcuo,
um sifo, utilizando azoto lquido ou gelo seco.
Na figura 5, por exemplo, mostra-se um tanque de alumnio para vcuo, aquecido electricamente, possuindo
quatro clulas de efuso feitas de ao inoxidvel. A chapa de ao inoxidvel tem uma espessura aproximada de
0,3 mm e possui um orifcio de efuso com um dimetro compreendido entre 0,2 e 1,0 mm, prendendo-se
clula de efuso atravs de uma tampa roscada.
Enche-se cada clula de efuso com as substncias de referncia e de teste, fixa-se com a tampa roscada o
diafragma metlico com o orifcio e faz-se a pesagem de cada clula com uma preciso da ordem de 0,1 mg.
Coloca-se a clula no equipamento controlado por termstato o qual depois esvaziado at se obter um valor
inferior a um dcimo da presso esperada. Para intervalos definidos de tempo variando entre 5 e 30 horas,
introduz-se ar no equipamento e determina-se a perda de massa da clula de efuso fazendo nova pesagem.
No sentido de se garantir que os resultados no so influenciados por impurezas volteis, repete-se a pesagem
da clula a intervalos definidos de tempo para verificar se a velocidade de evaporao constante ao longo de
pelo menos dois intervalos de tempo.
A presso de vapor p na clula de efuso dada por:
p =
m
KAt
2 RT
M
_
em que:
m = massa da substncia que sai da clula durante o tempo t (kg)
t = tempo (s)
A = rea da perfurao (m
2
)
K = factor de correco
-1
K
-1
)
T = temperatura (K)
M = massa molar (kg mol
-1
)
O factor de correco K depende da razo entre o comprimento e o raio do orifcio do cilindro:
razo: 0,1 0,2 0,6 1,0 2,0
K: 0,952 0,909 0,771 0,672 0,514
A equao anterior pode ser escrita da forma seguinte:
p = E
m
t
T
M
_
em que E =
1
KA
2R
p
a constante da clula de efuso.
Esta constante E da clula de efuso pode ser determinada com substncias de referncia (2,9) recorrendo
equao seguinte:
E =
prt
m

Mr
T
_
em que:
p(r) = presso de vapor da substncia de referncia (Pa)
M(r)= massa molar da substncia de referncia (kg.mol
-1
)
1.6.6. Mtodo de saturao com gs
Para se efectuar este teste utiliza-se um equipamento tpico que constitudo por diversos componentes
representados na figura 6a e adiante descritos (1).
Gs inerte:
O gs portador no deve reagir quimicamente com a substncia testada. Normalmente o azoto suficiente para
satisfazer essa finalidade mas, ocasionalmente, podem ser necessrios outros gases (10). O gs utilizado deve
ser seco (ver figura 6a, n.
o
4, da legenda: sensor de humidade relativa).
Controlo de fluxo:
necessrio um sistema adequado para o controlo do gs para garantir um fluxo constante e predeterminado
atravs da coluna do saturador.
Sistemas de captao para recolha de vapor:
Estes sistemas dependem das caractersticas da amostra particular e do mtodo de anlise escolhido. O vapor
dever ser recolhido em quantidade e de forma que permita a anlise posterior. Para algumas substncias
testadas so adequados sistemas de captao contendo lquidos tais como o hexano ou o etilenoglicol. Para
outras prefervel aplicar absorventes slidos.
Em alternativa captao de vapor e anlise posterior possvel utilizar diversas tcnicas analticas tais como a
cromatografia para se determinar quantitativamente a quantidade de material transportado por uma
quantidade conhecida de gs portador. Adicionalmente possvel medir a perda de massa da amostra.
Permutador de calor:
Para medies a temperaturas diferentes pode ser necessrio incorporar no equipamento um permutador de
calor.
Coluna do saturador:
A substncia a testar depositada sob a forma de soluo sobre um suporte inerte adequado. Carrega-se a
coluna do saturador com o suporte revestido, devendo as dimenses daquela e o dbito serem tais que se
garanta a saturao completa do gs portador. A coluna do saturador deve ser controlada por termstato. Para
medies de temperaturas superiores temperatura ambiente deve-se aquecer a regio entre a coluna do
saturador e o sistema de captao para evitar a condensao da substncia a testar.
No sentido de reduzir o transporte de massa que ocorre por difuso pode colocar-se um tubo capilar depois da
coluna do saturador (figura 6b).
Preparao da coluna do saturador:
A uma quantidade adequada de suporte adiciona-se uma soluo da substncia a testar num solvente
facilmente voltil. Dever-se- adicionar a substncia a testar em quantidade suficiente para manter a saturao
durante o tempo de durao do teste. Evapora-se o solvente totalmente ao ar ou num evaporador rotativo e
carrega-se a coluna do saturador com o material bem misturado. Aps o controlo da amostra por termstato
faz-se passar azoto atravs do equipamento.
Medio:
Os sistemas de captao ou o detector incorporado so ligados linha dos efluentes da coluna e procede-se ao
registo do tempo. Verifica-se o dbito no incio e a intervalos regulares durante a experincia, utilizando um
contador de bolhas (ou continuamente com um debitmetro).
Deve-se medir a presso sada do saturador. Isto pode ser feito do modo seguinte:
a) Introduzindo um manmetro entre o saturador e os sistemas de captao (isto pode no ser satisfatrio
devido ao facto de aumentar o espao morto e a superfcie de adsoro); ou
b) Determinando as quedas de presso atravs do sistema de captao particular utilizado em funo do
dbito, numa experincia separada (isto pode no ser muito satisfatrio para os sistemas de captao de
lquidos).
Determina-se em experincias preliminares ou por estimativa o tempo necessrio para recolher a quantidade de
substncia a testar que necessria para os diversos mtodos de anlise. Em alternativa, pode utilizar-se uma
tcnica analtica quantitativa (por exemplo, a cromatografia) para recolha da substncia para outras anlises.
Antes de se calcular a presso de vapor para uma determinada temperatura necessrio efectuar experincias
preliminares para se determinar o dbito mximo que saturar completamente o gs portador com o vapor da
substncia. Esta situao fica garantida no caso de se fazer passar o gs portador atravs do saturador
suficientemente devagar e de tal modo que uma velocidade inferior no origine maior presso de vapor
calculada.
O mtodo analtico especfico ser determinado pela natureza da substncia que se pretende testar (por
exemplo, gravimetria ou cromatografia gasosa).
Determina-se a quantidade de substncia transportada por um volume conhecido de gs portador.
1.6.6.3. Calculo da presso de vapor
Calcula-se a presso de vapor a partir da densidade de vapor, W/V, segundo a equao:
p =
W
V

RT
M
em que:
W = massa da substncia de teste evaporada (g)
V = volume de gs saturado (m
3
)
-1
K
-1
)
T = temperatura (K)
M = massa molar da substncia de teste (g mol
-1
)
Os volumes medidos devem ser corrigidos em funo das diferenas de presso e de temperatura existentes
entre o debitmetro e o saturador controlado por termstato. No caso de o debitmetro estar localizado a
jusante do sistema de captao de vapor necessrio efectuar correces que levem em considerao quaisquer
ingredientes vaporizados no sistema de captao (1).
1.6.7. Rotor giratrio (8, 11, 13)
Pode-se recorrer tcnica do rotor giratrio utilizando um viscosmetro de rotor giratrio conforme se mostra
na figura 8. A figura 7 representa esquematicamente a disposio experimental.
O equipamento de medida tpico constitudo por uma cabea de medio do rotor giratrio colocada num
invlucro termostatado com graduao de 0,1
o
C). O dispositivo que contm a amostra colocado num
invlucro termostatado (com graduao de 0,01
o
C) e todas as outras partes do conjunto experimental so
mantidas a uma temperatura superior, para evitar a condensao. Por meio de vlvulas de alto vcuo, liga-se ao
sistema uma bomba de alto vcuo.
A cabea de medio do rotor giratrio constituda por uma esfera de ao (4 a 5 mm de dimetro) colocada
num tubo. A esfera encontra-se suspensa e estabilizada por um campo magntico, utilizando-se geralmente
uma combinao de magnetos permanentes e de bobinas de controlo.
A esfera forada a girar por aco de campos girantes produzidos pelas bobinas. A existncia de bobinas de
leitura, que medem a sempre presente magnetizao lateral fraca da esfera, permitem efectuar a medio da sua
velocidade de rotao.
Quando a esfera atingiu j uma determinada velocidade de rotao v(o) (normalmente cerca de 400 rotaes
por segundo), interrompe-se o fornecimento de energia e inicia-se a desacelerao devido frico com o gs.
Mede-se a diminuio da velocidade de rotao em funo do tempo. Uma vez que o atrito causado pela
suspenso magntica desprezvel quando comparado com a frico com o gs, a presso p do gs dada por:
p =
cr
10 t
ln
vt
vo
em que:
c = velocidade mdia das molculas do gs
r = raio da esfera
= densidade absoluta da esfera
= coeficiente de transferncia do momento tangencial (0 = 1 para uma superfcie esfrica ideal de uma
esfera)
t = tempo
v(t) = velocidade de rotao decorrido o tempo t
v(o) = velocidade de rotao inicial
Tambm se pode escrever esta equao do modo seguinte:
p =
cr
10

t
n
t
n 1
t
n
t
n 1
em que t
n
, t
n-1
so os tempos necessrios para a ocorrncia de um nmero N determinado de revolues. Estes
intervalos de tempo t
n
e t
n-1
so sequenciais e t
n
> t
n-1
A velocidade mdia c das molculas de gs dada por:
c =
8 RT
M
_ _
1
2
em que:
T = temperatura
R = constante universal dos gases perfeitos
M = massa molar
2. RESULTADOS
A presso de vapor obtida por quaisquer dos mtodos anteriores dever ser determinada pelo menos para dois
valores de temperatura. prefervel fazer determinaes para trs ou vrios valores de temperatura de
preferncia no intervalo compreendido entre 0 e 50
o
C, no sentido de se verificar a linearidade da curva de
presso de vapor.
3. RELATRIO
o mtodo utilizado,
a especificao exacta da substncia (identificao e impurezas) e passos de purificao preliminares, se os
houver,
pelo menos dois valores de presso de vapor e dois valores de temperatura, preferencialmente no
intervalo compreendido entre 0 e 50
o
C,
todos os dados no tratados,
uma curva do tipo log p em funo de 1/T,
uma estimativa da presso de vapor para as temperaturas de 20 ou 25
o
C.
No caso de se observar um fenmeno de transio (variao de estado, decomposio), devero ser
acrescentados os seguintes dados informativos:
natureza da alterao,
temperatura qual ocorreu essa alterao, presso atmosfrica,
presso de vapor para temperaturas 10 e 20
o
C inferiores temperatura de transio e para temperaturas
10 e 20
o
C superiores a essa temperatura (salvo no caso de a transio se efectuar do estado slido para o
estado gasoso).
Todas as informaes e notas relevantes para a interpretao dos resultados devem constar do relatrio,
especialmente no que diz respeito s impurezas e ao estado fsico da substncia.
4. REFERNCIAS
(2) Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London,
1975, vol. II.
(3) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed.,
Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I.
(4) Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, p. 593.
(5) NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use Determination of vapour
pressure of solids and liquids within range from 10
-1
to 10
-5
Pa Static method.
(6) NF- T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use Determination of vapour
pressure of solids and liquids within range from 10
-3
to 1 Pa Vapour pressure balance method.
(7) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure temperature relationship and initial
decomposition temperature of liquids by isoteniscope.
(8) G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, vol. 5 (4), p. 2440.
(9) Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, p. 1173.
(10) B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, p. 435.
(11) G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), p. 642.
(12) G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), p. 1148.
(13) J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, vol. 3 (3), p. 1715.
Apndice 1
Mtodo por estimativa
INTRODUO
Os valores calculados da presso de vapor podem ser utilizados:
para se decidir qual dos mtodos experimentais o mais apropriado,
para proporcionar uma estimativa ou um valor limite nos casos em que o mtodo experimental no pode ser aplicado
por razes tcnicas (incluindo os casos em que a presso de vapor muito baixa),
para auxiliar a identificar os casos em que se justifica a omisso da medio experimental devido ao facto de a presso
de vapor ser eventualmente inferior a 10
-5
Pa temperatura ambiente.
MTODO POR ESTIMATIVA
Pode avaliar-se a presso de vapor de lquidos e de slidos recorrendo correlao de Watson modificada (a). O nico dado
experimental necessrio o ponto de ebulio normal. Este mtodo aplicvel para um intervalo de presses compreendido
entre 10
5
e 10
-5
Pa.
A informao pormenorizada sobre o mtodo encontra-se descrita no Handbook of Chemical Property Estimation
Methods (b).
PROCEDIMENTO DE CLCULO
De acordo com (b) calcula-se a presso de vapor do modo seguinte:
ln P
vp

H
vb
Z
b
RT
b
1
3 2
T
T
b
_ _
m
T
T
b
2m 3 2
T
T
b
_ _
m 1
ln
T
T
b
_
_
_
_
em que:
T = temperatura de trabalho
T
b
= ponto de ebulio normal
P
vp
= presso de vapor temperatura T
H
vb
= calor de vaporizao
Z
b
= factor de compressibilidade (estimado a 0,97)
m = factor emprico dependente do estado fsico para o valor da temperatura de trabalho
Alm disso temos:
H
vb
T
b
= K
F
8,75 R ln T
b

em que K
F
representa um factor emprico que leva em considerao a polaridade da substncia. Na publicao de referncia
(b) encontram-se enumerados os factores K
F
para diversos tipos de compostos.
frequente encontrar dados disponveis de valores de pontos de ebulio para valores de presso reduzida. Num caso desses,
de acordo com (b), calcula-se a presso de vapor do modo seguinte:
ln P
vp
ln P
1
Hv
1
Z
b
RT
1
1 3 2
T
T
1
_ _
m
T
1
T
2m 3 2
T
T
1
_ _
m 1
ln
T
T
1
_ _
em que T
1
representa o ponto de ebulio para o valor P
1
da presso reduzida.
RELATRIO
No caso de se utilizar o mtodo por estimativa, o relatrio dever conter documentao exaustiva sobre os clculos.
BIBLIOGRAFIA
(a) K.M. Watson, Ind. Eng. Chem., 1943, vol. 35, p. 398.
(b) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.
Apndice 2
Figura 1
Aparelho para a determinao da curva de presso de vapor de acordo com o mtodo dinmico
Figura 2a
Aparelho para a determinao da curva de presso de vapor de acordo com o mtodo esttico (utilizando um
manmetro de tubo em U)
Figura 2b
Aparelho para a determinao da curva da presso de vapor de acordo com o mtodo esttico (utilizando um
indicador de presso)
Figura 3
Isoteniscpio (ver referncia 7)
Figura 4
Aparelho para a determinao da curva da presso de vapor de acordo com o mtodo da balana de presso de
vapor
Figura 5
Exemplo de um aparelho para evaporao a baixa presso utilizando o mtodo de efuso, com uma clula de
efuso com o volume de 8 cm
3
Figura 6a
Exemplo de um sistema de circulao para a determinao da presso de vapor pelo mtodo da saturao com gs
Figura 6b
Exemplo de um sistema para a determinao da presso de vapor pelo mtodo da saturao com gs, com um tubo
capilar colocado a seguir ao compartimento de saturao
Figura 7
Exemplo da disposio do conjunto experimental para o mtodo do rotor giratrio
Figura 8
Exemplo de cabea de medio de rotor giratrio
A.5. TENSO SUPERFICIAL
1. MTODO
Os mtodos descritos baseiam-se nas normas de ensaio da OCDE (1). Os princpios fundamentais encontram-
-se descritos na referncia (2).
1.1. INTRODUO
Os mtodos descritos so aplicveis medio da tenso superficial em solues aquosas.
Considera-se til possuir informaes preliminares sobre a substncia, relativamente a: solubilidade em gua,
estrutura, propriedades relativas hidrlise e concentrao crtica de formao de micelas, antes de se
efectuarem estes testes.
Os mtodos que se seguem so aplicveis maior parte das substncias qumicas, sem qualquer restrio no
que diz respeito ao seu grau de pureza.
A medio da tenso superficial pelo mtodo do tensimetro de anel aplicvel apenas a solues aquosas com
uma viscosidade dinmica inferior a cerca de 200 mPa s.
Define-se como tenso superficial a entalpia superficial livre, por unidade de rea da superfcie.
A tenso superficial dada por:
N/m (unidade do SI) ou
mN/m (subunidade do SI)
1 N/m = 10
3
dines/cm
1 mN/m = 1 dine/cm no antigo e obsoleto sistema cgs
substncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibrao do mtodo e para
proporcionar a comparao com resultados obtidos com outros mtodos.
As substncias de referncia que abrangem um intervalo amplo de tenses superficiais encontram-se
enumeradas nas referncias (1) e (3).
Os mtodos baseiam-se na medio da fora mxima que necessrio exercer verticalmente sobre um colchete
ou anel em contacto com a superfcie do lquido que se pretende examinar colocado num recipiente, no sentido
de o separar dessa superfcie, ou sobre uma placa, com uma aresta em contacto com a superfcie, no sentido de
se remover a pelcula que se formou.
As substncias solveis em gua pelo menos para valores de concentrao de 1 mg/l so testadas em soluo
aquosa para um valor nico de concentrao.
Estes mtodos so susceptveis de proporcionar maior preciso do que a eventualmente necessria para a
avaliao ambiental.
Prepara-se uma soluo da substncia em gua destilada. A concentrao desta soluo deve atingir 90 % do
valor da solubilidade de saturao da substncia em gua; no caso de esta concentrao exceder o valor de 1 g/l,
utiliza-se para os testes a concentrao de 1 g/l. No necessrio testar as substncias cujo valor de solubilidade
em gua seja inferior a 1 mg/l.
1.6.1. Mtodo da placa
Ver ISO 304 e NF T 73-060 (agentes tensioactivos: determinao da tenso superficial por remoo de pelculas
lquidas).
1.6.2. Mtodo do colchete
lquidas).
1.6.3. Mtodo do anel
lquidas).
1.6.4. Mtodo do anel harmonizado pela OCDE
1.6.4.1. Aparelho
Os tensimetros comercialmente disponveis so adequados para esta medio. So constitudos pelos
elementos seguintes:
mesa de amostra mvel,
sistema de medio de fora,
corpo para medio (anel),
recipiente de medio.
1.6.4.1.1. Me s a d e a mos t r a mv e l
Utiliza-se a mesa de amostra mvel como suporte para o recipiente de medio de temperatura controlada que
contm o lquido que se pretende testar. A sua montagem faz-se num suporte em conjunto com o sistema de
medio de fora.
1.6.4.1.2. S i s t e ma d e me d i o d e f or a
O sistema de medio de fora (ver figura) fica colocado sobre a mesa da amostra. O erro de medio de fora
no dever exceder 10
-6
N, correspondente a um erro limite de 0,1 mg numa medio de massa. Em
muitos casos, a escala dos tensimetros comercialmente disponveis calibrada em mN/m, de modo que a
tenso superficial pode ser lida directamente em mN/m, com uma preciso de 0,1 mN/m.
1.6.4.1.3. Cor po pa r a a me d i o ( a ne l )
Normalmente o anel feito de um fio de platina/irdio com a espessura aproximada de 0,4 mm e com um
permetro mdio de 60 mm. O anel suspenso horizontalmente de uma haste metlica, atravs de um suporte
triangular de montagem, que estabelece a ligao ao sistema de medio de fora (ver figura).
Figura
Corpo para a medio
(Todas as dimenses esto expressas em milmetros)
1.6.4.1.4. Re c i pi e nt e d e me d i o
O recipiente de medio que contm a soluo a testar dever ser um recipiente de vidro termostatizado. Deve
ser concebido de tal modo que durante a medio a temperatura da soluo lquida que se pretende testar e a
fase gasosa sobre a sua superfcie permaneam constantes e impedindo que haja evaporao da amostra. So
aceitveis recipientes cilndricos de vidro que possuam um dimetro interno no inferior a 45 mm.
1.6.4.2. Preparao do equipamento
1.6.4.2.1. L i mpe z a
Os recipientes de vidro devem ser cuidadosamente limpos. Se necessrio, devero ser lavados com cido
cromossulfrico quente e depois lavados com cido fosfrico xaroposo (83 a 98 % em peso de H
3
PO
4
), lavados
muito bem com gua da torneira e lavados finalmente com gua bidestilada at se obter uma reaco neutra,
efectuando-se depois a secagem ou a lavagem com um pouco do lquido da amostra que se pretende medir.
O anel deve ser primeiro muito bem lavado com gua para se fazer a remoo de quaisquer substncias que
sejam solveis em gua, depois mergulhado rapidamente em cido cromossulfrico, lavado com gua
bidestilada at se obter uma reaco neutra e finalmente dever ser aquecido rapidamente sobre uma chama de
metanol.
Nota:
A contaminao com substncias que no sejam dissolvidas ou destrudas com o cido cromossulfrico ou
com o cido fosfrico, tais como os silicones, deve ser removida usando um solvente orgnico adequado.
1.6.4.2.2. Ca l i br a o d o a pa r e l ho
A validao do aparelho consiste em verificar o seu zero e em ajust-lo de tal modo que a indicao do
instrumento permita uma determinao segura em mN/m.
Montagem:
O aparelho deve ser nivelado, por exemplo, por meio de um nvel de bolha de ar colocado na base do
tensimetro, ajustando-se os parafusos de nivelamento existentes na base.
Ajustamento do zero:
Aps a montagem do anel no aparelho e antes da imerso no lquido deve ajustar-se o zero do tensimetro e
deve verificar-se o paralelismo do anel com a superfcie do lquido. Para satisfazer este objectivo pode utilizar-se
como espelho a superfcie do lquido.
Calibraes:
A calibrao pode ser efectuada recorrendo a um de dois procedimentos:
a) Utilizando uma massa: procedimento que utiliza cavaleiros de massa conhecida compreendida entre 0,1
e 1,0 g colocados sobre o anel. O factor de calibrao
a
pelo qual todas as leituras do instrumento
devem ser multiplicadas determina-se de acordo com a equao (1):
a =

r
a
(1)
em que:
r =
mg
2b
(mN/m)
m = massa do cavaleiro (g)
g = acelerao da gravidade (981 cm s
-2
ao nvel do mar)
b = permetro mdio do anel (cm)
a
= leitura do tensimetro aps colocao do cavaleiro no anel (mN/m)
b) Utilizando gua: procedimento que utiliza gua pura cuja tenso superficial, por exemplo, temperatura
de 23
o
C igual a 72,3 mN/m. Este procedimento mais rpido do que a calibrao com cavaleiros, mas
existe sempre o risco de a tenso superficial da gua estar falseada por vestgios de contaminao com
agentes tensioactivos.
O factor de calibrao
b
pelo qual todas as indicaes do instrumento devero ser multiplicadas
determina-se de acordo com a equao (2):
b =
g
(2)
em que:
o
= valor referido na literatura para a tenso superficial da gua (mN/m)
g
= valor medido da tenso superficial da gua (mN/m) ambos mesma temperatura.
1.6.4.3. Preparao de amostras
As solues aquosas devero ser preparadas com as substncias que se pretende testar, utilizando as necessrias
concentraes em gua, e no devero conter quaisquer substncias no dissolvidas.
A soluo deve ser mantida a uma temperatura constante ( 0,5
o
C). Uma vez que a tenso superficial de uma
soluo no recipiente de medio se altera no decurso do tempo, devero ser efectuadas diversas medies em
momentos diferentes e dever ser traada uma curva que represente a tenso superficial em funo do tempo.
Quando j no ocorrerem mais variaes significa que se atingiu um estado de equilbrio.
A contaminao com poeiras e com gases interfere com a medio. Em consequncia, o trabalho dever ser
efectuado sob uma cobertura de proteco.
1.6.5. Condies do teste
A medio dever ser efectuada aproximadamente temperatura de 20
o
C e dever ser controlada entre
0,5
o
C.
1.6.6. Realizao do teste
As solues que se pretendem medir devem ser cuidadosamente transferidas para o recipiente de medio,
limpo, tomando-se precaues para evitar a formao de espuma, e depois o recipiente de medida dever ser
colocado sobre a mesa do aparelho de teste. A parte superior da mesa com o recipiente de medida dever ser
elevada at que o anel fique imerso sob a superfcie da soluo que se pretende medir. Depois, a parte superior
da mesa dever ser baixada gradual e uniformemente (aproximadamente a velocidade de 0,5 cm/minuto) at
que ocorra a separao do anel da superfcie no momento em que se atingiu a fora mxima. A camada de
lquido associada ao anel no deve separar-se do anel. Depois de se terem completado as medies deve
imergir-se o anel novamente sob a superfcie e devem repetir-se as medies at se atingir um valor constante
para a tenso superficial. O momento da transferncia da soluo para o recipiente de medio dever ser
registado para cada determinao. Devero ser efectuadas leituras da fora mxima necessria para separar o
anel da superfcie do lquido.
2. RESULTADOS
Para se calcular a tenso superficial, o valor lido em mN/m no aparelho dever ser multiplicado primeiro pelo
factor de calibrao
a
ou
b
(conforme o procedimento de calibrao utilizado). Obter-se- deste modo um
valor aproximado, pelo que necessria correco posterior.
Harkins e Jordan (4) determinaram empiricamente factores de correco para valores de tenso superficial
medidos pelo mtodo do anel, os quais dependem das dimenses do anel, da densidade do lquido e da sua
tenso superficial.
Uma vez que trabalhoso determinar o factor de correco para cada medio individual a partir das tabelas de
Harkins e Jordan, para se calcular a tenso superficial de solues aquosas pode utilizar-se o procedimento
simplificado de leitura dos valores de tenso superficial corrigidos directamente a partir da tabela. (Recorrer-se-
- interpolao para leituras compreendidas entre os valores indicados na tabela.)
Tabela
Correco da tenso superficial medida
Apenas para solues aquosas, p = 1 g/cm
3
R 9,55 mm (raio mdio do anel)
r 0,185 mm (raio do fio do anel)
Valor experimental (mN/m)
Valor corrigido (mN/m)
Calibrao de massa [ver 1.6.4.2.2.a)] Calibrao com gua [ver 1.6.4.2.2.b)]
20 16,9 18,1
22 18,7 20,1
24 20,6 22,1
Valor experimental (mN/m)
Valor corrigido (mN/m)
Calibrao de massa [ver 1.6.4.2.2.a)] Calibrao com gua [ver 1.6.4.2.2.b)]
26 22,4 24,1
28 24,3 26,1
30 26,2 28,1
32 28,1 30,1
34 29,9 32,1
36 31,8 34,1
38 33,7 36,1
40 35,6 38,2
42 37,6 40,3
44 39,5 42,3
46 41,4 44,4
48 43,4 46,5
50 45,3 48,6
52 47,3 50,7
54 49,3 52,8
56 51,2 54,9
58 53,2 57,0
60 55,2 59,1
62 57,2 61,3
64 59,2 63,4
66 61,2 65,5
68 63,2 67,7
70 65,2 69,9
72 67,2 72,0
74 69,2
76 71,2
78 73,2
Este quadro foi compilado com base na correco de Harkins-Jordan e idntico ao da norma DIN (DIN
53914) para a gua e para solues aquosas (densidade p = 1 g/cm
3
e destina-se a um anel comercialmente
disponvel que possui as dimenses R = 9,55 mm (raio mdio do anel) e r = 0,185 mm (raio do fio do anel). A
tabela proporciona valores corrigidos para as medies de tenso superficial obtidas aps calibrao com
massas ou calibrao com gua.
Em alternativa, sem que haja a calibrao precedente, pode calcular-se a tenso superficial de acordo com a
frmula seguinte:
=
f F
4R
em que:
F = fora medida no dinammetro no ponto de ruptura da pelcula
R = raio do anel
f = factor de correco (1)
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO ENSAIO
mtodo utilizado,
tipo de gua ou de soluo utilizada,
especificao exacta da substncia (identificao e impurezas),
resultados da medio: tenso superficial (leitura) especificando as duas leituras individuais e a sua mdia
aritmtica e bem assim o valor mdio corrigido (tomando em considerao o factor relativo ao
equipamento e a tabela de correco,
concentrao da soluo,
temperatura do teste,
perodo de vida da soluo utilizada; em particular, o tempo decorrido entre a preparao e a medio
efectuada na soluo,
descrio da dependncia temporal da tenso superficial aps a transferncia da soluo para o recipiente
de medio,
todas as informaes e notas relevantes para a interpretao dos resultados devem ser descritas,
especialmente no que diz respeito a impurezas e estado fsico da substncia.
3.2. INTERPRETAO DOS RESULTADOS
Considerando que a gua destilada possui uma tenso superficial de 72,75 mN/m temperatura de 20
o
C, as
substncias que apresentem uma tenso superficial inferior a 60 mN/m sob as condies descritas para este
mtodo devero ser consideradas como materiais tensioactivos.
4. REFERNCIAS
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed.,
Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter XIV.
(3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, p. 511.
(4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, p. 1751.
A.6. SOLUBILIDADE EM GUA
1. MTODO
Os mtodos descritos baseiam-se nas Normas de Ensaio da OCDE (1).
1.1. INTRODUO
til possuir informaes preliminares sobre a frmula estrutural, a presso de vapor, a constante de
dissociao e a hidrlise (em funo do pH) da substncia para se realizar este teste.
No existe um mtodo nico susceptvel de abranger todas as possibilidades de solubilidade em gua.
Os dois mtodos de teste adiante descritos abrangem a totalidade de possibilidades de solubilidade em gua
mas no so aplicveis s substncias volteis:
um desses mtodos aplica-se a substncias essencialmente puras, com baixa solubilidade (< 10
-2
gramas
por litro), e que so estveis em gua, designado por mtodo de eluio em coluna,
o outro mtodo aplica-se a substncias essencialmente puras com solubilidades superiores (> 10
-2
gramas
por litro), e que so estveis em gua, designado por mtodo do balo.
A solubilidade da substncia testada em gua pode ser consideravelmente afectada pela presena de impurezas.
1.2. DEFINIO E UNIDADES
A solubilidade de uma substncia em gua especificada pela concentrao da massa de saturao dessa
substncia em gua a uma determinada temperatura. A solubilidade em gua especificada em unidades de
massa por volume de soluo. A unidade do SI kg/m
3
(tambm se pode utilizar gramas por litro).
Dever-se- determinar a quantidade aproximada de amostra e o tempo necessrio para conseguir a
concentrao da massa de saturao, num ensaio preliminar simples.
1.4.1. Mtodo de eluio em coluna
Este mtodo baseia-se na eluio de uma substncia a testar com gua numa microcoluna, a qual carregada
com um material de suporte inerte tal como esferas de vidro ou areia coberto com um excesso da substncia a
testar. Determina-se a solubilidade em gua quando a concentrao de massa do eluido constante. Esta
situao corresponde a um nvel constante de concentrao em funo do tempo.
1.4.2. Mtodo do balo
De acordo com este mtodo, dissolve-se a substncia (os slidos devem ser pulverizados) em gua a uma
temperatura ligeiramente superior temperatura do teste. Ao atingir-se a saturao arrefece-se a mistura e
mantm-se temperatura de ensaio, agitando enquanto for necessrio para alcanar o equilbrio. Em alternativa
pode efectuar-se a medio directamente temperatura de ensaio, desde que se garanta por amostragem
adequada que se atingiu o equilbrio na saturao. Posteriormente determina-se por um mtodo analtico
adequado concentrao de massa da substncia na soluo aquosa, a qual no deve conter quaisquer
partculas no dissolvidas.
1.5.1. Repetitividadc
Para o mtodo de eluio em coluna pode obter-se um resultado < 30 %, para o mtodo do balo poder-se-
observar um resultado < 15 %.
1.5.2. Sensibilidade
Este parmetro depende do mtodo de anlise, mas possvel efectuar determinaes de concentrao de massa
inferiores a 10
-6
gramas por litro.
1.6. DESCRIO DO MTODO
1.6.1. Condies do teste
O teste efectua-se preferencialmente temperatura de 20 0,5
o
C. No caso de se suspeitar da existncia de uma
dependncia da solubilidade em funo da temperatura (> 3 % por
o
C), dever-se- efectuar ensaios para dois
outros valores diferentes de temperatura, pelo menos 10
o
C acima e abaixo da temperatura escolhida. Neste
caso, o controlo de temperatura dever ser da ordem de 0,1
o
C. A temperatura escolhida dever ser mantida
constante em todas as partes relevantes do equipamento.
1.6.2. Teste preliminar
A uma quantidade aproximadamente de 0,1 g de amostra (as substncias slidas devero ser pulverizadas)
colocada numa proveta graduada de 10 ml, com rolha de vidro, adicionam-se volumes crescentes de gua
destilada temperatura ambiente, de acordo com a progresso indicada no quadro a seguir:
0,1 g solveis em x
ml de gua
0,1 0,5 1 2 10 100 > 100
Solubilidade aproxi-
mada (gramas por
litro)
> 1 000 1 000-200 200-100 100-50 50-10 10-1 < 1
Aps cada adio da quantidade de gua indicada, agita-se vigorosamente a mistura durante 10 minutos e
verifica-se visualmente a existncia de quaisquer partes no dissolvidas da amostra. Se aps a adio de 10 ml
de gua a amostra ou partes dela permanecerem por dissolver, necessrio repetir a experincia numa proveta
graduada de 100 ml com maiores volumes de gua. Para valores inferiores de solubilidade o tempo necessrio
para dissolver uma substncia pode ser consideravelmente mais longo (dever-se- esperar pelo menos 24
horas). A solubilidade aproximada dada na tabela anterior relativamente ao volume de gua adicionada para o
qual ocorre a dissoluo completa da amostra. No caso de a substncia continuar aparentemente insolvel, ser
necessrio esperar mais do que 24 horas (96 horas no mximo) ou dever ser experimentada outra diluio
para determinar se deve ser utilizado o mtodo de eluio em coluna ou o mtodo da solubilidade em balo.
1.6.3. Mtodo de eluio em coluna
1.6.3.1. Material de suporte, solvente e eluente
O material de suporte para o mtodo de eluio em coluna dever ser inerte. Os materiais que podem ser
utilizados so as esferas de vidro e a areia e dever ser utilizado um solvente voltil adequado, de qualidade
analtica, para se aplicar a substncia a testar ao material de suporte. Poder-se- utilizar como eluente gua
bidestilada num aparelho de quartzo ou de vidro.
Nota:
No deve ser utilizada gua proveniente directamente de um permutador de ies orgnicos.
1.6.3.2. Carga do suporte
Pesa-se aproximadamente 600 mg de material de suporte e transfere-se para um balo de fundo redondo de
50 ml.
Dissolve-se no solvente escolhido uma quantidade determinada e adequada da substncia a testar. Adiciona-se
ao material de suporte uma quantidade apropriada desta soluo. O solvente deve ser completamente
evaporado, por exemplo, num evaporador rotativo; caso contrrio no se conseguir a saturao do suporte
com gua, devido a efeitos de repartio que ocorrem na superfcie do material de suporte.
A colocao da carga no material de suporte pode originar problemas (resultados errados) se a substncia a
testar se depositar como um leo ou como uma fase cristalina diferente. O problema dever ser examinado
experimentalmente e os pormenores devero constar do relatrio.
Deixar que o material de suporte assim carregado fique embebido, durante aproximadamente 2 horas, em cerca
de 5 ml de gua e depois transfere-se a suspenso para a microcoluna. Em alternativa, o material de suporte
carregado e seco pode ser vertido na microcoluna a qual foi previamente cheia com gua e depois deixa-se
estabelecer o equilbrio durante aproximadamente 2 horas.
Procedimento de ensaio:
A eluio da substncia a partir do material de suporte pode ser efectuada recorrendo a uma de duas vias
diferentes:
bomba de recirculao (ver figura 1),
reservatrio de nvel (ver figura 4).
1.6.3.3. Mtodo de eluio em coluna com bomba de recirculao
Aparelho
A figura 1 representa uma disposio esquemtica de um sistema tpico. A figura 2 representa uma
microcoluna adequada, embora sejam aceitveis outras dimenses, desde que fiquem satisfeitos os critrios de
reprodutibilidade e de sensibilidade. A coluna dever dispor de um espao superior correspondente a pelo
menos cinco vezes o volume base de gua e dever ser capaz de conter um mnimo de cinco amostras. Em
alternativa, poder-se- reduzir as dimenses no caso de se utilizar um solvente de constituio para substituir os
cinco volumes de base iniciais removidos com as impurezas.
A coluna dever ser ligada a uma bomba de recirculao susceptvel de controlar fluxos aproximadamente
razo de 25 ml/hora. A ligao da bomba feita com tubos de politetrafluoro-etileno (PTFE) e/ou tubos de
vidro. A coluna e a bomba, quando ligadas, devero permitir a amostragem do efluente e o equilbrio da parte
superior presso atmosfrica. O material da coluna suportado com um pequeno tampo (5 mm) de l de
vidro, o qual serve tambm para filtrar partculas. A bomba de recirculao pode ser, por exemplo, uma bomba
peristltica ou uma bomba de membrana ( necessrio tomar precaues para que no haja contaminao e/ou
adsoro com o material do tubo).
Procedimento de medio
Inicia-se o fluxo atravs da coluna. Recomenda-se a utilizao de um dbito de aproximadamente 25 ml/hora
(isto corresponde a 10 volumes de base/hora para a coluna descrita). Os primeiros cinco volumes de base
(mnimo) so eliminados para remoo das impurezas solveis em gua. Depois disto deixa-se a bomba de
recirculao funcionar at que o equilbrio fique estabelecido, conforme definido por cinco amostras sucessivas
cujas concentraes no difiram mais do que 30 % numa observao aleatria. As amostras devero ser
separadas umas das outras por intervalos de tempo correspondentes passagem do eluente de pelo menos 10
volumes de enchimento da coluna.
1.6.3.4. Mtodo de eluio em coluna com reservatrio de nivelamento
Aparelho (ver figuras 4 e 3)
Reservatrio de nivelamento: A ligao ao reservatrio de nivelamento faz-se utilizando uma junta de vidro
esmerilado qual ligado um tubo de politetrafluoretileno (PTFE). Recomenda-se a utilizao de um dbito de
aproximadamente 25 ml/hora. As fraces sucessivas de eluido devero ser recolhidas e analisadas pelo mtodo
escolhido.
Procedimento de medio
Utilizam-se as fraces da zona mdia da eluio em que as concentraes so constantes ( 30 %) em pelo
menos cinco fraces consecutivas, para se determinar a solubilidade em gua.
Em ambos os casos (utilizando uma bomba de recirculao ou um reservatrio de nivelamento) dever-se-
fazer a verificao da presena de matria coloidal nas fraces, pela observao da existncia do efeito de
Tyndall (disperso de luz).
A presena dessas partculas invalida os resultados, devendo os testes ser repetidos melhorando a aco de
filtrao da coluna.
Deve registar-se o valor do pH de cada amostra. Dever-se- efectuar uma segunda experincia mesma
temperatura.
1.6.4. Mtodo do balo
1.6.4.1. Aparelho
No mtodo do balo necessrio o material seguinte:
instrumentos e utenslios de vidro usais em laboratrio,
um dispositivo adequado para a agitao de solues sob condies de temperatura constante e
controlada,
uma centrifugadora (de preferncia com controlo termosttico), se necessrio para as emulses, e
equipamento para determinao analtica.
A partir dos testes preliminares estima-se a quantidade de material necessrio para saturar o volume desejado
de gua. O volume necessrio de gua depender do mtodo analtico e do intervalo de solubilidade. Pesam-se
trs pores de aproximadamente cinco vezes a quantidade anteriormente determinada de material, que se
introduzem em trs recipientes de vidro com rolhas de vidro (por exemplo, tubos de centrifugao, bales).
Adiciona-se a cada recipiente o volume escolhido de gua e fecham-se hermeticamente. Os recipientes fechados
so depois agitados temperatura de 30
o
C. (Deve utilizar-se um dispositivo de oscilao ou de agitao
susceptvel de funcionar a uma temperatura constante, por exemplo, um agitador magntico em banho-maria
com termstato.) Decorrido o perodo de um dia remove-se um dos recipientes e reequilibra-se durante 24
horas temperatura de ensaio com agitao ocasional. O contedo do recipiente depois submetido a
centrifugao temperatura de ensaio e determina-se a concentrao do composto na fase aquosa lmpida
recorrendo a um mtodo analtico adequado. Os outros dois recipientes so tratados de modo anlogo, aps o
equilbrio inicial temperatura de 30
o
C durante dois e trs dias, respectivamente. Se os resultados da
concentrao obtidos pelo menos com os dois ltimos recipientes concordarem com a reprodutibilidade
necessria, considera-se que o teste satisfatrio. Todo o teste dever ser repetido, utilizando perodos de
tempo de equilbrio mais longos, se os resultados obtidos nos recipientes 1, 2 e 3 mostrarem uma tendncia
para valores crescentes.
O procedimento de medio tambm pode ser efectuado sem pr-incubao temperatura de 30
o
C. No sentido
de se estimar a velocidade a que se estabelece o equilbrio de saturao extraem-se amostras at que o tempo de
agitao deixe de influenciar a concentrao da soluo a testar.
Deve registar-se o valor do pH de cada amostra.
1.6.5. Anlise
prefervel um mtodo analtico especfico de cada substncia para estas determinaes uma vez que pequenas
quantidades de impurezas solveis podem originar erros grandes na solubilidade medida. So exemplos desses
mtodos os seguintes: a cromatografia de gases ou de lquidos, os mtodos de titulao, os mtodos
fotomtricos, os mtodos voltamtricos.
2. RESULTADOS
2.1. MTODO DA ELUIO EM COLUNA
Dever-se- calcular, para cada experincia, o valor mdio dos resultados obtidos com pelo menos cinco
amostras consecutivas, extrados do patamar constante de saturao, o mesmo devendo ser feito para o desvio-
-padro. Os resultados devero ser apresentados em unidades de massa por volume de soluo.
Procede-se comparao dos valores mdios calculados relativamente a dois testes utilizando fluxos diferentes,
devendo a sua repetitividade ser menor do que 30 %.
2.2. MTODO DO BALO
Devero ser apresentados os resultados individuais para cada um dos trs recipientes e, admitindo-se que esses
resultados so constantes (repetitividade menor do que 15 %), calcular-se- a sua mdia e apresentar-se- o
resultado em unidades de massa por volume de soluo. Isto pode exigir a reconverso de unidades de massa
em unidades de volume, utilizando-se a densidade no caso da solubilidade ser muito elevada (> 100 gramas por
litro).
3. RELATRIOS
3.1. MTODO DE ELUIO EM COLUNA
os resultados do teste preliminar,
a especificao exacta da substncia (identificao e impurezas),
as concentraes individuais, os dbitos e o pH de cada amostra,
as mdias e os desvios-padro de pelo menos cinco amostras do patamar constante de saturao para
cada experincia,
o valor mdio de duas experincias sucessivas e aceitveis,
a temperatura da gua durante o processo de saturao,
o mtodo de anlise utilizado,
a natureza do material de suporte utilizado,
o processo de carga do material de suporte,
o solvente utilizado,
a evidncia de qualquer instabilidade qumica da substncia durante o teste e o mtodo utilizado,
toda a informao relevante para a interpretao dos resultados, especialmente no que diz respeito a
impurezas e estado fsico da substncia.
3.2. MTODO DO BALO
os resultados do teste preliminar,
as determinaes analticas individuais e o valor mdio no caso de se determinar mais do que um valor
para cada recipiente,
o valor do pH de cada amostra,
a mdia dos valores para recipientes diferentes que tenham estado em conformidade,
a temperatura do teste,
o mtodo analtico utilizado,
evidncia de qualquer instabilidade qumica da substncia durante o teste e mtodo utilizado,
toda a informao relevante para a interpretao dos resultados, especialmente no que diz respeito a
impurezas e ao estado fsico da substncia.
4. REFERNCIAS
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use Determination of water
solubility of solids and liquids with low solubility Column elution method
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use Determination of water
solubility of solids and liquids with high solubility Flask method
Apndice
Figura 1
Mtodo de eluio em coluna com bomba de recirculao
Figura 2
Microcoluna tipo
(Todas as dimenses esto em milmetros)
Figura 3
Microcoluna tipo
Figura 4
Mtodo de eluio em coluna com reservatrio de nivelamento
A.8 COEFICIENTE DE PARTIO
1. MTODO
O mtodo do frasco agitado descrito baseia-se na norma de ensaio da OCDE (1).
1.1. INTRODUO
til possuir informaes preliminares sobre a frmula estrutural, a constante de dissociao, a solubilidade
em gua, hidrlise, solubilidade em n-octanol e tenso superficial, da substncia sujeita a este teste.
As medies devero ser efectuadas em substncias ionizveis apenas na sua forma no ionizada (cido livre ou
base livre) produzida pela utilizao de um tampo apropriado cujo pH possua um valor de pelo menos uma
unidade de pH abaixo (cido livre) ou acima (base livre) do valor pK.
Este mtodo de ensaio engloba dois procedimentos separados o mtodo do frasco agitado e a cromatografia
lquida de elevado rendimento (mais conhecida por HPLC ou High Performance Liquid Chromatography). O
primeiro mtodo aplica-se nos casos em que o valor log P
oa
(ver as definies mais adiante) se encontra no
intervalo entre 2 e 4 e o outro mtodo aplica-se nos casos em que aquele valor est compreendido entre 0 e
6. Antes de se executar qualquer dos procedimentos experimentais dever-se- obter primeiro uma estimativa
preliminar do coeficiente de partio.
O mtodo do frasco agitado aplica-se apenas a substncias essencialmente puras solveis em gua e em
n-octanol. No aplicvel aos materiais tensioactivos (para os quais dever ser obtido o valor calculado ou uma
estimativa com base nas solubilidades individuais em n-octanol e em gua).
O mtodo de HPLC no se aplica a bases e cidos fortes, a complexos de metais, a materiais tensioactivos ou a
substncias que reajam com o eluente. Para estes materiais dever ser obtido um valor calculado ou uma
estimativa, tomando como base as solubilidades individuais em n-octanol e em gua.
O mtodo de HPLC menos sensvel presena de impurezas do que o mtodo do frasco agitado. Contudo, em
alguns casos as impurezas podem tornar difcil a interpretao de resultados devido ao facto de se tornar
incerta a determinao dos picos. Para misturas que originem uma banda no resolvida devero ser
especificados os limites inferior e superior de log P.
Define-se o coeficiente de partio (P) como sendo a razo entre as concentraes de equilbrio (c
i
) de uma
substncia dissolvida num sistema de duas fases, constitudo por dois solventes claramente imiscveis. No caso
do n-octanol e da gua temos:
p
ow
=
c
n octanol
c
water
Em consequncia, o coeficiente de partio (P) o quociente entre duas concentraes e dado vulgarmente na
forma do seu logaritmo de base 10 (log P).
Mtodo do frasco agitado
substncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibrao do mtodo e para
proporcionar a comparao com resultados obtidos com outros mtodos.
Mtodo de HPLC
No sentido de se estabelecer uma correlao entre os dados de HPLC medidos para um determinado composto
com o seu valor P, torna-se necessrio estabelecer um grfico de calibrao de log P em funo dos dados
cromatogrficos utilizando pelo menos 6 pontos de referncia. deixado ao arbtrio do utilizador seleccionar
as substncias de referncia apropriadas. Sempre que possvel, pelo menos uma substncia de referncia dever
possuir um valor P
oa
superior, e outra um valor P
oa
inferior ao da substncia a testar. Para valores de log P
inferiores a 4, a calibrao pode basear-se nos dados obtidos pelo mtodo do frasco agitado. Para valores de log
P superiores a 4, a calibrao pode basear-se em valores calibrados e publicados em diversa literatura se esses
valores estiverem em conformidade com os valores calculados. Para se conseguir melhor preciso prefervel
escolher substncias de referncia cuja estrutura qumica esteja relacionada com a da substncia a testar.
Existem disponveis listagens extensivas de valores de log P
oa
para muitos grupos de compostos qumicos (2)(3).
No caso dos dados sobre os coeficientes de partio dos compostos estruturalmente afins no se encontrarem
disponveis, pode-se utilizar ento uma calibrao mais geral estabelecida com outros compostos de referncia.
No apndice 2 apresenta-se uma listagem de substncias de referncia recomendadas e seus valores P
oa
.
1.4. PRINCPIO DO MTODO
1.4.1. Mtodo do frasco agitado
No sentido de se determinar um coeficiente de partio, torna-se necessrio conseguir o equilbrio entre todos
os componentes do sistema que actuam entre si e devem-se determinar as concentraes das substncias
dissolvidas nas duas fases. Um estudo publicado na literatura relativa a este assunto indica que possvel utilizar
diversas tcnicas diferentes para resoluo deste problema, isto , a mistura perfeita das duas fases seguindo-se a
sua separao, no sentido de se determinar a concentrao de equilbrio para a substncia que se pretende
examinar.
1.4.2. Mtodo de HPLC
Efectua-se o HPLC em colunas analticas carregadas com uma fase slida comercialmente disponvel contendo
hidrocarbonetos de cadeia longa (por exemplo C
8
, C
18
) quimicamente ligados slica. Os compostos qumicos
injectados nessa coluna movem-se atravs dela a velocidades diferentes devido aos diferentes graus de partio
entre a fase mvel e a fase estacionria do hidrocarboneto. As misturas de compostos qumicas so eludas por
ordem da sua hidrofobicidade, sendo eludos primeiro os compostos qumicos solveis em gua e depois os
compostos qumicos solveis em leo, proporcionalmente ao seu coeficiente de partio entre hidrocarboneto
e gua. Isto permite estabelecer uma relao entre o tempo de reteno numa tal coluna (fase reversa) e o
coeficiente de partio entre n-octanol/gua. Deduz-se o coeficiente de partio a partir do factor de capacidade
k, dado pela expresso:
k =
t
r
t
o
t
o
na qual t
r
= tempo de reteno da substncia a testar e t
0
= tempo mdio que uma molcula de solvente
necessita para passar atravs da coluna (tempo limite).
No so necessrios mtodos analticos quantitativos e apenas necessria a determinao dos tempos de
eluio.
1.5.1. Repetitividade
No sentido de se garantir a exactido do coeficiente de partio necessrio efectuar determinaes em
duplicado sob trs condies de ensaio diferentes, podendo consequentemente alterar a quantidade de
substncia especificada e tambm a proporo entre os volumes de solvente. Os valores determinados do
coeficiente de partio, expressos pelos seus logaritmos, devero estar compreendidos num intervalo limitado
por 0,3 unidades logartmicas.
Mtodo de HPLC
No sentido de se aumentar a confiana da medio devero ser efectuadas determinaes em duplicado. Os
valores de log P derivados das medies individuais devero estar dentro de um intervalo limitado por 0,1
unidades logartmicas.
Determina-se o intervalo de medio do mtodo pelo limite de deteco do procedimento analtico. Isto dever
permitir a determinao de valores log P
oa
no intervalo compreendido entre 2 e 4 (ocasionalmente, quando
houver condies adequadas, este intervalo pode ser dilatado at valores de log P
oa
prximos de 5), quando a
concentrao do soluto em qualquer fase no for superior a 0,01 mol por litro.
Mtodo de HPLC
O mtodo de HPLC permite estimar os coeficientes de partio em termos de log P
oa
no intervalo 0 a 6.
Normalmente o coeficiente de partio de um composto pode ser estimado a menos de 1 unidade
logartmica relativamente ao valor obtido pelo mtodo do frasco agitado. Existem correlaes tpicas que
possvel encontrar na literatura (4)(5)(6)(7)(8). Normalmente, pode-se conseguir uma preciso superior quando
as curvas de correlao se baseiam em compostos de referncia estruturalmente afins (9).
1.5.3. Especificidade
A Lei de Partio de Nernst aplica-se apenas quando os parmetros temperatura, presso e pH so constantes
para solues diludas. Aplica-se estritamente a uma substncia pura dispersa entre dois solventes puros. Se
houver diversos solutos diferentes numa ou em ambas as fases simultaneamente, isto pode afectar os
resultados.
A dissociao ou a associao das molculas dissolvidas provoca desvios em relao Lei de Partio de Nernst.
Esses desvios so indicados pelo facto de o coeficiente de partio se tornar dependente da concentrao da
soluo.
Devido existncia de mltiplos estados de equilbrio, este mtodo no deve ser aplicado a compostos
ionizveis sem se aplicar uma correco. Deve-se tomar em considerao a utilizao de solues-tampo em
vez de gua para esses compostos; o valor do pH da soluo-tampo dever ser pelo menos uma unidade de pH
afastada do valor pKa da substncia e deve-se ter sempre presente a relevncia desse valor de pH para o
ambiente.
1.6.1. Estimativa preliminar do coeficiente de partio
Efectua-se uma estimativa do coeficiente de partio utilizando preferencialmente um mtodo de clculo (ver
apndice 1) ou, se for apropriado, recorrendo razo entre solubilidades da substncia a testar nos solventes
puros (10).
1.6.2. Mtodo do frasco agitado
1.6.2.1. Preparao
n-octanol: a determinao do coeficiente de partio dever ser efectuada com um reagente de qualidade
analtica de elevada pureza.
gua: deve-se utilizar gua destilada ou bidestilada num aparelho de vidro ou de quartzo. Para os compostos
ionizveis dever-se- utilizar solues-tampo em vez de gua, se tal se justificar.
Nota:
No deve ser utilizada gua obtida directamente a partir de um permutador inico.
1.6.2.1.1. P r - s a t ur a o d os s ol v e nt e s
Antes de se determinar um coeficiente de partio as fases do sistema solvente so mutuamente saturadas por
agitao temperatura da experincia. Para se conseguir isto, prtica corrente agitar dois frascos grandes
contendo gua ou n-octanol de qualidade analtica, contendo cada um deles uma quantidade suficiente do
outro solvente, durante um perodo de 24 horas, num agitador mecnico, e deixando-os depois em repouso
durante um perodo de tempo suficiente para permitir a separao de fases e para se conseguir um estado de
saturao.
1.6.2.1.2. P r e pa r a o pa r a o e ns a i o
O volume total do sistema bifsico dever encher quase completamente o recipiente de ensaio. Isto auxiliar a
evitar as perdas de material por volatilizao. A razo volumtrica e as quantidades de substncia a utilizar so
fixadas pelos factores seguintes:
avaliao preliminar do coeficiente de partio (ver supra),
a quantidade mnima da substncia a testar necessria para o procedimento analtico, e
a limitao de uma concentrao mxima, em qualquer das fases, no valor de 0,01 mol por litro.
Efectuam-se trs testes. No primeiro utiliza-se a razo volumtrica calculada entre n-octanol e a gua; no
segundo divide-se essa razo por dois e no terceiro multiplica-se essa razo por dois (por exemplo, 1:1, 1:2,
2:1).
1.6.2.1.3. S ubs t nc i a a t e s t a r
Prepara-se uma soluo em n-octanol pr-saturado com gua. A concentrao desta soluo dever ser
determinada com exactido antes de se utilizar na determinao do coeficiente de partio. Esta soluo dever
ser guardada em condies que assegurem a sua estabilidade.
1.6.2.2. Condies de ensaio
A temperatura de ensaio dever ser mantida constante ( 1
o
C) e estar compreendida no intervalo entre 20 e
25
o
C.
1.6.2.3.1. E s t a be l e c i me nt o d o e q ui l br i o d e pa r t i o
Para cada uma das condies de ensaio dever-se- preparar recipientes de ensaio em duplicado, contendo as
quantidades necessrias, medidas com exactido, dos dois solventes em conjunto com a quantidade necessria
da soluo referida.
Deve-se medir o volume das fases de n-octanol. Os recipientes de ensaio devero ser colocados num agitador
adequado ou em alternativa devero ser agitados manualmente. Quando se usa um tubo de centrifugao, o
mtodo recomendado consiste em rodar o tubo rapidamente 180
o
em torno do seu eixo transversal, de modo
que qualquer bolha de ar que esteja presa se movimente atravs das duas fases. A experincia demonstrou que
50 rotaes deste tipo so normalmente suficientes para se estabelecer o equilbrio de partio. Para melhor
garantia, recomenda-se a execuo de 100 rotaes em 5 minutos.
1.6.2.3.2. S e pa r a o d e f a s e s
Sempre que necessrio, no sentido de se efectuar a separao de fases, dever-se- efectuar a centrifugao da
mistura. Isto dever ser feito numa centrifugadora de laboratrio mantida temperatura ambiente ou, no caso
de se utilizar uma centrifugadora de temperatura no controlada, os tubos de centrifugao devero ser
mantidos, por razes de equilbrio, temperatura de ensaio durante pelo menos 1 hora antes da anlise.
1.6.2.4. Anlise
Para a determinao do coeficiente de partio necessrio determinar as concentraes da substncia a testar
em ambas as fases. Isto pode ser feito extraindo uma quantidade alquota de cada uma das duas fases a partir de
cada um dos tubos, de cada uma das sries de ensaio, procedendo depois sua anlise de acordo com o
procedimento escolhido. Deve-se calcular a quantidade total de substncia presente em ambas as fases e
efectuar-se- a comparao com a quantidade de substncia originalmente introduzida.
Dever ser extrada uma amostra da fase aquosa recorrendo a um procedimento que minimize o risco de
introduzir vestgios de n-octanol: pode-se utilizar uma seringa de vidro com uma agulha removvel para extrair
uma amostra da fase aquosa. A seringa dever estar, de incio, parcialmente cheia com ar. O ar dever ser
expelido suavemente enquanto se introduz a agulha atravs da camada de n-octanol. Retira-se com a seringa
um volume adequado de fase aquosa. Remove-se a seringa rapidamente da soluo e separa-se a agulha. O
contedo da seringa pode ser utilizado depois como amostra aquosa. A concentrao das duas fases separadas
dever ser determinada preferencialmente recorrendo a um mtodo especfico da substncia. Como exemplos
de mtodos analticos considerados apropriados faz-se referncia aos seguintes:
mtodos fotomtricos,
cromatografia gasosa,
cromatografia lquida de elevado rendimento (HPLC).
1.6.3. Mtodo de HPLC
1.6.3.1. Preparao
Aparelho
necessrio um cromatgrafo lquido equipado com uma bomba de pulsao livre e um dispositivo de
deteco adequado. Recomenda-se a utilizao de uma vlvula de injeco com ciclos de injeco. A presena
de grupos polares na fase estacionria pode prejudicar gravemente os resultados da coluna de HPLC. Em
consequncia, as fases estacionrias devero possuir uma percentagem mnima de grupos polares (11). Podem-
-se utilizar colunas pr-carregadas ou cargas de fase reversa de micropartculas disponveis comercialmente.
Pode-se interpor uma coluna de proteco entre o sistema de injeco e a coluna analtica.
Fase mvel
Utiliza-se metanol e gua de qualidade apropriada para HPLC, para a preparao do solvente de eluio, o qual
desgaseificado antes da utilizao. Deve-se utilizar uma eluio isocrtica. Dever-se- utilizar propores
metanol/gua com um teor mnimo de gua de 25 %. Normalmente, satisfatria a proporo de 3:1 (v/v) para
a mistura de metanol/gua para se efectuar a eluio de compostos de log P 6 ao fim de uma hora para um
dbito de 1 mililitro por minuto. Para os compostos com um valor log P elevado pode ser necessrio reduzir o
tempo de eluio (e tambm para os compostos de referncia) diminuindo a polaridade da fase mvel ou o
comprimento da coluna.
As substncias com muito fraca solubilidade em n-octanol tendem a originar valores de log P
oa
anormalmente
baixos quando se utiliza o mtodo de HPLC; os picos desses compostos acompanham frequentemente a frente
do solvente. Isto deve-se provavelmente ao facto de o processo de partio ser muito lento no se atingindo o
equilbrio no tempo normalmente necessrio para uma separao por HPLC. Consequentemente, a diminuio
do dbito e/ou a diminuio da proporo metanol/gua pode ser eficaz para se atingir um valor de confiana.
Os compostos de ensaio e de referncia devero ser solveis na fase mvel em concentraes suficientes para
permitirem as suas deteces. Apenas em casos excepcionais ser aceitvel adicionar aditivos mistura de
metanol/gua, uma vez que esses aditivos iro modificar as propriedades da coluna. Para as cromatografias com
aditivos obrigatrio utilizar uma coluna separada do mesmo tipo. No caso de a mistura metanol/gua no ser
apropriada possvel utilizar outras misturas de solvente orgnico/gua, por exemplo, etanol/gua ou
acetonitrilo/gua.
O pH do eluente constitui um parmetro crtico para os compostos ionizveis. Aquele valor dever estar
compreendido no intervalo de valores de pH de funcionamento da coluna, sendo esse intervalo normalmente
compreendido entre 2 e 8. Recomenda-se a utilizao de uma mistura tampo. necessrio tomar precaues
para evitar a precipitao de sal e a deteriorao da coluna cuja ocorrncia possvel com algumas misturas de
fase orgnica/tampo. As medies por HPLC com fases estacionrias base de slica, para valores de pH
superiores a 8, no so aconselhveis uma vez que a utilizao de uma fase mvel alcalina pode provocar a
deteriorao rpida do funcionamento da coluna.
Solutos
Os compostos de referncia devero possuir a maior pureza possvel. Os compostos destinados a serem
utilizados para efeitos de ensaio ou calibrao so dissolvidos na fase mvel, se possvel.
Condies de ensaio
Durante as medies a temperatura no dever variar 2 K.
1.6.3.2. Medio
Clculo do tempo limite t
o
O tempo limite t
o
pode ser determinado utilizando em alternativa uma srie homloga (por exemplo, n-alquil-
-metil-cetonas) ou compostos orgnicos no retidos (por exemplo, tioureia ou formamida). Para se calcular o
tempo limite t
o
utilizando uma srie homloga, injecta-se um conjunto de pelo menos 7 componentes de uma
srie homloga e procede-se determinao dos respectivos tempos de reteno. Elabora-se um grfico dos
tempos de reteno t
r(nc + 1)
em funo de t
r(nc)
e procede-se determinao da ordenada a na origem e do declive
b, atravs da equao de regresso:
t
r(nc + 1)
= a + b t
r(nc)
(n
c
= nmero de tomos de carbono). O tempo limite t
o
dado pela equao:
t
o
= a/(1 b)
Grfico de calibrao
O passo seguinte consiste em construir a curva de correlao de log k em funo de log P para os compostos de
referncia apropriados. Na prtica, efectua-se a injeco simultnea, de um conjunto compreendido entre 5 e
10 compostos de referncia padro cujo valor log P seja prximo do valor esperado e procede-se
determinao dos tempos de reteno, utilizando preferencialmente um integrador de registo ligado ao sistema
de deteco. Procede-se ao clculo dos logaritmos correspondentes dos factores de capacidade, log k, e traa-se
uma curva em funo do valor log P determinado pelo mtodo do frasco agitado. Efectua-se a calibrao a
intervalos regulares, pelo menos uma vez diariamente, de modo a poder fazer a compensao das possveis
variaes na evoluo da coluna.
Determinao do factor de capacidade da substncia de ensaio
Injecta-se a substncia de ensaio numa quantidade da fase mvel to pequena quanto possvel. Determina-se o
tempo de reteno (em duplicado), permitindo o clculo do factor k de capacidade. A partir do grfico de
correlao dos compostos de referncia, pode-se fazer uma interpolao para determinao do coeficiente de
partio da substncia de ensaio. Para coeficientes de partio muito baixos ou muito elevados necessria a
extrapolao. Nesses casos particulares necessrio tomar precaues relativamente aos limites de confiana da
curva de regresso.
2. RESULTADOS
Pode-se testar a fiabilidade dos valores de P determinados efectuando a comparao das mdias das
determinaes em duplicado com a mdia geral.
3. RELATRIO
no caso de os mtodos no serem aplicveis (por exemplo, material tensioactivo), apresentar-se- um
valor calculado ou uma estimativa tomando como base as solubilidades individuais em n-octanol e em
gua,
todas as informaes e notas relevantes para a interpretao dos resultados, especialmente no que diz
respeito a impurezas e ao estado fsico da substncia.
Para o caso do mtodo do frasco agitado:
o resultado da estimativa preliminar, se existir,
temperatura da determinao,
dados relativos aos procedimentos analticos utilizados na determinao das concentraes,
tempo e velocidade de centrifugao, se for caso disso,
concentraes medidas de ambas as fases para cada determinao (significa isto que devero ser descritas
12 concentraes na totalidade),
o peso da substncia de ensaio, o volume de cada fase utilizada em cada recipiente de ensaio e a
quantidade total calculada de substncia de ensaio presente em cada fase aps se atingir o equilbrio,
para cada conjunto de condies de ensaio devero ser indicados os valores calculados do coeficiente de
partio (P) e o valor mdio, devendo-se indicar igualmente a mdia para todas as determinaes. No
caso de haver indcios de dependncia da concentrao relativamente ao coeficiente de partio, esse
facto dever constar do relatrio,
deve-se referir o desvio-padro dos valores P individuais relativamente sua mdia,
o valor mdio de P correspondente a todas as determinaes deve ser expresso tambm na forma
logartmica (base 10),
o valor terico P
oa
calculado no caso de se ter feito a determinao desse valor ou quando o valor medido
for > 10
4
,
os valores de pH da gua utilizada e da fase aquosa durante a experincia,
no caso de se ter recorrido utilizao de tampes, o relatrio dever conter justificao da utilizao
desses tampes em vez de gua, a sua composio, a sua concentrao e os valores de pH e tambm os
valores de pH da fase aquosa antes e aps a experincia.
Para o caso do mtodo de HPLC:
o resultado da estimativa preliminar, se existir,
substncias de ensaio e de referncia e sua pureza,
intervalo de temperaturas das determinaes,
os valores de pH para os quais foram feitas as determinaes,
pormenores sobre a coluna analtica e sobre a coluna de proteco, fase mvel e meios de deteco,
dados de reteno e valores de log P encontrados na literatura para os compostos de referncia utilizados
na calibrao,
pormenores sobre a linha de regresso ajustada (log k em funo de log P),
dados de reteno mdia e valor de log P interpolado para o composto de ensaio,
descrio do equipamento e condies de funcionamento,
perfil de eluio,
quantidades das substncias de ensaio e de referncia introduzidas na coluna,
tempo limite e mtodo para a sua medio.
4. REFERNCIAS
(2) C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John
Wiley, New York, 1979.
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman,
A.J. Leo, dir.) Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College,
Claremont, California 91711.
(4) L. Renberg, G. Sundstrm and K. Sundh-Nygrd, Chemosphere, 1980, vol. 80, p. 683.
(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, p. 219 (1981).
(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, p. 73.
(7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, p. 1.
(8) J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, p. 675.
(9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, p. 787.
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl),
Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band 1/1,
p. 223-339.
(11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, p. 479.
(12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.
(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmentai Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use Determination of partition
coefficient Flask shaking method.
(15) C.V. Eadsforth and P.Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459.
(16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.
(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, p. 1207.
(18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci Technol., 1974, vol. 8, p. 1113.
(19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, p. 382.
(20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivitt von Wirkstoffen, Verlag
Chemie, Weinheim, New York, 1979.
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984.
(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978.
(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor, J. Med. Chem., 1976, vol. 19, p. 615.
Apndice 1
Mtodos de clculo/estimao
INTRODUO
Na publicao Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a) encontra-se uma introduo geral aos mtodos de
clculo, dados e exemplos.
possvel utilizar os valores calculados de P
oa
:
para se decidir qual dos mtodos experimentais apropriado (gama de utilizao para o frasco agitado: log P
oa
:
2 a 4, gama de HPLC: log P
oa
: 0 a 6),
para seleco das condies de ensaio apropriadas (por exemplo, substncias de referncia para os procedimentos de
HPLC, relao volumtrica n-octanol/gua para o mtodo do frasco agitado),
como verificao interna laboratorial sobre possveis erros experimentais,
para se obter um valor estimado de P
oa
no caso em que os mtodos experimentais no podem ser aplicados por razes
tcnicas.
MTODO DE ESTIMAO
Estimativa preliminar do coeficiente de partio
Pode-se estimar o valor do coeficiente de partio conhecendo as solubilidades da substncia de ensaio em solventes puros,
utilizando a equao:
P
estimado =
saturao c
n octanol
saturao c
gua
MTODOS DE CLCULO
Princpio dos mtodos de clculo
Todos os mtodos de clculo se baseiam na fragmentao formal da molcula em substruturas adequadas para as quais
sejam conhecidos valores dos fragmentos de log P
oa
. Calcula-se depois o valor log P
oa
da molcula inteira como sendo a
soma dos correspondentes valores dos seus fragmentos mais a soma dos termos de correco, para as interaces
intramoleculares.
Existem disponveis listas de constantes dos fragmentos e dos termos de correlao (b)(c)(d)(e). Algumas so actualizadas
regularmente (b).
Critrios de qualidade
De um modo geral, a fiabilidade do mtodo de clculo diminui com a complexidade crescente do composto submetido a
estudo. No caso de molculas simples com baixo peso molecular e com um ou dois grupos funcionais admite-se um desvio
compreendido entre 0,1 e 0,3 unidades de log P
oa
entre os resultados obtidos com diferentes mtodos de fragmentao e o
valor medido. No caso das molculas mais complexas a margem de erro pode ser superior. Isto depender da fiabilidade e da
disponibilidade de constantes dos fragmentos e tambm da capacidade para identificar interaces intramoleculares (por
exemplo, ligaes de hidrognio) e para utilizar correctamente os termos de correco (este problema pode ser minimizado
utilizando a aplicao informtica CLOGP-3) (b). No caso dos compostos ionizantes importante tomar em considerao
correctamente a carga e o grau de ionisao.
Procedimentos de clculo
Mtodo de Hansch
A constante do substituinte hidrofbico original, , introduzida por Fujita et al. (f), define-se do modo seguinte:
x
= log P
oa
(PhX) log P
oa
(PhH)
em que P
oa
(PhX) representa o coeficiente de partio de um derivado aromtico e P
oa
(PhH) representa o coeficiente de
partio do composto original
(por exemplo:
Cl
= log P
oa
(C
6
H
5
Cl) log P
oa
(C
6
H
6
) = 2,84 2,13 = 0,71).
De acordo com esta definio, o mtodo aplicvel essencialmente nos casos de substituio aromtica. Os valores para
um grande nmero de substituintes encontram-se em tabelas (b)(c)(d) e so utilizados para o clculo dos valores log P
oa
de
substruturas ou molculas aromticas.
Mtodo de Rekker
De acordo com Rekker (g) o valor de log P
oa
calcula-se do modo seguinte:
log P
oa
=
i
a
i
f
i
j
termos de interaco
em que f
i
representa as diferentes constantes dos fragmentos moleculares e a
i
representa a frequncia da sua ocorrncia na
molcula sujeita a investigao. Os termos de correco podem ser expressos na forma de um integral mltiplo de uma
nica constante C
m
(designada por constante mgica). As constantes dos fragmentos f
i
e C
m
foram determinadas a partir de
uma listagem de 1 054 valores experimentais de P
oa
(825 compostos) utilizando anlise de regresso mltipla (c)(h). A
determinao dos termos de interaco efectua-se de acordo com regras consagradas descritas na literatura (e)(h)(i).
Mtodo de Hansch-Leo
De acordo com Hansch e Leo (c) calcula-se o valor de log P
oa
de acordo com a equao:
log P
oa
=
i
a
i
f
i
j
b
j
F
j
em que f
i
representa as diferentes constantes dos fragmentos moleculares, F
j
representa os termos de correco e a
i
e b
j
representam as correspondentes frequncias de ocorrncia. Por aproximaes sucessivas determinou-se, a partir dos valores
experimentais de P
oa
, uma listagem de valores de fragmentos atmicos e de grupos e uma listagem dos termos de correco
F
j
(designados factores). Os termos de correco foram ordenados segundo diversas classes diferentes (a)(c). relativamente
complicado e moroso levar em considerao todas as regras e termos de correco. Existem disponveis diversas aplicaes
informticas (b).
Mtodo combinado
O clculo dos valores log P
oa
de molculas complexas pode ser consideravelmente aperfeioado, se a molcula for cindida
em substruturas para as quais se encontrem disponveis valores fiveis de log P
oa
, tanto a partir de tabelas (b)(c) como a
partir das medies do prprio investigador. Esses fragmentos (por exemplo, heterociclos, antraquinona, azobenzeno)
podem ser combinados depois com os valores y segundo Hansch ou com as constantes dos fragmentos segundo Rekker ou
Leo.
Observaes
i) Os mtodos de clculo apenas podem ser aplicados a compostos parcial ou totalmente ionizados no caso de ser
possvel tomar em considerao os necessrios factores de correco;
ii) No caso de se admitir a existncia de ligaes intramoleculares entre tomos de hidrognio necessrio adicionar (a)
os correspondentes termos de correco (aproximadamente + 0,6 a + 1,0 unidades log P
oa
). As indicaes para a
presena dessas ligaes podem ser obtidas a partir de modelos espaciais ou a partir de dados espectroscpicos da
molcula;
iii) No caso de serem possveis diversas formas tautomricas, deve-se utilizar a forma mais provvel como base de clculo;
iv) As revises das listagens de constantes de fragmentos devero ser acompanhadas cuidadosamente.
Relatrio
No caso de se utilizar mtodos de clculo/estimao o relatrio do ensaio dever, se possvel, conter a informao seguinte:
descrio da substncia (mistura, impurezas, etc.),
indicao de quaisquer possveis ligaes intramoleculares entre tomos de hidrognio, dissociao, carga e quaisquer
outros efeitos extraordinrios (por exemplo, tautomerismo),
descrio do mtodo de clculo,
identificao ou fonte da base de dados,
peculiaridades na escolha dos fragmentos,
documentao compreensiva relativa aos clculos.
BIBLIOGRAFIA
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill,
New York, 1983.
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem.
Software (Program CLOGP-3).
(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York,
1979.
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.
(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 1979, vol. 14, p. 479.
(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, p. 5175.
(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmentai Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.
(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459.
(i) R.A. Scherrer, ACS American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.
Apndice 2
Substncias de referncia recomendadas para o mtodo de HPLC
Substncia de referncia 2-butanona log P
oa
pKa
1 2-butanona 0,3
2 4-acetilpiridina 0,5
3 anilina 0,9
4 acetanilida 1,0
5 lcool benzlico 1,1
6 p-metoxifenol 1,3 pKa = 10,26
7 cido fenoxi-actico 1,4 pKa = 3,12
8 fenol 1,5 pKa = 9,92
9 2,4-dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96
10 benzonitrilo 1,6
11 fenilacetonitrilo 1,6
12 lcool 4-metilbenzlico 1,6
13 acetofenona 1,7
14 2-nitrofenol 1,8 pKa = 7,17
15 cido 3-nitrobenzico 1,8 pKa = 3,47
16 4-cloranilina 1,8 pKa = 4,15
17 nitrobenzeno 1,9
18 lcool cinmico 1,9
19 cido benzico 1,9 pKa = 4,19
20 p-cresol 1,9 pKa = 10,17
21 cido cinmico 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44
trans
22 anisol 2,1
23 benzoato de metilo 2,1
24 benzeno 2,1
25 cido 3-metilbenzico 2,4 pKa = 4,27
26 4-clorofenol 2,4 pKa = 9,1
27 tricloroetileno 2,4
28 atrazina 2,6
29 benzoato de etilo 2,6
30 2,6-diclorobenzonitrilo 2,6
31 cido 3-clorobenzico 2,7 pKa = 3,82
32 tolueno 2,7
33 1-naftol 2,7 pKa = 9,34
34 2,3-dicloroanilina 2,8
35 clorobenzeno 2,8
36 ter alil-fenlico 2,9
37 bromobenzeno 3,0
38 etilbenzeno 3,2
39 benzofenona 3,2
40 4-fenilfenol 3,2 pKa = 9,54
41 timol 3,3
Substncia de referncia 2-butanona log P
oa
pKa
42 1,4-diclorobenzeno 3,4
43 difenilamina 3,4 pKa = 0,79
44 naftaleno 3,6
45 benzoato de fenilo 3,6
46 isopropilbenzeno 3,7
47 2,4,6-triclorofenol 3,7 pKa = 6
48 bifenilo 4,0
49 benzoato de benzilo 4,0
50 2,4-dinitro-6-sec-butil-fenol 4,1
51 1,2,4-tricloro-benzeno 4,2
52 cido dodecanico 4,2
53 ter difenlico 4,2
54 n-butil-benzeno 4,5
55 fenantreno 4,5
56 fluoranteno 4,7
57 dibenzilo 4,8
58 2,6-difenilpiridina 4,9
59 trifenilamina 5,7
60 DDT 6,2
Outras substncias de referncia de baixo valor log P
oa
1 cido nicotnico - 0,07
A.9. PONTO DE INFLAMAO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
til possuir informao preliminar sobre a inflamabilidade da substncia antes de se efectuar este ensaio. O
procedimento de ensaio aplica-se a substncias lquidas cujos vapores possam ser inflamados por fontes de
ignio. Os mtodos de ensaio enumerados neste texto so apenas fiveis para os intervalos de pontos de
inflamao especificados nos mtodos individuais.
Deve tomar-se em considerao a possibilidade de ocorrncia de reaces qumicas entre a substncia e o
suporte da amostra quando se selecciona o mtodo a utilizar.
O ponto de inflamao a menor temperatura, corrigida para a presso de 101,325 kPa, qual um lquido
liberta vapores, sob as condies definidas no mtodo de ensaio, numa quantidade tal que se produz no
recipiente de ensaio uma mistura ar/vapor inflamvel.
Unidades:
o
C
t = T 273,15
(t em
o
C e T em K)
Coloca-se a substncia no recipiente de ensaio e aquece-se ou arrefece-se at temperatura de ensaio de acordo
com o procedimento descrito no mtodo de ensaio individual. Efectuam-se diversas tentativas para provocar a
ignio no sentido de se determinar se a amostra ou no inflamvel temperatura de ensaio.
A repetitividade varia de acordo com o intervalo de pontos de inflamao e com o mtodo de ensaio utilizado;
mximo 2
o
C.
A sensibilidade depende do mtodo de ensaio utilizado.
1.5.3. Especificidade
A especificidade de alguns mtodos de ensaio est limitada a certos intervalos de pontos de inflamao e sujeita
a dados associados substncia (por exemplo, viscosidade elevada).
1.6.1. Preparaes
Coloca-se uma amostra da substncia de ensaio num aparelho de teste de acordo com 1.6.3.1. e/ou 1.6.3.2.
Por razes de segurana recomenda-se que no caso das substncias energticas ou txicas se pratique um
mtodo que utilize uma pequena quantidade de amostra, cerca de 2 cm
3
.
1.6.2. Condies de ensaio
Tanto quanto for possvel por razes de segurana, o aparelho dever ser colocado numa posio livre de
correntes de ar.
1.6.3. Realizao do ensaio
1.6.3.1. Mtodo de equilbrio
Ver ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.
1.6.3.2. Mtodo de no equilbrio
Aparelho de Abel:
Ver BS 2000 parte 170, NF M07-011, NF T66-009.
Aparelho de Abel-Pensky:
Ver EN 57, DIN 51755 parte 1 (para temperaturas entre 5 e 65
o
C), DIN 51755 parte 2 (para temperaturas
inferiores a 5
o
C), NF M07-036.
Aparelho de Tag:
Ver ASTM D 56.
Aparelho de Pensky-Martens:
Ver ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.
Observaes:
No caso de se verificar que o ponto de inflamao, determinado por um mtodo de no equilbrio em 1.6.3.2.,
possui os valores 0 2
o
C, 21 2
o
C ou 55 2
o
C, deve fazer-se a sua confirmao recorrendo a um mtodo
de equilbrio que utilize o mesmo aparelho.
Apenas os mtodos que possam proporcionar os valores de temperatura do ponto de inflamao podem ser
utilizados para uma notificao.
Para se determinar o ponto de inflamao de lquidos viscosos (tintas, gomas e anlogos) contendo solventes,
apenas se pode utilizar aparelhos e mtodos de ensaio adequados para a determinao dos pontos de
inflamao de lquidos viscosos.
Ver ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 parte 1.
2. RESULTADOS
3. RELATRIO
deve especificar-se o mtodo utilizado e bem assim quaisquer desvios possveis,
os resultados e quaisquer observaes adicionais relevantes para a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
Nenhuma.
A.10. INFLAMABILIDADE (SLIDOS)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Considera-se til possuir informaes preliminares sobre as propriedades potencialmente explosivas da
substncia antes de se efectuar este ensaio.
Este ensaio apenas dever ser aplicado a substncias pulverulentas, granuladas ou pastosas.
No sentido de no se inclurem todas as substncias que podem ser inflamadas, mas apenas aquelas que ardem
rapidamente ou aquelas cuja combusto de alguma forma especialmente perigosa, apenas as substncias cuja
velocidade de combusto excede um determinado valor limite so consideradas altamente inflamveis.
Pode ser especialmente perigosa qualquer situao em que a incandescncia se propague atravs de um metal
em p, devido s dificuldades em extinguir o fogo. Os ps de metais devero ser considerados altamente
inflamveis se permitirem a propagao da incandescncia atravs da sua massa, num intervalo de tempo
especfico.
O tempo de combusto exprime-se em segundos.
No especificadas.
Dispe-se a substncia numa fita inquebrvel ou num rastilho de p com aproximadamente 250 mm de
comprimento e efectua-se um ensaio preliminar para se determinar se ao provocar-se a ignio com uma
chama de gs existe propagao por combusto rpida ou por combusto lenta. Se ocorrer a propagao da
combusto ao longo de 200 mm do rastilho no decurso de um intervalo especfico de tempo, efectua-se
seguidamente o programa de ensaio total para se determinar a velocidade de combusto.
No especificados.
1.6.1. Ensaio preliminar
Dispe-se a substncia numa fila inquebrvel ou num rastilho de p com aproximadamente 250 mm de
comprimento por 20 mm de largura e por 10 mm de altura, sobre uma placa no combustvel, no porosa e de
fraca condutividade trmica. Aplica-se a uma extremidade do rastilho de p uma chama de um queimador de
gs (dimetro mnimo de 5 mm) at o p iniciar a ignio ou durante um perodo mximo de 2 minutos
(5 minutos para ps de metais ou de ligas metlicas). Deve verificar-se se a combusto se propaga ao longo de
200 mm do rastilho no perodo de tempo do ensaio correspondente a 4 minutos (ou 40 minutos para os ps
de metais). No caso de a substncia no se inflamar e no houver propagao de combusto, quer por
combusto viva, quer por combusto lenta, ao longo de 200 mm do rastilho de p no perodo de ensaio
correspondente a 4 minutos (ou 40 minutos), ento a substncia no dever ser considerada altamente
inflamvel e no ser necessrio mais qualquer ensaio. Se a substncia propagar a combusto ao longo de
200 mm do rastilho de p em menos de 4 minutos ou em menos de 40 minutos no caso dos ps de metais,
deve dar-se continuidade ao procedimento a seguir descrito (ponto 1.6.2 e seguintes).
1.6.2. Ensaio da velocidade de combusto
1.6.2.1. Preparao
Enche-se livremente com as substncias pulverulentas ou granuladas um molde de 250 mm de comprimento
com uma seco transversal triangular cuja altura interna de 10 mm e cuja largura de 20 mm. De ambos os
lados do molde, segundo uma direco longitudinal, faz-se a montagem de duas placas metlicas que
constituem limitaes laterais e as quais se projectam 2 mm para alm da aresta superior da seco recta
triangular (ver figura). Depois deixa-se cair o molde trs vezes de uma altura de 2 cm sobre uma superfcie
slida. Se necessrio completa-se depois o enchimento do molde. Efectua-se depois a remoo das limitaes
laterais e retira-se o excesso de substncia. Na parte superior do molde coloca-se uma placa no combustvel,
no porosa e de baixa condutividade trmica, inverte-se o aparelho e remove-se o molde.
As substncias pastosas so dispostas sobre uma placa no combustvel, no porosa e de baixa condutividade
trmica na forma de um cordo de 250 mm de comprimento possuindo uma seco transversal de
aproximadamente 1 cm
2
.
No caso de se tratar de uma substncia sensvel humidade o ensaio dever ser efectuado to rapidamente
quanto possvel aps a sua remoo do recipiente.
1.6.2.3. Realizao do ensaio
Coloca-se a pilha numa zona de um sistema de exausto de fumos.
A velocidade do ar dever ser suficiente para evitar que os fumos escapem para o interior do laboratrio e no
dever variar durante o ensaio. Em torno do aparelho dever ser instalada uma blindagem em forma de
chamin.
Para iniciar a ignio da pilha numa das suas extremidades utiliza-se uma chama de um queimador de gs
(dimetro mnimo de 5 mm). Depois de a pilha ter ardido numa extenso de 80 mm, mede-se a velocidade de
combusto nos 100 mm seguintes.
Efectua-se o ensaio seis vezes, utilizando-se de cada vez uma placa fria limpa, a no ser que se observe um
resultado positivo mais cedo.
2. RESULTADOS
O tempo de combusto determinado no ensaio preliminar (1.6.1.) e o tempo mais curto de combusto
observado nos seis ensaios (1.6.2.3.) so relevantes para a avaliao.
3. RELATRIO
uma descrio da substncia que se pretende ensaiar, o seu estado fsico incluindo o teor em humidade,
os resultados do ensaio preliminar e do ensaio da velocidade de combusto, se tiverem sido efectuados,
todas as observaes adicionais relevantes para a interpretao dos resultados.
As substncias pulverulentas, granuladas ou pastosas so consideradas altamente inflamveis no caso de o
tempo de combusto em quaisquer ensaios efectuados de acordo com o procedimento de ensaio descrito em
1.6.2. ser inferior a 45 segundos. Os ps de metais ou de ligas metlicas so considerados altamente
inflamveis no caso de poderem ser inflamados e de a chama ou a zona de reaco se propagar a toda a
amostra em 10 minutos ou menos.
4. REFERNCIAS
(1) NF T 20-042 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.
Apndice
Figura
Molde e acessrios para a preparao da pilha
A.11. INFLAMABILIDADE (GASES)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Este mtodo permite determinar se os gases misturados com ar temperatura ambiente (cerca de 20
o
C) e
presso atmosfrica so inflamveis e, em caso afirmativo, qual o intervalo de concentraes. As misturas de
concentraes crescentes do gs com ar so expostas a uma fasca elctrica e observa-se a eventual ocorrncia
de ignio.
O intervalo de inflamabilidade o intervalo de concentraes entre os limites inferior e superior de exploso.
Os limites inferior e superior de exploso so os limites de concentrao do gs inflamvel misturado com ar
para cujos valores no ocorre a propagao da chama.
No especificadas.
Aumenta-se gradualmente a concentrao do gs em ar e expe-se a mistura escalonadamente aco de uma
fasca elctrica.
No especificados.
1.6.1. Aparelho
O recipiente de ensaio um cilindro de vidro colocado em posio vertical, possuindo um dimetro interno
mnimo de 50 mm e uma altura mnima de 300 mm. Os elctrodos de ignio encontram-se separados por
uma distncia de 3 a 5 mm e esto colocados 60 mm acima do fundo do cilindro. O cilindro possui uma
abertura para a libertao de presso. O aparelho deve ser protegido por uma blindagem para minimizar
quaisquer danos provocados pela exploso.
Como fonte de ignio utiliza-se uma fasca de induo com a durao de 0,5 segundo, que gerada por um
transformador de alta tenso com uma tenso de sada compreendida entre 10 e 15 kV (potncia mxima de
entrada da ordem de 300 W). Na referncia (2) encontra-se descrito um exemplo de um aparelho adequado.
O ensaio deve ser efectuado temperatura ambiente (cerca de 20
o
C).
Utilizando bombas doseadoras introduz-se no cilindro de vidro uma concentrao conhecida de gs em ar.
Provoca-se uma fasca na mistura e verifica-se se ocorre ou no a existncia de uma chama que se separa da
fonte de ignio e se propaga independentemente. Faz-se variar a concentrao do gs por escales de 1 % em
volume at que haja ocorrncia de ignio conforme anteriormente descrito.
No caso de a estrutura qumica do gs indicar que poder ser eventualmente no inflamvel e de se poder
calcular a composio da mistura estequiomtrica com ar, apenas ser necessrio ensaiar em escales de 1 %
misturas compreendidas no intervalo entre 10 % menos do que a composio estequiomtrica e 10 % mais do
que essa composio.
2. RESULTADOS
A ocorrncia de propagao da chama a nica informao relevante para a determinao desta propriedade.
3. RELATRIO
uma descrio, com dimenses, do aparelho utilizado,
a temperatura a que se efectuou o ensaio,
as concentraes de ensaio e os resultados obtidos,
o resultado do ensaio: gs no inflamvel ou gs altamente inflamvel,
no caso de se ter concludo que o gs no inflamvel, dever especificar-se ento o intervalo de
concentraes no qual foi ensaiado em escales de 1 %,
toda a informao e observaes relevantes para a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
(1) NF T 20-041 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of
gases.
(2) W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker und H.Schacke. Entwicklung einer
Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen. Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol. 56, 2, p. 126-
-127.
A.12. INFLAMABILIDADE (CONTACTO COM GUA)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Este mtodo de ensaio pode ser utilizado para se determinar se a reaco de uma substncia com gua ou com
ar hmido origina o desenvolvimento de quantidades perigosas de um gs ou de gases que possam ser
altamente inflamveis.
O mtodo de ensaio pode ser aplicado tanto a substncias slidas como a substncias lquidas. Este mtodo no
aplicvel a substncias cuja ignio seja espontnea quando em contacto com o ar.
Altamente inflamvel: substncias que em contacto com gua ou com ar hmido libertam gases altamente
inflamveis em quantidades perigosas numa proporo mnima de 1 litro/kg por hora.
Ensaia-se a substncia de acordo com os passos sequenciais adiante descritos: se ocorrer ignio em qualquer
desses passos no necessrio continuar o ensaio. No caso de se saber j que a substncia no reage
violentamente com a gua, prosseguir com o passo 4 (1.3.4.).
1.3.1. Passo 1
Coloca-se a substncia de ensaio numa tina contendo gua destilada temperatura de 20
o
C e verifica-se se
ocorre ou no o incio da combusto do gs libertado.
1.3.2. Passo 2
Coloca-se a substncia de ensaio sobre uma folha de papel de filtro flutuando sobre a superfcie da gua
destilada contida num prato, temperatura de 20
o
C, e observa-se se ocorre ou no o incio da combusto do
gs libertado. O papel de filtro destina-se apenas a manter a substncia num determinado local para aumentar
as probabilidades de ocorrncia de ignio.
1.3.3. Passo 3
Com a substncia de ensaio prepara-se uma pilha com aproximadamente 2 cm de altura e 3 cm de dimetro.
Verte-se nessa pilha algumas gotas de gua e observa-se se h ou no ocorrncia de incio de combusto do gs
libertado.
1.3.4. Passo 4
Mistura-se a substncia a ensaiar com gua destilada temperatura de 20
o
C e mede-se a velocidade de
libertao de gs durante um perodo de sete horas, em intervalos de uma hora. Se essa taxa de libertao de gs
for errtica ou no caso de ser crescente decorridas as sete horas, dever prolongar-se o tempo de medio at ao
mximo de cinco dias. O ensaio pode ser interrompido se em qualquer momento essa taxa exceder 1 litro/kg
por hora.
No especificadas.
No especificados.
1.6.1. Passo 1
Efectua-se o ensaio temperatura ambiente (cerca de 20
o
C).
Deve-se colocar uma pequena quantidade (aproximadamente com 2 mm de dimetro) da substncia de ensaio
numa tina contendo gua destilada. Deve-se anotar (i) qualquer eventual libertao de gs e (ii) a eventual
ocorrncia de ignio do gs. No caso de ocorrer ignio do gs no necessrio continuar o ensaio da
substncia uma vez que esta considerada perigosa.
1.6.2. Passo 2
1.6.2.1. Aparelho
Utiliza-se um papel de filtro flutuando sobre a superfcie de gua destilada contida em qualquer recipiente
adequado, por exemplo, um prato de evaporao com o dimetro de 100 mm.
o
C).
Coloca-se no centro da folha de papel de filtro uma pequena quantidade da substncia de ensaio
(aproximadamente com 2 mm de dimetro). Deve-se anotar se ocorre (i) qualquer eventual libertao de gs e
(ii) se ocorre ignio desse gs. Se ocorrer a ignio do gs no necessrio continuar o ensaio da substncia,
uma vez que esta considerada perigosa.
1.6.3. Passo 3
o
C).
Com a substncia de ensaio prepara-se uma pilha com aproximadamente 2 cm de altura e 3 cm de dimetro
com um entalhe na parte superior. Verte-se na perfurao algumas gotas de gua e verifica-se (i) se ocorre
eventualmente qualquer libertao de gs e (ii) se ocorre ignio desse gs. Se ocorrer ignio do gs no
necessrio continuar o ensaio da substncia uma vez que esta considerada perigosa.
1.6.4. Passo 4
1.6.4.1. Aparelho
O aparelho tem a configurao que se mostra na figura.
Procede-se a uma inspeco da embalagem para verificao da existncia de p (dimenso das partculas < 500
m) da substncia de ensaio. Se o p constituir mais do que 1 % p/p do total, ou se a amostra for frivel, ento
dever-se- triturar toda a substncia reduzindo-a a p antes do ensaio de modo a proporcionar uma reduo
das dimenses das partculas durante o armazenamento e o manuseamento; caso contrrio faz-se o ensaio da
substncia tal como foi recebida. O ensaio dever ser efectuado temperatura ambiente (cerca de 20
o
C) e
presso atmosfrica.
Coloca-se 10 a 20 ml de gua no funil de gotejamento do aparelho e coloca-se 10 g de substncia no frasco
cnico. Pode-se medir o volume de gs libertado recorrendo a meios adequados. Abre-se a torneira do funil de
gotejamento para deixar entrar a gua no frasco cnico e pe-se em funcionamento um cronmetro. Mede-se a
libertao de gs em cada hora durante um perodo de sete horas. No caso da libertao de gs durante esse
perodo ser errtica ou no caso de no fim desse perodo a taxa de libertao de gs ser crescente, ento dever-se-
- continuar a efectuar medies durante cinco dias. Se em qualquer momento do perodo de medio a taxa de
libertao de gs exceder 1 litro/kg por hora pode-se interromper o ensaio. Este ensaio dever ser efectuado em
triplicado.
No caso de ser desconhecida a identidade do gs, deve-se proceder a uma anlise desse gs. No caso de o gs
conter componentes altamente inflamveis e de no se saber se a mistura global altamente inflamvel, deve-se
preparar uma mistura da mesma composio e ensaiar-se de acordo com o mtodo A.11.
2. RESULTADOS
A substncia considerada perigosa se:
ocorrer ignio espontnea em qualquer passo do procedimento de ensaio,
ou
ocorrer libertao de gs inflamvel a uma taxa superior a 1 litro/kg de substncia por hora.
3. RELATRIO
pormenores sobre qualquer preparao inicial da substncia de ensaio,
os resultados dos ensaios (passos 1, 2, 3 e 4),
a identidade qumica do gs libertado,
a taxa de libertao de gs no caso de se realizar o passo 4 (1.6.4.),
quaisquer observaes adicionais relevantes para a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and Criteria, 1990, United Nations, New
York.
(2) NF T 20-040 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases
formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
Apndice
Figura
Aparelho
A.13 PROPRIEDADES PIROFRICAS DE SLIDOS E LQUIDOS
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O procedimento de ensaio aplicvel a substncias slidas ou lquidas as quais, em pequenas quantidades,
entram espontaneamente em combusto, decorrido um curto perodo de tempo aps estarem em contacto
com o ar temperatura ambiente (cerca de 20
o
C).
As substncias que necessitem de estar expostas ao ar durante diversas horas ou dias, temperatura ambiente
ou a temperaturas elevadas, antes que ocorra a ignio, no esto abrangidas por este mtodo.
Considera-se que uma substncia possui propriedades pirofricas se entrar em combusto ou se carbonizar sob
as condies descritas em 1.6.
Pode ser necessrio ensaiar tambm a auto-inflamabilidade de lquidos utilizando o mtodo A.15 relativo
temperatura de auto-ignio (lquidos e gases).
No especificadas.
Adiciona-se a substncia, no estado slido ou no estado lquido, a um veculo inerte e coloca-se em contacto
com o ar temperatura ambiente durante um perodo de cinco minutos. Se as substncias lquidas no se
inflamarem utiliza-se papel de filtro para as absorver e faz-se a exposio ao ar temperatura ambiente (cerca
de 20
o
C) durante cinco minutos. No caso de uma substncia slida ou lquida se inflamar, ou no caso de um
lquido se inflamar ou carbonizar uma folha de papel de filtro, ento considera-se que essa substncia
pirofrica.
Repetitividade: devido importncia que assumem as questes relativas segurana, um nico resultado
positivo suficiente para que essa substncia seja considerada pirofrica.
1.6. DESCRIO DO MTODO DE ENSAIO
1.6.1. Aparelho
Utiliza-se um vaso de porcelana com cerca de 10 cm de dimetro e enche-se com terra de diatomceas at cerca
de 5 mm de altura, temperatura ambiente (cerca de 20
o
C).
Nota:
A terra de diatomceas ou quaisquer outras substncias inertes comparveis geralmente disponveis devero ser
consideradas como representativas do solo onde a substncia de ensaio possa ser derramada em caso de
acidente.
necessrio papel de filtro seco para ensaiar os lquidos que no se inflamem em contacto com o ar quando
esto em contacto com um veculo inerte.
a) Slidos pulverulentos
De uma altura de cerca de 1 m deixa-se cair 1 a 2 cm
3
da substncia pulverulenta que se pretende ensaiar, sobre
uma superfcie no combustvel e verifica-se a eventualidade dessa substncia se inflamar durante a queda ou
decorridos cinco minutos em repouso.
Efectua-se o ensaio seis vezes, salvo no caso de se observar combusto.
b) Lquidos
Verte-se no vaso de porcelana cerca de 5 cm
3
do lquido que se pretende ensaiar e observa-se a eventual
inflamao da substncia no perodo de cinco minutos.
Se no houver inflamao nos seis ensaios, executam-se os ensaios seguintes:
Com o auxlio de uma seringa coloca-se 0,5 ml da amostra de ensaio num papel de filtro recortado e observa-
-se a eventual ocorrncia de inflamao ou de carbonizao do papel de filtro nos cinco minutos subsequentes
adio do lquido. Efectua-se o ensaio trs vezes, salvo se ocorrer inflamao ou carbonizao.
2. RESULTADOS
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS
Pode interromper-se o processo de ensaio logo que ocorra um resultado positivo em qualquer dos ensaios.
2.2. AVALIAO
Se a substncia se inflama no perodo de cinco minutos aps ter sido adicionada a um veculo inerte e exposta
ao ar, ou se uma substncia lquida carboniza ou inflama um papel de filtro no perodo de cinco minutos aps
a adio e exposio ao ar, ento considera-se que pirofrica.
3. RELATRIO
os resultados dos ensaios,
quaisquer observaes adicionais relevantes para a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
(1) NF T 20-039 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous
flammability of solids and liquids.
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and Criteria, 1990, United Nations, New
York.
A.14. PROPRIEDADES EXPLOSIVAS
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O mtodo proporciona um sistema de ensaio para se determinar se uma substncia slida ou pastosa
representa perigo de exploso quando submetida ao efeito de uma chama (sensibilidade trmica) ou quando
submetida a choque ou frico (sensibilidade a estmulos mecnicos) e se uma substncia lquida representa
perigo de exploso quando submetida ao efeito de uma chama ou choque.
O mtodo decompe-se em trs partes:
a) Um ensaio de sensibilidade trmica (1);
b) Um ensaio de sensibilidade mecnica relativamente ao choque (1);
c) Um ensaio de sensibilidade mecnica relativamente frico (1).
O mtodo proporciona dados para se avaliar a possibilidade de se iniciar uma exploso por meio de diversos
estmulos comuns. O mtodo no pretende garantir que uma substncia seja susceptvel de explodir sob
quaisquer condies.
O mtodo apropriado para se determinar se uma substncia representa perigo de exploso (sensibilidade
trmica e mecnica) sob as condies particulares especificadas na directiva. Esse mtodo baseia-se em diversos
tipos de aparelhos amplamente utilizados escala internacional (1) e os quais proporcionam normalmente
resultados significativos. Admite-se que o mtodo no definitivo. possvel utilizar aparelhos alternativos aos
especificados desde que sejam internacionalmente aceites e desde que os resultados possam ser adequadamente
correlacionados com os que se obtm com o aparelho especificado.
No necessrio efectuar os ensaios quando existir informao termodinmica disponvel (por exemplo, calor
de formao, calor de decomposio) e/ou a ausncia de diversos grupos reactivos (2) na frmula estrutural
permitir concluir, para alm de quaisquer dvidas razoveis, que a substncia incapaz de sofrer decomposio
rpida com libertao de gases ou libertao de calor (isto , o material no representa qualquer risco de
exploso). No caso dos lquidos no necessrio qualquer ensaio de sensibilidade mecnica relativamente
frico.
Explosivo:
Substncias que possam explodir sob o efeito de uma chama ou que sejam sensveis ao choque ou frico no
aparelho especificado (ou que sejam mecanicamente mais sensveis do que o 1,3-dinitrobenzeno num aparelho
alternativo).
O 1,3-dinitrobenzeno, produto cristalino tcnico, peneirado de modo a poder passar por uma malha de
0,5 mm, no caso do mtodo por frico e choque.
A perhidro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazina (RDX, hexogneo, ciclonite CAS 121-82-4), cuja recristalizao feita
a partir de uma soluo aquosa de ciclohexanona, peneirada a hmido atravs de uma malha de 250 m e
retida num peneiro de malha de 150 m, fazendo-se a secagem a 103 2
o
C (durante 4 horas) para a segunda
srie de ensaios de frico e choque.
So necessrios ensaios preliminares para se determinar as condies de segurana para a realizao dos trs
ensaios de sensibilidade.
1.4.1. Segurana na realizao dos ensaios (3)
Por razes de segurana, antes de se efectuarem os ensaios principais submetem-se amostras muito pequenas
(cerca de 10 mg) da substncia a aquecimento em ambiente no confinado, com uma chama de gs, aco de
choque em qualquer aparelho conveniente e aco de frico recorrendo utilizao de um malhete contra
uma bigorna ou recorrendo utilizao de qualquer mquina de frico. O objectivo consiste em determinar se
a substncia to sensvel e explosiva que os ensaios de sensibilidade prescritos, particularmente o ensaio de
sensibilidade trmica, devam ser efectuados com precaues especiais de modo a evitar ferimentos no operador.
1.4.2. Sensibilidade trmica
O mtodo implica o aquecimento da substncia num tubo de ao, tapado por placas perfuradas com furos de
diferentes dimetros, no sentido de se determinar se a substncia susceptvel de explodir sob condies de
aquecimento intenso e confinamento definido.
1.4.3. Sensibilidade mecnica (choque)
O mtodo consiste em submeter a substncia ao choque provocado por uma massa determinada caindo de
uma altura determinada.
14.4. Sensibilidade mecnica (frico)
O mtodo consiste em submeter substncias slidas ou pastosas frico entre superfcies normalizadas sob
condies especficas de carga e de movimento relativo.
No especificados.
1.6.1. Sensibilidade trmica (efeito de uma chama)
1.6.1.1. Aparelho
O aparelho constitudo por um tubo de ao no reutilizvel com o seu dispositivo de fecho reutilizvel (figu-
ra 1), instalado num dispositivo de aquecimento e de proteco. Cada tubo constitudo por folha de ao de
estiramento profundo (ver apndice) e possui um dimetro interno de 24 mm, um comprimento de 75 mm e
paredes com espessura de 0,5 mm. Os tubos possuem uma flange na extremidade aberta para permitir que
sejam fechados pelo corpo da placa perfurada. Esse corpo constitudo por uma placa perfurada resistente
presso, possuindo um furo central, presa firmemente a um tubo por meio de uma pea roscada de duas partes
(porca e manga roscada). A porca e a manga roscada so feitas de ao de crmio e mangans (ver apndice), que
no produz fascas at temperatura de 800
o
C. As placas perfuradas possuem 6 mm de espessura, so feitas de
ao resistente ao calor (ver apndice) e encontram-se disponveis com perfuraes de diversos dimetros.
Normalmente ensaia-se a substncia tal como recebida, embora em alguns casos a substncia aps triturao
seja, por exemplo, comprimida, moldada ou aglomerada por qualquer outra forma, necessria para o ensaio.
No caso dos slidos determina-se a massa de material a utilizar em cada ensaio recorrendo a um procedimento
experimental a seco em dois andares. Enche-se com 9 cm
3
de substncia um tubo de tara determinada e
carrega-se a substncia com uma fora de 80 N aplicada a toda a seco transversal do tubo. Por razes de
segurana ou nos casos em que a forma fsica da amostra possa ser modificada por compresso, pode recorrer-
-se a outros procedimentos de enchimento; por exemplo, se a substncia for muito sensvel frico o
enchimento pelo mtodo de embuchar no apropriado. Se o material for compressvel adiciona-se mais e
carrega-se enchendo-se o tubo at distncia de 55 mm medida a partir da parte superior. Determina-se a
massa total utilizada para encher o tubo at quele nvel de 55 mm e adiciona-se mais duas pores
carregando-se qualquer delas com a fora de 80 N. Depois, ou se adiciona mais material ou se retira, conforme
necessrio, deixando o tubo cheio at ao nvel de 15 mm medidos a partir da parte superior. Realiza-se uma
segunda experincia a seco, comeando com uma quantidade carregada correspondente a um tero da massa
total determinada na primeira experincia a seco. Adiciona-se mais duas pores dessas utilizando uma fora
de 80 N e ajusta-se o nvel da substncia no tubo at distncia de 15 mm, medida desde a parte superior, por
adio ou por subtraco de material conforme necessrio. A quantidade de slido determinada na segunda
experincia a seco utilizada para cada ensaio; o enchimento efectua-se com trs quantidades iguais, qualquer
delas comprimida at ao volume de 9 cm
3
utilizando-se a fora que for necessria (isto pode ser facilitado
utilizando anis espaadores).
Os lquidos e os geles so carregados no tubo at altura de 60 mm tomando-se precaues particulares com
os geles para se evitar a formao de espaos ocos. Faz-se deslizar a manga roscada pelo tubo, pela parte de
baixo, insere-se a placa perfurada apropriada e aperta-se a porca depois de se ter aplicado um pouco de
lubrificante base de dissulfureto de molibdnio. essencial verificar que no haja quaisquer vestgios de
substncia retida entre a flange e a placa, ou nas roscas.
O aquecimento proporcionado por uma chama de gs propano obtido em garrafa de gs industrial, equipada
com um regulador de presso (60 a 70 mbar), que passa atravs de uma vlvula calibradora e distribudo
uniformemente (conforme indicado por observao visual das chamas dos queimadores) a quatro queimadores
atravs de um cano distribuidor. Os queimadores esto localizados em torno da cmara de ensaio conforme se
mostra na figura 1. Os quatro queimadores conjuntamente possuem um consumo de aproximadamente 3,2
litros de propano por minuto. possvel utilizar outros queimadores e gases combustveis alternativos mas o
regime de aquecimento deve ser conforme especificado na figura 3. Para todos os aparelhos o regime de
aquecimento deve ser verificado periodicamente utilizando tubos cheios com ftalato de dibutilo conforme se
indica na figura 3.
1.6.1.3. Realizao dos ensaios
Cada ensaio efectuado at o tubo se fragmentar ou at o tubo ter sido aquecido durante cinco minutos. Um
ensaio que tenha como consequncia a fragmentao do tubo em trs ou mais partes, as quais podem em
alguns casos ser unidas umas s outras utilizando estreitas fitas de metal, conforme se ilustra na figura 2,
considerado do tipo explosivo. Um ensaio que tenha como consequncia menos fragmentos ou ausncia de
fragmentao considerado como sendo do tipo no explosivo.
Efectua-se primeiro uma srie de trs ensaios com uma placa cujo dimetro do orifcio seja de 6,0 mm e se no
se obtiver qualquer exploso efectua-se uma segunda srie de trs ensaios com uma placa cujo dimetro do
orifcio seja de 2,0 mm. Se ocorrer uma exploso durante quaisquer das sries de ensaio, no necessrio
efectuar mais ensaios.
1.6.1.4. Avaliao
Considera-se que o resultado do ensaio positivo se ocorrer uma exploso em qualquer das anteriores sries de
ensaios.
1.6.2. Sensibilidade mecnica (choque)
1.6.2.1. Aparelho (figura 4)
As partes essenciais de um aparelho de martelo cadente tpico so um bloco de ao moldado com base,
bigorna, coluna, guias, massas cadentes, dispositivo de libertao e um suporte para a amostra. A bigorna de
ao de 100 mm (dimetro) 70 mm (altura) enroscada parte superior de um bloco de ao de 230 mm
(comprimento) 250 mm (largura) 200 mm (altura) com uma base moldada de 450 mm (comprimento)
450 mm (largura) 60 mm (altura). Num suporte aparafusado parte posterior do bloco de ao prende-se
uma coluna feita de tubo de ao estirado sem juntas. Quatro parafusos prendem o aparelho a um slido bloco
de cimento de 60 60 60 cm de tal modo que as guias so absolutamente verticais e a massa cadente cai
livremente. Existem disponveis para utilizao massas de 5 e 10 kg, feitas de ao. A cabea batente de cada
massa feita de ao duro, HRC 60 a 63, e possui um dimetro mnimo de 25 mm.
A amostra de ensaio encerrada num dispositivo de choque constitudo por dois cilindros de ao coaxiais, um
sobre o outro, num guia de ao cilndrico e oco. Os cilindros de ao devero possuir um dimetro de 10
(- 0,003, - 0,005) mm e uma altura de 10 mm e devero possuir superfcies polidas, arestas arredondadas (raio
de curvatura de 0,5 mm) e uma dureza de HRC 58 a 65. O cilindro oco deve possuir um dimetro externo de
16 mm, um furo polido de 10 (+ 0,005, + 0,010) mm e uma altura de 13 mm. O dispositivo de choque
montado numa bigorna intermdia (26 mm de dimetro e 26 mm de altura) feita de ao e centrada por um
anel com perfuraes para permitir o escape dos fumos.
O volume da amostra dever ser de 40 mm
3
ou um volume que se ajuste a qualquer aparelho alternativo. As
substncias no estado slido devero ser testadas devidamente secas e preparadas do modo seguinte:
a) As substncias pulverizadas so peneiradas (malha com dimenses de 0,5 mm); toda a substncia que
passar pelo peneiro utilizada no ensaio;
b) As substncias comprimidas, moldadas ou aglomeradas por qualquer outra forma so partidas em
pequenas partes e peneiradas; a fraco peneirada com dimetros compreendidos entre 0,5 e 1 mm
usada no ensaio e dever ser representativa da substncia original.
As substncias normalmente fornecidas em pasta devero ser ensaiadas no estado seco, quando possvel, ou
depois de remover a quantidade mxima possvel de diluente. As substncias lquidas so ensaiadas com o
intervalo de 1 mm entre os cilindros de ao superior e inferior.
Realiza-se uma srie de seis ensaios deixando cair uma massa de 10 kg, de uma altura de 0,4 m (40 J). Se
ocorrer uma exploso durante os seis ensaios para o valor de 40 J deve realizar-se outra srie de seis ensaios
deixando cair uma massa de 5 kg e de uma altura de 0,15 m (7,5 J). Noutros aparelhos compara-se a amostra
com a substncia de referncia escolhida utilizando um procedimento reconhecido (por exemplo, tcnica de
sobe-e-desce, etc.).
1.6.2.4. Avaliao
Considera-se positivo o resultado do ensaio se ocorrer uma exploso (o aparecimento sbito de uma chama e/
/ou uma repercusso equivalente a uma exploso) pelo menos uma vez em qualquer dos ensaios com o
aparelho de choque especificado ou considera-se que a amostra mais sensvel do que o composto 1,3-
-dinitrobenzeno ou RDX num ensaio de choque alternativo.
1.6.3. Sensibilidade mecnica (frico)
1.6.3.1. Aparelho (figura 5)
O aparelho de frico constitudo por uma placa de base de ao moldado sobre a qual se monta o dispositivo
de frico. Este constitudo por uma cavilha de porcelana fixa e por uma placa de porcelana mvel. A placa de
porcelana suportada por uma armao que desliza em duas guias. A armao ligada a um motor elctrico
atravs de uma biela de ligao, um ressalto excntrico e uma engrenagem adequada de tal modo que a placa de
porcelana se move, uma vez apenas, para trs e para diante por baixo da cavilha de porcelana numa distncia de
10 mm. A carga da cavilha de porcelana de 120 a 360 newtons, por exemplo.
As placas lisas de porcelana so feitas de porcelana branca (rugosidade de 9 a 32 m) e possuem as dimenses
de 25 mm (comprimento) 25 mm (largura) 5 mm (altura). A cavilha cilndrica de porcelana feita tambm
de porcelana branca e tem 15 mm de comprimento, possui um dimetro de 10 mm e na extremidade esfrica
rugosa possui superfcies com um raio de curvatura de 10 mm.
O volume da amostra dever ser de 10 mm
3
ou um volume ajustado a qualquer aparelho alternativo.
As substncias slidas so ensaiadas devidamente secas e preparadas do modo seguinte:
a) As substncias pulverizadas so peneiradas (com malha de 0,5 mm); utiliza-se no ensaio toda a
substncia que passe atravs do peneiro;
b) As substncias comprimidas, moldadas ou aglomeradas por qualquer outra forma so partidas em peas
pequenas e peneiradas; utiliza-se para o ensaio a fraco peneirada de dimetro < 0,5 mm.
As substncias normalmente fornecidas em pasta devero ser ensaidas no estado seco, quando possvel. Se a
substncia no pode ser preparada no estado seco, a pasta (depois de removida a quantidade mxima possvel
de diluente) ensaiada na forma de uma pelcula com 0,5 mm espessura, 2 mm de largura e 10 mm de
comprimento preparada com uma matriz.
Coloca-se a cavilha de porcelana sobre a amostra submetida ao ensaio e aplica-se a carga. Ao efectuar-se o
ensaio, as marcas esponjosas da placa de porcelana devem ficar transversais direco do movimento. Devem
ser tomadas precaues para que a cavilha se ajuste sobre a amostra, para que haja material de ensaio suficiente
sob a cavilha e tambm para que a placa se mova correctamente sob a cavilha. Para as substncias pastosas
utiliza-se um calibrador com 0,5 mm de espessura e com uma fenda de 2 10 mm para se aplicar a substncia
placa. A placa de porcelana tem de se mover 10 mm para diante e para trs sob a cavilha de porcelana no
tempo de 0,44 segundos. Cada parte da superfcie da placa e da cavilha deve ser utilizada apenas uma vez; as
duas extremidades de cada cavilha serviro para duas experincias e as duas superfcies de uma placa serviro,
cada uma delas, para trs experincias.
Efectua-se uma srie de seis ensaios com uma carga de 360 N. Se ocorrer um evento positivo durante estes seis
ensaios deve ser efectuada outra srie de seis ensaios com uma carga de 120 N. Com outros aparelhos
compara-se a amostra com a substncia de referncia escolhida utilizando um procedimento consagrado (por
exemplo, tcnica de sobe-e-desce, etc.).
1.6.3.4. Avaliao
Considera-se positivo o resultado do ensaio se ocorrer uma exploso (a crepitao e/ou uma repercusso ou o
aparecimento sbito de uma chama so equivalentes a uma exploso) pelo menos uma vez em qualquer dos
ensaios com o aparelho de frico especificado ou se for satisfeito um critrio equivalente num ensaio de
frico alternativo.
2. RESULTADOS
Em princpio considera-se que uma substncia representa perigo de exploso no sentido da directiva se for
obtido um resultado positivo no ensaio de sensibilidade trmica, de choque ou de frico.
3. RELATRIO
identidade, composio, pureza, teor em humidade, etc., da substncia ensaiada,
a forma fsica da amostra e o facto eventual de ter sido triturada, quebrada e/ou peneirada,
as observaes durante os ensaios de sensibilidade trmica (por exemplo, a massa da amostra, o nmero
de fragmentos, etc.),
as observaes efectuadas durante os ensaios de sensibilidade mecnica (por exemplo, a formao de
quantidades considerveis de fumos ou a decomposio completa sem repercusso, chamas, fascas,
crepitao, etc.),
os resultados de cada tipo de ensaio,
no caso de se ter utilizado um aparelho alternativo, o relatrio dever conter a justificao cientfica e
tambm a evidncia de correlao entre os resultados obtidos com o aparelho especificado e os
resultados obtidos com o aparelho equivalente,
quaisquer comentrios teis tais como as referncias em ensaios com produtos idnticos e que possam
ser relevantes para uma interpretao adequada dos resultados,
3.2. INTERPRETAO E AVALIAO DOS RESULTADOS
O relatrio do ensaio dever mencionar quaisquer resultados que sejam considerados falsos, anmalos ou no
representativos. Se for necessrio deduzir quaisquer dos resultados dever descrever-se uma explicao e os
resultados de ensaios alternativos ou complementares. Salvo nos casos em que possa ser explicado um
resultado anmalo, deve aceitar-se o valor nominal e utilizar-se esse valor para classificar a substncia em
conformidade.
4. REFERNCIAS
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and Criteria, 1990, United Nations, New
York.
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Buttcrworths, London, ISBN 0-750-
-60103-5, 1990.
(3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, p. 6-13 and p. 30-42.
(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use Determination of explosion risk.
Apndice
Exemplo de especificao de material para o ensaio de sensibilidade trmica (ver DIN 1623)
(1) Tubo: especificao de material n
o
1.0336.505 g.
(2) Placa perfurada: especificao de material n.
o
1.4873
(3) Manga roscada e porca: especificao de material n.
o
1.3817.
Figura 1
Aparelho para o ensaio da sensibilidade trmica
Figura 2
Ensaio de sensibilidade trmica
Exemplos de fragmentao
Figura 3
Calibrao da taxa de aquecimento para o ensaio da sensibilidade trmica
Curva de temperatura/tempo obtida ao aquecer-se ftalato de dibutilo (27 cm3) num tubo fechado (placa com
orifcio de 1,5 mm) utilizando gs propano com o dbito de 3,2 litros/minuto. Mede-se a temperatura com um
termopar de 1 mm de dimetro feito de crmio/alumnio revestido com ao inoxidvel, colocado centralmente
43 mm sob o aro do tubo. A taxa de aquecimento entre 135 C e 285 C dever estar compreendida entre
185 e 215 K/minuto.
Figura 4
Aparelho para o ensaio de choque
Figura 4
Continuao
Figura 5
Sensibilidade frico: aparelho
A.15. TEMPERATURA DE AUTO-IGNIO (LQUIDOS E GASES)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
As substncias explosivas e as substncias que sofrem ignio espontnea em contacto com o ar temperatura
ambiente no devem ser submetidas a este ensaio. O procedimento de ensaio aplicvel a gases, lquidos e
vapores, que, na presena de ar, podem ser inflamados por uma superfcie quente.
A temperatura de auto-ignio pode ser consideravelmente reduzida pela presena de impurezas catalticas, pela
superfcie do material ou pelo facto de o recipiente de ensaio ter um volume superior.
O grau de propenso para a auto-ignio exprime-se em termos de temperatura de auto-ignio. A temperatura
de auto-ignio a menor temperatura para a qual a substncia de ensaio se inflama quando misturada com ar
sob as condies definidas no mtodo de ensaio.
As substncias de referncia esto enumeradas nas normas (ver 1.6.3.). Devem servir essencialmente para a
calibrao do mtodo, de vez em quando, e para permitir a comparao com resultados obtidos com outros
mtodos.
O mtodo permite a determinao da temperatura mnima da superfcie interior de um recinto fechado qual
ocorre a ignio de um gs, vapor ou lquido injectados nesse recinto fechado.
A repetitividade varia de acordo com o intervalo de temperaturas de auto-ignio e com o mtodo de ensaio
utilizado,
A sensibilidade e a especificidade dependem do mtodo de ensaio utilizado.
1.6.1. Aparelho
O aparelho encontra-se descrito no mtodo referido em 1.6.3.
O ensaio de uma amostra da substncia efectua-se de acordo com o mtodo referido em 1.6.3.
Ver IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.
2. RESULTADOS
Regista-se a temperatura de ensaio, a presso atmosfrica, a quantidade de amostra utilizada e o intervalo de
tempo decorrido at ocorrncia da ignio.
3. RELATRIO
a quantidade de amostra utilizada,
a presso atmosfrica,
o aparelho utilizado,
os resultados das medies (temperaturas de ensaio, resultados relativos ignio, correspondentes
intervalos de tempo),
4. REFERNCIAS
Nenhuma.
A.16. TEMPERATURA DE AUTO-1GNIO RELATIVA PARA OS SLIDOS
1. MTODO
1.1. INTRODUO
As substncias explosivas e as substncias que se inflamam espontaneamente em contacto com o ar
temperatura ambiente no devero ser submetidas a este ensaio.
O objectivo deste ensaio consiste em proporcionar informao preliminar sobre a auto-inflamabilidade de
substncias slidas a temperaturas elevadas.
Se o calor desenvolvido por reaco da substncia com oxignio ou por decomposio exotrmica no for
perdido para o meio envolvente com rapidez suficiente, ocorre o fenmeno de auto-aquecimento que conduz
auto-ignio. Em consequncia, a auto-ignio ocorre sempre que a razo de produo de calor excede a razo
da perda de calor.
O procedimento de ensaio til como pesquisa preliminar para as substncias slidas. Dada a natureza
complexa da ignio e da combusto de slidos, a temperatura de auto-ignio determinada de acordo com
este mtodo apenas dever ser utilizada para efeitos de comparao.
A temperatura de auto-ignio obtida por este mtodo a temperatura ambiente mnima expressa em
o
C qual
se inflamar um determinado volume de substncia sob condies definidas.
1.3. SUBSTNCIA DE REFERNCIA
Nenhuma.
Coloca-se num forno, temperatura ambiente, um determinado volume de substncia a ensaiar; traa-se uma
curva temperatura/tempo relativa s condies no centro da amostra, aumentando-se a temperatura do forno
at 400
o
C ou at ao ponto de fuso da substncia se for menor, razo de 0,5
o
C/minuto. Para os objectivos
deste ensaio, a temperatura do forno para a qual a temperatura da amostra de 400
o
C por auto-aquecimento
designada por temperatura de auto-ignio.
Nenhum.
1.6.1. Aparelho
1.6.1.1. Forno
Utiliza-se um forno de laboratrio de temperatura programada (com o volume aproximado de dois litros)
equipado com sistema de circulao de ar natural e com sistema para aliviar os efeitos da exploso. No sentido
de se evitar um potencial risco de exploso, no se dever permitir que quaisquer gases de decomposio
estabeleam contacto com os componentes elctricos do sistema de aquecimento.
1.6.1.2. Cubo de rede de arame
De acordo com o diagrama da figura 1 prepara-se uma pea de rede de arame de ao inoxidvel com aberturas
de 0,045 mm. A rede dever ser dobrada e presa com arame no interior de cubos abertos por cima.
1.6.1.3. Termopares
Termopares adequados.
1.6.1.4. Registador
Utiliza-se qualquer registador de dois canais calibrado de 0 a 600
o
C ou calibrado para a tenso correspondente.
As substncias so ensaiadas tal qual so recebidas.
Enche-se o cubo com a substncia de ensaio e bate-se suavemente adicionando-se mais substncia at o cubo
estar completamente cheio. Depois suspende-se o cubo no centro do forno, temperatura ambiente. Coloca-se
um termopar no centro do cubo e coloca-se outro entre o cubo e a parede do forno para registar a temperatura
deste.
As temperaturas do forno e da amostra so registadas continuamente ao mesmo tempo que a temperatura do
forno aumenta at 400
o
C ou at ao ponto de fuso da substncia, se for inferior, razo de 0,5
o
C/minuto.
Ao ocorrer a ignio da substncia o termopar da amostra indicar uma subida muito rpida da temperatura,
superior temperatura do forno.
2. RESULTADOS
A temperatura do forno qual a temperatura da amostra atinge 400
o
C por auto-aquecimento relevante para a
avaliao (ver figura 2).
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio dever, se possvel, conter a informao seguinte:
uma descrio da substncia a ensaiar,
os resultados da medio, incluindo a curva temperatura/tempo,
4. REFERNCIAS
(1) NF T 20-036 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of
the spontaneous flammability of solids.
Figura 1
Planificao do cubo de ensaio com 20 mm de aresta
Figura 2
Curva tpica de temperatura/tempo
A.17. PROPRIEDADES OXIDANTES (SLIDOS)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
til possuir informaes preliminares sobre quaisquer potenciais propriedades explosivas da substncia antes
de se efectuar este ensaio.
Este ensaio no aplicvel a lquidos, gases, substncias explosivas ou altamente inflamveis ou perxidos
orgnicos.
No necessrio efectuar este ensaio no caso de o exame da frmula estrutural determinar, para alm de
qualquer dvida razovel, que a substncia incapaz de reagir exotermicamente com um material combustvel.
No sentido de se determinar se o ensaio deve ser efectuado com precaues especiais, dever-se- efectuar um
ensaio preliminar.
Tempo de combusto: o tempo de reaco, em segundos, necessrio para a zona de reaco se deslocar ao
longo de uma pilha utilizando o procedimento descrito em 1.6.
Velocidade de combusto: expressa em milmetros por segundo.
Velocidade mxima de combusto: o valor mximo das velocidades de combusto obtidas com misturas
contendo entre 10 % e 90 % em peso do oxidante.
Utiliza-se o nitrato de brio (qualidade analtica) como substncia de referncia para o ensaio e para o ensaio
preliminar.
A mistura de referncia uma mistura de nitrato de brio com p de celulose preparada de acordo com 1.6.,
que possui a velocidade mxima de combusto (normalmente uma mistura contendo nitrato de brio na
proporo de 60 % em peso).
Por razes de segurana, efectua-se um ensaio preliminar. No necessrio mais nenhum ensaio no caso de se
verificar claramente no ensaio preliminar que a substncia de ensaio possui propriedades oxidantes. Se no for
esse o caso, a substncia dever ser ento submetida ao ensaio completo.
No ensaio completo mistura-se, segundo propores variveis, a substncia que se pretende ensaiar e uma
substncia combustvel previamente definida. Depois forma-se uma pilha com cada mistura e procede-se
ignio dessa pilha numa das suas extremidades. A velocidade mxima de combusto determinada ento
comparada com a velocidade mxima de combusto da mistura de referncia.
Se necessrio, vlido qualquer mtodo de triturao e de mistura desde que a diferena entre as velocidades
mximas de combusto em seis ensaios separados no se afastem do valor correspondente mdia aritmtica
em mais do que 10 %.
1.6.1. Preparao
1.6.1.1. Substncia de ensaio
Reduz-se a amostra de ensaio a partculas com dimenses < 0,125 mm utilizando o procedimento seguinte:
peneira-se a substncia de ensaio, tritura-se a parte restante e repete-se o procedimento at toda a substncia de
ensaio passar pelo peneiro.
Pode-se utilizar qualquer mtodo de triturao e de crivagem que satisfaam os critrios qualitativos.
Antes da preparao da mistura seca-se a substncia temperatura de 105
o
C, at se obter um peso constante.
No caso de a temperatura de decomposio da substncia de ensaio ser inferior a 105
o
C, torna-se necessrio
secar a substncia a uma temperatura inferior adequada.
1.6.1.2. Substncia combustvel
Utiliza-se p de celulose como substncia combustvel. A celulose dever ser do tipo utilizado para a
cromatografia de camada fina ou para a cromatografia em coluna. Verificou-se que adequada a celulose em
que 85 % das fibras possui um comprimento compreendido entre 0,020 e 0,075 mm. Faz-se passar o p de
celulose atravs de um peneiro de malha de 0,125 mm. Em todo o ensaio deve-se utilizar o mesmo lote de
celulose.
Antes de se preparar a mistura efectua-se a secagem do p de celulose temperatura de 105
o
C at se obter um
peso constante.
No caso de se utilizar serradura no ensaio preliminar faz-se a preparao dessa serradura de madeira macia
recolhendo a poro que passa atravs de um peneiro de malha de 1,6 mm, mistura-se muito bem e depois
seca-se temperatura de 105
o
C durante 4 horas numa camada com espessura inferior a 25 mm. Arrefece-se e
armazena-se num recipiente estanque ao ar, to cheio quanto for possvel, de preferncia ao fim de 24 horas de
secagem.
1.6.1.3. Fonte de ignio
Como fonte de ignio deve utilizar-se uma chama de um queimador de gs (com dimetro mnimo de 5mm).
No caso de se utilizar outra fonte de ignio (por exemplo, quando se efectua o ensaio em atmosfera inerte),
dever constar do relatrio uma descrio e a justificao.
Nota:
As misturas de oxidantes com celulose ou com serradura devem ser tratadas como potencialmente explosivas e
manuseadas com as devidas precaues.
1.6.2.1. Ensaio preliminar
Mistura-se muito bem a substncia seca com a celulose ou com a serradura seca na proporo em peso de duas
partes da substncia de ensaio para uma parte de celulose ou de serradura e com essa mistura prepara-se uma
pequena pilha com a configurao de um cone com as dimenses de 3,5 cm (dimetro da base) 2,5 cm
(altura) enchendo, sem bater, uma forma com a configurao do cone (por exemplo, um funil de vidro de
laboratrio com o bico tapado).
Coloca-se essa pilha sobre uma placa fria, no combustvel, no porosa e de fraca condutividade trmica. O
ensaio deve ser efectuado num aparador com exausto de fumos tal como em 1.6.2.2.
Coloca-se a fonte de ignio em contacto com o cone. Observa-se e regista-se o vigor e a durao da reaco
resultante.
Considera-se que a substncia um oxidante se a reaco for vigorosa.
Em qualquer caso em que o resultado suscite dvidas necessrio completar depois a sequncia de ensaio
adiante descrita.
1.6.2.2. Sequncia de ensaio
Procede-se preparao de misturas oxidante/celulose contendo oxidante em propores compreendidas entre
10 % e 90 % em peso, por acrescimentos sucessivos de 10 %. Nos casos limite, deve utilizar-se misturas
intermdias de oxidante/celulose para se obter com maior preciso a velocidade mxima de combusto.
A configurao da pilha conseguida por meio de um molde. Esse molde feito de metal, tem um
comprimento de 250 mm e uma seco recta transversal com uma altura interior de 10 mm e com uma
largura interior de 20 mm. De ambos os lados do molde, segundo a direco longitudinal, faz-se a montagem
de duas placas metlicas que constituem limitaes laterais que ultrapassam 2 mm a aresta superior da seco
recta triangular (ver figura). Enche-se livremente este dispositivo com um ligeiro excesso de mistura. Depois de
se deixar cair o molde uma vez, de uma altura de 2 cm sobre uma superfcie slida, remove-se a substncia em
excesso remanescente com uma folha colocada em posio oblqua, procede-se remoo das limitaes
laterais e alisa-se o p restante utilizando um cilindro. Depois coloca-se sobre o molde uma placa no
combustvel, no porosa e de fraca condutibilidade trmica, inverte-se o aparelho e remove-se o molde.
Coloca-se a placa sob o exaustor de um aparador com exausto de fumos.
A velocidade do ar dever ser suficiente para evitar que os fumos escapem para o interior do laboratrio e no
dever variar durante o ensaio. Em torno do aparelho dever instalar-se uma blindagem auxiliar da exausto.
Devido s propriedades higroscpicas da celulose e de algumas substncias que se pretendem ensaiar o teste
dever ser efectuado to rapidamente quanto possvel.
Inflama-se uma extremidade da pilha por contacto com a chama.
Mede-se o tempo de reaco para uma distncia de 200 mm aps a zona de reaco se ter propagado, segundo
uma distncia inicial de 30 mm.
Efectua-se o ensaio com a substncia de referncia e pelo menos com cada uma das misturas de substncia de
ensaio com celulose, no intervalo definido.
No caso de se verificar que a velocidade mxima de combusto significativamente superior da mistura de
referncia, pode-se interromper o ensaio; caso contrrio, deve-se repetir o ensaio cinco vezes para cada uma das
trs misturas que proporcionam a velocidade de combusto mais rpida.
No caso de se suspeitar que o resultado falsamente positivo, deve-se repetir o ensaio utilizando uma
substncia inerte com partculas de dimenses idnticas, tal como a diatomite, em vez de celulose. Em
alternativa deve-se ensaiar novamente a mistura de substncia de ensaio/celulose que possui a velocidade de
combusto mais rpida em atmosfera inerte (teor em oxignio < 2 % v/v).
2. RESULTADOS
Por razes de segurana deve-se considerar a velocidade mxima de combusto em vez do valor mdio
como sendo a propriedade oxidante caracterstica da substncia de ensaio.
Para a avaliao relevante o valor mximo da velocidade de combusto obtido numa srie de seis ensaios para
uma determinada mistura.
Traa-se um grfico do valor mximo da velocidade de combusto para cada mistura em funo da
concentrao do oxidante. A partir de grfico conclui-se sobre a velocidade mxima de combusto.
Os seis valores de velocidade de combusto medidos numa experincia efectuada com a mistura de mxima
velocidade de combusto no devem diferir do valor da mdia aritmtica em mais do que 10 %; caso contrrio,
devem aperfeioar-se os mtodos de triturao e de mistura.
A velocidade mxima de combusto obtida comparada com a velocidade mxima de combusto da mistura
de referncia (ver 1.3.).
Se os ensaios forem efectuados em atmosfera inerte, compara-se a velocidade mxima de reaco com a que se
obtm com a mistura de referncia em atmosfera inerte.
3. RELATRIO
identidade, composio, pureza, teor em humidade, etc., da substncia ensaiada,
qualquer tratamento da substncia de ensaio (por exemplo, triturao, secagem, etc.),
a fonte de ignio utilizada nos ensaios,
os resultados das medies,
o modo de reaco (por exemplo, combusto com chama superfcie, combusto atravs de toda a
massa, qualquer informao relativa aos produtos de combusto, etc.),
todas as observaes adicionais relevantes para a interpretao dos resultados, incluindo uma descrio
do vigor (chamas, fascas, fumos, combusto lenta, etc.) e durao aproximada observados no ensaio
preliminar sobre segurana/pesquisa, tanto para a substncia de ensaio como para a substncia de
referncia,
os resultados dos ensaios com uma substncia inerte, se existirem,
os resultados dos ensaios em atmosfera inerte, se existirem.
Considera-se que uma substncia um oxidante nos casos em que:
a) No ensaio preliminar se observa uma reaco vigorosa;
b) No ensaio completo, a velocidade mxima de combusto das misturas ensaiadas superior ou igual
velocidade mxima de combusto da mistura de referncia constituda por celulose e nitrato de brio.
No sentido de se evitar um resultado positivo falso, os resultados obtidos ao fazer-se o ensaio da substncia
misturada com um material inerte e/ou ao fazer-se o ensaio sob atmosfera inerte devero ser considerados
tambm ao fazer-se a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
(1) NF T 20-035 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of
solids.
Apndice
Figura
Molde e acessrios para a preparao da pilha
A.18. MASSA MOLECULAR MDIA EM FUNO DO NMERO DE MOLES E DISTRIBUIO DA MASSA
MOLECULAR EM POLMEROS
1. MTODO
O presente mtodo, que utiliza a cromatografia de permeao em gel (GPC), idntico ao mtodo OCDE TG
118 (1996). Os respectivos fundamentos e outras informaes tcnicas so apresentados na referncia (1).
1.1. INTRODUO
Tendo em conta a diversidade das propriedades dos biopolmeros, torna-se impossvel descrever um nico
mtodo que estabelea de modo preciso as condies de separao e avaliao dos mesmos, abrangendo todas
as possibilidades e especificidades. Muitos sistemas polimricos complexos, nomeadamente, no so analisveis
por cromatografia de permeao em gel. Nos casos em que o recurso a esta tcnica no se afigure vivel, a
massa molecular pode ser determinada atravs de outros mtodos (ver apndice), devendo documentar-se e
justificar-se a opo utilizada.
O mtodo descrito baseia-se na norma DIN 55672 (1); esta ltima contm informaes pormenorizadas sobre
o modo de execuo do ensaio e a avaliao dos respectivos resultados. Caso seja necessrio alterar
determinadas condies do processo experimental, deve apresentar-se a devida justificao. Podem utilizar-se
outras normas, na condio de apresentar as respectivas referncias. O mtodo descrito utiliza, para fins de
calibrao, amostras de poliestireno de polidispersibilidade conhecida, podendo ser necessrio efectuar
alteraes de modo a torn-lo adequado a determinados polmeros, nomeadamente polmeros hidrossolveis e
polmeros reticulados de cadeia longa.
A massa molecular mdia em funo do nmero de moles, M
n
, e a massa molecular mdia relativa massa das
espcies, M
w
, so determinadas por recurso s equaes:
M
n =
n
i = 1
H
i
n
i = 1
H
i
=M
i
M
w =
n
i = 1
H
i
M
i
n
i = 1
H
i
em que:
H
i
a intensidade do sinal do detector correspondente ao volume de reteno V
i
, contado a partir da linha de
base,
M
i
a massa molecular da fraco do polmero correspondente ao volume de reteno V
i
e
n o nmero de pontos obtidos experimentalmente.
A amplitude da distribuio de massas moleculares, que constitui uma medida da dispersibilidade do sistema,
dada pelo quociente M
w
/M
n
Uma vez que a cromatografia de permeao em gel constitui um mtodo relativo, deve efectuar-se uma
calibrao. Para tal, podem utilizar-se padres de poliestireno de cadeia linear, com uma distribuio limitada, e
massas moleculares mdias (M
n
e M
w
) e distribuio de massas moleculares conhecidas. A curva de calibrao
apenas pode ser utilizada na determinao da massa molecular da amostra desconhecida caso as condies de
separao da referida amostra e dos padres tenham sido seleccionadas de modo idntico.
Uma determinada relao entre a massa molecular e o volume de eluio apenas vlida nas condies
especficas de cada ensaio. Estas ltimas incluem, nomeadamente, a temperatura, o tipo de solvente (ou mistura
de solventes), as condies cromatogrficas e a coluna ou sistema de colunas de separao.
As massas moleculares da amostra determinadas pelo mtodo em causa constituem valores relativos, sendo
designadas massas moleculares em equivalentes de poliestireno. Tal facto significa que as massas moleculares
podem apresentar desvios relativamente aos valores absolutos em funo das diferenas estruturais e qumicas
entre a amostra e os padres. Caso se utilizem outros padres, nomeadamente polietilenoglicol, xido de
polietileno, metracrilato de polimetilo ou cido poliacrlico, devem justificar-se os motivos.
A determinao da distribuio das massas moleculares, bem como das massas moleculares mdias da amostra
(M
n
, M
w
), pode fazer-se por recurso cromatografia de permeao em gel, que consiste numa variante da
cromatografia lquida em que a amostra separada em funo dos volumes hidrodinmicos dos diversos
componentes (2).
A separao efectuada por passagem atravs de uma coluna cujo enchimento consiste num material poroso,
de modo geral um gel orgnico. As molculas de dimenses mais reduzidas passam atravs dos poros, sendo as
restantes excludas. A fixao das molculas de maiores dimenses , pois, menor, sendo eludas em primeiro
lugar. As molculas de dimenses mdias passam atravs de alguns poros, sendo eludas numa fase posterior.
Finalmente, as molculas de dimenses mais reduzidas, que possuem um raio hidrodinmico inferior ao dos
poros do gel, penetram estes ltimos, sendo eludas em ltimo lugar.
Em condies ideais, a separao determinada apenas pelas dimenses das molculas, embora, na prtica, seja
difcil evitar algumas interferncias devidas adsoro. A no uniformidade do enchimento e a existncia de
volumes mortos podero induzir problemas complementares (2).
A deteco pode ser efectuada com base no ndice de refraco ou por absoro no ultravioleta, originando
uma curva de distribuio simples. Todavia, de modo a atribuir valores de massa molecular aos vrios pontos
da curva, necessrio efectuar uma calibrao por recurso a polmeros de massa molecular conhecida e, se
possvel, de estrutura similar, nomeadamente padres de poliestireno. A curva resultante da representao
grfica da quantidade, em massa, das diversas espcies eludas em funo do logaritmo da massa molecular
deve exibir uma distribuio de Gauss, por vezes distorcida por uma ligeira assimetria na regio das massas
moleculares mais reduzidas.
A repetibilidade (desvio-padro relativo) do volume de eluio deve ser superior a 0,3 %. Se um cromatograma
elaborado em funo do tempo no corresponder aos critrios supra, deve assegurar-se a necessria
repetibilidade da anlise mediante correco por recurso a um padro interno (1). As polidisperses dependem
da massa molecular de cada padro. No caso da utilizao de padres de poliestireno, os valores caractersticos
so os seguintes:
M
p
< 2 000 M
w
/M
n
< 1,20
2 000 M
p
10
6
M
w
/M
n
< 1,05
M
p
> 10
6
M
w
/M
n
< 1,20
em que M
p
representa a massa molecular do padro correspondente ao mximo do pico.
1.6.1. Preparao das solues-padro de poliestireno
Os padres de poliestireno so dissolvidos, com agitao, no eluente escolhido. Na preparao das solues
devem ter-se em conta as recomendaes do fabricante.
As concentraes dos padres dependem de vrios factores, nomeadamente o volume de injeco, a
viscosidade da soluo e a sensibilidade do detector. Deve adaptar-se o volume de injeco mximo ao
comprimento da coluna, de modo a evitar uma sobrecarga. Os volumes de injeco caractersticos de
separaes analticas por cromatografia de permeao em gel com uma coluna de 30 cm 7,8 mm situam-se,
de modo geral, entre 40 e 100 l. possvel injectar volumes superiores, que no devem, contudo, exceder
250 l. Antes de calibrar a coluna, deve determinar-se o rcio adequado volume de injeco/concentrao.
1.6.2. Preparao da soluo de amostra
De modo geral, as condies atrs referidas so tambm aplicveis preparao das solues de amostra. Esta
ltima dissolvida num solvente adequado, nomeadamente tetra-hidrofurano (THF), sob agitao cuidadosa.
Em caso algum dever utilizar-se um banho de ultra-sons. Se necessrio, a soluo de amostra pode ser
purificada por passagem atravs de um filtro de membrana, cujos poros devero ter dimenses compreendidas
entre 0,2 e 2 m.
Deve referir-se no relatrio final a eventual presena de partculas no dissolvidas, que podero conter espcies
de massa molecular superior. Deve utilizar-se um mtodo adequado para determinar a percentagem ponderal
das partculas em causa. As solues devem ser utilizadas nas 24 horas subsequentes sua preparao.
1.6.3. Equipamento
Reservatrio de solvente,
desgaseificador (se adequado),
bomba,
amortecedor de pulsaes (se adequado),
sistema de injeco,
colunas cromatogrficas,
detector,
medidor de caudal (se adequado),
sistema de registo e processamento de dados,
recipiente para resduos.
Deve assegurar-se o carcter inerte do sistema cromatogrfico em relao aos solventes utilizados
(nomeadamente no caso da utilizao de capilares de ao com THF).
1.6.4. Sistema de injeco e de aporte de solvente
Introduz-se na coluna um determinado volume de soluo de amostra, manualmente ou por intermdio de um
amostrador automtico, numa zona bem definida. No caso da introduo manual, a compresso do mbolo ou
a retirada da seringa demasiado rpidas podero determinar alteraes na distribuio de massas moleculares
obtida. O sistema de aporte de solvente deve ser uniforme, recorrendo, se possvel, a um amortecedor de
pulsaes. O caudal deve ser da ordem de 1 ml/min.
1.6.5. Coluna
Em funo do tipo de amostra, os polmeros so analisados por recurso a uma nica coluna ou a diversas
colunas ligadas em srie. Encontram-se disponveis nos circuitos comerciais colunas de materiais porosos com
propriedades (por exemplo, dimenses dos poros, limites de excluso) bem definidas. A seleco do gel a
utilizar, bem como do comprimento da coluna, depende das propriedades da amostra (volumes
hidrodinmicos, distribuio das massas moleculares) e das condies especficas de separao, nomeadamente
o tipo de solvente utilizado, a temperatura e o caudal (l) (2) (3).
1.6.6. Pratos tericos
Deve caracterizar-se a coluna ou sistema de colunas a utilizar na separao pelo respectivo nmero de pratos
tericos. No caso da utilizao de THF como solvente de eluio, introduzir uma soluo de etilbenzeno ou
outro soluto apolar adequado numa coluna de comprimento conhecido. O nmero de pratos tericos dado
pela equao:
N= 5,54
V
e
W
1=2
_ _
2
ou N= 16
V
e
W
_ _
2
em que:
N = representa o nmero de pratos tericos,
V
e
= representa o volume de eluio correspondente ao mximo do pico,
W = representa a largura da base do pico,
W
1/2
= representa a largura do pico a meia altura.
1.6.7. Eficincia de separao
Alm do nmero de pratos tericos, que determina a largura das bandas, a eficincia de separao, obtida a
partir do declive da curva de calibrao, desempenha tambm um papel importante. A eficincia de separao
de uma coluna dada por:
V
e,Mx
V
e,10M
x
seco transversal da coluna

6,0
cm
3
cm
2
_ _
em que:
V
e, Mx
= representa o volume de eluio de uma fraco de poliestireno com massa molecular M
x
e
V
e,(10Mxx)
= representa o volume de eluio de uma fraco de poliestireno com massa molecular dez vezes
superior.
A resoluo do sistema geralmente definida do seguinte modo:
R
1,2 = 2
V
e1
V
e2
W
1
W
2
1
log
10
M
2
=M
1

em que:
V
e1
, V
e2
= representam os volumes de eluio dos dois padres de poliestireno, correspondentes ao mximo
dos picos,
W
1
, W
2
= representam a largura da base dos picos, e
M
1
, M
2
= representam as massas moleculares correspondentes aos mximos dos picos, devendo diferir num
factor de 10.
O valor R do sistema de colunas deve ser superior a 1,7 (4).
1.6.8. Solventes
Todos os solventes devem possuir um elevado grau de pureza (no caso do THF, o grau de pureza deve ser de
99,5 %). As dimenses do reservatrio de solvente (que pode, se necessrio, encontrar-se sob atmosfera inerte)
devem ser suficientes para permitir a calibrao da coluna e a realizao de diversas anlises. O solvente deve
ser desgaseificado antes da sua introduo na coluna por intermdio da bomba.
1.6.9. Controlo da temperatura
A temperatura dos componentes crticos internos (septo de injeco, colunas, detector, tubagens) deve ser
constante e adequada ao solvente escolhido.
1.6.10. Detector
A funo do detector consiste no registo quantitativo da concentrao da amostra eluda da coluna. De modo a
evitar o alargamento dos picos, o volume da clula de deteco deve ser to reduzido quanto possvel, no
devendo exceder 10 l, excepto no caso dos detectores de difuso de radiaes e de viscosidade. O mtodo de
deteco mais corrente consiste na refractometria diferencial. Todavia, se as propriedades especficas da amostra
ou do solvente de eluio o justificarem, podem utilizar-se outros tipos de detectores, nomeadamente de
radiao ultravioleta/visvel, infravermelha e detectores de viscosidade.
2. RESULTADOS E SUA APRESENTAO
2.1. RESULTADOS
Para pormenores sobre os critrios de avaliao, bem como no que respeita s exigncias em matria de recolha
e processamento de dados, deve consultar-se a norma DIN relevante (1).
Devem efectuar-se duas anlises independentes e individuais de cada amostra.
Em cada anlise, devem determinar-se os parmetros M
n
, M
w
, M
w
/M
n
e M
p
. Deve indicar-se explicitamente que
os valores determinados constituem valores relativos equivalentes massa molecular do padro utilizado.
Aps a determinao dos volumes de reteno ou tempos de reteno (eventualmente corrigidos por recurso a
um padro interno), representa-se graficamente o logaritmo de M
p
(valor correspondente ao mximo do pico
relativo ao padro de calibrao) em funo de um dos parmetros referidos. So necessrios pelo menos dois
pontos de calibrao por dcada de massas moleculares e pelo menos cinco pontos para a curva total, que deve
abranger a massa molecular estimada da amostra. A extremidade da curva de calibrao correspondente s
massas moleculares mais reduzidas definida pelo n-hexilbenzeno ou outro solvente apolar adequado. As
massas moleculares relativas ao nmero de moles e massa das espcies so, em geral, obtidas por
processamento electrnico dos dados, com base nas frmulas que se apresentam no ponto 1.2. Caso se recorra
ao tratamento manual dos mesmos, pode consultar-se a norma ASTM D 3536-91 (3).
Deve apresentar-se a distribuio na forma de quadro ou de grfico (percentagem da soma ou do diferencial da
frequncia em funo de log M). Na representao grfica, uma dcada de massas moleculares deve
corresponder a cerca de 4 cm, devendo a altura mxima dos picos ser de cerca de 8 cm. No caso de curvas de
distribuio integral, a diferena entre 0 e 100 % deve corresponder a cerca de 10 cm.
2.2. RELATRIO
O relatrio do ensaio deve incluir as seguintes informaes:
2.2.1. Substncia em estudo
Dados disponveis sobre a substncia em estudo (identidade, aditivos, impurezas),
descrio do tratamento da amostra, observaes, problemas surgidos.
2.2.2. Equipamento
Reservatrio de eluente, gs inerte, desgaseificao do eluente, composio do eluente, impurezas,
bomba, amortecedor de pulsaes, sistema de injeco,
colunas de separao (fabricante, todas as informaes disponveis sobre as caractersticas das colunas,
nomeadamente dimenses dos poros, tipo de material utilizado, nmero, comprimento e ordem de
utilizao das colunas),
nmero de pratos tericos da coluna ou sistema de colunas; eficincia de separao (resoluo do
sistema),
informaes relativas simetria dos picos,
temperatura da coluna, tipo de controlo da temperatura utilizado,
detector (princpio utilizado, tipo, volume da clula),
medidor de caudal, se utilizado (fabricante, princpio utilizado),
sistema de registo e processamento dos dados (equipamento e suporte lgico).
2.2.3. Calibrao do sistema
Descrio pormenorizada do mtodo utilizado para obter a curva de calibrao,
informaes relativas aos critrios de qualidade aplicveis ao mtodo (por exemplo, coeficiente de
correlao, erro quadrtico mdio, etc.),
informaes relativas s extrapolaes, hipteses e aproximaes efectuadas no decurso do processo
experimental, bem como da avaliao e processamento dos dados,
devem apresentar-se na forma de quadro os dados utilizados para a obteno da curva de calibrao,
incluindo, para cada ponto de calibrao, as seguintes informaes:
nome da amostra,
fabricante da amostra,
valores de M
p
, M
n
, M
w
, M
w
/M
n
caractersticos dos padres, fornecidos pelo fabricante ou obtidos
em determinaes posteriores, bem como pormenores sobre o mtodo de determinao utilizado,
volume de injeco e concentrao da substncia injectada,
valor de M
p
utilizado para a calibrao,
volume de eluio ou tempo de reteno corrigido correspondentes ao mximo dos picos,
valores de M
p
correspondentes ao mximo dos picos,
percentagem de erro dos valores de M
p
calculados e do valor de calibrao.
2.2.4. Avaliao
Avaliao com base no tempo: mtodos utilizados para assegurar a reprodutibilidade requerida (mtodo
de correco, padro interno, etc.),
informaes que indiquem se a avaliao foi efectuada com base no volume de eluio ou no tempo de
reteno,
informaes sobre os limites de avaliao, caso um pico no seja totalmente analisado,
descrio dos eventuais mtodos de nivelamento de dados utilizados,
processos de preparao e tratamento prvio da amostra,
eventual presena de partculas no dissolvidas,
volume de injeco (expresso em l) e concentrao de injeco (expressa em mg/ml),
observaes que indiquem efeitos susceptveis de induzir desvios relativamente s condies
cromatogrficas ideais,
descrio pormenorizada das alteraes aos procedimentos de ensaio,
pormenores relativos s margens de erro,
quaisquer outras informaes e observaes que possuam importncia para a interpretao dos
resultados.
3. REFERNCIAS
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel,
Teil 1.
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J.
Wiley and Sons.
(3) ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight
Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American
Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for
Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
Apndice
Exemplos de outros mtodos de determinao da massa molecular mdia em funo do nmero de moles (M
n
) em
polmeros
A cromatografia de permeao em gel constitui o mtodo mais indicado para a determinao de M
n
, em especial sempre que
se encontre disponvel uma srie de padres com estrutura idntica do polmero a analisar. Todavia, nos casos em que o
recurso quela tcnica apresente dificuldades prticas ou em que se preveja que a substncia em causa no satisfaz um
critrio regulamentar em matria de M
n
, sendo necessrio confirmar tal facto podem aplicar-se mtodos alternativos,
nomeadamente:
1. Utilizao das propriedades coligativas
1.1. Ebulioscopia/crioscopia:
estas tcnicas baseiam-se, respectivamente, na determinao do aumento do ponto de ebulio e do
abaixamento do ponto de congelao de um solvente induzidos pela adio do polmero. O princpio do
mtodo consiste no facto de os efeitos do polmero dissolvido no ponto de ebulio ou de congelao do
solvente dependerem da massa molecular do polmero (1) (2).
Aplicabilidade: M
n
< 20 000
1.2. Abaixamento da presso de vapor:
esta tcnica baseia-se na medio da presso de vapor de um lquido de referncia antes e aps a adio de
determinadas quantidades do polmero (1) (2).
Aplicabilidade: M
n
< 20 000 (em teoria; na prtica, o valor limitado).
1.3. Osmometria de membrana:
esta tcnica baseia-se no princpio da osmose, isto , da tendncia natural das molculas de solvente de
passarem, atravs de uma membrana semipermevel, de uma soluo diluda para uma soluo concentrada,
at atingir o equilbrio. No ensaio em causa, a concentrao da soluo diluda nula, enquanto que a soluo
concentrada contm o polmero. A passagem do solvente atravs da membrana determina uma diferena de
presso dependente da concentrao e da massa molecular do polmero (1) (3) (4).
Aplicabilidade: valores de M
n
compreendidos entre 20 000 e 200 000.
1.4. Osmometria de fase de vapor:
esta tcnica baseia-se na comparao da velocidade de evaporao de um aerossol de solvente puro com a
velocidade de evaporao de, no mnimo, trs aerossis que contm o polmero em concentraes diversas (1)
(5) (6).
Aplicabilidade: M
n
< 20 000
2. Anlise dos grupos terminais
A utilizao deste mtodo implica o conhecimento simultneo da estrutura global do polmero e da natureza
dos grupos terminais, distinguveis da cadeia principal por recurso a tcnicas tais como a ressonncia
magntica nuclear, a titulao ou a formao de derivados. Com base na determinao da concentrao
molecular dos grupos terminais presentes no polmero, pode obter-se a respectiva massa molecular (7) (8) (9).
Aplicabilidade: M
n
no superior a 50 000 (com fiabilidade decrescente).
3. Referncias
(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymeer Science, 3rd ed., John Wiley, New York.
(2) Glover, CA., (1975), Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4 In: Polymer Molecular Weights,
Part I, P.E., Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.
(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of
Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia,
Pennsylvania.
(4) Coll, H. (1989), Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper e., J. Wiley
and Sons, p. 25-52.
(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by
Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R.
Cooper ed., John Wiley and Sons.
(7) Schrder, E. Muller, G., and Arndt, K-F, (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.
(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E.
Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.
(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.
A.19. TEOR EM POLMEROS DE BAIXA MASSA MOLECULAR
1. MTODO
O presente mtodo, que utiliza a cromatografia de permeao em gel, idntico ao mtodo OCDE TG 119
(1996). Os respectivos fundamentos e outras informaes tcnicas so apresentados nas referncias.
1.1. INTRODUO
Tendo em conta a diversidade das propriedades dos biopolmeros, torna-se impossvel descrever um nico
mtodo que estabelea de modo preciso as condies de separao e avaliao dos mesmos, abrangendo todas
as possibilidades e especificidades. Muitos sistemas polimricos complexos, nomeadamente, no so analisveis
por cromatografia de permeao em gel (GPC). Nos casos em que o recurso a esta tcnica no se afigure vivel,
a massa molecular pode ser determinada atravs de outros mtodos (ver apndice), devendo documentar-se e
justificar-se a opo utilizada.
O mtodo descrito baseia-se na norma DIN 55672 (1); esta ltima contm informaes pormenorizadas sobre
o modo de execuo do ensaio e a avaliao dos respectivos resultados. Caso seja necessrio alterar
determinadas condies do processo experimental, deve apresentar-se a devida justificao. Podem utilizar-se
outras normas, na condio de apresentar as respectivas referncias. O mtodo descrito utiliza, para fins de
calibrao, amostras de poliestireno de polidispersibilidade conhecida, podendo ser necessrio efectuar
alteraes de modo a torn-lo adequado a determinados polmeros, nomeadamente polmeros hidrossolveis e
polmeros reticulados de cadeia longa.
Por conveno, considera-se baixa uma massa molecular inferior a 1 000 dalton.
A massa molecular mdia em funo do nmero de moles, M
n
, e a massa molecular mdia relativa massa das
espcies, M
w
, so determinadas por recurso s equaes:
M
n =
n
i = 1
H
i
n
i = 1
H
i
=M
i
M
w =
n
i = 1
H
i
M
i
n
i = 1
H
i
em que:
H
i
= a intensidade do sinal do detector correspondente ao volume de reteno V
j
, contado a partir da linha
de base,
M
i
= a massa molecular da fraco do polmero correspondente ao volume de reteno V
i
, e n o nmero
de pontos obtidos experimentalmente.
A amplitude da distribuio de massas moleculares, que constitui uma medida da dispersibilidade do sistema,
dada pelo quociente M
w
/M
n
.
Uma vez que a cromatografia de permeao em gel constitui um mtodo relativo deve efectuar-se uma
calibrao. Para tal, podem utilizar-se padres de poliestireno de cadeia linear, com uma distribuio limitada, e
massas moleculares mdias (M
n
e M
w
) e distribuio de massas moleculares conhecidas. A curva de calibrao
apenas pode ser utilizada na determinao da massa molecular da amostra desconhecida caso as condies de
separao da referida amostra e dos padres tenham sido seleccionadas de modo idntico.
Uma determinada relao entre a massa molecular e o volume de eluio apenas vlida nas condies
especficas de cada ensaio. Estas ltimas incluem, nomeadamente, a temperatura, o tipo de solvente (ou mistura
de solventes), as condies cromatogrficas e a coluna ou sistema de colunas de separao.
As massas moleculares da amostra determinadas pelo mtodo em causa constituem valores relativos, sendo
designadas massas moleculares em equivalentes de poliestireno. Tal facto significa que as massas moleculares
podem apresentar desvios relativamente aos valores absolutos em funo das diferenas estruturais e qumicas
entre a amostra e os padres. Caso se utilizem outros padres, nomeadamente polietilenoglicol, xido de
polietileno, metracrilato de polimetilo ou cido poliacrlico, devem justificar-se os motivos.
A determinao da distribuio das massas moleculares, bem como das massas moleculares mdias da amostra
(M
n
M
w
), pode fazer-se por recurso cromatografia de permeao em gel, que consiste numa variante da
cromatografia lquida em que a amostra separada em funo dos volumes hidrodinmicos dos diversos
componentes (2).
A separao efectuada por passagem atravs de uma coluna cujo enchimento consiste num material poroso,
de modo geral um gel orgnico. As molculas de dimenses mais reduzidas passam atravs dos poros, sendo as
restantes excludas. A fixao das molculas de maiores dimenses , pois, menor, sendo eludas em primeiro
lugar. As molculas de dimenses mdias passam atravs de alguns poros, sendo eludas numa fase posterior.
Finalmente, as molculas de dimenses mais reduzidas, que possuem um raio hidrodinmico inferior ao dos
poros do gel, penetram estes ltimos, sendo eludas em ltimo lugar.
Em condies ideais, a separao determinada apenas pelas dimenses das molculas, embora, na prtica, seja
difcil evitar algumas interferncias devidas absoro. A no uniformidade do enchimento e a existncia de
volumes mortos podero induzir problemas complementares (2).
A deteco pode ser efectuada com base no ndice de refraco ou por absoro no ultravioleta, originando
uma curva de distribuio simples. Todavia, de modo a atribuir valores de massa molecular aos vrios pontos
da curva, necessrio efectuar uma calibrao por recurso a polmeros de massa molecular conhecida e, se
possvel, de estrutura similar, nomeadamente padres de poliestireno. A curva resultante da representao
grfica da quantidade, expressa em massa, das diversas espcies eludas em funo do logaritmo da massa
molecular deve exibir uma distribuio de Gauss, por vezes distorcida por uma ligeira assimetria na regio das
massas moleculares mais reduzidas.
O teor de espcies de baixa massa molecular determinado a partir da curva. O respectivo clculo preciso
depende da reproduo do comportamento do polmero por parte das referidas espcies, por unidade de
massa.
A repetibilidade (desvio-padro relativo) do volume de eluio deve ser superior a 0,3 %. Se um cromatograma
elaborado em funo do tempo no corresponder aos critrios supra deve assegurar-se a necessria
repetibilidade da anlise mediante correco por recurso a um padro interno (1). As polidisperses dependem
da massa molecular de cada padro. No caso da utilizao de padres de poliestireno, os valores caractersticos
so os seguintes:
M
p
< 2 000 M
w
/M
n
< 1,20
2 000 M
p
10
6
M
w
/M
n
< 1,05
M
p
> 10
6
M
w
/M
n
< 1,20
(M
p
representa a massa molecular do padro correspondente ao mximo do pico).
1.6.1. Preparao das solues-padro de poliestireno
Os padres de poliestireno so dissolvidos, com agitao, no eluente escolhido, tendo em conta as
recomendaes do fabricante.
As concentraes dos padres dependem de vrios factores, nomeadamente o volume de injeco, a
viscosidade da soluo e a sensibilidade do detector. Deve adaptar-se o volume de injeco mximo ao
comprimento da coluna, de modo a evitar uma sobrecarga. Os volumes de injeco caractersticos de
separaes analticas por cromatografia de permeao em gel com uma coluna de 30 cm 7,8 mm situam-se,
de modo geral, entre 40 e 100 l. possvel injectar volumes superiores, que no devem, contudo, exceder
250 l. Antes de calibrar a coluna, deve determinar-se o rcio adequado volume de injeco/concentrao.
1.6.2. Preparao da soluo de amostra
De modo geral, as condies atrs referidas so tambm aplicveis preparao das solues de amostra. Esta
ltima dissolvida num solvente adequado, nomeadamente tetra-hidrofurano (THF), sob agitao cuidadosa.
Em caso algum dever utilizar-se um banho de ultra-sons. Se necessrio, a soluo de amostra pode ser
purificada por passagem atravs de um filtro de membrana, cujos poros devero ter dimenses compreendidas
entre 0,2 e 2 m.
Deve referir-se no relatrio final a eventual presena de partculas no dissolvidas, que podero conter espcies
de massa molecular superior. Deve utilizar-se um mtodo adequado para determinar a percentagem ponderal
das partculas em causa. As solues devem ser utilizadas nas 24 horas subsequentes sua preparao.
1.6.3. Correces determinadas pela presena de impurezas e aditivos
No que respeita ao teor de espcies com M < 1 000, torna-se geralmente necessrio introduzir uma correco
destinada a ter em conta a presena de componentes especficos no polimricos (nomeadamente impurezas e
aditivos), excepto no caso de o teor determinado ser inferior a 1 %. A referida correco pode ser efectuada por
anlise directa da soluo de polmero ou da soluo obtida aps a eluio cromatogrfica.
Se a soluo obtida por eluio cromatogrfica for demasiado diluda para permitir a anlise, dever ser
concentrada, podendo ser necessrio evapor-la secura, redissolvendo o resduo. A concentrao deve ser
efectuada em condies que assegurem a no concorrncia de alteraes na soluo eluda. O tratamento desta
depende do mtodo analtico utilizado para a anlise quantitativa.
1.6.4. Equipamento
O equipamento de cromatografia de permeao em gel inclui os seguintes componentes:
reservatrio de solvente,
desgaseificador (se adequado),
bomba,
amortecedor de pulsaes (se adequado),
sistema de injeco,
colunas cromatogrficas,
detector,
medidor de caudal (se adequado),
sistema de registo e processamento de dados,
recipiente para resduos.
Deve assegurar-se o carcter inerte do sistema cromatogrfico em relao aos solventes utilizados
(nomeadamente no caso da utilizao de capilares de ao com THF).
1.6.5. Sistema de injeco e de aporte de solvente
Introduz-se na coluna um determinado volume de soluo de amostra, manualmente ou por intermdio de um
amostrador automtico, numa zona bem definida. No caso da introduo manual, a compresso do mbolo ou
a retirada da seringa demasiado rpidas podero determinar alteraes na distribuio de massas moleculares
obtida. O sistema de aporte de solvente deve ser uniforme, recorrendo, se possvel, a um amortecedor de
pulsaes. O caudal deve ser da ordem de 1 ml/min.
1.6.6. Coluna
Em funo do tipo de amostra, os polmeros so analisados por recurso a uma nica coluna ou a diversas
colunas ligadas em srie. Encontram-se disponveis nos circuitos comerciais colunas de materiais porosos com
propriedades (por exemplo, dimenses dos poros, limites de excluso) bem definidas. A seleco do gel a
utilizar, bem como do comprimento da coluna, depende das propriedades da amostra (volumes
hidrodinmicos, distribuio das massas moleculares) e das condies especficas de separao, nomeadamente
o tipo de solvente utilizado, a temperatura e o caudal (1) (2) (3).
1.6.7. Pratos tericos
Deve caracterizar-se a coluna ou sistema de colunas a utilizar na separao pelo respectivo nmero de pratos
tericos. No caso da utilizao de THF como solvente de eluio, introduzir uma soluo de etilbenzeno ou
outro soluto apolar adequado numa coluna de comprimento conhecido. O nmero de pratos tericos dado
pela equao:
N= 5,54
V
e
W
1=2
_ _
2
ou N= 16
V
e
W
_ _
2
em que:
N = representa o nmero de pratos tericos,
V
e
= representa o volume de eluio correspondente ao mximo do pico,
W = representa a largura da base do pico,
W
1/2
= representa a largura do pico a meia altura.
1.6.8. Eficincia de separao
Alm do nmero de pratos tericos, que determina a largura das bandas, a eficincia de separao, obtida a
partir do declive da curva de calibrao, desempenha tambm um papel importante. A eficincia de separao
de uma coluna dada por:
V
e,Mx
V
e,10M
x
seco transversal da coluna

6,0
cm
3
cm
2
_ _
em que
V
e, Mx
= representa o volume de eluio de uma fraco de poliestireno com massa molecular M
x
e
V
e,(10Mx)
= representa o volume de eluio de uma fraco de poliestireno com massa molecular dez vezes
superior.
A resoluo do sistema geralmente definida do seguinte modo:
R
1,2 = 2
V
e1
V
e2
W
1
W
2
1
log
10
M
2
=M
1

em que
V
e1
, V
e2
= representam os volumes de eluio dos dois padres de poliestireno, correspondentes ao mximo
dos picos,
W
1
, W
2
= representam a largura da base dos picos, e
M
1
, M
2
= representam as massas moleculares correspondentes aos mximos dos picos, devendo diferir num
factor de 10.
O valor R do sistema de colunas deve ser superior a 1,7 (4).
1.6.9. Solventes
Todos os solventes devem possuir um elevado grau de pureza (no caso do THF, o grau de pureza deve ser de
99,5 %). As dimenses do reservatrio de solvente (que pode, se necessrio, encontrar-se sob atmosfera inerte)
devem ser suficientes para permitir a calibrao da coluna e a realizao de diversas anlises. O solvente deve
ser desgaseificado antes da sua introduo na coluna por intermdio da bomba.
1.6.10. Controlo da temperatura
A temperatura dos componentes crticos internos (septo de injeco, colunas, detector e tubagens) deve ser
constante e adequada ao solvente escolhido.
1.6.11. Detector
A funo do detector consiste no registo quantitativo da concentrao da amostra eluda da coluna. De modo a
evitar o alargamento dos picos, o volume da clula de deteco deve ser to reduzido quanto possvel, no
devendo exceder 10 l, excepto no caso dos detectores de difuso de radiaes e de viscosidade. O mtodo de
deteco mais corrente consiste na refractometria diferencial. Todavia, se as propriedades especficas da amostra
ou do solvente de eluio o justificarem, podem utilizar-se outros tipos de detectores, nomeadamente de
radiao ultravioleta/visvel, infravermelha e detectores de viscosidade.
2.1. RESULTADOS
Para pormenores sobre os critrios de avaliao, bem como no que respeita s exigncias em matria de recolha
e processamento de dados, deve consultar-se a norma DIN relevante (1).
Devem efectuar-se duas anlises independentes e individuais de cada amostra. Em todos os casos, devem
efectuar-se tambm ensaios em branco, em condies idnticas.
Deve indicar-se explicitamente que os valores determinados constituem valores relativos expressos em
equivalentes da massa molecular do padro utilizado.
Aps a determinao dos volumes de reteno ou tempos de reteno (eventualmente corrigidos por recurso a
um padro interno), representa-se graficamente o logaritmo de M
p
(valor correspondente ao mximo do pico
relativo ao padro de calibrao) em funo de um dos parmetros referidos. So necessrios pelo menos dois
pontos de calibrao por dcada de massas moleculares e pelo menos cinco pontos para a curva total, que deve
abranger a massa molecular estimada da amostra. A extremidade da curva de calibrao correspondente s
massas moleculares mais reduzidas definida pelo n-hexilbenzeno ou outro solvente apoiar adequado. A parte
da curva correspondente a massas moleculares inferiores a 1 000 determina-se e se necessrio corrige-se para
aditivos e impurezas. Caso se recorra ao tratamento manual dos mesmos, pode consultar-se a norma ASTM D
3536-91 (3).
Caso fique retido na coluna um polmero insolvel, provvel que a sua massa molecular seja superior massa
molecular da fraco solvel, pelo que a no tomada em conta do mesmo no clculo do teor de espcies de
baixa massa molecular determinar uma sobrestimativa deste ltimo. Apresentam-se em apndice directrizes
para a correco do teor de espcies de baixa massa molecular de polmeros insolveis.
Deve apresentar-se a distribuio na forma de quadro ou de grfico (percentagem da soma ou do diferencial da
frequncia em funo de log M). Na representao grfica, uma dcada de massas moleculares deve
corresponder a cerca de 4 cm, devendo a altura mxima dos picos ser de cerca de 8 cm. No caso de curvas de
distribuio integral, a diferena entre 0 e 100 % deve corresponder a cerca de 10 cm.
2.2. RELATRIO
Dados disponveis sobre a substncia em estudo (identidade, aditivos, impurezas),
descrio do tratamento da amostra, observaes, problemas.
2.2.2. Equipamento
Reservatrio de eluente, gs inerte, desgaseificao do eluente, composio do eluente, impurezas,
bomba, amortecedor de pulsaes, sistema de injeco,
colunas de separao (fabricante, todas as informaes disponveis sobre as caractersticas das colunas,
nomeadamente dimenses dos poros, tipo de material utilizado, nmero, comprimento e ordem de
utilizao das colunas),
nmero de pratos tericos da coluna ou sistema de colunas; eficincia de separao (resoluo do
sistema),
informaes relativas simetria dos picos,
temperatura da coluna, tipo de controlo da temperatura utilizado,
detector (princpio utilizado, tipo, volume da clula),
medidor de caudal, se utilizado (fabricante, princpio utilizado),
sistema de registo e processamento dos dados (equipamento e suporte lgico).
2.2.3. Calibrao do sistema
Descrio pormenorizada do mtodo utilizado para obter a curva de calibrao,
informaes relativas aos critrios de qualidade aplicveis ao mtodo (por exemplo, coeficiente de
correlao, erro quadrtico mdio, etc.),
informaes relativas s extrapolaes, hipteses e aproximaes efectuadas no decurso do processo
experimental, bem como da avaliao e processamento dos dados,
devem apresentar-se na forma de quadro os dados utilizados para a obteno da curva de calibrao,
incluindo, para cada ponto de calibrao, as seguintes informaes:
nome da amostra,
fabricante da amostra,
valores de M
p
, M
n
, M
w
, M
w
/M
n
caractersticos dos padres, fornecidos pelo fabricante ou obtidos em
determinaes posteriores, bem como pormenores sobre o mtodo de determinao utilizado,
volume de injeco e concentrao da substncia injectada,
valor de M
p
utilizado para a calibrao,
volume de eluio ou tempo de reteno corrigido correspondentes ao mximo dos picos,
valores de M
p
correspondentes ao mximo dos picos,
percentagem de erro dos valores de M
p
calculados e do valor de calibrao.
2.2.4. Informaes sobre o teor em polmeros de baixa massa molecular
Descrio dos mtodos de anlise e dos procedimentos utilizados,
informaes relativas ao teor de espcies e baixa massa molecular da amostra, expresso em percentagem
ponderal,
informaes relativas ao teor de impurezas, aditivos e de outras espcies no polimricas da amostra,
expresso em percentagem ponderal.
2.2.5. Avaliao
Avaliao com base no tempo: mtodos utilizados para assegurar a reprodutibilidade requerida (mtodo
de correco, padro interno, etc.),
informaes que indiquem se a avaliao foi efectuada com base no volume de eluio ou no tempo de
reteno,
informaes sobre os limites de avaliao, caso um pico no seja totalmente analisado,
descrio dos eventuais mtodos de nivelamento de dados utilizados,
processos de preparao e tratamento prvio da amostra,
eventual presena de partculas no dissolvidas,
volume de injeco (expresso em l) e concentrao de injeco (expressa em mg/ml),
observaes que indiquem efeitos susceptveis de induzir desvios relativamente s condies
cromatogrficas ideais,
descrio pormenorizada das alteraes aos procedimentos de ensaio,
pormenores relativos s margens de erro,
quaisquer outras informaes e observaes que possuam importncia para a interpretao dos
resultados.
3. REFERNCIAS
(1) DIN 55672 (1995). Geldpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutions-
mittel, Teil 1.
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography,
J.Wiley and Sons.
Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American
Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for
Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
Apndice
Directrizes para a correco do teor de espcies de baixa massa molecular determinada pela presena de polmeros
insolveis
A presena de polmeros insolveis na amostra determina perdas de massa no decurso da anlise por cromatografia de
permeao em gel. Os polmeros insolveis so retidos de forma irreversvel na coluna ou filtro, enquanto que a poro
solvel da amostra prossegue o seu percurso. Se for possvel estimar ou determinar o incremento do ndice de refraco do
polmero (dn/dc), pode calcular-se a perda de massa na coluna. Neste caso, efectua-se uma correco por recurso a
calibrao externa do refractmetro com substncias-padro de concentrao e dn/dc conhecidos. No exemplo que se segue,
utiliza-se um padro de poli(metacrilato de metilo) (pMMA).
No caso dos polmeros acrlicos, a calibrao externa consiste na anlise por cromatografia de permeao em gel de uma
soluo de um padro de pMMA em tetra-hidrofurano, de concentrao conhecida; os dados resultantes so utilizados para
calcular a constante do refractmetro, por recurso frmula:
K = R/(C V dn/dc)
em que:
K = representa a constante do refractmetro, expressa em mV.s/ml,
R = representa a resposta do padro de pMMA, expressa em mV.s,
C = representa a concentrao do padro de pMMA, expressa em mg/ml,
V = representa o volume de injeco, expresso em ml,
dn/dc = representa o incremento do ndice de refraco relativo soluo de pMMA em tetra-hidrofurano, expresso em
ml/mg.
Os valores infra so caractersticos de um padro de pMMA:
R = 2 937 891
C = 1,07 mg/ml
V = 0,1 ml
dn/dc = 9 10
-5
ml/mg
O valor de K resultante (3,05 10
11
) utilizado para o clculo da resposta terica do detector no caso da eluio e deteco
da totalidade do polmero injectado.
A.20. COMPORTAMENTO DOS POLMEROS DA DISSOLUO/EXTRACO AQUOSA
1. MTODO
O presente mtodo idntico verso revista do mtodo OCDE TG 120 (1997). As informaes tcnicas
especficas so apresentadas na referncia (1).
1.1. INTRODUO
No caso de determinados polmeros, nomeadamente polmeros de emulso, pode ser necessrio efectuar
trabalhos preliminares antes da aplicao do mtodo descrito infra. O mtodo no aplicvel a polmeros
lquidos e polmeros que reajam com a gua nas condies de ensaio.
Nos casos em que a aplicao do mtodo no se afigure vivel, pode investigar-se o comportamento dos
polmeros na dissoluo/extraco aquosa por recurso a outros mtodos, devendo apresentar-se a justificao
de tal facto, bem como a descrio pormenorizada dos mtodos em causa.
No aplicvel.
O comportamento dos polmeros na dissoluo/extraco aquosa determinado atravs do mtodo do
recipiente de vidro (ver A.6 Solubilidade em gua mtodo do recipiente de vidro) alterado do modo que
se descreve de seguida.
No aplicvel.
1.5.1. Equipamento
O equipamento necessrio aplicao do mtodo o seguinte:
dispositivo de triturao (por exemplo, triturador que produza partculas de dimenses conhecidas),
dispositivo de agitao com possibilidade de controlo da temperatura,
sistema de filtros de membrana,
equipamento analtico adequado,
crivos normalizados.
1.5.2. Preparao da amostra
Por recurso a crivos adequados, reduz-se uma amostra representativa a uma granulometria compreendida entre
0,125 e 0,25 mm. De modo a assegurar a estabilidade da amostra ou do processo de triturao, pode ser
necessrio utilizar um sistema de refrigerao. Os materiais com consistncia idntica da borracha podem ser
triturados temperatura do azoto lquido (1).
Caso no se obtenham partculas com a granulometria desejada, deve procurar reduzir-se tanto quanto possvel
as dimenses das mesmas, referindo tal facto no relatrio. Este ltimo deve tambm indicar o modo de
armazenagem da amostra triturada, antes da sua utilizao no ensaio.
1.5.3. Procedimento
Pesam-se trs pores de 10 g da substncia em estudo, que se colocam em trs recipientes munidos de rolhas
de vidro, a cada um dos quais se adicionam 1 000 ml de gua. Caso a utilizao de 10 g de amostra se revele
impraticvel, deve utilizar-se a quantidade mxima possvel, ajustando o volume de gua proporcionalmente
mesma.
Os recipientes so hermeticamente fechados e agitados a 20
o
C. Deve utilizar-se um dispositivo de agitao ou
dissoluo que funcione a temperatura constante. Aps 24 horas, centrifuga-se ou filtra-se o contedo de cada
recipiente, determinando-se a concentrao do polmero na fase aquosa lmpida por recurso a um mtodo
analtico adequado. Caso no se encontrem disponveis mtodos analticos adequados aplicveis fase aquosa,
pode estimar-se a solubilidade ou extractividade totais com base na massa a seco do resduo de filtrao ou do
precipitado obtido por centrifugao.
Em geral, necessrio efectuar uma distino quantitativa entre as impurezas e os aditivos, por um lado, e as
espcies de baixa massa molecular, por outro. No caso da determinao gravimtrica, deve tambm efectuar-se
um ensaio em branco, de modo a avaliar a contribuio de eventuais resduos decorrentes do processo
experimental.
O comportamento dos polmeros na dissoluo/extraco aquosa a 37
o
C, a pH 2 e pH 9 determina-se como
descrito para a experincia a 20
o
C. O pH das solues corrigido atravs da adio quer de tampes quer de
cidos ou bases adequados, nomeadamente cido clordrico, cido actico, hodrxido de sdio ou de potssio
de qualidade analtica e amnia.
Em funo do mtodo analtico utilizado, devem efectuar-se um ou dois ensaios. Sempre que seja possvel
utilizar mtodos suficientemente especficos que permitam a determinao directa do componente polimrico
na fase aquosa, pode efectuar-se um nico ensaio, tal como descrito supra. Todavia, caso tal no seja possvel e
seja necessrio determinar o comportamento dos polmeros na dissoluo/extraco aquosa do polmero por
um processo indirecto, nomeadamente atravs da determinao do teor de carbono orgnico total do extracto
aquoso, deve efectuar-se um ensaio complementar em triplicado, utilizando amostras de polmeros dez vezes
inferiores e volumes de gua idnticos aos utilizados no primeiro ensaio.
1.5.4. Anlise
1.5.4.1. Ensaio efectuado com uma nica granulometria
Alguns mtodos permitem a anlise directa dos componentes polimricos na fase aquosa. Todavia, como
alternativa, pode proceder-se anlise indirecta dos componentes polimricos dissolvidos/extrados mediante a
determinao do teor total de componentes solveis, aplicando uma correco destinada a ter em conta a
presena de componentes especficos no polimricos.
A determinao das espcies polimricas totais na fase aquosa pode ser efectuada por recurso a um mtodo
suficientemente sensvel, como por exemplo:
determinao do carbono orgnico total mediante digesto com persulfato ou dicromato, de modo a
obter CO
2
, que seguidamente doseado por espectroscopia de infravermelhos ou anlise qumica,
espectrometria de absoro atmica ou, no caso de polmeros que contenham silcio ou metais, de
plasma indutivo,
espectroscopia de absoro ou espectrofluorimetria no ultravioleta, no caso de polmeros arlicos,
cromatografia em fase lquida acoplada com espectrometria de massa, no caso de amostras de baixa
massa molecular.
A referida determinao pode tambm ser efectuada por evaporao secura, sob vcuo, do extracto aquoso,
seguida de anlise do resduo por espectroscopia de infravermelhos, ultravioleta, etc., ou espectrometria de
absoro atmica de plasma indutivo.
Caso a anlise da fase aquosa no seja vivel, esta ltima deve ser extrada com um solvente orgnico no
miscvel em gua, nomeadamente um hidrocarboneto clorado. Procede-se em seguida evaporao do solvente
e determinao do teor de polmero de acordo com o mtodo descrito supra. Na determinao do grau de
dissoluo/extraco do polmero devem subtrair-se quaisquer componentes do resduo identificados como
impurezas ou aditivos.
Caso se encontrem presentes quantidades relativamente elevadas das referidas matrias, pode ser necessrio
analisar o resduo por HPLC ou cromatografia em fase gasosa, com o objectivo de distinguir as impurezas do
monmero e das espcies presentes derivadas do mesmo, de modo a determinar o respectivo teor.
Em alguns casos, poder bastar a evaporao do solvente orgnico secura e subsequente pesagem do resduo
seco.
1.5.4.2. Ensaio efectuado com duas granulometrias
Determina-se o teor de carbono orgnico total dos extractos aquosos.
Efectua-se uma determinao gravimtrica com a poro no dissolvida e no extrada da amostra. Se, aps a
centrifugao ou filtragem do contedo de um determinado recipiente, permanecerem resduos polimricos
nas respectivas paredes, deve lavar-se o mesmo com o filtrado at que no se observem quaisquer resduos,
procedendo ento a uma nova centrifugao e filtragem. Os resduos que permaneam no filtro ou no tubo de
centrifugao so secos a 40
o
C, sob vcuo, e pesados.
2. RESULTADOS
2.1. ENSAIO EFECTUADO COM UMA NICA GRANULOMETRIA
Devem apresentar-se os resultados relativos a cada recipiente, bem como os valores mdios, expressos em
unidades de massa por volume de soluo (de modo geral, mg/l) ou de massa por massa de amostra de
polmero (de modo geral, mg/g). Deve tambm fornecer-se a perda de massa da amostra, expressa no quociente
entre a massa de soluto e a massa inicial da amostra, bem como os desvios-padro relativos. Devem apresentar-
-se dados relativos totalidade da substncia (polmero + aditivos essenciais, etc.) e apenas ao polmero (aps
subtraco do teor de aditivos).
2.2. ENSAIO EFECTUADO COM DUAS GRANULOMETRIAS
Os teores de carbono orgnico total dos diversos extractos aquosos (ensaios em triplicado), bem como o valor
mdio relativo a cada ensaio, devem ser expressos em unidades de massa por volume de soluo (de modo
geral, mgC/l) ou de massa por massa de amostra de polmero (de modo geral, mgC/g).
O facto de no se observarem diferenas entre os resultados relativos aos rcios superior e inferior amostra/
/gua poder indicar a extraco efectiva de todos os componentes extractveis. Neste caso, no geralmente
necessrio proceder anlise directa.
Devem apresentar-se as massas dos diversos resduos, expressas em percentagem das massas iniciais das
amostras, calculando as mdias relativas a cada ensaio. A diferena entre 100 % e as percentagens obtidas
representa as percentagens de matrias solveis e extractveis nas amostras originais.
3. RELATRIO
Informaes disponveis sobre a substncia em estudo (identidade, aditivos, impurezas, teor de espcies
de baixa massa molecular).
3.1.2. Condies experimentais
Descrio dos procedimentos utilizados e das condies experimentais,
descrio dos mtodos analticos e de deteco utilizados.
3.1.3. Resultados
Solubilidade ou extractividade, expressas em mg/ml; valores individuais e mdios obtidos nos ensaios de
extraco das diversas solues, discriminando o teor de polmero e de impurezas, aditivos, etc.,
solubilidade ou extractividade do polmero, expressas em mg/ml,
teor de carbono orgnico total dos extractos aquosos, massa do soluto e percentagens calculadas, se for
caso disso,
pH de cada amostra,
resultados dos ensaios em branco,
sempre que necessrio, referncias instabilidade qumica da substncia em estudo no decurso dos
processos de ensaio e analtico,
quaisquer informaes que possuam importncia para a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
(1) DIN 53733 (1976). Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen fr Prfzwecke.
A.21. PROPRIEDADES DE COMBURNCIA (LQUIDOS)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O presente mtodo de ensaio destina-se determinao do potencial de uma substncia lquida de aumentar a
velocidade ou intensidade de combusto de uma substncia combustvel, ou de formar misturas homogneas
com uma substncia combustvel que possam sofrer ignio espontnea. O mtodo baseia-se no ensaio da
ONU para lquidos comburentes (1l), ao qual equivalente. Todavia, uma vez que o mtodo A.21 se destina
essencialmente a satisfazer as exigncias da Directiva 67/548/CEE, apenas necessria a comparao com uma
substncia de referncia. Caso se preveja que os resultados do ensaio sejam utilizados para outros fins, pode ser
necessrio efectuar ensaios complementares e comparaes com outras substncias de referncia (
1
).
No necessrio realizar o ensaio se uma anlise simples da frmula estrutural da substncia permitir
estabelecer com um grau de confiana elevado que a mesma no reage exotermicamente com matrias
combustveis.
Antes de realizar o ensaio, conveniente obter informaes sobre eventuais propriedades explosivas da
substncia.
O mtodo no aplicvel a slidos, gases e outras substncias explosivas ou altamente inflamveis, nem a
perxidos orgnicos.
No necessrio realizar o ensaio se existirem dados referentes substncia em estudo obtidos por aplicao
do ensaio da ONU para lquidos comburentes (1).
O tempo mdio necessrio para o aumento da presso a mdia dos tempos determinados necessrios para
que a presso da mistura em estudo aumente de 690 kPa para 2 070 kPa acima da presso atmosfrica.
Utiliza-se como substncia de referncia uma soluo aquosa a 65 %, em massa, de cido ntrico de qualidade
analtica (
2
).
Caso o experimentador preveja que os resultados do ensaio sejam utilizados para outros fins (
1
), pode revelar-se
adequado efectuar ensaios com outras substncias de referncia (
3
).
O lquido em estudo misturado, na proporo 1:1, em massa, com fibras de celulose, e introduzido num
recipiente pressurizado. Se, durante o processo de mistura ou enchimento, ocorrer ignio espontnea, no
necessrio prosseguir o ensaio.
Caso no ocorra ignio espontnea, realiza-se o ensaio na sua totalidade. A mistura aquecida no recipiente
pressurizado, determinando-se o tempo mdio necessrio para que a presso aumente de 690 kPa para
2 070 kPa acima da presso atmosfrica. Este tempo comparado com o tempo mdio necessrio para o
aumento da presso da mistura na proporo de 1:1 da(s) substncia(s) de referncia com celulose.
Os resultados de uma srie de cinco ensaios com uma determinada substncia no devem diferir em mais de
30 % da mdia aritmtica. Devem desprezar-se os resultados que mostrem uma divergncia superior a 30 %
relativamente mdia, alterando-se os procedimentos de mistura e enchimento, aps o que deve repetir-se o
ensaio.
(
1
) Por exemplo, o ensaio no mbito da regulamentao da ONU relativa ao transporte de mercadorias perigosas.
(
2
) O cido deve ser titulado antes do ensaio, de modo a confirmar a sua concentrao.
(
3
) Na referncia 1, por exemplo, utilizam-se cido perclrico a 50 %, em massa, e clorato de sdio a 40 %, em massa.
1.6.1. Preparao
1.6.1.1. Substncia combustvel
Utilizam-se como matria combustvel fibras de celulose secas, de comprimento compreendido entre 50 e 250
m e dimetro mdio 25 m (
1
). As fibras so secas a massa constante, numa placa de espessura no superior a
25 mm, a 105
o
C, durante 4 horas, e mantidas num exsicador com exsicante, at ao arrefecimento e utilizao.
O teor de humidade da celulose seca deve ser inferior a 0,5 % em relao massa seca (
2
). Para tal, se necessrio,
deve prolongar-se o tempo de secagem (
3
). Deve utilizar-se o mesmo lote de celulose em todo o ensaio.
1.6.1.2.1. Di s pos i t i v o pr e s s ur i z a d o
Deve utilizar-se um dispositivo constitudo por um recipiente pressurizado de ao de forma cilndrica, com
89 mm de comprimento e 60 mm de dimetro externo (ver figura 1). So maquinadas duas superfcies planas
em lados opostos, reduzindo a seco local do recipiente para 50 mm, de modo a facilitar a imobilizao
durante a colocao dos obturadores de ignio e de ventilao. O recipiente, com um dimetro interno de
20 mm, rebaixado internamente em ambas as extremidades at uma profundidade de 19 mm e roscado para
tubos normalizados BSP (British Standard Pipe) de 1", ou o seu equivalente no sistema mtrico. enroscada
superfcie curva do recipiente pressurizado uma tomada de presso, a 35 mm de uma das extremidades,
perpendicularmente s superfcies planas maquinadas. O encaixe, roscado para receber a rosca da tomada de
presso (tubo normalizado BSP de 1/2", ou o seu equivalente no sistema mtrico), realizado a uma
profundidade de 12 mm. Se necessrio, instalada uma junta de material inerte, de modo a assegurar
estanquidade aos gases. A tomada de presso tem um comprimento exterior de 55 mm relativamente ao corpo
do dispositivo e um furo axial com 6 mm de dimetro. A extremidade da tomada de presso rebaixada e
roscada de forma a receber um transdutor de presso com diafragma. Pode utilizar-se qualquer dispositivo de
medio de presso que no seja atacado pelos gases de combusto ou produtos de decomposio e seja
adequado a aumentos de presso de 690-2 070 kPa em no mais de 5 minutos.
A extremidade do recipiente pressurizado mais distante da tomada de presso tapada com um obturador de
ignio e munida de dois elctrodos, um dos quais isolado do corpo do obturador e o outro ligado massa. A
extremidade oposta do recipiente fechada por um disco de ruptura adequado a uma presso de ruptura de
2 200 kPa, mantido em posio por um obturador de reteno com um furo axial de 20 mm de dimetro. Se
necessrio, instalada uma junta de material inerte, de modo a assegurar estanquidade aos gases. Durante a
utilizao, o dispositivo mantido na posio correcta por meio de um suporte (figura 2), geralmente
constitudo por uma placa de ao macio com 235 mm 184 mm 6 mm e um tubo de 185 mm de
comprimento e seco quadrada de 70 mm 70 mm 4 mm.
So cortados dois lados opostos na extremidade do tubo, de modo a obter uma estrutura constituda por uma
seco de tubo intacto com 86 mm de comprimento prolongada por dois lados at base. As extremidades
destes lados so cortadas de modo a formar um ngulo de 60
o
com a horizontal e soldadas placa de ao
macio que constitui a base. maquinada num dos lados da extremidade superior da base uma fenda com
22 mm de largura e 46 mm de profundidade, de modo que, ao colocar o dispositivo pressurizado com o
obturador de ignio para baixo, a tomada de presso encaixe na fenda. soldada face interna do lado inferior
do tubo um espaador de ao com 30 mm de largura e 6 mm de espessura. O dispositivo pressurizado
mantido firmemente em posio por dois parafusos de orelhas de 7 mm, colocados no lado oposto, e apoiado
inferiormente por dois elementos prismticos de ao de 12 mm de largura e 6 mm de espessura, soldados s
peas laterais na base da poro intacta do tubo.
1.6.1.2.2. S i s t e ma d e i g ni o
O sistema de ignio constitudo por um cabo de nquel-crmio de 25 cm de comprimento e 0,6 mm de
seco, com uma resistncia de 3,85 ohm/m. O cabo enrolado em forma de bobina por recurso a uma haste
de 5 mm de seco, e ligado aos elctrodos do obturador de ignio. A bobina deve apresentar uma das
configuraes que se ilustram na figura 3. A distncia entre a extremidade inferior do recipiente e a superfcie
interior da bobina de ignio deve ser de 20 mm. Caso os elctrodos no sejam ajustveis, as extremidades do
cabo de ignio entre a bobina e a base do recipiente devem ser isoladas por um elemento de cermica. O cabo
aquecido por aco de uma corrente contnua de intensidade mnima 10 A.
1.6.2. Realizao do ensaio (
4
)
O dispositivo completo, incluindo o transdutor de presso e o sistema de aquecimento, mas sem o disco de
ruptura na respectiva posio, colocado com o obturador de ignio para baixo. Com o auxlio de um
agitador de vidro (
5
), misturam-se num recipiente de vidro 2,5 g do lquido em estudo com 2,5 g de celulose
seca. Por motivos de segurana, a mistura deve ser executada com um dispositivo de segurana interposto entre
o operador e a mistura. Em caso de ignio durante os processos de mistura ou o enchimento, no necessrio
(
1
) Por exemplo, celulose Whatman para cromatografia em coluna, referncia CF 11, n.
o
de catlogo 4021 050.
(
2
) Confirmado, por exemplo, atravs de uma titulao de Karl Fisher.
(
3
) Como alternativa, pode obter-se o teor de humidade em causa por aquecimento a 105
o
C, sob vcuo, durante 24 h.
(
4
) As misturas de substncias comburentes com celulose devem ser consideradas potencialmente explosivas, devendo manipular-se com os
devidos cuidados.
(
5
) Na prtica, pode preparar-se uma quantidade de mistura na proporo 1:1 do lquido em estudo com celulose superior necessria para
o ensaio, transferindo 5 0,1 g da mesma para o recipiente pressurizado. A mistura deve ser preparada antes de cada ensaio.
prosseguir o ensaio. A mistura vertida em pequenas pores no recipiente pressurizado, agitando
ligeiramente, devendo assegurar-se a acumulao em torno da bobina de ignio, de forma a estabelecer um
bom contacto. A bobina no deve ser distorcida durante o processo de enchimento, facto que poderia
determinar resultados errneos (
1
). O disco de ruptura colocado na respectiva posio e o obturador de
reteno enroscado firmemente. O recipiente carregado, com o disco de ruptura no topo, transferido para o
suporte, que deve estar colocado numa chamin ou cmara com proteco. A fonte de alimentao ligada aos
terminais externos do obturador de ignio, aplicando-se uma corrente de 10 A. O tempo decorrido entre o
incio da mistura e o estabelecimento da corrente elctrica no deve exceder 10 minutos.
O sinal produzido pelo transdutor de presso transmitido a um sistema adequado que permita a deteco e o
registo contnuos da alterao da presso (por exemplo, um detector em contnuo acoplado a um registador). A
mistura aquecida at ruptura do disco de ruptura ou at terem decorrido, pelo menos, 60 segundos. Caso o
disco no sofra ruptura, deve deixar-se arrefecer a mistura antes de desmontar cuidadosamente o dispositivo,
tomando as precaues inerentes a uma eventual pressurizao. Realizam-se cinco ensaios com a substncia
em estudo e a(s) substncia(s) de referncia. Regista-se o tempo necessrio para a presso aumentar de 690 kPa
para 2 070 kPa acima da presso atmosfrica, calculando-se ento o tempo mdio necessrio para o aumento
da presso.
Algumas substncias produzem um aumento de presso excessivo ou demasiado reduzido, determinado por
reaces qumicas independentes das propriedades de comburncia das substncias. Nesses casos, pode ser
necessrio repetir o ensaio, utilizando uma substncia inerte, como, por exemplo, terra de diatomceas
(kieselguhr), em vez da celulose, de modo a esclarecer a natureza da reaco.
2. DADOS
Tempos necessrios para o aumento da presso da(s) substncia(s) em estudo e de referncia. Tempos
necessrios para o aumento da presso no caso dos ensaios com substncias inertes, se for caso disso.
Calculam-se os tempos mdios necessrios para o aumento da presso da(s) substncia(s) em estudo e de
referncia.
Calcula-se o tempo mdio necessrio para o aumento da presso no ensaio com a substncia inerte, se
realizado.
O quadro 1 fornece alguns exemplos de resultados:
Quadro 1
Exemplos de resultados (
a
)
Substncia (
b
)
Tempo mdio necessrio para o aumento da presso
(mistura com celulose na proporo 1:1)
(ms)
Soluo aquosa saturada de dicromato de amnio 20 800
Soluo aquosa saturada de nitrato de clcio 6 700
Soluo aquosa saturada de nitrato frrico 4 133
Soluo aquosa saturada de perclorato de ltio 1 686
Soluo aquosa saturada de perclorato de magnsio 777
Soluo aquosa saturada de nitrato de nquel 6 250
cido ntrico a 65 % 4 767 (
c
)
cido perclrico a 50 % 121 (
c
)
cido perclrico a 55 % 59
Soluo aquosa a 30 % de nitrato de potssio 26 690
Soluo aquosa saturada de nitrato de prata (
d
)
Soluo aquosa a 40 % de clorato de sdio 2 555 (
c
)
(
1
) Deve evitar-se, em especial, o contacto entre espiras adjacentes da bobina.
Substncia (
b
)
Tempo mdio necessrio para o aumento da presso
(mistura com celulose na proporo 1:1)
(ms)
Soluo aquosa a 45 % de nitrato de sdio 4 133
Substncia inerte
gua: celulose (
d
)
(
a
) Ver a referncia (1) para a classificao no mbito da regulamentao da ONU em matria de transporte de mercadorias
perigosas.
(
b
) As solues saturadas devem ser preparadas temperatura de 20
o
C.
(
c
) Valor mdio com base em ensaios de comparao interlaboratorial.
(
d
) Sem atingir a presso mxima de 2 070 kPa.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DE ENSAIO
O relatrio de ensaio deve incluir as seguintes informaes:
identidade, composio, grau de pureza, etc., da substncia em estudo,
concentrao da substncia em estudo,
procedimento utilizado para a secagem da celulose,
teor de humidade da celulose utilizada,
resultados das determinaes,
resultados dos ensaios com substncias inertes, se for caso disso,
tempos mdios necessrios para o aumento da presso determinados,
quaisquer eventuais alteraes do mtodo e respectiva motivao,
quaisquer informaes complementares ou observaes teis para a interpretao dos resultados.
3.2. INTERPRETAO DOS RESULTADOS (
1
)
Os resultados do ensaio so interpretados com base nos seguintes critrios:
a) Eventual ignio espontnea da mistura da substncia em estudo com celulose; e
b) Comparao do tempo mdio necessrio para o aumento da presso de 690 kPa para 2 070 kPa com
idntico parmetro da(s) substncia(s) de referncia.
Uma substncia lquida considerada comburente se:
a) Uma mistura da substncia com celulose na proporo 1:1, em massa, exibir ignio espontnea; ou
(
1
) Ver a referncia n.
o
1 para a interpretao dos resultados no mbito da regulamentao da ONU relativa ao transporte de mercadorias
perigosas, utilizando vrias substncias de referncia.
b) Uma mistura na proporo 1:1, em massa, exibir um tempo mdio necessrio para o aumento da presso
inferior ou igual ao tempo mdio necessrio para o aumento da presso de uma mistura na proporo
1:1, em massa, de soluo aquosa de cido ntrico a 65 % (em massa) e celulose.
De modo a evitar falsos resultados positivos, podem ser tambm tidos em conta na interpretao dos
resultados, se tal for considerado necessrio, os resultados obtidos num ensaio da substncia em estudo com
uma substncia inerte.
4. REFERNCIAS
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria, 3.
o
edio revista.
Publicao da ONU No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, p. 342. Test 0.2: Test for oxidizing liquids.
Figura 1
Dispositivo pressurizado
Figura 2
Suporte do dispositivo
Figura 3
Sistema de ignio
Nota: Cada uma destas duas configuraes pode ser utilizada
PARTE B: MTODOS PARA A DETERMINAO DA TOXICIDADE E DE OUTROS EFEITOS NA SADE
NDICE
INTRODUO GERAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
B.1.bis. TOXICIDADE ORAL AGUDA PROCEDIMENTO DE DOSE FIXA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
B.1.tris. TOXICIDADE ORAL AGUDA MTODO DE CLASSIFICAO DE TOXICIDADE AGUDA . . . . . . . . . 158
B.2. TOXICIDADE AGUDA (INALAO) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
B.3. TOXICIDADE AGUDA (DRMICA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
B.4. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAO/CORROSO DRMICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182
B.5. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAO/CORROSO OCULAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
B.6. SENSIBILIZAO CUTNEA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202
B.7. TOXICIDADE ORAL DA DOSE REPETIDA (28 DIAS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210
B.8. TOXICIDADE (INALAO) DA DOSE REPETIDA (28 DIAS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
B.9. TOXICIDADE (DRMICA) DA DOSE REPETIDA (28 DIAS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
B.10. MUTAGENICIDADE ENSAIO IN VITRO DE ABERRAES CROMOSSMICAS EM MAMFEROS . 225
B.11. MUTAGENICIDADE ENSAIO IN VIVO DE ABERRAES CROMOSSMICAS EM CLULAS DA
MEDULA DE MAMFEROS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233
B.12. MUTAGENICIDADE ENSAIO IN VIVO DOS MICRONCLEOS EM ERITRCITOS DE MAMFEROS 240
B.13/14. MUTAGENICIDADE ENSAIO DE MUTAO REVERSA EM BACTRIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248
B.15. TESTES DE MUTAGNESE E DESPISTE DE CARCINOGNESE MUTAO GNICA SACCHARO-
MYCES CEREVISIAE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256
B.16. RECOMBINAO MITTICA SACCHAROMYCES CEREVISIAE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 259
B.17. MUTAGENICIDADE ENSAIO DE MUTAO GNICA EM CLULAS DE MAMFEROS IN VITRO . . 262
B.18. LESO E REPARAO DO ADN SNTESE NO PROGRAMADA CLULAS DE MAMFERO IN
VITRO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271
B.19. TESTE IN VITRO DE TROCA ENTRE CROMTIDES DO MESMO CROMOSSOMA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275
B.20. TESTE DE LETALIDADE RECESSIVA LIGADA AO SEXO NA DROSOPHILA MELANOGASTER . . . . . . 279
B.21. TESTES DE TRANSFORMAO DE CLULAS DE MAMFERO IN VITRO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282
B.22. TESTE DE LETALIDADE DOMINANTE NO ROEDOR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285
B.23. ENSAIO DE ABERRAES CROMOSSMICAS EM ESPERMATOGNIAS DE MAMFERO . . . . . . . . . . . 288
B.24. TESTE DAS MALHAS (SPOT-TEST) NO RATINHO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 295
B.25. TRANSLOCAO HEREDITRIA NO RATINHO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 298
B.26. ENSAIO DE TOXICIDADE ORAL SUBCRNICA ESTUDO DE TOXICIDADE ORAL DE DOSE REPETIDA
EM ROEDORES COM A DURAO DE 90 DIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302
B.27. ENSAIO DE TOXICIDADE ORAL SUBCRNICA ESTUDO DE TOXICIDADE ORAL DE DOSE REPETIDA
EM ESPCIES NO ROEDORAS COM A DURAO DE 90 DIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308
B.28. TOXICIDADE DRMICA SUBCRNICA: TESTE DE DOSE REPETIDA POR VIA DRMICA, A NOVENTA
DIAS, EM ROEDORES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 314
B.29. TOXICIDADE SUBCRNICA POR INALAO: TESTE DE DOSE REPETIDA POR INALAO, A
NOVENTA DIAS, EM ROEDORES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318
B.30. TESTE DE TOXICIDADE CRNICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
B.31. ESTUDO DE TOXICIDADE SOBRE O DESENVOLVIMENTO PR-NATAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329
B.32. TESTE DE CARCINOGNESE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338
B.33. TESTE COMBINADO DE TOXICIDADE CRNICA/CARCINOGNESE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 344
B.34. TESTE DE TOXICIDADE SOBRE A REPRODUO EM UMA GERAO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 351
B.35. ESTUDO DE TOXICIDADE SOBRE A REPRODUO EM DUAS GERAES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355
B.36. TOXICOCINTICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365
B.37. NEUROTOXICIDADE RETARDADA DE SUBSTNCIAS ORGANOFOSFORADAS POR EXPOSIO
AGUDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 369
B.38. NEUROTOXICIDADE RETARDADA DE SUBSTNCIAS ORGANOFOSFORADAS POR ADMINISTRA-
O REPETIDA A 28 DIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374
B.39. ENSAIO IN VIVO DA SNTESE NO PROGRAMADA (UDS) DE ADN EM CLULAS DO FGADO DE
MAMFEROS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 378
B.40. CORROSO DA PELE IN VITRO: ENSAIO DA RESISTNCIA ELCTRICA TRANSCUTNEA (RET) . . . 384
B.40.A. CORROSO DA PELE IN VITRO: ENSAIO EM MODELOS DE PELE HUMANA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394
B.41. ENSAIO DE FOTOTOXICIDADE IN VITRO 3T3 NRU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400
B.42. SENSIBILIZAO DA PELE: ENSAIO DE GNGLIO LINFTICO LOCAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414
B.43. ESTUDO DE NEUROTOXICIDADE EM ROEDORES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420
B.44. ABSORO CUTNEA: MTODO IN VIVO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432
B.45. ABSORO CUTNEA: MTODO IN VITRO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 438
INTRODUO GERAL
A. CARACTERIZAO DA SUBSTNCIA EM ESTUDO
Antes de iniciar qualquer estudo de toxicidade devem conhecer-se a composio da substncia em estudo,
incluindo as principais impurezas que contenha, e as propriedades fsico-qumicas mais importantes,
nomeadamente a estabilidade.
As propriedades fsico-qumicas da substncia fornecem informaes de relevo para a escolha da via de
administrao e a concepo de cada estudo especfico, bem como para o manuseamento e a armazenagem da
substncia.
O estudo deve ser precedido do desenvolvimento de um mtodo analtico para a determinao qualitativa e
quantitativa da substncia em estudo (incluindo, sempre que possvel, as principais impurezas) no meio de
administrao e no material biolgico.
Devem incluir-se no relatrio de ensaio todas as informaes disponveis referentes identificao, s
propriedades fsico-qumicas, pureza e ao comportamento da substncia em estudo.
B. CUIDADOS COM OS ANIMAIS
Nos estudos de toxicidade fundamental efectuar um controlo estrito das condies ambientais e utilizar
tcnicas adequadas para o cuidado dos animais.
i) Condies de alojamento
As condies ambientais nos locais ou recintos destinados aos animais devem ser adequadas s espcies em
estudo. Para ratos, ratinhos e cobaias, a temperatura do local deve ser de 22
o
C 3
o
C e a humidade relativa de
30 % a 70 %; no que respeita aos coelhos, a temperatura ambiente deve ser de 20
o
C 3
o
C e a humidade
relativa de 30 % a 70 %.
Algumas tcnicas experimentais so particularmente sensveis aos efeitos da temperatura; em tais casos, a
descrio do mtodo de ensaio deve incluir pormenores relativos s condies adequadas. Em todos os ensaios
de toxicidade, a temperatura e humidade devem ser controladas, registadas e referidas no relatrio final.
A iluminao deve ser artificial, com uma alternncia de 12 horas de luz e 12 horas de obscuridade. Os
pormenores relativos iluminao devem ser registados e includos no relatrio final.
Salvo especificao em contrrio, os animais devem ser alojados individualmente ou em pequenos grupos do
mesmo sexo. Em caso de alojamento colectivo, no devem colocar-se mais de 5 animais numa gaiola.
Nos relatrios de experincias com animais, conveniente indicar o tipo de gaiolas utilizadas e o nmero de
animais alojados em cada gaiola, tanto durante o perodo de exposio substncia em estudo como durante o
eventual perodo de observao subsequente.
ii) Condies de alimentao
A dieta deve satisfazer todos os requisitos nutricionais da espcie em estudo. No caso de as substncias serem
administradas aos animais na respectiva dieta, o valor nutricional da mesma pode ser reduzido pela interaco
entre a substncia e determinados constituintes da dieta. Essa possibilidade deve ser tida em conta na
interpretao dos resultados dos ensaios. Podem utilizar-se dietas convencionais de laboratrio, com um
fornecimento ilimitado de gua para beber. A escolha da dieta pode ser condicionada pela necessidade de
assegurar a administrao adequada da substncia em estudo, caso se recorra a esta via.
Os eventuais contaminantes que influenciem a toxicidade no devem estar presentes em concentraes que
possam interferir com os resultados.
C. ENSAIOS ALTERNATIVOS
A Unio Europeia est empenhada em promover a elaborao e validao de tcnicas alternativas que forneam
a mesma quantidade de informaes que os ensaios actuais em animais, mas que utilizem um nmero inferior
de animais, lhes causem menor sofrimento ou evitem, de todo, o recurso aos mesmos.
Na caracterizao dos riscos e consequente classificao e rotulagem dos produtos e para a avaliao da
segurana qumica devem utilizar-se, sempre que possvel, mtodos deste tipo, medida que se encontrem
disponveis.
D. AVALIAO E INTERPRETAO
Aquando da avaliao e interpretao dos ensaios devem ter-se em conta as limitaes apresentadas pela
extrapolao directa para o homem dos resultados obtidos em estudos com animais e in vitro, pelo que, para a
confirmao dos referidos resultados, devem utilizar-se, sempre que se encontrem disponveis, dados referentes
a efeitos adversos no homem.
E. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
A maioria dos mtodos apresentados foram elaborados no mbito do programa da OCDE das directrizes em
matria de ensaios, devendo os mesmos ser executados em conformidade com as boas prticas de laboratrio,
de modo a garantir, na medida do possvel, o reconhecimento mtuo dos resultados.
Podem obter-se informaes adicionais nas referncias includas nas directrizes da OCDE, bem como em outras
publicaes no domnio em causa.
B.1.bis. TOXICIDADE ORAL AGUDA PROCEDIMENTO DE DOSE FIXA
1. MTODO
O presente mtodo equivalente ao Test Guideline TG 420 da OCDE (2001).
1.1. INTRODUO
Os mtodos tradicionais de avaliao de toxicidade aguda utilizam a morte dos animais como critrio
especfico. Em 1984, foi sugerida pela British Toxicology Society uma nova abordagem ao ensaio da toxicidade
aguda com base na administrao de uma srie de doses fixas (1). Esta abordagem evitava a utilizao da morte
dos animais como um critrio especfico. O novo mtodo baseava-se na observao de sinais evidentes de
toxicidade ocorrentes a determinado valor de uma srie de doses fixas. Em 1992 e no seguimento dos estudos
de validao in vivo efectuados tanto no Reino Unido (2) como internacionalmente (3), o procedimento foi
adoptado como mtodo de ensaio. Subsequentemente, as propriedades estatsticas do Procedimento de Dose
Fixa foram avaliadas em vrios estudos utilizando modelos matemticos (4)(5)(6). Em conjunto, os estudos in
vivo e de modelao mostraram que o procedimento reprodutvel, utiliza um menor nmero de animais e
causa menor sofrimento do que os mtodos tradicionais, permitindo classificar as substncias de um modo
semelhante a outros mtodos de ensaio de toxicidade aguda.
No Documento de Orientao sobre Ensaios de Toxicidade Oral Aguda (7) podem consultar-se as orientaes
sobre a seleco do mtodo de ensaio mais apropriado a determinado fim. Este Documento de Orientao
contm igualmente informao adicional sobre o procedimento e interpretao do Mtodo de Ensaio B.1.
Um dos princpios bsicos do presente mtodo consiste na utilizao de doses moderadamente txicas no
estudo principal, evitando a administrao de doses previsivelmente letais. Alm disso, no necessrio
administrar doses para as quais se sabe previamente que causam dor e sofrimento bvios, devido sua aco
corrosiva ou fortemente irritante. Os animais moribundos ou os animais que apresentam sinais bvios de dor
ou sofrimento grave e continuado devem ser sacrificados sem dor e, na interpretao dos resultados do ensaio,
devem ser considerados do mesmo modo que os animais que morrem durante o ensaio. Os critrios sobre a
deciso de sacrificar animais moribundos ou em sofrimento grave, bem como as orientaes sobre a
identificao de morte previsvel ou iminente, esto includos separadamente num Documento de Orienta-
o (8).
O presente mtodo permite obter informao sobre a perigosidade e possibilita a graduao e classificao da
substncia em conformidade com o Sistema Harmonizado ao Nvel Mundial (GHS) para a classificao de
substncias qumicas que causam toxicidade aguda (9).
Antes de efectuar o estudo, o laboratrio de ensaio deve ter em conta toda a informao disponvel sobre a
substncia de ensaio. Esta informao incluir a identificao e a estrutura qumica da substncia, as suas
propriedades fsico-qumicas, os resultados de quaisquer outros ensaios de toxicidade da substncia in vitro ou in
vivo, dados toxicolgicos sobre substncias estruturalmente semelhantes e a(s) utilizao(es) prevista(s) para a
substncia. Esta informao necessria para satisfazer todos os envolvidos em relao relevncia do ensaio
ao nvel da proteco da sade humana e ser til na determinao de uma dose inicial apropriada.
1.2. DEFINIES
Toxicidade oral aguda: refere-se ao conjunto de efeitos adversos que se manifestam aps a administrao oral
de uma dose nica da substncia ou de vrias doses num perodo de 24 horas.
Morte retardada: significa que o animal no morre nem aparenta estar moribundo num perodo de 48 horas,
mas morre mais tarde, no decorrer do perodo de observao de 14 dias.
Dose: quantidade aplicada da substncia de ensaio. O valor da dose expresso em peso de substncia de ensaio
por unidade de peso do animal (mg/kg).
Toxicidade evidente: termo geral que descreve a ocorrncia de sinais bvios de toxicidade na sequncia da
administrao da substncia de ensaio [consultar os exemplos descritos em (3)] no qual a dose fixa mais elevada
seguinte pode induzir, na maior parte dos animais, dor intensa, sinais persistentes de distrbios graves, estado
moribundo (os respectivos critrios so apresentados no Documento de Orientao de Critrios Especficos
sem Dor (8) ou, provavelmente, mortalidade.
GHS: Sistema Harmonizado ao Nvel Mundial (Globally Harmonised System) para a Classificao de
Substncias Qumicas e Misturas. Trata-se de um trabalho conjunto da OCDE (sade humana e ambiente), do
Comit de Peritos em Transporte de Mercadorias Perigosas das Naes Unidas (propriedades fsico-qumicas) e
da OIT (notificao de perigos) e coordenado pelo Programa Interorganizaes para a Boa Gesto das
Substncias Qumicas [Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)].
Morte iminente: situao em que se prev a ocorrncia de estado moribundo ou morte antes da prxima
observao planeada. Alguns dos sinais indicativos deste estado em roedores incluem convulses, posio
lateral, posio deitada e tremores. [Consultar o Documento de Orientao de Critrios Especficos sem Dor (8)
para mais detalhes.]
DL
50
(Dose Letal Mdia): dose nica, calculada estatisticamente, de uma substncia susceptvel de causar a
morte de 50 % dos animais quando administrada por via oral. O valor da DL
50
expresso em peso, de
substncia de ensaio, por unidade de peso do animal de ensaio (mg/kg).
Teste-limite: refere-se a uma dose com o valor limite superior admitido pelo ensaio (2 000 ou 5 000 mg/kg).
Estado moribundo: encontrar-se num estado de morte ou de incapacidade de sobrevivncia, mesmo com
tratamento. [Consultar o Documento de Orientao de Critrios Especficos sem Dor (8) para mais detalhes.]
Morte previsvel: presena de sinais clnicos indicativos de ocorrncia de morte em determinada altura (antes
do final planeado da experincia, por exemplo): incapacidade de alcanar gua ou comida. [Consultar o
Documento de Orientao de Critrios Especficos sem Dor (8) para mais detalhes.]
So administradas doses gradualmente crescentes a grupos de animais do mesmo sexo, usando as doses fixas de
5, 50, 300 e 2 000 mg/kg (excepcionalmente pode utilizar-se uma dose fixa adicional de 5 000 mg/kg;
consultar a seco 1.6.2). A dose inicial escolhida com base num estudo preliminar de determinao de
amplitude como a dose para qual previsvel obter alguns sinais de toxicidade sem causar efeitos txicos graves
ou mortalidade. Os sinais clnicos e as condies associadas com dor, sofrimento e morte iminente, so
descritos detalhadamente num Documento de Orientaes da OCDE separado (8). Outros grupos de animais
podero ser sujeitos a dosagens, com doses fixas superiores ou inferiores, consoante a presena ou ausncia de
sinais de toxicidade ou mortalidade. Repete-se este procedimento at identificao da dose que causa toxicidade
evidente ou que provoque uma e apenas uma morte ou at dose mais elevada no caso de no serem
observados quaisquer efeitos. O procedimento imediatamente interrompido no caso de se registarem mortes
dose mais baixa.
1.4.1. Seleco de espcies animais
A espcie preferida para ensaio o rato, mas podem ser utilizadas outras espcies de roedores. Normalmente,
utilizam-se fmeas (7). Tal escolha deve-se ao facto de uma anlise da literatura cientfica relativa aos ensaios
convencionais de DL
50
revelar que, habitualmente, a diferena de sensibilidade entre os sexos pequena e, nos
casos em que so observadas diferenas, as fmeas so, de um modo geral, ligeiramente mais sensveis (10). No
entanto, devem utilizar-se machos caso as propriedades toxicolgicas ou txico-cinticas descritas para
substncias qumicas estruturalmente semelhantes indicarem que estes podem revelar maior sensibilidade.
Quando o ensaio efectuado com machos, deve ser apresentada uma justificao adequada.
Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudveis e pertencentes a estirpes laboratoriais de uso corrente.
As fmeas devem ser nulparas e no grvidas. No incio da administrao das doses, todos os animais
devem ter idades compreendidas entre as 8 e as 12 semanas e um peso compreendido no intervalo de 20 %
do peso mdio dos animais aos quais foram anteriormente administradas doses.
1.4.2. Condies de alojamento e alimentao
A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser de 22
o
C ( 3
o
C). A humidade relativa
dever ser 50-60 %, embora sejam aceitveis valores entre um mnimo de 30 % e um mximo que, de
preferncia, no dever exceder 70 %, salvo durante os perodos de limpeza do compartimento. A iluminao
deve ser artificial, com sequncias de 12 horas de luz e 12 horas de escurido. A alimentao pode basear-se em
dietas de laboratrio convencionais, com fornecimento ilimitado de gua para beber. Os animais aos quais
administrada a mesma dose, podem ser agrupados na mesma gaiola desde que, o nmero de animais em cada
gaiola no impea a observao clara de cada um deles.
1.4.3. Preparao dos animais
Os animais so escolhidos ao acaso, marcados de modo a permitir uma identificao individualizada e
mantidos nas suas gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes do incio da administrao das doses de modo
a permitir que se aclimatem s condies laboratoriais.
1.4.4. Preparao das doses
De um modo geral, as substncias de ensaio devem ser administradas num volume constante ao longo de toda
a gama de doses a ensaiar atravs da variao da concentrao na preparao da dose. No entanto, para o caso
do ensaio de um produto ou de uma mistura no estado lquido, pode ser mais relevante para a avaliao de
risco subsequente a utilizao da substncia de ensaio sem qualquer diluio, ou seja, a concentrao constante,
sendo este um requisito apresentado por algumas autoridades competentes. Em qualquer dos casos, no deve
ser excedido o volume mximo da dose a ser administrada. O volume mximo de lquido que pode ser
administrado de cada vez depende do tamanho do animal de ensaio. No caso de roedores, em condies
normais o volume no deve exceder 1 ml/100 g de peso corporal. Para solues aquosas, contudo, pode ser
considerada a dose de 2 ml/100 g de peso corporal. Recomenda-se que, sempre que possvel, seja considerada
em primeiro lugar a utilizao de uma soluo/suspenso/emulso aquosa; caso tal no seja vivel, pode
considerar-se o uso de uma soluo/suspenso/emulso em leo (por exemplo, leo de milho); em ltima
instncia, poder eventualmente recorrer-se ao uso de solues noutros excipientes. Devem conhecer-se as
caractersticas txicas dos excipientes que no sejam a gua. As doses devem ser preparadas pouco tempo antes
da sua administrao, a menos que a estabilidade da preparao ao longo do perodo de utilizao seja
conhecida e tenha sido considerada aceitvel.
1.5. PROCEDIMENTO
1.5.1. Administrao de doses
A administrao deve ser feita numa toma nica, por sonda esofgica, usando tubo estomacal ou cnula de
intubao apropriada. Nos casos raros em que no possvel a administrao de uma toma nica, a dose pode
ser administrada em fraces menores ao longo de um perodo no superior a 24 horas.
Os animais devem ser sujeitos a jejum antes da administrao das doses (por exemplo, no caso de ratos, no
deve dar-se comida durante a noite, mas deve manter-se o fornecimento de gua; no caso de ratinhos, a comida
deve ser suspensa durante 3-4 horas e deve ser mantido o fornecimento de gua). Aps o perodo de jejum, os
animais devem ser pesados e deve ser administrada a substncia de ensaio. Aps a administrao da substncia,
pode evitar dar-se comida durante 3-4 horas para ratos e 1-2 horas para ratinhos. Nos casos de administrao
fraccionada da dose durante um certo lapso de tempo, pode ser necessrio dar comida e gua aos animais
consoante a durao do perodo de administrao.
1.5.2. Estudo de determinao de amplitude
O objectivo do estudo de determinao de amplitude consiste em seleccionar a dose inicial apropriada para o
estudo principal. A substncia de ensaio administrada a um nico animal de uma forma sequencial segundo
os fluxogramas do anexo 1. O estudo de determinao de amplitude termina quando se pode seleccionar a dose
inicial para o estudo principal (ou se for registada uma morte dose fixa mais baixa).
Para o estudo de determinao de amplitude, a dose inicial seleccionada de entre as doses fixas de 5, 50, 300 e
2 000 mg/kg, como sendo a dose que se prev poder causar toxicidade evidente com base, se possvel, nas
evidncias de dados in vivo e in vitro da mesma substncia qumica ou de substncias qumicas estruturalmente
semelhantes. Na ausncia de tal informao, a dose inicial ser de 300 mg/kg.
O intervalo de aplicao de doses a cada animal ser de, pelo menos, 24 horas. Todos os animais devem ser
observados durante um perodo de, pelo menos, 14 dias.
Excepcionalmente e apenas quando justificado por necessidades regulamentares especficas, pode ser
considerada a utilizao de uma dose fixa superior adicional de 5 000 mg/kg (consultar o Anexo 3). Por razes
de proteco dos animais, desencorajado o ensaio de animais na Categoria 5 do SHG (2 000-5 000 mg/kg).
Esta dose s deve ser considerada quando existe uma elevada probabilidade dos resultados deste ensaio terem
relevncia directa na proteco dos animais, da sade humana ou do ambiente.
Nos casos em que o animal de ensaio morre no estudo de determinao de amplitude quando se aplica a dose
fixa mais baixa (5 mg/kg), o procedimento normal consiste em terminar o estudo e classificar a substncia na
Categoria 1 do GHS (tal como se indica no Anexo 1). No entanto, se for necessria uma confirmao adicional,
pode ser efectuado um procedimento experimental suplementar, tal como se descreve seguidamente. Aplica-se
uma dose de 5 mg/kg a um segundo animal. Se o segundo animal morrer confirma-se a Categoria 1 do GHS e
o estudo imediatamente terminado. Se o segundo animal sobreviver, ser ento administrada a dose de 5 mg/
/kg a um mximo de mais trs animais. Dado que neste caso o risco de mortalidade elevado, a administrao
das doses a estes animais deve ser feita de um modo sequencial, de modo a proteger os animais. O intervalo,
entre a aplicao da dose a cada um dos animais, deve ser suficiente para assegurar a provvel sobrevivncia do
animal anterior. Se ocorrer uma segunda morte, a sequncia de aplicao da dose ser terminada
imediatamente e no sero ensaiados mais animais. Dado que, a ocorrncia de uma segunda morte
(independentemente do nmero de animais ensaiados at ao final do estudo) classificvel no resultado A
(duas ou mais mortes), segue-se a regra de classificao do Anexo 2 para a dose fixa de 5 mg/kg (Categoria 1, se
ocorrerem duas ou mais mortes, ou Categoria 2, se no ocorrer mais do que uma morte). Alm disso,
apresentam-se no Anexo 4 as orientaes sobre a classificao segundo o sistema da UE, vlido at
implementao do novo GHS.
1.5.3. Estudo principal
1.5.3.1. Nmero de animais e doses
No Anexo 2 apresentam-se os procedimentos a seguir aps o ensaio com a dose inicial. necessrio proceder
de uma das trs formas seguintes: terminar os ensaios e classificar a substncia na classe de perigosidade
apropriada, prosseguir os ensaios como uma dose fixa superior, ou prosseguir os ensaios com uma dose fixa
inferior. No entanto, por uma questo de proteco dos animais, a dose que causou morte, no estudo de
determinao de amplitude, no deve ser repetida no estudo principal (consultar Anexo 2). A experincia
prvia indicativa de que o resultado mais provvel da dose inicial ser a possibilidade de classificao da
substncia, o que toma desnecessrios quaisquer ensaios adicionais.
Ser normalmente utilizado um total de cinco animais do mesmo sexo para cada dose investigada. O grupo de
cinco animais ser constitudo por um animal do estudo prvio, ao qual foi administrada a dose seleccionada e
de quatro outros animais (excepto, em casos raros, se a dose utilizada no estudo principal no tiver sido
includa no estudo de determinao de amplitude).
O intervalo de tempo entre a aplicao de doses em cada nvel determinado pelo aparecimento, durao e
gravidade dos sinais de toxicidade. O tratamento dos animais com a dose seguinte deve ser adiado at ser
possvel estabelecer com segurana a sobrevivncia dos animais previamente tratados. Recomenda-se um
perodo de 3 ou 4 dias entre a administrao das doses para cada nvel de dosagem, se necessrio, de modo a
permitir a deteco de efeitos txicos retardados. O intervalo de tempo pode ser ajustado se necessrio, por
exemplo, em caso de resposta inconclusiva.
No caso de se considerar a utilizao da dose fixa mxima de 5 000 mg/kg, deve proceder-se em conformidade
com o procedimento descrito no Anexo 3. (Consultar igualmente a seco 1.6.2.)
1.5.3.2. Teste-limite
O teste-limite utilizado, essencialmente, em situaes nas quais o analista tem informao indicativa de o
material de ensaio no ser provavelmente txico, ou seja, s apresenta toxicidade acima das doses-limite
regulamentadas. A informao sobre a toxicidade do material de ensaio pode ser obtida a partir de ensaios em
compostos semelhantes ou de ensaios de misturas ou produtos semelhantes, tendo em considerao a
identificao e percentagem dos componentes cuja relevncia toxicolgica conhecida. Nos casos em que a
informao sobre a toxicidade do material de ensaio limitada ou inexistente, ou nos casos em que previsvel
que o material a ensaiar seja txico, deve ser efectuado o estudo principal.
Usando o procedimento normal para este ensaio, o teste-limite pode ser efectuado graas a um estudo de
determinao de amplitude com uma dose inicial de 2 000 mg/kg (ou, excepcionalmente, de 5 000 mg/kg),
seguido da administrao da dose a mais quatro animais.
1.6. OBSERVAES
Aps a aplicao da dose, os animais devem ser observados individualmente pelo menos uma vez durante os
primeiros 30 minutos e periodicamente durante as primeiras 24 horas, com especial cuidado nas primeiras
quatro horas. Seguidamente, necessrio observar os animais diariamente durante um perodo de 14 dias,
excepto se for necessrio retir-los do estudo e sacrific-los, sem dor, por motivo do bem-estar dos animais, ou
se forem encontrados mortos. No entanto, a durao do perodo de observao no deve ser estabelecida de
uma forma rgida, mas determinada com base nas reaces de toxicidade, velocidade do seu aparecimento e
durao do perodo de recuperao, que pode ser prolongado, se for considerado necessrio. O momento em
que os sinais de toxicidade aparecem e desaparecem so importantes, sobretudo se os sinais de toxicidade
tendem a aparecer de uma forma retardada (11). Todas as observaes so registadas sistematicamente,
mantendo-se uma ficha individual para cada animal.
Sero necessrias observaes adicionais se os animais continuaram a apresentar sinais de toxicidade. As
observaes devem incluir alteraes na pele e plos, olhos e membranas mucosas, aparelho respiratrio,
aparelho circulatrio, sistema nervoso autnomo e central, assim como da actividade somatomotora e
comportamental. Devem ser observados com especial ateno os tremores, convulses, salivao, diarreia,
letargia, sono e coma. Devem ser tomados em considerao os princpios e critrios resumidos no Documento
de Orientao de Critrios Especficos sem Dor (8). Os animais que forem encontrados em estado moribundo e
os animais que apresentarem dores violentas ou sinais de sofrimento grave e continuado devem ser sacrificados
sem dor. Quando os animais forem sacrificados a fim de evitar dor ou se forem encontrados mortos, deve ser
registado o momento da morte com o maior rigor possvel.
1.6.1. Peso corporal
O peso individual dos animais deve ser determinado pouco antes da administrao da substncia de ensaio e,
seguidamente, pelo menos uma vez por semana. Devem ser calculadas e registadas todas as variaes de peso.
No final do ensaio, os animais sobreviventes so pesados e, seguidamente, sacrificados sem dor.
1.6.2. Patologia
Todos os animais de ensaio (incluindo os que morreram durante o ensaio ou que foram retirados do ensaio por
motivos de preservao do seu bem-estar) devem ser sujeitos a uma autpsia pouco pormenorizada. Devem ser
registadas as alteraes patolgicas principais observadas em cada animal. Deve tambm ser considerada a
realizao de um exame microscpico dos rgos que mostrem sinais de patologia grave em animais que
sobreviveram, no mnimo, durante 24 horas aps a aplicao da dose inicial, j que este exame pode fornecer
informao til.
2. DADOS
Devem ser apresentados os dados individuais para cada animal. Adicionalmente, todos os dados devem ser
resumidos em forma tabular, mostrando, para cada grupo de ensaio, o nmero de animais utilizado, o nmero
de animais que apresentaram sinais de toxicidade, o nmero de animais que foram encontrados mortos durante
o ensaio ou que foram sacrificados a fim de evitar dor, o momento da morte de cada um dos animais, a
descrio e evoluo temporal dos efeitos de toxicidade e sua reversibilidade, assim como os resultados da
autpsia.
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio dever incluir as seguintes informaes:
Substncia de ensaio:
natureza fsica, pureza e propriedades fsico-qumicas relevantes (incluindo isomerizao);
dados relativos identificao qumica, incluindo nmero CAS.
Excipiente (se apropriado):
caso o excipiente no seja gua, uma justificao para a sua escolha.
Animais de ensaio:
espcie/estirpe usada;
estado microbiolgico do animal, caso seja conhecido;
nmero, idade e sexo dos animais (incluindo, quando necessrio, uma justificao para o uso de machos
em vez de fmeas);
provenincia, condies de alojamento, dieta, etc.
Condies do ensaio:
informao pormenorizada sobre a formulao da substncia de ensaio, incluindo informao detalhada
sobre a forma fsica do material administrado;
informao pormenorizada sobre a administrao da substncia de ensaio, incluindo volume das doses e
momento de aplicao;
informao pormenorizada sobre a qualidade dos alimentos e da gua (incluindo tipo e origem da dieta e
origem da gua);
justificao para a escolha da dose inicial.
Resultados:
tabela dos dados de resposta e da dose para cada animal (ou seja, animais que apresentaram sinais de
toxicidade, incluindo mortalidade, natureza, gravidade e durao dos efeitos);
tabela com indicao do peso corporal e suas variaes;
pesos individuais de animais no dia em que aplicada a dose, uma vez por semana no restante perodo e
na altura da sua morte ou sacrifcio;
data e momento da morte, no caso de ocorrncia de morte antes do sacrifcio previsto;
evoluo temporal do aparecimento de sintomas de toxicidade e sua reversibilidade, para cada animal;
resultados da autpsia e resultados histopatolgicos para cada animal, caso se encontrem disponveis.
Anlise dos resultados.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the
classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Biometrics, 20, 385.
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. e Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing
of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, p. 279-291.
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, RJ., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J.
e Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the
classical LD
50
test. Fd. Chem. Toxicol. 28, p. 469-482.
(4) Whitehead, A. e Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol,
30, p. 313-324.
(5) Stallard, N. e Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol,
14, p. 315- 323.
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose
procedure.-Hum. Exp. Toxicol., 21, p. 183-196.
(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety
Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as
Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and
Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.
(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects
of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the
Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/
/home/displaygeneral/0,3380,EN- documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segai,
L., Springer, J.A. e Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD
50
, and Fixed-
-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol, 33, p. 223-231.
(11) Chan P.K e A.W. Hayes (1994), Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation . Em: Principies and Methods of
Toxicology, 3
a
Edio. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd, New York, USA.
ANEXO 1
FLUXOGRAMA PARA O ESTUDO DE DETERMINAO DE AMPLITUDE
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ANEXO 2
FLUXOGRAMA PARA O ESTUDO PRINCIPAL
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ANEXO 3
CRITRIOS PARA A CLASSIFICAO DE SUBSTNCIAS DE ENSAIO COM VALORES PREVISVEIS DE DL
50
SUPERIORES A 2 000 MG/KG PARA AS QUAIS NO NECESSRIO EFECTUAR ENSAIO
Os critrios para a Categoria 5 de perigosidade destinam-se a permitir a identificao de substncias de ensaio que
representam um perigo de toxicidade aguda relativamente baixo, mas que, em certas circunstncias, podem representar
perigo para populaes vulnerveis. previsvel que estas substncias apresentem valores de DL
50
orais ou drmicos na
gama de 2 000-5 000 mg/kg ou dose equivalente para outras vias. As substncias de ensaio podem ser classificadas na
categoria de perigosidade definida por: 2 000 mg/kg < DL
50
< 5 000 mg/kg (Categoria 5 do GHS) nos seguintes casos:
a) se classificadas nesta categoria por qualquer dos esquemas de ensaio do anexo 2, baseados nas incidncias de
mortalidade;
b) se houver prova fivel indicativa de que os valores de DL
50
se encontram na gama correspondente Categoria 5 ou se
outros estudos em animais ou sobre efeitos de toxicidade em seres humanos forem indicativos de preocupao
acentuada em relao salvaguarda da sade humana;
c) atravs de extrapolao, estimativa ou medio de dados, desde que no seja garantida a atribuio a uma classe mais
perigosa, e
quando existe informao fivel indicativa de efeitos de toxicidade significativos em seres humanos, ou
quando no registada mortalidade nos ensaios por via oral at doses correspondentes aos valores para a
Categoria 4, ou
quando os especialistas so da opinio de que no se verificam sintomas clnicos de toxicidade significativos
para ensaios at doses com valores correspondentes Categoria 4, com excepo de diarreia, ereco pilosa ou
m aparncia, ou
nos casos em que os especialistas confirmem a existncia de informao fivel, proveniente de outros estudos
com animais, indicativa da existncia de potenciais efeitos agudos significativos.
ENSAIOS COM DOSES SUPERIORES A 2 000 MG/KG
Apenas pode ser considerada a utilizao de uma dose fixa superior adicional de 5 000 mg/kg em casos excepcionais e
justificados por necessidades especficas legais. Devido ao reconhecimento da necessidade de proteger o bem-estar dos
animais, os ensaios com doses de 5 000 mg/kg so desencorajados e s devem ser considerados no caso de ser muito
provvel que os resultados desse ensaio tenham especial relevncia para a proteco animal ou da sade humana (9).
Estudo de determinao de amplitude
As regras de deciso para o procedimento sequencial apresentado no anexo 1 sero aplicadas ao ensaio com dose de
5 000 mg/kg. Assim, quando se utiliza uma dose de 5 000 mg/kg no estudo de determinao de amplitude, o resultado A
(morte) requer o ensaio com um segundo animal com uma dose de 2 000 mg/kg. Os resultados B e C (toxicidade evidente
ou sem toxicidade) permitem a seleco da dose de 5 000 mg/kg, como dose inicial do estudo princi-
pal. De igual modo, para uma dose inicial diferente de 5 000 mg/kg, o ensaio realizado at dose de 5 000 mg/kg se
o resultado da dose de 2 000 mg/kg for B ou C. No caso de se obter um resultado A na subsequente dose de 5 000 mg/kg, a
dose inicial do estudo principal dever ser 2 000 mg/kg, enquanto para resultados B ou C deve utilizar-se uma dose inicial
de 5 000 mg/kg no estudo principal.
Estudo principal
As regras de deciso para o procedimento sequencial apresentado no anexo 2 sero aplicadas ao ensaio com dose de
5 000 mg/kg. Assim, quando se utiliza uma dose de 5 000 mg/kg no estudo principal, o resultado A (> duas mortes) requer
o ensaio com um segundo grupo, com uma dose de 2 000 mg/kg. Os resultados B (toxicidade evidente e/ou < uma morte)
ou C (sem toxicidade) no permitem a classificao da substncia em conformidade com o GHS. De igual modo, para uma
dose inicial diferente de 5 000 mg/kg, o ensaio realizado at dose de 5 000 mg/kg se o resultado da dose de 2 000 mg/kg
for C. No caso de se obter um resultado A na subsequente dose de 5 000 mg/kg, a substncia ser classificada na Categoria 5
do GHS, enquanto um resultado B ou C no permite a classificao da substncia.
ANEXO 4
MTODO DE ENSAIO B.1 bis
Orientaes sobre a classificao em conformidade com o esquema transitrio da UE, vlido at implementao total do Sistema de Classificao Harmonizado a Nvel Mundial (GHS) (obtido da
referncia (8))
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B.1.tris. TOXICIDADE ORAL AGUDA MTODO DE CLASSIFICAO DE TOXICIDADE AGUDA
1. MTODO
O presente mtodo equivalente ao Test Guideline TG 423 da OCDE (2001)
1.1. INTRODUO
O mtodo de classificao de toxicidade aguda (1) estabelecido no presente ensaio um procedimento gradual
que utiliza trs animais do mesmo sexo por etapa. Em mdia, consoante a mortalidade e/ou o estado
moribundo dos animais, so necessrias 2-4 etapas para avaliar a toxicidade aguda da substncia de ensaio. O
presente procedimento reprodutvel, utiliza uma quantidade muito limitada de animais e permite classificar as
substncias de um modo semelhante a outros mtodos de ensaio de toxicidade aguda. O mtodo de
classificao de toxicidade aguda baseia-se na avaliao biomtrica (2) (3) (4) (5) com doses fixas, separadas
apropriadamente de modo a permitir a avaliao da substncia para fins de classificao e avaliao de
perigosidade. O mtodo, adoptado inicialmente em 1996, foi amplamente validado in vivo relativamente aos
dados de DL
50
publicados na literatura nacional (6) e internacional (7).
No Documento de Orientao sobre Ensaios de Toxicidade Oral Aguda (8) podem consultar-se as orientaes
sobre a seleco do mtodo de ensaio mais apropriado a determinado fim. Este Documento de Orientao
contm igualmente informao adicional sobre o procedimento e interpretao do Mtodo de Ensaio B.1.tris.
No presente mtodo de ensaio no necessrio administrar doses de substncias de ensaio, que
comprovadamente causam dor e sofrimento bvios, devido sua aco corrosiva ou gravemente irritante.
Os animais moribundos ou que apresentam sinais bvios de dor ou sofrimento grave e continuado devem ser
sacrificados sem dor e, na interpretao dos resultados do ensaio, considerados do mesmo modo que os
animais que morrem durante o ensaio. Os critrios sobre a deciso de sacrificar animais moribundos ou em
sofrimento, bem como as orientaes sobre o reconhecimento de morte previsvel ou iminente, esto includos
separadamente num Documento de Orientao (9).
O presente mtodo utiliza doses estabelecidas previamente e os resultados permitem classificar a substncia em
conformidade com o Sistema Harmonizado ao Nvel Mundial (GHS) para a classificao de substncias
qumicas que causam toxicidade aguda (10).
Em princpio, o mtodo no se destina a calcular rigorosamente os valores de DL
50
, mas permite a
determinao de gamas de exposio definidas, nas quais expectvel a ocorrncia de mortes, dado que um dos
principais critrios especficos do ensaio a morte de uma dada proporo de animais. O mtodo permite
determinar valores de DL
50
somente quando, pelo menos, duas das doses utilizadas resultam numa mortalidade
superior a 0 % e inferior a 100 %. A utilizao de uma seleco de doses, previamente estabelecidas,
independentemente da substncia de ensaio, com a classificao especificamente dependente do nmero de
animais observados em vrios estados melhora as condies de comunicao de resultados entre laboratrios,
bem como a consistncia e a repetibilidade dos resultados.
Antes de efectuar o estudo, o laboratrio de ensaio deve ter em conta toda a informao disponvel sobre a
substncia de ensaio. Esta informao incluir a identificao e a estrutura qumica da substncia, as suas
propriedades fsico-qumicas, os resultados de quaisquer outros ensaios de toxicidade da substncia in vitro ou in
vivo, dados toxicolgicos sobre substncias estruturalmente semelhantes e a(s) utilizao(es) prevista(s) para a
substncia. Esta informao necessria para satisfazer todos os envolvidos em relao relevncia do ensaio
ao nvel da proteco da sade humana e ser til na determinao da dose inicial mais adequada.
1.2. DEFINIES
Toxicidade oral aguda: refere-se ao conjunto de efeitos adversos que se manifestam aps a administrao oral
de uma dose nica da substncia ou de vrias doses num perodo de 24 horas.
Morte retardada: significa que o animal no morre nem aparenta estar moribundo num perodo de 48 horas,
mas morre mais tarde, no decorrer do perodo de observao de 14 dias.
Dose: quantidade aplicada da substncia de ensaio. O valor da dose expresso em peso de substncia de ensaio
por unidade de peso de animal de ensaio (por exemplo, mg/kg).
GHS: Sistema Harmonizado ao Nvel Mundial (Globally Harmonised System) para a Classificao de
Substncias Qumicas e Misturas. Trata-se de um trabalho conjunto da OCDE (sade humana e ambiente), do
Comit de Peritos em Transporte de Mercadorias Perigosas das Naes Unidas (propriedades fsico-qumicas) e
da OIT (notificao de perigos) e coordenado pelo Programa Interorganizaes para a Boa Gesto das
Substncias Qumicas [Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)].
Morte iminente: situao em que se prev a ocorrncia de estado moribundo ou morte antes da seguinte
observao planeada. Alguns dos sinais indicativos deste estado em roedores incluem convulses, posio
lateral, posio deitada e tremores. [Para informao detalhada, consultar o Documento de Orientao sobre
Critrios Especficos sem Dor (9)].
DL
50
(Dose Letal Mdia): dose nica, calculada estatisticamente, de uma substncia susceptvel de causar a
50
expresso em peso de
substncia de ensaio por unidade de peso de animal de ensaio (mg/kg).
Dose-limite: refere-se a uma dose com o valor-limite superior admitido pelo ensaio (2 000 ou 5 000 mg/kg).
Estado moribundo: encontrar-se num estado de morte ou de incapacidade de sobrevivncia, mesmo com
tratamento. [Para informao detalhada, consultar o Documento de Orientao sobre Critrios Especficos sem
Dor (9).]
Morte previsvel: presena de sinais clnicos indicativos de ocorrncia de morte em determinada altura, antes
do final planeado da experincia; por exemplo: incapacidade de alcanar gua ou comida. [Consultar o
Documento de Orientao de Critrios Especficos sem Dor (9) para mais detalhes.]
1.3. PRINCPIO DO ENSAIO
O princpio do presente ensaio que, com base num procedimento gradual com a utilizao de um nmero
mnimo de animais por etapa, possvel obter informao suficiente sobre a toxicidade aguda de uma
substncia de ensaio, de modo a permitir a sua classificao. A substncia administrada, por via oral, a um
grupo de animais de ensaio a uma das doses anteriormente definidas. A substncia ensaiada utilizando um
procedimento gradual, em que cada etapa utiliza trs animais do mesmo sexo (normalmente fmeas). A
existncia ou inexistncia de mortalidade, relacionada com composto, dos animais tratados numa dada etapa,
determinar a etapa seguinte, ou seja:
no so necessrios mais ensaios,
administrada a mesma dose a mais trs animais,
administrada a dose seguinte, maior ou menor, a mais trs animais.
No anexo 1 apresenta-se informao detalhada sobre o procedimento de ensaio. O mtodo permitir uma
avaliao conducente classificao da substncia de ensaio numa das classes de toxicidade definidas pelos
valores-limite de DL
50
.
A espcie de roedores preferida para ensaio o rato, mas podem ser utilizadas outras espcies de roedores.
Normalmente, utilizam-se fmeas (9). Tal escolha deve-se ao facto de uma anlise da literatura cientfica relativa
aos ensaios convencionais de DL
50
revelar que, habitualmente, a diferena de sensibilidade entre os sexos
pequena e, nos casos em que so observadas diferenas, as fmeas so, de um modo geral, ligeiramente mais
sensveis (11). No entanto, devem utilizar-se machos caso as propriedades toxicolgicas ou txico-cinticas
descritas para substncias qumicas estruturalmente semelhantes indicarem que estes podem revelar maior
sensibilidade. Quando o ensaio efectuado com machos, deve ser apresentada uma justificao adequada.
Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudveis e pertencentes a estirpes laboratoriais de uso corrente.
As fmeas devem ser nulparas e no grvidas. No incio da administrao das doses, todos os animais
devem ter idades compreendidas entre as 8 e as 12 semanas e um peso compreendido no intervalo de 20 %
do peso mdio dos animais aos quais foram anteriormente administradas doses.
A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser 22
o
C ( 3
o
C). A humidade relativa dever
ser 50 %-60 %, embora sejam aceitveis valores entre um mnimo de 30 % e um mximo que, de preferncia,
no dever exceder 70 %, salvo durante os perodos de limpeza do compartimento. A iluminao deve ser
artificial, com sequncias de 12 horas de luz e 12 horas de escurido. A alimentao pode basear-se em dietas
de laboratrio convencionais, com fornecimento ilimitado de gua para beber. Os animais aos quais
administrada a mesma dose podem ser agrupados na mesma gaiola, desde que o nmero de animais em cada
gaiola no impea a observao clara de cada um deles.
Os animais so escolhidos ao acaso, marcados de modo a permitir uma identificao individualizada e
mantidos nas suas gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes do incio da administrao das doses para que
se aclimatem s condies laboratoriais.
De um modo geral, as substncias de ensaio devem ser administradas num volume constante ao longo de toda
a gama de doses a ensaiar atravs da variao da concentrao na preparao da dose. No entanto, para o caso
do ensaio de um produto ou de uma mistura no estado lquido, pode ser mais relevante para a avaliao de
risco subsequente a utilizao da substncia de ensaio sem qualquer diluio, ou seja, a concentrao constante,
sendo este um requisito apresentado por algumas autoridades competentes. Em qualquer dos casos, no deve
ser excedido o volume mximo da dose a ser administrada. O volume mximo de lquido que pode ser
administrado de cada vez depende do tamanho do animal de ensaio. No caso de roedores, o volume no deve
exceder, em condies normais, 1 ml/100 g de peso corporal. Para solues aquosas, contudo, pode ser
considerada a dose de 2 ml/100 g de peso corporal. Recomenda-se que, sempre que possvel, seja considerada
em primeiro lugar a utilizao de uma soluo/suspenso/emulso aquosa; caso tal no seja vivel, pode
considerar-se o uso de uma soluo/suspenso/emulso em leo (por exemplo, leo de milho); em ltima
instncia, poder eventualmente recorrer-se ao uso de solues noutros excipientes. Devem conhecer-se as
caractersticas toxicolgicas dos excipientes que no sejam a gua. As doses devem ser preparadas pouco tempo
antes da sua administrao, a menos que a estabilidade da preparao ao longo do perodo de utilizao seja
conhecida e tenha sido considerada aceitvel.
1.5. PROCEDIMENTO
A administrao por sonda esofgica deve ser feita, de preferncia, numa toma nica, usando um tubo
estomacal ou uma cnula de intubao apropriada. Nos casos raros em que no possvel a administrao de
uma toma nica, a dose pode ser administrada em fraces menores ao longo de um perodo no superior a
24 horas.
Os animais devem ser sujeitos a jejum antes da administrao das doses (por exemplo, no caso de ratos, no
deve dar-se comida durante a noite, mas deve manter-se o fornecimento de gua; no caso de ratinhos, a comida
deve ser suspensa durante 3-4 horas e deve ser mantido o fornecimento de gua). Aps o perodo de jejum, os
animais devem ser pesados e deve ser administrada a substncia de ensaio. Aps a administrao da substncia,
pode evitar dar-se comida durante 3-4 horas para ratos e 1-2 horas para ratinhos. Nos casos de administrao
fraccionada da dose durante um certo lapso de tempo, pode ser necessrio dar comida e gua aos animais,
consoante a durao do perodo de administrao.
1.5.2. Nmero de animais e doses
So utilizados trs animais em cada etapa. A dose a utilizar inicialmente deve ser seleccionada entre uma das
quatro doses fixas de 5, 50, 300 e 2 000 mg/kg de peso corporal. A dose inicial deve ser aquela que apresenta
maior probabilidade de induzir mortalidade em alguns dos animais tratados. Os fluxogramas do anexo 1
descrevem o procedimento a seguir para cada uma das doses iniciais. Apresentam-se ainda, no anexo 4, as
orientaes sobre a classificao segundo o sistema da UE, em vigor at implementao do novo GHS.
Quando a informao disponvel for indicativa de que no muito provvel que ocorra mortalidade com a
maior dose inicial (2 000 mg/kg de peso corporal), deve efectuar-se um teste-limite. Quando no existir
qualquer informao disponvel sobre a substncia de ensaio, recomenda-se a utilizao de uma dose inicial de
300 mg/kg de peso corporal por razes de proteco dos animais.
O intervalo de tempo entre os grupos de tratamento determinado pelo aparecimento, durao e gravidade
dos sinais de toxicidade. O tratamento dos animais com a dose seguinte deve ser adiado at ser possvel
estabelecer com segurana a sobrevivncia dos animais previamente tratados.
Excepcionalmente, e apenas quando justificado por necessidades legais especficas, pode ser considerada a
utilizao de uma dose fixa superior adicional de 5 000 mg/kg (consultar o anexo 2). Por razes de proteco
dos animais, desencorajado o ensaio de animais na Categoria 5 do GHS (2 000-5 000 mg/kg) e esta dose s
deve ser considerada quando existe uma elevada probabilidade de os resultados deste ensaio terem relevncia
directa para a proteco da sade humana ou dos animais ou do ambiente.
1.5.3. Teste-limite
O teste-limite utilizado, essencialmente, em situaes nas quais o analista tem informao indicativa do
material de ensaio no ser provavelmente txico, ou seja, s apresenta toxicidade acima das doses limite
regulamentadas. A informao sobre a toxicidade do material de ensaio pode ser obtida a partir de ensaios em
compostos semelhantes ou de ensaios de misturas ou produtos semelhantes, tendo em considerao a
identificao e percentagem dos componentes cuja relevncia toxicolgica conhecida. Nos casos em que a
informao sobre a sua toxicidade limitada ou inexistente ou nos casos em que previsvel que o material a
ensaiar seja txico, deve ser efectuado o estudo principal.
Pode ser efectuado um teste-limite a uma dose de 2 000 mg/kg de peso corporal com seis animais (trs animais
por etapa). Excepcionalmente, pode ser efectuado um teste-limite a uma dose de 5 000 mg/kg de peso corporal
com trs animais (consultar o anexo 2). Caso ocorra mortalidade na sequncia da administrao da substncia
de ensaio, pode ser necessrio efectuar ensaios posteriores com a dose inferior seguinte.
1.6. OBSERVAES
Aps a aplicao da dose, os animais devem ser observados individualmente, pelo menos uma vez durante os
primeiros trinta minutos e periodicamente durante as primeiras 24 horas, com especial cuidado nas primeiras
quatro horas. Em seguida, necessrio observar os animais diariamente, durante um perodo de 14 dias,
excepto se for necessrio retir-los do estudo e sacrific-los sem dor por motivo de bem-estar dos animais, ou
se forem encontrados mortos. No entanto, a durao do perodo de observao no deve ser estabelecida de
uma forma rgida, mas determinada com base nas reaces de toxicidade, velocidade do seu aparecimento e
durao do perodo de recuperao, que pode ser prolongado, se considerado necessrio. O momento em que
os sinais de toxicidade aparecem e desaparecem so importantes, sobretudo se os sinais de toxicidade tendem a
aparecer de uma forma retardada (12). Todas as observaes so registadas sistematicamente, mantendo-se uma
ficha individual para cada animal.
Sero necessrias observaes adicionais se os animais continuarem a apresentar sinais de toxicidade. As
observaes devem incluir alteraes na pele e plos, olhos, membranas mucosas, aparelho respiratrio,
aparelho circulatrio, sistema nervoso autnomo e central, assim como na actividade somatomotora e
comportamental. Devem ser observados com especial ateno os tremores, convulses, salivao, diarreia,
letargia, sono e coma. Devem ser tomados em considerao os princpios e critrios resumidos no Documento
de Orientao de Critrios Especficos sem Dor (9). Os animais que forem encontrados em estado moribundo e
os animais que apresentarem dores violentas ou sinais de sofrimento intenso e continuado devem ser
sacrificados sem dor. Quando os animais forem sacrificados a fim de evitar dor ou se forem encontrados
mortos, deve ser registado o momento da morte com o maior rigor possvel.
1.6.1. Peso corporal
O peso individual dos animais deve ser determinado imediatamente aps a administrao da substncia de
ensaio e, seguidamente, pelo menos uma vez por semana. Devem ser calculadas e registadas todas as variaes
de peso. No final do ensaio, os animais sobreviventes so pesados e, seguidamente, sacrificados sem dor.
1.6.2. Patologia
Todos os animais de ensaio (incluindo aqueles que morreram durante o ensaio ou que foram retirados do
ensaio por motivos de preservao do bem-estar do animal) devem ser sujeitos a uma autpsia pouco
pormenorizada. Devem ser registadas as alteraes patolgicas principais observadas em cada animal. Deve
tambm ser considerada a realizao de um exame microscpico dos rgos que mostrem sinais de patologia
grave em animais que sobreviveram, no mnimo, 24 horas aps a aplicao da dose inicial, j que este exame
pode fornecer informao til.
2. DADOS
Devem ser apresentados os dados individuais para cada animal. Adicionalmente, todos os dados devem ser
resumidos em forma tabular, mostrando, para cada grupo de ensaio, o nmero de animais utilizado, o nmero
de animais que apresentaram sinais de toxicidade, o nmero de animais que foram encontrados mortos durante
o ensaio ou que foram sacrificados a fim de evitar dor, o momento da morte de cada um dos animais, a
descrio e evoluo temporal dos efeitos de toxicidade e sua reversibilidade, assim como os resultados da
autpsia.
3. RELATRIO
3.1. Relatrio do ensaio
natureza fsica, pureza e propriedades fsico-qumicas relevantes (incluindo isomerizao);
dados relativos identificao qumica, incluindo o nmero CAS.
caso o excipiente no seja gua, uma justificao para a sua escolha.
Animais de ensaio:
estado microbiolgico do animal, caso seja conhecido;
nmero, idade e sexo dos animais (incluindo, quando necessrio, uma justificao para o uso de machos
em vez de fmeas);
provenincia, condies de alojamento, dieta, etc.
Condies do ensaio:
informao pormenorizada sobre a formulao da substncia, incluindo informao pormenorizada
sobre a forma fsica do material administrado;
informao pormenorizada sobre a administrao da substncia de ensaio, incluindo volume das doses e
o momento da aplicao;
informao pormenorizada sobre a qualidade dos alimentos e da gua (incluindo tipo e origem da dieta,
origem da gua);
justificao para a escolha da dose inicial.
Resultados:
tabela dos dados de resposta e da dose para cada animal (ou seja, animais que apresentaram sinais de
toxicidade, incluindo mortalidade, natureza, gravidade e durao dos efeitos);
tabela com indicao do peso corporal e suas variaes;
pesos individuais de animais no dia em que aplicada a dose, uma vez por semana no restante perodo e
na altura da sua morte ou sacrifcio;
data e momento da morte, no caso de ocorrncia de morte antes do sacrifcio previsto;
evoluo temporal do aparecimento de sintomas de toxicidade e sua reversibilidade para cada animal;
resultados da autpsia e resultados histopatolgicos para cada animal, caso se encontrem disponveis.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Roll R., Hfer-Bosse Th. And Kayser D., (1986) New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals.
Toxicol. Lett., Suppl. 31, p. 86.
(2) Roll R., Riebschlger M., Mischke U. and Kayser D., (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten
Toxizitt von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, p. 336-341.
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E., (1994) The Biometric Evaluation of the
Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, p. 559-610.
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E., (1995) The Biometric Evaluation of the OECD Modified
Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 729-734.
(5) Diener W., and Schlede E., (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC
50
Tests. ALTEX 16,
p. 129-134.
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D., (1992) A National Validation Study of the Acute-Toxic-
Class Method An Alternative to the LD
50
Test. Arch. Toxicol. 66, p. 455-470.
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D., (1994) The International Validation Study of the Acute-
-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 659-670.
(8) OECD, (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety
Monograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris.
(9) OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as
Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and
Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19.
(10) OECD, (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And
Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals
Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11. [http://
/webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].
(11) Lipnick R. L., Cotruvo, J. A., Hill R. N., Bruce R. D., Stitzel K. A., Walker A. P., Chu I.; Goddard M, Segal L.,
Springer J. A. and Myers R. C., (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD
50
, and Fixed
Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, p. 223-231.
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes., (1994) Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of
Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press Ltd., New York, USA.
ANEXO 1
PROCEDIMENTO A SEGUIR PARA CADA UMA DAS DOSES INICIAIS
CONSIDERAES GERAIS
Os esquemas de ensaio, descritos no presente anexo, descrevem esquematicamente o procedimento a seguir para cada dose
inicial.
Anexo 1a: a dose inicial de 5 mg/kg p.c.
Anexo 1b: a dose inicial de 50 mg/kg p.c.
Anexo 1c: a dose inicial de 300 mg/kg p.c.
Anexo 1d: a dose inicial de 2 000 mg/kg p.c.
Consoante o nmero de animais sacrificados sem dor ou mortos, o procedimento de ensaio segue as setas respectivas.
ANEXO 1
A PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 5 MG/KG DE PESO CORPORAL
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ANEXO 1 B
PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 50 MG/KG DE PESO CORPORAL
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ANEXO 1 C
PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 300 MG/KG DE PESO CORPORAL
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ANEXO 1 D
PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 2 000 MG/KG DE PESO CORPORAL
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ANEXO 2
CRITRIOS PARA A CLASSIFICAO DE SUBSTNCIAS DE ENSAIO COM VALORES PREVISVEIS DE DL
50
SUPERIORES A 2 000 MG/KG SEM NECESSIDADE DE EFECTUAR ENSAIO
Os critrios para a Categoria de Perigosidade 5 destinam-se a permitir a identificao de substncias de ensaio que
representam um perigo de toxicidade aguda relativamente baixo, mas que, em certas circunstncias, podem representar
perigo para populaes vulnerveis. previsvel que tais substncias apresentem valores de DL
50
por via oral ou drmica na
gama de 2 000-5 000 mg/kg ou dose equivalente para outras vias. As substncias de ensaio podem ser classificadas na
categoria de perigosidade definida por: 2 000 mg/kg < DL
50
< 5 000 mg/kg (Categoria 5 do GHS) nos seguintes casos:
a) se classificadas nesta categoria por qualquer dos esquemas de ensaio do anexo 1a-1d, baseados nas incidncias de
mortalidade;
b) se existir prova fivel indicativa de que os valores de DL
50
se encontram na gama correspondente Categoria 5 ou se
outros estudos em animais ou sobre efeitos de toxicidade em seres humanos forem indicativos de preocupao
acentuada em relao salvaguarda da sade humana;
c) atravs de extrapolao, estimativa ou medio de dados, desde que no seja garantida a atribuio a uma classe mais
perigosa, e
quando existe informao fivel indicativa de efeitos de toxicidade significativos em seres humanos, ou
quando no registada mortalidade nos ensaios por via oral at doses correspondentes aos valores para a
Categoria 4, ou
quando o perito de opinio de que no se verificam sintomas clnicos de toxicidade significativos para ensaios
at doses com valores correspondentes Categoria 4, com excepo de diarreia, ereco pilosa ou m aparncia,
ou
nos casos em que o perito confirme a existncia de informao fivel, proveniente de outros estudos em animais
que seja indicativa da existncia de potenciais efeitos agudos significativos.
ENSAIOS COM DOSES SUPERIORES A 2 000 MG/KG
Devido ao reconhecimento da necessidade de proteger o bem-estar dos animais, os ensaios de animais na Categoria 5
(5 000 mg/kg) so desencorajados e s devem ser considerados no caso de ser muito provvel que os resultados desse ensaio
tenham especial relevncia para a proteco da sade humana ou animal (10). No devem ser efectuados ensaios a doses
superiores.
Quando necessrio efectuar o ensaio com uma dose de 5 000 mg/kg, s necessria uma etapa (ou seja, trs animais). Se o
primeiro animal tratado morre, o ensaio prossegue a uma dose de 2 000 mg/kg, em conformidade com os fluxogramas do
anexo 1. Se o primeiro animal sobrevive, so tratados dois outros animais. Se somente um dos trs animais morrer, de
prever que o valor de DL
50
seja superior a 5 000 mg/kg. Se ambos os animais morrerem, o ensaio prossegue com uma dose
de 2 000 mg/kg.
ANEXO 3
MTODO DE ENSAIO B.l.tris: Orientaes sobre a classificao em conformidade com o esquema transitrio da
UE em vigor at implementao total do Sistema de Classificao Harmonizado a Nvel Mundial (GHS) [obtido
da referncia (8)]
B.2. TOXICIDADE AGUDA (INALAO)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
til possuir informaes preliminares sobre a distribuio granulomtrica das partculas, presso de vapor,
ponto de fuso, ponto de ebulio, ponto de inflamao e explosividade (se aplicvel) da substncia de ensaio.
Ver tambm a Introduo Geral, parte B (ponto A).
1.2. DEFINIES
Ver Introduo Geral, parte B (ponto B).
Nenhuma.
Vrios grupos de animais de experincia so expostos, durante um perodo determinado, a concentraes
diferentes de substncias a testar razo de uma concentrao por grupo. Subsequentemente, procede-se
observao dos efeitos e das mortes ocorridas. Os animais que morrem durante o ensaio so submetidos a
autpsia e no fim do ensaio os animais sobreviventes so tambm submetidos a autpsia.
Pode ser necessrio sacrificar os animais que apresentem manifestaes graves e permanentes de angstia e dor.
No se deve dosear as substncias de ensaio de uma forma que se saiba provocar dor acentuada e angstia
devido s suas propriedades corrosivas ou irritantes.
Nenhum.
1.6.1. Preparativos
Os animais so mantidos sob as condies de alojamento e alimentao experimentais durante pelo menos
cinco dias antes do ensaio. Antes do ensaio procede-se a uma escolha aleatria de animais adultos jovens e
saudveis que so distribudos por grupos de tratamento. No necessrio submet-los a uma exposio
simulada a no ser que tal facto seja indicado pelo tipo de aparelho de exposio que se utiliza.
Pode ser necessrio micronizar as substncias de ensaio slidas no sentido de se conseguir partculas com
dimenses apropriadas.
Sempre que necessrio pode adicionar-se substncia de ensaio um veculo adequado para ajudar a obter uma
concentrao adequada da substncia de ensaio na atmosfera e dever utilizar-se ento um grupo de controlo
tratado com veculo. No caso de se utilizar um veculo ou outros aditivos para facilitar a administrao da dose,
necessrio fazer a sua seleco entre os que no produzem efeitos txicos. Pode recorrer-se a dados histricos
se for apropriado.
1.6.2.1. Animais de experincia
Salvo no caso de haver contra-indicaes, o rato constitui a espcie preferencial. Devem utilizar-se as estirpes
vulgarmente utilizadas em laboratrio. Para cada sexo, no incio do ensaio, o intervalo de variao do peso para
os animais utilizados no dever exceder 20 % do valor mdio apropriado.
1.6.2.2. Nmero e sexo
Utilizam-se pelo menos 10 roedores (cinco fmeas e cinco machos) para cada nvel de concentrao. As fmeas
devem ser nulparas e no grvidas.
Nota: Nos ensaios de toxicidade aguda com animais de uma ordem superior dos roedores deve levar-se em
considerao a possibilidade de utilizar um menor nmero de animais. As doses devero ser seleccionadas
cuidadosamente e devero ser feitos todos os esforos possveis para no exceder as doses moderadamente
txicas. Nestes ensaios deve evitar-se a administrao de doses letais da substncia de ensaio.
1.6.2.3. Concentraes de exposio
Estas devem ser em nmero suficiente, pelo menos trs, e adequadamente espaadas para originarem grupos de
ensaio com uma diversidade de efeitos txicos e de taxas de mortalidade. Os dados devero ser suficientes para
permitirem traar uma curva dose/resposta e, sempre que possvel, uma determinao aceitvel do valor CL
50.
1.6.2.4. Teste limite
Se a exposio de cinco machos e cinco fmeas a uma concentrao de 20 mg/l de um gs ou 1 mg/l de um
aerossol ou de partculas, durante quatro horas (ou, nos casos em que tal no seja possvel devido s
propriedades fsico-qumicas, incluindo propriedades explosivas, da substncia testada, mxima concentrao
que seja possvel utilizar) no provocar a morte a qualquer animal num prazo de 14 dias, pode considerar-se
desnecessrio prosseguir os testes.
1.6.2.5. Tempo de exposio
O perodo de exposio deve ser de quatro horas.
Os animais devero ser expostos substncia a testar por meio de um dispositivo de inalao concebido de
forma a conseguir-se um fluxo de ar contnuo que assegurar pelo menos 12 renovaes de ar por hora e que
garanta uma concentrao de oxignio apropriada e uma distribuio uniforme do produto a testar no ar. No
caso de se utilizar uma cmara, essa ser concebida de maneira a obter-se uma superlotao mnima dos
animais e uma exposio mxima da substncia de ensaio. Como regra geral, para se assegurar a estabilidade da
atmosfera na cmara, o volume total dos animais de experincia no dever ultrapassar 5 % do volume da
cmara de ensaio. Pode tambm recorrer-se a um sistema de exposio oronasal, de cabea apenas ou de corpo
inteiro em cmara individual; os dois primeiros tipos de exposio permitem reduzir a penetrao por outras
vias.
1.6.2.7. Perodo de observao
O perodo de observao deve ser de, pelo menos, 14 dias. Contudo, o perodo de durao da observao no
deve ser fixo rigidamente. Deve ser determinado pelas reaces txicas, o momento de aparecimento de
sintomas e a durao do perodo de recuperao; em consequncia, pode ser prolongado quando se considerar
necessrio. O momento em que as manifestaes de toxicidade aparecem e desaparecem e o momento da
morte so importantes, especialmente se existir uma tendncia para retardar as mortes.
1.6.3. Procedimento
Imediatamente antes da exposio, os animais so pesados e depois so expostos concentrao de ensaio no
aparelho especificado durante um perodo de quatro horas, aps equilbrio da concentrao na cmara de
ensaio. O tempo para se estabelecer o equilbrio deve ser curto. A temperatura de ensaio deve ser mantida a
22
o
C 3
o
C. Em condies ideais a humidade relativa dever ser mantida entre 30 % e 70 %, mas em alguns
casos (por exemplo, em ensaios de alguns aerossis) tal pode ser impraticvel. A manuteno de uma presso
ligeiramente negativa no interior da cmara de ensaio ( 5 mm de gua) evitar a fuga da substncia de ensaio
para o meio envolvente. Durante o perodo de exposio no haver fornecimento de alimentos nem de gua.
Devem ser utilizados sistemas adequados para gerar e monitorizar a atmosfera de ensaio. O sistema deve
garantir que se atinja to rapidamente quanto possvel condies de exposio estveis. A cmara de ensaio
dever ser concebida e utilizada de tal modo que se mantenha no seu interior uma distribuio homognea da
atmosfera de ensaio.
Dever ser feita a medio ou monitorizao de:
a) dbito de ar (permanentemente);
b) concentrao real da substncia a testar medida na zona de respirao, pelo menos trs vezes durante a
exposio (algumas atmosferas, por exemplo aerossis em concentraes elevadas, podem necessitar de
uma monitorizao mais frequente). Durante o perodo de exposio diria a concentrao no variar
alm de + 15 % do valor mdio. Contudo, no caso de alguns aerossis esta preciso pode no ser possvel
e uma variao maior poder ento ser aceitvel. No caso dos aerossis, efectuar-se- uma anlise
granulomtrica das partculas tantas vezes quantas forem necessrias (pelo menos uma vez por grupo de
ensaio);
c) temperatura e humidade, continuamente, se for possvel.
Durante e aps a exposio s concentraes so feitas observaes, que devem ser registadas sistematicamente;
so feitas fichas individuais para cada animal. As observaes devero ser efectuadas com frequncia regular
durante o primeiro dia. Deve efectuar-se um exame clnico cuidadoso pelo menos uma vez durante cada dia de
trabalho, e devero ser efectuadas outras observaes diariamente tomando-se aces apropriadas para
minimizar as perdas de animais submetidos a estudo, por exemplo, efectuar-se- a autpsia ou a refrigerao
dos animais encontrados mortos e efectuar-se- o isolamento ou o sacrifcio dos animais fracos ou
moribundos.
As observaes devero incluir as modificaes do plo e da pele, dos olhos e das mucosas, do aparelho
respiratrio, do aparelho circulatrio, do sistema nervoso autnomo e central, bem como a actividade
somatomotora e do comportamento. Deve prestar-se particular ateno observao de tremores, convulses,
salivao, diarreia, letargia, sono e coma. O momento da morte deve ser registado com uma exactido to
grande quanto possvel. O peso de cada animal deve ser determinado semanalmente aps a exposio e no
momento da morte.
Os animais que morrem durante o ensaio e os sobreviventes no fim do ensaio so submetidos a autpsia com
particular referncia para quaisquer modificaes no tracto respiratrio superior e inferior. Devero ser
registadas todas as modificaes patolgicas. Sempre que for aconselhvel devero ser preparadas amostras dos
tecidos para exame histopatolgico.
2. RESULTADOS
Os resultados devero ser resumidos em quadros indicando-se para cada grupo de experincia o nmero de
animais no incio do teste, o momento da morte de cada animal, o nmero de animais que exibem outras
manifestaes de toxicidade, a descrio dos efeitos txicos e os resultados da autpsia. As variaes de peso
devero ser calculadas e registadas quando o perodo de sobrevivncia exceder um dia. Procede-se ao registo
dos animais que tiverem de ser sacrificados devido dor e angstia associadas substncia, procedendo-se de
igual modo para as mortes associadas ao composto. O valor CL
50
pode ser determinado por um mtodo
reconhecido. A avaliao dos resultados dever incluir a relao, se existir, entre a exposio dos animais
substncia de ensaio e a incidncia e gravidade de todas as anomalias, incluindo as anomalias de
comportamento e clnicas, as leses graves, as modificaes do peso do corpo, a mortalidade e quaisquer
outros efeitos toxicolgicos.
3. RELATRIO
espcies, estirpe, origem, condies ambientais, dieta, etc.;
condies de ensaio: descrio do aparelho de exposio incluindo projecto, tipo, dimenses, fonte de ar,
sistema para gerar aerossis, mtodo de condicionamento do ar e mtodo para alojar animais na cmara
de ensaio quando esta utilizada. Deve fazer-se uma descrio do equipamento para a medio da
temperatura, da humidade e das concentraes em aerossol e da distribuio granulomtrica.
Resultados sobre a exposio
Estes resultados devero ser agrupados em quadros e apresentados com valores mdios e com uma medio de
variabilidade (por exemplo, desvio-padro) e se possvel devero conter:
a) dbitos de ar atravs do equipamento de inalao;
b) temperatura e humidade do ar;
c) concentraes nominais (quantidade total da substncia de ensaio fornecida ao equipamento de inalao
dividida pelo volume de ar);
d) natureza do veculo, se for utilizado;
e) concentraes reais na zona de respirao;
f) dimetro aerodinmico mdio de massa (DAMM) e desvio-padro geomtrico (DPG);
g) perodo de equilbrio;
h) perodo de exposio:
apresentao de um quadro com os dados de resposta por sexo e por nvel de exposio (isto ,
nmero de animais que morreram ou que foram sacrificados durante o ensaio; nmero de animais
que apresentam manifestaes de toxicidade; nmero de animais expostos),
momento da morte durante ou aps a exposio, razes e critrios utilizados para o sacrifcio dos
animais,
todas as observaes,
valor CL
50
determinado para cada sexo no fim do perodo de observao (com especificao do
mtodo de clculo),
intervalo de confiana a 95 % para o valor CL
50
(no caso de este poder ser obtido),
curva de dose/mortalidade e seu declive (sempre que permitido pelo mtodo de determinao),
resultados da autpsia,
resultados das observaes histopatolgicas,
discusso dos resultados (dever prestar-se particular ateno ao efeito que o sacrifcio de animais
durante o ensaio pode ter sobre o valor CL
50
calculado),
interpretao dos resultados.
3.2. AVALIAO E INTERPRETAO
Ver Introduo Geral, parte B (ponto D).
4. REFERNCIAS
Ver Introduo Geral, parte B (ponto E).
B.3. TOXICIDADE AGUDA (DRMICA)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver Introduo Geral, parte B (ponto A).
1.2. DEFINIO
Nenhumas.
Aplica-se a substncia de ensaio sobre a pele de diversos grupos de animais de experincia, em doses graduadas,
utilizando-se uma dose por grupo. Subsequentemente, procede-se observao dos efeitos e das mortes
ocorridas. Os animais que morrem durante o ensaio so submetidos a autpsia e no fim do ensaio os animais
sobreviventes so tambm submetidos a autpsia.
Pode ser necessrio sacrificar os animais que apresentem manifestaes graves e permanentes de angstia e dor.
No se deve dosear as substncias de ensaio de uma forma que se saiba provocar dor acentuada e angstia
devido s suas propriedades corrosivas ou irritantes.
Nenhum.
1.6.1. Preparativos
Os animais so mantidos nas suas gaiolas sob condies de alimentao e alojamento experimentais durante
pelo menos cinco dias antes da experincia. Antes do ensaio os animais adultos jovens e saudveis so
seleccionados aleatoriamente e distribudos por grupos de tratamento. Aproximadamente 24 horas antes do
ensaio deve remover-se o plo da regio dorsal dos animais, tosquiando-o ou rapando-o. Ao tosquiar ou ao
rapar o plo necessrio tomar precaues para evitar leses da pele que possam alterar a sua permeabilidade.
A rea destinada aplicao da substncia de ensaio no poder ser inferior a 10 % da superfcie corporal.
Sempre que se procede ao ensaio de substncias slidas, as quais podem ser pulverizadas quando necessrio, a
substncia de ensaio deve ser humedecida com gua ou com um veculo apropriado para garantir um bom
contacto com a pele. No caso de se utilizar um veculo, deve tomar-se em considerao a influncia desse
veculo relativamente penetrao da substncia de ensaio na pele. Geralmente utilizam-se as substncias de
ensaio lquidas no diludas.
Pode ser utilizado o rato ou o coelho. Podem ser utilizadas outras espcies sendo necessrio justificar a sua
utilizao. Devem utilizar-se as estirpes vulgarmente utilizadas em laboratrio. Para cada sexo, no incio do
ensaio, o intervalo de variao do peso para os animais utilizados no dever exceder 20 % do valor mdio
apropriado.
Utilizam-se pelo menos cinco animais para cada dose. Devem ser todos do mesmo sexo. No caso de se utilizar
fmeas estas devem ser nulparas e no devem estar grvidas. No caso de existir informao disponvel
demonstrando que um dos sexos nitidamente mais sensvel, deve fazer-se a administrao das doses aos
animais desse sexo.
Nota: Nos ensaios de toxicidade aguda com animais de uma ordem superior dos roedores deve levar-se em
considerao a possibilidade de utilizar um menor nmero de animais. As doses devero ser seleccionadas
cuidadosamente e devero ser feitos todos os esforos possveis para no exceder as doses moderadamente
txicas. Nestes ensaios deve evitar-se a administrao de doses letais da substncia de ensaio.
1.6.2.3. Doses
Estas devem ser em nmero suficiente, pelo menos trs, e adequadamente espaadas para originarem grupos de
ensaio com uma diversidade de efeitos txicos e de taxas de mortalidade. Ao tomar-se a deciso sobre as doses
deve levar-se em considerao quaisquer efeitos irritantes ou corrosivos. Os dados devero ser suficientes para
permitirem traar uma curva dose/resposta e, sempre que possvel, uma determinao aceitvel do valor DL
50
.
1.6.2.4. Teste limite
Pode efectuar-se um teste limite com uma dose de pelo menos 2 000 mg/kg de peso do corpo num grupo de
cinco machos e de cinco fmeas utilizando os procedimentos anteriormente descritos. No caso de se observar
mortalidade associada ao composto necessrio considerar a hiptese de realizar um estudo completo.
O perodo de observao deve ser de pelo menos 14 dias. Contudo o perodo de durao da observao no
deve ser fixo rigidamente. Deve ser determinado pelas reaces txicas, o momento de aparecimento de
sintomas e a durao do perodo de recuperao; em consequncia, pode ser prolongado quando se considerar
necessrio. O momento em que as manifestaes de toxicidade aparecem e desaparecem e o momento da
morte so importantes, especialmente se existir uma tendncia para retardar as mortes.
1.6.3. Procedimento
Os animais sero colocados em gaiolas individuais. A substncia de ensaio ser aplicada uniformemente numa
rea aproximadamente equivalente a 10 % da superfcie total do corpo. No caso de substncias altamente
txicas, a superfcie a utilizar poder ser menor mas a camada da substncia dever ser o mais fina e uniforme
possvel.
A substncia de ensaio deve ser mantida em contacto com a pele por meio de uma gaze porosa e de um
adesivo antialrgico, durante um perodo de exposio de 24 horas. A superfcie tratada ser por sua vez
convenientemente coberta de maneira a manter no seu lugar a gaze e a substncia de ensaio e de modo a evitar
que os animais ingiram a substncia. Podem ser utilizados aparelhos de conteno para evitar a ingesto da
substncia mas no se recomenda a imobilizao completa,
No fim do perodo de exposio necessrio eliminar todos os resduos da substncia, se possvel, utilizando
gua ou qualquer outro meio adequado para limpeza da pele.
As observaes devem ser feitas e registadas sistematicamente. So feitas fichas individuais para cada animal. As
observaes devero ser efectuadas com frequncia regular durante o primeiro dia. Deve efectuar-se um exame
clnico cuidadoso pelo menos uma vez durante cada dia de trabalho, e devero ser efectuadas outras
observaes diariamente tomando-se aces apropriadas para minimizar as perdas de animais submetidos a
estudo, por exemplo, efectuar-se- a autpsia ou a refrigerao dos animais encontrados mortos e efectuar-se-
o isolamento ou o sacrifcio dos animais fracos ou moribundos.
As observaes devero incluir as modificaes do plo, pele tratada, dos olhos e das mucosas, do aparelho
respiratrio, do aparelho circulatrio, do sistema nervoso autnomo e central, bem como a actividade
somatomotora e do comportamento. Deve prestar-se particular ateno observao de tremores, convulses,
salivao, diarreia, letargia, sono e coma. O momento da morte deve ser registado com uma exactido to
grande quanto possvel. Os animais que morrem durante o ensaio e os que sobrevivem at ao fim do ensaio so
submetidos a autpsia. Devero ser registadas todas as modificaes patolgicas. Sempre que for aconselhvel
devero ser preparadas amostras dos tecidos para exame histopatolgico.
Avaliao da toxicidade no outro sexo
Depois de se ter completado o estudo relativamente a um dos sexos, submete-se a ensaio pelo menos um grupo
de cinco animais do sexo oposto para se verificar se os animais desse sexo no so nitidamente mais sensveis
substncia de ensaio. Em circunstncias individuais pode justificar-se a utilizao de menos animais. No caso de
existir informao adequada disponvel suficiente para demonstrar que os animais do sexo testado so
nitidamente mais sensveis, dispensvel proceder a ensaios com animais do outro sexo.
2. RESULTADOS
Os resultados devero ser resumidos em quadros indicando-se para cada grupo de experincia o nmero de
animais no incio do teste, o momento da morte de cada animal, o nmero de animais que exibem outras
manifestaes de toxicidade, a descrio dos efeitos txicos e os resultados da autpsia. Os pesos de cada
animal devero ser determinados e registados imediatamente antes da administrao da substncia de ensaio,
decorrida uma semana e no momento da morte; as variaes de peso devero ser calculadas e registadas
quando o perodo de sobrevivncia exceder um dia. Procede-se ao registo dos animais que tiverem que ser
sacrificados devido dor e angstia provocados pela substncia procedendo-se de igual modo para as mortes
provocadas pela substncia. O valor DL
50
pode ser determinado por um mtodo reconhecido.
A avaliao dos resultados dever incluir a relao, se existir, entre a exposio dos animais substncia de
ensaio e a incidncia e gravidade de todas as anormalidades, incluindo as anomalias de comportamento e
clnicas, as leses graves, as modificaes do peso do corpo, a mortalidade e quaisquer outros efeitos
toxicolgicos.
3. RELATRIO
espcies, estirpe, origem, condies ambientais, dieta, etc.,
condies experimentais (incluindo o mtodo de limpeza da pele e tipo de gaze: oclusiva ou no
oclusiva),
nveis de dosagem (com veculo, no caso de este ser utilizado, e as concentraes),
sexo dos animais submetidos experincia,
quadros com os dados de resposta por sexo e por valores de dosagem (isto , nmero de animais que
morreram ou que foram sacrificados durante os ensaios, nmero de animais que apresentam
manifestaes de toxicidade, nmero de animais expostos),
momento da morte aps a administrao da dose, razes e critrios utilizados para o sacrifcio dos
animais,
todas as observaes,
valor DL
50
para o grupo do sexo submetido ao estudo completo ao longo do perodo de 14 dias
(especificando-se o mtodo de determinao),
intervalo de confiana a 95 % para o valor DL
50
(no caso de ser possvel obter esse valor),
curva dose/mortalidade e seu declive (no caso de isto ser possvel com o mtodo de determinao),
quaisquer resultados das observaes histopatolgicas,
resultados de qualquer ensaio efectuado sobre o outro sexo,
discusso dos resultados (deve prestar-se particular ateno ao efeito que o sacrifcio dos animais durante
o ensaio pode ter sobre o valor DL
50
calculado),
4. REFERNCIAS
B.4. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAO/CORROSO DRMICA
1. MTODO
O presente mtodo baseia-se na publicao OECD TG 404 (2002) (normas de ensaio da OCDE).
1.1. INTRODUO
Na preparao do presente mtodo optimizado foi dada especial ateno aos possveis melhoramentos atravs
da avaliao de toda a informao j existente sobre a substncia de ensaio, de modo a evitar testes
desnecessrios em animais de laboratrio e assim ter em considerao a problemtica da proteco dos
animais. O presente mtodo inclui a recomendao de se levar a cabo uma anlise da importncia das provas de
todos os dados relevantes existentes antes de se efectuar o ensaio in vivo descrito para irritao/corroso pela
substncia. No caso de no se encontrarem disponveis dados suficientes, estes podem ser obtidos atravs da
aplicao de ensaios sequenciais (1). A estratgia de ensaio recomendada inclui a execuo de ensaios in vitro
validados e aceites e fornecida como anexo ao presente mtodo. Alm disso, quando for apropriado,
recomenda-se a aplicao sucessiva (no simultnea) de trs pensos de ensaio ao animal no ensaio in vivo inicial.
Tendo em considerao o interesse cientfico e a proteco dos animais, no devem ser efectuados ensaios in
vivo at se proceder a uma avaliao de todos os dados disponveis relevantes potencial corrosibilidade/
/irritabilidade drmica de uma substncia mediante uma anlise de importncia das provas. Os dados devem
incluir resultados de estudos em humanos e/ou animais de laboratrio, provas de corrosibilidade/irritabilidade
de uma ou mais substncias estruturalmente relacionadas, ou de misturas dessas substncias, dados que
demonstrem elevada acidez ou alcalinidade da substncia (2) (3) e resultados de ensaios in vitro ou ex vivo
validados e aceites (4) (5) (5a). Esta anlise deve reduzir a necessidade de ensaios in vivo da corrosibilidade/
/irritabilidade drmica de substncias para as quais j existem dados suficientes provenientes de outros estudos
em relao a estes dois factores.
Junta-se em anexo ao presente mtodo uma estratgia de ensaio sequencial prefervel, que inclui a execuo de
ensaios validados e aceites in vitro ou ex vivo para irritao/corroso. A estratgia foi desenvolvida num grupo de
trabalho (workshop) da OCDE (6), no qual foi recomendada por unanimidade dos participantes, tendo sido
adoptada como estratgia de ensaio recomendada pelo sistema harmonizado a nvel mundial para a
classificao de substncias qumicas (GHS) (7). Apesar de esta estratgia de ensaio sequencial no ser parte
integrante do mtodo de ensaio B.4, recomenda-se que a mesma seja adoptada antes da realizao de ensaios in
vivo. No caso de novas substncias recomenda-se uma metodologia de ensaio por etapas para a obteno de
dados cientficos sobre a corrosibilidade/irritabilidade da substncia. No caso de substncias j existentes, mas
cujos dados insuficientes sobre irritao/corroso drmica so insuficientes, recomenda-se a adopo desta
estratgia para a obteno dos dados em falta. Caso se opte por uma estratgia ou procedimento de ensaio
diferente ou se decida no aplicar uma metodologia de ensaio por etapas, deve apresentar-se uma justificao
para a opo feita.
Um ensaio in vivo, apenas deve ser considerado caso no seja possvel determinar a corrosibilidade, ou a
irritabilidade, atravs da anlise de importncia das provas e de acordo com a estratgia de ensaio sequencial
(ver anexo).
1.2. DEFINIES
Irritao drmica: consiste na produo de danos reversveis na pele aps a aplicao da substncia de ensaio,
por um perodo no superior a quatro horas.
Corroso drmica: consiste na produo de danos irreversveis na pele por exemplo, necrose visvel atravs
da epiderme e que atinge a derme, aps a aplicao de uma substncia de ensaio por um perodo no superior a
quatro horas. As reaces corrosivas tpicas so lceras, sangramento, crostas ensanguentadas e, aps o perodo
de observao de 14 dias, empalidecimento devido descolorao da pele, reas alargadas de alopecia e
cicatrizes. Deve ser considerada uma anlise histopatolgica na avaliao de leses duvidosas.
A substncia de ensaio aplicada em dose nica na pele de um animal de experincia; as reas de pele no
tratadas do animal de experincia so utilizadas como controlo. O grau de irritao/corroso observado e
registado em intervalos determinados e detalhadamente descrito de modo a permitir uma avaliao completa
dos efeitos. A durao do estudo deve ser suficiente para avaliar a reversibilidade ou irreversibilidade dos efeitos
observados.
Os animais que apresentarem sinais de se encontrarem em grave perigo e/ou apresentarem sinais de dor
durante qualquer das etapas do ensaio devem ser abatidos e a substncia deve ser classificada de acordo com
estas observaes. Os critrios para a deciso de abater animais moribundos e animais em grave sofrimento
podem ser consultados na referncia (8).
1.4.1. Preparao do ensaio in vivo
1.4.1.1. Seleco de espcies animais
O coelho albino o animal de laboratrio mais adequado, devendo ser usados coelhos jovens adultos
saudveis. A utilizao de outras espcies deve ser justificada.
1.4.1.2. Preparao dos animais
Aproximadamente 24 horas antes do ensaio, o plo deve ser removido por corte curto da rea dorsal do tronco
dos animais. Deve ter-se o cuidado de no ferir a pele do animal e s devem ser usados animais com pele
saudvel e intacta.
Algumas estirpes de coelhos tm tufos densos de plo, que so mais proeminentes em certas pocas do ano.
Estas reas de crescimento denso de plo no devem ser utilizadas como local de ensaio.
1.4.1.3. Condies de alojamento e alimentao
Os animais devem ser alojados individualmente. A temperatura do biotrio para os coelhos deve ser de 20
o
C
( 3
o
C). Embora a humidade relativa deva ser de pelo menos 30 % e de preferncia no exceder os 70 %,
excepto durante o perodo de limpezas, o valor pretendido deve ser de 50 %-60 %. A iluminao deve ser
artificial, com uma sequncia de 12 horas de luz seguida de uma de 12 horas de escurido. Na alimentao,
podem ser utilizadas dietas convencionais de laboratrio e deve ser fornecida gua de beber sem restries.
1.4.2. Protocolo de ensaio
1.4.2.1. Aplicao da substncia de ensaio
A substncia de ensaio deve ser aplicada numa pequena rea de pele (aproximadamente 6 cm
2
) e coberta com
um penso de gaze, colado com fita adesiva no irritante. Nos casos em que no possvel aplicao directa (por
exemplo, lquidos e algumas pastas), a substncia de ensaio deve ser aplicada num penso de gaze, que , por sua
vez, aplicado pele. Durante o perodo de exposio, o penso deve estar em contacto com a pele de uma forma
ligeiramente solta atravs de uma ligadura semioclusiva adequada. Se a substncia de ensaio for aplicada num
penso, este deve ser mantido sobre a pele de modo a assegurar um bom contacto e uma distribuio uniforme
da substncia na pele. Deve ser evitado o acesso do animal ao penso e a ingesto ou inalao da substncia de
ensaio.
As substncias de ensaio lquidas so geralmente utilizadas sem diluio. Quando se ensaiam slidos (que
podem ser pulverizados, caso tal seja considerado necessrio), a substncia de ensaio deve ser humedecida com
a menor quantidade de gua (ou, se necessrio, com outro excipiente adequado) suficiente para assegurar um
bom contacto com a pele. No caso de serem utilizados excipientes que no gua, a influncia potencial do
excipiente na irritao da pele pela substncia de ensaio deve ser mnima ou nula.
No final do perodo de exposio, que normalmente de quatro horas, a substncia de ensaio residual deve ser
removida, caso tal seja praticvel, utilizando gua ou um solvente apropriado, que no altere a resposta ou a
integridade da epiderme.
1.4.2.2. Nvel de dosagem
Aplica-se ao local de ensaio uma dose de 0,5 ml de lquido ou de 0,5 g de slido ou pasta.
1.4.2.3. Ensaio inicial (ensaio in vivo de irritao/corroso drmica utilizando um animal)
Recomenda-se vivamente que o ensaio in vivo seja efectuado inicialmente utilizando apenas um animal,
sobretudo quando se suspeita que a substncia potencialmente corrosiva. Tal procedimento est em
conformidade com a estratgia de ensaio sequencial (ver anexo 1).
No caso de uma substncia ter sido considerada corrosiva com base numa anlise de importncia das provas,
no so necessrios ensaios adicionais em animais. Para a maior parte das substncias que se suspeite serem
corrosivas, no so normalmente necessrios ensaios in vivo adicionais. No entanto, nos casos em que, devido a
insuficincia de provas, se considere necessria a obteno de dados adicionais, pode ser efectuado um nmero
restrito de ensaios em animais utilizando a seguinte metodologia: aplicao sequencial de at trs pensos de
ensaio ao animal. O primeiro penso removido aps trs minutos. Caso no se observe qualquer reaco grave
na pele, aplica-se um segundo penso, que removido ao fim de uma hora. Se nesta etapa as observaes
indicarem que se pode aumentar o tempo de exposio para quatro horas em condies no agressivas para o
animal, aplica-se um terceiro penso, que removido aps quatro horas, sendo a resposta devidamente
graduada.
Caso seja observado um efeito corrosivo aps qualquer das trs exposies sequenciais, o ensaio
imediatamente finalizado. Caso no se observe qualquer efeito corrosivo aps a remoo do ltimo penso, o
animal observado durante 14 dias, excepto se desenvolver corroso antes do final desse perodo.
Nos casos em que a substncia de ensaio no seja susceptvel de provocar corroso, mas que possa ser irritante,
deve ser aplicado um nico penso a um animal durante quatro horas.
1.4.2.4. Ensaio de confirmao (ensaio in vivo de irritao drmica com animais adicionais)
Se no for observado um efeito corrosivo no ensaio inicial, a resposta irritante ou negativa deve ser confirmada
utilizando at dois animais adicionais, cada um com um penso e por um perodo de exposio de quatro horas.
Se for observado um efeito irritante no ensaio inicial, o ensaio de confirmao pode ser efectuado de uma
forma sequencial ou atravs da exposio simultnea de dois animais adicionais. No caso excepcional de no
ser efectuado um ensaio inicial, podem tratar-se dois ou trs animais com um penso nico, que removido
quatro horas aps a aplicao. No caso de se utilizarem dois animais e ambos apresentarem a mesma resposta,
no necessrio efectuar mais ensaios. Caso contrrio, o terceiro animal igualmente ensaiado. Pode ser
necessria a utilizao de animais adicionais para confirmar respostas equvocas.
O perodo de observao deve ter uma durao suficiente para uma avaliao completa da reversibilidade dos
efeitos observados. No entanto, a experincia deve ser interrompida em qualquer altura caso o animal apresente
sintomas continuados de dor intensa ou de se encontrar em situao de perigo. Para a determinao da
reversibilidade dos efeitos, os animais devem ser observados durante 14 dias aps a remoo dos pensos. No
caso de se observar reversibilidade antes do fim do perodo de 14 dias, deve interromper-se a experincia.
1.4.2.6. Observaes clnicas e graduao das reaces da pele
Todos os animais devem ser examinados para sintomas de eritema e edema, sendo as respostas avaliadas aos 60
minutos e s 24, 48 e 72 horas aps a remoo do penso. No ensaio inicial com um animal, o local de ensaio
igualmente examinado imediatamente aps a remoo do penso. As reaces drmicas so graduadas e
registadas de acordo com a graduao da tabela infra. Caso ocorram danos na pele que no possam ser
identificados como irritao ou corroso aps 72 horas, pode ser necessrio efectuar observaes at ao dia 14
para determinar a reversibilidade dos efeitos. Alm da observao de irritao, todos os efeitos txicos locais,
tais como perda de gordura cutnea e quaisquer efeitos sistmicos adversos (por exemplo, efeitos em sintomas
de toxicidade e efeitos no peso corporal), devem ser descritos e registados pormenorizadamente. Poder ser
efectuado um exame histopatolgico para clarificar respostas equvocas.
A graduao das respostas drmicas necessariamente subjectiva. O pessoal que executa as observaes deve
ser treinado adequadamente no sistema de graduao utilizado (ver tabela infra) para se promover a
harmonizao da graduao da resposta drmica e auxiliar os laboratrios de ensaio e as pessoas envolvidas na
obteno e interpretao das observaes. Poder ser til a consulta de um guia ilustrado para graduao da
irritao drmica e outras leses (9).
2. DADOS
Os resultados do estudo devem ser resumidos sob a forma de tabela no relatrio final de ensaio e devem
abranger todos os itens descritos na seco 3.1.
2.2. ANLISE DOS RESULTADOS
Os resultados de irritao drmica devem ser avaliados conjuntamente com a natureza e a gravidade das leses
e a sua reversibilidade ou ausncia de reversibilidade. As respostas individuais no representam um padro
absoluto das propriedades irritantes do material, j que so tambm avaliados outros efeitos do material de
ensaio. Pelo contrrio, os resultados individuais devem ser encarados como valores de referncia, que
necessitam de ser avaliados conjuntamente com todas as outras observaes efectuadas durante o estudo.
Deve ser considerada a reversibilidade das leses drmicas na avaliao da resposta irritante. Nos casos em que
ocorrerem respostas como alopecia (rea limitada), hiperqueratose, hiperplasia e descamao persistentes no
final do perodo de 14 dias de observao, a substncia de ensaio deve ser considerada irritante.
3. RELATRIO
Fundamentao lgica para o ensaio in vivo: anlise de importncia das provas dos dados de ensaio
preexistentes, incluindo os resultados da estratgia de ensaio sequencial:
descrio dos dados relevantes disponveis de ensaios anteriores;
dados obtidos em cada etapa da estratgia de ensaio;
descrio dos ensaios in vitro efectuados, incluindo detalhes sobre o protocolo, resultados obtidos com
substncias de ensaio/referncia;
anlise de importncia das provas para a realizao do estudo in vivo.
dados de identificao (por exemplo, nmero CAS, origem, grau de pureza, impurezas conhecidas,
nmero de lote);
natureza fsica e propriedades fsico-qumicas (por exemplo, pH, volatilidade, solubilidade, estabilidade);
no caso de misturas, composio e percentagens relativas dos componentes.
Excipiente:
identificao, concentrao (quando apropriado), volume utilizado;
justificao para a escolha do excipiente.
Animais de ensaio:
espcie/estirpe utilizada, fundamentao lgica para a utilizao de outro tipo de animais que no
coelhos albinos;
nmero de animais de cada sexo;
peso individual dos animais no incio e no final do ensaio;
idade no incio do estudo;
origem dos animais, condies de alojamento, dieta, etc.
Condies do ensaio:
tcnica de preparao do local de aplicao do penso;
descrio pormenorizada dos materiais utilizados no penso e da tcnica de aplicao do penso;
descrio pormenorizada da preparao, aplicao e remoo da substncia de ensaio.
Resultados:
tabelas com a classificao das respostas de irritao/corroso para cada animal em cada observao;
descrio de todas as leses observadas;
descrio pormenorizada da natureza e grau da irritao ou corroso observadas e de quaisquer
observaes histopatolgicas;
descrio de quaisquer outros efeitos adversos locais (por exemplo, perda de gordura cutnea) e efeitos
sistmicos, alm da irritao ou corroso drmica.
4. REFERNCIAS
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani,
A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The
Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8.
ATLA 23, p. 410-429.
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin
of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicology In
Vitro, 2, p. 19-26.
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998)
Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, p. 709-720.
(4) ECETOC (1990) Monograph No 15, Skin Irritation, European Chemical Industry, Ecology and
Toxicology Centre, Brussels.
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G.
and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2.
Results and evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.
(5a) Mtodo de Ensaio B.40. Corroso drmica.
(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on
Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held
in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd1.org/ehs/test/background.htm).
(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and
Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals
Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/
/HCL6.htm).
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as
Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health
and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos.
htm).
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office
of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.
[Disponvel no Secretariado da OCDE.]
Tabela I
GRADUAO DE REACES DRMICAS
Formao de eritema e escara
Ausncia de eritema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
Eritema muito ligeiro (fracamente discernvel) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Eritema bem definido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Eritema moderado a grave . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Eritema grave (vermelhido cor de carne) e formao de escara que impede a graduao do eritema 4
Mximo possvel: 4
Formao de edema
Ausncia de edema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
Edema muito ligeiro (fracamente discernvel) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Edema ligeiro (bordos da rea bem definidos por elevao delineada) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Edema moderado (com uma elevao de aproximadamente 1 mm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Edema grave (com uma elevao superior a 1 mm e excedendo a rea de exposio) . . . . . . . . . . . 4
Mximo possvel: 4
Poder ser efectuado um exame histopatolgico para clarificar respostas equvocas.
ANEXO
Uma estratgia de ensaio sequencial para a irritao e corroso drmica
CONSIDERAES GERAIS
No sentido de atender aos interesses quer cientficos, quer da proteco dos animais, torna-se importante evitar o uso
desnecessrio de animais e minimizar os ensaios que possam causar reaces graves em animais. Deve ser avaliada toda a
informao sobre a substncia que seja relevante para a sua potencial capacidade irritante/corrosibilidade drmica antes de
se considerarem os ensaios in vivo. possvel que existam j dados suficientes para classificar a substncia de ensaio segundo
o seu potencial irritante ou corrosivo drmico, sem necessidade de recorrer a ensaios em animais de laboratrio. Assim, a
utilizao de uma anlise de importncia das provas e de uma estratgia de ensaio sequencial minimizar a necessidade de
ensaios in vivo, especialmente no caso de substncias com elevada probabilidade de produzirem reaces graves.
Recomenda-se a utilizao da anlise de importncia das provas para avaliar a informao existente sobre irritao e
corroso drmica de substncias, a fim de determinar a necessidade de se efectuarem estudos adicionais, diferentes dos
estudos drmicos in vivo, que sejam teis para caracterizar o referido potencial. No caso de serem necessrios estudos
adicionais, recomenda-se a utilizao de uma estratgia de ensaio sequencial para a obteno dos dados experimentais
relevantes. No caso de substncias para as quais no exista nenhuma histria de ensaios, deve ser utilizada a estratgia de
ensaio sequencial para a obteno dos dados necessrios para avaliar a sua irritao/corroso drmica. A estratgia de ensaio
descrita no presente anexo foi desenvolvida num grupo de trabalho (workshop) da OCDE (1). Foi subsequentemente
confirmada e ampliada no sistema harmonizado e integrado de classificao de perigos para a sade humana e efeitos
ambientais de substncias qumicas, tal como foi aprovado pela 28.
a
sesso conjunta do comit das substncias qumicas e
do grupo de trabalho de substncias qumicas, em Novembro de 1998 (2).
Apesar da presente estratgia de ensaio no fazer parte integrante do mtodo de ensaio B.4, ela expressa a metodologia
recomendada para a determinao das caractersticas de irritao/corroso drmica. Esta metodologia representa no s a
melhor prtica como tambm um ponto de referncia tico para o ensaio in vivo para irritao/corroso drmica. O mtodo
de ensaio fornece uma orientao para a realizao do ensaio in vivo e resume os factores que devem ser considerados antes
de ponderar a execuo deste ensaio. A estratgia fornece uma metodologia para a avaliao dos dados existentes sobre as
propriedades de irritao/corroso drmica de substncias de ensaio e uma metodologia em sries para a obteno de dados
relevantes sobre substncias para as quais sejam necessrios estudos adicionais ou no tenham sido efectuados quaisquer
estudos. Tambm se recomenda a realizao de ensaios in vitro ou ex vivo validados e aceites para o estudo de irritao/
/corroso drmica em circunstncias especficas.
DESCRIO DA ESTRATGIA DE AVALIAO E ENSAIO
Antes da realizao dos ensaios como parte da estratgia de ensaio sequencial (figura), deve ser avaliada toda a informao
disponvel de modo a determinar a necessidade de realizao de ensaios drmicos in vivo. Apesar de ser possvel obter
informao significativa a partir da avaliao de um s parmetro (por exemplo, pH extremo), deve ser avaliada a totalidade
da informao existente. Para uma deciso baseada na anlise da importncia das provas, devem ser avaliados todos os dados
relevantes sobre os efeitos da substncia em causa ou dos seus anlogos estruturais, e deve apresentar-se uma justificao
fundamentada para a deciso tomada. Deve dar-se especial relevncia aos dados existentes sobre a substncia relativamente a
humanos e animais e, em seguida, aos resultados dos ensaios in vitro ou ex vivo. Sempre que possvel, devem ser evitados
estudos in vivo de substncias corrosivas. Os factores considerados na estratgia de ensaio incluem:
Avaliao dos dados existentes sobre humanos e animais (etapa 1). Devem considerar-se em primeiro lugar os dados existentes
sobre humanos por exemplo, estudos clnicos e ocupacionais, relatrios de casos clnicos e/ou dados de ensaios em
animais como, por exemplo, dados obtidos em estudos de toxicidade de exposio drmica simples ou repetida j que
estes dados fornecem informao directamente relacionada com os efeitos na pele. As substncias que apresentem
capacidade irritante ou corrosiva conhecidas, assim como aquelas para as quais existem dados claros de no serem
corrosivas nem irritantes, no necessitam de ser ensaiadas em estudos in vivo.
Anlise de relaes estrutura-actividade (SAR) (etapa 2). Devem ser considerados os resultados de ensaios de substncias
qumicas estruturalmente semelhantes desde que se encontrem disponveis. No caso de existirem dados suficientes sobre
humanos e/ou animais relativos aos efeitos de substncias estruturalmente semelhantes, ou misturas deste tipo de
substncias, indicativos do seu potencial de irritao/corroso drmica, pode presumir-se que a substncia de ensaio em
avaliao produzir as mesmas respostas. Nestes casos, poder no ser necessrio proceder a ensaios da substncia de
ensaio. Os dados negativos obtidos de estudos de substncias estruturalmente semelhantes ou misturas dessas substncias
no constituem prova suficiente de no corrosibilidade/no irritabilidade da substncia segundo a estratgia de ensaio
sequencial. Devem ser utilizadas abordagens de SAR validadas e aceites para identificao do potencial de irritao e de
corroso drmica.
Propriedades fsico-qumicas e reactividade qumica (etapa 3). As substncias que apresentam um pH extremo, tal como 2,0 ou
11,5, podem ter efeitos locais fortes. Se o pH extremo servir como base de identificao da substncia como corrosiva
para a pele, a sua reserva cida/alcalina (ou poder tampo) deve ser tambm tida em considerao (3) (4). Se o poder tampo
indicar que a substncia pode no ser corrosiva para a pele, devem ser efectuados ensaios adicionais para confirmar esta
indicao, de preferncia utilizando ensaios in vitro ou ex vivo validados e aceites (ver etapas 5 e 6).
Toxicidade drmica (etapa 4). Caso se tenha provado que uma substncia qumica muito txica por via drmica, pode no ser
exequvel um estudo in vivo de irritao/corroso drmica por a quantidade de substncia de ensaio normalmente aplicada
poder exceder a dose muito txica, resultando consequentemente na morte ou em sofrimento grave dos animais. Alm
disso, pode no ser necessrio efectuar ensaios drmicos de irritao/corroso adicionais quando os estudos de toxicidade
drmica utilizando coelhos albinos tenham sido efectuados at um nvel de dosagem limite de 2 000 mg/kg de peso
corporal ou superior e no tenha sido observada qualquer irritao ou corroso drmica. Deve ter-se em conta uma srie de
consideraes aquando da avaliao da toxicidade drmica aguda em estudos efectuados anteriormente. Por exemplo, a
informao contida no relatrio sobre leses drmicas pode estar incompleta. Os ensaios e as observaes podem ter sido
efectuados noutra espcie que no o coelho, podendo as vrias espcies diferir grandemente na sensibilidade das respostas
apresentadas. A forma como a substncia de ensaio foi aplicada aos animais pode no ter sido adequada avaliao da
irritao/corroso da pele [por exemplo, diluio das substncias para ensaio da toxicidade drmica (5)]. No entanto, nos
casos em que os estudos de toxicidade drmica em coelhos foram projectados e efectuados correctamente, os resultados
negativos podem ser considerados prova suficiente de que a substncia no irritante nem corrosiva.
Resultados de ensaios in vitro ou ex vivo (etapas 5 e 6). No necessrio proceder a ensaios em animais com substncias que
tenham apresentado propriedades corrosivas ou de irritao grave num ensaio in vitro ou ex vivo validado e aceite (6) (7) que
tenha sido desenvolvido para avaliar especificamente estes efeitos. Pode considerar-se que tais substncias produziro efeitos
graves semelhantes in vivo.
Ensaio in vivo em coelhos (etapas 7 e 8). Caso seja tomada a deciso de efectuar um ensaio in vivo com base numa anlise da
importncia das provas, este deve comear por um ensaio inicial usando um animal. Se os resultados deste ensaio indicarem
que a substncia corrosiva para a pele, no devem ser efectuados outros ensaios. Se o ensaio inicial no revelar quaisquer
efeitos corrosivos, a resposta irritante ou negativa deve ser confirmada utilizando at dois animais adicionais com um
perodo de exposio de quatro horas. No caso de se observar um efeito irritante no ensaio inicial, o ensaio de confirmao
deve ser efectuado de uma forma sequencial ou atravs da exposio de dois animais adicionais simultaneamente.
REFERNCIAS
(1) OECD, (1996) Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD Workshop on Harmonization of Validation and
Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://
/www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
(2) OECD, (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of
Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on
Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Liebsch M., (1998) An Evaluation
of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, p. 709-720.
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H., (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of
Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxicology In Vitro, 2(1), p. 19-
-26.
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I., (1996) Animal, Human, and In Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation,
in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6,
Chapter 31, p. 411-436.
(6) Mtodo de Ensaio B.40.
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch,
M., (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by
the Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483524.
Figura
ESTRATGIA DE ENSAIO E AVALIAO PARA IRRITAO/CORROSO DRMICA
B.5. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAO/CORROSO OCULAR
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Na preparao do presente mtodo optimizado foi dada especial importncia aos possveis melhoramentos
resultantes da avaliao de toda a informao j existente sobre a substncia de ensaio, de modo a evitar ensaios
desnecessrios em animais de laboratrio e assim ter em considerao a problemtica da proteco dos
animais. O presente mtodo inclui a recomendao de se efectuar uma anlise da importncia das provas (1)
dos dados relevantes existentes antes de se efectuar o ensaio in vivo descrito para irritao/corroso ocular
aguda. No caso de no se encontrarem disponveis dados suficientes, recomenda-se a obteno desses dados
atravs da aplicao de ensaios sequenciais (2) (3). A estratgia de ensaio recomendada inclui a execuo de
ensaios in vitro validados e aceites e fornecida como anexo ao mtodo de ensaio. Alm disso, recomenda-se o
uso de um ensaio in vivo de irritao/corroso drmica para previso da corroso ocular antes de se considerar
um ensaio ocular in vivo.
Tendo em considerao o interesse cientfico e a proteco dos animais, no devem ser considerados ensaios in
vivo at se proceder a uma avaliao de todos os dados disponveis relevantes potencial corrosibilidade/
/capacidade irritante ocular de uma substncia para uma anlise da importncia das provas. Os dados devem
incluir provas de estudos existentes em humanos e/ou animais de laboratrio, provas de corrosibilidade/
/capacidade irritante de uma ou mais substncias estruturalmente relacionadas, ou de misturas dessas
substncias, dados que demonstrem elevada acidez ou alcalinidade da substncia (4) (5) e resultados de ensaios
in vitro ou ex vivo, validados e aceites, para corroso e irritao da pele (6) (6a). Estes estudos podem ter sido
efectuados previamente ou como resultado de uma anlise de importncia das provas.
Uma anlise deste tipo pode indicar, para algumas substncias, a necessidade de estudos in vivo do potencial de
irritao/corroso ocular da substncia. Em todos estes casos, antes de considerar a utilizao de um ensaio
ocular in vivo, deve efectuar-se preferencialmente um estudo in vivo prvio sobre os efeitos drmicos da
substncia, avaliados de acordo com o mtodo de ensaio B.4 (7). A aplicao de uma anlise de importncia das
provas e a estratgia de ensaio sequencial devero reduzir a necessidade de ensaios in vivo para a corrosibilidade/
/capacidade irritante ocular de substncias para as quais existem suficientes provas prvias de outros estudos.
Caso a determinao do potencial de corroso ou irritao ocular no possa ser efectuada utilizando a
estratgia de ensaio sequencial, mesmo aps a realizao de um estudo in vivo da corroso e irritao drmica,
pode ser efectuado um ensaio in vivo de irritao/corroso ocular.
Junta-se ao anexo do presente mtodo de ensaio uma estratgia de ensaio sequencial prefervel, que inclui a
execuo de ensaios validados in vitro ou ex vivo para irritao/corroso. A estratgia foi desenvolvida num
grupo de trabalho (workshop) da OCDE (8), no qual foi recomendada por unanimidade dos participantes, tendo
sido adoptada como estratgia de ensaio recomendada pelo sistema harmonizado a nvel mundial para a
classificao de substncias qumicas (GHS) (9). Recomenda-se que a estratgia de ensaio sequencial seja
adoptada antes de realizar ensaios in vivo. No caso de substncias novas, recomenda-se uma metodologia de
ensaio por etapas para a obteno de dados cientficos sobre a corrosibilidade/capacidade irritante da
substncia. No caso de substncias j existentes mas cujos dados sobre irritao/corroso drmica e ocular so
insuficientes, recomenda-se a adopo desta estratgia para a obteno dos dados em falta. Caso se opte por
uma estratgia ou protocolo de ensaio diferente ou se decida no aplicar uma metodologia de ensaio por
etapas, dever apresentar-se uma justificao fundamentada.
1.2. DEFINIES
Irritao ocular: consiste na produo de alteraes oculares aps a aplicao de uma substncia de ensaio
superfcie anterior do olho, alteraes essas que so completamente reversveis no intervalo de 21 dias aps a
aplicao.
Corroso ocular: consiste na produo de leses do tecido ocular ou enfraquecimento fsico grave da viso
aps aplicao da substncia de ensaio superfcie anterior do olho, no reversveis no intervalo de 21 dias
aps a aplicao.
A substncia de ensaio aplicada em dose nica a um dos olhos do animal de experincia; o olho que no sofre
tratamento utilizado como controlo. O grau de irritao/corroso ocular avaliado pelas leses de perfurao
da conjuntiva, da crnea e da ris, a intervalos determinados. So tambm descritos outros efeitos sobre o olho
e efeitos sistmicos adversos, de modo a permitir uma avaliao completa dos efeitos. A durao do estudo
deve ser suficiente para avaliar a reversibilidade ou irreversibilidade dos efeitos.
Os animais que apresentem sinais continuados de se encontrarem em grave perigo e/ou apresentarem sinais de
dor durante qualquer das etapas do ensaio devem ser abatidos e a substncia deve ser classificada de acordo
com estas observaes. Os critrios para a deciso de abater animais moribundos e animais em grave
sofrimento podem ser consultados na referncia (10).
1.4.1. Preparao para o ensaio in vivo
1.4.1.1. Seleco de espcies
O coelho albino o animal de laboratrio mais adequado, devendo ser usados animais adultos, jovens e
saudveis. A utilizao de outras estirpes ou espcies deve ser justificada.
Devem examinar-se ambos os olhos do animal seleccionado provisoriamente para o ensaio 24 horas antes do
incio do ensaio. No devem ser usados animais que apresentem irritao ocular, defeitos oculares ou leso
preexistente da crnea.
Os animais devem ser alojados individualmente. A temperatura do biotrio para os coelhos deve ser de 20
o
C (
3
o
C). A humidade relativa deve ser no mnimo de 30 % e, preferivelmente, no exceder 70 %, excepto durante
a lavagem do biotrio, devendo no entanto manter-se idealmente a valores de 50 %-60 %. A iluminao deve
ser artificial, com uma sequncia de 12 horas de luz e 12 horas de escurido. Como alimentao, podem ser
utilizadas dietas de laboratrio convencionais com fornecimento ilimitado de gua para beber.
1.4.2. Protocolo de ensaio
1.4.2.1. Aplicao da substncia de ensaio
A substncia de ensaio deve ser colocada no saco conjuntival de um dos olhos de cada animal, depois de se ter
separado cuidadosamente a plpebra inferior do globo ocular. Fecham-se as plpebras cuidadosamente durante
cerca de um segundo de modo a evitar a perda de material. O outro olho, que permanece sem tratamento,
utilizado como controlo.
1.4.2.2. Irrigao
Os olhos dos animais de ensaio no devem ser lavados pelo menos nas 24 horas seguintes instilao da
substncia de ensaio, excepto para o caso de slidos (consultar a seco 1.4.2.3.2) e no caso de ocorrncia
imediata de efeitos corrosivos ou irritantes. Aps 24 horas, desde que se considere apropriada, pode ser
efectuada uma lavagem.
No se recomenda a utilizao de um grupo-satlite de animais para investigar a influncia da lavagem, excepto
se tal se justificar cientificamente. Se for necessrio um grupo-satlite de animais, devem utilizar-se dois
coelhos. As condies de lavagem devem ser cuidadosamente documentadas, por exemplo, data e hora da
lavagem; composio e temperatura da soluo de lavagem; durao, volume e velocidade de aplicao.
1.4.2.3. Nvel de dosagem
1.4.2.3.1. Ensaio de lquidos
No caso do ensaio de lquidos, usa-se uma dose de 0,1 ml. No devem ser utilizados nebulizadores de bomba
para instilao directa da substncia no olho. O nebulizado lquido deve ser expelido e recolhido num
recipiente antes de se instilar 0,1 ml no olho.
1.4.2.3.2. Ensaio de slidos
No caso de ensaio de substncias slidas, pastas ou substncias em partculas, a quantidade usada deve ter um
volume de 0,1 ml ou uma massa no superior a 100 mg. O material de ensaio deve ser pulverizado a um p
fino. O volume de material slido deve ser medido aps compactao suave, por exemplo, atravs de batidas do
recipiente que o contm. Se ao tempo da primeira observao, 1 hora aps o tratamento, a substncia de ensaio
slida no tiver sido removida do olho do animal de ensaio atravs de mecanismos fisiolgicos, o olho pode ser
lavado com soro fisiolgico ou gua destilada.
1.4.2.3.3. Ensaio de aerossis
Recomenda-se a recolha do contedo de todos os nebulizadores de bomba e aerossis antes de instilao no
olho. A nica excepo para substncias em recipientes de aerossol pressurizados, que no podem ser
recolhidos devido sua vaporizao. Nestes casos, deve manter-se o olho aberto e administrar-se a substncia
de ensaio no olho numa aplicao nica de durao aproximada de um segundo, mantendo o recipiente
directamente frente do olho a uma distncia de 10 cm. Esta distncia pode variar em funo da presso do
nebulizador e do seu contedo. Devem ser tomadas precaues adequadas para no danificar o olho devido
presso do nebulizador. Em casos apropriados, pode ser necessrio avaliar o potencial de leso mecnica do
olho pela fora da nebulizao.
Pode obter-se uma estimativa da dose de um aerossol atravs de simulao do ensaio da seguinte forma:
nebuliza-se a substncia para um papel de pesagem atravs de uma abertura do tamanho do olho de coelho,
colocada directamente em frente do papel. Utiliza-se o aumento de peso do papel como uma aproximao da
quantidade nebulizada para o olho. Para substncias volteis, a dose pode ser estimada por pesagem do
recipiente de recolha antes e aps a remoo do material de ensaio.
1.4.2.4. Ensaio inicial (ensaio in vivo de irritao/corroso ocular utilizando um animal)
Tal como articulado na estratgia de ensaio sequencial (ver anexo 1), recomenda-se vivamente que o ensaio in
vivo seja efectuado inicialmente utilizando um animal.
Se, utilizando o protocolo descrito, os resultados deste ensaio indicarem que a substncia corrosiva ou
fortemente irritante para o olho, no devem ser efectuados outros ensaios de irritao ocular.
1.4.2.5. Anestesia local
A utilizao de anestesia local pode ser feita, mas analisando a sua necessidade caso a caso. Se a anlise de
importncia das provas indicar que a substncia pode causar dor ou se os ensaios iniciais revelarem ocorrncia
de reaco dolorosa, pode utilizar-se um anestsico local antes da instilao da substncia de ensaio. A seleco
do tipo, concentrao e dose de anestsico local deve ser feita cuidadosamente de modo a assegurar que a sua
utilizao no altere a reaco substncia de ensaio. O olho de controlo deve ser anestesiado de igual forma.
1.4.2.6. Ensaio de confirmao (ensaio in vivo de irritao ocular com animais adicionais)
Se no for observado um efeito corrosivo no ensaio inicial, a resposta irritante ou negativa deve ser confirmada
utilizando at dois animais adicionais. Se for observado no ensaio inicial um efeito francamente irritante,
indicativo de um efeito possivelmente forte (irreversvel) no ensaio de confirmao, recomenda-se que se
efectue o ensaio de confirmao de uma forma sequencial num animal de cada vez, em vez de expor dois
animais adicionais simultaneamente. Se o segundo animal apresentar efeitos corrosivos ou fortemente
irritantes, no se deve continuar o ensaio. Pode ser necessria a utilizao de animais adicionais para confirmar
respostas de irritao fracas ou moderadas.
A durao do perodo de observao deve ser suficiente para uma avaliao completa da magnitude e
reversibilidade dos efeitos observados. No entanto, a experincia deve ser interrompida em qualquer altura se o
animal apresentar sintomas continuados de dor intensa ou de se encontrar em situao de perigo (9). Para a
determinao da reversibilidade dos efeitos, os animais devem ser examinados normalmente durante 21 dias
aps a administrao da substncia de ensaio. No caso de se observar reversibilidade antes do fim do perodo
de 21 dias, deve interromper-se a experincia.
1.4.2.7.1. Observaes clnicas e graduao das reaces oculares
Os olhos devem ser examinados 1, 24, 48 e 72 horas aps a aplicao da substncia de ensaio. Os animais s
devem ser mantidos sob ensaio durante o tempo necessrio para obter informao definitiva. Os animais que
apresentem sintomas continuados de dor intensa ou de perigo devem ser abatidos sem demora, sendo a
substncia classificada de acordo com estes resultados. Os animais que apresentem as seguintes leses oculares
posteriores instilao devem ser abatidos: perfurao da crnea; ulcerao significativa da crnea, incluindo
estafiloma; sangue na cmara anterior do olho; opacidade da crnea de grau 4 persistente durante 48 horas;
ausncia de reflexo luz (resposta da ris de grau 2) persistente durante 72 horas; ulcerao da membrana
conjuntival; necrose da conjuntiva ou da membrana nictitante; ou formao de crosta. Este procedimento
devido ao facto de normalmente este tipo de leses ser irreversvel.
Os ensaios com animais que no desenvolvam leses oculares podem ser interrompidos, mas no antes de trs
dias aps a instilao. Os animais que apresentem leses fracas a moderadas devem permanecer sob observao
at cura de todas as leses ou durante o perodo de 21 dias, aps o qual o estudo finalizado. As observaes
devem ser efectuadas 7, 14 e 21 dias aps a aplicao de modo a determinar o estado das leses e a sua
reversibilidade ou irreversibilidade.
Os graus da reaco ocular (conjuntiva, crnea e ris) devem ser anotados em cada exame (tabela I). Quaisquer
outras leses do olho (por exemplo, pannus da crnea, colorao) ou efeitos sistmicos adversos devem
igualmente ser includos no relatrio.
O exame das reaces pode ser facilitado pela utilizao de uma lupa binocular, de uma lmpada de fenda
manual, de um biomicroscpio ou de outro instrumento apropriado. Aps anotao das observaes no final
de 24 horas, o exame aos olhos pode ser feito recorrendo a fluorescena.
A graduao das respostas oculares necessariamente subjectiva. O pessoal que executa as observaes deve ser
treinado adequadamente no sistema de graduao utilizado para promover a harmonizao da graduao da
resposta ocular e auxiliar os laboratrios de ensaio e as pessoas envolvidas na obteno e interpretao das
observaes.
2. DADOS
Os resultados de irritao ocular devem ser avaliados conjuntamente com a natureza e gravidade das leses e a
sua reversibilidade ou ausncia de reversibilidade. As respostas individuais no representam um padro
absoluto das propriedades irritantes do material, j que so tambm avaliados outros efeitos do material de
ensaio. Pelo contrrio, os resultados individuais devem ser encarados como valores de referncia que s so
significativos quando corroborados por uma descrio e avaliao completas de todas as observaes.
3. RELATRIO
Fundamentao lgica para o ensaio in vivo: anlise de importncia das provas dos dados de ensaio
preexistentes, incluindo os resultados da estratgia de ensaio sequencial:
descrio dos dados relevantes disponveis de ensaios anteriores;
dados obtidos em cada etapa da estratgia de ensaio;
descrio dos ensaios in vitro efectuados, incluindo detalhes sobre o protocolo, resultados obtidos com
substncias de ensaio/referncia;
descrio do estudo efectuado in vivo sobre irritao/corroso drmica, incluindo os resultados obtidos;
anlise de importncia das provas para a realizao do estudo in vivo.
dados de identificao (por exemplo, nmero CAS, origem, grau de pureza, impurezas conhecidas,
nmero de lote);
natureza fsica e propriedades fsico-qumicas (por exemplo, pH, volatilidade, solubilidade, estabilidade,
reactividade com gua);
no caso de misturas, composio e percentagens relativas dos componentes;
no caso de utilizao de um anestsico local, identificao, grau de pureza, tipo, dose e interaco
potencial com a substncia de ensaio.
Excipiente:
identificao, concentrao (quando apropriado), volume utilizado;
Animais de ensaio:
espcie/estirpe utilizada, fundamentao lgica para a utilizao de outro tipo de animais que no
coelhos albinos;
idade de cada animal no incio do estudo;
nmero de animais de cada sexo no ensaio e nos grupos de controlo (se necessrio);
peso individual dos animais no incio e no final do ensaio;
origem, condies de alojamento, dieta, etc.
Resultados:
descrio do mtodo utilizado para medir a irritao em cada observao (por exemplo, lmpada de
fenda manual, biomicroscpio, fluorescena);
disposio em tabelas dos dados sobre a resposta irritante/corrosiva para cada animal em cada
observao at remoo do animal do ensaio;
descrio pormenorizada do grau e natureza da irritao ou corroso observadas;
descrio de quaisquer outras leses do olho observadas (por exemplo, vascularizao, formao de
pannus da crnea, adeses, colorao);
descrio de efeitos no oculares locais e efeitos sistmicos adversos e, caso sejam efectuadas, das
observaes histopatolgicas.
A extrapolao dos resultados dos estudos de irritao ocular em animais de laboratrio para humanos tem
uma validade limitada. Em muitos casos, o coelho albino mais sensvel do que os humanos a substncias
irritantes ou corrosivas oculares.
A interpretao dos dados deve ser feita cuidadosamente de modo a excluir irritao resultante de infeces
secundrias.
4. REFERNCIAS
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani,
A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P., (1995) The
Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8.
ATLA 23, p. 410-429.
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I.,
Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N., (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical
Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, p. 159-164.
(3) Worth A.P. and Fentem J.H., (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA
27, 161-177
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H., (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin
of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicology In
Vitro, 2, p. 19-26.
(5) Neun, D.J., (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH.
J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227-231.
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G.
and Liebsch, M., (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2.
(6a) Mtodo de Ensaio B.40 para corroso da pele.
(7) Mtodo de Ensaio B.4. Toxicidade aguda: irritao/corroso drmica.
(8) OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held
in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
(9) OECD, (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and
Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals
Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.
htm).
(10) OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as
Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health
and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.
htm).
Tabela I
GRADUAO DE LESES OCULARES
Crnea
Opacidade: grau de densidade (as medies devem ser efectuadas na rea mais densa) (*)
Sem ulcerao nem opacidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
reas de opacidade escassas ou difusas (para alm de uma pequena perda do lustre normal); detalhes da ris
claramente visveis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
rea translcida claramente discernvel; detalhes da ris ligeiramente obscurecidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
rea nacarada; no so visveis os detalhes da ris; o tamanho da pupila dificilmente discernvel . . . . . . . . . . . 3
Crnea opaca; a ris no discernvel atravs da opacidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Mximo possvel: 4
NOTAS
(*) Deve ser anotada qual a rea de opacidade da crnea.
ris
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
Rugas marcadamente profundas, congesto, tumefaco, hiperemia ao redor da crnea moderada; ou injeco;
ris reactiva luz (considera-se que uma reaco lenta um efeito) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Hemorragia, destruio macia ou ausncia de reaco luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Mximo possvel: 2
Conjuntiva
Vermelhido (refere-se conjuntiva palpebral e bulbar; excluindo a crnea e a ris)
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
Alguns vasos sanguneos com hiperemia (injectados) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Cor carmesim difusa; vasos individuais no so claramente discernveis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Cor vermelho-carne difusa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Mximo possvel: 3
Quimiose
Tumefaco (refere-se s plpebras e/ou s membranas nictantes)
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
Alguma tumefaco acima do normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Tumefaco bvia, com everso parcial das plpebras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Tumefaco, com as plpebras semicerradas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Tumefaco, com as plpebras mais do que semicerradas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Mximo possvel: 4
ANEXO
Uma estratgia de ensaio sequencial para a irritao e corroso ocular
CONSIDERAES GERAIS
No sentido de atender aos interesses quer cientficos, quer da proteco dos animais, torna-se importante evitar o uso
desnecessrio de animais e minimizar os ensaios que possam causar reaces graves em animais. Deve ser analisada toda a
informao sobre a substncia que seja relevante para a sua potencial capacidade irritante/corrosibilidade ocular antes de se
considerarem os ensaios in vivo. possvel que existam j dados suficientes para classificar a substncia de ensaio segundo o
seu potencial irritante ou corrosivo ocular, sem necessidade de recorrer a ensaios em animais de laboratrio. Assim, a
utilizao de uma anlise de importncia das provas e de uma estratgia de ensaio sequencial minimizar a necessidade de
ensaios in vivo, especialmente no caso de substncias susceptveis de produzir reaces graves.
Recomenda-se a utilizao da anlise de importncia das provas para avaliar a informao existente sobre irritao e
corroso ocular e determinar a necessidade de se efectuar estudos adicionais, diferentes dos estudos oculares in vivo, que
sejam teis para caracterizar o referido potencial. No caso de serem necessrios estudos adicionais, recomenda-se a
utilizao de uma estratgia de ensaio sequencial para a obteno dos dados experimentais relevantes. No caso de
substncias para as quais no exista nenhuma histria de ensaios, deve ser utilizada a estratgia sequencial para a obteno
dos dados necessrios para avaliar a sua irritao/corroso ocular. A estratgia de ensaio descrita no presente anexo foi
desenvolvida num grupo de trabalho (workshop) da OCDE (1). Foi subsequentemente confirmado e ampliado no sistema
harmonizado e integrado de classificao de perigos para a sade humana e efeitos ambientais de substncias qumicas, tal
como foi aprovado pela 28.
a
sesso conjunta do comit das substncias qumicas e do grupo de trabalho de substncias
qumicas, em Novembro de 1998 (2).
Apesar da presente estratgia de ensaio no fazer parte integrante do mtodo de ensaio B.5, ela expressa a metodologia
recomendada para a determinao das propriedades de irritao/corroso ocular. Esta metodologia representa no s a
melhor prtica como tambm um ponto de referncia tico para o ensaio in vivo para irritao/corroso ocular. O mtodo de
ensaio fornece uma orientao para a realizao do ensaio in vivo e resume os factores que devem ser considerados antes de
ponderar a execuo deste ensaio. A estratgia de ensaio sequencial fornece uma metodologia de anlise da importncia das
provas para a avaliao dos dados existentes sobre as propriedades de irritao/corroso ocular de substncias e uma
metodologia em sries para a obteno de dados relevantes sobre substncias para as quais sejam necessrios estudos
adicionais ou para os quais no tenham sido efectuados quaisquer estudos. A estratgia inclui inicialmente a realizao de
ensaios in vitro ou ex vivo validados e aceites e, seguidamente, do mtodo de ensaio B.4 para o estudo de irritao/corroso
drmica em circunstncias especficas (3) (4).
DESCRIO DA ESTRATGIA DE ENSAIO POR ETAPAS
Antes da realizao dos ensaios como parte da estratgia de ensaio sequencial (figura) deve ser avaliada toda a informao
disponvel de modo a determinar a necessidade de realizao de ensaios oculares in vivo. Apesar de ser possvel obter
informao significativa a partir da avaliao de um s parmetro (por exemplo, pH extremo), deve ser avaliada a totalidade
da informao existente. Para uma deciso baseada na anlise da importncia das provas, devem ser avaliados todos os dados
relevantes sobre os efeitos da substncia em causa, bem como dos seus anlogos estruturais, e deve apresentar-se uma
justificao fundamentada para a deciso tomada. Deve dar-se especial relevncia aos dados existentes sobre a substncia
relativamente a humanos e animais e, seguidamente, aos resultados dos ensaios in vitro ou ex vivo. Sempre que possvel,
devem ser evitados estudos in vivo de substncias corrosivas. Os factores considerados na estratgia de ensaio incluem:
Avaliao dos dados existentes sobre humanos e animais (etapa 1). Devem considerar-se em primeiro lugar os dados existentes
sobre humanos por exemplo, estudos clnicos e ocupacionais, relatrios de casos clnicos e/ou dados de ensaios de
estudos oculares em animais , j que estes dados fornecem informao directamente relacionada com os efeitos nos olhos.
Em seguida, devem ser avaliados os dados disponveis sobre estudos de investigao da irritao/corroso drmica em
humanos e/ou animais. As substncias que apresentem evidncias de corrosibilidade ou capacidade irritante grave para os
olhos conhecidas no devem ser instiladas em olhos de animais. De igual forma, as substncias que apresentam efeitos
corrosivos ou irritantes para a pele tambm no devem ser instiladas em olhos de animais, devendo ser consideradas
igualmente corrosivas e/ou irritantes para os olhos. As substncias que apresentem provas suficientes de no serem
corrosivas ou irritantes em estudos oculares efectuados anteriormente tambm no devem ser ensaiadas em estudos
oculares in vivo.
Anlise de relaes estrutura-actividade (SAR) (etapa 2). Devem ser considerados os resultados de ensaios de substncias
qumicas estruturalmente semelhantes, caso se encontrem disponveis. No caso de existirem dados sobre humanos e/ou
animais suficientes, relativos aos efeitos de substncias estruturalmente semelhantes ou a misturas deste tipo de substncias,
indicativos do seu potencial de irritao/corroso ocular, pode presumir-se que a substncia de ensaio produzir as mesmas
reaces. Nestes casos, poder no ser necessrio proceder a ensaios da substncia. Os dados negativos obtidos de estudos de
substncias estruturalmente semelhantes ou misturas dessas substncias no constituem prova suficiente de no-
-corrosibilidade/no-irritabilidade da substncia sob estratgia de ensaio sequencial. Devem ser utilizadas abordagens de SAR
validadas e aceites para identificao do potencial de irritao e corroso, tanto dos efeitos drmicos como oculares.
Propriedades fsico-qumicas e reactividade qumica (etapa 3). As substncias que apresentam pH extremos, tais como 2,0 ou
11,5, podem ter efeitos locais fortes. Se o pH extremo servir como base de identificao da corrosibilidade ou capacidade
irritante ocular de uma substncia, a sua reserva cida/alcalina (poder tampo) tambm deve ser tida em considerao (5) (6).
Se o poder tampo indicar que a substncia pode no ser corrosiva para o olho, devem ser efectuados ensaios adicionais
para confirmar esta indicao, de preferncia utilizando ensaios in vitro ou ex vivo validados e aceites (ver seco das eta-
pas 5 e 6).
Considerao de outras informaes existentes (etapa 4). Nesta etapa, deve ser avaliada toda a informao disponvel sobre
toxicidade sistmica por via drmica. Deve ser tambm considerada a toxicidade drmica aguda da substncia de ensaio. Se
tiver sido demonstrado que a substncia muito txica por via drmica pode no ser necessrio efectuar ensaios oculares.
Apesar de no existir necessariamente uma relao entre a toxicidade drmica aguda e a irritao/corroso ocular, pode
considerar-se que se um agente muito txico por via drmica, tambm mostrar elevada toxicidade quando instilado no
olho. Estes dados podem ser tambm considerados entre as etapas 2 e 3.
Resultados de ensaios in vitro ou ex vivo (etapas 5 e 6). No necessrio proceder a ensaios em animais de substncias que
tenham apresentado propriedades corrosivas ou de irritao grave em ensaios in vitro ou ex vivo (7) (8) que tenham sido
validados e aceites para estimar especificamente a corrosibilidade/capacidade de irritao ocular ou drmica. Pode
considerar-se que estas substncias produziro efeitos graves semelhantes in vivo. Se no se encontrarem disponveis ensaios
in vitro/ex vivo validados e aceites, devem ultrapassar-se as etapas 5 e 6 e passar-se directamente etapa 7.
Avaliao da capacidade irritante ou corrosibilidade drmica in vivo de uma substncia (etapa 7). Caso no existam dados suficientes
para uma anlise da importncia das provas conclusiva sobre o potencial de irritao/corroso de uma substncia baseada
nos dados dos estudos supramencionados, deve proceder-se em primeiro lugar a uma avaliao do potencial de irritao/
/corroso drmica in vivo, utilizando o mtodo de ensaio B.4 (4) e o seu anexo (9). Se a substncia causar corroso ou
irritao grave da pele, deve ser considerada um irritante ocular corrosivo, excepto se existir outro tipo de informao que
apoie uma concluso alternativa. Assim, no h necessidade de efectuar um ensaio ocular in vivo. Se a substncia no for
corrosiva ou gravemente irritante para a pele, deve efectuar-se um ensaio ocular in vivo.
Ensaio in vivo em coelhos (etapas 8 e 9). O ensaio ocular in vivo deve comear por um ensaio inicial usando um animal. Se os
resultados deste ensaio indicarem que a substncia provoca irritao grave ou corrosiva para os olhos, no devem ser
efectuados outros ensaios. Se o ensaio no revelar quaisquer efeitos corrosivos ou de irritao grave, deve efectuar-se um
ensaio de confirmao com dois animais adicionais.
REFERNCIAS
(1) OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of
Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January
1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
(2) OECD, (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of
Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on
Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H., (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27,
p. 161-177.
(4) Mtodo de ensaio B.4. Toxicidade aguda: irritao/corroso drmica.
(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H., (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of
Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicology In Vitro, 2, p. 19-26.
(6) Neun, D.J., (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol.
Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227-231.
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch,
M., (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by
the Management Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483524.
(8) Mtodo de Ensaio B.40. Corroso drmica.
(9) Anexo ao mtodo de ensaio B.4: Uma estratgia de ensaio sequencial para irritao e corroso drmicas.
Figura
Estratgia de ensaio e avaliao para irritao/corroso ocular
B.6. SENSIBILIZAO CUTNEA
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Observaes
A sensibilidade e capacidade dos mtodos de ensaio para detectar substncias que possam induzir
sensibilizao cutnea considera-se importante num sistema de classificao em matria de toxicidade no
domnio da sade pblica.
No existe um mtodo nico que permita identificar de modo adequado todas as substncias que possuam um
potencial de sensibilizao cutnea para o homem.
Na seleco do mtodo de ensaio devem ter-se em conta factores tais como as caractersticas fsicas da
substncia, nomeadamente a sua capacidade de penetrao na pele.
Desenvolveram-se dois tipos de ensaios em porquinhos-da-ndia: ensaios com adjuvantes, em que a reaco
alrgica desencadeada por uma soluo ou suspenso da substncia em estudo em adjuvante completo de
Freunds, e os ensaios sem adjuvantes.
Em geral, os ensaios com adjuvantes permitem determinar o potencial de sensibilizao cutnea no homem
com mais preciso que os mtodos que no utilizam o adjuvante completo de Freunds, pelo que so
preferveis.
O ensaio de maximizao em porquinhos-da-ndia constitui um mtodo com adjuvante largamente utilizado.
Embora possam utilizar-se vrios outros mtodos para determinar o potencial de sensibilizao cutnea, o
mtodo em causa considerado o mais adequado.
Os ensaios sem adjuvantes (de que o ensaio de Buehler constitui o mais popular) so considerados menos
sensveis quando aplicados a determinadas classes de substncias.
Em alguns casos, podem existir motivos para a seleco do ensaio de Buehler, em que se procede aplicao
tpica, em vez do mtodo de maximizao em porquinhos-da-ndia, que utiliza a injeco intradrmica. No
caso do recurso ao mtodo de Buehler, deve fornecer-se a respectiva justificao.
O presente mtodo descreve o ensaio de maximizao em porquinhos-da-ndia e o mtodo de Buehler. Pode
recorrer-se a outros mtodos devidamente validados cuja utilizao seja cientificamente justificada.
Se um ensaio de despiste reconhecido fornecer um resultado positivo, a substncia submetida ao ensaio pode
ser designada potencialmente sensibilizante e pode no ser necessrio efectuar subsequentemente um ensaio
com cobaias. No entanto, se o referido ensaio fornecer um resultado negativo, necessrio efectuar um ensaio
com cobaias segundo a metodologia aplicvel ao presente mtodo de ensaio.
Ver tambm a parte B da Introduo Geral.
1.2. DEFINIES
Sensibilizao cutnea (dermatite de contacto alrgica): reaco cutnea, de origem imunolgica, a uma
determinada substncia. No homem, a reaco pode incluir pruridos, eritrema, edema, ppulas, vesculas,
bolhas ou uma combinao dos mesmos. Em outras espcies, as reaces podem diferir, embora apenas se
observe eritrema e edema.
Exposio de induo: exposio experimental de um indivduo a uma substncia em estudo, com o objectivo de
induzir uma reaco de hipersensibilidade.
Perodo de induo: perodo de, pelo menos, uma semana aps a exposio de induo, durante o qual pode
surgir uma reaco de hipersensibilidade.
Exposio de desencadeamento: exposio experimental a uma determinada substncia, aps o perodo de
induo, de um indivduo previamente exposto mesma, de modo a averiguar uma eventual reaco de
hipersensibilidade.
A sensibilidade e a fiabilidade da tcnica experimental utilizada devem ser determinadas semestralmente por
recurso a substncias que se saiba possurem propriedades de sensibilizao cutnea ligeiras ou moderadas.
Num ensaio realizado de forma adequada, a utilizao de um sensibilizante ligeiro ou moderado deve
determinar uma reaco de pelo menos 30 %, no caso de um ensaio com adjuvante, e de pelo menos 15 % no
caso de um ensaio sem adjuvante.
Recomenda-se a utilizao das substncias seguintes:
Nmero CAS Nmero EINECS Denominao EINECS Denominao comum
101-86-0 202-983-3 -Hexilcinamaldedo -Hexilcinamaldedo
149-30-4 205-736-8 Benzotiazolo-2-tiol (mercapto-
benzotiazolo)
Kaptax
94-09-7 202-303-5 Benzocana Norcana
Em determinados casos devidamente justificados podem utilizar-se outras substncias que satisfaam os
critrios atrs referidos.
Os animais utilizados so inicialmente expostos substncia em estudo por injeco intradrmica e/ou
aplicao epidrmica (exposio de induo). Aps um perodo de repouso de 14 dias (perodo de induo),
durante o qual poder observar-se uma reaco imunitria, os animais so expostos a uma dose de
desencadeamento. A extenso e o grau da reaco cutnea exposio de desencadeamento nos animais do
lote de ensaio comparada com a reaco observada nos animais do lote de controlo, sujeitos a um produto
inactivo na fase da induo e objecto da exposio de desencadeamento.
Caso se afigure aconselhvel a remoo da substncia em estudo, deve utilizar-se para tal gua ou um solvente
adequado que no altere a reaco observada, bem como a integridade da epiderme.
1.5.1. Ensaio de maximizao nos porquinhos-da-ndia
1.5.1.1. P r e pa r a o
Os animais (porquinhos-da-ndia albinos adultos, jovens e saudveis) so aclimatados s condies laboratoriais
durante, pelo menos, cinco dias. Antes do ensaio, procede-se respectiva distribuio aleatria por lotes. O
plo removido com o auxlio de uma tesoura ou lmina ou, eventualmente, por depilao qumica, de acordo
com o mtodo utilizado. Deve evitar-se produzir feridas. Os animais so pesados antes do incio do ensaio e
aps o respectivo termo.
1.5.1.2. Cond i e s d e e ns a i o
1.5.1.2.1. Animais de ensaio
Os animais devem ser porquinhos-da-ndia albinos de utilizao corrente em laboratrio.
1.5.1.2.2. Nmero e sexo
Podem utilizar-se animais de ambos os sexos. Caso se utilizem fmeas, estas devem ser nulparas e no grvidas.
Utiliza-se um mnimo de 10 animais no lote de ensaio e um mnimo de cinco animais no lote de controlo.
Caso se utilizem menos de 20 animais no lote de ensaio e menos de 10 animais no lote de controlo, no
possvel concluir a natureza sensibilizante do produto, pelo que se recomenda vivamente a realizao de
ensaios com outros animais, at atingir os nmeros referidos.
1.5.1.2.3. Doses
A concentrao de substncia em estudo utilizada em cada exposio por induo deve apresentar uma boa
tolerncia sistmica e corresponder concentrao mxima que produz uma irritao cutnea ligeira a
moderada. A concentrao utilizada na exposio de desencadeamento deve consistir na dose mxima no
irritante. Se necessrio, as concentraes adequadas podem ser determinadas a partir de um estudo-piloto
utilizando dois ou trs animais. Para tal, devem utilizar-se animais objecto de ensaio com adjuvante completo
de Freunds.
1.5.1.3. P r oc e d i me nt o
1.5.1.3.1. Induo
Dia 0 lote de ensaio
Administram-se trs pares de injeces intradrmicas de 0,1 ml na regio da espdua.
1.
a
injeco: mistura adjuvante completo de Freunds/gua ou soro fisiolgico (1:1) (v/v).
2.
a
injeco: substncia em estudo dissolvida num veculo adequado, na concentrao escolhida.
3.
a
injeco: substncia em estudo dissolvida numa mistura adjuvante completo de Freunds/gua ou soro
fisiolgico (1:1) (v/v), na concentrao escolhida.
Na 3.
a
injeco, as substncias hidrossolveis so dissolvidas na fase aquosa antes da mistura com adjuvante
completo de Freunds. As substncias lipossolveis ou insolveis so suspensas em adjuvante completo de
Freunds antes de adicionadas fase aquosa. A concentrao final da substncia em estudo deve ser igual
utilizada na 2.
a
injeco.
As 1.
a
e 2.
a
injeces so administradas em regies vizinhas, to prximas quanto possvel do crnio, enquanto
que a 3.
a
injeco administrada na parte posterior da zona de ensaio.
Dia 0 lote de controlo
Administram-se trs pares de injeces intradrmicas de 0,1 ml na mesma regio usada no caso dos animais do
lote de ensaio.
1.
a
injeco: mistura adjuvante completo de Freunds/gua ou soro fisiolgico (1:1) (v/v).
2.
a
injeco: veculo no diludo.
3.
a
injeco: mistura a 50 % (m/v) do veculo numa mistura adjuvante completo de Freunds/gua ou soro
fisiolgico (1:1) (v/v).
5.
o
-7.
o
dias lotes de ensaio e de controlo
No caso de a substncia no constituir um irritante cutneo, a zona de ensaio, com o plo previamente
removido, tratada, cerca de 24 horas antes da aplicao tpica de induo, com 0,5 ml de soluo a 10 % de
laurilssulfato de sdio em vaselina, de modo a produzir irritao local.
6.
o
-8.
o
dias lote de ensaio
O plo novamente removido da zona de ensaio. Impregna-se totalmente uma folha de papel de filtro
(2 4 cm) da substncia em estudo, dissolvida ou suspensa num veculo adequado, que se aplica na zona de
ensaio, sendo mantida em contacto com a mesma durante 48 horas, com o auxlio de um penso oclusivo. Deve
justificar-se a escolha do veculo utilizado. Os slidos devem ser finamente divididos e incorporados num
veculo adequado. Os lquidos podem ser aplicados directamente, se for caso disso.
6.
o
-8.
o
dias lote de controlo
O plo novamente removido da zona de ensaio. O veculo aplicado de modo anlogo ao anteriormente
descrito, sendo tambm mantido em contacto com a referida zona durante 48 horas, com o auxlio de um
penso oclusivo.
1.5.1.3.2. Desencadeamento
20.
o
-22.
o
Remove-se o plo do flanco dos animais dos lotes de ensaio e de controlo. Aplica-se num dos flancos de cada
animal um apsito ou uma cmara impregnados da substncia em estudo; se necessrio, pode aplicar-se no
outro flanco um apsito ou uma cmara impregnados do veculo. Os sistemas em causa so mantidos em
contacto com a pele com o auxlio de um penso oclusivo.
1.5.1.3.3. Observao e avaliao: lotes de ensaio e de controlo
Cerca de 21 horas aps a remoo do apsito ou da cmara, a zona em estudo limpa, sendo o plo
removido com o auxlio de uma tesoura ou lmina, se necessrio.
Cerca de 3 horas depois (ou seja, cerca de 48 horas aps o incio do ensaio), observa-se a reaco cutnea,
que se regista de acordo com a escala indicada no apndice.
Cerca de 24 horas aps a primeira observao (72 horas aps o incio do ensaio), procede-se a um novo
exame, cujos resultados se registam de modo anlogo.
Recomenda-se a realizao de leituras cegas com os animais dos lotes de ensaio e de controlo.
Caso seja necessrio clarificar os resultados obtidos no primeiro ensaio de desencadeamento, pode realizar-se
um segundo ensaio com um novo lote de controlo, cerca de uma semana depois. Pode tambm realizar-se um
segundo ensaio de desencadeamento com o mesmo lote de controlo.
Devem observar-se e registar-se de acordo com a escala de Magnusson/Kligman (ver apndice) todas as reaces
anormais, nomeadamente reaces sistmicas, resultantes dos processos de induo e desencadeamento. Alm
disso, podem efectuar-se outros exames, nomeadamente um exame histopatolgico ou uma determinao da
espessura da prega cutnea, com o objectivo de clarificar eventuais reaces duvidosas.
1.5.2. Ensaio de Buehler
1.5.2.1. P r e pa r a o
Os animais (porquinhos-da-ndia albinos adultos, jovens e saudveis) so aclimatados s condies laboratoriais
durante, pelo menos, cinco dias. Antes do ensaio, procede-se respectiva distribuio aleatria por lotes. O
plo removido com o auxlio de uma tesoura ou lmina ou, eventualmente, por depilao qumica, de acordo
com o mtodo utilizado. Deve evitar-se produzir feridas. Os animais so pesados antes do incio do ensaio e
aps o respectivo termo.
1.5.2.2. Cond i e s d e e ns a i o
1.5.2.2.1. Animais de ensaio
Os animais devem ser porquinhos-da-ndia albinos de utilizao corrente em laboratrio.
1.5.2.2.2. Nmero e sexo
Podem utilizar-se animais de ambos os sexos. Caso se utilizem fmeas, estas ltimas devem ser nulparas e no
grvidas.
Utiliza-se um mnimo de 20 animais no lote de ensaio e um mnimo de 10 animais no lote de controlo.
1.5.2.2.3. Doses
A concentrao de substncia em estudo utilizada em cada exposio por induo deve corresponder
concentrao mxima que produz uma irritao cutnea moderada. A concentrao utilizada na exposio de
desencadeamento deve consistir na dose mxima no irritante. Se necessrio, as concentraes adequadas
podem ser determinadas a partir de um estudo-piloto utilizando dois ou trs animais.
No caso de as substncias em estudo serem hidrossolveis, deve utilizar-se como veculo gua ou uma soluo
diluda de um tensioactivo no irritante. Nos restantes casos, o veculo deve consistir numa mistura etanol/gua
a 80 % (ensaios de induo) ou acetona (ensaios de desencadeamento).
1.5.2.3. P r oc e d i me nt o
1.5.2.3.1. Induo
Dia 0 lote de ensaio
Remove-se o plo do flanco dos animais. O sistema de apsito impregnado da substncia em estudo,
dissolvida ou suspensa num veculo adequado (deve justificar-se a escolha do veculo; as substncias lquidas
podem ser aplicadas sem diluio, se for caso disso)
e aplicado na zona de ensaio, sendo mantido em contacto com a mesma durante 6 horas, com o auxlio de um
apsito ou de uma cmara e de um penso adequado.
O sistema de apsito utilizado deve ser oclusivo. Pode utilizar-se uma mecha de algodo de forma circular ou
quadrada, com 4 a 6 cm
2
. De modo a garantir a ocluso, aconselhvel utilizar um dispositivo de imobilizao
adequado. Caso se utilize uma faixa, poder ser necessrio proceder a exposies adicionais.
Dia 0 lote de controlo
O plo novamente removido da zona de ensaio. O veculo aplicado de modo anlogo ao anteriormente
descrito, sendo tambm mantido em contacto com a referida zona durante 6 horas por intermdio de um
penso oclusivo ou de uma cmara. Caso se conclua que no necessrio efectuar um controlo simulado,
poder efectuar-se um controlo mais simples.
6.
o
-8.
o
dias e 13.
o
-15.
o
A substncia em estudo aplicada de modo anlogo ao anteriormente descrito, na mesma zona e no mesmo
flanco (se necessrio, proceder remoo do plo), entre o 6.
o
e o 8.
o
dias e, de novo, entre o 13.
o
e o 15.
o
dias.
1.5.2.3.2. Desencadeamento
27.
o
-29.
o
Remove-se o plo do flanco posterior dos animais dos lotes de ensaio e de controlo no sujeito a exposio
prvia e aplica-se um penso oclusivo ou cmara impregnados da quantidade adequada da substncia em estudo
(concentrao mxima no irritante).
Se necessrio, pode tambm aplicar-se um penso oclusivo ou cmara, impregnados do veculo, ao flanco
anterior dos animais de ambos os lotes no sujeito a exposio prvia. Os pensos ou cmaras so mantidos em
contacto com a pele durante 6 horas, com o auxlio de um dispositivo adequado.
1.5.2.3.3. Observao e avaliao
Cerca de 21 horas aps a remoo do apsito ou da cmara, remove-se o plo da rea em estudo.
Cerca de 3 horas depois (ou seja, cerca de 30 horas aps o incio do ensaio), observa-se a reaco cutnea,
que se regista de acordo com a escala indicada em apndice.
Cerca de 24 horas aps a primeira observao (54 horas aps o incio do ensaio), procede-se a um novo
exame, cujos resultados se registam de modo anlogo.
Recomenda-se a realizao de leituras cegas com os animais dos lotes de ensaio e de controlo.
Caso seja necessrio clarificar os resultados obtidos no primeiro ensaio de desencadeamento pode realizar-se
um segundo ensaio com um novo lote de controlo, cerca de uma semana depois. Pode tambm realizar-se um
segundo ensaio de desencadeamento com o mesmo lote de controlo.
Devem observar-se e registar-se de acordo com a escala de Magnusson/Kligman (ver apndice) todas as reaces
anormais, nomeadamente reaces sistmicas, resultantes dos processos de induo e desencadeamento. Alm
disso, podem efectuar-se outros exames, nomeadamente um exame histopatolgico ou uma determinao da
espessura da prega cutnea, com o objectivo de clarificar eventuais reaces duvidosas.
2. DADOS (GPMT E ENSAIO DE BUEHLER)
Os dados devem ser apresentados de forma sumria num quadro, referindo, para cada animal, a reaco
cutnea observada.
3. RELATRIO (GPMT E ENSAIO DE BUEHLER)
Caso se tenha realizado um ensaio de prospeco (por exemplo, ensaio ganglionar local LLNA ou ensaio
de tumefaco do pavilho auditivo no ratinho METS) antes do ensaio em porquinhos-da-ndia, deve
fornecer-se, juntamente com os resultados obtidos com a substncia em estudo e a substncia de referncia,
detalhes relativos ao procedimento.
Relatrio do ensaio (ensaio de maximizao em porquinhos da ndia e ensaio de Buehler)
O relatrio do ensaio deve incluir, sempre que possvel, as seguintes informaes:
Animais utilizados no ensaio:
estirpe;
nmero, idade e sexo dos animais;
provenincia, condies de alojamento, dieta administrada, etc.;
massa de cada animal no incio do ensaio.
Condies de ensaio:
pormenores relativos preparao da zona de ensaio;
pormenores relativos aos materiais e tcnicas de apsito utilizadas;
resultados dos estudos-piloto destinados a determinar as concentraes de induo e de
desencadeamento utilizadas no ensaio;
pormenores relativos preparao, aplicao e remoo da substncia em estudo;
justificao da escolha do veculo;
concentraes do veculo e da substncia em estudo utilizadas nos ensaios de induo e de
desencadeamento; quantidade total de substncia aplicada nos ensaios de induo e de desencadea-
mento.
Resultados:
resumo dos resultados do ltimo controlo de sensibilidade e fiabilidade (ver 1.3), nomeadamente
informaes sobre a substncia, a respectiva concentrao e o veculo utilizado;
dados relativos a cada animal, incluindo o sistema de classificao;
descrio da natureza e gravidade dos efeitos observados;
dados histopatolgicos.
Discusso dos resultados.
Concluses.
4. REFERNCIAS
O presente mtodo anlogo ao mtodo OCDE TG 406.
Apndice
QUADRO
Escala de Magnusson/Kligman para a avaliao das reaces ao ensaio de desencadeamento
0 = alteraes no visveis;
1 = eritrema discreto ou localizado;
2 = eritrema moderado ou confluente;
3 = eritrema intenso e tumefaco.
B.7. TOXICIDADE ORAL DA DOSE REPETIDA (28 DIAS)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver a parte B da Introduo Geral.
1.2. DEFINIES
A substncia em estudo administrada diariamente por via oral, em doses crescentes (uma dose por lote), a
vrios lotes de animais de ensaio, durante um perodo de 28 dias. No decurso deste perodo, os animais so
examinados diariamente em pormenor, com vista deteco de quaisquer sinais de toxicidade. Efectua-se a
autpsia dos animais que morrem ou so abatidos durante o ensaio e, no final do mesmo, procede-se ao abate
dos sobreviventes e respectiva autpsia.
O presente mtodo concede especial importncia aos efeitos neurolgicos, devendo efectuar-se um exame
clnico pormenorizado dos animais, de modo a obter o mximo possvel de informaes. O mtodo dever
permitir identificar substncias com potencial neurotxico, que podero necessitar de uma investigao mais
aprofundada. Alm disso, o mtodo pode fornecer indicaes sobre os eventuais efeitos imunolgicos e a
eventual toxicidade sobre os rgos reprodutores.
1.4.1. Preparao
Seleccionam-se de modo aleatrio animais adultos jovens e saudveis, que se repartem pelos lotes de ensaio e
de controlo. Devem dispor-se as gaiolas de forma a minimizar eventuais efeitos devidos respectiva
localizao. Os animais so identificados individualmente e mantidos nas gaiolas durante pelo menos cinco
dias antes do incio do ensaio, de modo a permitir a aclimatao s condies laboratoriais.
A substncia em estudo administrada por intermdio de uma sonda gstrica ou atravs da alimentao ou da
gua para beber. O mtodo de administrao oral depende do objectivo do ensaio, bem como das propriedades
fsico-qumicas da substncia.
Se necessrio, a substncia dissolvida ou suspensa num veculo adequado. Sempre que possvel, recomenda-se
o uso de uma soluo ou suspenso aquosa ou, se tal no for possvel, uma soluo ou emulso num leo
(nomeadamente leo de milho) ou ainda uma soluo noutro veculo. No caso de se utilizar um veculo no
aquoso, devem conhecer-se as respectivas caractersticas de toxicidade. Deve tambm determinar-se a
estabilidade da substncia no veculo utilizado.
1.4.2.1. Animais de ensaio
Embora possa recorrer-se a outros roedores, o rato constitui a espcie preferida. Devem utilizar-se animais
adultos, jovens e saudveis, de estirpes correntes de laboratrio. As fmeas devem ser nulparas e no grvidas.
A administrao da substncia deve ter incio logo que possvel aps o desmame e, em qualquer caso, antes de
os animais completarem nove semanas de idade.
No incio do estudo, a variao de massa dos animais deve ser mnima, no excedendo + 20 % da massa mdia
de cada sexo.
Caso um ensaio de toxicidade oral da dose repetida preceda um estudo a longo prazo, conveniente utilizar em
ambos os ensaios animais da mesma estirpe e provenincia.
Para cada dose, devem utilizar-se, pelo menos, 10 animais (cinco machos e cinco fmeas). Caso se preveja o
sacrifcio de alguns animais durante o ensaio, o referido nmero deve ser acrescido do nmero de animais a
sacrificar.
Alm disso, pode administrar-se a um lote extra de animais (cinco de cada sexo), durante 28 dias, a dose mais
elevada, com o objectivo de estudar a reversibilidade, a persistncia ou a manifestao retardada de efeitos
txicos nos 14 dias subsequentes administrao. Utiliza-se tambm um lote-satlite de 10 animais (cinco de
cada sexo) no ensaio de controlo.
1.4.2.3. Doses
De modo geral, devem utilizar-se, no mnimo, trs lotes de ensaio e um lote de controlo. Excepto no que
respeita administrao da substncia em estudo, deve proceder-se com os animais do lote de controlo do
mesmo modo que com os animais dos lotes de ensaio. Caso se recorra a um veculo para a administrao da
substncia em estudo, deve administrar-se o volume mximo do mesmo aos animais do lote de controlo.
Se, com base em outros dados, for previsvel que a dose de 1 000 mg/kg de massa corporal/dia no determine
quaisquer efeitos, pode proceder-se a um ensaio-limite. Na ausncia de dados adequados, pode realizar-se um
rastreio, de modo a determinar as doses a administrar.
Na seleco das doses devem ter-se em conta os eventuais dados disponveis em matria de toxicidade e
toxicocintica referentes substncia em causa ou a produtos afins. A dose mais elevada deve ser escolhida com
o objectivo de induzir efeitos txicos, evitando contudo a morte e o sofrimento intenso. Posteriormente, deve
seleccionar-se uma sequncia decrescente de doses, com o objectivo de evidenciar uma correlao entre a dose
administrada e a reaco observada, bem como a ausncia de efeitos adversos associados administrao da
dose mnima (NOAEL). A diferena ptima entre as doses consiste, frequentemente, num factor de 2 a 4; em
muitos casos, a utilizao de um quarto lote de ensaio prefervel ao recurso a intervalos de grande amplitude
(superior a um factor de 10) entre as doses.
Caso a substncia em estudo seja administrada atravs dos alimentos ou da gua para beber, deve assegurar-se
que as respectivas quantidades no perturbam o equilbrio nutricional e o balano hdrico normais. Se a
substncia for administrada com os alimentos, pode utilizar-se uma concentrao alimentar constante, expressa
em ppm, ou uma dose constante, expressa em relao massa corporal dos animais; deve especificar-se a
alternativa adoptada. No caso do recurso a uma sonda gstrica, a dose deve ser administrada diariamente
mesma hora e, se necessrio, ajustada de modo a manter uma dose constante em relao massa corporal do
animal.
Caso um ensaio de toxicidade oral da dose repetida preceda um estudo a longo prazo, conveniente utilizar
uma dieta semelhante em ambos os ensaios.
1.4.2.4. Ensaio-limite
Sempre que um ensaio, realizado de acordo com o presente mtodo, que utilize uma dose de, pelo menos,
1 000 mg/kg de massa corporal/dia ou, no caso da administrao atravs dos alimentos ou da gua para beber,
uma percentagem equivalente em relao aos mesmos (com base na determinao da massa corporal), no
produza efeitos txicos observveis, ou se, tendo em conta dados referentes a substncias estruturalmente afins,
no se preveja o surgimento de efeitos txicos, poder no ser necessrio efectuar um estudo completo com
trs doses. Nestes casos, justifica-se a realizao de um ensaio-limite, excepto se a exposio humana indicar a
necessidade de recurso a uma dose superior.
O perodo de observao deve ser de 28 dias. Os animais includos nos lotes extras destinados a ensaios
subsequentes devem ser mantidos em observao durante, pelo menos, 14 dias suplementares, de modo a
detectar a ocorrncia retardada, a persistncia ou a recuperao dos efeitos txicos.
1.4.3. Procedimento
A substncia administrada diariamente aos animais durante um perodo de 28 dias; em casos devidamente
justificados, pode proceder-se administrao cinco dias por semana. A administrao forada deve efectuar-se
numa dose nica, por intermdio de uma sonda gstrica ou de uma cnula de intubao adequada. O volume
mximo de lquido administrado em cada operao depende das dimenses do animal, no devendo exceder 1
ml/100 g de massa corporal, excepto no que respeita a solues aquosas, em que podem utilizar-se 2 ml/100 g
de massa corporal. Salvo no caso de substncias corrosivas ou irritantes, cujos efeitos so, de modo geral,
agravados em concentraes mais elevadas, devem minimizar-se as variaes no volume mediante o
ajustamento da concentrao, de modo a assegurar um volume constante para todas as doses.
1.4.3.1. Observaes gerais
Deve efectuar-se um exame clnico pelo menos uma vez por dia, de preferncia mesma hora, em funo do
perodo previsto de efeitos mais agudos devidos administrao da substncia, registando-se o estado de sade
dos animais. Alm disso, deve proceder-se observao de todos os animais pelo menos duas vezes por dia, de
modo a determinar a respectiva morbilidade e mortalidade. Os animais moribundos, bem como aqueles que
apresentem sinais de dor e sofrimento intensos, devem ser removidos, abatidos por interveno humana e
autopsiados.
Deve proceder-se a um exame clnico aprofundado de todos os animais pelo menos uma vez antes da primeira
exposio (de modo a permitir efectuar comparaes com o mesmo indivduo) e pelo menos uma semana aps
a mesma. O exame deve decorrer no exterior da gaiola, num recinto adequado e, de preferncia, mesma hora.
As observaes devem ser cuidadosamente registadas, de preferncia por recurso a um sistema definido em
pormenor pelo laboratrio em causa. Devem procurar minimizar-se eventuais alteraes das condies de
ensaio e assegurar que a observao seja efectuada por pessoal exterior ao mesmo. Os sinais anotados devem
incluir alteraes na pele, no plo, nos olhos e nas mucosas, bem como a ocorrncia de secrees, excrees ou
actividade autnoma (como, por exemplo, lacrimao, ereco pilosa, alteraes nas pupilas, respirao
anormal). Deve tambm registar-se quaisquer alteraes da atitude, postura e reaco manipulao, alm da
ocorrncia de movimentos clnicos ou tnicos e comportamentos estereotipados (por exemplo, actos de
higiene repetitivos, movimentos circulares repetitivos) ou estranhos (automutilao, marcha para a retaguarda).
Na 4.
a
semana de exposio deve determinar-se a reaco sensorial a diversos tipos de estmulos (auditivos,
visuais e proprioceptivos), bem como a fora da preenso e a actividade motora. A bibliografia indicada na
parte B da Introduo Geral fornece pormenores sobre os procedimentos a adoptar.
Se o ensaio em causa preceder um estudo de toxicidade subcrnica a 90 dias, podem omitir-se as observaes
funcionais na 4.
a
semana de exposio, que devero efectuar-se no mbito do ensaio subsequente. Alm disso, a
existncia de dados relativos a observaes funcionais efectuadas no mbito do ensaio da dose repetida facilita a
seleco das doses a utilizar no estudo de toxicidade subcrnica posterior.
Excepcionalmente, podem omitir-se as observaes funcionais no caso de lotes que apresentem sinais de
toxicidade numa extenso susceptvel de interferir de modo significativo com as mesmas.
1.4.3.2. Massa corporal e consumo de alimentos e gua para beber
Todos os animais devem ser pesados com uma frequncia pelo menos semanal, devendo tambm determinar-
-se, com a mesma frequncia, a quantidade de alimentos e de gua para beber consumidos, facto que se reveste
de especial importncia no caso de a substncia em estudo ser administrada atravs da gua para beber.
1.4.3.3. Hematologia
No final do ensaio, devem determinar-se os seguintes parmetros hematolgicos: hematcrito, concentrao de
hemoglobina, contagem de eritrcitos, contagem total e diferencial de leuccitos, contagem de plaquetas e
medida do tempo/potencial de coagulao.
As colheitas de sangue devem ser efectuadas numa zona determinada, imediatamente antes do abate dos
animais ou no mbito do mesmo, devendo armazenar-se as amostras em condies adequadas.
1.4.3.4. Bioqumica clnica
Devem tambm efectuar-se determinaes bioqumicas destinadas a investigar os principais efeitos txicos
sobre os tecidos, nomeadamente renal e heptico, com amostras de sangue de todos os animais, colhidas
imediatamente antes do respectivo abate ou no mbito do mesmo ( excepo dos animais encontrados
moribundos ou abatidos no decurso do ensaio). Recomenda-se que os animais sejam jejuados desde a vspera
da colheita de sangue (
1
). Os parmetros a determinar no plasma ou no soro so os seguintes: sdio, potssio,
glucose, colesterol total, ureia, creatinina, protenas totais e albumina, alm de, pelo menos, dois enzimas
indicadores dos efeitos hepatocelulares (tais como a alanina-aminotransferase, a aspartato-aminotransferase, a
fosfatase alcalina, a y-glutamil-transpeptidase e a sorbitol-desidrogenase). A determinao de outros enzimas de
origem heptica ou diversa, bem como de cidos biliares, poder, em determinados casos, proporcionar
informaes teis.
(
1
) No caso de algumas determinaes no soro e no plasma, como o caso da glucose, aconselhvel jejuar os animais desde a vspera. O
principal motivo deste facto reside em que a maior variabilidade dos resultados determinada pela ausncia de jejum pode ocultar
determinados efeitos, dificultando a interpretao dos resultados. No entanto, o jejum desde a vspera pode interferir com o metabolismo
geral dos animais, nomeadamente no caso de estudos por via alimentar, alterando a exposio diria substncia em estudo. Assim, caso
se opte pelo jejum desde a vspera, as anlises bioqumicas devem ser efectuadas aps observaes funcionais a realizar na 4.
a
semana do
ensaio.
Como opo, podem realizar-se na ltima semana do ensaio as seguintes determinaes na urina, recolhida de
acordo com um programa previamente estabelecido: aparncia, volume, osmolalidade ou gravidade especfica,
pH, protenas, glucose e sangue/hematcitos.
Alm disso, deve prever-se a pesquisa de marcadores sricos que forneam indicaes gerais sobre a leso de
tecidos. Caso as propriedades conhecidas da substncia afectem, ou se preveja que possam afectar, o perfil
metablico da mesma, devem realizar-se outras determinaes, nomeadamente de clcio, fosfatos, triglicridos
em jejum, hormonas especficas, meta-hemoglobina e colinesterase. A necessidade de efectuar tais
determinaes estabelecida em funo do tipo de substncia em estudo ou de cada caso especfico.
De modo geral, deve adoptar-se uma abordagem flexvel, em funo das espcies e dos efeitos observados ou
previstos da substncia em causa.
Se os dados disponveis relativos a ensaios anteriores se revelarem inadequados, devem determinar-se
parmetros hematolgicos e bioqumicos antes de administrar a substncia.
1.4.3.5. Autpsia
Todos os animais devem ser objecto de uma autpsia pormenorizada que inclua o exame da superfcie exterior
do corpo, dos orifcios e das cavidades craniana, torcica e abdominal, bem como do respectivo contedo.
Devem remover-se de modo adequado as membranas aderentes a rgos tais como o fgado, os rins, as
glndulas supra-renais, os testculos, os epididimos, o timo, o bao, o crebro e o corao, cuja massa hmida
deve ser determinada logo que possvel aps a dissecao, de modo a evitar a respectiva dessecao.
Os rgos e tecidos que se seguem devem ser conservados num meio de fixao adequado aos mesmos, bem
como ao tipo de exame histopatolgico subsequente: todos os tecidos que apresentem leses evidentes,
encfalo (regies representativas, nomeadamente crebro, cerebelo e protuberncia), espinal medula, estmago,
intestino delgado e clon (incluindo as placas de Peyer), fgado, rins, glndulas supra-renais, bao, corao,
timo, tiride, traqueia e pulmes (conservados por insuflao com fixador seguida de imerso), gnadas,
rgos genitais acessrios (por exemplo, tero e prstata), bexiga, gnglios linfticos (de preferncia um gnglio
situado na via de administrao e um gnglio distante da mesma, de modo a investigar possveis efeitos
sistmicos), nervos perifricos (citico ou tibial), nomeadamente na proximidade de msculos, e uma seco de
medula ssea (ou, como alternativa, um aspirado de medula ssea recentemente montado). Em funo das
observaes clnicas ou de natureza diversa efectuadas, poder ser necessrio examinar outros tecidos. Devem
tambm conservar-se quaisquer rgos susceptveis de constiturem alvos da substncia em estudo, em virtude
das propriedades conhecidas da mesma.
1.4.3.6. Exame histopatolgico
Deve proceder-se ao exame histopatolgico dos rgos e tecidos conservados dos animais do lote de controlo,
bem como dos lotes sujeitos a doses elevadas. Caso o exame destes ltimos revele alteraes atribuveis
substncia em estudo, devem examinar-se tambm os animais de todos os lotes restantes.
Devem examinar-se todas as leses importantes.
Sempre que se recorra a um lote extra, deve proceder-se ao exame histopatolgico dos tecidos e rgos que
tenham revelado alteraes nos animais dos restantes lotes.
DADOS
Devem registar-se os dados relativos a cada animal. Alm disso, todos os dados devem ser resumidos num
quadro, referindo-se, para cada lote de ensaio, o nmero de animais utilizados, o nmero de animais
encontrados mortos ou abatidos por interveno humana, a hora da morte de cada animal, o nmero de
animais que apresentam sinais de toxicidade, a descrio dos sinais de toxicidade observados, nomeadamente o
tempo decorrido at respectiva manifestao, bem como a sua durao e gravidade, o nmero de animais que
apresentem leses, o tipo de leses e a percentagem de animais que apresentam cada tipo de leses.
Sempre que possvel, os resultados numricos devem ser avaliados por recurso a um mtodo estatstico de
aceitao geral, cuja escolha deve ser efectuada na fase de concepo do ensaio.
3. RELATRIO
RELATRIO DO ENSAIO
espcie/estirpe;
provenincia, condies de alojamento, dieta administrada, etc.;
massa de cada animal determinada no incio do ensaio, semanalmente aps a administrao da
substncia e no final do ensaio.
Condies de ensaio:
justificao da escolha de um veculo no aquoso;
motivo da seleco da dose de partida;
pormenores relativos preparao da substncia em estudo e sua eventual incorporao nos
alimentos, nomeadamente a respectiva concentrao, estabilidade e homogeneidade;
pormenores relativos administrao da substncia em estudo;
equivalncia entre a concentrao da substncia em estudo nos alimentos ou na gua para beber,
expressa em ppm, e a dose, expressa em mg/kg de massa corporal, se for caso disso;
pormenores relativos qualidade dos alimentos e da gua.
Resultados:
massa corporal e respectivas alteraes;
consumo de alimentos e de gua, se for caso disso;
reaces txicas em funo do sexo e da dose administrada, nomeadamente sinais de toxicidade;
natureza, gravidade e durao dos sinais clnicos (reversveis ou no);
dados relativos actividade sensorial, fora de preenso e actividade motora;
resultados da anlise hematolgica, acompanhados dos respectivos parmetros de base;
resultados da anlise bioqumica, acompanhados dos respectivos parmetros de base;
massa corporal aquando do abate e massa dos diversos rgos;
dados obtidos por autpsia;
dados histopatolgicos pormenorizados;
dados de absoro, caso se encontrem disponveis;
tratamento estatstico dos resultados, se for caso disso.
Concluses.
4. REFERNCIAS
B.8. TOXICIDADE (INALAO) DA DOSE REPETIDA (28 DIAS)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
til possuir informaes preliminares sobre a distribuio granulomtrica, a presso de vapor, o ponto de
fuso, o ponto de ebulio, o ponto de inflamao e a explosividade (se aplicvel) da substncia.
Ver tambm a Introduo Geral, parte B (ponto A).
1.2. DEFINIO
Nenhuma.
Vrios grupos de animais de experincia so expostos diariamente, por um perodo determinado, a
concentraes diferentes das substncias a ensaiar, razo de uma concentrao por grupo, durante um
perodo de 28 dias. No caso de se utilizar um veculo para auxiliar a obter uma concentrao apropriada da
substncia de ensaio na atmosfera, deve utilizar-se um grupo de controlo para o veculo. Durante o perodo de
administrao os animais so observados diariamente para se detectar as manifestaes de toxicidade. Os
animais que morrem durante a experincia so autopsiados e no fim da experincia os animais sobreviventes
so igualmente autopsiados.
Nenhum.
1.6.1. Preparativos
Os animais so mantidos nas condies de alojamento e de alimentao da experincia pelo menos durante
cinco dias antes do ensaio. Antes de se comear o ensaio os animais jovens e saudveis so distribudos
aleatoriamente pelos grupos submetidos ao tratamento e pelo grupo de controlo. Se necessrio pode adicionar-
-se um veculo substncia de ensaio para se conseguir uma concentrao apropriada desta na atmosfera; no
caso de se utilizar um veculo ou outros aditivos para facilitar a administrao, estes devem ser
comprovadamente no txicos. Pode recorrer-se a dados anteriormente publicados, se necessrio.
1.6.2. Condies da experincia
Salvo contra-indicao, a espcie preferida o rato. Devem utilizar-se animais jovens e saudveis de uma estirpe
vulgarmente utilizada em laboratrio.
No incio da experincia a diferena de peso entre os animais no poder ultrapassar 20 % do peso mdio
apropriado.
Para cada grupo de ensaio sero utilizados pelo menos 10 animais (cinco fmeas e cinco machos). As fmeas
devero ser nulparas e no grvidas. Se for previsvel sacrificar alguns animais durante a experincia, deve
acrescentar-se ao nmero inicial o nmero de animais que se prev vir a sacrificar. Para alm destes, poder
haver um grupo-satlite de 10 animais (cinco animais de cada sexo) tratado com a dose mais elevada durante
28 dias e observado quanto reversibilidade, persistncia ou aparecimento tardio de efeitos txicos durante
14 dias aps o tratamento. Utiliza-se tambm um grupo-satlite de 10 animais de controlo (cinco animais de
cada sexo).
1.6.2.3. Concentrao de exposio
So utilizadas pelo menos trs concentraes, com um grupo de controlo ou, se necessrio, com um grupo de
controlo para o veculo quando este for utilizado (correspondendo concentrao do veculo ao nvel de
exposio mais elevada). Os animais do grupo de controlo so tratados da mesma forma que os animais dos
grupos de experincia com excepo da inalao da substncia de ensaio. A concentrao mais elevada dever
produzir efeitos txicos mas nenhuma ou poucas mortes. A menor concentrao no dever produzir
quaisquer manifestaes de toxicidade. No caso de se dispor de informao sobre a exposio humana, a
concentrao mais baixa ser superior a esse valor. O ideal seria a concentrao intermdia produzir o efeito
txico mnimo observvel. No caso de se utilizar vrias concentraes intermdias, a diferena entre elas ser
calculada de forma a conseguir-se uma gradao dos efeitos txicos. Nos grupos de concentrao baixa e
intermdia, assim como nos grupos de controlo, a incidncia de mortalidade dever ser baixa para permitir
uma avaliao significativa dos resultados.
1.6.2.4. Tempo de exposio
A durao da exposio diria dever ser de seis horas, podendo utilizar-se outros perodos para satisfazer
exigncias especficas.
Os animais sero expostos substncia de ensaio por meio de um dispositivo de inalao concebido de forma a
conseguir-se um fluxo de ar contnuo que assegurar pelo menos 12 renovaes de ar por hora e que garanta
uma concentrao de oxignio apropriada e uma distribuio uniforme do produto de ensaio no ar. No caso de
se utilizar uma cmara, esta ser concebida de maneira a obter-se uma superlotao mnima dos animais e uma
exposio mxima substncia de ensaio. Como regra geral, para se assegurar a estabilidade da atmosfera na
cmara, o volume total dos animais de experincia no dever ultrapassar 5 % do volume da cmara de
ensaio. Pode recorrer-se tambm a um sistema de exposio oronasal, apenas de cabea ou do corpo inteiro,
em cmara individual; os dois primeiros tipos de exposio permitem reduzir a penetrao por outras vias.
Os animais da experincia devero ser observados diariamente para se detectar manifestaes de toxicidade
durante todo o perodo de exposio e de recuperao. Proceder-se- ao registo do momento da morte e bem
assim do momento do aparecimento e desaparecimento das manifestaes de toxicidade.
1.6.3. Procedimento
Os animais so expostos diariamente substncia de ensaio, cinco a sete dias por semana, durante um perodo
de 28 dias. Os animais dos grupos-satlite destinados s observaes complementares sero mantidos vivos
durante mais 14 dias, sem tratamento, para se detectar a recuperao ou persistncia dos efeitos txicos. A
temperatura a que se efectua o ensaio dever ser mantida a 22 3
o
C.
Em condies ptimas, a humidade relativa dever ser mantida entre 30 % e 70 % mas, nalguns casos, isto
pode ser impraticvel (por exemplo, nos ensaios com aerossis). A manuteno de uma presso ligeiramente
negativa no interior da cmara de ensaio (< 5 mm de gua) evitar a fuga da substncia de ensaio para o meio
envolvente. Durante a exposio os animais no recebero alimentos nem gua.
Dever ser utilizado um sistema de inalao dinmico com um dispositivo apropriado de controlo analtico da
concentrao. Recomenda-se a realizao de um ensaio preliminar para se determinar as concentraes
apropriadas de exposio. O dbito de ar dever assegurar concentraes homogneas em toda a cmara de
exposio. O sistema dever permitir a obteno de condies estveis o mais rapidamente possvel.
a) dbito de ar (permanentemente);
b) a concentrao real da substncia de ensaio medida na zona de respirao. Durante o perodo de
exposio diria a concentrao no variar alm de 15 % do valor mdio. Contudo, no caso de alguns
aerossis esta preciso pode no ser possvel e poder ser aceitvel uma variao maior. Durante toda a
durao da experincia as concentraes dirias sero mantidas o mais constantes possvel. Para os
aerossis dever-se- efectuar semanalmente e por grupo de ensaio pelo menos uma anlise
granulomtrica das partculas;
c) temperatura e humidade, continuamente se for possvel.
Durante e aps a exposio s concentraes so feitas observaes e registadas sistematicamente; so feitas
fichas individuais para cada animal. Todos os animais sero observados diariamente e as manifestaes de
toxicidade, assim como o momento do seu aparecimento, a sua intensidade e a sua durao, sero registados.
As observaes devero incluir as modificaes da pele e do plo, dos olhos, das mucosas, do aparelho
respiratrio, do aparelho circulatrio, do sistema nervoso autnomo e central, da actividade somatomotora e
do comportamento. Determinar-se- semanalmente o peso dos animais. Recomenda-se tambm a
determinao do consumo alimentar semanal. Deve observar-se regularmente os animais para se evitar
perdas, tanto quanto possvel, causadas por canibalismo, autlise dos tecidos ou condies imprprias de
alojamento. No fim da experincia todos os animais sobreviventes dos grupos tratados no satlites sero
autopsiados. Os animais moribundos e os animais que apresentem graves sintomas de angstia ou dor devero
ser imediatamente retirados, sacrificados e submetidos a autpsia.
Os exames a seguir enunciados devero ser efectuados no fim do perodo de ensaio para todos os animais
incluindo os de controlo:
i) um exame hematolgico compreendendo os seguintes testes: hematcrito, concentrao de
hemoglobina, contagem de eritrcitos, contagem de leuccitos, frmula leucocitria, bem como um
estudo sobre o potencial de coagulao;
ii) a determinao de dados bioqumicos do sangue incluindo pelo menos um parmetro da funo heptica
e renal: alanina aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutmico-pirvica),
aspartato aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutmico-oxalo-actica), azoto
ureico, albumina, creatinina plasmtica, bilirrubina total e as protenas sricas totais.
As outras anlises eventualmente necessrias para uma avaliao toxicolgica adequada incluem as anlises de
clcio, fsforo, cloretos, sdio, potssio, glicose em jejum, anlises de lpidos, de hormonas, equilbrio cido-
-bsico, meta-hemoglobina e actividade colinestersica.
Pode recorrer-se a outras anlises bioqumicas clnicas sempre que necessrio para melhorar a investigao dos
efeitos observados.
1.6.3.1. Autpsia
Todos os animais submetidos a experincia devero ser submetidos a uma autpsia geral. Pelo menos o fgado,
os rins, as glndulas supra-renais, os pulmes e os testculos devero ser pesados ainda hmidos, to cedo
quanto possvel aps a dissecao para se evitar a perda de lquidos por evaporao. Tanto os rgos como os
tecidos (tracto respiratrio, fgado, rim, bao, testculos, glndulas supra-renais, corao e quaisquer rgos que
apresentem leses graves ou alteraes de volume) devero ser conservados num meio adequado para um
eventual exame histopatolgico futuro. Os pulmes devero ser removidos intactos, pesados e tratados com
um fixador adequado para se garantir que a estrutura do pulmo seja mantida.
No grupo tratado com a concentrao mais elevada e nos grupos de controlo o exame histolgico dever ser
efectuado em rgos e tecidos conservados. Os rgos e tecidos que apresentem efeitos susceptveis de serem
atribudos substncia de ensaio administrada na dose mais elevada devero ser examinados em todos os
grupos tratados com doses inferiores. Deve proceder-se a um exame histolgico dos animais de qualquer
grupo-satlite com particular nfase sobre os rgos e tecidos que apresentaram efeitos identificados nos outros
grupos tratados.
2. RESULTADOS
Os resultados sero resumidos na forma de quadros indicando, para cada experincia, o nmero de animais no
incio do ensaio e o nmero de animais que apresenta cada tipo de leso.
Todos os resultados observados devero ser avaliados por um mtodo estatstico apropriado. Pode ser utilizado
qualquer mtodo estatstico reconhecido.
3. RELATRIO
espcie, estirpe, origem, condies ambientais, dieta, etc.;
condies experimentais:
Descrio do aparelho de exposio incluindo projecto, tipo, dimenses, fonte de ar, sistema gerador de
aerossis, mtodo de condicionamento de ar, tratamento do ar evacuado e, no caso disso, o mtodo de
acondicionamento dos animais na cmara de ensaio. Deve apresentar-se uma descrio do equipamento
utilizado para medir a temperatura, a humidade e, se necessrio, a estabilidade das concentraes do
aerossol ou da distribuio granulomtrica das partculas.
Dados relativos exposio:
Estes dados sero apresentados sob a forma de um quadro indicando os valores mdios, assim como uma
medida de variao (por exemplo, o desvio-padro) e diro respeito:
a) aos dbitos de ar atravs do dispositivo de inalao,
b) temperatura e humidade do ar,
c) s concentraes nominais (quantidade total da substncia de ensaio introduzida no dispositivo de
inalao, dividida pelo volume de ar),
d) natureza do veculo, se utilizado,
e) s concentraes reais na zona de respirao,
f) ao dimetro aerodinmico mdio de massa (DAMM) e ao desvio-padro geomtrico (DPG);
resposta txica por sexo e por concentrao;
momento da morte durante a experincia ou indicao dos animais sobreviventes;
descrio dos efeitos txicos ou outros; dose que no produz efeito;
momento de observao de qualquer manifestao anormal e sua evoluo;
dados relativos alimentao e peso corporal;
exames hematolgicos efectuados e seus resultados;
testes bioqumicos clnicos utilizados e seus resultados;
resultados da autpsia;
descrio pormenorizada de todas as observaes histopatolgicas;
tratamento estatstico dos resultados sempre que possvel;
discusso dos resultados;
4. REFERNCIAS
B.9. TOXICIDADE (DRMICA) DA DOSE REPETIDA (28 DIAS)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver Introduo Geral parte B (ponto A).
1.2. DEFINIES
Nenhuma.
Administra-se pele diariamente a substncia de ensaio, em doses graduadas, a diversos grupos de animais de
experincia, utilizando-se uma dose por grupo durante um perodo de 28 dias. Durante o perodo de
administrao observa-se os animais diariamente para se detectar manifestaes de toxicidade. Faz-se a autpsia
dos animais mortos durante o ensaio e no final do ensaio faz-se tambm a autpsia dos animais que
sobreviveram ao teste.
Nenhum.
1.6.1. Preparativos
Os animais so mantidos sob as condies de alojamento e alimentao experimentais durante pelo menos
cinco dias antes do ensaio. Antes do ensaio procede-se a uma escolha aleatria de animais adultos, jovens e
saudveis e que so distribudos por grupos de tratamento. Pouco tempo antes de se iniciar o ensaio rapa-se os
plos da regio dorsal dos animais. No caso de se recorrer tosquia esta dever ser efectuada aproximadamente
24 horas antes do ensaio. Normalmente necessrio repetir estas operaes todas as semanas, devendo tomar-
-se muito cuidado para no lesar a pele. A rea destinada aplicao da substncia de ensaio no poder ser
inferior a 10 % da superfcie corporal. O peso do animal dever ser tomado em considerao na deciso da
zona a expor e da dimenso da superfcie a tratar. Sempre que se procede ao ensaio de substncias slidas, as
quais podem ser pulverizadas se necessrio, a substncia de ensaio deve ser humedecida com gua ou com um
veculo apropriado para garantir um bom contacto com a pele. As substncias de ensaio lquidas so
geralmente utilizadas sem serem diludas. Procede-se a uma aplicao diria durante cinco a sete dias por
semana.
1.6.2. Condies da experincia
Podem ser utilizados ratos adultos, coelhos ou cobaias. Outras espcies podero ser utilizadas mas a sua
utilizao dever ser justificada.
No incio da experincia a diferena de peso entre os animais no poder ultrapassar 20 % do peso mdio
apropriado.
Para cada grupo de ensaio sero utilizados pelo menos 10 animais (cinco fmeas e cinco machos) com pele
saudvel. As fmeas devero ser nulparas e no grvidas. Se for previsvel sacrificar alguns animais durante a
experincia, deve acrescentar-se ao nmero inicial o nmero de animais que se prev vir a sacrificar. Para alm
destes, poder haver um grupo-satlite de 10 animais (cinco animais de cada sexo) tratado com a dose mais
elevada durante 28 dias e observado quanto reversibilidade, persistncia ou aparecimento tardio de efeitos
txicos durante 14 dias aps o tratamento. Utiliza-se tambm um grupo-satlite de 10 animais de controlo
(cinco animais de cada sexo).
1.6.2.3. Doses
So necessrias pelo menos trs doses diferentes com um controlo ou com um veculo de controlo no caso de
ser utilizado um veculo. O perodo de exposio dever ser no mnimo de seis horas por dia. A substncia de
ensaio ser aplicada diariamente mesma hora e a quantidade a administrar ser ajustada regularmente
(semanal ou bissemanalmente) de modo a manter-se constante relativamente ao peso corporal do animal. Os
animais do grupo de controlo sero tratados da mesma maneira que os animais dos grupos de experincia, com
excepo da aplicao da substncia de ensaio. No caso de se utilizar um veculo para facilitar a administrao,
este ser administrado ao grupo de controlo da mesma forma que aos grupos tratados, devendo a dose
corresponder do grupo tratado com a dose mais elevada. A dose mais elevada ser determinada de forma a
produzir efeitos txicos mas nunca, ou raramente, a morte do animal. A dose mais baixa no dever produzir
quaisquer efeitos txicos. No caso de se dispor de informao sobre a exposio humana, a dose mais baixa
dever exceder esse valor. O ideal seria a dose intermdia produzir o efeito txico mnimo observado. No caso
de se utilizar vrias doses intermdias, a diferena entre elas ser calculada de forma a conseguir-se uma
gradao dos efeitos txicos. Nos grupos das doses mais baixa e intermdia, assim como nos grupos de
controlo, a incidncia da mortalidade dever ser baixa para permitir uma avaliao significativa dos resultados.
No caso de a aplicao da substncia de ensaio provocar uma grave irritao cutnea, dever-se- reduzir as
concentraes, o que poder originar uma diminuio ou at um desaparecimento dos outros efeitos txicos da
dose mais elevada. Se as leses cutneas forem muito graves, pode tornar-se necessrio interromper a
experincia e recome-la com concentraes mais fracas.
1.6.2.4. Teste-limite
Se j tiver sido efectuada uma experincia preliminar com uma dose de 1 000 mg/kg ou com uma dose mais
elevada em funo da possibilidade de uma exposio humana conhecida, que no tenha provocado quaisquer
efeitos txicos, ser intil prosseguir a experincia.
Os animais da experincia sero observados diariamente para se detectar manifestaes de toxicidade. Proceder-
-se- ao registo do momento da morte e do momento do aparecimento e do desaparecimento das manifestaes
de toxicidade.
1.6.3. Procedimento
Os animais sero colocados em gaiolas individuais. Em condies ideais a substncia de ensaio ser
administrada aos animais sete dias por semana durante um perodo de 28 dias. Os animais de todos os grupos-
-satlite que forem objecto de observaes complementares sero mantidos vivos durante mais 14 dias, sem
tratamento, para se detectar a recuperao ou a persistncia dos efeitos txicos. O tempo de exposio ser pelo
menos de seis horas por dia.
A substncia de ensaio ser aplicada uniformemente numa rea equivalente a 10 % da superfcie total do corpo.
No caso de substncias altamente txicas, a superfcie a utilizar poder ser menor mas a camada da substncia
dever ser o mais fina e uniforme possvel.
Durante a exposio a substncia de ensaio mantida em contacto com a pele por meio de uma gaze porosa e
de um adesivo antialrgico. A superfcie tratada ser por sua vez convenientemente coberta de maneira a
manter no seu lugar a gaze e a substncia de ensaio e de modo a evitar que os animais ingiram a referida
substncia. possvel utilizar aparelhos de conteno para evitar a ingesto da substncia, mas no se
recomenda a imobilizao completa. Como alternativa pode utilizar-se uma coleira de proteco.
No fim do tempo de exposio necessrio, se possvel, eliminar todos os resduos da substncia utilizando
gua ou recorrendo a qualquer outro mtodo adequado para limpeza da pele.
Os animais sero observados diariamente, registando-se sempre as manifestaes de toxicidade assim como o
momento do seu aparecimento, a sua intensidade e a sua durao. Proceder-se- observao das modificaes
do plo e da pele, dos olhos e das mucosas, do aparelho respiratrio, do aparelho circulatrio, do sistema
nervoso autnomo e central, assim como da actividade somatomotora e do comportamento. Determinar-se-
semanalmente o peso dos animais. Recomenda-se tambm que se determine semanalmente o consumo
alimentar. Deve observar-se regularmente os animais para se evitar perdas, tanto quanto possvel, causadas por
canibalismo, autlise dos tecidos ou condies imprprias de alojamento. No fim da experincia todos os
animais sobreviventes dos grupos tratados no satlites sero autopsiados. Os animais moribundos e os
animais que apresentem graves sintomas de angstia ou dor devero ser imediatamente retirados, sacrificados e
submetidos a autpsia.
Os exames a seguir enunciados devero ser efectuados no fim do perodo de ensaio para todos os animais
incluindo os de controlo:
1. Um exame hematolgico compreendendo os seguintes testes: hematcrito, concentrao de
hemoglobina, contagem de eritrcitos, contagem de leuccitos, frmula leucocitria, bem como um
estudo sobre o potencial de coagulao.
2. A determinao de dados bioqumicos do sangue incluindo pelo menos um parmetro da funo
heptica e renal: alanina aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutmico-
-pirvica), aspartato aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutmico-oxalo-a-
ctica), azoto ureico, albumina, creatinina plasmtica, bilirrubina total e as protenas sricas totais.
As outras anlises eventualmente necessrias para uma avaliao toxicolgica adequada incluem as anlises de
clcio, fsforo, cloretos, sdio, potssio, glicose em jejum, anlises de lpidos, de hormonas, equilbrio cido-
-bsico, meta-hemoglobina e actividade colinestersica.
Pode recorrer-se a outras anlises bioqumicas clnicas sempre que necessrio para melhorar a investigao dos
efeitos observados.
1.6.4. Autpsia
Todos os animais submetidos a experincia devero ser submetidos a uma autpsia geral. Pelo menos o fgado,
os rins, as glndulas supra-renais e os testculos devero ser pesados ainda hmidos, to cedo quanto possvel
aps a dissecao para se evitar a perda de lquidos por evaporao. Todos os rgos e tecidos, isto , pele
normal e tratada, fgado, rins, bao, testculos, glndulas supra-renais, corao e rgos-alvo (isto , os rgos
que apresentem leses graves ou variaes de volume) devero ser conservados num meio adequado para
eventual exame histopatolgico futuro.
1.6.5. Exame histopatolgico
No grupo tratado com a dose mais elevada e no grupo de controlo deve efectuar-se o exame histolgico dos
rgos e tecidos conservados. Os rgos e tecidos que apresentem efeitos susceptveis de serem atribudos
substncia de ensaio administrada na dose mais elevada devero ser examinados em todos os grupos tratados
com doses inferiores. Deve proceder-se a um exame histolgico dos animais de qualquer grupo-satlite com
particular nfase sobre os rgos e tecidos que apresentaram efeitos identificados nos outros grupos tratados.
2. RESULTADOS
Os resultados sero resumidos na forma de quadros indicando, para cada experincia, o nmero de animais no
incio do ensaio e o nmero de animais que apresenta cada tipo de leso.
Todos os resultados observados devero ser avaliados por um mtodo estatstico apropriado. Pode ser utilizado
qualquer mtodo estatstico reconhecido.
3. RELATRIO
dados sobre os animais (espcie, estirpe, origem, condies ambientais, dieta, etc.),
condies experimentais (incluindo o tipo de cobertura: oclusiva ou no oclusiva),
doses (incluindo o veculo, se utilizado) e concentraes,
dose sem efeito, se possvel,
resposta txica por sexo e por dose,
momento da morte durante a experincia ou indicao dos animais sobreviventes no fim da experincia,
efeitos txicos ou outros,
momento da observao de qualquer manifestao anormal e sua evoluo,
dados relativos alimentao e peso corporal,
exames hematolgicos efectuados e resultados,
provas bioqumicas clnicas utilizadas e seus resultados,
descrio pormenorizada de todos os resultados histopatolgicos,
tratamento estatstico dos resultados, se possvel,
discusso dos resultados,
4. REFERNCIAS
B.10. MUTAGENICIDADE ENSAIO IN VITRO DE ABERRAES CROMOSSMICAS EM MAMFEROS
1. MTODO
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 473 Ensaio in vitro de aberraes cromossmicas em
mamferos (1997).
1.1. INTRODUO
O objectivo do ensaio in vitro de aberraes cromossmicas identificar os agentes que causam aberraes
estruturais dos cromossomas em culturas de clulas de mamferos (1) (2) (3). As aberraes estruturais podem
ser de dois tipos, afectando os cromossomas ou os cromatdeos. A maior parte dos mutagneos qumicos
induzem aberraes cromatdicas, mas tambm podem ocorrer aberraes cromossmicas. Um aumento da
taxa de poliploidia pode indicar que um determinado produto qumico tem potencial para induzir aberraes
numricas. Contudo, este mtodo no foi concebido para medir as aberraes numricas nem normalmente
utilizado com esse objectivo. As mutaes nos cromossomas e eventos relacionados causam diversas doenas
genticas humanas, existindo provas substanciais de que as alteraes que causam nos oncogenes e nos genes
supressores de tumores das clulas somticas esto envolvidas na induo de cancro nos seres humanos e em
animais utilizados em experincias.
O ensaio in vitro de aberraes cromossmicas pode envolver culturas de linhas celulares bem estabelecidas, de
uma determinada estirpe ou ainda culturas de clulas primrias. As clulas utilizadas so seleccionadas com
base na sua capacidade de crescimento em cultura, na estabilidade do caritipo, no nmero e diversidade dos
seus cromossomas e na frequncia das aberraes cromossmicas espontneas.
Os ensaios in vitro exigem geralmente a utilizao de uma fonte exgena de activao metablica, que no
consegue imitar inteiramente as condies in vivo nos mamferos. Deve ter-se o cuidado de evitar condies que
conduzam a resultados positivos que no sejam reflexo de uma mutagenicidade intrnseca mas que possam
resultar, por exemplo, de mudanas do pH, da presso osmtica ou ainda de nveis elevados de citotoxicidade
(4) (5).
O presente ensaio utilizado para a anlise de agentes eventualmente mutagneos ou carcinogneos para os
mamferos. Muitos dos compostos que do um resultado positivo no presente ensaio so carcinogneos nos
mamferos, no existindo, contudo, uma correlao perfeita entre o ensaio e a carcinogenicidade. A correlao
depende da classe qumica e existem cada vez mais provas de que alguns agentes carcinogneos no so
detectados por este ensaio, por os seus mecanismos de actuao no passarem directamente pela danificao do
ADN.
1.2. DEFINIES
Aberrao cromatdica: leso estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida de
unio, de cromatdeos simples.
Aberrao cromossmica: leso estrutural de um cromossoma expressa na ruptura, ou na ruptura seguida de
unio, de ambos os cromatdeos no mesmo local.
Endorreduplicao: processo mediante o qual, na sequncia de um perodo S de replicao do ADN, o ncleo
no sofre mitose, iniciando-se um novo perodo S, que resulta em cromossomas com 4, 8, 16, ... cromatdeos.
Lacuna: leso acromtica de extenso inferior largura de um cromatdeo e que determine um ligeiro
desalinhamento do mesmo.
ndice mittico: relao entre o nmero de clulas em metafase e o nmero total de clulas observadas numa
populao de clulas, que fornece uma indicao do grau de proliferao da populao em causa.
Aberrao numrica: alterao do nmero de cromossomas relativamente ao nmero de cromossomas
caracterstico das clulas utilizadas.
Poliploidia: nmero de cromossomas mltiplo do nmero haplide (n), mas diferente do nmero diplide (ou
seja, 3n, 4n, etc.).
Aberrao estrutural: alterao da estrutura dos cromossomas detectvel por exame microscpico das clulas
em metafase, na forma de supresso de segmentos, de alteraes de partes da sequncia ou da troca de
segmentos num cromatdeo ou entre cromatdeos.
As culturas celulares so expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de um sistema
de activao metablica. Aps um perodo determinado, adiciona-se um produto fixador da metafase (por
exemplo, Colcemid
ou colchicina); as clulas so colhidas, coradas e analisadas microscopicamente para

detectar a presena de aberraes cromossmicas nas clulas em metafase.
1.4.1. Preparao
1.4.1.1. Clulas
Podem utilizar-se diversas linhas celulares, estirpes ou culturas celulares primrias, incluindo clulas humanas
(por exemplo: fibroblastos do hamster da China ou linfcitos da circulao perifrica do ser humano ou de
outros mamferos).
1.4.1.2. Meios e condies de cultura
As culturas devem ser mantidas em meios de cultura e condies de incubao adequados (tipo de recipiente,
concentrao de CO
2
, temperatura e humidade). As linhas celulares e estirpes devem ser periodicamente
controladas no que respeita estabilidade do nmero modal de cromossomas e ausncia de contaminao
por micoplasma, no devendo ser utilizadas se se verificar que foram contaminadas. Deve ser conhecida a
durao do ciclo celular normal para as clulas e condies de cultura utilizadas.
1.4.1.3. Preparao das culturas
Linhas e estirpes de clulas definidas: multiplicam-se as clulas provenientes de culturas de arranque por
incubao a 37
o
C num meio cuja densidade no permita a confluncia das culturas antes da colheita.
Linfcitos: adiciona-se sangue total tratado com anticoagulante (por exemplo: heparina) ou linfticos
provenientes de indivduos saudveis a um meio de cultura contendo um agente mitognico (por exemplo: fito-
-hemoglutinina), incubando a 37
o
C.
1.4.1.4. Activao metablica
As clulas devem ser expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de um sistema
adequado de activao metablica. O sistema mais frequentemente utilizado consiste numa fraco ps-
-mitocondrial reforada com co-factor (S9) preparada a partir de fgados de roedores tratados com agentes de
induo enzimtica, como por exemplo Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) ou uma mistura de fenobarbitona e
-naftoflavona (10) (11) (12).
A fraco ps-mitocondrial geralmente utilizada em concentraes na gama dos 1-10 % v/v no meio de
ensaio final. O estado do sistema de activao metablica pode depender da classe dos produtos qumicos em
estudo. Em alguns casos pode revelar-se adequado utilizar vrias concentraes diferentes de fraco ps-
-mitocondrial.
Progressos tais como a elaborao por engenharia gentica de linhas celulares que exprimam enzimas de
activao especficos oferecem possibilidades de activao endgena. A escolha das linhas celulares a utilizar
ter de ser cientificamente justificada (por exemplo: pela relevncia do isoenzima de citocromo P450 para o
metabolismo da substncia em estudo).
1.4.1.5. Substncia em estudo/preparao
As substncias slidas devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e, se necessrio,
diludas antes de serem adicionadas s clulas. As substncias lquidas podem ser adicionadas directamente aos
sistemas em estudo e/ou diludas antes de serem adicionadas s clulas. Devem ser utilizadas preparaes
frescas da substncia em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o respectivo
armazenamento no coloca problemas para o ensaio.
1.4.2.1. Solvente/veculo
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo, devendo ser compatvel com a sobrevivncia
das clulas e com a actividade da mistura S9. Caso se utilizem solventes/veculos cujas propriedades no se
encontrem totalmente elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que
possvel, recomenda-se a utilizao de solventes/veculos aquosos. Quando forem realizados ensaios de
substncias instveis na presena de gua, os solventes orgnicos utilizados devem ser anidros. A gua poder
ser removida atravs de um filtro molecular.
A citotoxidade, a solubilidade no sistema de ensaio e as alteraes do pH ou da presso osmtica constituem
alguns dos critrios a ter em conta na determinao da concentrao mxima.
A citotoxidade deve ser determinada na experincia principal tanto na presena como na ausncia de um
sistema de activao metablica, por recurso a um indicador adequado da integridade e do crescimento
celulares, nomeadamente o grau de confluncia, as contagens de clulas viveis ou o ndice mittico. Poder ser
til determinar previamente a citotoxidade e solubilidade atravs de uma experincia preliminar.
Devem utilizar-se pelo menos trs concentraes analisveis. No caso de substncias que sejam citotxicas, as
concentraes utilizadas devem abranger uma gama compreendida entre a toxicidade mxima e uma toxicidade
reduzida ou nula; o que significa geralmente que as concentraes devem variar num factor de 2 a 10. No
momento da colheita, a concentrao mxima deve determinar uma reduo significativa (superior a 50 %) do
grau de confluncia, da contagem de clulas viveis e do ndice mittico. O ndice mittico constitui uma
medida indirecta dos efeitos citotxicos/citostticos, dependendo do tempo decorrido aps a exposio.
Todavia, a sua utilizao aceitvel no caso de culturas em suspenso, em que os restantes mtodos de
determinao da toxicidade podem revelar-se fastidiosos ou impraticveis. Os dados relativos cintica do ciclo
celular, nomeadamente o tempo mdio de gerao (TMG), podem ser utilizados como informao suplementar.
O TMG constitui, no entanto, uma mdia global, que nem sempre permite identificar a existncia de
subpopulaes com um crescimento menos rpido, podendo acontecer em alguns casos que ligeiros aumentos
do TMG possam resultar em atrasos muito substanciais no que respeita ao surgimento de aberraes.
No caso de substncias sem efeitos citotxicos considerveis, a concentrao mxima do ensaio deve ser a mais
baixa de 5 l/ml, 5 mg/ml ou 0,01 M.
Para substncias relativamente insolveis que no sejam txicas em concentraes inferiores concentrao
insolvel, a dose mxima a utilizar deve corresponder a uma concentrao acima do limite de solubilidade no
meio de cultura final aps o perodo de exposio. Em alguns casos (por exemplo: quando a toxicidade apenas
ocorre em concentraes superiores menor concentrao insolvel) conveniente ensaiar mais de uma
concentrao com precipitao visvel. Poder ser til avaliar a solubilidade no incio e no fim da exposio,
uma vez que a mesma se pode alterar durante a exposio no sistema de ensaio devido presena de clulas, de
S9, de soro, etc. A insolubilidade pode ser detectada vista desarmada. O precipitado no deve interferir com as
contagens necessrias.
1.4.2.3. Controlos negativos e positivos
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo), tanto na presena
como na ausncia de um sistema de activao metablica. Quando for utilizada activao metablica, o
produto qumico de controlo positivo deve ser o mesmo que exige a activao para dar uma resposta
mutagnica.
Para os controlos positivos deve ser utilizado um agente clastognico conhecido aos nveis de exposio
esperados, de forma a obter um aumento detectvel e reprodutvel ao longo do tempo que permita demonstrar
a sensibilidade do sistema de ensaio.
As concentraes do controlo positivo devem ser escolhidas de modo a que os seus efeitos sejam claros,
devendo ser utilizadas lminas codificadas de forma a que no sejam imediatamente identificveis pela pessoa
que procede leitura. As substncias de controlo positivo podem ser, por exemplo:
Condio de activao metablica Substncia N.
o
CAS N.
o
EINECS
Ausncia de activao metab-
lica exgena
metanossulfonato de metilo 66-27-3 200-625-0
metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7
etil nitrosureia 759-73-9 212-072-2
mitomicina C 50-07-7 200-008-6
N-xido de 4-nitroquinolina 56-57-5 200-281-1
Presena de activao metab-
lica exgena
benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5
ciclofosfamida
ciclofosfamida monohidrato
50-18-0
6055-19-2
200-015-4
Podem utilizar-se no controlo positivo outras substncias adequadas. A possibilidade de utilizao de produtos
qumicos de uma classe afim para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam.
Para cada colheita, devem tambm realizar-se controlos negativos, em que as clulas so expostas apenas ao
solvente ou veculo e ao meio de tratamento, procedendo-se do mesmo modo que num ensaio normal. Alm
disso, devem igualmente ser utilizados controlos no expostos substncia em estudo, a menos que j existam
dados de controlo que demonstrem que o solvente escolhido no induz nenhum efeito deletrio ou
mutagnico.
1.4.3. Procedimento
1.4.3.1. Exposio substncia em estudo
As clulas em crescimento so expostas substncia em estudo na presena e na ausncia de um sistema de
activao metablica. Os linfcitos devem ser expostos substncia em estudo cerca de 48 horas aps o
estmulo mitognico.
1.4.3.2. Normalmente, devem ser utilizadas culturas em duplicado para cada concentrao, sendo fortemente
recomendada a utilizao de culturas em duplicado tambm para os controlos negativos/solventes. Quando
puder ser demonstrado, a partir dos dados de experincias anteriores, que a diferena entre as culturas
duplicadas mnima (13) (14), pode aceitar-se a utilizao de uma nica cultura para cada concentrao.
As substncias gasosas ou volteis devem ser ensaiadas por mtodos apropriados, por exemplo em recipientes
selados (15) (16).
1.4.3.3. Intervalo de amostragem das culturas
No primeiro ensaio, as clulas so expostas substncia em estudo, na presena e na ausncia de um sistema de
activao metablica, durante 3-6 horas, sendo colhidas a intervalos equivalentes a cerca de 1,5 ciclos celulares
normais, a partir do incio da exposio (12). Se este protocolo der resultados negativos tanto na presena
como na ausncia de um sistema de activao, deve ser realizada uma experincia adicional sem activao, com
exposio em contnuo at colheita, passado um tempo equivalente a 1.5 ciclos celulares normais. Certos
produtos qumicos podem ser detectados mais facilmente com tempos de exposio/colheita superiores a 1,5
ciclos celulares. Os resultados negativos com activao metablica tero de ser confirmados caso a caso. Nos
casos em que a confirmao dos resultados negativos no seja considerada necessria, deve ser apresentada
uma justificao.
1.4.3.4. Preparao dos cromossomas
As culturas de clula so tratadas com Colcemid
ou colchicina, geralmente durante 1-3 horas antes da

colheita. Procede-se colheita individual das culturas e ao respectivo processamento, com vista preparao
dos cromossomas, que inclui o tratamento hipotnico das clulas, seguido de fixao e colorao.
1.4.3.5. Anlise
Todas as lminas, incluindo as provenientes dos lotes de controlo positivo e negativo, devem ser
independentemente codificadas antes da anlise microscpica. Uma vez que os processos de fixao do
frequentemente lugar ruptura de uma determinada proporo das clulas em metafase, com perda dos
cromossomas, as clulas contabilizadas devem apresentar, para todos os tipos de clula, um nmero de
centrmeros igual ao nmero modal 2. Devem ser contabilizadas pelo menos 200 metafases com uma boa
distribuio para cada concentrao e para o controlo, com boa concordncia entre os replicados, quando
existam. Esse nmero pode ser inferior caso se observe um nmero elevado de aberraes.
Embora o objectivo do ensaio consista na deteco de aberraes cromossmicas estruturais, devem registar-se
os casos de poliploidia e de endorreduplicao, quando ocorram.
2. DADOS
A unidade experimental a clula, pelo que se deve avaliar a percentagem de clulas que apresentam uma
aberrao cromossmica estrutural. Os diferentes tipos de aberrao cromossmica estrutural devem ser
enumerados e discriminados pelo seu nmero e frequncia nas culturas experimentais e de controlo. A
ocorrncia de lacunas registada em separado e includa no relatrio, mas no geralmente contabilizada para
o clculo da frequncia total das aberraes.
Durante a experincia principal para a deteco de aberraes, devem ser igualmente registadas as medies da
citotoxidade realizadas em paralelo com os ensaios, para todas as culturas de controlo e para os casos de
resposta negativa.
Devem ser fornecidos dados individuais para cada cultura, para alm de um quadro com o resumo dos dados
globais.
No necessrio comprovar uma reaco positiva inequvoca. Os resultados ambguos devem ser esclarecidos
atravs de experincias adicionais, de preferncia com modificao das condies experimentais. A necessidade
de confirmar os resultados negativos j foi discutida no ponto 1.4.3.3. As experincias subsequentes devem
contemplar a modificao dos parmetros de estudo, por forma a alargar a gama de condies avaliadas. Os
parmetros de estudo que podem ser alterados incluem a gama e os intervalos entre as diferentes concentraes
e as condies da activao metablica.
2.2. AVALIAO E INTERPRETAO DOS RESULTADOS
Existem vrios critrios para determinar um resultado positivo, nomeadamente o aumento do nmero de
clulas com aberraes cromossmicas relacionado com a concentrao ou que seja reprodutvel. Deve
atender-se, antes de mais, importncia biolgica dos resultados. Como auxlio para a avaliao dos resultados
dos ensaios, podero ser utilizados mtodos estatsticos (3) (13), embora a significncia estatstica no deva ser
o nico elemento para a determinao de uma resposta positiva.
Um aumento do nmero de clulas poliplides pode indicar que a substncia em estudo apresenta o potencial
de inibir a mitose e de induzir aberraes cromossmicas numricas. Um aumento do nmero de clulas com
cromossomas endorreduplicados pode indicar que a substncia em estudo apresenta o potencial de inibir a
progresso do ciclo celular (17) (18).
Uma substncia cujos resultados no cumpram os critrios supra considerada no mutagnica para o sistema
em causa.
Embora a maioria de experincias tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros o
conjunto dos dados no permitir que se obtenha uma opinio inequvoca sobre a actividade da substncia em
estudo, podendo acontecer que os resultados continuem a ser ambguos ou duvidosos independentemente do
nmero de vezes que a experincia seja repetida.
Um resultado positivo no ensaio in vitro de aberraes cromossmicas indica que a substncia em estudo induz
aberraes cromossmicas estruturais nas clulas somticas de mamferos em cultura. Um resultado negativo
indica que, nas condies do ensaio, a substncia em estudo no induz aberraes cromossmicas estruturais
nas clulas somticas de mamferos em cultura.
3. APRESENTAO DE RELATRIOS
RELATRIO DE ENSAIO
O relatrio de ensaio deve incluir a seguinte informao:
Solvente/veculo:
justificao para a escolha do veculo,
solubilidade e estabilidade da substncia em estudo no solvente/veculo, se conhecida.
Clulas:
tipo e origem das clulas,
caractersticas do caritipo e adequao do tipo de clulas utilizado,
ausncia de micoplasma, quando aplicvel,
informao sobre a durao do ciclo celular,
sexo dos dadores de sangue, sangue completo ou linfcitos, agente mitognico utilizado,
nmero de passagens, quando aplicvel,
mtodos de manuteno da cultura celular, quando aplicvel,
nmero modal de cromossomas.
Condies de ensaio:
identificao e concentrao da substncia que pra a metafase, durao da exposio da clula,
justificao para a seleco das concentraes e do nmero de culturas, incluindo, por exemplo, dados
sobre a citotoxicidade e sobre as limitaes de solubilidade, quando disponveis,
volumes adicionados do veculo e da substncia em estudo,
temperatura de incubao,
tempo de incubao,
durao da exposio,
densidade celular da cultura de arranque, quando aplicvel,
tipo e composio do sistema de activao metablica, incluindo critrios de aceitabilidade,
controlos positivos e negativos,
mtodos de preparao das lminas,
critrios de contabilizao das aberraes,
nmero de clulas em metafase analisadas,
mtodos de determinao da toxicidade,
critrios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou no conclusivo.
Resultados:
sinais de toxicidade, ou seja, grau de confluncia, dados relativos ao ciclo celular, contagens de clulas,
ndice mittico,
sinais de precipitao,
dados sobre o pH e a presso osmtica do meio de tratamento, caso tenham sido determinados,
definio das aberraes observadas, incluindo as lacunas,
nmero de clulas em que se observa uma aberrao cromossmica e tipo dessas aberraes,
discriminados para cada cultura exposta e de controlo,
alteraes da ploidia, quando observadas,
relao dose-resposta, quando seja possvel de determinar,
anlise estatstica, quando tenha sido realizada,
dados relativos ao controlo negativo (solvente/veculo) e positivo realizados em paralelo com o ensaio,
dados histricos sobre o controlo negativo (solvente/veculo) e positivo, com as respectivas gamas,
valores mdios e desvios-padro.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Evans, H. J., (1976) Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens,
Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and
London, p. 1-29.
(2) Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T., (1985) The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster
Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds)
Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, p. 427-432.
(3) Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura,
F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Anderson, G. and Zeiger, E., (1978)
Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of
108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl. 10), p. 1-175.
(4) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991)
Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res,
257, p. 147-204.
(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992) Clastogenicity of low pH to Various Cultured
Mammalian Cells. Mutation Res., 268, p. 297-305.
(6) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975) Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with
the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347-364.
(7) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation
Res., 113, p. 173-215.
(8) Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogel, N., (1976) Cytogenetic Effects of
Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome
Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine
(DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, p. 83-90.
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr., (1979) Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals
Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, p. 277-290.
(10) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C.,
(1992) Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-
-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175-177.
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., (1976) A Safe Substitute for Polychlorinated
Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and
Philpot, R.M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, p. 85-
-88.
(12) Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T.,
(1994) Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res.,
312, p. 241-261.
(13) Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. and Phillips, B., (1989) Analysis
of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland,
D.J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, p. 141-154.
(14) Soper, K.A. and Galloway, S.M., (1994) Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome
Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, p. 139-149.
(15) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982) CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases
and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents.
New York, Plenum, p. 91-103.
(16) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L., (1983) Evaluation of an Exposure System Using
Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation
Assay. Environmental Mutagenesis, 5, p. 795-801.
(17) Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2
arrest. Mutation Res., 119, p. 403-413.
(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster
cells. Cancer Res., 43, p. 1362-1364.
B.11. MUTAGENICIDADE ENSAIO IN VIVO DE ABERRAES CROMOSSMICAS EM CLULAS DA
MEDULA DE MAMFEROS
1. MTODO
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 475 Ensaio de aberraes cromossmicas em clulas da
medula de mamferos (1977).
1.1. INTRODUO
O ensaio de aberraes cromossmicas em clulas da medula de mamferos utilizado para a deteco de
aberraes cromossmicas estruturais induzidas pela substncia em estudo em clulas da medula de animais,
geralmente roedores (1) (2) (3) (4). As aberraes estruturais podem ser de dois tipos, afectando os
cromossomas ou os cromatdeos. A maior parte dos mutagneos qumicos induzem aberraes cromatdicas,
mas tambm podem ocorrer aberraes cromossmicas. Um aumento da taxa de poliploidia pode indicar que
um determinado produto qumico tem potencial para induzir aberraes numricas. As mutaes
cromossmicas e eventos relacionados causam diversas doenas genticas humanas, existindo provas
substanciais de que as alteraes que causam nos oncogenes e nos genes supressores de tumores das clulas
somticas esto envolvidas na induo de cancro nos seres humanos e em animais utilizados em experincias.
Os animais utilizados no presente ensaio so geralmente roedores. A medula o tecido objectivo do ensaio, por
se tratar de um tecido altamente vascularizado e que contm uma populao de clulas com grande ritmo de
duplicao e que podem ser facilmente isoladas e processadas. O presente mtodo no se destina aplicao
noutras espcies animais ou tecidos objectivo.
O presente ensaio de aberraes cromossmicas particularmente relevante para a avaliao dos riscos
mutagnicos, uma vez que permite tomar em considerao os factores do metabolismo in vivo da
farmacocintica e dos processos de reparao do ADN, embora estes possam variar de espcie para espcie e de
tecido para tecido. Os ensaios in vivo so igualmente teis para a investigao complementar de efeitos
mutagnicos detectados atravs de ensaios in vitro.
Se existirem provas de que nem a substncia em estudo nem nenhum dos seus metabolitos reactivos entram
em contacto com o tecido objectivo, o presente ensaio no apropriado.
1.2. DEFINIES
Endorreduplicao: processo no qual, aps um perodo S de replicao do ADN, o ncleo no entra em
mitose iniciando um novo perodo S. O resultado so cromossomas com 4, 8, 16, ... cromatdeos.
Poliploidia: nmero de cromossomas mltiplo do nmero haplide (n), mas diferente do nmero diplide (ou
seja, 3n, 4n, etc.).
em metafase, na forma de supresso de segmentos, de alteraes de partes da sequncia ou da troca de
Os animais so expostos substncia em estudo atravs de um modo de exposio apropriado, sendo
sacrificados passado o tempo necessrio aps a exposio. Antes do sacrifcio, os animais so tratados com um
produto fixador da metafase (por exemplo, colchicina ou Colcemid
). Seguidamente, so feitas preparaes de

cromossomas a partir das clulas de medula onde, aps colorao, as clulas em metafase so analisadas para
deteco de aberraes cromossmicas.
1.4.1. Preparao
1.4.1.1. Seleco das espcies animais
Geralmente, so utilizados ratos, ratazanas ou hamsters chineses, embora possa ser qualquer outra espcie de
mamifero apropriada. Devem ser utilizados animais adultos saudveis jovens das raas de laboratrio mais
comuns. No incio do estudo, a variaao de peso entre os animais deve ser mnima, no devendo exceder
20 % do peso mdio de cada sexo.
1.4.1.2. Condies de acomodao e alimentao
Devem ser aplicadas as condies gerais referidas na Introduo Geral, parte B, embora o objectivo para a
humidade deva ser de 50 %-60 %.
Os animais adultos saudveis jovens so distribudos aleatoriamente pelos grupos de controlo e pelos grupos
expostos. As gaiolas devem ser dispostas de modo a que eventuais efeitos devidos respectiva colocao sejam
minimizados. Os animais so identificados de forma inequvoca, devendo ser aclimatados s condies de
laboratrio durante pelo menos cinco dias.
1.4.1.4. Preparao das doses
diludas antes de serem adicionadas s clulas. As substncias lquidas podem ser adicionadas directamente aos
1.4.2. Condies do ensaio
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo nem produzir efeitos txicos nas doses
utilizadas. Caso se utilizem solventes/veculos cujas propriedades no se encontrem totalmente elucidadas,
devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que possvel, recomenda-se a
utilizao de solventes/veculos aquosos.
1.4.2.2. Controlos
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo) para cada sexo.
Com excepo da exposio substncia em estudo, todos os animais, incluindo os dos grupos de controlo,
devem ser manuseados de forma idntica.
Os controlos positivos devem produzir aberraes estruturais in vivo aos nveis a que se espera o surgimento de
um aumento detectvel em relao linha de base. A dose a administrar para o controlo positivo deve ser
escolhida de modo a que os seus efeitos sejam claros mas tambm a que as lminas codificadas no sejam
imediatamente identificadas pela pessoa que procede s leituras. aceitvel que o controlo positivo seja
administrado por uma via diferente da substncia em estudo e que s seja realizada uma amostra. A
possibilidade de utilizao de produtos qumicos de uma classe relacionada para o controlo positivo deve ser
considerada, quando existam. As substncias de controlo positivo podem incluir, por exemplo:
Substncia Nmero CAS Nmero EINECS
etilnitrosureia 759-73-9 212-072-2
mitomicina C 50-07-7 200-008-6
ciclofosfamida
50-18-0
6055-19-2
200-015-4
trietilenomelamina 51-18-3 200-083-5
Para cada colheita devem tambm realizar-se controlos negativos, em que os animais so expostos apenas ao
solvente ou veculo, procedendo-se do mesmo modo que num ensaio normal, a menos que existam dados
histricos de controlo aceitveis em relao variabilidade de animal para animal e frequncia da ocorrncia
de clulas com aberraes cromossmicas. Se s estiver prevista uma amostra dos controlos negativos, a altura
mais apropriada a primeira amostra. Alm disso, devem igualmente ser utilizados controlos no expostos
substncia em estudo, a menos que j existam dados de estudos anteriores ou publicados que mostrem que o
solvente/veculo escolhido no induz nenhum efeito deletrio ou mutagnico.
1.5. PROCEDIMENTO
1.5.1. Nmero e sexo dos animais
Cada grupo de estudo e de controlo deve incluir pelo menos cinco animais analisveis por sexo. Se no
momento do estudo existirem dados disponveis de estudos com as mesmas espcies e com utilizao da
mesma via de administrao que demonstrem que no h qualquer diferena substancial da toxicidade entre os
sexos, ser suficiente testar um nico sexo. Nos casos em que a exposio humana aos produtos qumicos possa
ser especfica a cada sexo, como acontece com alguns produtos farmacuticos, o ensaio deve ser executado com
animais do sexo em causa.
1.5.2. Programao do tratamento
As substncias de ensaio so preferivelmente administradas numa nica exposio, podendo igualmente ser
administradas numa dose dividida, ou seja, duas exposies no mesmo dia, separadas por apenas algumas
horas, para facilitar a administrao de grandes volumes. Qualquer outro regime de administrao ter de ser
cientificamente justificado.
Devem ser colhidas duas amostras separadas, aps exposio durante um dia. Para os roedores, a primeira
amostra deve ser colhida 1,5 ciclos celulares normais (que normalmente de 12-18 horas) aps a exposio.
Dado que o tempo necessrio para a absoro e metabolismo da substncia em estudo, bem como o seu efeito
sobre a cintica do ciclo celular, podem afectar o momento ptimo para a deteco de uma eventual aberrao
cromossmica, recomenda-se a recolha de uma segunda amostra 24 horas aps a primeira. Se forem utilizados
regimes de administrao ao longo de mais de um dia, deve ser colhida uma amostra 1,5 ciclos celulares
normais aps a exposio final.
Antes do sacrifcio, os animais so injectados intraperitonealmente com uma dose apropriada de um agente de
fixao da metafase (por exemplo, Colcemid
ou colchicina). As amostras sero colhidas a intervalos regulares,

correspondentes a aproximadamente 3-5 horas para os ratos e a 4-5 horas para os hamsters chineses, a partir
desse momento. As clulas da medula so colhidas e analisadas para deteco de aberraes cromossmicas.
1.5.3. Doses
Se for realizado um estudo para avaliao da gama de doses a administrar, por no estarem disponveis dados
apropriados, esse estudo deve ser executado no mesmo laboratrio, utilizando as mesmas espcies, linha
celular, sexo e regime de exposio a utilizar no estudo principal (5). Se a substncia for txica, devero ser
utilizadas trs doses diferentes para a primeira amostragem, abrangendo uma gama compreendida entre a
toxicidade mxima e uma toxicidade reduzida ou quase nula. Na segunda amostragem s ser necessrio avaliar
a dose mxima, que definida como a dose que produz sinais de toxicidade tais que indiquem que a utilizao
de doses superiores, com o mesmo regime de administrao, produzir mortalidade. As substncias com
actividade biolgica especfica em doses baixas e no txicas (como acontece com as hormonas e agentes
mitognicos) podero constituir uma excepo aos critrios de fixao da dose, devendo ser avaliadas caso a
caso. A dose mxima pode igualmente ser definida como a dose que produz algumas indicaes de toxicidade
na medula (por exemplo, uma reduo superior a 50 % do ndice mittico).
1.5.4. Ensaio-limite
Se um ensaio com uma dose de pelo menos 2 000 mg/kg de peso corporal numa nica exposio ou em duas
exposies no mesmo dia no produzir nenhum efeito txico perceptvel e se, com base nos dados respeitantes
a substncias estruturalmente relacionadas, no for previsvel a existncia de toxicidade gentica, poder no ser
considerado necessrio um estudo completo com utilizao de trs doses diferentes. Para os estudos de maior
durao, a dose limite de 2 000 mg/kg de peso corporal/dia para as exposies at 14 dias e de 1 000 mg/kg
de peso corporal/dia para as exposies de durao superior a 14 dias. A exposio prevista para o ser humano
pode indicar a necessidade de se utilizarem doses mais elevadas nos ensaios-limite.
1.5.5. Administrao das doses
A substncia em estudo geralmente administrada por sonda esofgica, utilizando um tubo estomacal ou
cnula de intubao apropriada, ou por injeco intraperitoneal. Podero ser aceites, mediante justificao,
outras vias de administrao. O volume mximo de lquido que pode ser administrado de cada vez por sonda
esofgica ou por injeco depende tambm do tamanho do animal de ensaio, no devendo exceder 2 ml/100 g
de peso corporal. A utilizao de volumes mais elevados deve ser justificada. Com excepo das substncias que
causem irritao ou que sejam corrosivas, cujos efeitos sero normalmente agravados em concentraes mais
altas, a variabilidade do volume de ensaio deve ser minimizada atravs do ajustamento das concentraes, por
forma a garantir um volume constante e independente da dose a administrar.
1.5.6. Preparao dos cromossomas
Imediatamente aps o sacrifcio, a medula colhida, exposta a uma soluo hipotnica e fixada. As clulas so
depois esfregadas em lminas e coradas.
1.5.7. Anlise
O ndice mittico deve ser determinado como medio da citotoxicidade em pelos menos 1 000 clulas por
animal para todos os animais expostos substncia em estudo (incluindo os controlos positivos) e para os
animais no expostos do controlo negativo.
Devem ser analisadas pelo menos 100 clulas de cada animal. Este nmero poder ser menor quando se
verificarem taxas elevadas de aberraes. Todas as lminas, incluindo as provenientes dos lotes de controlo
positivo e negativo, devem ser independentemente codificadas antes da anlise microscpica. Uma vez que os
processos de fixao do frequentemente lugar ruptura de uma determinada proporo das clulas em
metafase, com perda dos cromossomas, as clulas contabilizadas devem apresentar, para todos os tipos de
clula, um nmero de centrmeros igual ao nmero modal 2.
2. DADOS
Os dados respeitantes a cada animal devem ser apresentados num quadro. A unidade experimental o animal.
Para cada animal, devem ser apresentados o nmero de clulas contabilizadas, o nmero de aberraes por
clula e a percentagem de clulas com aberraes cromossmicas estruturais. Os diferentes tipos de aberrao
cromossmica estrutural devem ser enumerados, com os respectivos nmeros e frequncias, para os grupos
expostos substncia em estudo e para os grupos de controlo. A ocorrncia de lacunas registada em separado
e includa no relatrio, mas no geralmente contabilizada para o clculo da frequncia total das aberraes. Se
no houver qualquer evidncia de uma diferena na resposta entre os sexos, os dados de ambos os sexos
podero ser combinados para fins estatsticos.
Existem vrios critrios para determinar um resultado positivo, nomeadamente o aumento do nmero de
clulas com aberraes cromossmicas relacionado com a concentrao ou um claro aumento do nmero de
clulas com aberraes num determinado grupo ou numa determinada amostra. Deve atender-se, antes de
mais, importncia biolgica dos resultados. Como auxlio para a avaliao dos resultados dos ensaios,
podero ser utilizados mtodos estatsticos (6), embora a significncia estatstica no deva ser o nico elemento
para a determinao de uma resposta positiva. Os resultados ambguos devem ser esclarecidos atravs de
estudos adicionais, de preferncia com modificao das condies experimentais.
Um aumento do nmero de clulas poliplides pode indicar que a substncia em estudo apresenta o potencial
de inibir a mitose e de induzir aberraes cromossmicas numricas. Um aumento do nmero de clulas com
cromossomas endorreduplicados pode indicar que a substncia em estudo apresenta o potencial de inibir a
progresso do ciclo celular (7) (8).
Uma substncia cujos resultados no cumpram os critrios supra no presente ensaio considerada no
mutagnica.
Um resultado positivo no ensaio in vitro de aberraes cromossmicas indica que a substncia em estudo induz
aberraes cromossmicas estruturais nas clulas da medula das espcies testadas. Um resultado negativo
indica que, nas condies do ensaio, a substncia em estudo no induz aberraes cromossmicas estruturais
nas clulas da medula das espcies testadas.
Deve ser discutida a probabilidade de a substncia em estudo ou os seus metabolitos alcanarem o sistema
circulatrio geral ou especificamente o tecido objectivo (ou seja, a toxicidade sistmica).
RELATRIO DE ENSAIO
Solvente/veculo:
Animais de ensaio:
espcie/linha celular utilizada,
nmero, idade e sexo dos animais,
origem, condies de acomodao, alimentao, etc.,
peso de cada animal no incio do ensaio, incluindo a gama de pesos, a respectiva mdia e o desvio-padro
para cada grupo.
Condies de ensaio:
controlos positivos e negativos (veculo/solvente),
resultados do estudo para definio da gama de doses, quando tenha sido realizado,
justificao para a seleco das doses,
preparao da substncia em estudo,
modo de administrao da substncia em estudo,
justificao da via de administrao escolhida,
mtodo para a verificao de que a substncia em estudo atingiu a circulao geral ou o tecido objectivo,
quando aplicvel,
converso da concentrao da substncia em estudo (ppm) na alimentao/abeberao para a dose real
(mg/kg peso corporal/dia), quando aplicvel,
qualidade dos alimentos e da gua,
descrio pormenorizada dos calendrios de exposio e amostragem,
mtodos de medio da toxicidade,
substncia utilizada para fixar a metafase, respectiva concentrao e durao de exposio,
nmero de clulas analisadas por animal,
Resultados:
sinais de toxicidade,
ndice mittico,
tipo e nmero de aberraes observadas em cada animal,
nmero total de aberraes em cada grupo, com as respectivas mdias e desvios-padro,
nmero de clulas aberrantes em cada grupo, com as respectivas mdias e desvios-padro,
alteraes da ploidia, quando observadas,
dados relativos ao controlo negativo realizado em paralelo com o ensaio,
dados histricos sobre o controlo negativo com as respectivas gamas, valores mdios e desvios-padro,
dados relativos ao controlo positivo realizado em paralelo com o ensaio.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Adler, I.D., (1984) Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt
and J.M. Parry (Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., p. 275-306.
(2) Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo
Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189,
p. 157-165.
(3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Bootman, J. and Henderson, L., (1990) In Vivo
Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures.
UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141.
(4) Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M.,
Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., (1994)
Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration
Test. Mutation Res., 312, p. 305-312.
(5) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker,
G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK
Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In vivo Mutagenicity Assays.
Mutagenesis, 7, p. 313-319.
(6) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth,
D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: UKEMS Sub-
-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity
Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University Press, Cambridge. p. 184-232.
(7) Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2
arrest. Mutation Res. 119, p. 403-413.
(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster
cells. Cancer Res., 43, p. 1362-1364.
B.12. MUTAGENICIDADE ENSAIO IN VIVO DOS MICRONCLEOS EM ERITRCITOS DE MAMFEROS
1. MTODO
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 474 Ensaio dos microncleos em eritrcitos de
mamferos (1997).
1.1. INTRODUO
O ensaio in vivo dos microncleos de mamferos utilizado para a deteco de danos induzidos pela substncia
em estudo nos cromossomas ou no aparelho mittico dos eritoblastos, atravs da anlise dos eritrcitos
retirados da medula e/ou de clulas de sangue perifrico de animais, geralmente roedores.
O objectivo do ensaio do microncleo identificar substncias que causam danos citognicos, dando lugar
formao de microncleos com fragmentos de cromossoma ou com cromossomas inteiros.
Quando um eritroblasto da medula se desenvolve para dar um eritrcito policromtico, o ncleo principal
expulso; qualquer microncleo que tenha sido formado pode ficar para atrs (lagging), no citoplasma, onde
no deveria existir qualquer material nuclear. A visualizao dos microncleos facilitada nestas clulas, uma
vez que no existe um ncleo principal. Um aumento de frequncia de eritrcitos policromticos,
micronucleados, nos animais expostos substncia em estudo representa uma indicao de danos
cromossmicos induzidos.
Para o presente ensaio utiliza-se normalmente a medula de roedores, uma vez que os eritrcitos policromticos
so produzidos nesse tecido. A medio dos eritrcitos (policromticos) imaturos micronucleados no sangue
perifrico igualmente aceitvel para qualquer outra espcie em que tenha sido demonstrado que o bao no
tem a capacidade de eliminar os eritrcitos micronucleados ou que apresente uma sensibilidade adequada para
a deteco de agentes que causam aberraes cromossmicas estruturais ou numricas. Os microncleos
podem ser distinguidos por alguns critrios, que incluem a identificao da presena ou ausncia de um
centrmero ou de ADN centromrico nos microncleos. A frequncia dos eritrcitos (policromticos) imaturos
micronucleados o principal ponto final utilizado. A proporo de eritrcitos (normocromticos) maturos
com microncleos no sangue perifrico pode igualmente ser utilizada como ponto final do ensaio quando os
animais forem expostos substncia em estudo de forma contnua durante quatro semanas ou mais.
O ensaio in vivo do microncleo de mamferos particularmente relevante para a avaliao dos perigos
mutagnicos, uma vez que permite a avaliao dos elementos metablicos, da farmacocintica e dos processos
de reparao do ADN in vivo, embora estes possam variar de espcie para espcie, de tecido para tecido e em
termos do ponto final gentico. Os ensaios in vivo so igualmente teis para a investigao suplementar de um
efeito mutagnico detectado in vitro.
1.2. DEFINIES
Centrmero: Regio(es) de um cromossoma a que esto associadas fibras fusiformes durante a diviso
celular, permitindo o movimento ordeiro dos cromossomas para os plos da clula.
Microncleos: Pequenos ncleos separados e adicionais dos ncleos das clulas principais, produzidos durante
a telefase da mitose (meiose) por fragmentos do cromossoma ou cromossomas inteiros que ficam para trs
(lagging).
Eritrcito normocromtico: Eritrcito maduro a que faltam ribossomas e que pode, por conseguinte,
distinguir-se dos eritrcitos policromticos imaturos por colorao selectiva dos ribossomas.
Eritrcito policromtico: Eritrcito imaturo, numa fase de desenvolvimento intermediria, que ainda contm
ribossomas e pode, por conseguinte, distinguir-se dos eritrcitos normocromticos maturos por colorao
selectiva dos ribossomas.
Os animais so expostos substncia em estudo por uma via apropriada. Se for utilizada a medula, os animais
so sacrificados passado o tempo necessrio aps a exposio, a medula extrada e so feitas preparaes
coradas (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Quando utilizado o sangue perifrico, o sangue recolhido passado o tempo
necessrio aps a exposio e so preparados esfregaos corados (4) (8) (9) (10). Nos estudos com sangue
perifrico, as amostras de clula devem ser colhidas to cedo quanto possvel aps a ltima exposio
substncia em estudo. As preparaes so analisadas para a presena de microncleos.
1.4.1. Preparao
Quando se pretender utilizar preparaes da medula, recomenda-se a utilizao de ratos ou ratazanas, embora
possa ser utilizada qualquer espcie de mamfero que seja apropriada. Quando se utilizar o sangue perifrico,
recomenda-se a utilizao de ratos. Contudo, pode ser utilizada qualquer espcie de mamfero que seja
apropriada, desde que se trate de uma espcie em que o bao no remove os eritrcitos micronucleados ou que
apresente uma sensibilidade adequada para a deteco de agentes que causam aberraes cromossmicas
estruturais ou numricas. Devem ser utilizados animais saudveis jovens de linhas de laboratrio com
caractersticas bem conhecidas. No incio do estudo, a diferena de peso entre os animais deve ser mnima, no
devendo exceder + 20 % do peso mdio de cada sexo.
expostos. Os animais so identificados de forma inequvoca, devendo ser aclimatados s condies de
laboratrio durante pelo menos cinco dias. As gaiolas devem ser dispostas de modo a que eventuais efeitos
devidos respectiva colocao sejam minimizados.
diludas antes de serem administradas aos animais. As substncias lquidas podem ser adicionadas directamente
aos sistemas em estudo e/ou diludas antes de serem adicionadas s clulas. Devem ser utilizadas preparaes
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo nem produzir efeitos txicos nas doses
utilizao de solventes/veculos aquosos.
1.4.2.2. Controlos
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo) para cada sexo.
Com excepo da exposio substncia em estudo, todos os animais, incluindo os dos grupos de controlo,
devem ser manuseados de forma idntica.
Os controlos positivos devem produzir microncleos in vivo aos nveis de exposio a que se espera o
surgimento de um aumento detectvel em relao linha de base. A dose de controlo positivo a administrar
deve ser escolhida de modo a que os seus efeitos sejam claros mas tambm a que as lminas codificadas no
sejam imediatamente identificadas pela pessoa que procede s leituras. aceitvel que o controlo positivo seja
administrado por uma via diferente da substncia em estudo e que s seja realizada uma amostra. A
possibilidade de utilizao de produtos qumicos de uma classe relacionada para o controlo positivo deve ser
considerada, quando existam. As substncias de controlo positivo podem incluir, por exemplo:
etilnitrosureia 759-73-9 212-072-2
mitomicina C 50-07-7 200-008-6
ciclofosfamida
50-18-0
6055-19-2
200-015-4
trietilenomelamina 51-18-3 200-08 3-5
Para cada colheita devem tambm realizar-se controlos negativos, em que os animais so expostos apenas ao
solvente ou veculo, procedendo-se do mesmo modo que num ensaio normal, a menos que existam dados
histricos de controlo aceitveis em relao variabilidade de animal para animal e frequncia da ocorrncia
de clulas com aberraes cromossmicas. Se s estiver prevista uma amostra dos controlos negativos, a altura
mais apropriada a primeira amostra. Alm disso, devem igualmente ser utilizados controlos no expostos
substncia em estudo, a menos que j existam dados de estudos anteriores ou publicados que mostrem que o
solvente/veculo escolhido no induz nenhum efeito deletrio ou mutagnico.
Se for utilizado o sangue perifrico, uma amostra anterior exposio poder servir para o controlo negativo,
mas apenas nos estudos de menor durao (ou seja, 1 a 3 exposies), desde que os dados respeitantes a essa
amostra estejam de acordo com o esperado em funo de experincias anteriores.
1.5. PROCEDIMENTO
Cada grupo exposto e de controlo deve incluir pelo menos cinco animais analisveis por sexo (11). Se no
momento do estudo existirem dados disponveis de estudos com as mesmas espcies e com utilizao da
mesma via de administrao que demonstrem que no h qualquer diferena substancial da toxicidade entre os
sexos, ser suficiente testar um nico sexo. Nos casos em que a exposio humana aos produtos qumicos possa
ser especfica a cada sexo, como acontece com alguns produtos farmacuticos, o ensaio deve ser executado com
animais do sexo em causa.
No possvel recomendar qualquer programao especfica para a exposio (ou seja, uma, duas ou mais
exposies com intervalos de 24 horas). As amostras recolhidas durante regimes de administrao prolongada
so aceitveis, desde que o estudo demonstre a existncia de um efeito positivo ou, para um estudo negativo,
desde que a toxicidade seja demonstrada ou que se utilize uma dose limite, com administrao at ao momento
da colheita. As substncias de ensaio podem igualmente ser administradas numa dose dividida, ou seja, duas
exposies no mesmo dia, separadas por apenas algumas horas, para facilitar a administrao de grandes
volumes.
O ensaio pode ser executado de duas formas:
a) Os animais so expostos substncia em estudo uma nica vez. As amostras de medula so colhidas pelo
menos duas vezes, a primeira das quais pelo menos 24 horas aps a exposio, com intervalos
apropriados entre as colheitas mas no ultrapassando as 48 horas aps a exposio. Uma eventual
colheita antes de 24 horas aps a exposio ter de ser justificada. As amostras de sangue perifrico so
colhidas pelo menos duas vezes, a primeira das quais pelo menos 36 horas aps a exposio, com
intervalos apropriados entre as colheitas, mas no ultrapassando as 72 horas aps a exposio. Quando
for identificada uma resposta positiva numa determinada colheita, no ser necessrio continuar o
estudo;
b) Se forem utilizadas duas ou mais exposies dirias (por exemplo, duas ou mais exposies com
intervalos de 24 horas), a primeira amostra deve ser colhida 18 a 24 horas depois da exposio final no
caso do sangue perifrico (12).
Quando necessrio, podero ser recolhidas amostras adicionais.
1.5.3. Doses
apropriados, esse estudo deve ser executado no mesmo laboratrio, utilizando as mesmas espcies, linha
celular, sexo e regime de exposio a utilizar no estudo principal (13). Se a substncia for txica devero ser
utilizadas trs doses diferentes para a primeira amostragem, abrangendo uma gama compreendida entre a
toxicidade mxima e uma toxicidade reduzida ou quase nula. Na segunda amostragem s ser necessrio avaliar
a dose mxima, que definida como a dose que produz sinais de toxicidade tais que indiquem que a utilizao a
doses superiores, com o mesmo regime de administrao, produzir mortalidade. As substncias com
actividade biolgica especfica em doses baixas e no txicas (como acontece com as hormonas e agentes
mitognicos) podero constituir uma excepo aos critrios de fixao da dose, devendo ser avaliadas caso a
caso. A dose mxima pode igualmente ser definida como a dose que produz algumas indicaes de toxicidade
na medula (por exemplo, reduo da proporo de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais na
medula ou no sangue perifrico).
exposies no mesmo dia no produzir nenhum efeito txico perceptvel e se, com base nos dados respeitantes
a substncias estruturalmente relacionadas, no for previsvel a existncia de toxicidade gentica, poder no ser
considerado necessrio um estudo completo com utilizao de trs doses diferentes. Para os estudos de maior
durao a dose limite de 2 000 mg/kg de peso corporal/dia para as exposies at 14 dias e de 1 000 mg/kg
de peso corporal/dia para as exposies de durao superior a 14 dias. A exposio prevista para o ser humano
pode indicar a necessidade de se utilizarem doses mais elevadas nos ensaios-limite.
forma a garantir um volume constante e independente da dose a administrar.
1.5.6. Preparao da medula/sangue
As clulas da medula so retiradas do fmur ou da tbia imediatamente aps o sacrifcio. Geralmente, as clulas
so retiradas do fmur ou da tbia, preparadas e coradas de acordo com mtodos j definidos. O sangue
perifrico retirado da veia caudal ou de outro vaso sanguneo apropriado. As clulas de sangue so
imediatamente sujeitas a uma colorao supravital (8) (9) (10) ou ento so preparados esfregaos que depois
so corados. A utilizao de uma colorao especfica para o ADN [por exemplo, laranja de acridina (14) ou
pironina-y de milho 33 258 plus da Hoechst (15)] pode eliminar alguns dos erros associados utilizao de
uma colorao no especfica para o ADN. Esta vantagem no impossibilita a utilizao de coloraes
convencionais (por exemplo, Giemsa). Outros sistemas [por exemplo, colunas de celulose para remoo das
clulas nucleadas (16)] podem igualmente ser utilizados, desde que se demonstre que esses sistemas funcionam
de forma adequada para a preparao de microncleos em laboratrio.
1.5.7. Anlise
A proporo de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais (imaturos + maduros) determinada para
cada animal atravs da contagem de pelo menos 200 eritrcitos no caso da medula e de 1 000 eritrcitos no
caso do sangue perifrico (17). Todas as lminas, incluindo as dos controlos positivos e negativos, devem ser
codificadas independentemente antes da anlise microscpica. A eventual ocorrncia de eritrcitos imaturos
micronucleados deve ser analisada em pelo menos 2 000 eritrcitos imaturos por animal. A contagem de
eritrcitos maduros micronucleados poder ser utilizada como informao adicional. Ao analisar as lminas, a
proporo de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais no deve ser inferior a 20 % do valor de
controlo. Quando os animais forem sujeitos a uma exposio contnua durante quatro semanas ou mais,
podero ser tambm analisados 2 000 eritrcitos maduros por animal, para determinao da ocorrncia de
microncleos. Os sistemas automatizados de anlise (tratamento de imagens e citometria de fluxo e suspenses
celulares) so alternativas aceitveis avaliao manual, se apropriadamente justificadas e validadas.
2. DADOS
Para cada animal, devem ser verificados separadamente o nmero de eritrcitos imaturos, o nmero de
eritrcitos imaturos micronucleados e a proporo de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais.
Quando os animais tiverem sido expostos substncia em estudo em contnuo durante quatro semanas ou
mais, devem tambm ser recolhidos dados em relao aos eritrcitos maduros. Para cada animal, deve ser
apresentada a proporo de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais e, se for considerado
necessrio, de eritrcitos maduros micronucleados. Se no houver qualquer evidncia de uma diferena na
resposta entre os sexos, os dados de ambos os sexos podero ser combinados para fins estatsticos.
H diversos critrios para determinar um resultado positivo, como por exemplo um aumento do nmero de
clulas micronucleadas relacionado com a dose ou um claro aumento do nmero de clulas micronucleadas
num determinado grupo e numa determinada amostragem. Deve ser tomada em considerao, antes de mais, a
importncia biolgica dos resultados. Como auxlio para a avaliao dos resultados dos ensaios podero ser
utilizados mtodos estatsticos (18) (19), embora a significncia estatstica no deva ser o nico elemento para a
determinao de uma resposta positiva. Os resultados ambguos devem ser esclarecidos atravs de estudos
adicionais, de preferncia com modificao das condies experimentais.
Uma substncia cujos resultados no cumpram os critrios acima indicados no presente ensaio considerada
no mutagnica.
Um resultado positivo no ensaio dos microncleos indica que a substncia em estudo induz a ocorrncia dos
mesmos, como resultado de danos nos cromossomas ou no sistema mittico dos eritroblastos da espcie
testada. Um resultado negativo indica que, nas condies do ensaio, a substncia em estudo no induz a
ocorrncia de microncleos nos eritroblastos imaturos da espcie testada.
RELATRIO DE ENSAIO
Solvente/veculo:
Animais de ensaio:
peso de cada animal no incio do ensaio, incluindo a gama de pesos, a respectiva mdia e o desvio-
-padro para cada grupo.
Condies de ensaio:
controlos positivos e negativos (veculo/solvente),
mtodo para a verificao de que a substncia em estudo atingiu a circulao geral ou o tecido objectivo,
quando aplicvel,
descrio pormenorizada dos calendrios de exposio e amostragem,
critrios de contabilizao dos eritrcitos imaturos micronucleados,
Resultados:
proporo de eritrcitos imaturos em relao aos eritrcitos totais,
nmero de eritrcitos imaturos micronucleados em cada animal,
mdias e desvios-padro dos eritrcitos imaturos micronucleados por grupo,
anlise estatstica e respectivo mtodo,
dados relativos ao controlo negativo realizado em paralelo com o ensaio e dados histricos sobre o
controlo negativo,
dados relativos ao controlo positivo realizado em paralelo com o ensaio.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Heddle, J.A., (1973) A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, p. 187-190.
(2) Schmid, W., (1975) The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, p. 9-15.
(3) Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W.,
(1983) The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res., 123, p. 61-118.
(4) Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A., (1990) The In Vivo
Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S.
Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, p. 29-80.
(5) MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M., (1983) Micronuclei in Circulating Erythrocytes:
A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. In: Developments in
Science and Practice of Toxicology, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam,
p. 555-558.
(6) MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D.,
(1987) Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erytrocytes.
Mutation Res., 189, p. 103-112.
(7) MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E., (1990) The in vivo Erythrocyte Micronucleus
Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity
Studies. Fund. Appl. Toxicol., 14, p. 513-522.
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1990) The Micronucleus Assay with
Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, p. 245-
-249.
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test, (1992) Micronucleus Test with Mouse
Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th
Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., 278, p. 83-98.
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian
Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), (1995) Protocol
recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 153-
-159.
(11) Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B.,
Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., (1994) In Vivo Rodent Erythrocyte
Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, p. 293-304.
(12) Higashikuni, N. and Sutou, S., (1995) An optimal, generalized sampling time of 30 6 h after double
dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 313-319.
G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M., (1992) Report of British Toxicology Society/UK
Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays.
(14) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1983) An Application of Acridine Orange Fluorescent
Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res., 120, p. 241-247.
(15) MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G., (1983) A Simple Fluorescent Staining Procedure for
Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, p. 269-
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(16) Romagna, F. and Staniforth, C.D., (1989) The automated bone marrow micronucleus test. Mutation Res.,
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(17) Gollapudi, B. and McFadden, L.G., (1995) Sample size for the estimation of polychromatic to
normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, p. 97-99.
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L., (1990) In Vivo
Cytogenetics Assay. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures.
UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cambridge
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141.
D.G. and Savage, J.R.K., (1989) Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.)
Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity
Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne,
Sydney, p. 184-232.
B.13./14. MUTAGENICIDADE ENSAIO DE MUTAO REVERSA EM BACTRIAS
1. MTODO
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 471 Ensaio de mutao reversa bacteriana (1997).
1.1. INTRODUO
O ensaio de mutao reversa bacteriana utiliza estirpes de Salmonelas typhimurium e Escherichia coli carentes em
aminocidos para detectar mutaes pontuais, causadas pela substituio, adio ou supresso de um ou mais
pares de bases do ADN (1) (2) (3). O princpio do presente ensaio de mutao reversa bacteriana a deteco de
mutaes que invertem as mutaes existentes nas estirpes de ensaio, restaurando a capacidade funcional das
bactrias sintetizarem um cido essencial. As bactrias com mutao reversa so detectadas pela sua capacidade
de crescimento na ausncia do aminocido em que as estirpes de ensaio eram carentes.
As mutaes pontuais causam diversas doenas genticas humanas, existindo provas substanciais de que as
mutaes pontuais em oncogenes e em genes supressores de tumores nas clulas somticas esto envolvidas na
formao de tumores nos seres humanos e em animais experimentais. O ensaio de mutao reversa bacteriana
rpido, barato e de relativamente fcil execuo. Muitas das estirpes de ensaio tm diversas caractersticas que
as tornam mais sensveis para a deteco de mutaes, nomeadamente sequncias de ADN identificativas dos
locais de inverso, aumento da permeabilidade celular a grandes molculas e eliminao ou aumento da
ocorrncia de erros nos processos de reparao do ADN. A especificidade das estirpes de ensaio pode fornecer
alguma informao til sobre os tipos de mutaes induzidos pelos agentes genotxicos. J existe uma grande
base de dados com resultados respeitantes a uma vasta gama de ensaios de mutao reversa bacteriana, tendo
sido desenvolvidas metodologias com caractersticas bem conhecidas e que utilizam produtos qumicos com
diferentes propriedades fsico-qumicas, nomeadamente compostos temporrios.
1.2. DEFINIES
Ensaio de mutao reversa com Salmonelas typhimurium ou Escherichia coli: detecta mutaes em estirpes
carentes num determinado aminocido (histidina ou triptofano, respectivamente), que tem como resultado a
produo de uma estirpe independente do abastecimento externo desse aminocido.
Mutagneos de substituio de um par de bases so os agentes que causam uma alterao das bases do
ADN. No ensaio de mutao reversa essa alterao pode ocorrer no local da mutao original ou num local
diferente do genoma bacteriano.
Mutagneos por deslocao do quadro de leitura so agentes que causam a adio ou supresso de um ou
mais pares de bases no ADN, modificando dessa forma o quadro de leitura do ARN.
1.3. CONSIDERAES INICIAIS
O ensaio de mutao reversa bacteriana utiliza clulas procariotas, que diferem das clulas de mamfero em
caractersticas como a absoro, metabolismo, estrutura dos cromossomas e processos de reparao do ADN.
Os ensaios conduzidos in vitro exigem geralmente a utilizao de uma fonte exgena de activao metablica.
Os sistemas de activao metablica in vitro no reproduzem inteiramente as condies in vivo nos mamferos.
O ensaio no fornece, por conseguinte, informao directa sobre a potncia mutagnica e carcinognica da
substncia nos mamferos.
O ensaio de mutao reversa bacteriana geralmente utilizado para a despistagem inicial da actividade
genotxica e, nomeadamente, para detectar a induo de mutaes pontuais. Uma extensa base de dados
demonstrou que muitos produtos qumicos que do resultados positivos no presente ensaio apresentam uma
actividade mutagnica noutros ensaios. H exemplos de agentes mutagnicos que no so detectados pelo
presente ensaio, podendo as razes para essas falhas ser atribudas natureza especfica do ponto final
detectado, a diferenas na activao metablica ou ainda a diferenas na biodisponibilidade. Por outro lado,
elementos que aumentem a sensibilidade do ensaio de mutao reversa bacteriana podem conduzir
sobrestimao da actividade mutagnica.
O ensaio de mutao reversa bacteriana pode no ser apropriado para a avaliao de certas classes de produtos
qumicos, nomeadamente compostos altamente bactericidas (por exemplo, certos antibiticos) e produtos que
se pensa (ou que se sabe) que interferem especificamente com o sistema de replicao das clulas de mamferos
(por exemplo, alguns inibidores da topoisomerase e alguns compostos anlogos a nucleosdeos). Nesses casos,
poder ser mais apropriado utilizar ensaios de mutao em clulas de mamferos.
Embora muitos dos compostos que do resultados positivos no presente ensaio sejam carcinogneos para os
mamferos, essa correlao no absoluta. Com efeito, a correlao depende da classe qumica e, por outro
lado, alguns agentes carcinogneos no so detectados no ensaio pelo facto de o seu mecanismo ou
mecanismos de actuao, no genotxicos, no afectarem as clulas bacterianas.
As suspenses bacterianas so expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de um
sistema de activao metablico exgeno. No mtodo de incorporao em placas, as suspenses so misturadas
num revestimento de gelose e depois vertidas na superfcie duma lmina de gelose com meio mnimo. No
mtodo com incubao prvia, a mistura de tratamento incubada e s depois misturada com uma cobertura
de gelose e preparada em placas com meio mnimo. Independentemente da tcnica que tenha sido utilizada, as
colnias com mutao reversa so contadas e comparadas com o nmero de colnias com mutao reversa
espontnea em placas de controlo com solvente, aps dois ou trs dias de incubao.
Esto descritos diversos procedimentos para executar o ensaio de mutao reversa bacteriana. Entre os mais
geralmente utilizados esto o mtodo de incorporao em placas (1) (2) (3) (4), o mtodo com incubao
prvia (2) (3) (5) (6) (7) (8), o mtodo em flutuao (9) (10) e o mtodo em suspenso (11). As adaptaes
necessrias para os ensaios de gases ou vapores tambm se encontram descritas (12).
Os procedimentos descritos no presente mtodo dizem principalmente respeito aos mtodos de incorporao
em placas e com incubao prvia. Qualquer dos dois aceitvel para a realizao de experincias na presena e
na ausncia de um sistema de activao metablica. Algumas substncias podero ser detectadas de forma mais
eficaz utilizando o mtodo com incubao prvia. Essas substncias pertencem a classes qumicas que incluem
as nitrosaminas alifticas de cadeia curta, os metais, os aldedos, os corantes azicos e compostos diazcios, os
alcalides de priolizidina, os compostos allicos e os compostos nitro (3). Por outro lado, certas classes de
mutagneos nem sempre so detectadas quando se utilizam os procedimentos padro, tais como o mtodo de
incorporao em placas ou o mtodo com incubao prvia. Esses casos so considerados especiais e
recomenda-se fortemente que sejam utilizados procedimentos alternativos para a sua deteco. Esto j
identificados os seguintes casos especiais (e exemplos dos procedimentos que podem ser utilizados para a sua
deteco): corantes azicos e compostos diazticos (3) (5) (6) (13), gases e compostos qumicos (12) (14) (15)
(16) e glicsidos (17) (18) volteis. Qualquer desvio do procedimento padro ter de ser cientificamente
justificado.
1.5.1. Preparao
1.5.1.1. Bactrias
Devem ser utilizadas culturas frescas de bactrias na fase final do crescimento exponencial ou no incio da fase
estacionria (aproximadamente 10
9
clulas/ml). No devem ser utilizadas culturas em fase estacionria
adiantada. essencial que as culturas utilizadas na experincia contenham um ttulo elevado de clulas viveis,
que pode ser demonstrado por dados histricos de controlo sobre as curvas de crescimento ou durante o
prprio ensaio, atravs da determinao das clulas viveis em placas.
A temperatura de incubao recomendada de 37
o
C.
Devem ser utilizadas pelo menos cinco estirpes das bactrias, entre as quais quatro estirpes de S. typhimurium
(TA1535; TA1537 ou TA97 ou TA 97a; TA98 e TA100) para as quais foi demonstrado que so fiveis e do
resultados reprodutveis entre laboratrios. Essas quatro estirpes de S. typhimurium tm um par com as bases
GC no local da inverso primria e sabe-se que no permitem detectar certos agentes mutagneos oxidantes, de
ligao cruzada nem hidrazinas. Essas substncias podem ser detectadas utilizando as estirpes E. coli WP2 ou S.
typhimurium TA102 (19) que tm um par com as bases AT no local da inverso primria. Por conseguinte, a
combinao de estirpes recomendada :
S. typhimurium TA1535, e
S. typhimurium TA1537 ou TA97 ou TA97a, e
S. typhimurium TA98, e
S. typhimurium TA 100, e
E. coli WP2 uvrA, ou E. coli WP2 uvrA (pKM101), ou S. typhimurium TA102.
Para a deteco de agentes mutagneos causadores de ligaes cruzadas, poder ser prefervel incluir a estirpe
TA102 ou acrescentar uma estirpe capaz de reparar o ADN de E. coli [por exemplo, E. coli WP2 ou E. coli WP2
(pKM101)].
Devem ser utilizados os procedimentos estabelecidos para a preparao de culturas de arranque, verificao dos
mercadores e armazenamento. As quantidades de aminocidos necessrios para o crescimento (histidina para
as estirpes de S. typhimurium e triptofano para as estirpes de E. coli) devem ser demonstradas para cada
preparao de cultura de arranque conservada. Outras caractersticas fenotpicas devem tambm ser verificadas,
a saber: a presena ou ausncia de plasmdeos de Factor-r, quando necessrio [ou seja, resistncia ampicilina
nas estirpes TA98, TA100 e TA97 ou TA97a, WP2 uvrA e WP2 uvrA (pKM101) e resistncia ampicilina e
tetraciclina na estirpe TA102]; presena de mutaes caractersticas (ou seja, mutao rfa em S. typhimurium,
atravs da sensibilizao com violeta de cristal, e mutao uvrA em E. coli ou mutao uvrB em S. typhimurium,
atravs da sensibilizao com raios ultravioleta) (2) (3). As estirpes devem ainda apresentar, de forma
espontnea, contagens de mutaes reversas nas gamas de frequncia esperadas em funo dos dados histricos
de controlo do laboratrio e tambm, de preferncia, da literatura.
1.5.1.2. Meio
Ser utilizado um meio mmimo de gelose apropriado (por exemplo, contendo meio mnimo Vogel-Bonner E e
glucose) e uma cobertura de gelose com histidina e biotina ou triptofano para permitir alguma diviso celular
(1) (2) (9).
As bactrias devem ser expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de um sistema
adequado de activao metablica. O sistema mais geralmente utilizado uma fraco ps-mitocondrial
reforada com co-factor (S9) preparada a partir de fgados de roedores tratados com agentes de induo
enzimtica, como por exemplo Aroclor 1254 (1) (2) ou uma mistura de fenobarbitona e -naftoflavona (18)
(20) (21). A fraco ps-mitocondrial geralmente utilizada em concentraes na gama de 5 % a 30 % v/v na
mistura S9. A escolha e o estado do sistema de activao metablico podem depender da classe dos produtos
qumicos em estudo. Em alguns casos pode revelar-se adequado utilizar vrias concentraes diferentes de
fraco ps-mitocondrial. Para os corantes azicos para os compostos diazicos, poder ser mais indicado um
sistema activao metablica redutor (6) (13).
diludas antes da exposio das bactrias. As substncias lquidas podem ser adicionadas directamente aos
encontrem totalmente elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que
substncias instveis na presena de gua, os solventes orgnicos utilizados devem ser anidros.
1.5.2.1. Estirpes (ver 1.5.1.1)
1.5.2.2. Concentrao de exposio
A citotoxidade e a solubilidade na mistura final constituem alguns dos critrios a ter em conta na determinao
da maior quantidade da substncia em estudo a utilizar.
Poder ser til determinar a toxicidade e insolubilidade atravs de uma experincia preliminar. A citotoxicidade
pode ser detectada pela reduo do nmero de colnias com mutao reversa, pela presena de colnias mais
claras ou de menores dimenses ou pelo grau de sobrevivncia das culturas expostas. A citotoxidade de uma
substncia pode variar na presena de sistemas de activao metablicos. A insolubilidade deve ser avaliada em
funo da precipitao verificvel a olho nu na mistura final nas condies reais do ensaio.
A concentrao mxima de ensaio recomendada para substncias solveis no citotxicas de 5 mg/placa ou
de 5 l/placa. Para as substncias no citotxicas insolveis a 5 mg/placa ou a 5 l/placa, uma ou mais das
concentraes ensaiadas devem ser insolveis na mistura final. As substncias de ensaio citotxicas abaixo dos
5 mg/placa ou 5 l/placa devem ser ensaiadas at uma concentrao citotxica. O precipitado no deve
interferir com a contagem.
Numa experincia inicial devem ser utilizadas pelo menos cinco concentraes analisveis diferentes da
substncia em estudo, com intervalos aproximadamente semilogartmicos (ou seja, 10) entre as
concentraes. Para a investigao da relao concentrao-resposta podero ser indicados intervalos menores.
Poder ser contemplada a possibilidade de ensaiar concentraes superiores a 5 mg/placa ou 5 l/placa quando
se pretender avaliar substncias que contenham quantidades substanciais de impurezas potencialmente
mutagnicas.
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente ou veculo) especficos para
cada estirpe, devendo, para os controlos positivos, ser escolhidas concentraes que demonstrem o
desempenho eficaz de cada ensaio.
Para os ensaios com utilizao de um sistema de activao metablica, a substncia de referncia para os
controlos positivos deve ser seleccionada com base no tipo de estirpe de bactria utilizada.
As seguintes substncias so exemplos de controlos positivos apropriados para os ensaios com activao
metablica:
9,10-dimetilantraceno 781-43-1 212-308-4
7,12-dimetilbenzo[a]antraceno 57-97-6 200-359-5
benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5
2-aminoantraceno 613-13-8 210-330-9
ciclofosfamida 50-18-0 200-015-4
ciclofosfamida monohidrato 6055-19-2
A seguinte substncia um controlo positivo apropriado para o mtodo de activao metablico redutor:
vermelho do Congo 573-58-0 209-358-4
O 2-aminoantraceno no deve ser utilizado como nico indicador da eficcia da mistura S9. Se essa substncia
for utilizada, cada lote S9 deve ser igualmente caracterizado com um agente mutagnico que exija activao
metablica por enzimas microssmicos, como por exemplo o benzo[a]pireno ou o dimetilbenzo[a]an-traceno.
As seguintes substncias so exemplos de controlos positivos especficos apropriados para cada estirpe,
adequados para os ensaios sem utilizao de um sistema exgeno de activao metablica:
Substncia Nmero CAS Nmero EINECS Estirpe
nitrito de
sdio
26628-22-8 247-852-1 TA 1535 e TA 100
2-nitrofluo-
reno
607-57-8 210-138-5 TA 98
9-aminoacri-
dina
90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 e TA 97A
ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 e TA 97A
hidroper-
xido de iso-
propilben-
zeno
80-15-9 201-254-7 TA 102
mitomicina C 50-07-7 200-008-6 WP2 uvrA e TA 102
Substncia Nmero CAS Nmero EINECS Estirpe
N-etil-N-
-nitro-N-nitro-
soguanidina
70-25-7 200-730-1 WP2, WP2 uvrA e WP2 uvrA (pKM101)
4-nitroquino-
lina-l-xido
56-57-5 200-281-1 WP2, WP2 uvrA e WP2 uvrA (pKM101)
furilfuramida
(AF2)
3688-53-7 estirpes com plasmdeos
Podem utilizar-se no controlo positivo outras substncias adequadas. A possibilidade de utilizao de produtos
qumicos de uma classe afim para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam.
Devem tambm realizar-se controlos negativos, consistindo apenas em solvente ou veculo e sem a substncia
em estudo, que sero sujeitos exactamente ao mesmo procedimento que os grupos expostos. Alm disso,
devem igualmente ser utilizados controlos no expostos substncia em estudo, a menos que existam dados
histricos de controlo que demonstrem que o solvente escolhido no induz qualquer efeito deletrio ou
mutagnico.
1.5.3. Procedimento
Para o mtodo de incorporao em placas (1) (2) (3) (4) sem activao metablica, utilizam-se geralmente
0,05 ml ou 0,1 ml da soluo de ensaio, 0,1 ml de cultura bacteriana fresca (aproximadamente 10
8
clulas
viveis) e 0,5 ml de tampo estril, que so misturados com 2,0 ml de gelose de cobertura. Para o ensaio com
activao metablica, utilizam-se geralmente 0,5 ml de mistura de activao metablica, que contm uma
quantidade adequada de fraco ps-mitocondrial (entre 5 % a 30 % v/v na mistura de activao metablica),
misturada com a gelose de cobertura (2,0 ml), as bactrias e a substncia em estudo/soluo de ensaio. O
contedo de cada tubo misturado e deitado sobre uma placa de meio mnimo de gelose. A gelose de
cobertura deve solidificar antes da incubao.
No mtodo com incubao prvia (2) (3) (5) (6), a substncia em estudo/soluo de ensaio previamente
incubada com a estirpe de ensaio (aproximadamente 10
8
clulas viveis) e o tampo estril ou o sistema de
activao metablica (0,5 ml), geralmente durante 20 minutos ou mais a 30-37
o
C, antes de ser misturada com
a gelose de cobertura e deitada sobre uma placa com meio mnimo de gelose. Normalmente, so utilizados
0,05 ou 0,1 ml da substncia em estudo/soluo de ensaio, 0,1 ml de cultura bacteriana e 0,5 ml da mistura S9
ou de tampo estril, misturados com 2,0 ml de gelose de cobertura. Os tubos devem ser arejados durante a
pr-incubao, utilizando o agitador.
Para uma avaliao adequada da variao, devem ser utilizadas placas em triplicado para cada dose. A utilizao
de placas em duplicado aceitvel, desde que seja justificada cientificamente. A perda ocasional de uma placa
no invalida necessariamente o ensaio.
selados (12) (14) (15) (16).
1.5.4. Incubao
Todas as placas de cada ensaio devem ser incubadas a 37
o
C durante 48-72 horas. Aps a incubao, contam-se
as colnias com mutao reversa em cada placa.
2. DADOS
Os dados devem ser apresentados sob a forma do nmero de colnias com mutao reversa por placa. O
nmero de colnias com mutao reversa nas placas de controlo negativas (controlo do solvente e, se tiver sido
utilizado, controlo no exposto) e positivas deve tambm ser apresentado. As contagens individuais das placas,
o nmero mdio de colnias com mutao reversa por placa e o respectivo desvio-padro devem ser
apresentados para a substncia em estudo e para os controlos positivos e negativos (no expostos substncia
em estudo e/ou solvente).
No h nenhuma exigncia concreta para a verificao de uma resposta positiva clara. Os resultados ambguos
devem ser melhor esclarecidos, de preferncia com modificao das condies experimentais. Os resultados
negativos tm de ser confirmados caso a caso. Nos casos em que a confirmao dos resultados negativos no
seja considerada necessria, deve ser apresentada uma justificao. Para a realizao de experincias adicionais,
deve ser analisada a possibilidade de modificao dos parmetros do estudo, por forma a aumentar a gama de
condies avaliadas. Os parmetros que podem eventualmente ser alterados incluem a gama de concentraes,
o mtodo de tratamento (incorporao em placas ou pr-incubao em meio lquido) e as condies de
activao metablica.
H diversos critrios para determinar um resultado positivo, tais como um aumento do nmero de colnias
por placa com mutao reversa em pelo menos uma estirpe, com ou sem sistema de activao metablico, que
esteja relacionado com a concentrao na gama ensaiada e/ou que seja reprodutvel numa ou mais das
concentraes ensaiadas (23). Deve ser tomada em considerao, antes de mais, a importncia biolgica dos
resultados. Como auxlio para a avaliao dos resultados dos ensaios, podero ser utilizados mtodos
estatsticos (24). Contudo, a significncia estatstica no deve ser o nico elemento de determinao para uma
resposta positiva.
no mutagnica.
Um resultado positivo no ensaio de mutao reversa bacteriana indica que a substncia induz mutaes
pontuais por substituio das bases ou por deslocao do quadro de leitura no genoma de Salmondas
typhimurium e/ou Escherichia coli. Um resultado negativo indica que, nas condies do ensaio, a substncia no
mutagnica para as espcies ensaiadas.
RELATRIO DE ENSAIO
Solvente/veculo:
justificao para a escolha do solvente/veculo,
Estirpes:
estirpes usadas,
nmero de clulas por cultura,
caractersticas da estirpe.
Condies de ensaio:
quantidade da substncia em estudo por placa (mg/placa ou l/placa), com justificao da escolha da
dose e do nmero de placas preparadas por concentrao,
meios utilizados,
protocolo do tratamento.
Resultados:
contagens individuais das placas,
nmero mdio de colnias com mutao reversa por placa e respectivo desvio-padro,
dados relativos aos controlos negativo (solvente/veculo) e positivo realizados em paralelo com o ensaio,
com as respectivas gamas, valores mdios e desvios-padro,
dados histricos relativos aos controlos negativo (solvente/veculo) e positivo realizados em paralelo
com o ensaio, com as respectivas gamas, valores mdios e desvios-padro.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E., (1975) Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with
the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347-364.
Res., 113, p. 173-215.
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt,
S. and Zeiger, E., (1994) Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation
Res., 312, p. 217-233.
(4) Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J.,
Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V., (1986) The Salmonella typhimurium/Mammalian
Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation
Res., 168, p. 69-240.
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y., (1975)
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(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M., (1980) Factors
Modulating Mutagenicity Microbial Tests. In: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed.
Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York. p. 273-285.
(7) Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. and Foster, R., (1980) Bacterial Mutation
Assays. In: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirkland, Cambridge University Press,
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(8) Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L., (1987) Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J.
Food Safety, 8, p. 167-177.
(9) Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A., (1976) Use of a simplified fluctuation test to detect low
levels of mutagens. Mutation Res., 38, p. 33-42.
(10) Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Bridges (1984) The Fluctuation Test in Bacteria. In:
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Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, p. 141-161.
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Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium. Environmental Mutagenesis, 3, p. 453-465.
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Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, p. 335-344.
(13) Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and Vaughn, V.L., (1984) Mutagenicity of Benzidine and
Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay. Mutation Res.,
136, p. 33-47.
(14) Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K., (1992) Salmonella Mutagenicity
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(15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G., (1977) Mutagenic Activity of Chemicals Identified in
Drinking Water. In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (Eds.) Elsevier,
Amsterdam, p. 249-258.
(16) Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D., (1987) Vaporisation Technique to Measure
Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. Environmental
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T., (1979) Mutagenicity of the
Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella
typhimurium. Cancer Res., 39, p. 3780-3782.
(18) Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N., (1980) Fecalase: A Model for Activation of Dietary
Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p. 4961-4965.
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G., (1990) Comparison of Salmonella typhimurium TA
102 with Escherichia coli WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, p. 285-291.
Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems. In: In vitro metabolic Activation in Mutagenesis
Testing Eds. F.J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, p. 85-88.
(21) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C.,
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(24) Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W.D. and Tweats, D.J., (1989)
Analysis of Data from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for
Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J.,
Cambridge University Press, p. 28-65.
B.15. TESTES DE MUTAGNESE E DESPISTE DE CARCINOGNESE MUTAO GNICA
SACCHAROMYCES CEREV1SIAE
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Ver Introduo Geral, parte B.
1.2. DEFINIO
Nenhuma.
Podem utilizar-se vrias estirpes haplides e diplides do fungo Saccharomyces Cerevisiae para medir a produo
de mutaes gnicas induzidas por agentes qumicos em presena e na ausncia de activao metablica.
A medio de mutaes forward (forward mutations) pode ser realizada nomeadamente pela medio da
passagem dos mutantes vermelhos que exigem adenina (ade-1, ade-2) para uma forma branca duplamente
exigente em adenina, assim como por sistemas selectivos como a induo de resistncia canavanina e
cicloheximida.
O mtodo de mutao reversvel mais frequentemente utilizado implica a utilizao da estirpe haplide XV
185-14C que inclui as mutaes nonsense ocre ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 e trp 5-48, que so reversveis por
mutagnios que provoquem substituies de bases induzindo mutaes num locus especfico ou mutaes
supressivas ocre. A estirpe XV 185-14C inclui igualmente o marcador his 1-7, uma mutao nonsense,
principalmente reversvel pelas mutaes de segundo locus e ainda o marcador hom 3-10 que reversvel por
mutagnios conduzindo ultrapassagem do quadro de leitura do cdigo gentico (Frameshift Mutation).
Das estirpes diplides de S. Cerevisiae, a nica cujo uso est generalizado a estirpe D
7
que homozigtica para
ilv 1-92.
1.5. CRITRIOS QUALITATIVOS
Nenhum.
Preparativos
As solues das substncias a testar bem como as das substncias de controlo sero preparadas imediatamente
antes do ensaio, com a ajuda de um veculo apropriado. Quando se tratar de substncias orgnicas no solveis
na gua, devero ser utilizados os solventes orgnicos como o etanol, a acetona ou o dimetilsulfxido (DMSO)
numa concentrao no ultrapassando 2 % v/v. A concentrao final do veculo no deve afectar de forma
significativa a viabilidade das clulas nem as caractersticas de crescimento.
Ac t i v a o me t a bl i c a
As clulas devero ser expostas s substncias a testar na presena e na ausncia de um sistema exgeno de
activao metablica apropriado.
O mtodo mais frequentemente utilizado consiste na adio da fraco ps-mitocondrial preparada a partir de
fgados de roedores tratados previamente por indutores enzimticos e adicionada de co-factores. Podem
utilizar-se tambm outras espcies, tecidos, fraces ps-mitocondriais ou mtodos para a activao
metablica.
Condies do ensaio
E s t i r pe s d e e x pe r i nc i a
A estirpe haplide XV 185-14C e a estirpe diplide D
7
so as mais frequentemente utilizadas em estudos de
mutao gnica. Podem tambm ser apropriadas outras estirpes.
Me i os
Utilizam-se meios de cultura apropriados para determinar a sobrevida celular e o nmero de mutantes.
Us o d e c ont r ol os ne g a t i vos e pos i t i v os
Devero ser realizados simultaneamente controlos positivos, controlos no tratados e controlos com solvente.
Sero utilizadas substncias qumicas apropriadas como controlos positivos para cada fenmeno mutacional
especfico.
Conc e nt r a e s d e e x pos i o
Devero ser utilizados pelo menos cinco concentraes convenientemente espaadas da substncia a testar. No
caso de substncias txicas a concentrao mxima testada no dever diminuir a taxa de sobrevida abaixo de
5 % a 10 %. As substncias relativamente insolveis na gua sero testadas at ao seu limite de solubilidade
com mtodos apropriados. No caso das substncias no txicas francamente solveis na gua a concentrao
mxima ser determinada caso a caso.
Cond i e s d e i nc uba o
Devem incubar-se as placas no escuro temperatura de 28-30
o
C durante quatro a sete dias.
F r e q u nc i a s d e mut a e s e s pont ne a s
Sero utilizadas as subculturas cujas frequncias de mutao espontnea estejam situadas dentro dos limites
normais admitidos.
Nme r o d e pl a c a s
Devero utilizar-se pelo menos trs placas por concentrao para determinar os prototrficos produzidos por
mutao gnica e observar a viabilidade das clulas. No caso de experincias usando marcadores com uma
pequena taxa de mutao como o hom 3-10, pode aumentar-se o nmero de placas utilizado para fornecer
dados estatisticamente significativos.
Procedimento
As estirpes de S. Cerevisiae so tratadas habitualmente no curso dum ensaio em meio lquido, implicando a
utilizao de clulas em fase estacionria ou de crescimento. As experincias iniciais deveriam ser efectuadas
com clulas em crescimento. Expem-se substncia a testar 1-5 10 clulas/ml durante um perodo at 18
horas, temperatura de 28-37
o
C, agitando-se a mistura; deve adicionar-se uma quantidade adequada dum
sistema de activao metablica durante o tratamento. No fim do tratamento as clulas sero centrifugadas,
lavadas, e semeadas num meio de cultura apropriado. Depois da incubao as placas sero examinadas para se
determinar a taxa de sobrevida e a induo de mutaes gnicas. Se a primeira experincia der resultados
negativos deve realizar-se segunda, utilizando-se clulas em fase estacionria. Se a primeira experincia der
resultados positivos, estes sero confirmados por uma experincia independente apropriada.
2. RESULTADOS
Os resultados devem ser apresentados em quadros, indicando o nmero de colnias contadas, o nmero de
mutantes, a taxa de sobrevida e a frequncia de mutantes. Todos os resultados devero ser confirmados por
uma experincia independente. Os resultados devero ser avaliados com mtodos estatsticos adequados.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO DO TESTE
O relatrio do teste dever incluir as seguintes informaes:
estirpe utilizada,
condies do teste: clulas em fase estacionria ou de crescimento, composio dos meios, temperatura e
durao da incubao, sistema de activao metablica,
condies do tratamento: nveis de exposio, procedimento e durao do tratamento, temperatura do
tratamento, controlos positivos e negativos,
nmero de colnias contadas, nmero de mutantes, taxa de sobrevida e frequncia de mutantes, relao
dose/resposta se possvel, avaliao estatstica dos resultados.
4. REFERNCIAS
B.16. RECOMBINAO MITTICA SACCHAROMYCES CEREVISIAE
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.2. DEFINIO
Nenhuma.
A recombinao mittica no Saccharomyces Cerevisiae pode ser detectada ao nvel intergnico (ou mais
generalizadamente entre um gene e o seu centrmero) e ao nvel intragnico. O primeiro caso denomina-se
crossing-over mittico e d origem a trocas recprocas, enquanto no segundo caso as trocas so no recprocas a
maior parte das vezes, sendo este denominado converso gnica. O crossing-over geralmente detectado pela
produo de colnias ou de sectores recessivos homozigticos a partir de uma estirpe heterozigtica, enquanto
a converso gnica detectada pela produo de prototrficos revertidos de uma estirpe auxotrfica
heteroallica contendo dois alelos defeituosos diferentes do mesmo gene. As estirpes mais correntemente
utilizadas para detectar uma converso gnica mittica so as D
4
(heteroallica para ade 2 e trp 5), D
7
(heteroallica para trp 5), BZ
34
(heteroallica para arg 4) e JD1 (heteroallica para his 4 e trp 5). O crossing-over
mittico produzindo sectores homozigticos de cor vermelha e rosa pode ser determinado com D
5
ou D
7
(que
mede tambm a converso gnica mittica e a mutao reversvel para ilv 1-92), sendo estas duas estirpes
heteroallicas complementares para os alelos ade 2.
Nenhum.
1.6. DESCRIO DO MTODO DO ENSAIO
Preparativos
As solues das substncias a testar assim como das substncias de controlo ou de referncia devero ser
preparadas imediatamente antes do ensaio, com a ajuda do veculo apropriado. No caso de substncias
orgnicas insolveis na gua devero utilizar-se solventes orgnicos como o etanol, a acetona e o
dimetilsulfxido (DMSO), em concentraes no ultrapassando 2 % v/v. A concentrao final do veculo no
dever afectar de maneira significativa a viabilidade das clulas nem as caractersticas de crescimento.
As clulas sero expostas s substncias a testar na presena e na ausncia de um sistema exgeno de activao
metablica. O mtodo mais frequentemente utilizado consiste na adio da fraco ps-mitocondrial preparada
a partir de fgados de roedores tratados previamente com indutores enzimticos e adicionada de co-factores.
Podem tambm utilizar-se outras espcies, tecidos, fraces ps-mitocondriais ou mtodos para activao
metablica.
Condies do ensaio
E s t i r pe s d e e x pe r i nc i a
As estirpes mais frequentemente utilizadas so as diplides D
4
, D
5
, D
7
e JDl. Podem tambm ser apropriadas
outras estirpes.
Me i os
Utilizam-se os meios de cultura apropriados para determinar a taxa de sobrevida e a frequncia de
recombinaes mitticas.
Devero ser realizados simultaneamente controlos positivos, controlos no tratados e controlos com solvente.
Sero utilizadas substncias qumicas apropriadas como controlos positivos para cada tipo especfico de
recombinao.
Devero ser utilizadas pelo menos cinco concentraes convenientemente espaadas da substncia a testar. A
citotoxicidade e a solubilidade so alguns dos factores a ter em considerao. A concentrao mais fraca no
deve ter qualquer efeito na viabilidade das clulas. No caso de produtos qumicos txicos, a concentrao
mxima testada no deve diminuir a taxa de sobrevida abaixo de 5 % a 10 %. Os produtos qumicos
relativamente insolveis na gua sero testados at ao seu limite de solubilidade por mtodos apropriados. No
caso de produtos qumicos no txicos, francamente solveis na gua, a concentrao mxima testada ser
determinada caso a caso.
As clulas podem ser expostas s substncias a testar em fase estacionria ou em fase de crescimento durante
perodos de durao at 18 horas. No entanto, no caso de um tratamento de longa durao, as culturas sero
examinadas ao microscpio para se detectar a formao de esporos, cuja presena tornar o teste nulo.
Cond i e s d e i nc uba o
As placas sero incubadas no escuro a uma temperatura de 28-30
o
C, durante quatro a sete dias. As placas
utilizadas para a determinao dos sectores homozigticos vermelho e rosa produzidos por crossing-over
mittico sero conservadas num refrigerador a 4
o
C durante mais um a dois dias antes da contagem, de modo
a que a pigmentao das colnias interessadas possa intensificar-se.
F r e q u nc i a d e r e c ombi na e s mi t t i c a s e s pont ne a s
Devero utilizar-se subculturas cujas frequncias de recombinao mittica se situem dentro da gama admitida
normalmente.
Nme r o d e pl a c a s
Devero ser semeadas pelo menos trs placas por concentrao a fim de determinar a viabilidade bem como o
nmero de prototrficos produzidos por converso gnica mittica. No caso de determinao da homozigotia
recessiva produzida por crossing-over mittico, o nmero de placas ser aumentado para se obter um nmero de
colnias adequado.
Procedimento
As estirpes de S. Cerevisiae so tratadas habitualmente no curso de um ensaio em meio lquido, implicando a
utilizao de clulas em fase estacionria ou de crescimento. As experincias iniciais deveriam ser efectuadas
com clulas em crescimento. So expostas 1-5 10
7
clulas/ml substncia a testar durante um perodo at
18 horas, temperatura de 28-37
o
C, agitando-se a mistura; deve adicionar-se uma quantidade adequada de um
sistema de activao metablica durante o tratamento.
No fim do tratamento as clulas sero centrifugadas, lavadas e semeadas no meio de cultura adequado. Depois
da incubao, as placas sero examinadas a fim de determinar a taxa de sobrevida e a induo de recombinao
mittica.
Se a primeira experincia der resultados negativos deve realizar-se segunda, utilizando-se clulas em fase
estacionria. Se a primeira experincia der resultados positivos, estes sero confirmados por uma experincia
independente apropriada.
2. RESULTADOS
Os resultados devem ser apresentados em quadros, indicando o nmero de colnias contadas, o nmero de
recombinantes, a taxa de sobrevida e a frequncia de recombinantes.
Todos os resultados devero ser confirmados por uma experincia independente.
Os resultados devero ser avaliados com mtodos estatsticos adequados.
3. RELATRIO
O relatrio do teste dever incluir as informaes seguintes:
estirpe utilizada,
condies do teste: clulas em fase estacionria ou em fase de crescimento, composio dos meios,
temperatura e durao da incubao, sistema de activao metablica,
condies de tratamento: concentrao de exposio, procedimento e durao do tratamento,
temperatura do tratamento, controlos positivos e negativos,
nmero de colnias contadas, nmero de recombinantes, taxa de sobrevida e frequncia de
recombinao, relao dose/resposta se possvel; avaliao estatstica dos resultados,
4. REFERNCIAS
B.17. MUTAGENICIDADE ENSAIO DE MUTAO GNICA EM CLULAS DE MAMFEROS IN VITRO
1. MTODO
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 476 Ensaio de mutao gnica de mamferos in vitro
(1997).
1.1. INTRODUO
O ensaio de mutao gnica em clulas de mamferos in vitro pode ser utilizado para detectar mutaes gnicas
induzidas por substncias qumicas. As linhas celulares que podem ser utilizadas incluem as clulas L5178Y do
linfoma do rato, as linhas celulares CHO, CHO-AS52 e V79 do hamster chins e as clulas linfoblastides
humanas TK6 (1). Nessas linhas celulares, os pontos finais genticos mais utilizados so as mutaes da
timidina quinase (TK), da hipoxantina-guanina fosforibosil transferase (HPRT) e do transgene de xan-tina-
-guanina fosforibosil transferase (XPRT). Os ensaios de mutao TK, HPRT e XPRT detectam diferentes gamas de
ocorrncias genticas. A localizao autossmica das mutaes TK e XPRT pode permitir a deteco de
ocorrncias genticas (por exemplo, supresso de grandes sequncias) que no so detectadas no locus HPRT
nos cromossomas X (2) (3) (4) (6).
No ensaio de mutao gnica em clulas de mamferos in vitro podem ser utilizadas culturas de qualquer linha
celular ou estirpe de caractersticas bem conhecidas. As clulas utilizadas so seleccionadas com base na sua
capacidade de desenvolvimento em cultura e na estabilidade da frequncia das mutaes espontneas.
Os ensaios realizados in vitro exigem geralmente a utilizao de uma fonte exgena de activao metablica. Os
sistemas de activao metablicos in vitro no reproduzem inteiramente as condies in vivo nos mamferos.
Devem portanto ser evitadas condies que conduzam a resultados que no reflectem uma mutagenicidade
intrnseca. Os eventuais resultados positivos no resultantes de mutagenicidade intrnseca podem ser causados
por alteraes do pH, da presso osmtica ou por nveis elevados de citotoxicidade (7).
O presente ensaio utilizado para o controlo de eventuais agentes mutagneos e carcinogneos em mamferos.
Embora muitos dos compostos que do resultados positivos no presente ensaio sejam carcinogneos para os
mamferos, essa correlao no absoluta. Com efeito, a correlao depende da classe qumica e, por outro
lado, h cada vez mais dados que provam que alguns agentes carcinogneos no so detectados no ensaio
porque parecem actuar atravs de mecanismos no genotxicos ou atravs de mecanismos ausentes nas clulas
bacterianas (6).
1.2. DEFINIES
Mutao para diante: mutao gentica do tipo parental para a forma mutante que causa uma alterao ou
perda de actividade enzimtica da funo da protena codificada.
Mutagneos por substituio de um par de bases: substncias que causam a substituio de um ou vrios
pares de bases do ADN.
Mutagneos por deslocao do quadro de leitura: substncias que causam a adio ou supresso de um par
de bases ou de uma sequncia de pares de bases do ADN.
Perodo de expresso fenotpica: perodo que decorre at que os produtos dos genes inalterados se esgotem
nas clulas recentemente sujeitas a uma mutao.
Frequncia de mutao: relao entre o nmero de clulas mutantes observadas e o nmero de clulas viveis.
Crescimento total relativo: aumento no nmero de clulas por unidade de tempo, por comparao com uma
populao de controlo: calculado como o produto da relao entre o crescimento em suspenso e no controlo
negativo com a relao entre a eficincia de clonagem em suspenso e no controlo negativo.
Crescimento relativo em suspenso: relao entre o aumento no nmero de clulas durante o perodo de
expresso em suspenso e no controlo negativo.
Viabilidade: eficincia de clonagem das clulas expostas incubadas em placas, aps o perodo de expresso, sob
condies selectivas.
Sobrevivncia: eficincia de clonagem das clulas expostas incubadas em placas no fim do perodo de
exposio; a sobrevivncia geralmente expressa em relao sobrevivncia da populao celular de controlo.
As clulas deficientes em timidina quinase (TK) devido mutao TK TK so resistentes aos efeitos
citotxicos do anlogo de pirimidina da trifluorotimidina (TFT). As clulas que dispem de timidina quinase
so sensveis ao TFT, que causa inibio do metabolismo celular e impede a diviso da clula. Logo, as clulas
mutantes podem proliferar na presena de TFT, o que no acontece com as clulas normais, com timidina
quinase. Da mesma forma, as clulas carentes em HPRT ou XPRT so seleccionadas pela resistncia
6-tioguanina (TG) ou 8-azaguanina (AG). As propriedades da substncia em estudo devem ser
cuidadosamente tomadas em considerao se o ensaio de mutao gnica em clulas de mamferos for
utilizado para ensaiar uma substncia anloga das bases ou um composto relacionado com o agente selectivo.
Assim, por exemplo, deve ser investigada qualquer suspeita de toxicidade selectiva da substncia em estudo para
as clulas mutantes e no mutantes. Logo, o desempenho do sistema/agente selectivo deve ser confirmado
quando se ensaiarem produtos qumicos estruturalmente relacionados com o agente selectivo (8).
As clulas em suspenso ou em cultura em monocamada so expostas substncia em estudo tanto na
presena como na ausncia de um sistema de activao metablica durante um perodo de tempo apropriado,
sendo depois cultivadas para determinar a citotoxidade e para permitir a expresso fenotpica antes de
seleccionar o mutante (9) (10) (11) (12) (13). A citotoxidade geralmente determinada atravs da medio da
eficincia relativa de clonagem (sobrevivncia) ou do crescimento total relativo das culturas aps o perodo de
exposio. As culturas expostas so mantidas em meio de crescimento durante um perodo de tempo suficiente,
que varia em funo do locus seleccionado e do tipo de clula, por forma a permitir uma expresso fenotpica
to boa quanto possvel das mutaes induzidas. A frequncia de mutao determinada inoculando um
nmero conhecido de clulas num meio com agente selectivo para as clulas mutantes e num meio sem agente
selectivo, para determinao das respectivas eficincias de clonagem (viabilidade). Aps um perodo de
incubao apropriado, as colnias so contadas. A frequncia de mutao calculada a partir do nmero de
colnias mutantes no meio selectivo e do nmero de colnias no meio no selectivo.
1.4.1. Preparao
1.4.1.1. Clulas
O presente ensaio pode ser realizado com diversos tipos de clulas, nomeadamente subclones das clulas
L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 ou TK6. Os tipos de clula utilizados no presente ensaio devem ter uma
sensibilidade demonstrada a mutagneos qumicos, uma eficincia de clonagem elevada e uma frequncia de
mutao espontnea estvel. As clulas devem ser verificadas para detectar eventuais contaminaes por
microplasma, no devendo ser utilizadas se estiverem contaminadas.
O ensaio deve ser concebido para ter uma determinada sensibilidade e definio. O nmero de clulas e de
culturas e as concentraes da substncia em estudo a utilizar sero reflexo dos parmetros definidos (14). O
nmero mnimo de clulas viveis que devem sobreviver exposio e ser utilizadas em cada fase do ensaio
deve basear-se na frequncia da mutao espontnea. A ttulo indicativo, deve ser utilizado um nmero de
clulas pelo menos dez vezes superior ao inverso da frequncia de mutao espontnea, com um mnimo
recomendado de 10
6
clulas. Para verificao da consistncia do desempenho do ensaio, devem estar
disponveis dados histricos adequados sobre o sistema celular utilizado.
Devem ser utilizados meios de cultura e condies de incubao (recipientes, temperatura, CO
2
, concentrao e
humidade) apropriados. Os meios devem ser escolhidos de acordo com o sistema selectivo e com o tipo de
clulas utilizados no ensaio. particularmente importante que sejam escolhidas condies de cultura que
garantam o crescimento ptimo das clulas durante o perodo de expresso e a capacidade de formao de
colnia por parte das clulas mutantes e no mutantes.
As clulas so propagadas a partir de culturas de arranque, inoculadas no meio de cultura e incubadas a 37
o
C.
Antes da realizao no presente ensaio, as culturas podero ter de ser limpas de clulas mutantes eventualmente
presentes.
As bactrias devem ser expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de um sistema
adequado de activao metablica. O sistema mais geralmente utilizado uma fraco ps-mitocondrial
reforada com co-factor (S9) preparada a partir de fgados de roedores tratados com agentes de induo
enzimtica, como por exemplo Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) ou uma mistura de fenobarbitona e
-naftoflavona (19) (20).
A fraco ps-mitocondrial geralmente utilizada em concentraes na gama de 1-10 % v/v no meio de ensaio
final. A escolha e estado do sistema de activao metablico podem depender da classe de produto qumico em
estudo. Em alguns casos, poder ser apropriado utilizar mais de uma concentrao de fraco ps-
-mitocondrial.
Alguns desenvolvimentos, nomeadamente a produo por engenharia gentica de linhas celulares que
expressem enzimas de activao especficas, podem ter algum potencial em termos de activao endgena. A
escolha das linhas celulares utilizadas deve ser cientificamente justificada (por exemplo, pela importncia da
isoenzima do citocromo P450 para o metabolismo da substncia em estudo).
diludas antes da exposio das clulas. As substncias lquidas podem ser adicionadas directamente aos
encontrem totalmente elucidadas devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que
substncias instveis na presena de gua, os solventes orgnicos utilizados devem ser anidros. A gua poder
ser removida atravs de um filtro molecular.
A citotoxidade, a solubilidade no sistema de ensaio e as alteraes do pH ou da presso osmtica constituem
alguns dos critrios a ter em conta na determinao de concentrao mxima.
A citotoxidade deve ser determinada tanto na presena como na ausncia de um sistema de activao
metablica na experincia principal, utilizando um indicador apropriado da integridade e crescimento das
clulas, tal como a eficincia relativa de clonagem (sobrevivncia) ou o crescimento relativo total. Poder ser til
determinar a toxicidade e insolubilidade atravs de uma experincia preliminar.
Devem ser utilizadas pelo menos quatro concentraes analisveis. Quando existir citotoxicidade, essas
concentraes devem abranger uma gama de toxicidade que varie da toxicidade mxima a quase nula; o que
significa geralmente que as concentraes devem variar num factor de 2 a 10. Se a concentrao mxima for
definida por razes de citotoxicidade, a sobrevivncia relativa (eficincia relativa de clonagem) ou o crescimento
relativo total devem ser da ordem dos 10 %-20 % (mas no inferiores a 10 %). Para as substncias com
citotoxidade relativamente baixa, a concentrao mxima do ensaio deve ser a mais baixa de 5 mg/ml, 5 l/ml
ou 0,01 M.
Para substncias relativamente insolveis a dose mxima a utilizar deve ser igual ou superior ao limite de
solubilidade nas condies de cultura. A insolubilidade no meio final a que as clulas so expostas deve ser
demonstrada. Poder ser til avaliar a solubilidade no incio e no fim do tratamento, uma vez que a mesma se
pode alterar durante a exposio no sistema de ensaio devido presena de clulas, de S9, de soro, etc. A
insolubilidade pode ser detectada vista desarmada. O precipitado no deve interferir com as contagens
necessrias.
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo), tanto na presena
como na ausncia de um sistema de activao metablica. Quando for utilizada activao metablica, o
produto qumico de controlo positivo deve ser o mesmo que exige activao para dar uma resposta
mutagnica.
As substncias de controlo positivo podem ser, por exemplo:
Condio de activao metablica Locus Substncia Nmero CAS
Nmero
EINECS
Ausncia de activao meta-
blica exgena
HPRT Metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7
Etil nitrosureia 759-73-9 212-072-2
TK (col-
nias peque-
nas e
grandes)
Metanossulfonato de metilo 66-27-3 200-625-0
XPRT Metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7
Etil nitrosureia 759-73-9 212-072-2
Presena de activao meta-
blica exgena
HPRT 3-3-Metilcolantreno 56-49-5 200-276-4
N-Nitrosodimetilamina 62-75-9 200-549-8
7,12-Dimetilbenzantraceno 57-97-6 200-359-5
TK (col-
nias peque-
nas e
grandes)
Ciclofosfamida 50-18-0 200-015-4
Ciclofosfamida monohi-
drato
6055-19-2
Benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5
3-3-Metilcolantreno 56-49-5 200-276-5
XPRT N-n- Nitrosodimetilamina
(nveis elevados de S 9)
62-75-9 200-549-8
Benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5
Podem ser utilizadas outras substncias de referncia apropriadas para o controlo positivo. Assim, se um
laboratrio dispuser, por exemplo, de uma base de dados histricos sobre a utilizao de 5-bromo
2'-deoxiuridina (nmero CAS 59-14-3, nmero EINECS 200-415-9), essa substncia de referncia poder
tambm ser utilizada. Quando existam, deve ser analisada a possibilidade de utilizar produtos qumicos de
controlo positivos de classes qumicas relacionadas.
Devem tambm realizar-se controlos negativos, consistindo apenas em solvente ou veculo e sem a substncia
em estudo, que sero sujeitos exactamente ao mesmo procedimento que os grupos expostos. Alm disso,
devem igualmente ser utilizados controlos no expostos substncia em estudo, a menos que existam dados
histricos de controlo que demonstrem que o solvente escolhido no induz qualquer efeito deletrio ou
mutagnico.
1.4.3. Procedimento
1.4.3.1. Exposio substncia em estudo
As clulas em proliferao devem ser expostas substncia em estudo tanto na presena como na ausncia de
um sistema de activao metablica durante um perodo de tempo apropriado (trs a seis horas geralmente
eficaz). O perodo de exposio pode ser alargado a um ou mais ciclos celulares.
Para cada concentrao a ensaiar, podem ser utilizadas culturas expostas nicas ou em duplicado. Quando
forem utilizadas culturas nicas, o nmero de concentraes deve ser aumentado, por forma a garantir um
nmero de culturas adequado para a anlise (por exemplo, pelo menos oito concentraes analisveis). Devem
tambm ser includas culturas de controlo negativas (solventes) duplicadas.
selados (21) (22).
1.4.3.2. Medio da sobrevivncia, viabilidade e frequncia de mutao
No fim do perodo de exposio, as clulas so lavadas e cultivadas para determinar a sobrevivncia e para
permitir a expresso fenotpica das mutaes. A medio de citotoxicidade atravs da determinao da
eficincia relativa de clonagem (sobrevivncia) ou do crescimento total relativo das culturas geralmente
iniciada aps o perodo de exposio.
Para cada locus h um tempo mnimo definido para permitir uma expresso fenotpica quase ptima das
mutaes recentemente induzidas (o HPRT e o XPRT exigem pelo menos de seis a oito dias e o TK pelo menos
dois dias). As clulas so cultivadas em meios com presena e ausncia do agente selectivo para determinao,
respectivamente, do nmero de mutaes e da eficincia de clonagem. A medio da viabilidade (utilizada para
calcular a frequncia de mutao) iniciada no fim do perodo de expresso atravs de cultura em placas com
meio no selectivo.
Se a substncia em estudo der um resultado positivo no ensaio L5178Y TK
+/-
, deve ser realizada uma medio
do tamanho das colnias em pelo menos uma das culturas de ensaio (a concentrao mxima com resultado
positivo) e nos controlos negativos e positivos. Se a substncia em estudo der um resultado negativo no ensaio
L5178Y
+/-
, deve ser realizada uma medio do tamanho das colnias nos controlos negativos e positivos. Nos
estudos que utilizem TK6TK
+/-
a medio do tamanho das colnias poder tambm ser realizada.
2. DADOS
Os dados devem incluir a determinao de citotoxicidade e da viabilidade, para alm da contagem das colnias
e das frequncias de mutao nas culturas expostas e nas culturas de controlo. No caso de um resultado
positivo no ensaio L5178Y TK
+/-
, as colnias devem ser contabilizadas utilizando o critrio das colnias
pequenas e grandes em pelo menos uma das concentraes da substncia em estudo (a concentrao mxima
com resultado positivo) e nos controlos negativos e positivos. A natureza molecular e citognica das clulas
mutantes que formam colnias grandes e pequenas j foi investigada em pormenor (23) (24). No ensaio TK
+/-
as
colnias devem ser contabilizadas utilizando os critrios do crescimento normal (colnias grandes) e do
crescimento lento (colnias pequenas) (25). As clulas mutantes que tenham sofrido danos genticos mais
extensos apresentam tempos de duplicao maiores, pelo que formam colnias mais pequenas. Esses danos
variam tipicamente da perda da totalidade dos genes a aberraes cromossmicas s visveis por anlise do
caritipo. A induo de mutaes que resultam no aparecimento de colnias pequenas foi associada com
produtos qumicos que induzem aberraes cromossmicas graves (26). As clulas menos seriamente afectadas
por mutaes apresentam taxas de crescimento semelhantes s clulas parentais e formam colnias grandes.
Deve ser apresentada a sobrevivncia (eficincias relativas de clonagem) ou o crescimento total relativo. A
frequncia de mutao deve ser expressa como a relao entre o nmero de clulas mutantes e o nmero de
clulas sobreviventes.
Devem ser fornecidos dados individuais das culturas. Para alm disso, todos os dados devem ser apresentados
sob a forma de um quadro.
No h nenhuma exigncia concreta para a verificao de uma resposta positiva clara. Os resultados ambguos
devem ser melhor esclarecidos, de preferncia com modificao das condies experimentais. Os resultados
negativos tm de ser confirmados caso a caso. Nos casos em que a confirmao dos resultados negativos no
seja considerada necessria, deve ser apresentada uma justificao. Para a realizao de experincias adicionais,
deve ser analisada a possibilidade de modificao dos parmetros do estudo, por forma a aumentar a gama de
condies avaliadas. Os parmetros que podem eventualmente ser alterados incluem a gama de concentraes e
as condies de activao metablica.
H diversos critrios para determinar um resultado positivo, tais como um aumento da frequncia de mutao
que esteja relacionado com a concentrao na gama testada e/ou que seja reprodutvel. Deve ser tomada em
considerao, antes de mais, a importncia biolgica dos resultados. Como auxlio para a avaliao dos
resultados dos ensaios, podero ser utilizados mtodos estatsticos. Contudo, a importncia estatstica no deve
ser o nico elemento de determinao para uma resposta positiva.
no mutagnica.
Embora a maioria das experincias tenha resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros o
Um resultado positivo no ensaio de mutao gnica em clulas de mamferos in vitro indica que a substncia
induz mutaes gnicas nas culturas de clulas de mamferos utilizadas. Uma resposta positiva concentrao
que seja reprodutvel mais significativa. Um resultado negativo indica que, nas condies do ensaio, a
substncia no induz mutaes gnicas nas culturas de clulas de mamfero utilizadas.
RELATRIO DE ENSAIO
Solvente/veculo:
Clulas:
tipo e origem das clulas,
nmero de culturas celulares,
nmero de transferncias, quando aplicvel,
mtodos de manuteno da cultura celular, quando aplicvel,
ausncia de micoplasma.
Condies de ensaio:
justificao para a seleco das concentraes e do nmero de culturas, incluindo, por exemplo, dados
sobre a citotoxicidade e sobre as limitaes de solubilidade, quando disponveis,
composio dos meios, concentrao de CO
2
volumes adicionados do veculo e da substncia em estudo,
tempo de incubao,
durao de tratamento,
densidade celular durante a exposio,
durao do perodo de expresso (incluindo o nmero de clulas inoculadas e os calendrios de sub-
-cultura e de alimentao, quando aplicvel),
agentes selectivos,
critrios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou no conclusivo,
mtodos utilizados para a enumerao dos nmeros de clulas mutantes e viveis,
definio das colnias cuja dimenso e tipo so caracterizados (incluindo os critrios para a definio de
colnias pequenas e grandes, conforme apropriado).
Resultados:
dados sobre o pH e a presso osmtica durante a exposio substncia de ensaio, caso tenham sido
determinados,
dimenso das colnias, caso tenha sido medida pelo menos para os controlos positivos e negativos,
capacidade do laboratrio para a deteco de pequenas colnias mutantes no sistema L5178Y TK
+/-
,
quando aplicvel,
dados relativos ao controlo negativo (solvente/veculo) e positivo realizados em paralelo com o ensaio,
dados histricos sobre o controlo negativo (solvente/veculo) e positivo, com as gamas, valores mdios e
desvios-padro,
frequncia das mutaes.
Concluses.
4. REFERNCIAS
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191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, p. 133-147.
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+/-
TK
+/-
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-108.
Res., 113, p. 173-215.
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Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFT
r
) Mutants of L5178Y/TK
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Mouse Lymphoma Cells.
Mutation Res., 151, p. 161-174.
(25) Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B., (1990) Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a
Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, p. 89-102.
(26) Moore, M.M. and Doerr, C.L., (1990) Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small-
-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK
+/-
-3.7.2C Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5,
p. 609-614.
B.18. LESO E REPARAO DO ADN SNTESE NO PROGRAMADA CLULAS DE MAMFERO IN
VITRO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.2. DEFINIO
Nenhuma.
O Teste de Sntese No Programada de ADN (Unscheduled DNA Synthesis-UDS) mede a sntese de ADN para
reparao aps exciso e remoo de um fragmento de ADN contendo uma regio de leso induzida por
agentes qumicos e fsicos. O teste baseia-se na incorporao da timidina marcada com trtio (
3
H-TdR) no ADN
de clulas de mamfero no se encontrando na fase S do ciclo celular. Pode determinar-se a incorporao de
3
H-TdR examinando o ADN proveniente das clulas tratadas por auto-radiografia ou por contagem de
cintilao em meio lquido (LSC-Liquid Scintilation Counting). As clulas de mamfero em cultura, com a
excepo dos hepatcitos primrios de rato, so tratadas com a substncia a testar em presena e na ausncia de
um sistema exgeno de activao metablica. A UDS pode tambm ser medida por mtodos in vivo.
Nenhum.
Preparativos
As substncias a testar, bem como as de controlo ou de referncia sero preparadas no meio de cultura,
dissolvidas ou colocadas em suspenso em veculos apropriados, sendo depois diludas em meio de cultura,
antes de utilizadas no ensaio. A concentrao final no dever afectar a viabilidade celular.
Podem ser utilizadas neste ensaio culturas primrias de hepatcitos de rato, linfcitos humanos ou linhas
celulares estabelecidas (por exemplo, fibroblastos humanos diplides).
As clulas sero expostas substncia a testar em presena e na ausncia de um sistema de activao metablica
apropriado.
Condies experimentais
Nme r o d e c ul t ur a s
So necessrias para cada ponto experimental pelo menos duas culturas celulares para a auto-radiografia e seis
culturas celulares (ou menos se tal se justificar tecnicamente) para a contagem de cintilao em meio lquido.
Devero ser includos em cada experincia controlos simultneos (no tratados e/ou veculo) com e sem
activao metablica.
Para o ensaio com hepatcitos de rato, por exemplo, pode utilizar-se como controlo positivo o 7,12 DMBA
(7,12-dimetil benzantraceno) ou o 2-AAF (2-acetilaminofluoreno). No caso de linhas celulares estabelecidas,
em ensaios com auto-radiografia ou LSC realizados sem activao metablica, pode utilizar-se como controlo o
4-NQO (4-nitroquinolina N-xido); quando se tiver recorrido a sistemas de activao metablica, a N-dimetil-
-nitrosamina um dos compostos utilizveis como controlo positivo.
Dever utilizar-se uma gama de concentraes da substncia a testar para permitir uma boa determinao da
resposta. A concentrao mxima dever produzir alguns efeitos citotxicos. As substncias relativamente
insolveis na gua sero testadas at ao seu limite de solubilidade. No que respeita s substncias no txicas
francamente solveis na gua, a concentrao mxima a testar dever ser determinada caso a caso.
C l ul a s
Para a manuteno das culturas recorrer-se- a meios de cultura, a uma concentrao de CO
2
, a uma
temperatura e a humidade apropriados. As linhas celulares estabelecidas devero ser examinadas
periodicamente para detectar uma contaminao por Mycoplasma.
No se utiliza nenhum sistema de activao metablica nas culturas primrias de hepatcitos. As linhas
celulares estabelecidas e os linfcitos so expostos substncia a testar em presena e na ausncia de um
sistema de activao metablica apropriado.
Procedimentos
P r e pa r a o d a s c ul t ur a s
As linhas celulares estabelecidas provenientes de culturas-me (por exemplo, por tripsinizao ou por agitao)
so semeadas em recipientes de cultura numa densidade adequada e incubada a 37
o
C.
As culturas de pouca durao de hepatcitos de rato so estabelecidas permitindo que os hepatcitos
recentemente dissociados num meio apropriado possam aderir superfcie de crescimento.
As culturas de linfcitos humanos so realizadas com tcnicas apropriadas.
Tr a t a me nt o d a s c ul t ur a s c om s ubs t nc i a a t e s t a r
Hepatcitos primrios de rato
Tratam-se hepatcitos primrios de rato, isolados recentemente, com a substncia a testar no meio contendo
3
H-TdR, durante um perodo de tempo adequado. No fim do perodo de tratamento o meio ser eliminado, as
clulas lavadas, fixadas e secadas. As lminas so mergulhadas numa emulso de auto-radiografia [em
alternativa pode usar-se uma pelcula fotogrfica (stripping film)], passando depois exposio, revelao,
colorao e contagem.
Linhas celulares estabelecidas e linfcitos
Tcnicas auto-radiogrficas: Expem-se as culturas celulares substncia a testar durante perodos de tempo
adequados, sendo tratadas em seguida com a
3
H-TdR. A durao da exposio ser em funo da natureza da
substncia, da actividade do sistema metablico e do tipo das clulas. Para detectar o pico da UDS, dever
acrescentar-se a
3
H-TdR, seja ao mesmo tempo que a substncia a testar, seja nos minutos que se seguem
exposio substncia a testar. A escolha entre estas duas tcnicas ser determinada por eventuais interaces
entre a substncia testada e a
3
H-TdR. Para se poder fazer a distino entre a UDS e a replicao
semiconservativa do ADN pode inibir-se esta ltima utilizando-se, por exemplo, um meio deficiente em
arginina, um baixo teor de sdio ou acrescentando-se hidroxiureia ao meio de cultura.
Medio LSC de UDS: Antes de proceder ao tratamento com a substncia a testar, bloqueia-se a entrada das
clulas na fase S da forma descrita acima; expem-se em seguida as clulas substncia a testar, como descrito
para a auto-radiografia. No fim do perodo de incubao extrai-se o ADN das clulas e determina-se a
quantidade total de ADN, bem como a quantidade de
3
H-TdR incorporada.
preciso notar que, se forem utilizados linfcitos humanos, no necessrio suprimir a replicao
semiconservativa do ADN nas culturas no estimuladas.
Anlise
De t e r mi n a e s a u t o - r a d i o g r f i c a s
Para determinar a UDS nas clulas em clulas em cultura no se contam os ncleos em fase S. Devero contar-
-se pelo menos 50 clulas por concentrao. As lminas sero codificadas antes da contagem. Em cada lmina
sero contados vrios campos escolhidos ao acaso, suficientemente afastados uns dos outros. Determinar-se- a
quantidade de
3
H-TdR incorporado no citoplasma contando-se trs superfcies do tamanho do ncleo no
citoplasma de cada clula contada.
De t e r mi na o L S C
Nas determinaes LSC-UDS deveria utilizar-se um nmero adequado de culturas para cada concentrao e
para os controlos.
Todos os resultados sero confirmados por experincias independentes.
2. RESULTADOS
Os resultados devero ser apresentados sob a forma de quadros.
2.1. DETERMINAES AUTO-RADIOGRFICAS
A quantidade de
3
H-TdR incorporada no citoplasma, bem como o nmero de gros contados por ncleo
celular, sero registados separadamente.
A mdia, a mediana e a moda podem ser utilizadas para descrever a distribuio da quantidade de
3
H-TdR
incorporado no citoplasma, bem como o nmero de gros por ncleo.
2.2. DETERMINAO LSC
Para as determinaes LSC a incorporao de
3
H-TdR dever ser indicada sob a forma dpm/ug do ADN. Pode
utilizar-se a mdia dos dpm/ug do ADN com o seu desvio-padro para descrever a distribuio da
incorporao.
Os resultados devero ser avaliados com mtodos estatsticos apropriados.
3. RELATRIO
3.1. RELATRIO
O relatrio dever conter as seguintes informaes:
clulas utilizadas, densidade e nmero de passagens na ocasio do tratamento, nmero de culturas
celulares,
mtodos utilizados na manuteno das culturas, incluindo o meio, a temperatura e a concentrao de
CO
2
,
substncia a testar, veculo, concentraes e justificao da escolha das concentraes usadas no teste,
pormenores relativos aos sistemas da activao metablica,
esquema do tratamento,
tcnica de auto-radiografia utilizada,
mtodos utilizados para bloquear a entrada das clulas na fase S,
tcnicas utilizadas para extraco do ADN e determinao da quantidade total de ADN nas
determinaes LSC,
relao dose/resposta, se possvel,
avaliao estatstica,
4. REFERNCIAS
B.19. TESTE IN V1TRO DE TROCA ENTRE CROMTIDES DO MESMO CROMOSSOMA
(Sister Chromatid Exchange SCE)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.2. DEFINIO
Nenhuma.
O ensaio de troca entre cromtides do mesmo cromossoma (SCE) constitui um teste de curto prazo que se
destina a detectar as trocas recprocas de ADN entre as cromtides de um mesmo cromossoma em duplicao.
As SCE representam a troca recproca de produtos de replicao do ADN em loci aparentemente homlogos. O
processo de troca implica provavelmente uma ciso e uma fuso do ADN, apesar de sabermos pouco acerca da
sua base molecular. Para detectar as SCE necessrio poder marcar separadamente as cromtides do mesmo
cromossoma; isto possvel pela incorporao da bromodesoxiuridina (BrdU) no ADN cromossmico durante
dois ciclos celulares.
As clulas de mamfero in vitro so expostas substncia a testar na presena e na ausncia de um sistema
exgeno de activao metablica de mamfero, se for caso disso, e colocadas num meio de cultura contendo
(BrdU) durante dois ciclos de replicao. Aps tratamento com um inibidor do fuso (por exemplo, colchicina) a
fim de acumular as clulas numa fase da mitose metafase-like (c-metafase) recolhem-se as clulas e fazem-se
preparaes de cromossomas.
Nenhum.
Preparativos
podem ser utilizadas no ensaio culturas primrias (linfcitos humanos) ou linhas celulares estabelecidas
(por exemplo, clulas de ovrio de hamster chins). As linhas celulares devero ser examinadas para
detectar uma eventual contaminao por Mycoplasma,
sero utilizados meios de cultura e condies de incubao adequados (por exemplo, temperatura,
recipientes de cultura, concentrao em CO
2
e humidade),
as substncias a testar podem ser preparadas nos meios de cultura, dissolvidas ou colocadas em
suspenso em veculos apropriados antes de proceder ao tratamento das clulas. A concentrao final do
veculo no meio de cultura no dever afectar nem a viabilidade das clulas nem a taxa de crescimento, e
os efeitos sobre a frequncia de SCE sero verificados por meio de um solvente de controlo,
as clulas sero expostas substncia a testar na presena e na ausncia de um sistema exgeno de
activao metablica de mamfero. Quando se utilizarem tipos celulares com actividade metablica
intrnseca, a taxa e a natureza dessa actividade devero ser adequadas classe qumica testada.
Nme r o d e c ul t ur a s
Sero utilizadas pelo menos duas culturas separadas para cada ponto experimental.
Ut i l i z a o d e c ont r ol os ne ga t i v os e pos i t i v os
Devero ser includos em cada experincia controlos positivos utilizando uma substncia com aco directa e
uma substncia necessitando de activao metablica; dever tambm utilizar-se um controlo para o veculo.
As substncias seguintes podem, por exemplo, ser utilizadas como controlos positivos:
substncia com aco directa:
etilmetanosulfonato de etilo,
substncia com aco indirecta:
ciclofosfamida.
Se for caso disso, pode incluir-se um controlo positivo suplementar pertencendo mesma classe qumica da
substncia a testar.
Conc e nt r a o d e e x pos i o
Deveriam ser utilizadas pelo menos trs concentraes da substncia a testar, convenientemente espaadas. A
concentrao mxima dever produzir um efeito txico significativo mas permitindo ainda uma replicao
celular adequada. As substncias relativamente insolveis na gua sero testadas at ao seu limite de
solubilidade com mtodos apropriados. No caso de substncias no txicas francamente solveis na gua a
concentrao mxima da substncia a testar dever ser determinada caso a caso.
Procedimento
P r e pa r a o d a s c ul t ur a s
Utilizam-se linhas celulares estabelecidas provenientes de culturas-me (por exemplo, por tripsinizao ou por
agitao), semeadas em recipientes de cultura, numa densidade adequada e incubadas a 37
o
C. No caso de
culturas em monocamada, o nmero de clulas por recipiente deveria ser ajustado de forma a que as culturas
no estejam confluentes a mais de 50 % no momento da colheita. As clulas podem tambm ser utilizadas na
forma de cultura em suspenso. As culturas de linfcitos humanos so preparadas a partir de sangue
heparinizado utilizando tcnicas apropriadas e incubadas a 37
o
C.
Tr a t a me nt o
So expostas substncia a testar clulas em fase exponencial de crescimento, durante um lapso de tempo
adequado; na maior parte dos casos uma a duas horas podem ser suficientes mas, nalguns casos, o tratamento
pode ser prolongado para cobrir at dois ciclos celulares completos. As clulas que no tiverem actividade
metablica intrnseca suficiente devero ser expostas substncia a testar na presena e na ausncia de um
sistema de activao metablica apropriado. No fim do perodo de exposio, as clulas so lavadas de forma a
eliminar a substncia testada, e depois cultivadas na presena de BrdU durante dois ciclos de replicao. Um
outro mtodo consiste na exposio simultnea das clulas substncia testada e BrdU durante dois ciclos
celulares completos.
As culturas de linfcitos humanos so tratadas enquanto se encontrarem num estado de semi-sincronizao.
As clulas so analisadas no decurso da segunda diviso aps tratamento, garantindo assim a exposio das
fases mais sensveis de ciclo celular substncia a testar. Todas as culturas a que se adicionou BrdU sero
manipuladas na obscuridade ou com pouca iluminao proveniente de lmpadas incandescentes at ao
momento da colheita das clulas, para reduzir a fotlise do ADN contendo BrdU.
Col he i t a d a s c l ul a s
As culturas de clulas so tratadas com um inibidor do fuso (por exemplo, colchicina) uma a quatro horas antes
da colheita. Cada cultura colhida e processada separadamente para a preparao dos cromossomas.
P r e pa r a o d os c r omos s oma s e c ol or a o
As preparaes de cromossomas so feitas com mtodos Standard de citogentica. Podem utilizar-se vrias
tcnicas para corar as lminas de forma a pr em evidncia as SCE (por exemplo, o mtodo por fluorescncia
mais Giemsa).
An l i s e
O nmero de clulas analisado ser em funo da frequncia espontnea controlo de SCE. Habitualmente
analisam-se pelo menos 25 metafases de boa qualidade, por cultura, para contar as SCE. As lminas so
codificadas antes da anlise. Para os linfcitos humanos apenas so analisadas as metafases contendo 46
centrmeros. Para as linhas celulares estabelecidas apenas so analisadas as metafases com 2 centrmeros que
o nmero modal. Dever ser precisado se uma inverso de colorao ao nvel do centrmero ou no
considerada como SCE. Os resultados sero confirmados por uma experincia independente.
2. RESULTADOS
Os resultados devero ser apresentados em quadros. O nmero de SCE por metafase e o nmero de SCE por
cromossoma so dados separadamente para todas as culturas, tratadas e controlos.
Os resultados sero analisados com mtodos estatsticos adequados.
3. RELATRIO
O relatrio deveria conter as informaes seguintes:
clulas utilizadas, mtodos de manuteno da cultura celular,
condies experimentais: composio de meios, concentrao de CO
2
, concentrao da substncia a
testar, veculo utilizado, temperatura de incubao, tempo de tratamento, inibidor do fuso utilizado,
concentrao e durao do tratamento com este, tipo de sistema de activao de mamfero utilizado,
nmero de culturas celulares por ponto experimental,
pormenores relativos tcnica utilizada na preparao das lminas,
nmero de metafases analisadas (resultados indicados separadamente para cada cultura),
nmero mdio de SCE por clula e por cromossoma (resultados indicados separadamente para cada
cultura),
critrio de contagem de SCE,
justificao da escolha das doses,
avaliao estatstica,
4. REFERNCIAS
B.20. TESTE DE LETALIDADE RECESSIVA LIGADA AO SEXO NA DROSOPHILA MELANOGASTER
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.2. DEFINIO
Nenhuma.
O teste de letalidade recessiva ligada ao sexo (SLRL Sex Linked Recessive Letal Test) utilizando a Drosophila
melanogaster detecta a ocorrncia de mutaes mutaes pontuais bem como pequenas deleces na linha
germinal do insecto. Esta prova um ensaio de mutao forward capaz de detectar mutaes em cerca de
800 loci do cromossoma X, o que representa cerca de 80 % de todos os loci deste cromossoma. O cromossoma
X representa cerca de um quinto do genoma haplide completo.
As mutaes do cromossoma X de Drosophila melanogaster so expressas fenotipicamente nos machos
portadores do gene mutante. Quando a mutao letal no estado hemizigtico, a sua presena deduzida a
partir da ausncia de um dos grupos de descendncia masculina, em vez dos dois habitualmente produzidos
por uma fmea heterozigtica. O SLRL baseia-se nestes factos, utilizando cromossomas especificamente
marcados e com rearranjos da sua estrutura.
Nenhum.
Preparativos
S t oc k s
Podem ser utilizados machos de um stock de tipo selvagem bem definido e fmeas do stock Muller-5. Podem
tambm ser utilizados outros stocks de fmeas marcadas adequadamente, com cromossomas X invertidos de
forma mltipla.
S ubs t nc i a a t e s t a r
As substncias a testar devem ser dissolvidas em gua. As substncias insolveis na gua podem ser dissolvidas
ou colocadas em suspenso em veculos apropriados (por exemplo, uma mistura de etanol com Tween-60 ou
80), sendo depois diludas em gua ou numa soluo salina antes da administrao. Deve evitar-se como
veculo o dimetilsulfxido (DMSO).
Nme r o d e a ni ma i s
O teste deve ser concebido com uma sensibilidade e grau de significncia preestabelecido. A frequncia de
mutantes espontneos observada no grupo de controlo ir influenciar fortemente o nmero de cromossomas
tratados que devem ser analisados.
Vi a d e a d mi ni s t r a o
A administrao pode ser oral, por injeco ou por exposio a gases ou vapores. A ingesto da substncia
testada pode ser feita por intermdio de uma soluo aucarada. Se necessrio, as substncias podem ser
dissolvidas numa soluo de NaCL a 0,7 % e injectadas no trax ou no abdmen.
Devem ser includos controlos negativos (veculo) e positivos. No entanto, se existirem dados apropriados de
experincias anteriores, no so necessrios controlos simultneos.
N v e i s d e e x pos i o
Devem utilizar-se trs nveis de exposio. Para uma avaliao preliminar pode utilizar-se apenas uma nica
concentrao da substncia testada, podendo essa ser a concentrao mxima tolerada ou a concentrao
produzindo alguns sinais de toxicidade. No caso de substncias no txicas dever utilizar-se a concentrao
mxima praticvel.
P r oc e d i me nt o
Tratam-se com a substncia a testar machos de fentipo selvagem (com trs a cinco dias de idade), sendo
acasalados individualmente a um maior nmero de fmeas virgens do stock Muller-5 ou outro stock marcado de
forma apropriada (com cromossomas X invertidos de forma mltipla). Estas fmeas sero substitudas de dois
em dois ou de trs em trs dias por outras fmeas virgens para se cobrir o ciclo germinal completo. A
descendncia destas fmeas examinada para detectar os efeitos sobre o esperma maduro, as espermtides em
estdios precoces, intermdios ou tardios, os espermatcitos e as espermatognias na ocasio do tratamento.
As fmeas F
1
heterozigticas provenientes dos cruzamentos mencionados acima so acasaladas individual-
mente (isto , um fmea por frasco de experincia) com os seus irmos. Na gerao F
2
examina-se cada cultura
para detectar a ausncia de machos do tipo selvagem. Se uma cultura revelar ser proveniente de uma fmea F
1
portadora de um gene letal no cromossoma X paterno (isto , quando no se observar nenhum macho
portador do cromossoma tratado), devem testar-se as filhas dessa fmea com o mesmo genotipo para verificar
se a letalidade se repete na gerao seguinte.
2. RESULTADOS
Os resultados devem ser apresentados em quadros indicando o nmero de cromossomas X tratados, o nmero
de machos no frteis e o nmero de cromossomas letais por cada concentrao de exposio e por cada
perodo de acasalamento para cada macho tratado. O nmero de agregados de diferentes dimenses dever ser
indicado. Estes resultados devero ser confirmados por uma experincia separada.
Devero ser utilizados mtodos estatsticos apropriados na avaliao dos testes de letalidade recessiva ligada ao
sexo. O reagrupamento de genes letais recessivos provenientes de um nico macho dever ser considerado e
avaliado com um mtodo estatstico apropriado.
3. RELATRIO
stock: stocks ou estirpes de Drosophila utilizados, idade dos insectos, nmero de machos tratados, nmero
de machos estreis, nmero de culturas F
2
estabelecidas, nmero de cromossomas portadores de um gene
letal detectado em cada estdio das clulas germinais,
critrios aplicados para determinar as dimenses dos grupos tratados,
condies experimentais: descrio pormenorizada do esquema de tratamento e de amostragem, nveis
de exposio, dados sobre a toxicidade, controlos negativos (solvente) e positivos se necessrio,
critrios aplicados na contagem das mutaes letais,
relao exposio/efeito, se possvel,
e avaliao estatstica dos resultados,
4. REFERNCIAS
B.21. TESTES DE TRANSFORMAO DE CLULAS DE MAMFERO IN VITRO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.2. DEFINIO
Nenhuma.
Podem utilizar-se sistemas de cultura de clulas de mamfero para detectar in vitro alteraes do fentipo
induzidas por substncias qumicas associadas com uma transformao maligna in vivo. Entre as culturas mais
frequentemente utilizadas contam-se as C3H1OT 1/2, 3T3, SHE, rato Fischer; os testes baseiam-se nas
alteraes da morfologia celular, formao de ninhos celulares ou alteraes ligadas necessidade de
ancoragem a um agar semi-slido. Existem outros sistemas menos frequentemente utilizados que detectam
outras alteraes fisiolgicas ou morfolgicas nas clulas depois de uma exposio a carcinognios qumicos.
Nenhum dos fenmenos finais destes testes in vitro apresenta uma relao mecanicista estabelecida com o
cancro. Alguns dos sistemas de testes so capazes de detectar promotores de tumores. Pode determinar-se a
citotoxicidade medindo o efeito da substncia a testar sobre a capacidade para formar uma colnia (eficcia de
cloning) ou ainda sobre as taxas de crescimento das culturas. A medio da citotoxicidade tem por fim
determinar se a exposio da substncia testada foi toxicologicamente significativa mas no pode servir para
calcular a frequncia das transformaes em todas as provas uma vez que algumas destas podem implicar uma
incubao prolongada e/ou uma nova passagem.
Nenhum.
Preparativos
C l ul a s
Podem ser utilizadas vrias linhas celulares ou clulas primrias, dependendo do teste de transformao
utilizado. O investigador deve assegurar-se de que as clulas do teste efectuado apresentam a alterao
fenotpica adequada depois da exposio a carcinognios conhecidos e que a validade e fiabilidade do teste
efectuado no seu laboratrio sejam comprovadas e documentadas.
Me i o
Devero utilizar-se meios e condies de ensaio adequados ao teste de transformao utilizado.
S ubs t nc i a a t e s t a r
As substncias a testar podem ser preparadas nos meios de cultura, e dissolvidas ou colocadas em suspenso
em veculos apropriados antes do tratamento das clulas. A concentrao final do veculo no sistema de cultura
no deve afectar a viabilidade celular nem a taxa de crescimento, nem a incidncia de transformaes.
As clulas devero ser expostas substncia a testar na presena e na ausncia de um sistema de activao
metablica adequado. Alternativamente, quando se utilizar tipos de clulas com actividade metablica
intrnseca, a natureza dessa actividade ser comprovadamente apropriada classe qumica testada.
Condies do ensaio
Ut i l i z a o d e c ont r ol os pos i t i v os e ne ga t i v os
Sero includos em cada experincia controlos positivos utilizando uma substncia com aco directa e uma
substncia necessitando de activao metablica; utilizar-se- igualmente um controlo negativo (veculo).
Podem ser utilizadas como controlos positivos as seguintes substncias:
substncias qumicas com aco directa:
etilmetanosulfonato,
-propiolactona,
substncias necessitando de activao metablica:
2-acetilaminofluoreno,
4-dimetilaminobenzeno,
7,12-dimetilbenzantraceno.
Dever ser includo, quando justificado, um controlo positivo suplementar pertencendo mesma classe
qumica que a substncia testada.
Devero ser utilizadas vrias concentraes das substncias a testar. Estas concentraes devero produzir um
efeito txico dependente da concentrao; a concentrao mxima dever produzir uma baixa taxa de
sobrevivncia, a concentrao mnima uma taxa de sobrevivncia prxima da observada nos controlos
negativos. As substncias relativamente insolveis na gua sero testadas at ao seu limite de solubilidade com
mtodos apropriados. No caso de substncias no txicas, francamente solveis na gua, a concentrao
mxima dever ser determinada caso a caso.
Procedimento
As clulas sero expostas durante um perodo de tempo dependente do sistema celular utilizado, que pode
implicar um novo tratamento acompanhado de mudana de meio (e se necessrio uma nova mistura de
activao metablica) se a exposio for prolongada. As clulas que no tenham actividade metablica
intrnseca suficiente devero ser expostas substncia a testar na presena e na ausncia de um sistema de
activao metablica apropriado. No fim do perodo de exposio, as clulas so lavadas de forma a eliminar a
substncia testada e cultivadas em condies que permitam o aparecimento do fentipo transformado em
estudo sendo ento determinada a incidncia desta transformao. Todos os resultados devero ser
confirmados por uma experincia independente.
2. RESULTADOS
Os resultados devero ser apresentados em quadros e podem ser apresentados de vrias formas consoante o
mtodo utilizado, por exemplo, contagem por placa, placas positivas ou nmero de clulas transformadas.
Quando apropriado, a sobrevivncia ser expressa em percentagem das taxas de controlo e a frequncia de
transformao corresponder ao nmero de clulas transformadas por nmero de sobreviventes. Os resultados
devero ser avaliados com mtodos estatsticos apropriados.
3. RELATRIO
tipo de clula utilizada, nmero de culturas de clulas, mtodos de manuteno das culturas de clulas,
condies do teste: concentrao da substncia a testar, veculo usado, tempo de incubao, durao e
frequncia do tratamento, densidade celular durante o tratamento, tipo de sistema exgeno de activao
metablica utilizado, controlos positivos e negativos, especificao do fentipo estudado, sistema
selectivo usado (se apropriado); justificao da escolha das doses,
mtodo utilizado para contar as clulas viveis e as transformadas;
avaliao estatstica,
4. REFERNCIAS
B.22. TESTE DE LETALIDADE DOMINANTE NO ROEDOR
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.2. DEFINIO
Nenhuma.
A letalidade dominante provoca a morte do embrio ou do feto. A induo de letalidade dominante por
exposio a uma substncia qumica indica que a substncia afectou o tecido germinal da espcie estudada.
Admite-se geralmente que a letalidade dominante devida a uma leso cromossmica (alteraes estruturais e
numricas). No caso de os animais tratados serem fmeas, a morte do embrio pode tambm ser devida a
efeitos txicos.
Em geral, os machos so expostos substncia a testar e acasalados com fmeas virgens no tratadas. Os
diferentes estdios das clulas germinais podem ser testados separadamente utilizando-se perodos de
acasalamento sequenciais. O aumento do nmero de implantes mortos por fmea no grupo tratado em relao
ao nmero de implantes mortos por fmea no grupo de controlo reflecte as perdas aps a implantao. As
perdas antes da implantao podem ser calculadas por contagem dos corpos amarelos ou comparando o
nmero total de implantes por fmea no grupo tratado e no grupo de controlo. O efeito total de letalidade
dominante igual soma das perdas antes e depois da implantao. O clculo do efeito total da letalidade
dominante baseia-se na comparao entre o nmero de implantes vivos por fmea no grupo tratado e o
registado no grupo de controlo. Uma diminuio do nmero dos implantes em determinados intervalos pode
ser devida destruio das clulas (isto , de espermatcitos e/ou espermatognias).
Nenhum.
Preparativos
Quando for possvel, as substncias a testar sero dissolvidas ou colocadas em suspenso numa soluo salina
isotnica. As substncias qumicas insolveis na gua podem ser dissolvidas ou colocadas em suspenso em
veculos apropriados. O veculo utilizado no dever interferir com a substncia a testar nem dever produzir
efeitos txicos. Sero utilizadas preparaes frescas da substncia a testar.
A substncia a testar dever ser administrada uma nica vez. Pode ser utilizado um programa de tratamento
repetido em funo das informaes toxicolgicas disponveis. As vias de administrao habituais so a
intubao oral ou a injeco interperitoneal. Podem ser adequadas outras vias de administrao.
Ani ma i s d e e x pe r i nc i a
Recomenda-se a utilizao de ratos ou ratinhos. Repartem-se ao acaso entre os grupos tratados e de controlo
animais jovens e sos tendo atingido a plena maturidade sexual.
Nme r o e s e xo
Utiliza-se um nmero adequado de machos tratados, tendo em conta a frequncia espontnea da caracterstica
biolgica que est a ser avaliada. O nmero escolhido dever basear-se numa sensibilidade de deteco e grau
de significao preestabelecidos. Por exemplo, num teste tpico, o nmero de machos escolhido para cada
grupo de dose dever ser suficientemente grande para obter 30 a 50 fmeas grvidas por perodo de
acasalamento.
Ut i l i z a o d e c ont r ol os ne ga t i v os e pos i t i v os
Devero ser includos em cada experincia controlos positivos e negativos (veculos), sendo geralmente
simultneos. Se experincias recentes efectuadas no mesmo laboratrio tiverem dado resultados aceitveis com
os controlos positivos, estes resultados podero ser utilizados em vez de um controlo positivo simultneo. No
que respeita s substncias de controlo positivo dever utilizar-se uma dose baixa apropriada (por exemplo
MMS, intraperitonealmente, 10 mg/kg) para demonstrar a sensibilidade do teste.
Dos e s
Normalmente usam-se trs nveis de dose diferentes. A dose mxima dever produzir sinais de toxicidade ou
reduzir a fecundidade dos animais tratados. Em alguns casos pode ser suficiente uma nica dose elevada.
E ns a i o- l i mi t e
As substncias no txicas so testadas razo de 5 g/kg no caso de administrao nica e de 1 g/kg/dia no
caso de administrao repetida.
Procedimento
Vrios esquemas de tratamento so possveis. O mtodo mais frequente o da administrao nica. Podem
utilizar-se outros esquemas de tratamento.
Cada macho acasalado sequencialmente com uma ou duas fmeas virgens no tratadas, a intervalos de tempo
apropriados aps o tratamento. As fmeas devero ser deixadas com os machos durante pelo menos um ciclo
completo do estro, ou at que o acasalamento seja comprovado pela presena de esperma na vagina ou pela
presena de um rolho vaginal.
O nmero de acasalamentos aps tratamento determinado pelo esquema de tratamento e dever assegurar
que sejam testados todos os estdios das clulas germinais tratadas.
As fmeas so sacrificadas durante a segunda metade da gestao e o contedo do tero examinado para
determinao do nmero de implantes vivos e mortos. Os ovrios podem ser examinados para determinar o
nmero de corpos amarelos.
2. RESULTADOS
Os resultados devero ser apresentados em quadros, indicando o nmero de machos, o nmero de fmeas
grvidas bem como o nmero de fmeas no grvidas. Os resultados de cada acasalamento, incluindo a
identidade de cada macho e de cada fmea so apresentados separadamente. Sero descritos para cada fmea a
semana de acasalamento e a dose recebida pelos machos, bem como a frequncia dos implantes vivos e mortos.
O clculo do efeito total de letalidade dominante baseia-se numa comparao do nmero de implantes vivos
por fmea no grupo tratado com o nmero de implantes vivos por fmea no grupo de controlo. Compara-se a
relao implantes vivos/mortos no grupo tratado com a mesma relao no grupo de controlo para indicao
das perdas ps-implantao.
Se os resultados forem registados sob a forma de mortalidades precoces e mortalidades tardias, os quadros
devero tornar clara essa diferena. Se for avaliada a perda anterior implantao, devem apresentar-se os
resultados. Esta perda pode ser calculada como a discrepncia entre o nmero de corpos amarelos e o nmero
de implantes ou como a diminuio do nmero mdio de implantes por fmea em relao ao dos
acasalamentos de controlo.
Os resultados sero avaliados com mtodos estatsticos apropriados.
3. RELATRIO
O relatrio do teste dever incluir as informaes seguintes:
espcies, estirpe, idade e peso dos animais utilizados, nmero de animais de cada sexo nos grupos
tratados e de controlo,
substncia a testar, veculo, doses testadas e justificao da escolha das doses, controlos negativos e
positivos, dados relativos toxicidade,
via de administrao e esquema do tratamento,
esquema de acasalamento,
mtodo utilizado para comprovar o acasalamento,
momento do sacrifcio,
critrios de contagem dos efeitos de letalidade dominante,
avaliao estatstica,
4. REFERNCIAS
B.23. ENSAIO DE ABERRAES CROMOSSMICAS EM ESPERMATOGNIAS DE MAMFERO
1. MTODO
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 483 Ensaio de aberrao cromossmica em
espermatognias de mamfero (1997).
1.1. INTRODUO
O objectivo do ensaio in vivo de aberraes cromossmicas em espermatognias de mamfero identificar as
substncias que causam aberraes cromossmicas estruturais nas clulas espermatognias de mamfero (1) (2)
(3) (4) (5). As aberraes estruturais podem ser de dois tipos, cromossmicas ou cromatdicas. A maior parte
dos mutagneos qumicos induzem aberraes cromatdicas, mas tambm podem ocorrer aberraes
cromossmicas. O mtodo no foi concebido para medir aberraes numricas e no normalmente utilizado
com esse objectivo. As mutaes cromossmicas e eventos relacionados causam diversas doenas genticas
humanas.
O presente ensaio mede eventos a nvel dos cromossomas de clulas germinais espermatognias e, por
conseguinte, pressupe-se que tenha um carcter de previso da induo de mutaes transmissveis nas clulas
germinais.
No presente ensaio utilizam-se normalmente roedores. O ensaio citognico in vivo detecta aberraes
cromossmicas nas mitoses das espermatognias. O mtodo no diz respeito a outros tipos de clulas.
Para detectar aberraes cromatdicas em clulas espermatognias deve examinar-se a primeira diviso mittica
da clula aps a exposio, antes que as eventuais leses sejam perdidas por via de divises celulares
subsequentes. Para obteno de informao adicional sobre as clulas germinais das espermatognias expostas
pode proceder-se anlise dos cromossomas durante a meiose, para deteco de aberraes cromossmicas na
diacinese-metafase 1, momento em que as clulas expostas passam forma de espermatcitos.
O presente ensaio in vivo foi concebido para investigar se os agentes mutagneos das clulas somticas tambm
so activos para as clulas germinais. Alm disso, o ensaio das espermatognias relevante para a avaliao dos
riscos de mutagenicidade, na medida em que permite a considerao dos elementos do metabolismo in vivo, da
farmacocintica e dos processos de reparao do ADN.
Nos testculos esto presentes diversas geraes de espermatognias, com diferentes graus de sensibilidade ao
tratamento qumico. Logo, as aberraes detectadas representam uma resposta agregada das vrias populaes
de clulas espermatognias expostas, com predominncia para as clulas espermatognias mais diferenciadas,
que so em maior nmero. Dependendo da sua posio no testculo, diferentes geraes de espermatognias
podero ou no ser expostas circulao geral, devido barreira fsica e fisiolgica constituda pelas clulas de
Sertoli e barreira sangue-testculo.
1.2. DEFINIES
Poliploidia: nmero de cromossomas mltiplo do nmero haplide (n), mas diferente do diplide (ou seja, 3n,
4n e assim por diante).
em metafase sob a forma de supresso de segmentos, de alteraes de partes da sequncia ou da troca de
Os animais so expostos substncia em estudo atravs de um modo de exposio apropriado, sendo
sacrificados passado o tempo necessrio aps a exposio. Antes do sacrifcio os animais so tratados com um
agente de fixao da metafase (por exemplo, colchicina ou Colcemid
). Seguidamente so feitas preparaes de

cromossomas a partir das clulas germinais e, aps serem coradas, as clulas em metafase so analisadas para
deteco de aberraes cromossmicas.
1.4.1. Preparao
Geralmente, so utilizados ratos ou hamsters chineses machos, embora possam ser utilizados machos de
qualquer outra espcie de mamfero apropriada. Devem ser utilizados animais adultos saudveis jovens das
raas de laboratrio mais comuns. No incio do estudo, a diferena de peso entre os animais deve ser mnima,
no devendo exceder 20 % do peso mdio de cada sexo.
Os animais machos adultos saudveis jovens so distribudos aleatoriamente pelos grupos de controlo e pelos
grupos expostos. As gaiolas devem ser dispostas de modo a que eventuais efeitos devidos respectiva colocao
sejam minimizados. Os animais so identificados de forma inequvoca, devendo ser aclimatados s condies
de laboratrio durante pelo menos cinco dias antes de se iniciar o estudo.
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo, no devendo produzir efeitos txicos nas doses
utilizao de um solvente/veculo aquoso.
1.4.2.2. Controlos
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo). Com excepo da
exposio substncia em estudo, todos os animais, incluindo os dos grupos de controlo, devem ser
manuseados de forma idntica.
Os controlos positivos devem produzir aberraes estruturais in vivo nas clulas espermatognias quando
administrados aos nveis de exposio a que se espera o surgimento de um aumento detectvel em relao
linha de base.
A dose de controlo positiva a administrar deve ser escolhida de modo a que os seus efeitos sejam claros mas
tambm a que as lminas codificadas no sejam imediatamente identificadas pela pessoa que procede s
leituras. aceitvel que o controlo positivo seja administrado por uma via diferente da substncia em estudo e
que s seja realizada uma amostra. A possibilidade de utilizao de produtos qumicos de uma classe
relacionada para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam. As substncias de controlo positivo
podem incluir, por exemplo:
Ciclofosfamida
Ciclofosfamida monohidrato
50-18-0
6055-19-2
200-015-4
Ciclohexilamina 108-91-8 203-629-0
Mitomicina C 50-07-7 200-008-6
Acrilamida monomrica 79-06-1 201-173-7
Trietilenomelamina 51-18-3 200-083-5
Para cada amostragem prevista devem ser includos controlos negativos expostos apenas ao solvente ou
veculo, que sero sujeitos exactamente ao mesmo procedimento que os grupos expostos, a menos que existam
dados histricos de controlo aceitveis em relao variabilidade de animal para animal e frequncia da
ocorrncia de clulas com aberraes cromossmicas. Alm disso, devem ser tambm preparados controlos
no expostos substncia em estudo, a menos que existam dados de controlo histricos ou publicados que
mostrem que o solvente/veculo escolhido no induz qualquer efeito deletrio ou mutagnico.
1.5. PROCEDIMENTO
1.5.1. Nmero de animais
Cada grupo exposto e de controlo deve incluir pelo menos cinco animais machos analisveis.
As substncias de ensaio so preferivelmente administradas numa ou em duas doses (ou seja, numa s
exposio ou em duas exposies). As substncias podero igualmente ser administradas numa dose dividida,
ou seja, duas exposies no mesmo dia, separadas por apenas algumas horas, para facilitar a administrao de
grandes volumes. Qualquer outro regime de administrao ter de ser cientificamente justificado.
No grupo exposto dose mais elevada sero realizadas duas amostras aps a exposio. Uma vez que a cintica
celular poder ser afectada pela substncia em estudo, sero colhidas duas amostras, uma cerca de 24 horas
aps a exposio e outra cerca de 48 horas aps a exposio. Para os restantes animais deve ser colhida uma
amostra 1,5 ciclos celulares normais ou 24 horas aps a exposio, a no ser nos casos em que se saiba que a
utilizao de outros tempos de amostragem mais apropriada para a deteco dos efeitos (6).
Para alm disso, podero ser utilizados outros tempos de amostragem. Assim, por exemplo, no caso de
produtos qumicos que possam induzir lagging cromossmico ou efeitos independentes do factor S, poder ser
necessrio fazer a amostragem mais cedo (1).
A necessidade ou no de uma repetio da exposio ter de ser avaliada caso a caso. Se o tratamento for
repetido, os animais devem ser sacrificados 24 horas (1,5 ciclos celulares) aps a ltima exposio. Quando
necessrio, podero ser realizadas amostras adicionais.
Antes do sacrifcio, os animais so injectados intraperitonealmente com uma dose apropriada de um agente de
fixao da metafase (por exemplo, Colcemid
ou colchicina). As amostras sero colhidas a intervalos regulares a

partir desse momento. Esse intervalo corresponde a aproximadamente 3-5 horas para os ratos e a 4-5 horas
para os hamsters chineses.
1.5.3. Doses
apropriados, esse estudo deve ser executado no mesmo laboratrio, utilizando as mesmas espcies, linha celular
e regime de exposio a utilizar no estudo principal (7). Se existir toxicidade, sero utilizadas trs doses
diferentes para a primeira amostragem. Essas doses devem abranger uma gama de toxicidade mxima a quase
nula. Na segunda amostragem s ser necessrio avaliar a dose mais elevada. A dose mais elevada definida
como a dose que produz sinais de toxicidade tais que indiquem que a utilizao de doses superiores, com o
mesmo regime de administrao, produzir mortalidade.
As substncias com actividade biolgica especfica em doses baixas e no txicas (como acontece com as
hormonas e agentes mitognicos) podero constituir uma excepo aos critrios de fixao da dose, devendo
ser avaliadas numa base casustica. A dose mais elevada pode igualmente ser definida como uma dose que
produz algumas indicaes de toxicidade nas espermatognias (por exemplo, reduo da taxa de mitose das
espermatognias na primeira e segunda metafase meiticas; essa reduo no deve ser superior a 50 %).
exposies no mesmo dia no produzir nenhum efeito txico perceptvel e se no for previsvel a existncia de
toxicidade gentica com base nos dados respeitantes a substncias estruturalmente relacionadas, poder no ser
considerado necessrio um estudo completo com utilizao de trs doses diferentes. A exposio prevista para
o ser humano pode indicar a necessidade de se utilizarem doses mais elevadas nos ensaios-limite.
forma a garantir um volume constante para todas as doses a administrar.
1.5.6. Preparao dos cromossomas
Imediatamente aps o sacrifcio, devem ser preparadas suspenses celulares de um ou de ambos os testculos,
que sero seguidamente expostas a uma soluo hipotnica e fixadas. As clulas so depois esfregadas em
lminas e coradas.
1.5.7. Anlise
Devem ser analisadas pelo menos 100 clulas em metafase avanada de cada animal (ou seja, um mnimo de
500 metafases por grupo). Este nmero poder ser menor quando se verificarem taxas elevadas de aberraes.
Todas as lminas, incluindo as dos controlos positivos e negativos, devem ser independentemente codificadas
antes da anlise microscpica. Uma vez que os procedimentos de preparao das lminas do frequentemente
lugar ruptura de uma certa proporo das clulas em metafase, com perda de cromossomas, as clulas
contabilizadas devem conter um nmero de centrmeros igual a 2n 2.
2. DADOS
Para cada animal devem ser verificados o nmero de clulas com aberraes cromossmicas e o nmero de
aberraes cromossmicas por clula. Os diferentes tipos de aberrao cromossmica estrutural devem ser
enumerados com os respectivos nmeros e frequncias para os grupos expostos substncia em estudo e de
controlo. A ocorrncia de lacunas registada em separado e includa no relatrio, mas no geralmente
contabilizada para o clculo da frequncia total das aberraes.
Se para alm das mitoses tambm se observarem meioses, a relao entre o nmero de mitoses e de metafases I
ou II das espermatognias deve ser determinada num total de 100 clulas em diviso por animal, para medio
da citotoxicidade em todos os animais expostos substncia em estudo e do controlo negativo, de forma a
poder estabelecer se existem efeitos citotxicos. Se s se observarem mitoses, o ndice mittico deve ser
calculado utilizando pelo menos 1 000 clulas de cada animal.
H diversos critrios para determinar um resultado positivo, como por exemplo um aumento do nmero de
clulas com aberraes cromossmicas relacionado com a dose ou um claro aumento do nmero de clulas
com aberraes num determinado grupo e numa determinada amostragem. Deve ser tomada em considerao,
antes de mais, a importncia biolgica dos resultados. Como auxlio para a avaliao dos resultados dos
ensaios, podero ser utilizados mtodos estatsticos (8), embora a significncia estatstica no deva ser o nico
elemento para a determinao de uma resposta positiva. Os resultados ambguos devem ser esclarecidos atravs
de estudos adicionais, de preferncia com modificao das condies experimentais.
no mutagnica.
Um resultado positivo no ensaio in vitro para aberraes cromossmicas em espermatognias indica que a
substncia em estudo induz aberraes cromossmicas estruturais nas clulas germinais das espcies testadas.
Um resultado negativo indica que, nas condies do ensaio, a substncia em estudo no induz aberraes
cromossmicas estruturais nas clulas germinais das espcies testadas.
circulatrio geral ou especificamente o tecido objectivo.
RELATRIO DE ENSAIO
Solvente/veculo:
Animais de ensaio:
nmero e idade dos animais,
Condies de ensaio:
justificao do momento do sacrifcio,
descrio pormenorizada dos calendrios de tratamento e amostragem,
substncia utilizada para fixar a metafase, respectiva concentrao e durao da exposio,
Resultados:
ndice mittico,
proporo de clulas espermatognias em mitose em relao s clulas em metafase I ou II,
tipo e nmero de aberraes, discriminados para cada animal,
nmero total de aberraes por grupo,
nmero de clulas aberrantes por grupo,
dados relativos ao controlo negativo realizado em paralelo com o ensaio,
dados histricos sobre o controlo negativo, com as respectivas gama, valor mdio e o desvio-padro,
dados relativos ao controlo positivo realizado em paralelo com o ensaio,
alteraes da ploidia, quando observadas.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Adler, I.D., (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their
Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and
Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B. and Magnusson, J. (Eds.) Liss, New York, p. 477-484.
(2) Adler, I.D., (1984). Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S.
Venitt and J.M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, p. 275-306.
(3) Evans, E.P., Breckon, G. and Ford, C.E., (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from
Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L., (1990). In Vivo Cytogenetic
Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS
Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press,
Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141.
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y., (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial
Chromosomes. Mutation Res., 52, p. 207-209.
(6) Adler, I.D., Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N.,
(1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of
the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, p. 313-318.
G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M., (1992). Report of British Toxicology Society/UK
Environmental Mutagen Society Working group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays.
D.G. and Savage, J.R.K., (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.)
Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity
Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne,
Sydney, p. 184-232.
B.24. TESTE DAS MALHAS (SPOT-TEST) NO RATINHO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.2. DEFINIO
Nenhuma.
Este teste uma prova in vivo efectuada no ratinho, cujos embries em desenvolvimento so expostos
substncia a testar. As clulas visadas dos embries em desenvolvimento so os melanoblastos e os genes alvo
so os responsveis pela pigmentao do plo. Os embries em desenvolvimento so heterozigticos para
alguns desses genes. Uma mutao ao nvel do alelo dominante ou a perda do alelo dominante de um desses
genes num melanoblasto (na sequncia de vrios fenmenos genticos) traduz-se pela expresso do fentipo
recessivo nas clulas que dele descendem, do que resulta o aparecimento de uma malha de cor diferente no plo
do ratinho. Conta-se assim o nmero de descendentes portadores de malhas (mutaes) e a sua frequncia
comparada com a frequncia observada na descendncia resultante do desenvolvimento de embries tratados
apenas com o solvente. O teste das malhas no ratinho (spot test) detecta as mutaes somticas presumveis nas
clulas fetais.
Nenhum.
Preparativos
Quando for possvel as substncias a testar so dissolvidas ou colocadas em suspenso numa soluo salina
isotnica. As substncias insolveis na gua sero dissolvidas ou colocadas em suspenso em veculos
apropriados. O veculo utilizado no dever interferir com a substncia a testar nem produzir efeitos txicos.
Devero utilizar-se solues preparadas de fresco da substncia a testar.
Ratinhos da estirpe T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, c
ch
p/c
ch
p; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald
spotting, s/s) so acasalados seja com a estirpe HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, ln
fz/ln fz; pearl pe/pe) ou com a C57 BL (nonagouti, a/a). Podem utilizar-se outros cruzamentos apropriados como
entre a NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) e a DBA (nonagouti, a/a; brown, b/b; dilute, d/d) na condio de
produzirem uma descendncia nonagouti.
Nme r o e s e xo
Deve tratar-se um nmero suficiente de fmeas grvidas de forma a obter um nmero adequado de
descendentes vivos para cada dose utilizada. A dimenso da amostra depende do nmero de malhas observadas
nos ratinhos tratados bem como da importncia dos dados dos controlos. S se aceitar um resultado negativo
se forem examinados pelo menos 300 descendentes das fmeas tratadas com a dose mxima.
Cont r ol os ne ga t i v os e pos i t i v os
Dever dispor-se de dados de controlo simultneos respeitantes aos ratinhos tratados apenas com o veculo
(controlos negativos). Dados de controlo de experincias anteriores provenientes do mesmo laboratrio podem
ser-lhes reunidos para se aumentar a sensibilidade do teste, no caso de estes serem homogneos. Se a substncia
testada no se revelar mutagnica, deveriam estar disponveis os dados obtidos recentemente pelo mesmo
laboratrio para um controlo positivo cuja aco mutagnica nesta prova seja conhecida.
As vias de administrao habituais nas fmeas grvidas so a intubao oral e a injeco intraperitoneal.
Tratamentos por inalao ou outras vias de administrao sero usados quando tal for apropriado.
Dos e s
Utilizam-se pelo menos dois nveis de dose, um dos quais provocando sinais de toxicidade ou reduzindo o
tamanho das ninhadas. No caso de substncias no txicas, recorrer-se- a um tratamento com a dose mxima
praticvel.
Procedimento
Administra-se normalmente um tratamento nico no dia 8, 9 ou 10 de gestao, sendo o dia 1 aquele em que
se observe pela primeira vez a presena de um rolho vaginal. Estes dias correspondem 7,25, 8,25 e 9,25 dias
aps a concepo. Podem ser efectuados tratamentos sucessivos durante esses dias.
An l i s e
Trs a quatro semanas aps o nascimento a descendncia codificada e examinada para se detectar a presena
de malhas. Distinguem-se trs classes de malhas:
a) Malhas brancas situadas a menos de 5 mm da linha mdio-ventral que se presuma resultarem de morte
celular (WMVS);
b) Malhas amarelas de tipo agouti, associadas aos mamilos, aos rgos genitais, garganta, s regies axilar
e inguinal bem como no meio da regio frontal, que se presuma serem devidas a uma diferenciao
defeituosa (MDS); e
c) Malhas pigmentadas e brancas, distribudas ao acaso no plo, que se presuma serem devidas a mutaes
somticas (RS).
Contam-se as trs classes mas apenas a ltima, isto , a RS, tem relevncia gentica. Os problemas postos pela
distino entre as classes MDS e RS podem ser resolvidos examinando-se amostras de plos ao microscpio de
fluorescncia.
Sero anotadas as alteraes macroscpicas evidentes observadas na descendncia.
2. RESULTADOS
Os resultados so apresentados indicando o nmero total de crias examinadas e o nmero de crias
apresentando uma ou vrias malhas que se presuma serem devidas a uma mutao somtica. Os resultados
relativos aos animais tratados e aos controlos negativos so comparados por mtodos apropriados. Os
resultados so apresentados igualmente referindo-se a ninhada como unidade.
3. RELATRIO
as estirpes utilizadas no cruzamento,
o nmero de fmeas grvidas nos grupos tratados e de controlo,
o tamanho mdio das ninhadas nos grupos tratados e de controlo na ocasio do nascimento e do
desmame,
as doses da substncia a testar,
o solvente utilizado,
o dia da gestao em que se administrou o tratamento,
a via de administrao,
o nmero total de crias observadas, bem como o nmero das que apresentavam malhas WMVS, MDS e
RS nos grupos tratados e de controlo,
alteraes morfolgicas macroscpicas,
relao dose/efeito, se possvel,
avaliao estatstica,
4. REFERNCIAS
B.25. TRANSLOCAO HEREDITRIA NO RATINHO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.2. DEFINIO
Nenhuma.
O teste de translocao hereditria no ratinho detecta alteraes cromossmicas estruturais e numricas nas
clulas germinais de mamfero que so postas em evidncia na descendncia da primeira gerao. Os tipos de
alteraes cromossmicas detectadas so as translocaes recprocas e, se for includa a descendncia do sexo
feminino, a perda do cromossoma X. Os portadores de translocaes e as fmeas XO apresentam uma
fertilidade reduzida, permitindo a seleco de uma descendncia F
1
para anlise citogentica. Alguns tipos de
translocao provocam esterilidade total (X-autossoma e tipo c-t). As translocaes so observadas por
mtodos citogenticos nas clulas meiticas na diacinese-metafase I de indivduos do sexo masculino, sejam
machos F
1
ou filhos de fmeas F
1
. As fmeas XO so identificadas citogeneticamente pela presena de apenas
39 cromossomas nas mitoses da medula ssea.
Nenhum.
Preparativos
As substncias a testar so dissolvidas numa soluo salina isotnica. Se forem insolveis na gua sero
dissolvidas ou colocadas em suspenso em veculos apropriados. Utilizam-se solues preparadas de fresco da
substncia a testar. Se se utilizar um veculo para facilitar a administrao este no deve interferir com a
substncia a testar nem produzir efeitos txicos.
As vias de administrao so habitualmente a intubao oral ou a injeco intraperitoneal. Podem ser
adequadas outras vias de administrao.
Estas experincias so efectuadas em ratinhos para facilitar a reproduo e a verificao citolgica. No
requerida nenhuma estirpe especfica. No entanto, o nmero mdio de crias por ninhada da estirpe utilizada
dever ser superior a oito e ser relativamente constante.
Sero utilizados animais sos tendo j atingido a maturidade sexual.
Nme r o d e a ni ma i s
O nmero de animais necessrios depende da frequncia de translocaes espontneas bem como da taxa de
induo mnima requerida para um resultado positivo.
O teste consiste habitualmente na anlise da descendncia masculina F
1
. Sero testados pelo menos 500
descendentes masculinos F
1
por cada dose. Se se incluir a descendncia feminina F
1
, sero necessrios 300
machos e 300 fmeas.
Cont r ol os ne ga t i v os e pos i t i v os
Devem estar disponveis dados de controlo adequados provenientes de provas realizadas simultaneamente ou
de experincias anteriores. Quando existirem dados aceitveis de controlos positivos provenientes de
experincias efectuadas recentemente no mesmo laboratrio, estes podem ser utilizados em vez de controlos
positivos simultneos.
Dos e s
testada apenas uma dose, tratando-se habitualmente da dose mxima associada produo de efeitos txicos
mnimos mas no afectando o comportamento reprodutor nem a sobrevivncia. Para estabelecer uma relao
dose/resposta so necessrias duas doses adicionais, mais baixas. No caso de substncias no txicas, dever
recorrer-se a uma exposio dose mxima praticvel.
Procedimento
Tr a t a me nt o e a c a s a l a me nt o
So possveis dois esquemas de tratamento. A administrao nica da substncia a testar o mtodo mais
frequente. A substncia a testar pode tambm ser administrada sete dias por semana durante 35 dias. O
nmero de acasalamentos depois do tratamento determinado pelo esquema de tratamento e ser tal que
todos os estdios de clulas germinais sejam implicados. No fim do perodo de acasalamento as fmeas so
colocadas em gaiolas individuais. Quando as fmeas parirem registar-se-o a data, o nmero de crias da
ninhada e o sexo das crias. Toda a descendncia do sexo masculino desmamada e toda a do sexo feminino
afastada a no ser que esteja includa na experincia.
P e s q ui s a d os he t e r oz i gt i c os d e t r a ns l oc a o
utilizado um de dois mtodos disponveis:
anlise da fertilidade da descendncia F
1
e verificao ulterior de eventuais portadores de translocaes
por anlise citogentica,
anlise citogentica de todos os machos F
1
sem seleco prvia por verificao da fertilidade.
a) Anlise da fertilidade
A diminuio de fertilidade de um indivduo F
1
pode ser determinada observando-se o nmero de crias
da ninhada e/ou analisando o contedo uterino das fmeas com que acasalou.
Devero estabelecer-se critrios para determinao da fertilidade normal e diminuda da estirpe de
ratinhos utilizada.
Observao do nmero de animais por ninhada: Os machos F
1
a testar so colocados em gaiolas individuais
com fmeas provenientes da mesma experincia ou da colnia. As gaiolas so inspeccionadas
diariamente a partir do dia 18 aps o acasalamento. O nmero de crias da ninhada e o sexo da
descendncia F
2
so registados na ocasio do nascimento, sendo as crias eliminadas em seguida. Se se
testar a descendncia do sexo feminino F
1
ento os descendentes F
2
provenientes de ninhadas pequenas
so conservados com vista a uma anlise mais profunda. As fmeas portadoras de uma translocao
sero objecto de uma verificao por anlise citogentica de uma translocao em qualquer dos seus
descendentes machos. As fmeas XO so identificadas pela alterao da razo macho/fmea na sua
descendncia que passa de 1/1 para 1/2 machos/fmeas. Num mtodo sequencial os animais F
1
normais
no sero objecto de outra verificao se a primeira ninhada F
2
atingir ou ultrapassar um valor normal
preestabelecido, seno observar-se- uma segunda ou uma terceira ninhada F
2
.
Os animais F
1
que no puderem ser classificados como normais aps uma observao de at trs
ninhadas F
2
no mximo, sero submetidos seja a um novo controlo por anlise do contedo uterino das
fmeas com que acasalaram, seja directamente a uma anlise citogentica.
Anlise do contedo uterino: A reduo do nmero de crias por ninhada nos portadores de translocao
devida morte de embries, de modo que um grande nmero de implantes mortos indica a presena de
uma translocao no animal submetido ao teste. Cada macho F
1
a testar acasalado com duas ou trs
fmeas. A concepo confirmada pela inspeco matinal diria das fmeas para detectar a presena de
rolho vaginal. As fmeas so sacrificadas 14 a 16 dias mais tarde, registando-se o nmero de implantes
vivos e mortos presentes nos seus teros.
b) Anlise citogentica
As preparaes de testculo so efectuadas pelo mtodo de secagem ao ar. Os portadoras de translocaes
so identificados pela presena de configuraes multivalentes na diacinese-metafase I nos
espermatcitos primrios. A observao de pelo menos duas clulas apresentando uma associao
multivalente constitui a prova necessria de que o animal testado portador de uma translocao.
Se no tiver sido efectuada nenhuma seleco por anlise de fertilidade, todos os machos F
1
so
submetidos a um exame citogentico. Devem ser analisadas ao microscpio um mnimo de 25 clulas em
diacinese-metafase I por macho. necessrio o exame das metafases mitticas nas espermatognias ou
na medula ssea, no caso dos machos tendo testculos pequenos ou apresentando uma paragem meitica
antes da diacinese ou no caso das fmeas F
1
suspeitas de serem XO. A presena de um cromossoma
anormalmente longo e/ou curto em alguma de 10 clulas a prova de uma translocao particular
acarretando a esterilidade do macho (tipo c-t). Algumas translocaes X-autossoma provocando a
esterilidade do macho podem apenas ser identificadas por uma anlise de bandas de cromossomas
mitticos. A presena de 39 cromossomas em 10 mitoses por cada 10 a prova de um estado XO numa
fmea.
2. RESULTADOS
Os resultados so apresentados sob a forma de quadros.
O nmero mdio de crias por ninhada e a razo entre os sexos so registados nascena e no desmame para
cada perodo de acasalamento.
Quando da avaliao da fertilidade dos animais F
1
devero apresentar-se o nmero mdio de crias por ninhada
das ninhadas resultantes de todos os acasalamentos normais bem como o nmero de crias individual das
ninhadas provenientes de animais F
1
portadores de translocao. No que respeita anlise do contedo uterino
sero anotados o nmero mdio de implantes vivos e mortos resultantes de acasalamentos normais e o nmero
de implantes vivos e mortos para cada acasalamento de animais portadores de translocao.
Quando da anlise citogentica da diacinese-metafase I, sero registados os diferentes tipos de configuraes
multivalentes e o nmero total de clulas para cada portador de translocao.
Para os indivduos F
1
estreis sero indicados o nmero total de acasalamentos e a durao do perodo de
acasalamento. Sero indicados o peso dos testculos bem como os pormenores da anlise citogentica.
Para as fmeas XO indicar-se- o nmero de crias mdio por ninhada, a razo entre os sexos na descendncia
F
2
, bem como os resultados da anlise citogentica.
Se forem seleccionados eventuais portadores de translocao F
1
por testes de fertilidade os quadros devero
mencionar quantos deles foram confirmados como sendo heterozigticos de translocao.
Sero apresentados os dados relativos aos controlos negativos bem como as experincias de controlo positivo.
3. RELATRIO
estirpe de ratinho utilizada, idade dos animais, peso dos animais tratados,
nmero de animais progenitores de cada sexo nos grupos tratados e de controlo,
condies experimentais, descrio pormenorizada do tratamento, doses, solventes, esquema de
acasalamento,
nmero e sexo de crias por fmea, nmero e sexo das crias mantidas para uma anlise de translocao,
momento e critrios da anlise de translocao,
nmero e descrio pormenorizada dos portadores de translocao, incluindo dados relativos
reproduo e ao contedo uterino, se possvel,
mtodos citogenticos e pormenores da anlise microscpica, de preferncia com fotografias,
avaliao estatstica,
4. REFERNCIAS
B.26. ENSAIO DE TOXICIDADE ORAL SUBCRNICA ESTUDO DE TOXICIDADE ORAL DE DOSE
REPETIDA EM ROEDORES COM A DURAO DE 90 DIAS
1. MTODO
O presente mtodo de ensaio da toxicidade oral subcrnica idntico ao mtodo OCDE TG 408 (1998).
1.1. INTRODUO
Ao avaliarem-se as caractersticas txicas de uma substncia qumica poder proceder-se determinao da
toxicidade oral subcrnica utilizando doses repetidas depois de se ter obtido informao inicial sobre a
toxicidade a partir de ensaios de toxicidade aguda ou de dose repetida com a durao de 28 dias. O estudo de
90 dias permite obter informao sobre os perigos para a sade susceptveis de decorrer de uma exposio
repetida ao longo de um perodo de tempo prolongado, abrangendo a maturao e o crescimento aps o
desmame e prolongando-se pela vida adulta. O estudo permitir obter informao sobre os principais efeitos
txicos, identificar os rgos-alvo e a possibilidade de acumulao, bem como fazer uma estimativa de um
nvel de exposio sem efeitos adversos observados a utilizar na seleco dos nveis de administrao em
estudos crnicos e na determinao de critrios de segurana para a exposio no caso de seres humanos.
O mtodo utilizado d um maior destaque aos terminais neurolgicos e permite formar uma ideia sobre os
efeitos imunolgicos e ao nvel da reproduo. Deve salientar-se a necessidade de efectuar uma observao
clnica pormenorizada dos animais, de modo a obter-se o mximo de informao possvel. Este estudo deve
permitir tambm identificar substncias susceptveis de causar efeitos neurotxicos, imunolgicos ou ao nvel
dos rgos de reproduo, que podero justificar uma investigao mais aprofundada.
1.2. DEFINIES
Dose: quantidade de substncia administrada. A dose expressa em termos de massa (g, mg) ou em termos da
massa da substncia em estudo por massa unitria do animal estudado (por exemplo, mg/kg), ou em termos de
concentraes dietticas constantes (ppm).
Dosagem: termo geral que abrange a dose administrada, bem como a frequncia e durao da administrao.
NOAEL: abreviatura de no observed adverse effect level (dose sem efeitos adversos observados), que consiste na
dose mxima ou no nvel de exposio mximo que no produz efeitos adversos detectveis no ensaio
atribuveis ao mesmo.
vrios lotes de animais de ensaio, durante um perodo de 90 dias. No decurso deste perodo, os animais so
examinados em pormenor, com vista deteco de quaisquer sinais de toxicidade. Efectua-se a autpsia dos
animais que morrem ou so sacrificados durante o ensaio e, no final do mesmo, procede-se ao abate dos
sobreviventes e respectiva autpsia.
Devem ser utilizados animais saudveis que tenham sido aclimatados s condies laboratoriais durante pelo
menos cinco dias e no tenham sido anteriormente submetidos a procedimentos experimentais. Os animais
utilizados no estudo devem ser caracterizados quanto espcie, estirpe, provenincia, sexo, peso e/ou idade. Os
animais devem ser repartidos aleatoriamente pelos grupos de ensaio e de controlo. As gaiolas devem ser
dispostas de modo a reduzir ao mnimo os eventuais efeitos devidos respectiva colocao. Deve ser atribudo
a cada animal um nmero de identificao diferente.
A substncia em estudo administrada por intermdio de uma sonda gstrica ou atravs da alimentao ou da
gua de beber. O mtodo de administrao oral depende do objectivo do ensaio, bem como das propriedades
fsico-qumicas da substncia em estudo.
que se considere primeiramente a possibilidade de se utilizar uma soluo ou suspenso aquosa; em segundo
lugar, uma soluo ou emulso em leo (nomeadamente leo de milho); e, por ltimo, uma soluo noutro
veculo. No caso de se utilizar um veculo no aquoso, devem conhecer-se as respectivas caractersticas de
toxicidade. Deve tambm determinar-se a estabilidade da substncia nas condies de administrao.
1.4.3.1. Animais a utilizar no ensaio
Embora possa recorrer-se a outros roedores, como por exemplo o ratinho, o rato constitui a espcie preferida.
Devem utilizar-se animais adultos, jovens e saudveis, de estirpes correntes de laboratrio. As fmeas devem ser
nulparas e no grvidas. A administrao da substncia deve ter incio logo que possvel aps o desmame e, em
qualquer caso, antes de os animais completarem nove semanas de idade. No incio do estudo, a variao de
massa dos animais deve ser mnima, no excedendo 20 % da massa mdia de cada sexo. Caso o estudo
preceda um estudo da toxicidade crnica a longo prazo, conveniente utilizar em ambos os casos animais da
mesma estirpe e provenincia.
Para cada dose devem utilizar-se, pelo menos, 20 animais (10 machos e 10 fmeas). Caso se preveja o sacrifcio
de alguns animais durante o ensaio, o referido nmero deve ser acrescido do nmero de animais a sacrificar.
Com base em conhecimentos anteriores da substncia em estudo ou de um anlogo prximo, dever
considerar-se a possibilidade de incluir um lote extra de 10 animais (cinco de cada sexo) no grupo de controlo e
no grupo a que ir ser administrada a dose mxima, a fim de se observar, aps o perodo de ensaio, a
reversibilidade ou persistncia de eventuais efeitos txicos. A durao deste perodo de observao dever ser
correctamente estabelecida tendo em conta os efeitos a observar.
1.4.3.3. Doses
Devem ser utilizadas pelo menos trs doses e um controlo simultneo, excepto nos casos em que seja realizado
um ensaio-limite (ver 1.4.3.4). As doses podero basear-se nos resultados de estudos de dose repetida ou de
determinao da gama, e devero levar em conta todos os dados toxicolgicos e toxicocinticos existentes para
a substncia em estudo ou substncias afins. A dose mxima deve ser seleccionada com a finalidade de
provocar toxicidade, mas no a morte nem um sofrimento excessivo, a no ser que a natureza fsico-qumica
ou os efeitos biolgicos da substncia em estudo determinem que a referida dose seja limitada. Deve
(por exemplo, superior a um factor de 6-10) entre as doses.
O grupo de controlo deve ser constitudo por animais aos quais no administrada a substncia em estudo ou
um grupo de controlo do veculo se for utilizado um veculo para administrar a substncia em estudo. Com
excepo da exposio substncia em estudo, os animais do grupo de controlo devem ser manuseados de
forma idntica aos outros animais. Caso se recorra a um veculo para a administrao da substncia em estudo,
deve administrar-se o volume mximo do mesmo aos animais do lote de controlo. Se a substncia em estudo
for administrada atravs dos alimentos e causar um menor consumo alimentar, ser vantajoso utilizar-se um
grupo de controlo alimentado aos pares para se distinguir entre as redues que se devem palatabilidade e a
alteraes toxicolgicos no modelo em estudo.
Devero considerar-se as seguintes caractersticas do veculo e outros aditivos, conforme aplicvel; efeitos ao
nvel da absoro, distribuio, metabolismo ou reteno da substncia em estudo; efeitos nas propriedades
qumicas da substncia em estudo susceptveis de alterar as suas caractersticas txicas; e efeitos no consumo de
alimentos ou gua ou no estado nutricional dos animais.
Sempre que um ensaio, realizado de acordo com o presente mtodo, que utilize uma dose de pelo menos
1 000 mg/kg de massa corporal/dia, no produza efeitos txicos observveis, ou se, tendo em conta dados
referentes a substncias estruturalmente afins, no se prevejam efeitos txicos, poder no ser necessrio
efectuar um ensaio completo com trs doses. Nestes casos, justifica-se a realizao de um ensaio-limite, excepto
se a exposio humana indicar a necessidade de recurso a uma dose superior.
1.5. PROCEDIMENTO
mximo de lquido que pode administrar-se de cada vez depende das dimenses do animal. Esse volume no
deve exceder 1 ml/100 g de massa corporal, excepto no caso de solues aquosas, em que se poder utilizar um
volume de 2 ml/100 g de massa corporal. Salvo no caso de substncias corrosivas ou irritantes, cujos efeitos
so, de modo geral, agravados em concentraes mais elevadas, devem minimizar-se as variaes no volume
mediante o ajustamento da concentrao, de modo a assegurar um volume constante para todas as doses.
Caso a substncia em estudo seja administrada atravs dos alimentos ou da gua de beber, deve assegurar-se que
as respectivas quantidades no perturbam o equilbrio nutricional e hdrico normal. Se a substncia for
administrada com os alimentos, pode utilizar-se uma concentrao alimentar constante, expressa em ppm, ou
uma dose constante, expressa em relao massa corporal dos animais; deve especificar-se a alternativa
adoptada. No caso do recurso a uma sonda gstrica, a dose deve ser administrada diariamente mesma hora e,
se necessrio, ajustada de modo a manter uma dose constante em relao massa corporal do animal. Caso um
ensaio de 90 dias preceda um estudo da toxicidade crnica a longo prazo, conveniente utilizar uma dieta
semelhante em ambos os ensaios.
1.5.2. Observaes
O perodo de observao deve ser de, pelo menos, 90 dias. Os animais includos nos lotes extra destinados a
observaes subsequentes devem ser mantidos durante um perodo de tempo suficiente sem administrao da
substncia em estudo de modo a detectar a persistncia ou a recuperao dos efeitos txicos.
dos animais. Todos os animais devero ser examinados pelo menos duas vezes por dia, normalmente ao
princpio e ao fim de cada dia, a fim de se identificarem sinais de morbilidade e mortalidade.
exposio (de modo a permitir efectuar comparaes para o mesmo indivduo) e uma vez por semana aps a
mesma. O exame deve decorrer no exterior da gaiola, num recinto adequado e, de preferncia, mesma hora.
As observaes devem ser cuidadosamente registadas, de preferncia por recurso a um sistema definido em
pormenor pelo laboratrio em causa. Deve procurar-se assegurar que as variaes nas condies de observao
sejam mnimas. Os sinais anotados devem incluir, nomeadamente, alteraes na pele, no plo, nos olhos e nas
mucosas, bem como a ocorrncia de secrees, excrees ou actividade autnoma (como, por exemplo,
lacrimao, ereco pilosa, alteraes nas pupilas, respirao anormal). Devem tambm registar-se quaisquer
alteraes da atitude, postura e reaco manipulao, alm da ocorrncia de movimentos clnicos ou tnicos
e comportamentos estereotipados (por exemplo, actos de higiene repetitivos, movimentos circulares
repetitivos) ou estranhos (automutilao, marcha para a retaguarda) (1).
Deve proceder-se a um exame oftalmolgico, utilizando um oftalmoscpio ou equipamento equivalente
adequado, antes de se iniciar a administrao da substncia em estudo e ao terminar o estudo, de preferncia a
todos os animais, ou pelo menos aos animais dos grupos de dose mxima e de controlo. Se forem detectadas
alteraes nos olhos, devem examinar-se todos os animais.
Na fase final do perodo de exposio, mas, em qualquer caso, nunca antes da 11.
a
semana, deve proceder-se
avaliao da reactividade sensorial a estmulos de diferentes tipos (1) (por exemplo, estmulos auditivos, visuais
e proprioceptivos) (2), (3), (4), avaliao da fora de preenso (5) e avaliao da actividade motora (6). Para mais
pormenores sobre os procedimentos que se podem utilizar, devem consultar-se as respectivas referncias. No
entanto, tambm se podero adoptar procedimentos alternativos aos indicados nas referncias.
As observaes funcionais podero ser omitidas na fase final do estudo quando existirem dados sobre
observaes funcionais de outros estudos e os exames clnicos realizados diariamente no revelarem quaisquer
deficincias funcionais.
Excepcionalmente, podem omitir-se as observaes funcionais no caso de lotes que apresentem sinais de
toxicidade cuja intensidade seja susceptvel de interferir de modo significativo com as mesmas.
1.5.2.1. Massa corporal e consumo de alimentos/gua
Todos os animais devem ser pesados pelo menos uma vez por semana. O consumo de alimentos deve ser
medido pelo menos uma vez por semana. Se a substncia em estudo for administrada atravs da gua de beber,
deve tambm medir-se o consumo de gua pelo menos uma vez por semana. O consumo de gua tambm
poder ser levado em conta em estudos dietticos ou de administrao forada em que esse consumo se possa
alterar.
1.5.2.2. Hematologia e bioqumica clnica
Devem colher-se amostras de sangue de um local designado e, caso aplicvel, essas amostras devero ser
armazenadas em condies adequadas. No final do perodo de estudo, sero colhidas amostras logo antes de se
abaterem os animais ou como parte do procedimento de abate.
No final do ensaio e no caso de terem sido colhidas amostras de sangue intercalares, devem determinar-se os
seguintes parmetros hematolgicos: hematcrito, concentrao de hemoglobina, contagem de eritrcitos,
contagem total e diferencial de leuccitos, contagem de plaquetas e medida do tempo/potencial de coagulao.
sobre os tecidos, nomeadamente renal e heptico, com amostras de sangue de todos os animais, colhidas
imediatamente antes do respectivo abate ou no mbito do mesmo (com excepo dos animais encontrados
moribundos ou abatidos no decurso do ensaio). Tal como no caso de estudos hematolgicos, poder efectuar-
-se uma recolha de amostras intercalares para efeito de anlises bioqumicas clnicas. Recomenda-se que os
animais sejam jejuados desde a vspera da colheita de sangue (
1
). Os parmetros a determinar no plasma ou no
soro so os seguintes: sdio, potssio, glicose, colesterol total, ureia, creatinina, protenas totais e albumina,
alm de, pelo menos, dois enzimas indicadores dos efeitos hepatocelulares (tais como a alanina-
-aminotransferase, a aspartato-aminotransferase, a fosfatase alcalina, a gama-glutamil transpeptidase e a
sorbitol-desidrogenase). A determinao de outras enzimas de origem heptica ou diversa, bem como de cidos
biliares, poder, em determinados casos, proporcionar informaes teis.
Em opo, podem realizar-se na ltima semana do ensaio as seguintes determinaes na urina, recolhida de
acordo com um programa previamente estabelecido: aparncia, volume, osmolalidade ou gravidade especfica,
pH, protenas, glicose e sangue/hematcitos.
tecidos. Caso as propriedades conhecidas da substncia afectem, ou se preveja que possam afectar, perfis
metablicos conexos, devem realizar-se outras determinaes, nomeadamente de clcio, fosfatos, triglicridos
em jejum, hormonas especficas, meta-hemoglobina e colinesterase. A necessidade de efectuar tais
determinaes estabelecida em funo do tipo de substncia em estudo ou de cada caso especfico.
De um modo geral, deve adoptar-se uma abordagem flexvel, em funo das espcies e dos efeitos observados
e/ou previstos da substncia em causa.
Se os dados disponveis relativos a ensaios anteriores se revelarem inadequados, haver que decidir sobre a
necessidade de se determinarem parmetros hematolgicos e bioqumicos antes de administrar a substncia. De
um modo geral, no se recomenda que estes dados sejam gerados antes de se iniciar a administrao (7).
1.5.2.3. Autpsia geral
Todos os animais devem ser objecto de uma autpsia geral pormenorizada que inclua o exame da superfcie
exterior do corpo, dos orifcios e das cavidades craniana, torcica e abdominal, bem como do respectivo
contedo. Devem remover-se de modo adequado as membranas aderentes a rgos tais como o fgado, os rins,
as glndulas supra-renais, os testculos, os epiddimos, o timo, o bao, o crebro e o corao, cuja massa
hmida deve ser determinada logo que possvel aps a dissecao, de modo a evitar a respectiva dessecao.
Este procedimento aplica-se a todos os animais (excepto os que estiverem moribundos ou tiverem sido abatidos
no decurso do ensaio).
encfalo (regies representativas, nomeadamente crebro, cerebelo e protuberncia), espinal medula (a trs
nveis: cervical, mdio-torcico e lombar), pituitria, tiride, paratiride, timo, esfago, glndulas salivares,
estmago, intestino delgado e clon (incluindo as placas de Peyer), fgado, rins, glndulas supra-renais, bao,
corao, traqueia e pulmes (conservados por insuflao com fixador seguida de imerso), aorta, gnadas,
tero, rgos genitais acessrios, glndula mamria (nas fmeas), prstata, bexiga, vescula (ratinho), gnglios
linfticos (de preferncia um gnglio situado na via de administrao e um gnglio distante da mesma, de modo
a investigar possveis efeitos sistmicos), nervos perifricos (citico ou tibial), de preferncia na proximidade de
msculos, e uma seco de medula ssea (ou, como alternativa, um aspirado de medula ssea recentemente
montado), pele e olhos (se tiverem sido observadas alteraes no exame oftalmolgico). Em funo das
observaes clnicas ou de natureza diversa efectuadas, poder ser necessrio examinar outros tecidos. Devem
tambm conservar-se quaisquer rgos susceptveis de constiturem alvos da substncia em estudo, em virtude
das propriedades conhecidas da mesma.
1.5.2.4. Histopatologia
Deve proceder-se ao exame histopatolgico dos rgos e tecidos conservados dos animais dos grupos de
controlo, bem como dos lotes sujeitos a doses elevadas. Caso o exame destes ltimos revele alteraes
atribuveis substncia em estudo, devem examinar-se tambm os animais de todos os lotes restantes.
(
1
) Para a determinao de determinados parmetros no soro e no plasma, nomeadamente a glicose, prefervel que os animais sejam
jejuados desde a vspera, principalmente porque, no sendo jejuados, haver inevitavelmente uma maior variabilidade que tender a
encobrir os efeitos mais subtis e a tornar difcil a interpretao dos resultados. No entanto, por outro lado, o jejum desde a vspera poder
interferir no metabolismo geral dos animais, e, particularmente em estudos alimentares, poder perturbar a exposio diria substncia
em estudo. Se for adoptado o jejum desde a vspera, devero efectuar-se determinaes bioqumicas aps a realizao das observaes
funcionais do estudo.
2.1. DADOS
quadro, referindo-se, para cada lote de ensaio, o nmero de animais no incio do ensaio, o nmero de animais
encontrados mortos durante o ensaio ou abatidos por uma questo de humanidade, a hora da morte de cada
animal, o nmero de animais que apresentam sinais de toxicidade, a descrio dos sinais de toxicidade
observados, nomeadamente o tempo decorrido at respectiva manifestao, bem como a sua durao e
gravidade, o nmero de animais que apresentem leses, o tipo de leses e a percentagem de animais que
apresentam cada tipo de leses.
Caso aplicvel, os resultados numricos devem ser avaliados segundo um mtodo estatstico adequado e
geralmente aceite. Os mtodos estatsticos e dados a serem analisados devem ser seleccionados durante a fase de
concepo do estudo.
2.2.1. Substncia em estudo:
natureza fsica, pureza e propriedades fsico-qumicas,
dados de identificao,
veculo (caso aplicvel): justificao da escolha de um veculo no aquoso.
2.2.2. Espcie submetida ao ensaio:
espcie e estirpe utilizada,
2.2.3. Condies do ensaio:
justificao das doses seleccionadas,
pormenores relativos preparao da substncia em estudo e sua eventual incorporao nos alimentos,
nomeadamente a respectiva concentrao, estabilidade e homogeneidade,
doses reais (mg/kg massa corporal/dia), e factor de converso da concentrao da substncia em estudo
na alimentao/abeberao (ppm) para a dose real, quando aplicvel,
2.2.4. Resultados:
massa corporal e respectivas alteraes,
consumo de alimentos e de gua, se for caso disso,
reaces txicas em funo do sexo e da dose administrada, nomeadamente sinais de toxicidade,
natureza, gravidade e durao dos sinais clnicos (reversveis ou no),
resultados do exame oftalmolgico,
dados relativos actividade sensorial, fora de preenso e actividade motora (caso existam),
resultados da anlise hematolgica, acompanhados dos respectivos parmetros de base,
resultados da anlise bioqumica, acompanhados dos respectivos parmetros de base,
massa corporal final, massa dos rgos e relaes massas dos rgos/massa corporal,
dados obtidos por autpsia,
descrio pormenorizada dos resultados do exame histopatolgico,
dados de absoro, caso se encontrem disponveis,
Concluses.
3. REFERNCIAS
(1) IPCS, (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to
Chemicals. Environmental Health Criteria Document No 60.
(2) Tupper, D.E., Wallace, R.B., (1980) Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp.,
40, p. 999-1003.
(3) Gad, S.C., (1982) A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J.Toxicol. Environ. Health, 9,
p. 691-704.
(4) Moser, V.C., Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M., (1991) Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional
Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, p. 267-
-283.
(5) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T., (1979) A Method for the Routine Assesment of Fore- and
Hind-limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, p. 233-236.
(6) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C., (1991)
Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological
Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, p. 599-609.
(7) Weingand K., Brown G., Hall R. et al., (1996) Harmonisation of Animal Clinic Pathology Testing in
Toxicity and Safety Studies, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, 198-201.
B.27. ENSAIO DE TOXICIDADE ORAL SUBCRNICA ESTUDO DE TOXICIDADE ORAL DE DOSE
REPETIDA EM ESPCIES NO ROEDORAS COM A DURAO DE 90 DIAS
1. MTODO
O presente mtodo de ensaio da toxicidade oral subcrnica idntico ao mtodo OCDE TG 409 (1998).
1.1. INTRODUO
Ao avaliarem-se as caractersticas txicas de uma substncia, poder proceder-se determinao da toxicidade
oral subcrnica utilizando doses repetidas depois de se ter obtido informao inicial sobre a toxicidade em
ensaios de toxicidade aguda ou de dose repetida com a durao de 28 dias. O estudo de 90 dias permite obter
informao sobre os perigos para a sade susceptveis de decorrer de uma exposio repetida ao longo de um
perodo de crescimento rpido e at ao incio da vida adulta. O estudo permitir obter informao sobre os
principais efeitos txicos, identificar os rgos-alvo e a possibilidade de acumulao, bem como fazer uma
estimativa de um nvel de exposio sem efeitos adversos observados a utilizar na seleco dos nveis de
administrao em estudos crnicos e na determinao de critrios de segurana para a exposio no caso de
seres humanos.
O mtodo de ensaio permite identificar, em espcies no roedoras, os efeitos adversos da exposio a
substncias qumicas e deve ser utilizado apenas:
nos casos em que os efeitos observados noutros estudos revelem a necessidade de clarificao/
/caracterizao numa segunda espcie no roedora, ou
nos casos em que estudos toxicocinticos revelem que uma determinada espcie no roedora a escolha
de animal laboratorial mais adequada, ou
nos casos em que outras razes especficas justifiquem a utilizao de uma espcie no roedora.
1.2. DEFINIES
Dose: quantidade de substncia administrada. A dose expressa em termos de massa (g, mg) ou em termos da
massa da substncia de ensaio por massa unitria do animal estudado (por exemplo, mg/kg), ou em termos de
concentraes dietticas constantes (ppm).
Dosagem: termo geral que abrange a dose administrada, bem como a frequncia e durao da administrao.
NOAEL: abreviatura de no observed adverse effect level (dose sem efeitos adversos observados), que consiste na
dose mxima ou no nvel de exposio mximo que no produz efeitos adversos detectveis no ensaio
atribuveis ao mesmo.
vrios lotes de animais de ensaio, durante um perodo de 90 dias. No decurso deste perodo os animais so
examinados em pormenor, com vista deteco de quaisquer sinais de toxicidade. Efectua-se a autpsia dos
animais que morrem ou so sacrificados durante o ensaio e, no final do mesmo, procede-se ao abate dos
sobreviventes e respectiva autpsia.
1.4.1. Seleco das espcies animais
A espcie no roedora normalmente utilizada o co, que deve ser de uma raa especfica: utiliza-se
frequentemente o beagle. Podero tambm utilizar-se outras espcies, como, por exemplo, sunos ou mini-
-sunos. No se recomendam primatas, cuja utilizao deve ser justificada. Devem utilizar-se animais jovens e
saudveis, e, no caso do co, a administrao deve iniciar-se de preferncia aos 4-6 meses, o mais tardar aos
9 meses de idade. No caso de o estudo preceder um estudo da toxicidade crnica a longo prazo, deve utilizar-se
a mesma espcie/raa em ambos os casos.
Devem ser utilizados animais saudveis que tenham sido aclimatados s condies laboratoriais e no tenham
sido anteriormente submetidos a processos experimentais. A durao da aclimatao depender da espcie
seleccionada para o ensaio e da sua provenincia. Recomenda-se uma aclimatao de pelo menos cinco dias
para os ces ou sunos especificamente criados para o efeito a partir de uma colnia residente, e pelo menos
duas semanas para sunos de provenincia externa. Os animais utilizados no estudo devem ser caracterizados
quanto espcie, estirpe, provenincia, sexo, peso e/ou idade. Os animais devem ser repartidos aleatoriamente
pelos grupos de ensaio e de controlo. As gaiolas devem ser dispostas de modo a que eventuais efeitos devidos
respectiva colocao sejam minimizados. Deve atribuir-se a cada animal um nmero de identificao diferente.
A substncia em estudo pode ser administrada atravs dos alimentos ou da gua de beber, por sonda gstrica
ou em cpsulas. O mtodo de administrao oral depende do objectivo do ensaio, bem como das propriedades
fsico-qumicas da substncia em estudo.
que se considere primeiramente a possibilidade de se utilizar uma soluo ou suspenso aquosa; em segundo
lugar, uma soluo ou emulso em leo (nomeadamente leo de milho); e, por ltimo, uma soluo noutro
veculo. No caso de se utilizar um veculo no aquoso, devem conhecer-se as respectivas caractersticas de
toxicidade. Deve tambm determinar-se a estabilidade da substncia nas condies de administrao.
1.5. PROCEDIMENTOS
Para cada dose devem utilizar-se, pelo menos, oito animais (quatro machos e quatro fmeas). Caso se preveja o
sacrifcio de alguns animais durante o ensaio, o referido nmero deve ser acrescido do nmero de animais a
sacrificar. O nmero de animais no final do estudo deve ser suficiente para permitir uma avaliao vlida dos
efeitos txicos. Com base em conhecimentos anteriores da substncia em estudo ou de um anlogo prximo,
dever considerar-se a possibilidade de incluir um lote extra de oito animais (quatro por sexo) no grupo de
controlo e no grupo a que ir ser administrada a dose mxima, a fim de se observar, aps o perodo de ensaio, a
reversibilidade ou persistncia de eventuais efeitos txicos. A durao deste perodo de observao dever ser
correctamente estabelecida tendo em conta os efeitos a observar.
1.5.2. Dosagem
Devem ser utilizadas pelo menos trs doses e um controlo simultneo, excepto nos casos em que seja realizado
um ensaio-limite (ver 1.5.3). As doses podero basear-se nos resultados de estudos de dose repetida ou de
determinao da gama e devero levar em conta todos os dados toxicolgicos e toxicocinticos existentes
relativos ao composto em estudo ou a substncias afins. A dose mxima deve ser seleccionada com a finalidade
de provocar toxicidade, mas no a morte nem um sofrimento excessivo, a no ser que a natureza fsico-qumica
ou os efeitos biolgicos da substncia em estudo determinem que a referida dose seja limitada. Deve
(por exemplo, superior a um factor de 6-10) entre as doses.
O grupo de controlo deve ser constitudo por animais aos quais no administrada a substncia em estudo ou
um grupo de controlo do veculo se for utilizado um veculo para administrar a substncia em estudo. Com
excepo da exposio substncia em estudo, os animais do grupo de controlo devem ser manuseados de
forma idntica aos outros animais. Caso se recorra a um veculo para a administrao da substncia em estudo,
deve administrar-se o volume mximo do mesmo aos animais do lote de controlo. Se a substncia em estudo
for administrada atravs dos alimentos provocando um menor consumo alimentar, ser vantajoso utilizar-se
um grupo de controlo alimentado aos pares para se distinguir entre as redues que se devem palatabilidade e
a alteraes toxicolgicos no modelo em estudo.
Devero considerar-se as seguintes caractersticas do veculo e outros aditivos, conforme aplicvel: efeitos ao
nvel da absoro, distribuio, metabolismo ou reteno da substncia em estudo; efeitos nas propriedades
qumicas da substncia em estudo susceptveis de alterar as suas caractersticas txicas; e efeitos no consumo de
alimentos ou gua ou no estado nutricional dos animais.
referentes a substncias estruturalmente afins, no se prevejam efeitos txicos, poder no ser necessrio
efectuar um ensaio completo com trs doses. Nestes casos justifica-se a realizao de um ensaio-limite, excepto
se a exposio humana indicar a necessidade de recurso a uma dose superior.
mximo de lquido que pode administrar-se de cada vez depende das dimenses do animal. Normalmente, deve
administrar-se o mnimo volume possvel. Salvo no caso de substncias corrosivas ou irritantes, cujos efeitos
so, de modo geral, agravados em concentraes mais elevadas, devem minimizar-se as variaes no volume
mediante o ajustamento da concentrao, de modo a assegurar um volume constante para todas as doses.
Caso a substncia em estudo seja administrada atravs dos alimentos ou da gua de beber, deve assegurar-se que
as respectivas quantidades no perturbam o equilbrio nutricional e hdrico normal. Se a substncia for
administrada com os alimentos, pode utilizar-se uma concentrao alimentar constante, expressa em ppm, ou
uma dose constante, expressa em relao massa corporal dos animais; deve especificar-se a alternativa
adoptada. No caso de uma substncia administrada por meio de uma sonda gstrica ou cpsula, a dose deve ser
administrada diariamente mesma hora e, se necessrio, ajustada de modo a manter uma dose constante em
relao massa corporal do animal. Caso um ensaio de 90 dias preceda um estudo da toxicidade crnica a
longo prazo, conveniente utilizar uma dieta semelhante em ambos os ensaios.
1.5.5. Observaes
O perodo de observao deve ser de, pelo menos, 90 dias. Os animais includos nos lotes extra destinados a
observaes subsequentes devem ser mantidos em observao durante um perodo de tempo suficiente sem
administrao da substncia em estudo, de modo a detectar a persistncia ou a recuperao dos efeitos txicos.
dos animais. Todos os animais devero ser examinados pelo menos duas vezes por dia, normalmente ao
princpio e ao fim de cada dia, a fim de se identificarem sinais de morbilidade e mortalidade.
exposio (de modo a permitir efectuar comparaes com o mesmo indivduo) e uma vez por semana aps a
mesma. Estas observaes devem ser feitas, caso possvel, fora da gaiola, num recinto adequado, e de
preferncia sempre s mesmas horas. Deve procurar-se assegurar que as variaes nas condies de observao
sejam mnimas. Os sinais de toxicidade devem ser cuidadosamente registados, incluindo a hora a que se
manifestaram, a sua intensidade e durao. As observaes devem incluir alteraes na pele, no plo, nos olhos
e nas mucosas, bem como a ocorrncia de secrees, excrees ou actividade autnoma (como, por exemplo,
lacrimao, ereco pilosa, alteraes nas pupilas, respirao anormal). Devem tambm registar-se quaisquer
alteraes da atitude, postura e reaco manipulao, alm da ocorrncia de movimentos clnicos ou tnicos
e comportamentos estereotipados (por exemplo, actos de higiene repetitivos, movimentos circulares
repetitivos) ou estranhos.
Deve proceder-se a um exame oftalmolgico, utilizando um oftalmoscpio ou equipamento equivalente
adequado, antes de se iniciar a administrao da substncia em estudo e ao terminar o estudo, de preferncia a
todos os animais, mas pelo menos, aos animais dos grupos de dose mxima e de controlo. Se forem detectadas
alteraes nos olhos atribuveis substncia em estudo, devem examinar-se todos os animais.
1.5.5.1. Massa corporal e consumo de alimentos/gua
Todos os animais devem ser pesados pelo menos uma vez por semana. O consumo de alimentos deve ser
medido pelo menos uma vez por semana. Se a substncia em estudo for administrada atravs da gua de beber,
deve tambm medir-se o consumo de gua pelo menos uma vez por semana. O consumo de gua tambm
poder ser levado em conta em estudos dietticos ou de administrao forada em que esse consumo se possa
alterar.
1.5.5.2. Hematologia e bioqumica clnica
Devem colher-se amostras de sangue de um local designado e, caso aplicvel, essas amostras devero ser
armazenadas em condies adequadas. No final do perodo de estudo sero colhidas amostras mesmo antes de
se abaterem os animais ou como parte do procedimento de abate.
No incio do estudo e, posteriormente, a intervalos mensais ou a meio do perodo do estudo, e, por ltimo, no
final do estudo, devem determinar-se os seguintes parmetros hematolgicos: hematcrito, concentrao de
hemoglobina, contagem de eritrcitos, contagem total e diferencial de leuccitos, contagem de plaquetas e
medida do potencial de coagulao, como, por exemplo, tempo de coagulao, tempo de protrombina, ou
tempo do tromboplastina.
sobre os tecidos, nomeadamente renal e heptico, com amostras de sangue de todos os animais, colhidas no
incio do estudo, em seguida mensalmente ou a meio do perodo do estudo, e, por ltimo, no final do perodo
do estudo. As reas de ensaio que devem ser consideradas so o equilbrio electroltico, o metabolismo dos
hidratos de carbono, e as funes heptica e renal. A seleco de ensaios especficos ser feita com base em
observaes do modo de aco da substncia em estudo. Recomenda-se que os animais sejam jejuados durante
um perodo de tempo adequado para a respectiva espcie antes de se proceder colheita de amostras de sangue.
Sugere-se que sejam determinados os seguintes parmetros: clcio, fsforo, cloreto, sdio, potssio, glicose em
jejum, alanina-aminotransferase, aspartato-aminotransferase, ornitina descarboxilase, gama-glutamil-trans-
peptidase, nitrognio ureico, albumina, creatinina no sangue, bilirrubina total e protena srica total.
Devem efectuar-se determinaes na urina pelo menos no incio, seguidamente a meio, e, por ltimo, no final
do estudo de acordo com um programa previamente estabelecido. As determinaes a efectuar na urina devem
incluir a aparncia, volume, osmolalidade ou gravidade especfica, pH, protenas, glicose e sangue/hematcitos.
Caso necessrio, podero utilizar-se outros parmetros a fim de alargar o estudo de um ou mais efeitos
observados.
tecidos. Entre outras determinaes que podero ser necessrias para uma avaliao toxicolgica adequada
referem-se anlises de lpidos, hormonas, equilbrio cidos/bases, meta-hemoglobina e inibio da colinesterase.
Caso necessrio, podero efectuar-se outras determinaes bioqumicas para alargar o estudo dos efeitos
observados. A necessidade de efectuar tais determinaes estabelecida em funo do tipo de substncia em
estudo ou de cada caso especfico.
De um modo geral, deve adoptar-se uma abordagem flexvel, em funo das espcies e dos efeitos observados
e/ou previstos da substncia em causa.
1.5.5.3. Autpsia geral
Todos os animais devem ser objecto de uma autpsia geral pormenorizada que inclua o exame da superfcie
exterior do corpo, dos orifcios e das cavidades craniana, torcica e abdominal, bem como do respectivo
contedo. Devem remover-se de modo adequado as membranas aderentes a rgos tais como o fgado (com a
vescula), os rins, as glndulas supra-renais, os testculos, os epiddimos, os ovrios, o tero, a tiride (com
paratirides), o timo, o bao, o crebro e o corao, cuja massa hmida deve ser determinada logo que possvel
aps a dissecao, de modo a evitar a respectiva dessecao. Este procedimento aplica-se a todos os animais
(excepto os que estiverem moribundos ou tiverem sido abatidos no decurso do ensaio).
encfalo (regies representativas, nomeadamente crebro, cerebelo e protuberncia), espinal medula (a trs
nveis: cervical, mdio-torcico e lombar), pituitria, olhos, tiride, paratiride, timo, esfago, glndulas
salivares, estmago, intestino delgado e clon (incluindo as placas de Peyer), fgado, vescula, pncreas, rins,
glndulas supra-renais, bao, corao, timo, tiride, traqueia e pulmes, aorta, gnadas, tero, rgos genitais
acessrios, glndula mamria feminina, bexiga, gnglios linfticos (de preferncia um gnglio situado na via de
administrao e um gnglio distante da mesma, de modo a investigar possveis efeitos sistmicos), nervos
perifricos (citico ou tibial), de preferncia na proximidade de msculos, e uma seco de medula ssea (ou,
como alternativa, um aspirado de medula ssea recentemente montado) e pele. Em funo das observaes
clnicas ou de natureza diversa efectuadas, poder ser necessrio examinar outros tecidos. Devem tambm
conservar-se quaisquer rgos susceptveis de constiturem alvos da substncia em estudo, em virtude das
propriedades conhecidas da mesma.
1.5.5.4. Histopatologia
Deve proceder-se ao exame histopatolgico dos rgos e tecidos conservados dos animais dos grupos de
controlo, bem como dos lotes sujeitos a doses elevadas. Caso o exame destes ltimos revele alteraes
atribuveis substncia em estudo, devem examinar-se tambm os animais de todos os lotes restantes.
2.1. DADOS
quadro, referindo-se, para cada lote de ensaio, o nmero de animais no incio do ensaio, o nmero de animais
encontrados mortos durante o ensaio ou abatidos por uma questo de humanidade, a hora da morte de cada
animal, o nmero de animais que apresentam sinais de toxicidade, a descrio dos sinais de toxicidade
observados, nomeadamente o tempo decorrido at respectiva manifestao, bem como a sua durao e
gravidade, o nmero de animais que apresentem leses, o tipo de leses e a percentagem de animais que
apresentam cada tipo de leses.
Caso aplicvel, os resultados numricos devem ser avaliados segundo um mtodo estatstico adequado e
geralmente aceite. Os mtodos estatsticos e dados a serem analisados devem ser seleccionados durante a fase de
concepo do estudo.
2.2.1. Substncia em estudo:
natureza fsica, pureza e propriedades fsico-qumicas,
dados de identificao
veculo (caso aplicvel): justificao da escolha de um veculo no aquoso.
2.2.2. Espcie submetida ao ensaio:
espcie e a estirpe utilizada,
pormenores relativos preparao da substncia em estudo e sua eventual incorporao nos alimentos,
nomeadamente a respectiva concentrao, estabilidade e homogeneidade,
doses reais (mg/kg massa corporal/dia) e factor de converso da concentrao da substncia em estudo na
alimentao/abeberao (ppm) para a dose real, quando aplicvel,
2.2.4. Resultados:
massa corporal e respectivas alteraes,
consumo de alimentos e de gua, se for caso disso,
reaces txicas em funo do sexo e da dose administrada, nomeadamente sinais de toxicidade,
natureza, gravidade e durao dos sinais clnicos (reversveis ou no),
exame oftalmolgico,
resultados da anlise hematolgica, acompanhados dos respectivos parmetros de base,
resultados da anlise bioqumica, acompanhados dos respectivos parmetros de base,
massa corporal final, massa dos rgos e relaes massas dos rgos/massa corporal,
dados obtidos por autpsia,
descrio pormenorizada dos resultados do exame histopatolgico,
dados de absoro, caso se encontrem disponveis,
eventual tratamento estatstico dos resultados.
Concluses.
B.28. TOXICIDADE DRMICA SUBCRNICA: TESTE DE DOSE REPETIDA POR VIA DRMICA, A
NOVENTA DIAS, EM ROEDORES
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.2. DEFINIES
Nenhuma.
A substncia a testar aplicada diariamente em doses graduais na pele dos animais dos vrios grupos, razo
de uma dose por grupo por um perodo de noventa dias. Durante o perodo de aplicao, os animais so
observados diariamente para se detectarem manifestaes de toxicidade. Os animais que morrem durante a
experincia so autopsiados e no fim da experincia os animais sobreviventes so igualmente autopsiados.
Nenhum.
Preparativos
Os animais so mantidos nas condies de alojamento e de alimentao da experincia, durante pelo menos
cinco dias antes do teste. Antes de comear o teste os animais jovens e sos so distribudos ao acaso pelos
grupos submetidos ao tratamento e de controlo. Pouco tempo antes de se iniciar o ensaio rapam-se os plos da
regio dorsal dos animais. Se se recorrer tosquia esta dever ser efectuada mais ou menos 24 horas antes do
teste. Normalmente necessrio repetir estas operaes todas as semanas devendo tomar-se muito cuidado
para no lesar a pele. A rea destinada aplicao da substncia a testar no poder ser inferior a 10 % da
superfcie corporal. O peso do animal entrar em linha de conta na deciso da zona a expor e da dimenso da
superfcie a tratar. Sempre que se testam substncias slidas, que podem ser pulverizadas se necessrio, a
substncia a testar deve ser humedecida com gua ou com um veculo apropriado para garantir um bom
contacto com a pele. As substncias a testar lquidas so geralmente usadas sem ser diludas. Procede-se a uma
aplicao diria durante cinco a sete dias por semana.
Podem ser utilizados o rato, o coelho ou a cobaia; tambm podem usar-se outras espcies, sendo necessrio
justificar o seu emprego. No incio da experincia a diferena de peso entre os animais no poder ultrapassar
20 % do peso mdio. Se um estudo drmico subcrnico constituir a fase preliminar de um estudo a longo
prazo, deve utilizar-se a mesma espcie e estirpe em ambos os estudos.
Nme r o e s e xo
Para cada dose sero utilizados pelo menos 20 animais (10 fmeas e 10 machos) de pele s. As fmeas devero
ser nulparas e no grvidas. Se for previsvel sacrificar alguns animais durante a experincia devem acrescentar-
-se ao nmero inicial o nmero de animais que se prev sacrificar. Para alm destes poder haver um grupo-
-satlite de 20 animais (10 de cada sexo) tratado com a dose mais elevada, durante 90 dias e observado quanto
reversibilidade, persistncia ou aparecimento tardio de efeitos txicos durante 28 dias aps o tratamento.
Dos e s
So necessrias pelo menos trs doses diferentes com um controlo ou um veculo de controlo se for usado um
veculo. O perodo de exposio dever no mnimo ser de seis horas por dia. A substncia a testar ser aplicada
diariamente mesma hora e a quantidade a administrar ser ajustada regularmente (semanalmente ou
bissemanalmente), de modo a manter-se constante relativamente ao peso corporal do animal. Os animais do
grupo de controlo sero tratados da mesma maneira que os animais dos grupos de experincia com excepo
da aplicao da substncia a testar. Se se utilizar um veculo para facilitar a administrao, este ser
administrado ao grupo de controlo da mesma forma que aos grupos tratados, devendo a dose corresponder
do grupo tratado com a dose mais elevada. A dose mais elevada ser determinada de forma a produzir efeitos
txicos mas nunca, ou raramente, a morte do animal; a dose mais baixa no dever produzir quaisquer efeitos
txicos. Se se dispuser de informao sobre a exposio humana, a dose mais baixa dever exceder esse valor. O
ideal seria a dose intermdia produzir o efeito txico mnimo observvel. Se se utilizarem vrias doses
intermdias a diferena entre elas ser calculada de forma a conseguir-se uma gradao dos efeitos txicos. Nos
grupos das doses mais baixa e intermdia a incidncia de mortalidade dever ser baixa para permitir uma
avaliao significativa dos resultados.
Se a aplicao da substncia a testar provocar uma grave irritao cutnea, devero reduzir-se as concentraes,
o que poder originar uma diminuio ou at um desaparecimento dos outros efeitos txicos da dose mais
elevada. Se as leses cutneas forem muito graves, pode tornar-se necessrio interromper a experincia e
recome-la com concentraes mais fracas.
Te s t e - l i mi t e
Se j tiver sido efectuada uma experincia preliminar com uma dose de 1 000 mg/kg ou com uma dose mais
elevada em funo da possibilidade de uma exposio humana conhecida, que no tenha provocado quaisquer
efeitos txicos, ser intil prosseguir a experincia.
P e r od o d e obs e r v a o
Os animais da experincia sero observados diariamente para detectar manifestaes de toxicidade. Sero
registados o momento da morte e o momento do aparecimento e desaparecimento das manifestaes de
toxicidade.
Os animais sero colocados em gaiolas individuais. Em condies ideais a substncia a testar ser administrada
aos animais sete dias por semana durante um perodo de 90 dias.
Os animais de todos os grupos-satlite que forem objecto de observaes complementares sero mantidos
vivos durante mais 28 dias, sem tratamento, para se detectar a recuperao ou a persistncia dos efeitos txicos.
O tempo de exposio ser de seis horas por dia.
A substncia a testar ser aplicada uniformemente numa rea equivalente a 10 % da superfcie total do corpo.
No caso de substncias altamente txicas, a superfcie a utilizar poder ser menor mas a camada da substncia
dever ser o mais fina e uniforme possvel.
Durante a exposio a substncia a testar mantida em contacto com a pele por meio de uma gaze porosa e de
um adesivo antialrgico. A superfcie tratada ser por sua vez convenientemente coberta de maneira a manter
no seu lugar a gaze e a substncia a testar, e a evitar que os animais ingiram a dita substncia. Podem utilizar-se
aparelhos de conteno, para evitar a ingesto da substncia, mas no se recomenda a imobilizao completa.
No fim do tempo de exposio, se possvel, necessrio eliminar todos os resduos da substncia com gua ou
por meio de qualquer outro mtodo adequado de limpeza da pele.
Os animais sero observados diariamente, sendo sempre registadas as manifestaes de toxicidade assim como
o momento do seu aparecimento, a sua intensidade e durao. Durante o perodo de cativeiro observar-se-o as
modificaes do plo e da pele, dos olhos e das mucosas, do aparelho respiratrio, aparelho circulatrio, do
sistema nervoso autnomo e central, assim como da actividade somatomotora e do comportamento. O
consumo alimentar e o peso dos animais sero determinados semanalmente. Devem observar-se regularmente
os animais a fim de se evitarem perdas por canibalismo, por autlise dos tecidos ou por condies imprprias
de alojamento. No fim da experincia todos os animais sobreviventes dos grupos tratados no satlites sero
autopsiados. Os animais moribundos sero imediatamente retirados e autopsiados.
Os exames que a seguir se enunciam so normalmente feitos a todos os animais incluindo os controlos:
a) Um exame oftalmolgico usando um oftalmoscpio ou equipamento adequado equivalente deve ser feito
antes da administrao da substncia a testar e no fim da experincia, de preferncia a todos os animais,
ou pelo menos nos grupos da dose mais elevada e de controlo. Se se detectarem alteraes oculares
devem examinar-se todos os animais;
b) Um exame hematolgico ser efectuado no fim da experincia compreendendo os seguintes testes:
hematcrito, concentrao de hemoglobina, contagem de eritrcitos, contagem de leuccitos, frmula
leucocitria, bem como um estudo da coagulao e tempo de coagulao, tempo de protrombina, tempo
de tromboplastina, ou contagem de plaquetas;
c) A determinao de dados bioqumicos no sangue deve ser feita no fim da experincia. Apresentam um
interesse geral para todos os estudos a avaliao do equilbrio electroltico, do metabolismo dos hidratos
de carbono, da funo heptica e renal. A escolha dos testes especficos ser influenciada por observaes
relativas ao modo de aco da substncia a testar. Sugere-se o doseamento do clcio, fsforo, cloretos,
sdio, potssio, glicose em jejum (o perodo de jejum depender da espcie), transaminase glutmico-
-pirvica srica (
1
), transaminase glutmico-oxaloactica sriea (
2
), ornitina-descarboxilase, gama-glutamil
transpeptidase, azoto ureico, albumina, creatinina plasmtica, bilirubina total e as protenas sricas totais.
As outras anlises eventualmente necessrias a uma avaliao toxicolgica adequada incluem anlises de
lpidos, hormonas, equilbrio cido-bsico, methemoglobina, e actividade colinestersica. Podem efectuar-
-se outras anlises bioqumicas clnicas, se necessrio, para aprofundar o estudo dos efeitos observados;
d) Um exame regular da urina no necessrio; este exame s indicado em caso de efeitos txicos
provveis ou manifestos.
Se a informao de estudos anteriores no for apropriada dever considerar-se a necessidade de determinao
dos parmetros hematolgicos e bioqumicos clnicos antes de comear a experincia.
Aut ps i a
Todos os animais sero submetidos a uma autpsia geral que incluir o exame da superfcie exterior do corpo,
de todos os orifcios e das cavidades craniana, torcica e abdominal e respectivos contedos. O fgado, os rins,
as glndulas supra-renais e os testculos sero pesados, ainda hmidos, o mais rapidamente possvel depois da
dissecao, para se evitar a perda de lquidos por evaporao. Os seguintes rgos e tecidos devero ser
conservados num meio adequado na eventualidade de um exame histopatolgico ulterior: todas as leses
macroscpicas, encfalo, incluindo cortes da medula/protuberncia, crtex cerebeloso e crtex cerebral,
hipfise, tirideia, paratirideia, todo o tecido tmico, (traqueia), pulmes, corao, aorta, glndulas salivares,
fgado, bao, rins, supra-renais, pncreas, gnadas, tero, rgos genitais anexos, vescula biliar (quando
presente), esfago, estmago, duodeno, jejuno, leo, cego, clon, recto, bexiga, gnglio linftico representativo,
(glndula mamria na fmea), (musculatura da coxa), nervo perifrico, (olhos), (esterno com medula ssea),
(fmur, incluindo superfcie articular), (medula espinhal a trs nveis: cervical, mediotorcica e lombar) e
(glndulas lacrimais). Os tecidos mencionados entre parnteses s sero examinados em caso de aparecimento
de sinais de toxicidade ou de compromisso do rgo-alvo.
E x a me hi s t opa t ol g i c o
a) Sero objecto de um exame histopatolgico completo a pele normal e a pele tratada, assim como os
rgos e tecidos de todos os animais de controlo e do grupo exposto dose mais elevada;
b) Todas as leses macroscpicas sero examinadas;
c) Os rgos-alvo dos animais pertencentes aos grupos tratados com outras doses devero ser examinados;
d) Se se utilizarem ratos, os pulmes dos animais dos grupos expostos s doses baixa e intermdia sero
submetidos a um exame histopatolgico para se detectar qualquer sinal de infeco uma vez que isso nos
permite uma avaliao conveniente do estado de sade dos animais. Outros exames histopatolgicos
sistemticos podem no se justificar para os animais desses grupos mas devem ser sempre efectuados aos
rgos que apresentem leses no grupo tratado com a dose mais elevada;
e) Quando se usar um grupo satlite, ser feito um exame histopatolgico aos tecidos e rgos que
apresentem sinais de toxicidade nos grupos tratados.
2. RESULTADOS
Os resultados devem ser resumidos sob a forma de quadros, indicando, para cada grupo de experincia, o
nmero de animais no incio desta, o nmero de animais apresentando leses, o tipo de leses e a percentagem
de animais apresentando cada tipo de leso. Os resultados sero avaliados por meio de um mtodo estatstico
apropriado. Pode utilizar-se qualquer mtodo estatstico reconhecido.
(
1
) Conhecida actualmente por transaminase da alanina.
(
2
) Conhecida actualmente por transaminase do aspartato.
3. RELATRIO
espcie, estirpe, origem, condies do meio ambiente, dieta,
doses (compreendendo veculo, se utilizado) e concentraes,
dose sem efeitos, se possvel,
momento de morte durante a experincia ou indicao dos animais sobreviventes no fim da experincia,
descrio dos efeitos txicos ou outros,
momento da observao de qualquer manifestao anormal e sua evoluo,
dados relativos alimentao e peso do animal,
observaes oftalmolgicas,
exames hematolgicos efectuados e seus resultados,
testes bioqumicos clnicos utilizados e seus resultados (incluindo resultados das anlises de urina),
descrio pormenorizada de todas as observaes histopatolgicas,
interpretao dos resultados,
condies experimentais.
4. REFERNCIAS
B.29. TOXICIDADE SUBCRNICA POR INALAO: TESTE DE DOSE REPETIDA POR INALAO, A
NOVENTA DIAS, EM ROEDORES
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.2. DEFINIES
Nenhuma.
Vrios grupos de animais de experincia so expostos diariamente, por um perodo determinado, a
concentraes diferentes de substncias a testar razo de uma concentrao por grupo durante um perodo de
90 dias. Quando se utiliza um veculo para ajudar a obter uma concentrao apropriada da substncia a testar
na atmosfera deve usar-se um grupo-controlo para o veculo. Durante o perodo de administrao os animais
so observados diariamente para se detectarem as manifestaes de toxicidade. Os animais que morrem
durante a experincia so autopsiados e no fim da experincia os animais sobreviventes so igualmente
autopsiados.
Nenhum.
P r e pa r a t i v os
Os animais so mantidos nas condies de alojamento e de alimentao da experincia pelo menos durante
cinco dias antes do teste. Antes de comear o teste os animais jovens e sos so distribudos ao acaso pelos
grupos submetidos ao tratamento e de controlo. Se necessrio pode adicionar-se um veculo substncia a
testar para se conseguir uma concentrao apropriada desta na atmosfera; se um veculo ou outros aditivos
forem usados para facilitar a administrao devem ser comprovadamente no txicos. Pode recorrer-se a dados
anteriormente publicados se necessrio.
Cond i e s e x pe r i me nt a i s
Salvo contra-indicao, a espcie preferida o rato. Devem utilizar-se animais jovens e sos de uma estirpe
corrente de laboratrio. No incio da experincia a diferena de peso entre os animais no poder ultrapassar
20 % do peso mdio. Se um estudo subcrnico por inalao constituir a fase preliminar de um estudo a longo
prazo, deve utilizar-se a mesma espcie e estirpe em ambos os estudos.
Nme r o e s e xo
Para cada concentrao de exposio sero utilizados pelo menos 20 animais (10 fmeas e 10 machos). As
fmeas devero ser nulparas e no grvidas. Se for previsvel sacrificar alguns animais durante a experincia
devem acrescentar-se ao nmero inicial o nmero de animais que se prev sacrificar. Para alm destes, um
grupo-satlite de 20 animais (10 de cada sexo) poder ser exposto concentrao mais elevada durante 90 dias
e ser observado quanto reversibilidade, persistncia ou ao aparecimento tardio de efeitos txicos durante
28 dias aps o tratamento.
Conc e nt r a o d e e x pos i o
So utilizadas pelo menos trs concentraes, com um grupo-controlo ou, se necessrio, um grupo-controlo
para o veculo quando este for utilizado (correspondendo a concentrao do veculo ao nvel de exposio mais
elevada). Os animais do grupo de controlo so tratados da mesma forma que os dos grupos da experincia com
excepo da inalao da substncia a testar. A concentrao mais elevada dever produzir efeitos txicos mas
nenhuma ou poucas mortes. Se se dispuser de informao sobre a exposio humana a concentrao mais
baixa ser superior a esse valor. O ideal seria a concentrao intermdia produzir o efeito txico mnimo
observvel. Se se utilizarem vrias concentraes intermdias a diferena entre elas ser calculada de forma a
conseguir-se uma gradao dos efeitos txicos. Nos grupos de concentrao baixa e intermdia, assim como
nos grupos controlo, a incidncia de mortalidade dever ser baixa para permitir uma avaliao significativa dos
resultados.
Te mpo d e e x pos i o
A durao diria do tempo de exposio dever ser de seis horas aps se obterem as concentraes dentro da
cmara de exposio. Podem utilizar-se outros tempos de exposio para satisfazer outras exigncias
especficas.
E q ui pa me nt o
Os animais sero expostos substncia a testar por meio de um dispositivo de inalao concebido de forma a
conseguir-se um fluxo de ar contnuo que assegurar pelo menos 12 renovaes de ar por hora e garanta uma
concentrao de oxignio apropriada e uma distribuio uniforme do produto a testar no ar. Se se utilizar uma
cmara, esta ser concebida de maneira a obter-se uma superlotao mnima dos animais e uma exposio
mxima substncia a testar. Como regra geral para se assegurar a estabilidade da atmosfera na cmara o
volume total dos animais de experincia no deve ultrapassar 5 % do volume da cmara de ensaio. Pode
tambm recorrer-se a um sistema de exposio oro-nasal, de cabea apenas ou do corpo inteiro em cmara
individual; os dois primeiros tipos de exposio permitem reduzir a penetrao por outras vias.
P e r od o d e obs e r v a o
Os animais da experincia devero ser observados diariamente para se detectarem manifestaes de toxicidade
durante todo o perodo de exposio e de recuperao. Sero registados o momento da morte assim como o do
aparecimento e desaparecimento das manifestaes de toxicidade.
Os animais so expostos diariamente substncia a testar razo de cinco a sete dias por semana, durante um
perodo de 90 dias. Os animais dos grupos-satlite destinados s observaes complementares sero mantidos
vivos durante mais 28 dias, sem tratamento, para se detectar a recuperao ou a persistncia dos efeitos txicos.
A temperatura a que se efectua o teste dever ser mantida a 22 3
o
C. Em condies ptimas, a humidade
relativa dever ser mantida entre 30 % e 70 % mas, nalguns casos, isto pode ser impraticvel (por exemplo,
testes com aerossol). Durante a exposio, os animais no recebero alimentos nem gua.
Dever ser usado um sistema de inalao dinmico com um dispositivo apropriado de controlo analtico da
concentrao. Recomenda-se a realizao de um teste preliminar para se determinarem as concentraes
apropriadas de exposio. O dbito de ar dever assegurar concentraes homogneas em toda a cmara de
exposio. O sistema dever permitir a obteno de condies estveis o mais rapidamente possvel.
a) Dbito de ar (permanentemente);
b) A concentrao real da substncia a testar medida na zona de respirao. Durante o perodo de exposio
diria a concentrao no variar alm de 15 % do valor mdio. Contudo, no caso de poeiras e
aerossis esta preciso pode no ser possvel e uma variao maior poder ento ser aceitvel. Durante
toda a durao da experincia, as concentraes dirias sero mantidas o mais constantes possvel.
Durante a elaborao do sistema gerador proceder-se- a uma anlise granulomtrica das partculas para
determinar a estabilidade das concentraes do aerossol. Durante a exposio far-se-o anlises o mais
frequentemente possvel para determinao da estabilidade da repartio granulomtrica;
c) Temperatura e humidade;
d) Durante e aps a exposio s concentraes so feitas observaes e registadas sistematicamente; so
feitas fichas individuais para cada animal. Todos os animais sero observados diariamente e as
manifestaes de toxicidade, assim como o momento do seu aparecimento, a sua intensidade e a sua
durao sero registados. Durante o perodo de cativeiro conveniente observar, nomeadamente, as
modificaes da pele e do plo, dos olhos, das mucosas, do aparelho respiratrio, do aparelho
circulatrio, do sistema nervoso autnomo e central, da actividade somatomotora e do comportamento.
O consumo alimentar e o peso dos animais sero determinados todas as semanas. necessrio observar
regularmente os animais a fim de se assegurar que no h perdas por canibalismo, autlise dos tecidos ou
condies imprprias de alojamento. No fim da experincia, todos os animais sobreviventes so
autopsiados. Durante a experincia, os animais moribundos sero imediatamente retirados e autopsiados.
Os exames que a seguir se enunciam so normalmente feitos a todos os animais, incluindo os de controlo:
a) Um exame oftalmolgico usando um oftalmoscpio ou equipamento adequado equivalente deve ser feito
antes da exposio substncia a testar e no fim da experincia de preferncia a todos os animais ou pelo
menos nos grupos da dose mais elevada e de controlo. Se se detectarem alteraes oculares devem
examinar-se todos os animais;
b) Um exame hematolgico ser efectuado no fim da experincia, compreendendo os seguintes testes:
hematcrito, concentrao de hemoglobina, contagem de eritrcitos, contagem de leuccitos, frmula
leucocitria, bem como um estudo da coagulao pelo tempo de coagulao, tempo de protombina,
tempo de tromboplastina ou contagem de plaquetas;
c) A determinao de dados bioqumicos no sangue deve ser feita no fim da experincia. Apresentam um
interesse geral para todos os estudos a avaliao do equilbrio electroltico, do metabolismo dos hidratos
de carbono, da funo heptica e renal. A escolha dos testes especficos ser influenciada por observaes
relativas ao modo de aco da substncia a testar. Sugere-se o doseamento do clcio, fsforo, cloretos,
sdio, potssio, glicose em jejum (o perodo de jejum depender da espcie), transaminase glutmico-
-pirvica sria (
1
), transaminase glutmico-oxaloactica sria (
2
), ornitina-descarboxilase, gama-glutamil
transpeptidase, azoto ureico, albumina, creatinina plasmtica, bilirubina total e as protenas sricas totais.
As outras anlises eventualmente necessrias a uma avaliao toxicolgica adequada incluem anlises de
lpidos, hormonas, equilbrio cido-bsico, methemoglobina e actividade colinestersica. Podem efectuar-
-se outras anlises bioqumicas clnicas, se necessrio, para aprofundar o estudo dos efeitos observados;
d) Um exame regular da urina no necessrio; este exame s indicado em caso de efeitos txicos
provveis ou manifestos.
Se a informao de estudos anteriores no for apropriada dever considerar-se a necessidade de determinao
dos parmetros hematolgicos e bioqumicos clnicos antes de comear a experincia.
Aut ps i a
Todos os animais so submetidos a uma autpsia geral que incluir o exame da superfcie exterior do corpo, de
todos os orifcios e das cavidades cranianas, torcicas e abdominal e respectivos contedos. O fgado, os rins, as
glndulas supra-renais e os testculos sero pesados, ainda hmidos, o mais rapidamente possvel depois da
dissecao para evitar a perda de lquidos por evaporao. Os seguintes rgos e tecidos devero ser
conservados num meio adequado na eventualidade de exames histopatolgicos ulteriores: todas as leses
macroscpicas, pulmes que devem ser retirados inteiros, pesados e tratados com um fixador apropriado
que permita conservar a estrutura pulmonar (considera-se a perfuso com o fixador como um mtodo eficaz),
tecidos da naso-faringe, encfalo incluindo cortes da medula/da protuberncia, crtex cerebeloso e crtex
cerebral, hipfise, tirideia/paratirideia, todo o tecido tmico, traqueia, pulmes, corao, aorta, glndulas
salivares, fgado, bao, rins glndulas supra-renais, pncreas, gnadas, tero, (rgos genitais anexos), (pele),
vescula biliar (quando presente), esfago, estmago, duodeno, jejuno, leo, cego, clon, recto, bexiga, gnglio
linftico representativo (glndula mamria na fmea), (musculatura da coxa), nervo perifrico, (olhos), esterno
com medula ssea, (fmur, incluindo superfcie articular), (medula espinhal a trs nveis: cervical, mediotorcica
e lombar). Os tecidos mencionados entre parntesis s sero observados em caso de aparecimento de sinais de
toxicidade ou de compromisso do rgo-alvo.
E x a me hi s t opa t ol g i c o
a) Sero objecto de um exame histopatolgico completo as vias respiratrias, assim como os rgos e
tecidos de todos os animais do grupo de controlo e dos do grupo exposto dose mais elevada;
b) Todas as leses macroscpicas sero examinadas;
c) Os rgos-alvo dos animais pertencentes a outros grupos tratados sero examinados;
d) Os pulmes dos animais pertencentes aos grupos expostos s doses baixa e intermdia sero submetidos
a um exame histopatolgico, uma vez que isto nos permite uma avaliao conveniente do estado de
sade dos animais. Outros exames histopatolgicos sistemticos podem no se justificar para os animais
desses grupos mas devem ser sempre efectuados aos rgos que apresentem leses no grupo tratado com
(
1
) Conhecida actualmente por transaminase da alanina.
(
2
) Conhecida actualmente por transaminase do aspartato.
a dose mais elevada;
e) Quando se usa um grupo-satlite, ser praticado um exame histopatolgico aos tecidos e rgos que
apresentem sinais de toxicidade nos grupos tratados.
2. RESULTADOS
Os resultados sero resumidos sob a forma de quadros indicando, para cada grupo de teste o nmero de
animais no incio, o nmero de animais atingidos por leses, o tipo de leses e a percentagem de animais
apresentando cada tipo de leso. Os resultados sero avaliados com um mtodo estatstico apropriado. Pode ser
utilizado qualquer mtodo estatstico reconhecido.
3. RELATRIO
O relatrio do teste deve incluir as seguintes informaes:
espcie, estirpe, origem, condies do meio ambiente, dieta,
Descrio do aparelho de exposio: incluindo concepo, tipo, dimenses, fonte de ar, sistema gerador de
partculas e de aerossis, mtodo de condicionamento de ar, tratamento do ar evacuado e, no caso disso,
o mtodo de acondicionamento dos animais na cmara de ensaio. O equipamento utilizado para medir a
temperatura, a humidade e, se necessrio, a estabilidade das concentraes do aerossol ou da
granulometria das partculas ser descrito.
Dados relativos exposio: estes dados sero apresentados sob a forma de um quadro indicando os valores
mdios assim como uma medida de variao (por exemplo, desvio-padro) e diro respeito:
a) Aos dbitos de ar atravs do dispositivo de inalao;
b) temperatura e humidade do ar;
c) s concentraes nominais (quantidade total da substncia a testar introduzida no dispositivo de
inalao dividida pelo volume de ar);
d) natureza do veculo, se utilizado;
e) s concentraes reais na zona de respirao;
f) s dimenses mdias das partculas, se necessrio,
resposta txica por seco e por concentrao,
dose sem efeito, se possvel,
momento da morte durante a experincia ou indicao dos animais sobreviventes,
descrio dos efeitos txicos ou outros,
momento de observao de qualquer manifestao anormal e sua evoluo,
exames hematolgicos efectuados e seus resultados,
testes bioqumicos clnicos utilizados e seus resultados (incluindo anlises de urina),
tratamento estatstico dos resultados, se apropriado,
4. REFERNCIAS
B.30. TESTE DE TOXICIDADE CRNICA
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.2. DEFINIES
Nenhuma.
A substncia a testar administrada normalmente sete dias por semana, pela via apropriada a vrios grupos de
animais de experincia razo de uma dose por cada grupo durante a maior parte da sua vida. Durante e
depois da exposio substncia a testar, observam-se diariamente os animais de experincia para se detectar
manifestaes de toxicidade.
Nenhum.
Preparativos
Os animais so mantidos nas condies de alojamento e de alimentao da experincia, durante pelos menos
cinco dias antes do teste. Antes de comear o teste, os animais jovens e sos so distribudos ao acaso pelos
grupos submetidos ao tratamento e de controlo.
A espcie preferida o rato.
Podem utilizar-se outras espcies (roedores ou no roedores) de acordo com os resultados de estudos
anteriores. Devem utilizar-se animais jovens e sos de estirpes correntes de laboratrio, e o tratamento deve
comear o mais cedo possvel aps o desmame.
No incio da experincia a diferena de peso entre os animais no dever ultrapassar 20 % do peso mdio. Se
um estudo subcrnico oral tiver constitudo a fase preliminar de um estudo a longo prazo deve utilizar-se a
mesma espcie e estirpe em ambos os estudos.
Nme r o e s e xo
No caso de roedores sero utilizados pelo menos 40 animais (20 fmeas e 20 machos) para cada dose e grupo
de controlo correspondente. As fmeas devero ser nulparas e no grvidas. Se estiver previsto o sacrifcio de
animais no decurso da experincia, os efectivos devem ser aumentados do nmero de animais cujo sacrifcio
estiver previsto.
Para os no roedores aceita-se um nmero mais pequeno de animais, pelo menos quatro por sexo e por grupo.
Dos e s e f r e q u nc i a d e e x pos i o
Devem utilizar-se pelo menos trs doses alm do grupo de controlo correspondente. A dose mxima dever
produzir manifestaes ntidas de toxicidade sem causar mortalidade excessiva.
A dose mais baixa no produzir nenhum efeito txico.
A(s) dose(s) intermdia(s) ter (tero) um valor prximo da mdia entre a dose mxima e a dose mnima.
Os nveis de dose devero ter em conta os dados obtidos nos ensaios e estudos de toxicidade efectuados
anteriormente.
Normalmente a frequncia de exposio ser diria. Se o produto qumico for administrado na gua de beber
ou incorporado na alimentao, deve estar constantemente disponvel.
Cont r ol os
Dever utilizar-se um grupo de controlo idntico em todos os aspectos aos grupos tratados com excepo da
exposio substncia a testar.
Em condies especiais, como em estudos por inalao implicando o emprego de aerossis ou o uso de um
emulsionante com actividade biolgica no estudada em ensaios por via oral, dever utilizar-se um grupo
suplementar de controlo negativo correspondente. O grupo de controlo negativo tratado da mesma maneira
que os outros grupos com excepo da exposio substncia a testar ou a qualquer veculo.
As duas vias principais de administrao so a oral e a respiratria (por inalao). A escolha da via de
administrao depende das caractersticas fsico-qumicas da substncia a testar e da via mais provvel de
exposio humana.
A utilizao da via cutnea coloca problemas prticos considerveis. A toxicidade crnica sistmica provocada
pela absoro percutnea pode normalmente deduzir-se dos resultados de outros testes orais, e do
conhecimento da quantidade de substncia absorvida por via percutnea em estudos anteriores de toxicidade
por essa via.
E s t ud os por v i a or a l
A via oral de administrao preferida, salvo contra-indicaes, se a substncia a testar for absorvida pelo tubo
digestivo e se a ingesto for uma via possvel de exposio humana. Os animais podem receber a substncia a
testar na alimentao, dissolvida na gua de beber, ou numa cpsula. Em condies ideais a dose diria ser
administrada sete dias por semana visto que a administrao em cinco dias por cada sete pode permitir a
recuperao do animal ou a diminuio de toxicidade no perodo em que o tratamento interrompido e assim
afectar os resultados e a avaliao subsequente. No entanto, por razes essencialmente prticas, a administrao
em cinco dias por cada sete considerada aceitvel.
E s t ud os por i na l a o
Um vez que os estudos por inalao colocam problemas tcnicos de maior complexidade do que os por outras
vias de administrao, so dadas aqui recomendaes mais pormenorizadas. Deve notar-se que a instilao
endotraqueal pode constituir uma alternativa vlida em certas situaes especficas.
As exposies prolongadas (de longo prazo) so habitualmente calculadas em funo da exposio humana
prevista: os animais so expostos cinco dias por semana (exposio intermitente) razo de seis horas por dia
depois de se obterem as concentraes na cmara de experincia ou expostos sete dias em cada sete (exposio
contnua) razo de 22 a 24 horas por dia destinando-se uma hora por dia alimentao dos animais segundo
um horrio regular e manuteno das cmaras. Em ambos os casos os animais so habitualmente expostos a
uma concentrao fixa da substncia a testar.
Uma diferena essencial entre a exposio intermitente e a exposio contnua reside no facto de na primeira os
animais disporem de um perodo de 17 a 18 horas para recuperar dos efeitos da exposio diria e mesmo de
um perodo mais longo durante os fins-de-semana.
A escolha da exposio intermitente ou contnua ser feita em funo dos objectivos do estudo e da exposio
humana que deve ser simulada. Convm no entanto ter em conta certas dificuldades tcnicas: por exemplo as
vantagens da exposio contnua na simulao das condies do ambiente podem ser contrariadas pela
necessidade de alimentar e dar de beber aos animais durante a exposio e ainda pela necessidade de tcnicas
mais complicadas de produo de aerossis e de vapores, bem como de monitorizao.
C ma r a s d e e x pos i o
Os animais so expostos substncia a testar em cmaras de inalao concebidas de forma a conseguir-se um
fluxo de ar dinmico de pelo menos 12 renovaes de ar por hora e uma concentrao adequada de oxignio e
uma distribuio uniforme da substncia a testar no ar. As cmaras de exposio e as cmaras de controlo sero
idnticas quanto construo e concepo a fim de garantirem condies de exposio comparveis em todos
os aspectos, com excepo da exposio substncia a testar. Geralmente mantm-se uma ligeira presso
negativa no interior da cmara para impedir fugas da substncia a testar para a rea envolvente. As cmaras
devero ser concebidas de forma a evitar a superlotao com os animais de experincia. Em geral, para
assegurar a estabilidade da atmosfera da cmara, o volume total dos animais de experincia no deve
ultrapassar 5 % do volume da cmara de exposio.
i) Dbito do ar: o dbito do ar na cmara dever de preferncia ser monitorizado continuamente;
ii) Concentrao: durante o perodo de exposio diria a concentrao da substncia a testar no deve
variar mais do que 15 % em redor do valor mdio;
iii) Temperatura e humidade: para roedores a temperatura deve ser mantida a 22
o
C ( 2
o
C) e a humidade
dentro da cmara ser de 30 % a 70 %, excepto quando se utilizar gua para colocar em suspenso na
atmosfera das cmaras a substncia a testar. Estes parmetros sero, de preferncia, monitorizados
permanentemente;
iv) Anlise granulomtrica das partculas: dever efectuar-se uma determinao da distribuio
granulomtrica das partculas nas atmosferas das cmaras onde se utilizam aerossis lquidos ou
slidos. As partculas do aerossol devero ter um dimetro respirvel para o animal de experincia
utilizado. Sero retiradas amostras das atmosferas das cmaras de ensaio, na zona de respirao dos
animais. A amostra de ar retirada dever ser representativa da distribuio das partculas a que os animais
so expostos e representar, numa base gravimtrica, o conjunto do aerossol em suspenso, mesmo se
uma grande parte deste no for inalvel. As anlises granulomtricas sero feitas frequentemente durante
a elaborao do sistema gerador para assegurar a estabilidade do aerossol, sendo depois feitas tantas vezes
quanto as necessrias durante as exposies para determinar de forma adequada a estabilidade das
distribuies das partculas a que os animais forem expostos.
Dur a o d o e s t ud o
O perodo de administrao dever ser pelo menos de 12 meses.
Procedimento
Obs e r v a e s
Dever proceder-se pelo menos uma vez por dia a um exame clnico atento. Observaes complementares
devero ser feitas diariamente e tomar-se medidas apropriadas para diminuir a perda de animais do estudo, por
exemplo autpsia, ou refrigerao dos animais encontrados mortos e isolamento ou sacrifcio dos animais de
sade precria. Os animais sero observados cuidadosamente para se detectar o aparecimento ou
desaparecimento de sinais de toxicidade assim como para reduzir a perda de animais por doena, autlise
dos tecidos ou canibalismo.
Os sinais clnicos incluindo as modificaes neurolgicas e oculares assim como a mortalidade sero registados
relativamente a todos os animais. Ser registado o momento do aparecimento de efeitos txicos e a sua
evoluo assim como os tumores suspeitos.
O peso de cada animal ser determinado e registado uma vez por semana durante as t13 primeiras semanas do
perodo de ensaio e posteriormente pelo menos uma vez de quatro em quatro semanas. O consumo alimentar
ser determinado todas as semanas durante as 13 primeiras semanas do estudo e posteriormente de trs em
trs meses a menos que o estado de sade ou as modificaes do peso corporal dos animais justifiquem outra
frequncia.
E x a me he ma t ol g i c o
Dever efectuar-se um exame hematolgico (por exemplo, concentrao de hemoglobina, hematcrito, nmero
total de leuccitos, plaquetas ou outros testes de coagulao) aos trs meses, aos seis meses e em seguida a
intervalos de seis meses e no fim da experincia, em amostras de sangue recolhidas de todos os no roedores e
de 10 ratos/sexo de cada grupo. Se possvel, as amostras deveriam ser colhidas de cada vez nos mesmos ratos.
Alm disso, deve colher-se uma amostra de sangue antes do teste, aos no roedores.
Se as observaes clnicas sugerirem uma deteriorao do estado de sade de alguns dos animais durante o
estudo, dever obter-se uma frmula leucocitria dos animais afectados.
Dever obter-se uma frmula leucocitria em amostras de sangue dos animais do grupo tratado com a dose
mais elevada e dos controlos. Sero obtidas frmulas no(s) grupo(s) tratado(s) com dose mais baixa apenas no
caso de se verificar uma grande discrepncia entre o grupo tratado com a dose mais elevada e os controlos, ou
se indicados pelos achados patolgicos.
An l i s e d e ur i na
Sero colhidas as amostras de urina para anlise a todos os no roedores assim como em 10 ratos/sexo de
todos os grupos, se possvel sempre aos mesmos ratos e na mesma altura dos exames histopatolgicos. Devero
ser efectuadas as seguintes determinaes em cada animal individualmente ou, no caso dos roedores, num pool
de urina do mesmo grupo e do mesmo sexo:
aspecto: volume e densidade para os animais tomados individualmente,
protenas, glicose, corpos cetnicos, sangue oculto (semiquantitativamente),
microscopia do sedimento urinrio (semiquantitativamente).
Bi oq u mi c a c l ni c a
De seis em seis meses e no fim do estudo colher-se-o amostras de sangue para determinaes bioqumicas
clnicas de todos os no roedores e a 10 ratos/sexo de todos os grupos e, se possvel, sempre dos mesmos ratos
de cada vez. Alm disso, ser recolhida uma amostra pr-teste dos no roedores. O plasma preparado a partir
destas amostras ser utilizado para as seguintes determinaes:
concentrao de protenas totais,
concentrao de albumina,
testes de funo heptica (tais como a actividade da fosfatase alcalina, actividades da transaminase
glutmico-pirvica (
1
) e da glutmico-oxaloactica (
2
), gama-glutamil transpeptidase, ornitina descarbo-
xilase,
metabolismo dos hidratos de carbono como uma glicemia em jejum,
testes da funo renal como a ureia sangunea.
Aut ps i a
Todos os animais sero submetidos a uma autpsia geral, incluindo os que morrem no decurso da experincia
ou que tenham sido sacrificados por se encontrarem moribundos. Antes do sacrifcio devero colher-se
amostras de sangue de todos os animais para se fazerem frmulas leucocitrias. Devero ser considerados todos
os tumores ou leses nitidamente visveis e as leses suspeitas de serem tumores. Tentar-se- estabelecer
correlaes entre os achados macroscpicos e as observaes microscpicas.
Devero ser conservados todos os rgos e tecidos para um exame histopatolgico. Este procedimento inclui
habitualmente os seguintes rgos e tecidos: encfalo (
3
) (medula/protuberncia, crtex cerebeloso, crtex
cerebral), hipfise, tiroideia (incluindo paratiroideias), timo, pulmes (incluindo traqueia), corao, aorta,
glndulas salivares, fgado (
3
), bao, rins (
3
), supra-renais (
3
), esfago, estmago, duodeno, jejuno, leo, cego,
clon, recto, bexiga, gnglios linfticos, pncreas, gnadas (
3
), rgos genitais anexos, glndula mamria na
fmea, pele, musculatura, nervo perifrico, medula espinhal (cervical, torcica, lombar), esterno com medula
ssea, e fmur (incluindo articulao) e olhos. A insuflao dos pulmes e bexiga com um fixador o meio
ptimo para preservar estes tecidos; a insuflao dos pulmes nos estudos de inalao essencial para um
exame histopatolgico apropriado. Em estudos especiais como os de inalao deve ser estudado todo o sistema
respiratrio, incluindo o nariz, faringe e laringe.
(
1
) Actualmente designada transaminase da alanina.
(
2
) Actualmente designada transaminase do aspartato.
(
3
) Estes rgos, provenientes de 10 animais por sexo e por grupo no caso dos roedores devero ser pesados.
Se se fizerem outros exames clnicos, a informao obtida dever estar disponvel antes do exame
microscpico, uma vez que pode fornecer indicaes preciosas ao patologista.
Hi s t opa t o1og i a
Devero ser examinadas microscopicamente todas as alteraes visveis, em particular tumores e outras leses
ocorrendo em qualquer rgo. Alm disso so recomendados os seguintes procedimentos:
a) Exame microscpico de todos os rgos e tecidos, com uma descrio completa de todas as leses
encontradas em:
1. todos os animais que morrerem ou forem sacrificados durante o estudo,
2. todos os animais do grupo de dose mais elevado e controlos;
b) Os rgos e tecidos apresentando alteraes causadas ou possivelmente causadas pela substncia testada
so tambm examinados nos grupos de dose mais baixa;
c) Quando os resultados do teste indicarem uma reduo substancial da durao normal da vida dos
animais ou uma induo de efeitos que possam afectar a resposta txica, dever-se- examinar os animais
do grupo da dose imediatamente inferior, do modo descrito acima;
d) informaes sobre a incidncia de leses ocorrendo normalmente na estirpe de animais utilizados, nas
mesmas condies laboratoriais, isto , dados de experincias anteriores acerca dos controlos, so
indispensveis para uma avaliao correcta da significncia das alteraes observadas nos animais
tratados.
2. RESULTADOS
Os resultados devero ser resumidos em quadros, indicando, para cada grupo de experincia o nmero de
animais no incio do teste, o nmero de animais apresentando leses e a percentagem de animais apresentando
cada tipo de leses. Os resultados devero ser avaliados com um mtodo estatstico apropriado.
3. RELATRIO
espcie, estirpe, origem, condies do ambiente, dieta,
Descrio do dispositivo de exposio:
Incluindo concepo, tipo, dimenses, fonte de ar, sistema gerador de partculas e aerossis, mtodo de
acondicionamento dos animais na cmara de exposio, quando utilizada. Dever ser descrito o
equipamento utilizado para a medio da temperatura, da humidade e, se necessrio, da estabilidade da
concentrao ou a granulometria das partculas.
Dados relativos experincia
Estes devero ser apresentados em forma de quadros indicando as mdias e uma medida da variao (por
exemplo, o desvio-padro) e devero incluir:
a) Os dbitos do ar atravs do dispositivo de inalao;
b) A temperatura e a humidade do ar;
c) As concentraes nominais (quantidade total da substncia a testar introduzida no dispositivo de
inalao dividida pelo volume do ar);
d) Natureza do veculo, se utilizado;
e) Concentraes na zona de respirao;
f) Dimenses mdias das partculas (se necessrio),
doses (incluindo veculo, se utilizado) e concentraes,
resposta txica, por sexo e por dose,
dose sem efeitos, se possvel,
momento da morte durante o estudo ou indicao dos animais sobreviventes,
descrio dos efeitos txicos e outros,
momento de observao das manifestaes anormais e sua evoluo subsequente,
testes hematolgicos utilizados e todos os seus resultados,
testes bioqumicos clnicos empregados e todos os resultados (incluindo todas as anlises de urina),
4. REFERNCIAS
B.31. ESTUDO DE TOXICIDADE SOBRE O DESENVOLVIMENTO PR-NATAL
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O presente mtodo de ensaio de toxicidade sobre o desenvolvimento destina-se a fornecer informao geral
sobre os efeitos de exposio pr-natal no animal de ensaio prenhe e no organismo em desenvolvimento no
tero; pode incluir a avaliao de efeitos maternos e de morte, anomalias estruturais ou alteraes no
crescimento do feto. Apesar de constiturem uma parte importante do desenvolvimento, as deficincias
funcionais no so contempladas neste mtodo de ensaio, podero ser testadas num estudo independente ou
em complementaridade ao presente estudo, usando o mtodo de ensaio de neurotoxicidade sobre o
desenvolvimento. Para obter informaes relativas aos ensaios sobre deficincias funcionais e outros efeitos
ps-natais, devero consultar-se os mtodos de ensaio para o estudo da toxicidade sobre a reproduo em duas
geraes e o estudo da neurotoxicidade sobre o desenvolvimento, conforme seja apropriado.
Em situaes pontuais, poder revelar-se oportuno introduzir adaptaes especficas no mtodo de ensaio com
base em informaes relativas, por exemplo, s propriedades fsico-qumicas ou toxicolgicas da substncia de
ensaio. Contudo, este procedimento s ser aceitvel quando existirem fortes razes cientficas de que as
alteraes ao mtodo conduziro a um ensaio mais informativo. Nesse caso, os fundamentos cientficos que
justificam as adaptaes introduzidas devero ser cuidadosamente documentados no relatrio do estudo.
1.2. DEFINIES
Toxicologia sobre o desenvolvimento: estudo dos efeitos adversos que se manifestam num organismo em
desenvolvimento em resultado da exposio a determinada substncia antes da concepo, durante o
desenvolvimento pr-natal ou no perodo que decorre desde o nascimento at maturao sexual. As
principais manifestaes de toxicidade sobre desenvolvimento incluem: 1) morte do organismo, 2) anomalia
estrutural, 3) alteraes no crescimento e 4) deficincia funcional. Anteriormente, a toxicologia sobre o
desenvolvimento era, em muitos casos, designada por teratologia.
Efeito adverso: qualquer alterao normalidade relacionada com o tratamento que diminua a capacidade de
um organismo para sobreviver, reproduzir-se ou adaptar-se ao meio ambiente. No que respeita toxicologia
sobre o desenvolvimento, esta definio abrange, no seu sentido mais lato, todos os efeitos que interfiram no
desenvolvimento normal do concepto, antes e aps o nascimento.
Alteraes no crescimento: alterao de peso ou tamanho do corpo ou de um rgo de um descendente.
Alteraes (anomalias): alteraes estruturais no desenvolvimento, que incluem as malformaes e as
variaes (28).
Malformao/Anomalia grave: alterao estrutural considerada prejudicial para o animal (pode tambm ser
letal), cuja ocorrncia normalmente rara.
Variao/Anomalia ligeira: alterao estrutural pouco ou nada prejudicial para o animal; pode ser transiente e
ocorrer com relativa frequncia na populao de controlo.
Concepto: conjunto dos derivados de um vulo fertilizado em qualquer estdio de desenvolvimento, desde a
fertilizao at ao nascimento, incluindo as membranas extraembrionrias, bem como o embrio ou o feto.
Implantao (nidao): ligao do blastocisto ao revestimento epitelial do tero, incluindo a sua penetrao
atravs do epitlio uterino e a sua implantao no endomtrio.
Embrio: estdio inicial ou em desenvolvimento de qualquer organismo; mais especificamente, o produto da
fertilizao de um vulo nas fases de desenvolvimento que decorrem desde o aparecimento da corda dorsal at
formao de todas as estruturas principais.
Embriotoxicidade: conjunto dos efeitos prejudiciais sobre a estrutura, desenvolvimento, crescimento e/ou
viabilidade normais de um embrio.
Feto: organismo em gestao no perodo ps-embrionrio.
Toxicidade fetal: conjunto dos efeitos prejudiciais sobre a estrutura, desenvolvimento, crescimento e/ou
viabilidade normais de um feto.
Aborto: expulso prematura do tero dos produtos da concepo: o embrio ou um feto invivel.
Reabsoro: reabsoro (presente ou passada) de um produto de concepo morto depois de implantado no
tero.
Reabsoro prematura: sinais de implantao sem existncia reconhecvel de embrio/feto.
Reabsoro tardia: embrio ou feto morto, que apresentam alteraes degenerativas externas.
NSEAO: abreviatura para nvel sem efeito adverso observvel; corresponde maior dose ou ao maior nvel de
exposio para o qual no se observam efeitos adversos relacionados com o tratamento.
Nenhuma.
Normalmente, a substncia de ensaio administrada aos animais prenhes desde o momento da implantao
(pelo menos) at ao dia anterior ao previsto para o sacrifcio. O dia do sacrifcio dever ser agendado o mais
prximo possvel da data esperada para o parto, sem que seja descurada a possibilidade de ocorrerem parto
prematuro e a consequente perda de dados. O mtodo de ensaio no se destina apenas a examinar o perodo da
organognese (por exemplo, dias 5-15 em roedores e dias 6-18 no coelho); permite tambm avaliar efeitos de
toxicidade desde a pr-implantao (se apropriado) e ao longo de todo o perodo de gestao at ao dia anterior
operao cesariana. As fmeas so sacrificadas pouco antes da operao cesariana, aps o que os contedos
uterinos so examinados e os fetos inspeccionados para detectar a presena de anomalias externas visveis e
alteraes dos tecidos moles e do esqueleto.
Recomenda-se que o ensaio seja realizado com as espcies mais relevantes e que se utilizem as espcies e
estirpes laboratoriais mais vulgarmente usadas em ensaios de toxicidade sobre o desenvolvimento pr-natal. As
espcies preferidas para ensaio so o rato, no caso de roedores, e o coelho, no caso de no roedores. O uso de
outras espcies dever ser devidamente justificado.
A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser 22
o
C (+ 3
o
C) para roedores e 18
o
C (
3
o
C) para coelhos. A humidade relativa dever ser 50 %-60 %, embora sejam aceitveis valores entre um
mnimo de 30 % e um mximo que, preferivelmente, no dever exceder 70 %, salvo durante os perodos de
limpeza do compartimento. A iluminao deve ser artificial, com sequncias de 12 horas de luz e 12 horas de
escurido. A alimentao pode basear-se em dietas de laboratrio convencionais, com fornecimento ilimitado
de gua para beber.
O acasalamento deve ocorrer em gaiolas adequadas para o efeito. Embora seja prefervel alojar individualmente
os animais durante o acasalamento, considera-se aceitvel o alojamento conjunto de um pequeno nmero de
animais.
Devem usar-se animais saudveis que tenham permanecido nas condies laboratoriais durante pelo menos
cinco dias antes do ensaio para aclimatao e que no tenham sido sujeitos a experincias anteriores. Os
animais de ensaio devem ser caracterizados no que respeita espcie, estirpe, provenincia, sexo, peso e/ou
idade. Os animais de todos os grupos de ensaio devem ser, tanto quanto possvel, uniformes quanto ao peso e
idade. Devem usar-se fmeas jovens, adultas e nulparas em todos os nveis de dose. As fmeas devem acasalar
com machos da mesma espcie e estirpe, devendo evitar-se o acasalamento entre irmos. Em roedores,
considera-se o dia 0 de gestao aquele em que se observa um rolho vaginal e/ou esperma. Em coelhos, o dia 0
normalmente o dia do coito ou da inseminao artificial, caso esta tcnica seja usada. As gaiolas devem ser
dispostas de forma a minimizar possveis efeitos derivados do seu posicionamento. Cada animal deve receber
um nmero de identificao individualizado. As fmeas acasaladas devem ser distribudas pelos grupos de
controlo e de tratamento de forma aleatria. Caso tenha havido alojamento conjunto de vrias fmeas durante
o acasalamento, os animais de cada conjunto devem ser distribudos uniformemente pelos grupos de ensaio.
Do mesmo modo, as fmeas inseminadas pelo mesmo macho devem ser distribudas equitativamente pelos
vrios grupos.
1.6. PROCEDIMENTO
Cada grupo de ensaio e de controlo deve comportar um nmero de fmeas suficiente para que se obtenham
cerca de 20 animais com locais de implantao no momento da necropsia. Os grupos com menos de 16
animais com locais de implantao podero ser considerados como inadequados. A mortalidade materna no
invalida necessariamente o estudo, desde que no seja superior a cerca de 10 %.
Se for usado um agente de transporte ou outro aditivo para facilitar a administrao das doses, devero ser
tomadas em considerao as seguintes caractersticas: efeitos na absoro, distribuio, metabolismo e reteno
ou excreo da substncia de ensaio; efeitos nas propriedades qumicas da substncia de ensaio susceptveis de
alterar as suas caractersticas txicas; e efeitos no consumo de alimentos, na ingesto de gua ou no estado
nutricional dos animais. O agente de transporte no dever apresentar toxicidade sobre o desenvolvimento
nem exercer efeitos na reproduo.
1.6.3. Dosagem
Normalmente, a substncia de ensaio dever ser administrada diariamente, desde a implantao (por exemplo,
no dia cinco ps-acasalamento) at ao dia anterior ao previsto para a operao cesariana. Se estudos anteriores
eventualmente disponveis no indicarem um elevado potencial para perdas pr-implantao, o tratamento
poder prolongar-se de forma a abranger todo o perodo de gestao, desde o acasalamento at ao dia anterior
ao previsto para o sacrifcio. sabido que a manipulao imprpria ou a sujeio a tenses durante a gravidez
podem resultar em perdas pr-natais, pelo que devem evitar-se manipulaes desnecessrias dos animais
prenhes e tenses de origem externa, tais como rudo, de forma a minimizar as perdas por factores no
relacionados com o tratamento.
Devem utilizar-se pelo menos trs nveis de dose e um controlo simultneo. Os animais saudveis devem ser
distribudos aleatoriamente pelos grupos de controlo e de tratamento. Os nveis de dose devem ser espaados
de forma a produzir uma gradao de efeitos txicos. A escolha do nvel de dose mximo deve ter como
objectivo produzir alguma toxicidade sobre o desenvolvimento e/ou sobre a me (sinais clnicos ou diminuio
do peso corporal), mas no a morte ou sofrimento agudo, salvo se existirem limitaes impostas pela natureza
fsico-qumica ou pelas propriedades biolgicas da substncia de ensaio. Pelo menos um dos nveis de dose
intermdios dever produzir efeitos txicos mnimos observveis. O nvel de dose mais baixo no dever
induzir qualquer sinal de toxicidade sobre a me ou sobre o desenvolvimento. Deve seleccionar-se uma
sequncia descendente de nveis de dose que permita detectar qualquer resposta relacionada com a dosagem e
determinar o nvel sem efeito adverso observvel (NSEAO). Frequentemente, a melhor forma de estabelecer
estas sequncias consiste no espaamento das doses em srie geomtrica, usando factores de dois ou de quatro.
A adio de um quarto grupo de ensaio muitas vezes prefervel ao uso de intervalos muito grandes entre as
dosagens (ou seja, com um factor superior a 10). Embora um dos objectivos do ensaio seja a determinao do
NSEAO materno, podem considerar-se aceitveis estudos que no permitam o clculo deste valor (1).
A escolha dos nveis de dose dever tomar em considerao todos os dados de toxicidade existentes, bem como
informaes adicionais sobre o metabolismo e toxicocintica da substncia de ensaio ou de substncias
relacionadas. Estas informaes podero ser tambm usadas para demonstrar a adequao do regime de
dosagem.
Deve usar-se um grupo de controlo simultneo, que poder ser um grupo com tratamento simulado ou, se for
usado um agente de transporte para administrar a substncia de ensaio, um grupo de controlo do agente de
transporte. Todos os grupos devem ser tratados com o mesmo volume da substncia de ensaio ou do agente de
transporte. Os animais do(s) grupo(s) de controlo devem ser manipulados de forma idntica aos animais dos
grupos de ensaio. Os grupos de controlo do agente de transporte devero receber o volume mximo de agente
de transporte utilizado no ensaio (ou seja, um volume idntico ao do grupo do nvel de dose mais baixo).
Se um ensaio com um nvel de dose oral de pelo menos 1 000 mg/kg de peso corporal/dia, realizado de acordo
com os procedimentos descritos neste estudo, no provocar toxicidade observvel nos animais prenhes nem na
sua descendncia e se, para alm disso, os dados existentes sobre compostos estrutural e/ou metabolicamente
relacionados com a substncia de ensaio no sugerirem a possvel ocorrncia de efeitos, poder considerar-se
desnecessrio realizar um ensaio completo com trs nveis de dose. Nos casos em que se preveja exposio
humana, poder ser necessrio aumentar o nvel de dose oral no ensaio-limite. Quando se usam outras formas
de administrao, como inalao ou aplicao cutnea, as propriedades fsico-qumicas da substncia de ensaio
so muitas vezes indicativas e limitantes do nvel mximo de exposio praticvel (por exemplo, a aplicao
cutnea no dever causar toxicidade local grave).
Na maior parte dos casos, a substncia de ensaio ou o agente de transporte so administrados oralmente por
intubao. Se for usada outra via de administrao, o experimentador dever indicar e justificar as razes que
presidiram sua escolha; nesse caso, poder ser necessrio introduzir modificaes apropriadas no mtodo de
ensaio (2)(3)(4). A substncia de ensaio deve ser administrada todos os dias aproximadamente mesma hora.
Normalmente, a dose a administrar a cada animal calculada com base na determinao mais recente do seu
peso corporal. No entanto, o ajuste das doses durante o ltimo tero da gravidez deve ser feito com precauo.
A escolha da dose deve tomar em considerao dados de estudos anteriores para evitar um excesso de
toxicidade materna; contudo, se tal suceder, as mes com indcios de toxicidade excessiva devem ser
sacrificadas. Se vrios animais prenhes apresentarem sinais de excesso de toxicidade, dever considerar-se a
possibilidade de pr termo ao grupo de dose a que pertencem. A administrao por gavagem deve ser feita, de
preferncia, numa toma nica, usando uma sonda gstrica ou uma cnula de intubao apropriada. O volume
mximo de lquido que pode ser administrado numa toma depende do tamanho do animal de ensaio, no
devendo exceder 1 ml/100 g de peso corporal; exceptuam-se as solues aquosas, que podem ser administradas
na proporo de 2 ml/100 g de peso corporal. Quando se usa leo de milho como agente de transporte, o
volume mximo aceitvel de 0,4 ml/100 g de peso corporal. Deve minimizar-se a variabilidade do volume de
ensaio efectuando ajustes nas concentraes, de forma a assegurar a constncia do volume em todos os nveis
de dose.
1.6.6. Observao das mes
Devem efectuar-se observaes clnicas pelo menos uma vez por dia, de preferncia sempre (s) mesma(s)
hora(s). A escolha do momento da observao deve tomar em considerao o perodo de efeitos mximos
previsto que se verifica aps a administrao da dose. Estas observaes devem ser descritas num registo, que
dever conter indicaes sobre a condio dos animais, incluindo mortalidade, estado moribundo, alteraes
pertinentes do comportamento e todos os sinais de manifesta toxicidade.
1.6.7. Peso corporal e consumo de alimento
Os animais devem ser pesados no dia 0 de gestao (se os animais acasalados forem fornecidos por um criador
externo, a pesagem poder ser feita at ao dia trs de gestao, o mais tardar), no primeiro dia de dosagem, de
trs em trs dias (pelo menos) durante o perodo de dosagem e no dia do sacrifcio.
Devem efectuar-se registos do consumo de alimento de trs em trs dias, coincidindo com dias da determinao
do peso corporal.
1.6.8. Inspeco ps-morte
As fmeas devem ser sacrificadas no dia anterior ao previsto para o parto. As fmeas que apresentem sinais de
aborto ou parto prematuro antes da data marcada para o sacrifcio devero ser mortas antecipadamente e
submetidas a um exame macroscpico completo.
No momento do sacrifcio ou da morte durante o estudo, as mes sero objecto de um exame macroscpico, a
fim de se detectarem quaisquer anomalias estruturais ou modificaes patolgicas. A observao das mes
durante a operao de cesariana e a subsequente anlise fetal devero ser feitas de preferncia sem que os
restantes animais do grupo se apercebam para evitar perturbaes.
1.6.9. Exame dos contedos uterinos
Imediatamente aps o sacrifcio ou o mais cedo possvel depois da morte espontnea, os teros sero retirados
para se averiguar o estado de gravidez dos animais. Os teros que no se apresentem grvidos devem ser
submetidos a exames adicionais (por exemplo, colorao com sulfureto de amnio em roedores e colorao de
Salewsky ou um mtodo alternativo apropriado em coelhos) para confirmar o estado de no gravidez (5).
Devem pesar-se os teros grvidos, incluindo o colo. No sero considerados para pesagem os teros grvidos
provenientes de animais encontrados mortos durante o estudo.
Deve determinar-se o nmero de corpos amarelos nos animais prenhes.
Devem examinar-se os contedos uterinos para determinar os nmeros de embries ou de fetos mortos, bem
como o nmero de fetos viveis. Deve avaliar-se o grau de reabsoro, a fim de determinar o tempo relativo da
morte do concepto (ver seco 1.2).
1.6.10. Exame dos fetos
Devem determinar-se o sexo e o peso corporal de cada feto.
Cada feto ser objecto de um exame para detectar alteraes externas (6).
Os fetos devem ser examinados para detectar alteraes do esqueleto e dos tecidos moles (por exemplo,
variaes e malformaes ou anomalias) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21)
(22) (23) (24). aconselhvel (mas no obrigatrio) proceder categorizao das alteraes fetais, explicitando
claramente os critrios usados para definir cada categoria. O aparelho reprodutor deve ser objecto de especial
ateno, devendo ser inspeccionado quanto a sinais de alteraes no desenvolvimento.
No caso de roedores, devem preparar-se e examinar-se cerca de metade dos animais de cada ninhada para
deteco de alteraes do esqueleto; os restantes animais sero preparados e examinados para determinar
alteraes dos tecidos moles, usando mtodos aprovados de seccionamento em srie ou tcnicas adequadas de
dissecao macroscpica cuidadosa.
No caso de no roedores (por exemplo, o coelho), todos os fetos sero examinados para detectar alteraes dos
tecidos moles e do esqueleto. Os corpos sero preparados por dissecao cuidadosa e examinados quanto
existncia de alteraes dos tecidos moles; o exame pode incluir procedimentos adicionais para avaliao da
estrutura cardaca interna (25). Metade dos fetos ser decapitada e as cabeas removidas sero processadas para
avaliao de alteraes de tecidos moles (incluindo olhos, crebro, meatos nasais e lngua), usando mtodos
correntes de seccionamento em srie (26) ou outros mtodos de sensibilidade idntica. Os corpos dos fetos
decapitados e os restantes fetos intactos sero processados e examinados para se detectarem alteraes do
esqueleto, recorrendo a mtodos idnticos aos descritos para roedores.
2. DADOS
Os dados relativos s mes e aos seus descendentes devem ser registados individualmente e resumidos em
forma tabular, indicando, para cada grupo de ensaio, o nmero de animais no incio do ensaio, o nmero de
animais encontrados mortos durante o ensaio ou sacrificados por razes humanitrias, o momento de todas as
mortes (espontneas ou provocadas), o nmero de fmeas grvidas, o nmero de animais com sinais de
toxicidade, uma descrio dos sinais de toxicidade observados (incluindo o momento do aparecimento, a
durao e a intensidade), os tipos de observaes embrionrias/fetais e todos os dados relevantes sobre as
ninhadas.
Os resultados numricos devem ser avaliados por um mtodo estatstico apropriado, usando a ninhada como
unidade para a anlise de dados. Deve usar-se um mtodo estatstico geralmente aceite; a sua escolha deve fazer
parte do planeamento do estudo e ser devidamente justificada. Devem tambm registar-se os dados relativos a
animais que no sobreviveram at data prevista para o sacrifcio. Quando apropriado, estes dados podero ser
includos nas mdias de grupos; contudo, a sua importncia e, consequentemente, a sua incluso ou excluso
em qualquer mdia de grupo devem ser avaliadas e justificadas caso a caso.
Os dados recolhidos no Estudo de Toxicidade sobre o Desenvolvimento Pr-Natal devero ser analisados em
termos dos efeitos observados. Esta anlise dever considerar a seguinte informao:
resultados do ensaio relativos me e ao embrio/feto, incluindo uma avaliao da relao (ou da
ausncia de relao) entre a exposio dos animais substncia de ensaio e a incidncia e a gravidade de
todos os efeitos observados;
critrios usados para a categorizao das alteraes externas, dos tecidos moles e do esqueleto dos fetos,
caso tenha sido feita;
dados de controlo de estudos anteriores, quando apropriado, a fim de consolidar a interpretao dos
resultados do presente estudo;
nmeros usados no clculo de todas as percentagens ou ndices;
anlise estatstica adequada dos resultados do estudo, quando apropriado; dever incluir informao
suficiente sobre o mtodo de anlise para que um examinador/estatstico independente possa reavaliar e
reconstituir a anlise.
No caso de o estudo demonstrar a inexistncia de qualquer efeito txico, dever considerar-se a possibilidade de
realizar investigaes adicionais no sentido de definir a absoro e a biodisponibilidade da substncia de ensaio.
A finalidade do estudo de toxicidade sobre o desenvolvimento pr-natal reside na obteno de informaes
relativas aos efeitos de exposio repetida a uma substncia durante a gravidez tanto nas mes como no
desenvolvimento intra-uterino dos seus descendentes. A interpretao dos resultados deve tomar em
considerao dados de estudos subcrnicos, de reproduo e toxicocinticos, entre outros eventualmente
disponveis. O estudo enfatiza de igual modo a toxicidade geral, que pode ser avaliada pela toxicidade sobre a
me, e a toxicidade sobre o desenvolvimento. Assim, os resultados obtidos vo permitir estabelecer, at certo
ponto, a distino entre i) os efeitos sobre o desenvolvimento no associados a toxicidade geral e ii) os efeitos
sobre o desenvolvimento que apenas so induzidos em nveis que tambm so txicos para a me (27).
3. RELATRIO
RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio dever incluir as seguintes informaes especficas:
natureza fsica e, quando relevante, propriedades fsico-qumicas;
identificao, incluindo o nmero CAS, caso este seja conhecido ou esteja definido;
pureza.
Agente de transporte (se apropriado):
caso o agente de transporte no seja gua, uma justificao para a sua escolha.
Animais de ensaio:
espcie e estirpe usadas;
nmero e idade dos animais;
provenincia, condies de alojamento, dieta, etc.;
pesos individuais dos animais no incio do ensaio.
Condies de ensaio:
razes que presidiram escolha dos diferentes nveis de dose;
informao pormenorizada sobre a formulao da substncia de ensaio/preparao da dieta,
concentrao atingida, estabilidade e homogeneidade da preparao;
informao pormenorizada sobre a administrao da substncia de ensaio;
converso da concentrao da substncia de ensaio na dieta/gua de beber (ppm) para a dose real (mg/kg
de peso corporal/dia), se aplicvel;
condies ambientais;
informao pormenorizada sobre a qualidade dos alimentos e da gua.
Resultados:
Dados de resposta txica materna por dose, incluindo, entre outras informaes:
nmero de animais no incio do ensaio, nmero de animais sobreviventes, nmero de animais prenhes,
nmero de animais que abortaram, nmero de animais com parto prematuro;
dia da morte no decurso do estudo ou indicao dos animais sobreviventes no termo da experincia;
os dados relativos a animais que no sobreviveram at data prevista para o sacrifcio devem ser
includos no relatrio, mas no devem ser usados em comparaes estatsticas entre grupos;
dia da observao de cada sinal de anomalia clnica e subsequente evoluo dessa anomalia;
peso corporal, alterao do peso corporal e peso do tero grvido; opcionalmente, alterao do peso
corporal corrigida em relao ao peso do tero grvido;
consumo de alimento e consumo de gua (caso este tenha sido medido);
resultados da necropsia, incluindo o peso uterino;
devero indicar-se os valores dos NSEAO para os efeitos maternos e para os efeitos sobre o
desenvolvimento.
Desenvolvimento atingido nas ninhadas com implantes em cada nvel de dose, incluindo:
nmero de corpos amarelos;
nmero de implantaes, nmero e percentagem de fetos vivos e mortos e de reabsores;
nmero e percentagem de perdas pr e ps-implantao.
Desenvolvimento atingido nas ninhadas com fetos vivos em cada nvel de dose, incluindo:
nmero e percentagem de descendentes vivos;
proporo entre os sexos;
peso corporal fetal, de preferncia por sexo e nos dois sexos em conjunto;
malformaes externas, dos tecidos moles e do esqueleto, bem como outras alteraes relevantes;
critrios usados na categorizao, se apropriado;
nmero total e percentagem de fetos e ninhadas que apresentem qualquer alterao externa, dos tecidos
moles ou do esqueleto, bem como os tipos e incidncias de anomalias individuais e outras alteraes
relevantes.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Kavlock R.J. et al., (1996) A Simulation Study of the Influence of Study Design on the Estimation of
Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16, p. 399-410.
(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z., (1990) Proceedings of the Workshop on the Acceptability and
Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies. Fundamental and Applied Toxicology, 14, p. 386-
-398.
(3) Wong, B.A., et al., (1997) Developing Specialised Inhalation Exposure Systems to Address Toxicological
Problems. CIIT Activities, 17, p. 1-8.
(4) US Environmental Protection Agency, (1985) Subpart E-Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR
798.4350: Inhalation Developmental Toxicity Study.
(5) Salewski, E., (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen Nachweis von Implantations Stellen am
Uterusder Ratte. Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experimentelle Pathologie, 247, 367.
(6) Edwards, J.A., (1968) The external Development of the Rabbit and Rat Embryo. In Advances in Teratology.
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(7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and
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Staining Techniquefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses. Congenital Anomalies 32,
p. 381-391.
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Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology, 37, p. 476.
(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Foetuses.
Journal of Morphology 127, 291-306.
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(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in Rats: Malformations or Variations? Teratology,
8, p. 309-316.
(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD (Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal
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(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of
Skeleton and Histological Study of Viscera. Supplement to Teratology Workshop Manual, p. 163-173.
(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of appearance of Centers of Ossification in the
Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible Influence of the Sex Factor.
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(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red
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(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification of the Albino Rat (Mus Norvegicus
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(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Teratology. In Teratology: Principles and Techniques,
Wilson J.G. and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, p. 251-277.
(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977) Handbook of Teratology, Vol. 4. Plenum, NY.
(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Techniques in the Evaluation of Pesticide
Teratogenicity. Acta Vet. Acad. Sci. Hung., 28, p. 233-239.
(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mammalian Foetuses. Teratology, 9, p. 37-38.
(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting Procedure for the Detection of Anomalies in the
Rabbit Foetal Head. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, D., Merker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.).
University of Chicago, Chicago, IL, p. 126-144.
(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for Developmental Toxicity Risk Assessment.
Federal Register, 56, p. 63798-63826.
(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Abnormalities in Common Laboratory Mammals
(Version 1) Teratology, 55, p. 249-292.
B.32. TESTE DE CARCINOGNESE
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.2. DEFINIES
Nenhuma.
1.4. PRINCPIO DO MTODO DO ENSAIO
A substncia a testar administrada normalmente sete dias por semana, pela via apropriada, a vrios grupos de
animais de experincia razo de uma dose por cada grupo durante a maior parte da sua vida. Durante e
depois da exposio substncia a testar observa-se diariamente os animais de experincia, para se detectarem
sinais de toxicidade, em especial a formao de tumores.
Nenhum.
Os animais so mantidos nas condies de alojamento e alimentao da experincia durante pelo menos cinco
dias antes do teste. Antes de comear o teste os animais jovens e sos so distribudos ao acaso pelos grupos
submetidos ao tratamento e de controlo.
A espcie preferida o rato. Podem utilizar-se outras espcies (roedores ou no roedores) de acordo com
resultados de estudos anteriores. Devem utilizar-se animais jovens e sos de estirpes correntes de laboratrio e
o tratamento deve comear o mais cedo possvel aps o desmame.
um estudo de toxicidade subcrnica oral tiver constitudo a fase preliminar de um estudo a longo prazo deve
utilizar-se a mesma espcie e estirpe em ambos os estudos.
Nme r o e s e xo
No caso de roedores sero utilizados pelo menos 100 animais (50 machos e 50 fmeas) para cada dose e grupo
de controlo correspondente. As fmeas sero nulparas e no grvidas. Se estiver previsto o sacrifcio de
animais no decurso da experincia, os efectivos devem ser aumentados do nmero dos animais cujo sacrifcio
estiver previsto.
Devem utilizar-se pelo menos trs doses alm do grupo de controlo correspondente. A dose mxima dever
provocar sinais mnimos de toxicidade tais como um pequeno abrandamento da progresso do peso corporal
(menos de 10 %), sem alterar substancialmente a durao normal de vida devido a efeitos diferentes de tumores.
A dose mais baixa no dever alterar o crescimento normal, desenvolvimento e longevidade dos animais, ou
produzir qualquer manifestao de toxicidade.
A(s) dose(s) intermdia(s) ter (tero) um valor prximo da mdia entre a dose mxima e a dose mnima.
Os nveis de dose devero ter em conta os dados obtidos nos ensaios e estudos de toxicidade efectuados
anteriormente.
Normalmente a frequncia de exposio ser diria.
Se a substncia a testar for administrada na gua de beber ou incorporada na alimentao, deve estar
constantemente disponvel.
Cont r ol os
Dever utilizar-se um grupo de controlo idntico em todos os aspectos aos grupos de tratamento com
excepo da exposio substncia a testar.
Em condies especiais, como em estudos por inalao implicando o emprego de aerossis ou o uso de um
suplementar de controlo no exposto ao veculo.
As trs principais vias de administrao so a oral, cutnea e inalatria. A escolha da via de administrao
depende das caractersticas fsico-qumicas da substncia a testar e da via mais provvel de exposio humana.
Estudos por via oral
testar na dieta, dissolvida na gua de beber ou sob a forma de cpsulas.
Em condies ideais, a dose diria ser administrada sete dias por cada sete visto que a administrao em cinco
dias por cada sete pode permitir a recuperao do animal ou a diminuio da toxicidade no perodo em que o
tratamento interrompido e assim afectar os resultados e a avaliao subsequente. No entanto, por razes
essencialmente prticas a administrao em cinco dias por sete considerada aceitvel.
Estudos por via cutnea
A exposio cutnea por aplicao com pincel pode ser escolhida para simular uma via principal de exposio
humana e tambm como um modelo experimental para a induo de leses cutneas.
Estudos por inalao
Uma vez que os estudos de inalao colocam problemas tcnicos de maior complexidade do que os que usam
outras vias de administrao, so dadas aqui recomendaes mais pormenorizadas. Deve notar-se que a
instilao endotraqueal pode constituir uma alternativa vlida em certas situaes especficas.
prevista: os animais so expostos cinco dias em cada sete (exposio intermitente) razo de seis horas por dia
contnua) razo de 22 a 24 horas por dia, destinando-se uma hora por dia alimentao dos animais segundo
horrio regular e manuteno das cmaras. Em ambos os casos os animais so habitualmente expostos a uma
concentrao fixa da substncia a testar.
Uma diferena essencial entre a exposio intermitente e a exposio contnua reside no facto de na primeira os
animais disporem de um perodo de 17 a 18 horas para recuperar dos efeitos da exposio diria e mesmo de
um perodo mais longo durante os fins-de-semana. A escolha entre a exposio intermitente ou contnua ser
feita em funo dos objectivos do estudo e da exposio humana que deve ser simulada. Convm no entanto ter
em conta certas dificuldades tcnicas: por exemplo as vantagens da exposio contnua na simulao das
condies do ambiente podem ser contrariadas pela necessidade de alimentar e dar de beber aos animais e
ainda pela necessidade de tcnicas mais complicadas de produo de aerossis e de vapores, bem como de
monitorizao.
Os animais sero expostos substncia a testar em cmaras de inalao concebidas de forma a conseguir-se um
fluxo de ar dinmico de pelo menos 12 renovaes de ar por hora, uma concentrao de oxignio adequada e
idnticas quanto construo e concepo a fim de garantirem condies de exposio comparveis em todos
assegurar a estabilidade da atmosfera da cmara, o volume total dos animais de experincia no dever
i) Dbito do ar: o dbito do ar na cmara dever de preferncia ser monitorizado continuamente;
variar mais do que 15 % em redor do valor mdio. Durante toda a durao do estudo as concentraes
dirias devero ser mantidas o mais constantes possvel;
iii) Temperatura e humidade: para os roedores a temperatura deve ser mantida a 22
o
C ( 2
o
C) e a humidade
dentro da cmara ser de 30 % a 70 % excepto quando se utilizar gua para colocar a substncia a testar
em suspenso na atmosfera das cmaras. Estes parmetros sero de preferncia monitorizados
permanentemente;
iv) Anlise granulomtrica das partculas: dever efectuar-se uma repartio granulomtrica das partculas
nas atmosferas das cmaras onde se utilizem aerossis lquidos ou slidos. As partculas do aerossol
devero ter um dimetro respirvel para o animal de experincia utilizado. Sero retiradas amostras das
atmosferas das cmaras de ensaio, na zona de respirao dos animais. A amostra de ar retirada dever ser
representativa da distribuio das partculas a que os animais so expostos e representar, numa base
gravimtrica, o conjunto do aerossol em suspenso, mesmo se uma grande parte deste no for inalvel.
As anlises granulomtricas sero feitas frequentemente durante a elaborao do sistema gerador para
assegurar a estabilidade do aerossol, sendo depois feitas tantas vezes quanto as necessrias durante as
exposies para determinar de forma adequada a estabilidade das distribuies de partculas a que os
animais foram expostos.
A durao de um estudo de carcinognese compreende a maior parte da vida dos animais de experincia. O
teste deve terminar aos 18 meses no ratinho e no hamster e aos 24 meses no rato; no entanto, no caso de
algumas estirpes de animais com maior longevidade e/ou uma frequncia baixa de tumores espontneos, o fim
deveria ser aos 24 meses no ratinho e no hamster e aos 30 meses no rato. Em alternativa, aceitvel terminar
um estudo to prolongado quando o nmero de sobreviventes do grupo tratado com a dose mais baixa ou do
de controlo atingirem 25 %. Quando se terminar um teste em que exista uma diferena aparente na resposta
consoante o sexo, dever considerar-se cada sexo separadamente. Quando apenas os animais do grupo tratado
com doses mais elevadas morrerem prematuramente por razes bvias de toxicidade, no necessrio
terminar a experincia na condio que as manifestaes de toxicidade no causem problemas nos outros
grupos. Para que um resultado negativo do teste seja aceitvel preciso que, por cada grupo, no haja mais de
10 % de animais perdidos devido a autlise, canibalismo ou por condies imprprias de alojamento e que a
taxa de sobrevida em todos os grupos no seja inferior a 50 % depois de 18 meses no caso do ratinho e do
hamster e depois de 24 meses no caso do rato.
Procedimento
Obs e r v a e s
As observaes dirias dos animais em cativeiro devero incluir alteraes da pele e do plo, dos olhos e
membranas mucosas, bem como dos aparelhos respiratrio e circulatrio, dos sistemas nervosos autnomo e
central, da actividade somatomotora e do comportamento.
necessria uma observao regular dos animais para se evitar, tanto quanto possvel, a perda de animais por
causas como canibalismo, autlise dos tecidos ou condies imprprias de alojamento. Os animais
moribundos sero imediatamente removidos e autopsiados.
As manifestaes clnicas e a mortalidade de todos os animais sero registadas. Dever tomar-se especial
ateno formao de tumores; devero registar-se o momento do aparecimento, a localizao, as dimenses,
o aspecto e a progresso de todos os tumores nitidamente visveis ou palpveis.
Dever determinar-se semanalmente o consumo alimentar (e o consumo de gua, quando a substncia a testar
for administrada na gua de beber) durante as primeiras 13 semanas de estudo e depois com intervalos de cerca
de trs meses, excepto quando o estado de sade dos animais ou o seu peso corporal justificarem outra
frequncia.
O peso corporal ser determinado e registado individualmente uma vez por semana durante as 13 primeiras
semanas do teste e depois pelo menos de quatro em quatro semanas.
Exames clnicos
He ma t ol og i a
Se as observaes efectuadas durante o perodo de cativeiro indicarem uma deteriorao do estado de sade de
alguns animais durante o estudo, dever obter-se uma frmula leucocitria dos animais afectados.
Dever efectuar-se a todos os animais um esfregao de sangue aos 12 meses, 18 meses e antes do sacrifcio.
Ser efectuada uma frmula leucocitria em amostras dos animais do grupo tratado com a dose mais elevada e
dos controlos. Se estes resultados, em especial os obtidos antes do sacrifcio ou os provenientes dos exames
histopatolgicos indicarem necessidade disso, sero obtidas frmulas leucocitrias dos animais do(s) grupo(s)
tratado(s) com a dose imediatamente inferior.
Aut ps i a
Todos os animais sero submetidos a uma autpsia geral, incluindo os que morreram no decurso da
experincia ou que tenham sido sacrificados por se encontrarem moribundos. Devero ser conservados todos
os tumores ou leses nitidamente visveis e as leses suspeitas de serem tumores.
Devero ser conservados em meios adequados para um possvel exame histopatolgico ulterior os seguintes
rgos e tecidos: encfalo (incluindo cortes da medula/protuberncia, crtex cerebeloso, crtex cerebral),
hipfise, tiroideia/paratiroideias, todo o tecido tmico, traqueia e pulmes, corao, aorta, glndulas salivares,
fgado, bao, rins, supra-renais, pncreas, gnadas, tero, rgos genitais anexos, pele, esfago, estmago,
duodeno, leo, cego, clon, recto, bexiga, gnglio linftico representativo, glndula mamria na fmea,
musculatura da coxa, nervo perifrico, esterno com medula ssea, fmur (incluindo articulao), medula
espinhal a trs nveis (cervical, mediotorcico e lombar) e olhos.
A insuflao de um fixador nos pulmes e na bexiga constitui a melhor maneira de preservar estes tecidos; a
insuflao dos pulmes nos estudos de inalao essencial para um exame histopatolgico apropriado. Nos
estudos de inalao deve conservar-se toda a via respiratria, incluindo as fossas nasais, faringe e laringe.
E x a me s hi s t opa t ol g i c os
a) Sero submetidos a um exame histopatolgico completo os rgos e tecidos de todos os animais que
morrerem ou forem sacrificados durante o teste, nos grupos tratados com a dose mais elevada e de
controlo;
b) Todos os tumores nitidamente visveis ou as leses suspeitas de serem tumores devero ser examinadas
microscopicamente, em todos os grupos;
c) Se se observar uma diferena significativa na incidncia de leses neoplsicas entre o grupo tratado com a
dose mais elevada e o de controlo, devero ser efectuados exames histopatolgicos a esses rgos ou
tecidos em particular nos outros grupos;
d) Se a sobrevida no grupo tratado com a dose mais elevada for substancialmente inferior do grupo de
controlo, ento dever ser submetido a um exame completo o grupo tratado com a dose imediatamente
inferior;
e) Se no grupo exposto dose mais elevada se observar uma induo de efeitos txicos ou outros
susceptveis de afectar a resposta neoplsica, dever ser submetido a um exame completo o grupo tratado
com a dose imediatamente inferior.
2. RESULTADOS
Os resultados devero ser resumidos na forma de quadros, indicando para cada grupo da experincia o nmero
de animais no incio, o nmero de animais apresentando tumores detectados durante o teste, o momento da
deteco e o nmero de animais em que se observaram tumores na autpsia. Os resultados sero avaliados com
um mtodo estatstico adequado. Poder utilizar-se qualquer mtodo estatstico reconhecido.
3. RELATRIO
espcie, estirpe, origem, condies de ambiente, dieta,
3.1.1. Descrio do sistema de exposio:
Incluindo concepo, tipo, dimenses, fonte de ar, sistema gerador de partculas e aerossis, mtodo de
condicionamento do ar, tratamento do ar expirado e mtodo de acondicionamento dos animais na
cmara de exposio se esta for utilizada. Dever ser descrito o equipamento utilizado para indicao da
temperatura, humidade e, se necessrio, estabilidade das concentraes do aerossol e granulometria.
3.1.2. Dados relativos exposio:
Devero ser apresentados na forma de quadros indicando as mdias e uma medida de variao (por
f) Dimenses medianas das partculas (se necessrio),
incidncia dos tumores por sexo, dose e tipo de tumor,
momento da morte durante o estudo ou indicao dos animais sobreviventes,
resultados do exame hematolgico,
tratamento estatstico dos resultados e descrio dos mtodos utilizados,
4. REFERNCIAS
B.33. TESTE COMBINADO DE TOXICIDADE CRNICA/CARCINOGNESE
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.2. DEFINIES
Nenhuma.
O objectivo de um estudo combinado da toxicidade crnica/carcinognese determinar os efeitos txicos e
carcinognicos de uma substncia numa espcie mamfera, aps uma exposio prolongada.
Com este fim, o teste de carcinognese completado com, pelo menos, um grupo-satlite tratado e um grupo
satlite de controlo. A dose utilizada para o grupo satlite da dose mais elevada pode ser superior do grupo
tratado com a dose mais elevada no teste de carcinognese. Os animais no estudo de carcinognese so
examinados do ponto de vista da toxicidade geral bem como da resposta carcinognica. Os animais do grupo-
-satlite tratado so examinados do ponto de vista da toxicidade geral.
A substncia a testar administrada sete dias por semana, pela via apropriada, a vrios grupos de animais de
experincia, razo de uma dose por grupo durante a maior parte da sua vida. Durante e depois da exposio
substncia a testar observam-se diariamente os animais de experincia para se detectar manifestaes de
toxicidade e o aparecimento de tumores.
Nenhum.
Os animais so mantidos nas condies de alojamento e de alimentao da experincia, durante pelo menos
cinco dias antes do teste. Antes do incio do teste os animais jovens e sos so distribudos ao acaso pelos
grupos submetidos ao tratamento e de controlo.
A espcie preferida o rato. Podem utilizar-se outras espcies (roedores ou no roedores) de acordo com os
resultados de estudos anteriores. Devem utilizar-se animais jovens e sos de estirpes correntes de laboratrio e
o tratamento deve comear o mais cedo possvel aps de desmame.
um estudo de toxicidade subcrnica-oral tiver constitudo a fase preliminar de um estudo a longo prazo, deve
utilizar-se a mesma espcie e estirpe em ambos os estudos.
Nme r o e s e xo
No caso dos roedores sero utilizados pelo menos 100 animais (50 fmeas e 50 machos) para cada dose e
grupo de controlo correspondente. As fmeas devero ser nulparas e no grvidas. Se estiver previsto o
sacrifcio de animais no decurso da experincia os efectivos devem ser aumentados do nmero de animais cujo
sacrifcio estiver previsto.
O(s) grupo(s)-satlite(s) tratado(s) para a avaliao de efeitos patolgicos diferentes de tumores dever(devero)
conter 20 animais de cada sexo, enquanto o grupo-satlite de controlo dever conter 10 animais de cada sexo.
Para o estudo da carcinognese devem utilizar-se pelo menos trs doses, alm do grupo de controlo
correspondente. A dose mxima dever produzir manifestaes mnimas de toxicidade, como um ligeiro
decrscimo da progresso de peso (menos de 10 %) sem alterar substancialmente o tempo de vida normal
devido a efeitos diferentes de tumores.
A dose mnima no dever interferir com o crescimento normal, desenvolvimento e longevidade do animal ou
produzir qualquer efeito txico. Em geral no dever ser inferior a 10 % da dose mxima.
A(s) dose(s) intermdia(s) ter(tero) um valor prximo da mdia entre a dose mxima e a dose mnima.
Os nveis da dose devero ter em conta os dados obtidos nos ensaios e estudos de toxicidade efectuados
anteriormente.
Para o estudo de toxicidade crnica, sero includos no estudo outros grupos tratados bem como grupos-
-satlite de controlo correspondentes. A dose mxima administrada aos grupos-satlite tratados dever produzir
sinais claros de toxicidade.
A frequncia de exposio , normalmente, diria.
Se a substncia qumica for administrada na gua de beber ou incorporada na dieta deve encontrar-se
constantemente disponvel.
Cont r ol os
Dever utilizar-se um grupo de controlo idntico em todos os aspectos aos grupos tratados, com excepo da
exposio substncia a testar.
Em condies especiais como em estudos por inalao implicando o emprego de aerossis ou o uso de um
suplementar de controlo que no seja exposto ao veculo.
As trs vias principais de administrao so a oral, a cutnea e por inalao. A escolha da via de administrao
depende das caractersticas fsico-qumicas da substncia a testar e da via mais provvel de exposio humana.
Estudos por via oral
testar na dieta, dissolvida na gua de beber ou em cpsulas.
Em condies ideais, a dose diria ser administrada sete dias em cada sete, visto que a administrao em cinco
dias por cada sete pode permitir a recuperao do animal ou a diminuio de toxicidade no perodo em que o
tratamento interrompido e assim afectar os resultados e a avaliao subsequente. No entanto, por razes
essencialmente prticas, considera-se aceitvel a administrao cinco dias por semana.
Estudos por via cutnea
A exposio cutnea por aplicao com pincel na pele pode ser escolhida para simular uma via principal de
exposio humana e tambm como modelo experimental para a induo de leses cutneas.
Estudos de inalao
Uma vez que os estudos de inalao colocam problemas tcnicos de maior complexidade do que os por outras
vias de administrao, so dadas aqui recomendaes mais pormenorizadas. Deve notar-se que a instilao
endotraqueal pode constituir uma alternativa vlida em certas situaes especficas.
prevista: os animais so expostos cinco dias em cada sete (exposio intermitente) razo de seis horas por dia
contnua) razo de 22 a 24 horas por dia, destinando-se uma hora por dia alimentao dos animais,
segundo um horrio regular, e manuteno das cmaras. Em ambos os casos os animais so habitualmente
expostos a uma concentrao fixa da substncia a testar. ma diferena essencial entre a exposio intermitente e
a contnua reside no facto de na primeira os animais disporem de um perodo de 17 a 18 horas para recuperar
dos efeitos da exposio diria e mesmo de um perodo mais longo, durante os fins-de-semana.
A escolha entre a exposio intermitente ou contnua ser feita em funo dos objectivos do estudo e da
exposio humana que deve ser simulada. Convm, no entanto, ter em conta certas dificuldades tcnicas: por
exemplo, as vantagens da exposio contnua na simulao das condies do ambiente podem ser contrariadas
pela necessidade de alimentar e dar de beber aos animais e ainda pela necessidade de tcnicas mais complicadas
de produo de aerossis e de vapores bem como de monitorizao.
Os animais no expostos substncia a testar em cmaras de inalao concebidas de forma a conseguir-se um
fluxo de ar dinmico de pelo menos doze renovaes de ar por hora, uma concentrao de oxignio adequada e
idnticas quanto construo e concepo, a fim de garantirem condies de exposio comparveis em todos
assegurar a estabilidade da atmosfera da cmara, o volume total dos animais de experincia no dever
i) Dbito de ar: o dbito de ar na cmara dever, de preferncia, ser monitorizado continuamente;
variar mais do que 15 % em redor do valor mdio;
iii) Temperatura e humidade: para os roedores a temperatura deve ser mantida a 22
o
C ( 2
o
C) e a humidade
dentro da cmara ser de 30 % a 70 % excepto quando se utilizar gua para colocar a substncia testada
em suspenso na atmosfera da cmara. Estes parmetros sero, de preferncia, monitorizados
permanentemente;
iv) Anlise granulomtrica das partculas: dever efectuar-se uma distribuio granulomtrica das partculas
nas atmosferas das cmaras onde se utilizam aerossis lquidos ou slidos. As partculas do aerossol
devero ter um dimetro respirvel para o animal de experincia utilizado. Sero retiradas amostras das
atmosferas das cmaras de ensaio na zona de respirao dos animais. A amostra de ar retirada dever ser
representativa da distribuio das partculas a que os animais so expostos e representar, numa base
gravimtrica, o conjunto do aerossol em suspenso, mesmo se uma grande parte deste no for inalvel.
As anlises granulomtricas sero feitas frequentemente durante a elaborao do sistema gerador para
assegurar a estabilidade do aerossol sendo depois feitas tantas vezes quanto as necessrias durante as
exposies para determinar de forma adequada a estabilidade das distribuies de partculas a que os
animais foram expostos.
A durao da parte dedicada a carcinognese compreende a maior parte da vida dos animais de experincia. O
teste deve terminar aos 18 meses no ratinho e hamster e aos 24 meses no rato; no entanto, no caso de algumas
estirpes de animais com maior longevidade e/ou uma frequncia baixa de tumores espontneos o fim deveria
ser aos 24 meses no ratinho e no hamster e aos 30 meses no rato. Em alternativa, aceitvel terminar um
estudo to prolongado quando o nmero de sobreviventes do grupo tratado com a dose mais baixa ou do de
controlo atingirem 25 %. Quando se terminar um teste em que exista uma diferena aparente na resposta
consoante o sexo, dever considerar-se cada sexo separadamente. Quando apenas animais do grupo tratado
com a dose mais elevada morrerem prematuramente por razes bvias de toxicidade no necessrio terminar
a experincia, na condio de que as manifestaes de toxicidade no causem problemas nos outros grupos.
Para que um resultado negativo de um teste seja aceitvel preciso que, por cada grupo, no haja mais de 10 %
de animais perdidos devido a autlise, canibalismo ou problemas de manuteno e que a taxa de sobrevida em
todos os grupos no seja inferior a 50 % depois de 18 meses no caso do ratinho e do hamster e depois de
24 meses no caso do rato.
Os grupos-satlite de 20 animais tratados por sexo e os 10 animais de controlo por sexo associados, utilizados
para o teste da toxicidade crnica, devero ser conservados no estudo durante 12 meses pelo menos. Estes
animais devero ser escalados para sacrifcio para uma avaliao da patologia relacionada com a substncia a
testar, no complicada por alteraes geritricas.
Procediment
Obs e r v a e s
As observaes dirias dos animais em cativeiro devero incluir alteraes da pele e do plo, olhos e
membranas mucosas, bem como dos aparelhos respiratrio e circulatrio, dos sistemas nervosos autnomo e
central, da actividade somatomotora e do comportamento.
Os exames clnicos devero ser efectuados com intervalos adequados aos animais dos grupos satlite tratados.
necessrio uma observao regular dos animais para se evitar, tanto quanto possvel, a perda de animais por
causas como o canibalismo, autlise dos tecidos ou condies imprprias de alojamento. Os animais
moribundos sero imediatamente removidos e autopsiados.
As manifestaes clnicas, incluindo alteraes neurolgicas e oculares, bem como a mortalidade de todos os
animais, sero registadas. Dever tomar-se especial ateno formao de tumores; devero registar-se o
momento do aparecimento, a localizao, as dimenses, o aspecto e a progresso de todos os tumores
nitidamente visveis ou palpveis. O incio e a progresso das manifestaes txicas devem ser registados.
Dever determinar-se semanalmente o consumo alimentar (e o consumo de gua, quando a substncia a testar
for administrada na gua de beber), durante as primeiras 13 semanas de estudo e depois com intervalos de
cerca de trs meses, excepto quando o estado de sade dos animais ou o seu peso corporal indicarem a
necessidade de outra frequncia.
O peso corporal ser determinado e registado individualmente em todos os animais uma vez por semana
durante as 13 primeiras semanas do teste e depois pelo menos de quatro em quatro semanas.
Exames clnicos
He ma t ol og i a
Dever ser efectuado um exame hematolgico (por exemplo, concentrao de hemoglobina, hematcrito,
nmero total de eritrcitos, nmero total de leuccitos, plaquetas ou outros testes de coagulao) aos trs
meses, aos seis meses, e em seguida a intervalos de seis meses e no fim da experincia, em amostras de sangue
recolhidas de 10 ratos/sexo de cada grupo. Se possvel, as amostras deveriam ser colhidas de cada vez nos
mesmos ratos.
Se as observaes efectuadas durante o perodo de cativeiro indicarem uma deteriorao do estado de sade de
alguns animais durante o estudo, dever obter-se uma frmula leucocitria dos animais afectados. Dever obter-
-se uma frmula leucocitria em amostras de sangue dos animais do grupo tratado com a dose mais elevada e
dos controlos. Sero obtidas frmulas no(s) grupo(s) tratado(s) com doses inferiores apenas no caso de se
verificar uma grande discrepncia entre o grupo tratado com a dose mais alta e os controlos, ou se indicado
pelos achados patolgicos.
An l i s e d e ur i na
Sero colhidas amostras de urina para anlise em 10 ratos/sexo de todos os grupos; estas anlises sero feitas, se
possvel, na mesma altura dos exames hematolgicos. Devero ser efectuadas as seguintes determinaes, em
cada animal individualmente ou, no caso dos roedores, numa pool de urina do mesmo grupo e do mesmo sexo:
aspecto: volume e densidade para os animais tomados individualmente,
protenas, glicose, corpos cetnicos, sangue oculto (semiquantitativamente),
microscopia do sedimento urinrio (semiquantitativamente).
Bi oq u mi c a c l ni c a
De seis em seis meses e no fim do estudo colher-se-o amostras de sangue para determinaes bioqumicas
clnicas de todos os no roedores e a 10 ratos/sexo de todos os grupos e, se possvel, sempre dos mesmos ratos
de cada vez. Alm disso, ser recolhida uma amostra pr-teste dos no roedores. O plasma preparado a partir
destas amostras ser utilizado para as seguintes determinaes:
concentrao de protenas totais,
concentrao de albumina,
provas de funo heptica (tais como a actividade da fostatase alcalina, actividade da transaminase
glutmico-pirvica (
1
) e da transaminase glutmico-oxaloactica (
2
), gama-glutamil transpeptdase,
ornitina-descarboxilase,
metabolismo dos hidratos de carbono como uma glicmia em jejum,
testes da funo renal como a ureia sangunea.
Gr os s ne c r ops y
Full gross necropsy should be performed in all animals, including those which died during the experiment or
were sacrificed having been found in a moribund condition. Prior to sacrifice, samples of blood should be
collected from all animals for differential blood counts. All grossly visible tumours or lesions suspected of being
tumours should be preserved. An attempt should be made to correlate gross observations with the microsopic
findings.
All organs and tissues should be preserved for histopathological examination. This usually concerns the
following organs and tissues: brain (
3
) (medulla/pons, cerebellar cortex, cerebral cortex); pituitary, thyroid
(including parathyroid), thymus, lungs (including trachea), heart, aorta, salivary glands, liver (
3
), spleen,
kidneys (
3
), adrenals (
3
), oesophagus, stomach, duodenum, jejunum, ileum, caecum, colon, rectum, urinary
bladder, lymph nodes, pancreas, gonads (
3
), accessory genital organs; female mammary gland, skin,
musculature, peripheral nerve, spinal cord (cervical, thoracic, lumbar), sternum with bone marrow and femur
(including joint) and eyes.
Although inflation of lungs and urinary bladder with a fixative is the optimal way to preserve these tissues,
inflation of the lungs in inhalation studies is a necessary requirement for appropriate histopathological
examination. In special studies such as inhalation studies, the entire respiratory tract should be studied,
including nose, pharynx and larynx.
If other clinical examinations are carried out, the information obtained from these procedures should be
available before microsopic examination, because it may give significant guidance to the pathologist.
Hi s t opa t hol og y
For the chronic toxicity testing portion:
Detailed examination should be made of all preserved organs of all animals of the satellite high-dose and
control groups. Where test-substance-related pathology is found in the high-dose satellite group, target organs
of all other animals in any other treated satellite group should be subjected to full and detailed histological
examination as well as those of the heated groups in the carcinogenicity testing portion of the study at its
termination.
For the carcinogenicity testing portion:
(a) Full histopathology should be carried out on the organs and tissues of all animals that died or were
sacrificed during the test, and of all animals in the control and high-dose groups;
(
1
) Designada actualmente por transaminase da alamina.
(
2
) Designada actualmente por transaminase da aspartato.
(
3
) These organs, from 10 animals per sex per groups for rodents, should be weighed.
(b) All grossly visible tumours or lesions suspected of being tumours in all groups occurring in any organ
should be examined microscopically;
(c) If there is a significant difference in the incidence of neoplastic lesions in the high-dose and control
groups, histopathology should be carried out on that particular organ or tissue in the other groups;
(d) If the survival of the high-dose group is substantially less than the control then the next-lower dose group
should be examined fully;
(e) If there is evidence in the high-dose group of the induction of toxic or other effects that might affect a
neoplastic response, the next-lower dose level should be examined fully.
2. DATA
Data should be summarised in tabular form, showing for each test group the number of animals at the start of
the test, the number of animals showing tumours or toxic effects detected during the test, the time of detection
and the number of animals found to have tumours following sacrifice. Results should be evaluated by an
appropriate statistical method. Any recognised statistical method may be used.
3. REPORTING
3.1. TEST REPORT
The test report shall, if possible, contain the following information:
species, strain source, environmental conditions, diet,
3.1.1. Descrio do dispositivo de exposio:
incluindo concepo, tipo, dimenses, fonte de ar, sistema gerador de partculas e aerossis, mtodo de
condicionamento de ar, tratamento do ar expirado, e o modo de acondicionamento dos animais na
cmara de exposio, quando utilizada. Dever ser descrito o equipamento para a medio de
temperatura, da humidade e, se necessrio, da estabilidade da concentrao ou a granulometria das
partculas;
3.1.2. Dados relativos exposio:
Estes devero ser apresentados na forma de quadros indicando as mdias e uma medida de variao (por
f) Dimenses mdias das partculas (se necessrio);
incidncia dos tumores por sexo, dose e tipo de tumor,
momento da morte durante o estudo ou indicao dos animais sobreviventes, incluindo o grupo-satlite,
resposta txica, por sexo e por dose,
testes hematolgicos utilizados e todos os seus resultados,
testes bioqumicos clnicos empregados e todos os seus resultados (incluindo todas as anlises de urina),
tratamento estatstico dos resultados e descrio dos mtodos utilizados,
4. REFERNCIAS
B.34. TESTE DE TOXICIDADE SOBRE A REPRODUO EM UMA GERAO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.2. DEFINIES
Nenhuma.
Administra-se a substncia a testar em vrias doses graduais a vrios grupos de animais, machos e fmeas. Os
machos devero ser tratados durante o crescimento e pelo menos um ciclo espermatognico completo (cerca
de 56 dias no ratinho e 70 dias no rato) de forma a que a substncia testada provoque um efeito nocivo
eventual na espermatognese.
As fmeas da gerao progenitora (P) devero ser tratadas durante pelo menos dois ciclos do estro para permitir
que a substncia testada provoque alguns efeitos nocivos no estro. Os animais so em seguida acasalados.
Administra-se a substncia testada aos animais de ambos os sexos durante o perodo de acasalamento, e depois
unicamente s fmeas durante a gestao e o perodo de aleitamento. Se se administrar a substncia por
inalao ser necessrio modificar-se o mtodo.
Nenhum.
Preparativos
Antes do ensaio, os animais adultos jovens e sos so distribudos ao acaso pelos grupos tratados e de controlo.
Os animais so mantidos nas condies de alojamento e alimentao da experincia pelo menos durante cinco
dias antes do incio do teste. Recomenda-se a administrao da substncia a testar na alimentao ou na gua de
beber. Podem aceitar-se igualmente outras vias de administrao. Deve utilizar-se o mesmo mtodo de
administrao em todos os animais e durante toda a experincia. Se for utilizado um veculo ou outros aditivos
para facilitar a administrao devem estes ser comprovadamente isentos de efeitos txicos. O tratamento dever
ser efectuado durante os sete dias da semana.
Seleco da espcie
As espcies preferidas so o rato ou o ratinho. Devem utilizar-se animais sos, no sujeitos a experincias
anteriores. As estirpes com taxas de fecundidade baixa no devero ser utilizadas. Sero especificadas a espcie,
a estirpe, o sexo, o peso e/ou a idade dos animais de experincia.
Para avaliar a fecundidade de modo adequado devero ser estudados tanto machos como fmeas. Todos os
animais tratados e de controlo devero estar desmamados antes do incio do tratamento.
Nmero e sexo
Cada grupo tratado e cada grupo de controlo deve comportar um nmero de animais suficientes para obter
cerca de 20 fmeas grvidas de termo ou prximas deste.
O objectivo a obteno de um nmero de gestaes e de ninhadas suficientes para permitir uma avaliao
significativa do efeito da substncia sobre a fecundidade, a gestao, o comportamento maternal dos animais da
gerao P bem como o aleitamento, o crescimento e o desenvolvimento da gerao F
1
desde a concepo at ao
desmame.
Cond i e s e x pe r i me nt a i s
A alimentao e a gua sero fornecidas ad libitum. Quando as fmeas grvidas estiverem prximas do termo
devero ser colocadas em gaiolas individuais de parto ou de maternidade podendo ser-lhes fornecidos os
materiais de nidificao necessrios.
Dos e s
Devem utilizar-se pelo menos trs grupos tratados e um grupo de controlo. Se for utilizado um veculo para a
administrao da substncia a testar, o grupo de controlo dever receber o volume mximo de veculo que
tenha sido utilizado. Se uma substncia testada causar diminuio da ingesto de alimentos e da sua
assimilao, pode tornar-se necessrio um grupo de controlo negativo. Nas condies ideais, a no ser que
existam limitaes devidas natureza fsico-qumica ou efeitos biolgicos da substncia testada, a dose mxima
dever produzir um efeito txico mas no a morte dos animais progenitores (P). A(s) dose(s) intermdia(s)
dever (devero) induzir os efeitos txicos mnimos atribuveis substncia a testar e a dose mnima no dever
produzir nenhum efeito nocivo observvel nos progenitores ou na sua descendncia. Quando a substncia for
administrada por gavage ou cpsula, a dose administrada a cada animal dever ser calculada em funo do peso
corporal de cada um e ajustada semanalmente, tendo em conta modificaes desse peso. No caso das fmeas
durante a gravidez, as doses podem ser calculadas em funo do peso corporal no dia 0 ou 6, se desejado.
Te s t e l i mi t e
No caso de substncias pouco txicas, se uma dose de pelo menos 1 000 mg/kg de peso no provocar nenhuns
sinais de interferncia com a capacidade de reproduo, podem considerar-se desnecessrios estudos com
outras doses. Se um estudo preliminar da dose mxima, com toxicidade materna evidente, no mostrar efeitos
nocivos na fertilidade, podero considerar-se desnecessrios estudos com outras doses.
Procedimentos do teste
P l a no d e e x pe r i nc i a
A substncia a testar dever ser administrada diariamente aos machos progenitores (P) assim que atingirem a
idade de cinco a nove semanas depois do desmame e de um perodo de adaptao de, pelo menos, cinco dias.
Nos ratos o tratamento prosseguido durante 10 semanas antes do perodo de acasalamento (nos ratinhos
durante oito semanas). Os machos devero ser sacrificados e examinados ou no fim do perodo de
acasalamento ou em alternativa mantidos vivos prosseguindo-se com a administrao da substncia na comida,
com vista produo eventual de uma segunda ninhada, devendo neste caso ser sacrificados e examinados um
pouco antes do fim do estudo. No caso das fmeas (P) o tratamento dever comear depois de, pelo menos,
cinco dias de adaptao e ser prosseguido durante, pelo menos, duas semanas antes do acasalamento. As
fmeas P devero continuar a receber o seu tratamento dirio durante as trs semanas do perodo de
acasalamento e gestao at ao desmame dos filhos F
1
. Podero admitir-se modificaes do esquema de
administrao no caso de se disporem de outras informaes sobre a substncia testada, como a induo do
metabolismo ou bioacumulao.
P r oc e s s o d e a c a s a l a me nt o
Nos estudos de toxicidade sobre a reproduo, os acasalamentos podero ser feitos seja 1:1 (um macho com
uma fmea) seja 1:2 (um macho com duas fmeas).
No caso de um acasalamento 1:1 deve colocar-se a fmea sempre com o mesmo macho at ficar grvida ou
durante trs semanas. Devero examinar-se as fmeas todas as manhs para verificar a presena de esperma ou
de rolho vaginal. O dia 0 da gestao definido como o dia em que se verifique a presena de rolho vaginal
ou de esperma.
Os casais em que o acasalamento no tiver sucesso devem ser avaliados para determinar as causas da aparente
esterilidade.
Isto pode implicar procedimentos como novo acasalamento com animais que j tenham procriado, proceder a
um exame microscpico dos rgos de reproduo ou ao exame do ciclo do estro ou da espermatognese.
Nme r o d e a ni ma i s por ni nha d a
Permite-se que os animais usados no estudo de fertilidade dem luz normalmente e criem a sua descendncia
at ao desmame sem homogeneizao das ninhadas.
Se se fizer uma homogeneizao das ninhadas sugere-se o seguinte mtodo: entre o dia 1 e o dia 4 depois do
nascimento, o nmero de animais por ninhada pode ser ajustado eliminando-se por seleco as crias
suplementares a fim de obter, na medida do possvel, quatro fmeas e quatro machos por ninhada.
Se o nmero de machos e de fmeas no permitir obter quatro crias de cada sexo por ninhada pode aceitar-se
um ajustamento parcial (por exemplo cinco machos e trs fmeas). No so possveis ajustamentos nas
ninhadas com menos de oito crias.
Obs e r v a e s
Deve observar-se cada animal pelo menos uma vez por dia durante todo o perodo do ensaio. Devero registar-
-se as modificaes de comportamento significativas, sinais de parto difcil ou prolongado, bem como qualquer
sinal de toxicidade incluindo a mortalidade. Durante os perodos de pr-acasalamento e acasalamento deve
determinar-se diariamente o consumo alimentar. Depois do parto e durante o aleitamento dever determinar-se
o consumo alimentar (e o consumo de gua quando o teste da substncia for administrado na gua para beber)
no dia de se pesarem as crias. Os machos e fmeas progenitores devero ser pesados no primeiro dia do
tratamento e, em seguida, uma vez por semana. Estas observaes sero registadas individualmente para cada
animal adulto.
Calcula-se a durao da gestao a partir do dia 0 da gravidez. Cada ninhada dever ser examinada o mais cedo
possvel, aps o parto, para se determinar o nmero e o sexo das crias, os nado-mortos, os nado-vivos e a
presena de anomalias macroscpicas.
As crias mortas e as crias sacrificadas no dia 4 devero ser conservadas e examinadas para detectar eventuais
anomalias. Devem contar-se as crias vivas e pesar as ninhadas na manh aps o nascimento, bem como no 4.
o
e 7.
o
dias e, em seguida, semanalmente at ao fim do estudo, sendo os animais nessa altura pesados
individualmente.
Devero ser registadas as alteraes fsicas ou de comportamento nos progenitores do sexo feminino e na sua
descendncia.
P a t ol og i a
Aut ps i a
No momento do sacrifcio ou da morte, no decurso do estudo, os animais da gerao P devero ser examinados
macroscopicamente para se detectar qualquer anomalia estrutural ou alterao patolgica, dedicando-se uma
ateno especial aos rgos do aparelho reprodutor. Devem procurar-se eventuais malformaes nas crias
mortas ou moribundas.
Hi s t opa t ol og i a
Devem conservar-se para exame microscpico os ovrios, o tero, o colo uterino, a vagina, os testculos, os
epiddimos, as vesculas seminais, a prstata, a glndula coagulante, a hipfise e o(s) rgo(s)-alvo de todos os
animais P. No caso de estes rgos no terem sido examinados noutros estudos com doses repetidas, devero
ser feitos exames histolgicos a todos os animais do grupo tratados com dose mais elevada, do grupo de
controlo e aos animais mortos durante o estudo, quando tal for praticvel.
Os rgos que apresentarem alteraes nestes animais sero tambm examinados em todos os outros animais
P. Neste caso dever efectuar-se um exame microscpico de todos os tecidos que apresentarem alteraes
patolgicas macroscpicas. Como foi j sugerido no procedimento para o acasalamento, os rgos
reprodutores dos animais suspeitos de esterilidade podero ser submetidos a um exame microscpico.
2. RESULTADOS
Os resultados podem ser resumidos em quadros, indicando para cada grupo experimental o nmero de animais
no incio do estudo, o nmero de machos frteis, o nmero de fmeas grvidas, os diversos tipos de alteraes,
e a percentagem de animais apresentando cada tipo de alterao.
Se possvel, os resultados numricos devero ser avaliados com um mtodo estatstico apropriado. Pode ser
utilizado qualquer mtodo estatstico reconhecido.
3. RELATRIO
O relatrio do teste dever tambm incluir as seguintes informaes:
espcie/estirpe utilizada,
resposta txica por sexo e por dose, incluindo fertilidade, gestao e viabilidade,
momento da morte no decurso do estudo ou indicao dos animais sobreviventes no fim do estudo,
quadro apresentando os pesos de cada ninhada, o peso mdio das crias e os pesos individuais das crias no
fim do estudo,
efeito txico ou outro sobre a reproduo, a descendncia e o crescimento ps-natal,
dia da observao de qualquer manifestao anormal e sua evoluo subsequente,
peso corporal dos animais P,
descrio pormenorizada das observaes microscpicas,
tratamento estatstico dos resultados, se necessrio,
4. REFERNCIAS
B.35. ESTUDO DE TOXICIDADE SOBRE A REPRODUO EM DUAS GERAES
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O presente mtodo de ensaio de toxicidade sobre a reproduo em duas geraes destina-se a fornecer
informao geral sobre os efeitos de uma substncia de ensaio na integridade e no desempenho dos sistemas
reprodutores de machos e fmeas, incluindo a funo gonadal, o ciclo do estro, o comportamento de
acasalamento, a concepo, a gestao, a parturio, a lactao e o desmame, bem como sobre o crescimento e
o desenvolvimento dos descendentes. O estudo pode tambm dar informaes sobre os efeitos da substncia de
ensaio na morbidade e na mortalidade neonatais e fornecer dados preliminares relativos toxicidade sobre o
desenvolvimento pr-natal e ps-natal, podendo ainda servir de guia para ensaios subsequentes. Alm de
estudar o crescimento e o desenvolvimento da gerao F
l
, este mtodo de ensaio destina-se tambm a avaliar a
integridade e o desempenho dos sistemas reprodutores dos machos e fmeas dessa gerao, bem como o
crescimento e o desenvolvimento da gerao F
2
. Caso seja necessrio obter informaes suplementares relativas
toxicidade sobre o desenvolvimento e s deficincias de desempenho, o presente protocolo pode ser
complementado pela introduo de partes de outros estudos descritos em mtodos para avaliar a toxicologia
sobre o desenvolvimento e/ou a neurotoxicidade sobre o desenvolvimento, conforme o caso; em alternativa,
aqueles tpicos podem ser investigados em estudos independentes, com recurso aos mtodos de ensaio
adequados.
A substncia de ensaio administrada em doses graduais a vrios grupos de machos e fmeas. Os machos da
gerao P devem ser tratados durante o crescimento e durante pelo menos um ciclo espermatognico completo
(cerca de 56 dias no ratinho e 70 dias no rato), de forma a permitir a deteco de quaisquer efeitos nocivos na
espermatognese. Os efeitos sobre os espermatozides so determinados por uma srie de parmetros (por
exemplo, morfologia e mobilidade) e por exame histopatolgico detalhado de preparaes de tecidos. Caso
tenham sido previamente realizados estudos de dose repetida de durao adequada (por exemplo, um estudo de
90 dias) que forneam dados sobre a espermatognese, no ser necessrio incluir os machos da gerao P na
avaliao. No entanto, recomenda-se que sejam guardadas amostras ou gravaes digitais do esperma da
gerao P para possibilitar uma avaliao posterior. As fmeas da gerao P devem ser tratadas durante o
crescimento e durante vrios ciclos estrais completos, para permitir a deteco de quaisquer efeitos adversos
causados pela substncia de ensaio na normalidade do ciclo do estro. A substncia de ensaio administrada aos
animais progenitores (P) durante o acasalamento, durante os perodos de gravidez resultantes e at ao desmame
da descendncia F
1
. Nesta altura, a substncia de ensaio passa a ser administrada aos descendentes F
1
, que a
devero receber durante o crescimento at idade adulta, o acasalamento e a produo da gerao F
2
, at ao
desmame da gerao F
2
.
Todos os animais devem ser objecto de observaes clnicas e exames patolgicos para se detectarem sinais de
toxicidade, devendo dedicar-se ateno especial aos efeitos sobre a integridade e o desempenho dos sistemas
reprodutores masculino e feminino, bem como aos efeitos sobre o crescimento e o desenvolvimento da
descendncia.
1.3.1. Seleco da espcie animal
A espcie preferida para ensaio o rato. Caso se utilizem outras espcies, ser necessrio justificar o seu
emprego e introduzir no mtodo de ensaio as modificaes apropriadas. Deve evitar-se a utilizao de estirpes
de fecundidade baixa ou em que se verifique frequentemente uma incidncia elevada de deficincias de
desenvolvimento. No incio do estudo, a diferena de peso entre os animais dever ser mnima, no podendo
ultrapassar 20 % do peso mdio de cada sexo.
o
C ( 3
o
dever ser de 50 %-60 %, embora sejam aceitveis valores entre um mnimo de 30 % e um mximo que,
preferivelmente, no dever exceder 70 %, salvo durante os perodos de limpeza do compartimento. A
iluminao deve ser artificial, com sequncias de 12 horas de luz e 12 horas de escurido. A alimentao pode
basear-se em dietas de laboratrio convencionais, com fornecimento ilimitado de gua para beber. Quando a
substncia de ensaio for administrada pela alimentao, a escolha da dieta poder ser condicionada pela
necessidade de assegurar a dosagem adequada.
Os animais podem ser alojados individualmente ou em pequenos grupos do mesmo sexo. O acasalamento deve
ocorrer em gaiolas adequadas para o efeito. Quando houver sinais de cpula, as fmeas acasaladas devem ser
colocadas em gaiolas individuais de parto ou de maternidade. Em alternativa, os ratos acasalados podem ser
mantidos em grupos pequenos, separando-se apenas um ou dois dias antes do parto. As fmeas grvidas
prximas do termo devem dispor dos materiais de nidificao apropriados e reconhecidos.
Devem usar-se animais jovens e saudveis, que tenham permanecido nas condies experimentais durante pelo
menos cinco dias antes do ensaio para aclimatao e que no tenham sido sujeitos a experincias anteriores. Os
animais de ensaio devem ser caracterizados no que respeita espcie, estirpe, provenincia, sexo, peso e/ou
idade. Devem conhecer-se as relaes de parentesco directo entre os animais, de modo a evitar o acasalamento
entre irmos. Os animais devem ser distribudos ao acaso pelos grupos de controlo e de tratamento
(recomenda-se a estratificao por peso corporal). As gaiolas devem ser dispostas de forma a minimizar
possveis efeitos derivados do seu posicionamento. Cada animal deve receber um nmero de identificao
individualizado. Estes procedimentos devem ser levados a efeito antes do incio da dosagem dos animais da
gerao P e por ocasio do desmame dos animais da gerao F
1
seleccionados para acasalamento. Devem
manter-se registos da ninhada de origem de todos os animais seleccionados da gerao F
1
. Quando o ensaio
envolve pesagem individual das crias ou quaisquer testes de desempenho, as crias devem ser identificadas
individualmente o mais cedo possvel depois do nascimento.
No incio da dosagem, os animais progenitores (P) devem ter cerca de cinco a nove semanas de idade. Os
animais de todos os grupos de ensaio devero ser, tanto quanto possvel, uniformes quanto ao peso e idade.
1.4. PROCEDIMENTO
Cada grupo de ensaio e controlo deve comportar um nmero de animais suficiente para que se obtenham
preferivelmente 20 ou mais fmeas grvidas de termo ou prximas deste. Nos casos em que se utilizem
substncias que causam efeitos indesejveis relacionados com o tratamento (por exemplo, esterilidade,
toxicidade excessiva na dose mais elevada), poder no ser possvel cumprir este requisito. O objectivo a
obteno de um nmero de fmeas grvidas suficiente para garantir uma avaliao significativa do potencial da
substncia para afectar a fecundidade, a gravidez e o comportamento maternal, bem como o aleitamento, o
crescimento e o desenvolvimento da prole F
1
, desde a concepo at maturidade, e o desenvolvimento da sua
descendncia (F
2
) at ao desmame. Por esse motivo, a impossibilidade de obter o nmero desejado de animais
prenhes (isto , 20) no invalida necessariamente o estudo e deve ser avaliada caso a caso.
Recomenda-se que a substncia de ensaio seja administrada oralmente (atravs da alimentao, na gua de
beber ou por gavage), excepto nos casos em que se considere mais apropriado utilizar outra via de
administrao (por exemplo, aplicao cutnea ou inalao).
Se for necessrio, a substncia de ensaio pode ser dissolvida ou suspensa num agente de transporte apropriado.
Recomenda-se que, sempre que possvel, seja considerada em primeiro lugar a utilizao de uma soluo/
/suspenso aquosa; caso tal no seja vivel, pode considerar-se o uso de uma soluo/emulso em leo (por
exemplo, leo de milho); em ltima instncia, poder eventualmente recorrer-se ao uso de solues noutros
agentes de transporte. Devem conhecer-se as caractersticas txicas dos agentes de transporte que no sejam a
gua. Deve determinar-se a estabilidade da substncia de ensaio no agente de transporte.
1.4.3. Dosagem
Devem utilizar-se pelo menos trs nveis de dose e um controlo simultneo. A escolha do nvel de dose
mximo deve ter como objectivo produzir um efeito txico, mas no a morte ou sofrimento forte, salvo se
existirem limitaes impostas pela natureza fsico-qumica ou pelas propriedades biolgicas da substncia de
ensaio. Normalmente, consideram-se aceitveis estudos com mortalidade inesperada, desde que a taxa de
mortalidade dos animais progenitores (P) seja inferior a cerca de 10 %. Deve seleccionar-se uma sequncia
descendente de nveis de dose que permita detectar qualquer efeito relacionado com a dosagem e determinar o
nvel sem efeitos adversos observveis (NSEAO). Em muitos casos, a melhor forma de estabelecer estas
sequncias consiste no espaamento das doses em srie geomtrica, usando factores de dois ou de quatro. A
adio de um quarto grupo de ensaio muitas vezes prefervel ao uso de intervalos muito grandes entre as
dosagens (ou seja, com um factor superior a 10). Quando a substncia de ensaio administrada na alimentao,
o espaamento entre as doses no deve ser superior a um factor de trs. A escolha dos nveis de dose dever
considerar todos os dados de toxicidade existentes, em especial os resultados de estudos de dose repetida,
devendo ainda levar em conta quaisquer informaes relativas ao metabolismo e cintica d substncia de
ensaio ou de substncias relacionadas. Estas informaes podero tambm ser usadas para demonstrar a
adequao do regime de dosagem.
O grupo de controlo deve ser um grupo no sujeito a tratamento ou, se for usado um agente de transporte para
administrar a substncia de ensaio, um grupo de controlo do agente de transporte. Os animais do grupo de
controlo devem ser tratados da mesma maneira que os animais dos grupos de ensaio, com excepo do
tratamento com a substncia de ensaio. Se for usado um agente de transporte, o grupo de controlo dever
receber o volume mximo de agente de transporte utilizado no ensaio. Se a substncia de ensaio for
administrada na alimentao e causar uma diminuio da ingesto de alimentos e da sua assimilao, poder
ser necessrio utilizar um grupo de controlo negativo (submetido ao mesmo regime alimentar reduzido); em
alternativa, podero usar-se os dados de estudos controlados destinados a avaliar os efeitos da diminuio do
consumo de alimento nos parmetros reprodutores.
Devero ser tomadas em considerao as seguintes caractersticas do agente de transporte e outros aditivos:
efeitos na absoro, distribuio, metabolismo ou reteno da substncia de ensaio; efeitos nas propriedades
qumicas da substncia de ensaio susceptveis de alterar as suas caractersticas txicas; e efeitos no consumo de
alimentos, na ingesto de gua ou no estado nutricional dos animais.
Se um estudo com um nvel de dose oral de pelo menos 1 000 mg/kg de peso corporal/dia (ou uma
percentagem equivalente nos alimentos ou na gua de beber, caso se recorra a um destes tipos de
administrao), realizado de acordo com os procedimentos descritos neste estudo, no provocar efeitos txicos
observveis nos animais progenitores nem na sua prole e se, para alm disso, os dados existentes sobre
compostos estrutural e/ou metabolicamente relacionados com a substncia de ensaio no sugerirem a possvel
ocorrncia de toxicidade, poder considerar-se desnecessrio realizar um ensaio completo com vrios nveis de
dose. O ensaio-limite sempre vlido, excepto nos casos em que se preveja exposio humana e em que seja
necessrio testar um nvel de dose oral mais elevado. Quando se usam outras formas de administrao, como
inalao ou aplicao cutnea, as propriedades fsico-qumicas da substncia de ensaio (por exemplo, a
solubilidade) so muitas vezes indicativas e limitantes do nvel mximo de exposio praticvel.
Os animais devem ser tratados com a substncia de ensaio durante os sete dias da semana. A forma de
administrao preferida a via oral (alimentao, gua de beber ou gavage). Se for usada outra via de
administrao, devero ser indicadas as razes subjacentes sua escolha; neste caso, poder ser necessrio
introduzir modificaes apropriadas no mtodo de ensaio. Deve utilizar-se o mesmo mtodo de administrao
em todos os animais durante o perodo experimental apropriado. A administrao por gavage deve ser feita
com uma sonda gstrica. O volume de lquido administrado numa toma no deve exceder 1 ml/100 g de peso
corporal (o volume mximo para leo de milho de 0,4 ml/100 g de peso corporal); exceptuam-se as solues
aquosas, que podem ser administradas na proporo de 2 ml/100 g de peso corporal. Deve minimizar-se a
variabilidade do volume de ensaio efectuando ajustes nas concentraes, de forma a assegurar a constncia do
volume em todos os nveis de dose; exceptuam-se os casos em que se utilizam substncias irritantes ou
corrosivas, que normalmente exercem efeitos exacerbados quando aplicadas em concentraes mais elevadas.
Normalmente, nos estudos com administrao por gavage, as crias amamentadas s recebem a substncia de
ensaio de forma indirecta, atravs do leite; a dosagem directa inicia-se apenas na altura do desmame. Nos
estudos em que a substncia de ensaio administrada na alimentao ou na gua de beber, as crias podem
receber uma quantidade adicional da substncia de ensaio quando, na ltima semana do perodo de lactao,
comeam a comer por si prprias.
importante assegurar que as quantidades de substncia de ensaio administradas atravs da alimentao ou da
gua de beber no interferem nas exigncias normais de nutrio ou de consumo de gua. Quando a substncia
de ensaio for incorporada na alimentao, pode utilizar-se uma concentrao alimentar constante (ppm) ou,
alternativamente, um nvel de dose constante em relao ao peso corporal dos animais; deve especificar-se o
mtodo escolhido para o ensaio. No caso de uma substncia administrada por gavage, a dose deve ser
administrada todos os dias mesma hora, devendo ser ajustada pelo menos uma vez por semana a fim de se
manter uma dose constante em relao ao peso corporal do animal; estes ajustes devero ser feitos tendo em
conta os dados relativos distribuio placentria.
1.4.6. Plano da experincia
A substncia de ensaio comea a ser administrada diariamente aos machos e fmeas progenitores (P) ao
atingirem entre cinco e nove semanas de idade. A dosagem diria dos machos e fmeas F
1
deve comear na
altura do desmame; importa ter presente que, quando a substncia de ensaio administrada atravs da
alimentao ou na gua de beber, pode ocorrer exposio directa das crias da gerao F
1
substncia de ensaio
durante o perodo de lactao. O tratamento de ambos os sexos das geraes P e F
1
deve decorrer durante pelo
menos 10 semanas antes do acasalamento, prosseguindo nas duas semanas do perodo de acasalamento. Os
machos devem ser sacrificados e examinados quando deixam de ser necessrios para avaliao de efeitos sobre
o aparelho reprodutor. A dosagem das fmeas progenitoras (P) deve continuar durante a gravidez,
prolongando-se at ao desmame da prole F
1
. O esquema de administrao poder ser modificado com base em
informaes relativas substncia de ensaio, incluindo dados sobre toxicidade, induo de metabolismo ou
bioacumulao. Normalmente, a dose a administrar a cada animal calculada com base na determinao mais
recente do seu peso corporal. No entanto, o ajuste das doses durante o ltimo tero da gravidez deve ser feito
com precauo.
O tratamento dos machos e fmeas P e F
1
deve continuar at ao momento do sacrifcio. Todos os machos e
fmeas adultos P e F
1
devem ser sacrificados quando deixarem de ser necessrios para avaliao de efeitos sobre
a reproduo. Os animais da descendncia F
l
no seleccionados para acasalamento e todos os descendentes F
2
devero ser sacrificados aps o desmame.
1.4.7. Processo de acasalamento
1.4.7.1. Acasalamento dos progenitores (P)
Para o acasalamento, cada fmea deve ser colocada juntamente com um nico macho pertencente ao mesmo
nvel de dosagem (acasalamento 1:1) at que ocorra cpula ou tenham decorrido duas semanas. As fmeas
devem ser examinadas diariamente para verificar a presena de esperma ou um rolho vaginal. Considera-se o
dia 0 de gravidez aquele em que se observa um rolho vaginal e/ou esperma. Quando a tentativa de
acasalamento for mal sucedida, poder tentar-se um novo acasalamento das fmeas com machos do mesmo
grupo comprovadamente aptos a procriar. Os pares acasalados devem ser identificados nos dados do ensaio de
forma inequvoca. Deve evitar-se o acasalamento entre irmos.
1.4.7.2. Acasalamento de F
1
Para o acasalamento da descendncia F
1
e produo da gerao F
2
, devem seleccionar-se pelo menos um macho
e uma fmea de cada ninhada, em altura de desmame, para acasalamento com outras crias pertencentes ao
mesmo nvel de dose mas provenientes de ninhadas diferentes. A seleco das crias de cada ninhada deve ser
feita de forma aleatria, desde que no se verifiquem diferenas significativas no peso corporal ou na aparncia
dos animais. Caso se observem essas diferenas, devem seleccionar-se os animais mais representativos de cada
ninhada. Embora a forma mais correcta de seleco seja aquela que se baseia no peso corporal, em
determinadas circunstncias poder ser mais conveniente recorrer aparncia. A descendncia F
1
s deve
acasalar depois de ter atingido a maturidade sexual completa.
Os casais sem descendncia devem ser avaliados para determinar as causas da aparente esterilidade. Esta
avaliao pode envolver novas tentativas de acasalamento com outros machos ou fmeas comprovadamente
aptos a procriar, o exame microscpico dos rgos reprodutores e a observao dos ciclos do estro ou da
espermatognese.
1.4.7.3. Segundo acasalamento
Em determinadas circunstncias, tais como situaes em que se verifiquem alteraes na dimenso da ninhada
relacionadas com o tratamento ou em que se observe um efeito ambguo no primeiro acasalamento,
recomenda-se que os adultos P ou F
1
acasalem de novo para produzir uma segunda ninhada. O segundo
acasalamento de fmeas ou machos que no tenham produzido ninhadas dever ser feito com reprodutores
comprovados do sexo oposto. Se numa das geraes for estritamente necessrio produzir uma segunda
ninhada, os animais devem acasalar novamente cerca de uma semana depois do desmame da ltima ninhada.
1.4.7.4. Dimenso das ninhadas
Os animais devem poder parir normalmente e criar os seus descendentes at ao desmame. A uniformizao do
tamanho das ninhadas opcional; caso seja feita, deve descrever-se pormenorizadamente o mtodo usado.
1.5. OBSERVAES
1.5.1. Observaes clnicas
Deve efectuar-se diariamente uma observao clnica geral; nos casos em que a dose administrada por gavage,
a escolha do momento da observao deve tomar em considerao o perodo de efeitos mximos previsto que
se verifica aps a administrao da dose. Devem registar-se quaisquer modificaes de comportamento, sinais
de parto difcil ou prolongado e todos os sinais de toxicidade. Dever efectuar-se uma inspeco adicional mais
pormenorizada de cada animal pelo menos uma vez por semana, que por convenincia poder coincidir com o
momento da pesagem. Para alm disso, cada animal deve ser observado duas vezes por dia (ou uma vez por dia
durante o fim-de-semana, quando for conveniente) para avaliar morbidade e mortalidade.
1.5.2. Peso corporal e consumo de alimento/gua dos animais progenitores
Os animais progenitores (P e F
1
) devem ser pesados no primeiro dia de tratamento e, em seguida, pelo menos
uma vez por semana. O peso das fmeas progenitoras (P e F
1
) deve ser determinado, no mnimo, nos dias 0, 7,
14 e 20 ou 21 da gestao, durante a lactao (nos dias coincidentes com a pesagem das crias) e no dia do
sacrifcio. Estas observaes devem ser registadas individualmente para cada animal adulto. Durante os
perodos de pr-acasalamento e gestao, o consumo de alimento deve ser medido pelo menos semanalmente.
Se a substncia de ensaio for administrada na gua, o consumo de gua deve ser determinado pelo menos uma
vez por semana.
1.5.3. Ciclo do estro
A durao e a normalidade do ciclo do estro nas fmeas P e F
1
so avaliadas por observao de esfregaos
vaginais obtidos antes do acasalamento, durante o acasalamento (opcional) e at existirem evidncias de cpula.
A remoo de clulas vaginais/cervicais deve ser feita cuidadosamente, de modo a evitar o distrbio da mucosa
e a subsequente induo de uma gravidez fictcia (1).
1.5.4. Parmetros dos espermatozides
No momento do sacrifcio, dever registar-se o peso dos testculos e do epiddimo de todos os machos P e F
1
aps o sacrifcio. Deve reservar-se um exemplar de cada tipo de rgo para exame histopatolgico (ver
seces 1.5.7 e 1.5.8.1). Para a contagem de espermatdios e de espermatozides das reservas do conduto
epididimrio resistentes a homogeneizao, devero usar-se, respectivamente, os testculos e os epiddimos de
subgrupos de pelo menos 10 machos de cada grupo P e F
1
. Deve colher-se o esperma do conduto epididimrio
ou do canal deferente dos animais desses subgrupos para avaliar a mobilidade e a morfologia dos
espermatozides. Se forem detectados efeitos relacionados com o tratamento ou se estudos anteriores
indicarem possveis efeitos na espermatognese, devero analisar-se os espermatozides de todos os machos de
cada grupo de dose; caso contrrio, a contagem pode restringir-se aos machos P e F
1
dos grupos de controlo e
de dose mxima.
Deve proceder-se contagem do nmero total de espermatdios testiculares e de espermatozides do conduto
epididimrio resistentes a homogeneizao (2) (3). O nmero de espermatozides das reservas do conduto
pode ser determinado considerando o volume e a concentrao de esperma na suspenso usada para a anlise
qualitativa e efectuando a contagem de espermatozides aps macerao e/ou homogeneizao do restante
tecido do conduto. As contagens devem ser feitas nos subgrupos de machos seleccionados de todos os grupos
de dosagem e ser levadas a efeito imediatamente aps o sacrifcio dos animais, excepto se forem feitas gravaes
de vdeo ou digitais ou se os animais forem congelados para anlise posterior. Nestes casos, podem analisar-se
primeiro os grupos de controlo e de dose mxima; se no se observarem efeitos relacionados com o tratamento
(por exemplo, efeitos na contagem, mobilidade ou morfologia dos espermatozides), no ser necessrio
avaliar os restantes grupos de dose; caso contrrio, devero analisar-se tambm os grupos de dosagem inferior.
A mobilidade dos espermatozides do epiddimo (ou do canal deferente) deve ser analisada ou gravada em
vdeo imediatamente aps o sacrifcio. O esperma deve ser retirado o mais rapidamente possvel, enquanto os
danos so mnimos; seguidamente, deve ser diludo para uma anlise de mobilidade usando mtodos aprovados
(4). A determinao da percentagem de espermatozides progressivamente mveis poder ser tanto subjectiva
como objectiva. Quando se realiza uma anlise de mobilidade assistida por computador (5) (6) (7) (8) (9) (10), a
determinao da mobilidade progressiva baseia-se em valores crticos definidos pelo utilizador em relao
velocidade mdia e rectitude da trajectria, ou ndice linear. Se existirem gravaes em vdeo de amostras (11)
ou outras imagens obtidas durante a necropsia, pode efectuar-se posteriormente a anlise dos machos P e F
1
dos grupos de controlo e de dose mxima. Se no se observarem efeitos relacionados com o tratamento, ser
desnecessrio avaliar os restantes grupos de dose; caso contrrio, devero analisar-se tambm os grupos de
dosagem inferior. Caso no existam imagens de vdeo ou digitais, todas as amostras de todos os grupos de
tratamento devem ser analisadas no momento da necropsia.
Deve efectuar-se a anlise morfolgica de uma amostra de espermatozides epididimrios (ou do canal
deferente). Depois de fixados, os espermatozides (pelo menos 200 por amostra) so examinados em
preparaes hmidas (12) e classificados como normais ou anormais. As anomalias morfolgicas em
espermatozides incluem fuso, cabeas isoladas e ausncia de cabeas e/ou de caudas. A avaliao deve ser
feita nos subgrupos de machos seleccionados de todos os grupos de dose, quer imediatamente aps o sacrifcio
dos animais, quer posteriormente, usando gravaes de vdeo ou digitais. Depois de fixados, os esfregaos
podem tambm ser guardados para anlise posterior. Nestas situaes, podem analisar-se primeiro os grupos
de controlo e de dose mxima. Se no se observarem efeitos relacionados com o tratamento (por exemplo,
efeitos na morfologia dos espermatozides), no ser necessrio analisar os restantes grupos de dose; caso
contrrio, devero analisar-se tambm os grupos de dosagem inferior.
Caso um dos parmetros de avaliao de espermatozides acima mencionados tenha sido examinado
anteriormente num estudo sistmico de toxicidade de pelo menos 90 dias, poder considerar-se desnecessrio
repetir a sua avaliao no estudo em duas geraes. Recomenda-se, no entanto, que se guardem amostras ou
gravaes digitais de espermatozides da gerao P para possibilitar uma avaliao posterior, caso esta venha a
ser necessria.
1.5.5. Descendncia
Cada ninhada deve ser examinada o mais cedo possvel aps o parto (dia 0 de lactao) para se determinar o
nmero e o sexo das crias, os nados-mortos, os nados-vivos e a presena de anomalias macroscpicas. Caso
no se encontrem maceradas, as crias encontradas mortas no dia 0 devem ser examinadas para determinar
eventuais malformaes e a causa da morte; estes animais devem manter-se conservados. As crias vivas devem
ser contadas e pesadas individualmente no momento do nascimento (dia 0 de lactao) ou no dia 1; a partir da,
os pesos devem ser avaliados em dias regulares de pesagem, por exemplo, nos dias 4, 7, 14 e 21 de lactao.
Devem registar-se as alteraes fsicas ou de comportamento observadas nas mes ou nos descendentes.
A avaliao do desenvolvimento fsico da descendncia deve basear-se principalmente no aumento do peso
corporal. Outros parmetros fsicos (por exemplo, abertura dos olhos e ouvidos, erupo dos dentes,
crescimento de plo) podero dar informaes suplementares. No entanto, estes dados devero ser
considerados preferencialmente no contexto da maturao sexual (por exemplo, idade e peso corporal no
momento da abertura vaginal ou da separao blano-prepucial) (13). Devem efectuar-se avaliaes de
desempenho (por exemplo, actividade motora, funo sensorial e ontogenia dos reflexos) da descendncia F
1
antes e/ou depois do desmame, dedicando especial ateno aos aspectos relacionados com a maturao sexual,
caso no tenham sido includas em estudos independentes. Deve determinar-se a idade da abertura vaginal e da
separao do prepcio nos animais recm-desmamados seleccionados para acasalamento. Se forem detectadas
alteraes na proporo entre os sexos ou no tempo de maturao sexual dos animais F
1
, dever medir-se a
distncia anogenital das crias F
2
no dia 0 ps-natal.
As observaes de desempenho podero ser omitidas em grupos que revelem claramente outros sinais de
efeitos adversos (por exemplo, um decrscimo significativo na progresso do peso, etc.). Caso se realizem, as
avaliaes de desempenho no devem ser efectuadas em crias seleccionadas para acasalamento.
1.5.6. Necropsia macroscpica
Todos os animais progenitores (P e F
1
), bem como todas as crias apresentando anomalias externas ou sinais
clnicos e uma cria seleccionada aleatoriamente das geraes F
1
e F
2
, escolhida ao acaso quanto ao sexo e
ninhada de origem, devem ser analisados macroscopicamente no momento do sacrifcio ou da morte no
decurso do estudo para se detectar qualquer anomalia estrutural ou alterao patolgica; dever dedicar-se uma
ateno especial aos rgos do aparelho reprodutor. Caso no se encontrem maceradas, as crias sacrificadas, em
estado moribundo ou encontradas mortas devem ser examinadas para se determinarem eventuais
malformaes e/ou a causa da morte; estes animais devem manter-se conservados.
Devem examinar-se os teros de todas as fmeas primparas a fim de se detectarem a presena e o nmero de
locais de implantao; este exame dever ser feito de forma a no comprometer a avaliao histopatolgica.
1.5.7. Pesagem dos rgos
No momento do sacrifcio, dever determinar-se o peso do corpo e dos seguintes rgos de todos os animais
progenitores P e F
1
(os rgos pares devem ser pesados individualmente):
tero, ovrios,
testculos, epiddimo (total e conduto),
prstata,
vesculas seminais, glndulas coagulantes e respectivos fluidos e prstata (como uma unidade),
crebro, fgado, rins, bao, glndula pituitria, tiride, glndulas supra-renais e rgos-alvo conhecidos.
Devem determinar-se os pesos corporais terminais das crias F
1
e F
2
seleccionadas para necropsia, devendo ainda
pesar-se o crebro, o bao e o timo de uma cria seleccionada aleatoriamente quanto ao sexo e ninhada de
origem (ver seco 1.5.6).
Sempre que possvel, a avaliao dos resultados da necropsia macroscpica e da pesagem de rgos dever ser
efectuada tendo em conta os dados de outros estudos de dose repetida.
1.5.8. Histopatologia
1.5.8.1. Animais progenitores
Devem ser fixados e conservados em meio adequado para exame histopatolgico os seguintes rgos e tecidos
de animais progenitores (P e F
1
) (ou amostras representativas):
vagina, tero com colo e ovrios (preservados em fixador adequado);
um testculo (preservado em fixador de Bouin ou equivalente), um epiddimo, vesculas seminais, prstata
e glndula coagulante;
rgo(s)-alvo previamente identificado(s) de todos os animais P e F
1
seleccionados para acasalamento.
Sero objecto de um exame histopatolgico completo os rgos e tecidos conservados acima mencionados de
todos os animais P e F
1
dos grupos de controlo e de dose mxima seleccionados para acasalamento. A
inspeco dos ovrios dos animais P opcional. Sero examinados os rgos que apresentem alteraes
relacionadas com o tratamento dos animais dos grupos de doses mdia e baixa, a fim de auxiliar a
determinao do NSEAO. Adicionalmente, dever efectuar-se a avaliao histopatolgica dos rgos
reprodutores de animais dos grupos de dose mdia e baixa suspeitos de fertilidade reduzida (por exemplo,
animais com insucesso no acasalamento, concepo, gerao ou parto de uma descendncia saudvel, ou
animais com alteraes nos ciclos do estro ou no nmero, mobilidade ou morfologia dos espermatozides).
Devero examinar-se todas as leses macroscpicas, tais como atrofias ou tumores.
Os testculos devem ser objecto de um exame histopatolgico pormenorizado (por exemplo, usando fixador de
Bouin, incluso em parafina e seces transversais com 4-5m de espessura) a fim de se detectarem efeitos
relacionados com o tratamento, tais como reteno de espermatdios, ausncia de camadas ou tipos de clulas
germinais, clulas gigantes multinucleadas ou perda de clulas espermatognicas para o lmen (14). O exame
do epiddimo intacto deve abranger a cabea, o corpo e o conduto e pode efectuar-se por observao de uma
seco longitudinal. A anlise do epiddimo destina-se a detectar infiltrao de leuccitos, alterao na
prevalncia de tipos de clulas, tipos de clulas aberrantes e fagocitose de espermatozides. Os rgos
reprodutores masculinos podem ser examinados recorrendo ao uso de PAS (cido p-aminossaliclico) e
colorao com hematoxilina.
Os ovrios no perodo ps-lactao devem conter folculos primordiais e folculos em crescimento, bem como
os grandes corpos amarelos da lactao. O exame histopatolgico dever detectar uma diminuio qualitativa
da populao de folculos primordiais. As fmeas F
1
devem ser submetidas a uma avaliao quantitativa dos
folculos primordiais; o nmero de animais, a seleco da seco do ovrio e o tamanho da amostra seccionada
devem ser adequados, do ponto de vista estatstico, para o procedimento de avaliao usado. O exame deve
incluir a contagem do nmero de folculos primordiais (que podero estar combinados com pequenos folculos
em crescimento) em ovrios de tratamento e em ovrios de controlo, para posterior comparao de resultados
(15) (16) (17) (18) (19).
1.5.8.2. Animais recm-desmamados
Devem ser fixados e conservados em meio apropriado para exame histopatolgico os tecidos e rgos-alvo
com anomalias macroscpicas de todas as crias que apresentem anomalias externas ou sinais clnicos, bem
como de uma cria seleccionada aleatoriamente das geraes F
1
e F
2
, escolhida ao acaso quanto ao sexo e
ninhada de origem e que no tenha sido seleccionada para acasalamento. Deve efectuar-se a caracterizao
histopatolgica completa do tecido conservado, dando especial ateno aos rgos do aparelho reprodutor.
2. DADOS
Os dados devem ser registados individualmente e resumidos na forma de quadros, indicando, em relao a cada
grupo de ensaio e cada gerao, o nmero de animais no incio do ensaio, o nmero de animais encontrados
mortos durante o ensaio ou sacrificados, o momento de todas as mortes ou sacrifcios, o nmero de animais
frteis, o nmero de fmeas grvidas, o nmero de animais com manifestaes de toxicidade, uma descrio
dos sinais de toxicidade observados (incluindo o momento do aparecimento, a durao e a intensidade), os
tipos de observaes feitas nos progenitores e nos descendentes, os tipos de alteraes histopatolgicas e todos
os dados relevantes relativos s ninhadas.
Os resultados numricos devem ser avaliados com um mtodo estatstico adequado e geralmente aceite; a
escolha do mtodo estatstico deve constar do planeamento do estudo e ser devidamente justificada. Os
modelos estatsticos dose-resposta podem ser teis para a anlise dos dados. O relatrio deve incluir
informao suficiente sobre o mtodo de anlise e o programa informtico usados para que um examinador/
/estatstico independente possa reavaliar e reconstituir a anlise.
Os dados recolhidos no estudo de toxicidade sobre a reproduo em duas geraes, incluindo os relativos aos
exames microscpicos e necropsias, devero ser analisados em termos dos efeitos observados. A anlise dever
considerar a relao (ou a ausncia de relao) entre a dose da substncia de ensaio e a presena ou ausncia,
incidncia e gravidade de anomalias, incluindo leses macroscpicas, rgos identificados como alvos,
alteraes da fertilidade, anomalias clnicas, alteraes da reproduo e procriao, alteraes do peso corporal,
efeitos na mortalidade e quaisquer outros efeitos txicos. A anlise dos resultados do ensaio deve ainda ter em
conta as propriedades fsico-qumicas da substncia de ensaio, assim como informao toxicocintica, se
disponvel.
Um ensaio de toxicidade sobre a reproduo bem elaborado dever fornecer uma estimativa satisfatria do
nvel sem efeito e dar conhecimento dos efeitos adversos na reproduo, parturio, lactao e
desenvolvimento ps-natal, incluindo o crescimento e o desenvolvimento sexual.
A finalidade de um estudo de toxicidade sobre a reproduo em duas geraes consiste na obteno de
informaes relativas aos efeitos de exposio repetida a uma substncia durante todas as fases do ciclo
reprodutor. Mais especificamente, o estudo fornece informaes sobre os parmetros reprodutores, bem como
sobre o desenvolvimento, o crescimento, a maturao e a sobrevivncia da descendncia. A interpretao dos
resultados deve tomar em considerao dados de estudos subcrnicos, de desenvolvimento pr-natal e
toxicocinticos, entre outros eventualmente disponveis. Os resultados deste estudo podem ser usados para
avaliar a necessidade de realizar ensaios suplementares sobre uma substncia qumica. A extrapolao dos
resultados para a espcie humana tem uma validade limitada; mais adequado ser usar os dados do ensaio para
obter informao sobre nveis sem efeito e nveis tolerveis de exposio humana (20) (21) (22) (23).
3. RELATRIO
natureza fsica e, se relevante, propriedades fsico-qumicas;
dados de identificao;
pureza.
Agente de transporte (se apropriado):
caso o agente de transporte no seja gua, uma justificao para a sua escolha.
Animais de ensaio:
provenincia, condies de alojamento, dieta, materiais de nidificao, etc.;
pesos individuais dos animais no incio do ensaio.
Condies de ensaio:
razes que presidiram escolha dos diferentes nveis de doses;
concentraes atingidas;
estabilidade e homogeneidade da preparao;
Resultados:
consumo de alimentos, consumo de gua (se disponvel), eficincia do regime alimentar (aumento do
peso corporal por grama de alimento consumido) e consumo da substncia de ensaio pelos animais P e
Fl, excepto durante o perodo de coabitao e durante pelo menos o ltimo tero do perodo de lactao;
dados de absoro (se disponveis);
dados dos pesos corporais dos animais P e F
1
seleccionados para acasalamento;
pesos das ninhadas e das crias;
peso corporal no momento do sacrifcio e pesos absolutos e relativos dos rgos dos animais
progenitores;
natureza, gravidade e durao de efeitos detectados em observaes clnicas (reversveis ou no);
momento da morte no decurso do estudo ou indicao dos animais sobreviventes no termo da
experincia;
dados de resposta txica por sexo e por dose, incluindo ndices de acasalamento, fertilidade, gestao,
nascimento, viabilidade e lactao; os nmeros usados para calcular estes ndices devem constar do
relatrio;
efeitos txicos (ou outros) na reproduo, descendncia, crescimento ps-natal, etc.;
resultados da necropsia;
descrio pormenorizada de todas as observaes histopatolgicas;
nmero de fmeas P e F
1
com ciclos normais e durao dos ciclos;
nmero total de espermatozides no conduto epididimrio; percentagem de espermatozides
progressivamente mveis; percentagem de espermatozides morfologicamente normais e percentagem
de espermatozides que apresentam cada uma das anomalias identificadas;
durao do acasalamento, incluindo o nmero de dias at sua concretizao;
durao do perodo de gestao;
nmero de implantaes, corpos amarelos, dimenso da ninhada;
nmero de nados-vivos e de perdas ps-implantao;
nmero de crias com anomalias macroscpicas visveis; deve indicar-se o nmero de animais de tamanho
inferior ao normal, caso tenha sido determinado;
dados sobre aspectos fsicos caractersticos das crias e outros dados de desenvolvimento ps-natal; deve
ser dada uma justificao relativamente escolha dos aspectos fsicos analisados;
dados sobre observaes de desempenho nas crias e adultos, se aplicvel;
tratamento estatstico dos resultados, se apropriado.
Concluses, incluindo os valores dos NSEAO para efeitos sobre as mes e os descendentes.
4. REFERNCIAS
(1) Sadleir, R.M.F.S., (1979) Cycles and Seasons, In: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization,
C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.
(2) Gray, L.E. et al., (1989) A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive
Development and Function in the Rat. Fundamental and Applied Toxicology, 12, p. 92-108.
(3) Robb, G.W. et al., (1978) Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult
Rats. Journal of Reproduction and Fertility, 54 p. 103-107.
(4) Klinefelter, G.R. et al., (1991) The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion
Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reproductive Toxicology, 5,
p. 39-44
(5) Seed, J. et al., (1996) Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit,
and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology, 10(3), p. 237-244.
(6) Chapin, R.E. et al., (1992) Methods for Assessing Rat Sperm Motility. Reproductive Toxicology, 6, p. 267-
-273
(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992) Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in
Adult Rats: an In Vitro Demonstration. Journal of Andrology, 13, p. 409-421.
(8) Slott, V.L. et al., (1991) Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations. Reproductive Toxicology,
5, p. 449-458.
(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993) Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm
Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxicology, Part A., Academic,
Orlando, Florida, p. 319-333.
(10) Toth, G.P. et al., (1989) The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic
Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology, 10,
p. 401-415.
(11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987) Computerised Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility.
Journal of Andrology, 8, p. 330-337.
(12) Linder, R.E. et al., (1992) Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to
Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology, 6, p. 491-505.
(13) Korenbrot, C.C. et al., (1977) Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the
Male Rat. Biological Reproduction, 17, p. 298303.
(14) Russell, L.D. et al., (1990) Histological and Histopathological Evaluation of the Testis, Cache River Press,
Clearwater, Florida.
(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993) Part B. Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology,
Academic, Orlando, Florida.
(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian Follicle Number in Mice As a Screen of
Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, p. 421-426.
(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989) Test Methods for Assessing Female Reproductive and Developmental
Toxicology. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven, New York.
(18) Smith, B.J. et al,., (1991) Comparison of Random and Serial Sections in Assessment of Ovarian Toxicity.
Reproductive Toxicology, 5, p. 379-383.
(19) Heindel, J.J., (1999) Oocyte Quantitation and Ovarian Histology. In: An Evaluation and Interpretation of
Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston and C.A. Kimmel (eds.), ILSI
Press, Washington, DC.
(20) Thomas, J. A., (1991) Toxic Responses of the Reproductive System. In: Casarett and Doulls Toxicology,
M.O. Amdur, J. Doull, and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.
(21) Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989) Assessment of Male Reproductive Toxicity: A Risk Assessment
Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.
(22) Palmer, A.K., (1981) In: Developmental Toxicology, Kimmel, C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press,
New York.
(23) Palmer, A.K., (1978) In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press,
New York.
B.36. TOXICOCINTICA
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.2. DEFINIES
Nenhuma.
Administra-se a substncia a testar pela via apropriada. Consoante o objectivo do estudo, pode administrar-se a
substncia em dose nica ou repetida, durante perodos de tempo determinados a um ou vrios grupos de
animais de experincia. Em seguida e, dependendo do tipo de estudo, determinam-se os nveis da substncia e/
/ou seus metabolitos nos lquidos orgnicos, tecidos e/ou excreta.
Os estudos podem ser efectuados com formas marcadas ou no marcadas da substncia a testar. No caso de
utilizao de um marcador, a posio deste na substncia deve fornecer o mximo de informao sobre o
destino do composto.
Nenhum.
Preparativos
Aclimatizam-se s condies do laboratrio jovens animais adultos e saudveis, durante pelo menos cinco dias
antes da experincia. Antes de comear o ensaio, distribuem-se os animais ao acaso pelos grupos submetidos
ao tratamento. Em certas condies especiais podem utilizar-se animais muito jovens, fmeas grvidas ou
animais pr-tratados.
Animais de experincia
Os estudos toxicocinticos podem ser efectuados numa ou vrias espcies de animais apropriadas e devero ter
em conta as espcies j utilizadas ou que se preveja utilizar noutros estudos toxicolgicos sobre a mesma
substncia a testar. Quando se utilizam roedores num ensaio, a variao de peso entre os animais no deve
exceder 20 % do peso mdio.
Nmero e sexo
Para os estudos de absoro e de excreo devero utilizar-se grupos de quatro animais para cada dose. A
escolha de um sexo determinado no obrigatria mas, nalguns casos, pode tornar-se necessrio estudar
animais de ambos os sexos. No caso de haver respostas diferentes consoante o sexo sero tratados quatro
animais de cada sexo. No caso de estudos com no roedores pode utilizar-se um menor nmero de animais.
Quando se estudar a distribuio nos tecidos, para calcular a dimenso inicial do grupo dever ter-se em conta
o nmero de animais a sacrificar nas datas de exame pr-estabelecidas, bem como o nmero de exames.
Para o estudo do metabolismo, a dimenso do grupo tratado ser adaptada s necessidades do estudo. Para os
estudos com doses repetidas e com vrios exames intermdios, dever ter-se em conta, para calcular a dimenso
do grupo tratado, o nmero de exames e o de sacrifcios previstos; no entanto, no pode ser inferior a dois
animais. A dimenso do grupo dever ser suficiente para permitir uma avaliao aceitvel do aumento dos
nveis, planalto e da diminuio dos nveis (se for caso disso) da substncia a testar e/ou metabolitos.
Doses
No caso de administrao nica devem utilizar-se pelo menos duas doses diferentes. Deve haver um dose baixa
com a qual no se observem efeitos txicos e uma dose elevada susceptvel de modificar os parmetros
toxicinticos ou com a qual se observem efeitos txicos.
No caso de administrao repetida, a dose baixa habitualmente suficiente mas, nalgumas circunstncias, pode
ser tambm necessria uma dose elevada.
Via de administrao
Os estudos toxicinticos sero efectuados usando a mesma via e, quando apropriado, o mesmo veculo j
utilizado ou que se preveja utilizar noutros estudos de toxicidade. A substncia a testar habitualmente
administrada por via oral (por gavage ou incorporao na alimentao), por aplicao na pele ou por inalao
durante perodos de tempo determinados, a vrios grupos de animais de experincia. A administrao da
substncia a testar por via endovenosa pode ser til para determinar a absoro relativa pelas outras vias. Alm
disso, podem obter-se informaes teis sobre o modo de distribuio da substncia logo aps a sua
administrao endovenosa.
A possibilidade de uma interferncia do veculo com a substncia a testar dever ser tomada em considerao.
Deve prestar-se ateno particular s diferenas de absoro, quando a substncia a testar for administrada por
gavage ou na alimentao e necessidade de determinar a dose com preciso quando a substncia a testar for
incorporada na alimentao.
Perodo de observao
Todos os animais devem ser observados diariamente registando-se os sinais de toxicidade e outras
manifestaes clnicas relevantes, incluindo o momento do aparecimento, sua gravidade e durao.
Procedimento
Depois de pesar os animais de experincia, administra-se a substncia a testar por uma via apropriada. Se se
considerar necessrio, os animais podero estar em jejum antes da administrao da substncia a testar.
Absoro
A taxa e o grau de absoro da substncia administrada podem ser avaliadas por diferentes mtodos, em
presena e na ausncia, de grupos de referncia (
1
), por exemplo:
determinao da quantidade da substncia testada e/ou dos seus metabolitos nos excreta tais como urina,
blis, fezes, ar expirado e no contedo da carcaa,
comparao da resposta biolgica (por exemplo, estudo da toxicidade aguda) obtida, nos grupos de
experincia, nos grupos de controlo e/ou nos grupos de referncia,
comparao da quantidade de substncia e/ou de metabolitos excretados pelos rins nos grupos de
experincia e nos de referncia,
determinao da rea sob a curva nvel plasmtico/tempo da substncia a testar e/ou dos seus
metabolitos e comparao com os resultados obtidos num grupo de referncia.
Distribuio
Existem actualmente duas abordagens anlise do(s) modo(s) de distribuio, podendo utilizar-se um deles ou
ambos:
as tcnicas de autoradiografia de corpo inteiro fornecem informaes qualitativas teis,
o sacrifcio dos animais a intervalos diferentes depois da exposio e a determinao da concentrao e
da quantidade de substncia a testar e/ou dos seus metabolitos nos tecidos e nos rgos fornecem
informaes quantitativas.
(
1
) Neste mtodo entende-se por grupo de referncia um grupo em que a substncia a testar administrada por outra via que assegure uma
disponibilidade total de dose.
Excreo
Nos estudos de excreo, recolhem-se a urina, as fezes, o ar expirado e, nalguns casos, a blis. A quantidade da
substncia a testar e/ou de metabolitos presentes nestes excreta ser medida vrias vezes depois da exposio,
at que cerca de 95 % da dose administrada tenha sido eliminada, ou durante sete dias consecutivos, se no se
tiver atingido antes aquela percentagem.
Nalguns casos pode ser necessrio considerar a quantidade de substncia a testar eliminada no leite dos animais
de experincia que esto a aleitar.
Metabolismo
Para determinar a via metablica e a sua extenso sero analisadas amostras biolgicas com mtodos
adequados. Sero estudadas as estruturas dos metabolitos e propostas vias metablicas apropriadas quando
houver necessidade de responder a questes levantadas em estudos toxicolgicos anteriores. Pode ser til a
realizao de estudos in vitro para obter informaes sobre as vias metablicas.
Podem obter-se informaes complementares sobre a relao entre o metabolismo e a toxicidade com estudos
bioqumicos tais como a determinao dos efeitos sobre sistemas de enzimas metabolizantes, da depleco em
compostos endgenos com grupos sulfidrilos no proteicos, e da ligao s macromolculas.
2. RESULTADOS
Consoante o tipo de estudo efectuado, os resultados sero resumidos em quadros, acompanhados por grficos
quando tal for apropriado. Sero indicados para cada grupo de experincia as variaes mdias e estatsticas das
medies em funo do tempo, das doses, dos tecidos e dos rgos, quando apropriado. O grau de absoro
bem como as quantidades excretadas e o ritmo de excreo sero determinados por mtodos apropriados.
Quando forem efectuados estudos de metabolismo, ser indicada a estrutura dos metabolitos identificados e
sero apresentadas as possveis vias metablicas.
3. RELATRIO
Segundo o tipo de estudo efectuado, o relatrio do ensaio dever conter as seguintes informaes:
espcie, estirpe, origem, meio ambiente, regime alimentar,
caracterizao dos produtos marcados, se utilizados,
doses e intervalos usados,
via(s) de administrao e qualquer veculo utilizado,
efeitos txicos e outros observados,
mtodos de determinao da substncia testada e/ou metabolitos nas amostras biolgicas incluindo o ar
expirado,
apresentao em quadros das medidas efectuadas por sexo, dose, regime, tempo, tecidos e rgos,
indicao do grau de absoro e de excreo em funo do tempo,
mtodos de caracterizao e identificao dos metabolitos nas amostras biolgicas,
mtodos utilizados para as medies bioqumicas relacionadas com o metabolismo,
vias de metabolismo propostas,
discusso de resultados,
4. REFERNCIAS
B.37. NEUROTOXICIDADE RETARDADA DE SUBSTNCIAS ORGANOFOSFORADAS POR EXPOSIO
AGUDA
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Na determinao e avaliao dos efeitos txicos das substncias deve ter-se em conta o potencial de certos
grupos, de determinarem tipos especficos de neurotoxicidade no detectveis noutros ensaios de toxicidade.
Verifica-se, assim, que algumas substncias organofosforadas induzem neurotoxicidade retardada, constituindo
potenciais alvos para avaliao.
Os ensaios de rastreio in vitro podem ser utilizados para identificar substncias susceptveis de induzir
polineuropatias retardadas; todavia, a obteno de resultados negativos nos ensaios in vitro no comprova que
as referidas substncias no possuem efeitos neurotxicos.
1.2. DEFINIES
As substncias organofosforadas incluem os steres, tiosteres e anidridos no ionizados de cidos
organofosfricos, organofosfnicos e organofosforamdicos ou de cidos fosforotiicos, fosfonotiicos e
fosforotioamdicos afins, bem como quaisquer outras substncias que possam causar o tipo de neurotoxicidade
retardada que se observa por vezes nas referidas classes de substncias.
Neurotoxicidade retardada o sndroma associado manifestao retardada de ataxia e de axonopatias distais na
espinal medula e nos nervos perifricos, bem como inibio e reduo da actividade da esterase envolvida
na neuropatia, presente no tecido nervoso.
Pode utilizar-se uma substncia de referncia com um lote de controlo positivo, de modo a demonstrar que, nas
condies de ensaio, no existe uma alterao significativa da reaco da espcie em causa.
O fosfato de tris-o-tolilo [n.
o
CAS: 78-30-8; n.
o
EINECS: 201-103-5; designado ster tris (2-metilfe-nlico) do
cido fosfrico na nomenclatura CAS e tambm conhecido por fosfato de tris-o-cresilo] constitui uma
substncia neurotxica largamente utilizada.
A substncia em estudo administrada por via oral, numa nica dose, a galinhas domsticas eventualmente
protegidas de efeitos colinrgicos agudos. Os animais so observados durante 21 dias, registando-se a
manifestao de quaisquer perturbaes do comportamento, bem como de ataxia e paralisia. As determinaes
bioqumicas, nomeadamente da inibio da esterase envolvida na neuropatia, so efectuadas com aves
seleccionadas de modo aleatrio em cada lote, em geral 24 e 48 horas aps a administrao. 21 dias aps a
exposio, procede-se ao abate dos restantes animais, seguido do exame histopatolgico de determinados
tecidos do sistema nervoso.
1.5.1. Preparao
Seleccionam-se de modo aleatrio galinhas adultas, jovens e saudveis, isentas de afeces virais e medicao
concomitantes, bem como de anomalias da marcha, que se repartem pelos lotes de ensaio e de controlo. Os
animais so aclimatados s condies de laboratrio durante pelo menos cinco dias antes do incio do ensaio.
Devem utilizar-se gaiolas ou recintos cujas dimenses permitam a livre mobilidade das aves e a fcil observao
da respectiva marcha.
A substncia em estudo administrada por via oral, por intermdio de uma sonda gstrica, de cpsulas de
gelatina ou de um mtodo comparvel. Os lquidos podem ser administrados sem diluio ou dissolvidos num
veculo adequado, nomeadamente leo de milho; os slidos devem ser dissolvidos sempre que possvel, uma
vez que a absoro de doses elevadas de slidos dispersos em cpsulas de gelatina poder no ser eficaz. No
caso de se utilizar um veculo no aquoso, devem conhecer-se, ou determinar-se antes do ensaio, as respectivas
caractersticas de toxicidade.
Recomenda-se a utilizao de galinhas poedeiras, adultas e jovens (Gallus gallus domesticus), com idades
compreendidas entre 8 e 12 meses. Devem utilizar-se raas e variedades correntes, mantendo-se os animais em
condies que permitam a sua livre mobilidade.
Alm do lote de ensaio, devem utilizar-se um lote de controlo com o veculo e um lote de controlo positivo. Os
animais includos no lote de controlo com o veculo devem ser tratados de modo anlogo aos animais do lote
de ensaio, omitindo-se apenas a administrao da substncia em estudo.
Deve utilizar-se um nmero suficiente de animais em cada lote, de modo a que possam ser abatidos pelo menos
seis animais para as determinaes bioqumicas (trs em dois momentos diferentes), sobrevivendo seis para o
perodo de observao de 21 dias.
Pode efectuar-se um controlo positivo em paralelo ou, como alternativa, utilizar dados obtidos em controlos
positivos anteriores. O lote de controlo positivo deve ser constitudo por um mnimo de seis aves a que se
administra uma substncia com actividade neurotxica retardada conhecida, destinando-se trs animais s
determinaes bioqumicas e os restantes a observao. Recomenda-se a actualizao peridica dos dados
obtidos. Caso um laboratrio altere algum elemento essencial do protocolo experimental (por exemplo,
variedade de animais utilizada, condies de alimentao ou alojamento), deve efectuar-se novo controlo
positivo.
1.5.2.3. Doses
Para estabelecer a dose a utilizar no ensaio, deve realizar-se um estudo prvio com um nmero adequado de
aves e de doses, que poder implicar a morte de alguns animais. Todavia, de modo a evitar a mortalidade devida
a efeitos colinrgicos agudos, pode utilizar-se atropina ou outro agente protector que se saiba no interferir
com as reaces neurotxicas retardadas. Na estimativa da dose mxima no letal da substncia em estudo
podem utilizar-se diversos mtodos de ensaio (ver o mtodo B.1.bis).
A dose de substncia em estudo a utilizar no ensaio deve ser to elevada quanto possvel, em funo dos
resultados do estudo prvio de seleco, no excedendo 2 000 mg/kg de massa corporal. O nmero de animais
mortos durante o ensaio no deve interferir com o nmero mnimo de animais a utilizar para as determinaes
bioqumicas e para o exame histopatolgico a 21 dias (seis em ambos os casos). De modo a evitar a
mortalidade devida a efeitos colinrgicos agudos, pode utilizar-se atropina ou outro agente protector que se
saiba no interferir com as reaces neurotxicas retardadas.
referentes a substncias estruturalmente afins, no se preveja o surgimento de efeitos txicos, poder no ser
necessrio efectuar um ensaio com uma dose mais elevada. Nestes casos, justifica-se a realizao de um ensaio-
-limite, excepto se a exposio humana indicar a necessidade de recurso a uma dose superior.
O perodo de observao deve ser de 21 dias.
1.5.3 Procedimento
Aps a administrao de um agente destinado a evitar a mortalidade devida a efeitos colinrgicos agudos,
administra-se a substncia em estudo numa nica dose.
Devem iniciar-se as observaes logo aps a administrao da substncia. Os animais devem ser
cuidadosamente observados vrias vezes nos dois dias subsequentes administrao e pelo menos diariamente
at perfazer o perodo de 21 dias ou at ao abate previsto. Devem registar-se todos os sinais de toxicidade,
incluindo o momento da manifestao, o tipo, a gravidade e a durao das anomalias de comportamento. A
ataxia deve determinar-se de acordo com uma escala numrica constituda por um mnimo de quatro nveis,
devendo tambm registar-se os casos de paralisia. Pelo menos duas vezes por semana, devem retirar-se das
gaiolas os animais seleccionados para observao patolgica, submetendo-os a um perodo de actividade
motora forada, nomeadamente a subida de uma escada, de modo a facilitar a observao de efeitos txicos
mnimos. Os animais moribundos, bem como aqueles que mostrem sinais de dor e sofrimento intensos, devem
ser removidos, abatidos por interveno humana e autopsiados.
1.5.3.2. Massa corporal
As aves devem ser pesadas imediatamente antes da administrao da substncia em estudo e, pelo menos, uma
vez por semana na sequncia da mesma.
1.5.3.3. Determinaes bioqumicas
Alguns dias aps a administrao da substncia, devem abater-se seis aves seleccionadas de modo aleatrio dos
lotes de ensaio e de controlo com o veculo, bem como trs aves do lote de controlo positivo (caso este ltimo
seja efectuado em paralelo), preparando-se os respectivos crebros e espinais medulas com vista a determinar a
inibio da actividade da esterase envolvida na neuropatia. Alm disso, pode tambm revelar-se til preparar,
para o mesmo fim, tecidos provenientes dos nervos citicos. Em geral, abatem-se trs animais do lote de
controlo e de cada lote de ensaio 24 horas aps a administrao da substncia e trs 48 horas aps a mesma; os
trs animais dos lotes de controlo positivos devem ser abatidos 24 horas aps a administrao. Caso os sinais
clnicos de intoxicao (que pode ser avaliada em funo do momento da manifestao dos efeitos colinrgicos)
observados indicarem que o agente txico eliminado de forma bastante lenta, poder ser prefervel recolher
tecidos de trs animais em dois momentos compreendidos entre 24 horas e, no mximo, 72 horas aps a
administrao.
Se for caso disso, podem tambm efectuar-se determinaes de acetilcolinesterase com as amostras em causa.
Todavia, a possvel ocorrncia in vivo de reactivao espontnea da mesma poder levar a subestimar a
capacidade de inibio da acetilcolinesterase da substncia em estudo.
1.5.3.4. Autpsia
A autpsia dos animais abatidos (abates previstos e abates de animais moribundos) deve incluir o exame
macroscpico do crebro e da espinal-medula.
O tecido nervoso dos animais sobreviventes aps o perodo de observao, que no for utilizado para as
determinaes bioqumicas deve ser objecto de exame microscpico. Os tecidos devem ser fixados in situ, por
recurso a tcnicas de perfuso. As seces a examinar incluem o cerebelo (ao nvel meio-longitudinal), a medulla
oblongata, a espinal medula e os nervos perifricos. Devem recolher-se seces da espinal medula provenientes
do segmente cervical superior e das regies mediotorcica e lombo-sagrada. Devem tambm recolher-se
seces provenientes da regio distal do nervo tibial e das respectivas ramificaes para o msculo
gastroenmio, bem como do nervo citico. As seces em causa devem ser coradas com corantes adequados
mielina e corantes especficos dos axnios.
2. DADOS
A obteno de resultados negativos para os parmetros bioqumicos, histopatolgicos e de comportamento
investigados no mbito do presente ensaio no implica, de modo geral, a realizao de ensaios complementares
de neurotoxicidade retardada. A obteno de resultados duvidosos ou no conclusivos poder requerer a
realizao de estudos complementares.
quadro, referindo-se, para cada lote de ensaio, o nmero de animais utilizados, o nmero de animais que
apresentam leses e alteraes de comportamento ou dos parmetros bioqumicos, bem como o tipo e a
gravidade das referidas leses, e a percentagem de animais que apresentam cada tipo de leses e alteraes, em
funo da respectiva gravidade.
Os resultados do ensaio devem ser avaliados em termos de incidncia, gravidade e correlao das alteraes de
comportamento, bem como dos efeitos bioqumicos, histopatolgicos e outros efeitos observados nos lotes de
ensaio e de controlo.
3. RELATRIO
RELATRIO DO ENSAIO
3.1. Animais utilizados no ensaio:
estirpe utilizada;
provenincia, condies de alojamento, etc.;
3.2. Condies de ensaio:
pormenores relativos preparao da substncia em estudo e respectiva estabilidade e homogeneidade,
se for caso disso;
pormenores relativos qualidade dos alimentos e da gua;
motivo da seleco da dose utilizada;
especificao das doses administradas, incluindo pormenores relativos ao veculo, bem como ao volume
utilizado e s caractersticas fsicas da substncia administrada;
identidade do agente protector eventualmente utilizado e pormenores relativos respectiva
administrao.
3.3. Resultados:
dados relativos massa corporal;
consumo de alimentos e de gua, se for caso disso;
reaces txicas observadas em cada lote, incluindo a mortalidade;
descrio pormenorizada dos ensaios bioqumicos realizados e respectivos resultados;
descrio pormenorizada dos resultados do exame histopatolgico;
Concluses.
4. REFERNCIAS
B.38. NEUROTOXICIDADE RETARDADA DE SUBSTNCIAS ORGANOFOSFORADAS POR
ADMINISTRAO REPETIDA A 28 DIAS
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Na determinao e avaliao dos efeitos txicos das substncias deve ter-se em conta o potencial de certas
classes das mesmas de determinarem tipos especficos de neurotoxicidade no detectveis noutros ensaios de
toxicidade. Verifica-se, assim, que algumas substncias organofosforadas induzem neurotoxicidade retardada,
constituindo potenciais alvos para avaliao.
Os ensaios de rastreio in vitro podem ser utilizados para identificar substncias susceptveis de induzir
polineuropatias retardadas; todavia, a obteno de resultados negativos nos ensaios in vitro no comprova que
as referidas substncias no possuem efeitos neurotxicos.
O presente ensaio de toxicidade retardada a 28 dias fornece informaes sobre os eventuais riscos para a sade
decorrentes da exposio repetida num perodo limitado, nomeadamente a relao dose administrada-efeito,
bem como uma estimativa das doses sem efeitos observados, a utilizar no estabelecimento de critrios de
segurana na exposio substncia.
1.2. DEFINIES
As substncias organofosforadas incluem os steres, tiosteres e anidridos no ionizados de cidos
organofosfricos, organofosfnicos e organofosforamdicos ou de cidos fosforotiicos, fosfonotiicos e
fosforotioamdicos afins, bem como quaisquer outras substncias que possam causar o tipo de neurotoxicidade
retardada que se observa por vezes nas referidas classes de substncias.
Neurotoxicidade retardada a sndrome associada manifestao retardada de ataxia e de axonopatias distais na
espinal medula e nos nervos perifricos, bem como inibio e a reduo da actividade da esterase envolvida
na neuropatia, presente no tecido nervoso.
A substncia em estudo administrada por via oral a galinhas domsticas, durante 28 dias. Os animais so
observados pelo menos diariamente, registando-se a manifestao de quaisquer perturbaes do
comportamento, bem como de ataxia e paralisia, at 14 dias aps a administrao da ltima dose. As
determinaes bioqumicas, nomeadamente da inibio da esterase envolvida na neuropatia, so efectuadas
com aves seleccionadas de modo aleatrio em cada lote, em geral 24 e 48 horas aps a administrao da ltima
dose. Duas semanas aps esta ltima, procede-se ao abate dos restantes animais, seguido do exame
histopatolgico de determinados tecidos do sistema nervoso.
1.4.1. Preparao
Seleccionam-se de modo aleatrio galinhas adultas, jovens e saudveis, isentas de afeces virais e medicao
concomitantes, bem como de anomalias da marcha, que se repartem pelos lotes de ensaio e de controlo. Os
animais so aclimatados s condies de laboratrio durante pelo menos cinco dias antes do incio do ensaio.
Devem utilizar-se gaiolas ou recintos cujas dimenses permitam a livre mobilidade das aves e a fcil observao
da respectiva marcha.
A substncia em estudo administrada por via oral, por intermdio de uma sonda gstrica, de cpsulas de
gelatina ou de um mtodo comparvel. Os lquidos podem ser administrados sem diluio ou dissolvidos num
veculo adequado, nomeadamente leo de milho; os slidos devem ser dissolvidos sempre que possvel, uma
vez que a absoro de doses elevadas de slidos dispersos em cpsulas de gelatina poder no ser eficaz. No
caso de se utilizar um veculo no aquoso, devem conhecer-se, ou determinar-se antes do ensaio, as respectivas
caractersticas de toxicidade.
Recomenda-se a utilizao de galinhas poedeiras, adultas e jovens (Gallus gallus domesticus), com idade
compreendida entre 8 e 12 meses. Devem utilizar-se raas e variedades correntes, mantendo-se os animais em
condies que permitam a sua livre mobilidade.
Devem utilizar-se pelo menos trs lotes de ensaio e um lote de controlo com o veculo. Os animais includos no
lote de controlo com o veculo devem ser tratados de modo anlogo aos animais do lote de ensaio, omitindo-se
apenas a administrao da substncia em estudo.
Deve utilizar-se um nmero suficiente de animais em cada lote, de modo a que possam ser abatidos pelo menos
seis animais para as determinaes bioqumicas (trs em dois momentos diferentes), sobrevivendo seis para o
perodo de observao de 14 dias aps a administrao da ltima dose.
1.4.2.3. Doses
Na seleco das doses devem ter-se em conta os resultados dos ensaios de neurotoxicidade retardada por
administrao aguda, bem como quaisquer outros dados disponveis em matria de toxicidade e cintica
referentes substncia em causa. A dose mais elevada deve ser escolhida com o objectivo de induzir efeitos
txicos, nomeadamente de neurotoxicidade retardada, evitando contudo a morte e o sofrimento intenso.
Posteriormente, deve seleccionar-se uma sequncia decrescente de doses, com o objectivo de evidenciar uma
correlao entre a dose administrada e a reaco observada, bem como a ausncia de efeitos nocivos associados
administrao da dose mais reduzida.
referentes a substncias estruturalmente afins, no se preveja a manifestao de efeitos txicos, poder no ser
necessrio efectuar um ensaio com uma dose mais elevada. Nestes casos, justifica-se a realizao de um ensaio-
-limite, excepto se a exposio humana indicar a necessidade de recurso a uma dose superior.
Os animais devem ser observados com uma frequncia pelo menos diria no decurso do perodo de exposio
e nos 14 dias subsequentes administrao da ltima dose, salvo no caso de se proceder a autpsias
intermdias.
1.4.3. Procedimento
Deve administrar-se a substncia aos animais sete dias por semana, num perodo de 28 dias.
Devem iniciar-se as observaes logo aps a administrao da primeira dose. Os animais devem ser
cuidadosamente observados com uma frequncia diria mnima, no decurso do perodo de exposio e nos 14
dias subsequentes administrao da ltima dose, ou at ao abate previsto. As observaes devem incluir,
nomeadamente, as anomalias de comportamento. A ataxia deve determinar-se de acordo com uma escala
numrica constituda por um mnimo de quatro nveis, devendo tambm registar-se os casos de paralisia. Pelo
menos duas vezes por semana, devem retirar-se das gaiolas os animais seleccionados para observao
patolgica, submetendo-os a um perodo de actividade motora forada, nomeadamente a subida de uma
escada, de modo a facilitar a observao de efeitos txicos mnimos. Os animais moribundos, bem como
aqueles que mostrem sinais de dor e sofrimento intensos, devem ser removidos, abatidos por interveno
humana e autopsiados.
1.4.3.2. Massa corporal
As aves devem ser pesadas imediatamente antes da administrao da primeira dose e, pelo menos, uma vez por
semana na sequncia da mesma.
1.4.3.3. Determinaes bioqumicas
Alguns dias aps a administrao da ltima dose, devem abater-se seis aves seleccionadas de modo aleatrio
dos lotes de ensaio e de controlo com o veculo, preparando-se os respectivos crebros e espinais medulas com
vista a determinar a inibio da actividade da esterase envolvida na neuropatia. Alm disso, pode tambm
revelar-se til preparar, para o mesmo fim, tecidos provenientes dos nervos citicos. Em geral, abatem-se trs
animais do lote de controlo e de cada lote de ensaio 24 horas aps a administrao da ltima dose e trs 48
horas aps a mesma. Podem utilizar-se outros intervalos de abate, apresentando a respectiva justificao, caso
os dados provenientes de ensaios de toxicidade aguda ou de outro tipo de estudos (nomeadamente de
toxicocintica) mostrem que esses intervalos so mais adequados.
Se for caso disso, podem tambm efectuar-se determinaes de acetilcolinesterase com as amostras em causa.
Todavia, a possvel ocorrncia in vivo de reactivao espontnea da mesma poder levar a subestimar a
capacidade de inibio da acetilcolinesterase da substncia em estudo.
1.4.3.4. Autpsia
A autpsia dos animais abatidos (abates previstos e abates de animais moribundos) deve incluir o exame
macroscpico do crebro e da espinal medula.
O tecido nervoso dos animais sobreviventes aps o perodo de observao que no for utilizado para as
determinaes bioqumicas deve ser objecto de exame microscpico. Os tecidos devem ser fixados in situ, por
recurso a tcnicas de perfuso. As seces a examinar incluem o cerebelo (ao nvel meio-longitudinal), a medulla
oblongata, a espinal medula e os nervos perifricos. Devem recolher-se seces da espinal medula provenientes
do segmento cervical superior e das regies mdio-torcica e lombo-sagrada. Devem tambm recolher-se
seces provenientes da regio distal do nervo tibial e das respectivas ramificaes para o msculo
gastroenmio, bem como do nervo citico. As seces em causa devem ser coradas com corantes adequados
mielina e corantes especficos dos axnios. Inicialmente, o exame microscpico deve abranger apenas os
tecidos conservados dos animais do lote de controlo e do lote a que foi administrada a dose mais elevada; se,
neste ltimo caso, se observarem efeitos txicos, deve efectuar-se tambm o exame microscpico dos tecidos
provenientes dos animais dos lotes a que foram administradas doses reduzidas e intermdias.
2. DADOS
A obteno de resultados negativos para os parmetros bioqumicos, histopatolgicos e de comportamento
investigados no mbito do presente ensaio no implica, de modo geral, a realizao de ensaios complementares
de neurotoxicidade retardada. A obteno de resultados duvidosos ou no conclusivos poder requerer a
realizao de estudos complementares.
quadro, referindo-se, para cada lote de ensaio, o nmero de animais utilizados, o nmero de animais que
apresentem leses e alteraes de comportamento ou dos parmetros bioqumicos, bem como o tipo e a
gravidade das referidas leses, e a percentagem de animais que apresentam cada tipo de leses e alteraes, em
funo da respectiva gravidade.
Os resultados do ensaio devem ser avaliados em termos de incidncia, gravidade e correlao das alteraes de
comportamento, bem como dos efeitos bioqumicos, histopatolgicos e outros efeitos observados nos lotes de
ensaio e de controlo.
3. RELATRIO
RELATRIO DO ENSAIO
3.1. Animais utilizados no ensaio:
estirpe utilizada;
provenincia, condies de alojamento, etc.;
3.2. Condies de ensaio:
pormenores relativos preparao da substncia em estudo e respectiva estabilidade e homogeneidade,
se for caso disso;
pormenores relativos qualidade dos alimentos e da gua;
motivo da seleco das doses utilizadas;
especificao das doses administradas, incluindo pormenores relativos ao veculo, bem como ao volume
utilizado e s caractersticas fsicas da substncia administrada;
motivos da seleco de outros intervalos para as determinaes bioqumicas que no 24 ou 48 horas
aps a administrao da ltima dose.
3.3. Resultados:
dados relativos massa corporal;
reaces txicas observadas por dose administrada, incluindo a mortalidade;
nvel sem efeitos adversos observveis;
descrio pormenorizada dos ensaios bioqumicos realizados e respectivos resultados;
descrio pormenorizada dos resultados do exame histopatolgico;
Concluses.
4. REFERNCIAS
B.39. ENSAIO IN VIVO DA SNTESE NO PROGRAMADA (UDS) DE ADN EM CLULAS DO FGADO DE
MAMFEROS
1. MTODO
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TB 486 Ensaio in vivo da sntese no programada (UDS) de
ADN em clulas do fgado de mamferos (1997).
1.1. INTRODUO
O objectivo do ensaio in vivo da sntese no programada (UDS) de ADN em clulas do fgado de mamferos
identificar as substncias que induzem a reparao do ADN nas clulas do fgado de animais expostos
substncia em estudo (1) (2) (3) (4).
O presente ensaio in vivo apresenta um mtodo para investigao dos efeitos dos produtos qumicos
genotxicos sobre o fgado. O valor limite medido indicativo dos danos e da subsequente reparao do ADN
em clulas do fgado. O fgado geralmente o local principal de metabolizao dos compostos absorvidos, pelo
que particularmente apropriado para avaliar os danos do ADN in vivo.
O ponto final da sntese no programada (UDS) de ADN medido atravs da determinao da incorporao de
nucletidos marcados por clulas que no se encontram numa fase de sntese programada de ADN (fase S). A
tcnica mais utilizada a determinao da incorporao de timidina marcada com trtio (
3
H-TdR) por
autoradiografia. Nos ensaios UDS in vivo so geralmente utilizados fgados de rato. Podem tambm ser
utilizados outros tecidos, mas no esse o objectivo do presente mtodo.
A deteco de uma resposta UDS depende do nmero de bases do ADN excizadas e substitudas no local
danificado. Por conseguinte, o ensaio UDS particularmente vlido para a deteco de reparao de cadeias
longas (20-30 bases) induzida pela substncia. A reparao de cadeias curtas (1-3 bases) , pelo contrrio,
detectada com uma sensibilidade muito mais baixa. Alm disso, podem existir eventos mutagnicos
decorrentes da no reparao, reparao incorrecta ou de problemas de replicao das leses do ADN. A
extenso da resposta UDS no d qualquer indicao em relao fidelidade do processo de reparao. Alm
disso, possvel que um agente mutagneo reaja com o ADN mas que os danos do ADN no sejam
posteriormente reparados atravs de um processo de reparao da exciso. A ausncia de informao especfica
sobre a actividade mutagnica do ensaio UDS compensada pela potencial sensibilidade do seu ponto final,
uma vez que medido na totalidade do genoma.
1.2. DEFINIES
Clulas em reparao: apresentam uma granulao nuclear lquida (NNG) superior a um valor pr-
-determinado, a justificar pelo laboratrio que conduz o ensaio.
Granulao nuclear lquida (NNG): medida quantitativa da actividade celular UDS em ensaios
autoradiogrficos UDS, calculada pela subtraco do nmero mdio de grnulos citoplsmicos em sectores
citoplsmicos equivalentes ao ncleo (CG) ao nmero de grnulos nucleares (NG): NNG = NG CG. As
contagens NNG so calculadas para cada clula e so depois ponderadas para as clulas de uma cultura, em
culturas paralelas, etc.
Sntese no programada (UDS) de ADN: sntese de reparao do ADN aps exciso e remoo de uma
sequncia de ADN que contm uma regio danificada por induo de substncias qumicas ou de agentes
fsicos.
O ensaio UDS in vivo em clulas do fgado de mamferos indica a ocorrncia de uma sntese de reparao do
ADN aps exciso e remoo de uma sequncia de ADN que continha uma regio danificada por induo de
substncias qumicas ou de agentes fsicos. O ensaio baseia-se geralmente na incorporao de
3
H-TdR no ADN
de clulas do fgado com uma baixa proporo de clulas na fase S do ciclo celular. A incorporao de
3
H-TdR
geralmente determinada por autoradiografia, uma vez que esta tcnica no to sensvel interferncia das
clulas em fase S como, por exemplo, a contagem de cintilao em meio lquido.
1.4.1. Preparao
Geralmente so utilizados ratos, embora possa ser utilizada qualquer outra espcie de mamfero apropriada.
Devem ser utilizados animais adultos saudveis jovens das raas de laboratrio mais comuns. No incio do
estudo, a diferena de peso entre os animais deve ser mnima, no devendo exceder 20 % do peso mdio de
cada sexo.
expostos. As gaiolas devem ser dispostas de modo a que eventuais efeitos devidos respectiva colocao sejam
minimizados. Os animais so identificados de forma inequvoca, devendo ser aclimatados s condies de
laboratrio durante pelo menos cinco dias antes de se iniciar o estudo.
O solvente/veculo no deve reagir com a substncia em estudo, no devendo produzir efeitos txicos nas doses
utilizao de um solvente/veculo aquoso.
1.4.2.2. Controlos
Cada experincia deve incluir em paralelo controlos positivos e negativos (solvente/veculo). Com excepo da
exposio substncia em estudo, todos os animais, incluindo os dos grupos de controlo, devem ser
manuseados de forma idntica.
Os controlos positivos devem ser substncias comprovadamente causadoras de UDS quando administradas aos
nveis de exposio a que se espera o surgimento de um aumento detectvel em relao linha de base. Os
controlos positivos que exijam activao metablica devem ser utilizados em doses que desencadeiem uma
resposta moderada (4). A dose de controlo positiva a administrar deve ser escolhida de modo a que os seus
efeitos sejam claros mas tambm a que as lminas codificadas no sejam imediatamente identificadas pela
pessoa que procede s leituras. As substncias de controlo positivo podem incluir, por exemplo:
Tempo de amostragem Substncia Nmero CAS Nmero EINECS
Amostragens iniciais (2-4 horas) N-nitrosodimetilamina 62-75-9 200-249-8
Amostragens finais (12-16 horas) N-2-fluorenilacetamida (2-AAF) 53-96-3 200-188-6
Podem ser utilizadas outras substncias de controlo positivo apropriadas. O controlo positivo pode ser
administrado por uma via diferente da substncia em estudo.
1.5. PROCEDIMENTO
1.5.1. Nmero e sexo de animais
Deve ser utilizado um nmero de animais suficiente para que a variao biolgica natural seja tomada em
considerao nos resultados do ensaio, com pelo menos trs animais analisveis por grupo. Se j existir uma
base de dados histricos significativa, os grupos de controlo positivo e negativo podero conter apenas um ou
dois animais.
Se no momento do estudo existirem dados disponveis de estudos com as mesmas espcies e com utilizao da
mesma via de administrao que demonstrem que no h qualquer diferena substancial de toxicidade entre os
sexos, ser suficiente testar um nico sexo, de preferncia o sexo masculino. Nos casos em que a exposio
humana aos produtos qumicos possa ser especfica a cada sexo, como acontece com alguns produtos
farmacuticos, o ensaio deve ser executado com animais do sexo em causa.
As substncias de ensaio so preferivelmente administradas numa nica exposio.
1.5.3. Doses
Normalmente, so utilizadas pelo menos duas doses diferentes. A dose mais elevada definida como a dose que
produz sinais de toxicidade tais que indiquem que a utilizao de doses superiores, com o mesmo regime de
administrao, produzir mortalidade. Em termos gerais, a dose inferior deve ser de 25 %-50 % da dose mais
elevada.
As substncias com actividade biolgica especfica em doses baixas e no txicas (como acontece com as
hormonas e agentes mitognicos) podero constituir uma excepo aos critrios de fixao da dose, devendo
ser avaliadas caso a caso. Se for realizado um estudo para avaliao da gama de doses a administrar, por no
estarem disponveis dados apropriados, esse estudo deve ser executado no mesmo laboratrio, utilizando as
mesmas espcies, linha celular, sexo e regime de exposio a utilizar no estudo principal.
A dose mais elevada pode igualmente ser definida como uma dose que produz algumas indicaes de
toxicidade no fgado (por exemplo, ncleos picnticos).
exposies no mesmo dia no produzir nenhum efeito txico perceptvel e se no for previsvel a existncia de
toxicidade gentica com base nos dados respeitantes a substncias estruturalmente relacionadas, poder no ser
considerado necessrio um estudo completo. A exposio prevista para o ser humano pode indicar a
necessidade de se utilizarem doses mais elevadas nos ensaios-limite.
cnula de intubao apropriada. Podero ser aceites, mediante justificao, outras vias de administrao, mas a
via intraperitoneal no recomendada, uma vez que poder expor o fgado substncia em estudo
directamente e no atravs do sistema circulatrio. O volume mximo de lquido que pode ser administrado de
cada vez por sonda esofgica ou por injeco depende tambm do tamanho do animal de ensaio, no devendo
exceder 2 ml/100 g de peso corporal. A utilizao de volumes mais elevados deve ser justificada. Com excepo
das substncias que causem irritao ou que sejam corrosivas, cujos efeitos sero normalmente agravados em
concentraes mais altas, a variabilidade do volume de ensaio deve ser minimizada atravs do ajustamento das
concentraes, por forma a garantir um volume constante para todas as doses a administrar.
1.5.6. Preparao das clulas de fgado
As clulas do fgado so normalmente preparadas a partir dos animais expostos substncia em estudo 12-16
horas aps a administrao da substncia em estudo. Geralmente ser necessrio realizar uma primeira amostra
(normalmente 2-4 horas aps a exposio), que s no ter de ser utilizada quando haja uma resposta positiva
clara s
12-16 horas. Contudo, podem ser utilizados outros tempos de amostragem, desde que sejam justificados
com base em dados toxicocinticos.
As culturas celulares de curta durao do fgado de mamferos so geralmente preparadas irrigando o fgado in
situ com colagenase e deixando que algumas clulas livres separadas do fgado h pouco tempo se fixem a uma
superfcie apropriada. As clulas do fgado de animais do controlo negativo devem ter uma viabilidade de pelo
menos 50 % (5).
1.5.7. Determinao da UDS
As clulas de fgado de mamfero isoladas h pouco tempo so geralmente incubadas num meio que contm
3
H-TdR durante um perodo adequado, por exemplo 3-8 horas. No final do perodo de incubao, as clulas so
lavadas para remover o meio residual e depois incubadas num meio com excesso de timidina no rotulada para
diminuir a radioactividade no incorporada (lavagem a frio). As clulas so ento enxaguadas, fixadas e secas.
Para os tempos de incubao mais prolongados, pode no ser necessria a lavagem a frio. As lminas so
mergulhadas na emulso autoradiogrfica, expostas na obscuridade (ou seja, refrigeradas durante 7-14 dias),
reveladas e coradas, aps o que se procede contagem dos grnulos de prata expostos. Devem ser preparadas
duas ou trs lminas de cada animal.
1.5.8. Anlise
As preparaes devem conter um nmero suficiente de clulas com morfologia normal para permitir uma
avaliao significativa da UDS. As preparaes so examinadas microscopicamente para sinais de citotoxicidade
evidente (por exemplo, picnose, nveis diminudos de radiao proveniente da timina rotulada).
As lminas devem ser codificadas antes da contagem dos grnulos. Normalmente so contadas 100 clulas de
cada animal, de pelo menos duas lminas; se forem contadas menos de 100 clulas/animal, deve ser fornecida
uma justificao. As contagens dos grnulos dos ncleos em fase S no so tomadas em considerao, mas a
proporo de clulas em fase S pode ser registada.
O grau de incorporao da
3
H-TdR nos ncleos e citoplasma das clulas morfologicamente normais,
evidenciado pelo depsito de grnulos de prata, deve ser determinado por mtodos apropriados.
As contagens de grnulos so determinadas nos ncleos (grnulos nucleares, NG) e em sectores do citoplasma
equivalentes ao ncleo (grnulos citoplsmicos, CG). As contagens de CG so feitas no sector do citoplasma
mais rotulado ou fazendo a mdia de dois ou trs locais com grnulos citoplsmicos escolhidos aleatoriamente
junto regio do ncleo. Outros mtodos de contagem (por exemplo, contagem de clulas inteiras) podem ser
utilizados, se se justificarem (6).
2. DADOS
Devem ser apresentados dados relativos a cada lmina e a cada animal. Para alm disso, todos os dados devem
ser apresentados sob a forma de um quadro. As contagens de granulao nuclear lquida (NNG) devem ser
calculadas para cada clula, para cada animal, para cada dose e para cada tempo de colheita subtraindo as
contagens CG das contagens NG. Se forem contadas as clulas em reparao, os critrios para definir essas
clulas devem ser justificados e baseados em dados histricos ou dos controlos negativos realizados em
paralelo com o ensaio. Os resultados numricos podem ser avaliados atravs de mtodos estatsticos. Os
mtodos estatsticos a utilizar eventualmente devem ser escolhidos e justificados antes da realizao do estudo.
Os exemplos de critrios para a definio de uma resposta como positiva/negativa incluem:
positiva i) Valores de NNG positivos, acima de um limiar pr-definido justificado com base nos dados
histricos do laboratrio; ou
ii) Valores de NNG significativamente superiores aos do controlo em paralelo;
negativa i) Valores de NNG iguais/inferiores ao limiar de controlo histrico; ou
ii) Valores de NNG no significativamente superiores aos do controlo em paralelo.
A importncia biolgica dos dados deve ser considerada, ou seja, devem ser tomados em considerao
parmetros como a variao de animal para animal, a relao dose/resposta e a citotoxicidade. Como auxlio
para a avaliao dos resultados dos ensaios, podero ser utilizados mtodos estatsticos, embora a significncia
estatstica no deva ser o nico elemento para a determinao de uma resposta positiva.
Um resultado positivo no ensaio UDS em clulas do fgado de mamferos in vivo indica que a substncia em
estudo induz danos no ADN das clulas do fgado de mamferos in vivo que podem ser reparados por sntese
no programada de ADN in vitro. Um resultado negativo indica que, nas condies do ensaio, a substncia em
estudo no induz danos no ADN que sejam detectveis pelo presente ensaio.
RELATRIO DE ENSAIO
Solvente/veculo:
Animais de ensaio:
Condies de ensaio:
controlos positivos e negativos veculo/solvente,
mtodos usados para verificar se o agente em estudo atingiu o sistema circulatrio geral, caso tenham
sido utilizados,
converso da concentrao da substncia em estudo na alimentao/abeberao (ppm) para a dose real
descrio pormenorizada dos calendrios de tratamento e amostragem,
mtodo de preparao e cultura das clulas do fgado,
tcnica de autoradiografia utilizada,
nmero de lminas preparadas e nmero de clulas contabilizadas,
critrios de avaliao,
Resultados:
valores mdios das contagens de grnulos nucleares, grnulos citoplsmicos e da granulao nuclear
lquida para cada lmina, animal e grupo,
dados relativos aos controlos positivos e negativos (solvente/veculo) realizados em paralelo com o
ensaio,
dados histricos relativos aos controlos positivos e negativos (solvente/veculo) realizados em paralelo
com o ensaio, com as respectivas gama, valor mdio e desvio-padro,
nmero de clulas em reparao, caso tenham sido contabilizadas,
nmero de clulas em fase S, caso tenham sido contadas,
viabilidade das clulas.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, B. and Penman, M.G., (1985) An Assessment of the In Vivo Rat
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(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, C., (1993) Assessment of the Relation
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/In Vitro DNA Repair Assay (UDS). Mutation Res., 291, p. 21-27.
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Vivo/In Vitro Hepatocyte DNA Repair Assay. Environ. Mutagen, 4, p. 553-562.
B.40. CORROSO DA PELE IN VITRO: ENSAIO DA RESISTNCIA ELCTRICA TRANSCUTNEA (RET)
1. MTODO
Este mtodo de ensaio equivalente ao OECD TG 430 (2004).
1.1. INTRODUO
Entende-se por corroso da pele a produo de danos irreversveis nos tecidos cutneos por aplicao de uma
matria em estudo (definida de acordo com o sistema harmonizado global de classificao e rotulagem das
misturas e substncias qumicas) (1). O presente mtodo permite determinar a corrosividade sem recorrer a
animais vivos.
A determinao da corrosividade cutnea tem normalmente feito uso de animais de laboratrio (2). A
preocupao com a dor e o sofrimento inerentes a esse processo levou reviso do mtodo de ensaio B.4,
tendo passado a ser possvel determinar a corroso da pele por mtodos alternativos (in vitro), que evitam a dor
e o sofrimento de animais.
A primeira etapa com vista definio de ensaios alternativos que pudessem ser utilizados na determinao da
corrosividade cutnea num contexto legislativo foi a realizao de estudos de pr-validao (3). Seguidamente,
foi realizado um estudo com vista validao formal de mtodos in vitro para a determinao da corroso da
pele (4) (5) (6) (7) (8). O resultado desses estudos e outra literatura publicada conduziram recomendao de
que poderiam ser utilizados para determinar a corrosividade cutnea in vivo (9) (10) (11) o ensaio em modelos
de pele humana (ver o mtodo de ensaio B.40.A) e o presente ensaio (ensaio da resistncia elctrica
transcutnea).
Um estudo de validao e outros estudos publicados concluram que o ensaio da resistncia elctrica
transcutnea (RET) em pele de rato (12) (13) permite distinguir com fiabilidade as substncias
reconhecidamente corrosivas da pele das que o no so (5) (9).
O ensaio descrito no presente mtodo permite identificar misturas e substncias qumicas corrosivas. Permite
igualmente identificar misturas e substncias qumicas no-corrosivas, quando associado a outras informaes
disponveis (por exemplo, pH, relaes estrutura-actividade, dados humanos ou em animais) que corroborem
tais caractersticas (1) (2) (11) (14). O mtodo no d informaes sobre a irritao da pele, nem permite dividir
as substncias corrosivas em categorias (como as previstas no sistema de classificao harmonizado global) (1).
Para uma avaliao completa dos efeitos locais na pele aps uma exposio nica por via drmica recomenda-
-se a aplicao da estratgia de ensaio sequencial apensa ao mtodo de ensaio B.4 (2) e associada ao sistema
harmonizado global (1). Essa estratgia de ensaio inclui a realizao de ensaios de corroso da pele (descritos
no presente mtodo) e de irritao da pele in vitro antes de ser ponderada a realizao de ensaios em animais
vivos.
1.2. DEFINIES
Corroso da pele in vivo: Produo de danos irreversveis pele, nomeadamente a necrose visvel da
epiderme, prolongando-se para a derme, aps a aplicao de uma substncia em estudo durante um mximo de
quatro horas. So exemplos tpicos de reaces corrosivas as lceras, hemorragias e escaras sanguinolentas e,
para o final do perodo de observao de 14 dias, a descolorao, devido perda de pigmentao da pele, a
formao de zonas de alopecia total e a ocorrncia de cicatrizes. As leses duvidosas podero ser esclarecidas
por mtodos histopatolgicos.
Resistncia elctrica transcutnea (RET): Valor da resistncia em k medido para a impedncia elctrica da
pele. Trata-se de um mtodo simples e robusto de avaliao da funo de barreira por meio do registo do fluxo
inico atravs da pele com uma ponte de Wheatstone.
Quadro 1
Substncias qumicas de referncia
Denominao Nmero EINECS Nmero CAS
1,2-Diaminopropano 201-155-9 78-90-0 Extremamente corrosivo
cido acrlico 201-177-9 79-10-7 Extremamente corrosivo
2-terc-Butilfenol 201-807-2 88-18-6 Corrosivo
Hidrxido de potssio (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Corrosivo
cido sulfrico (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Corrosivo
cido octanico (cido caprlico) 204-677-5 124-07-02 Corrosivo
4-Amino-1,2,4-triazole 209-533-5 584-13-4 No corrosivo
Eugenol 202-589-1 97-53-0 No corrosivo
Brometo de fenetilo 203-130-8 103-63-9 No corrosivo
Tetracloroetileno 204-825-9 27-18-4 No corrosivo
cido isoesterico 250-178-0 30399-84-9 No corrosivo
4-(Metiltio)-benzaldedo 222-365-7 3446-89-7 No corrosivo
A maioria das substncias qumicas constantes do quadro foi retomada da lista seleccionada para o estudo de
validao internacional do ECVAM (4). A seleco baseia-se nos seguintes critrios:
i) Nmero idntico de substncias corrosivas e no corrosivas;
ii) Substncias disponveis no comrcio e da maioria das classes qumicas pertinentes;
iii) Incluso de substncias extremamente corrosivas e de substncias menos corrosivas, para possibilitar
uma diferenciao com base no poder corrosivo;
iv) Escolha de substncias qumicas que podem ser manuseadas no laboratrio sem outros perigos graves
alm da corrosividade.
Aplica-se a matria em estudo, durante 24 horas, sobre a superfcie epidrmica de discos cutneos num sistema
de ensaio com dois compartimentos, no qual o disco estabelece a separao entre os compartimentos. Os
discos cutneos so retirados de ratos com 28 a 30 dias de idade, mortos sem crueldade. As matrias corrosivas
so identificadas pela sua capacidade de causarem uma perda da integridade normal do stratum corneum e da
funo de barreira, perda essa que medida pela descida da RET abaixo de um determinado limite (12). Para
determinao da RET na pele do rato, foi seleccionado um valor-limite de 5 k, com base numa multiplicidade
de dados obtidos com uma vasta gama de substncias qumicas, situando-se a grande maioria dos valores
claramente muito acima (frequentemente > 10 k) ou muito abaixo (frequentemente < 3 k) desse valor (12).
Em geral, as matrias no corrosivas para os animais, mas simplesmente irritantes (ou no irritantes), no
reduzem a RET abaixo daquele valor-limite. A utilizao de outras preparaes cutneas ou de outros
equipamentos pode alterar o valor-limite, necessitando da correspondente validao.
O mtodo inclui uma etapa de ligao de um corante, para a confirmao dos resultados positivos na
determinao da RET (incluindo prximos de 5 k). A etapa de ligao do corante esclarece se o aumento de
permeabilidade inica se deve destruio fsica do stratum corneum. O mtodo de determinao da RET em
pele de rato revelou-se capaz de prever a corrosividade in vivo no coelho, determinada pelo mtodo de en-
saio B.4 (2). De referir que o ensaio in vivo da corrosividade para a pele e da irritao da pele no coelho
fortemente conservador, comparativamente ao ensaio do emplastro cutneo em pessoas (15).
7.5.7. Os animais
O rato a espcie escolhida por ter sido demonstrada a sensibilidade da pele desses animais s substncias
qumicas utilizadas no ensaio (10). A linhagem e idade do rato (no momento da colheita da pele) assumem
particular importncia, devendo os folculos pilosos encontrar-se na fase de dormncia, antes do crescimento
da pilosidade adulta.
Com uma pequena tosquiadora, cortam-se cuidadosamente os plos dorsais e dos flancos de ratos fmeas ou
machos jovens (linhagem Wistar ou comparvel), com aproximadamente 22 dias de idade. Os animais so
depois lavados, esfregando cuidadosamente, devendo a zona tosquiada da pele ser mergulhada numa soluo
antibitica (contendo, por exemplo, estreptomicina, penicilina, cloranfenicol e anfotericina em concentraes
suficientes para inibir o crescimento bacteriano). Os animais voltam a ser lavados com soluo antibitica no
terceiro ou quarto dia aps a primeira lavagem e so utilizados nos trs dias seguintes segunda lavagem,
quando o stratum corneum tiver recuperado da tosquia.
1.5.2. Preparao dos discos cutneos
Os animais so mortos sem crueldade entre a idade de 28 e 30 dias (esta idade muito importante). Em
seguida, retira-se a pele dorsal lateral dos animais e remove-se a gordura subcutnea em excesso, raspando
cuidadosamente. Cortam-se discos cutneos de aproximadamente 20 mm de dimetro. A pele pode ser
guardada antes da utilizao dos discos, desde que se demonstre que os dados de controlo (positivos e
negativos) so equivalentes aos obtidos com pele fresca.
Cada disco cutneo colocado numa das extremidades de um tubo de politetrafluoroetileno (PTFE), com a
superfcie epidrmica em contacto com o tubo. A pele bem fixada na extremidade do tubo com uma anilha
trica tensa de borracha, eliminando-se o tecido em excesso. As dimenses do tubo e da anilha so as indicadas
na figura 2. A anilha a seguir envolvida em vaselina, de forma a garantir a estanquidade da sua unio com o
tubo de PTFE. O tubo depois suspenso, com uma tampa-suporte de molas, dentro de uma cmara receptora
com uma soluo de sulfato de magnsio (MgSO
4
) 154 mM (figura 1). O disco cutneo deve ficar totalmente
imerso na soluo de MgSO
4
. Cada pele de rato pode fornecer de 10 a 15 discos cutneos.
Como procedimento de controlo de qualidade, antes de se iniciar o ensaio mede-se a resistncia elctrica de
dois discos cutneos de cada pele de animal. Para que os restantes discos possam ser utilizados no ensaio,
ambos os discos devem permitir obter valores de resistncia superiores a 10 k. Se o valor da resistncia for
inferior a 10 k os discos restantes da pele em causa sero rejeitados.
1.5.3. Aplicao das substncias em estudo e de controlo
Para garantir a adequabilidade do modelo experimental, devem utilizar-se em paralelo, em cada estudo, uma
amostra de controlo positiva e uma amostra de controlo negativa. Devem ser utilizados para o efeito discos
cutneos de um s animal. Como substncias de controlo sugerem-se o cido clordrico 10 M (positivo) e a
gua destilada (negativo).
As substncias em estudo lquidas so aplicadas uniformemente (150 l) na superfcie epidrmica no interior
do tubo. Quando a matria ensaiada for slida, aplicar-se- uniformemente no disco uma quantidade suficiente
da mesma, de modo a cobrir toda a superfcie epidrmica. Em seguida, deita-se gua desionizada (150 l) por
cima do slido e agita-se suavemente o tubo. Para garantir um contacto mximo com a pele, pode ser
necessrio aquecer as matrias slidas a 30
o
C, para fundir ou amolecer a substncia em estudo, ou mo-las,
para produzir um p ou granulado.
Para cada substncia em estudo e substncia de controlo sero utilizados trs discos cutneos. A substncia em
estudo aplicada a uma temperatura compreendida entre 20
o
C e 23
o
C durante 24 horas. Em seguida, a
substncia em estudo removida por lavagem em gua corrente a uma temperatura mxima de 30
o
C, at
remoo completa.
1.5.4. Medies de RET
Mede-se a impedncia (RET) da pele utilizando uma ponte de Wheatstone de baixa tenso de corrente alternada
(13). As especificaes gerais da ponte de Wheatstone so as seguintes: tenso operacional de 1 V a 3 V,
corrente alternada sinusoidal ou rectangular de 50 Hz a 1 000 Hz e gama de medio de pelo menos 0,1 k a
30 k. A ponte utilizada no estudo de validao media valores de indutncia, capacitncia e resistncia at
2 000 H, 2 000 F e 2 M, respectivamente, a frequncias de 100 Hz ou 1 kHz, utilizando valores em srie ou
em paralelo. Para o ensaio RET de corrosividade, as medies so registadas em resistncia, frequncia de
100 Hz, utilizando valores em srie. Antes da medio da resistncia elctrica, reduz-se a tenso superficial da
pele adicionando um volume de etanol a 70 % suficiente para cobrir toda a epiderme. Aps alguns segundos,
remove-se o etanol do tubo e hidrata-se o tecido adicionando 3 ml de soluo de sulfato de magnsio 154 mM.
Para medir a resistncia do disco cutneo em k, colocam-se os elctrodos da ponte de Wheatstone de cada um
dos lados do disco (figura 1). As dimenses dos elctrodos e o comprimento de cada elctrodo abaixo da pina
tipo crocodilo so indicados na figura 2. A pina aplicada ao elctrodo interno deve ficar apoiada no rebordo
do tubo de PTFE durante a medio da resistncia, de forma a garantir que o comprimento de elctrodo
mergulhado na soluo de sulfato de magnsio seja constante. O elctrodo externo deve ser colocado dentro da
cmara receptora de forma a tocar no fundo da mesma. A distncia entre a tampa-suporte de molas (spring clip)
e o fundo do tubo de PTFE deve ser mantida constante (figura 2), porque afecta o valor de resistncia medido. A
distncia entre o elctrodo interno e o disco cutneo deve ser mnima (1 mm a 2 mm) e constante.
Se o valor de resistncia medido exceder 20 k, tal pode dever-se presena de restos da substncia em estudo
na superfcie epidrmica do disco cutneo. Para eliminar essas matrias, poder, por exemplo, tapar-se o tubo
de PTFE com o polegar, usando luvas de borracha, e agitar-se durante cerca de 10 segundos. Rejeita-se a soluo
de sulfato de magnsio e repete-se a medio da resistncia com soluo fresca de MgSO
4
.
As propriedades e dimenses da montagem de ensaio e o procedimento experimental aplicado podem
influenciar os valores de RET obtidos. O limite de corroso de 5 k foi estabelecido a partir de dados obtidos
com a montagem e segundo os procedimentos especificamente descritos no presente mtodo. Podero ser
aplicveis outros valores-limite e de controlo se as condies de ensaio forem alteradas ou for utilizada uma
montagem diferente. , portanto, necessrio calibrar a metodologia e os valores-limite de resistncia ensaiando
uma srie de padres de referncia seleccionados das substncias qumicas utilizadas no estudo de validao (4)
(5), ou de classes qumicas similares s das substncias qumicas em estudo. Figuram no quadro 1 uma srie de
substncias qumicas adequadas.
1.5.5. Mtodos da ligao de corante
A exposio a determinadas matrias no corrosivas pode originar uma reduo da resistncia para valores
inferiores ao limite de 5 k, ao permitir a passagem de ies atravs do stratum corneum, que se traduz numa
reduo da resistncia elctrica (5). Determinados compostos orgnicos neutros e substncias qumicas
tensioactivas (detergentes, emulsionantes e outras substncias tensioactivas), por exemplo, podem remover os
lpidos cutneos, da resultando uma maior permeabilidade inica da barreira. Por esta razo, se os valores de
RET das substncias em estudo forem inferiores a 5 kV ou prximos deste limite, sem que haja danos visveis,
deve ser efectuada uma avaliao da penetrao de um corante nos tecidos de controlo e nos tecidos tratados,
para determinar se os valores de RET obtidos se deveram a uma maior permeabilidade cutnea ou corroso da
pele (3) (5). Neste ltimo caso, se o stratum corneum estiver danificado, o corante sulforrodamina B, uma vez
aplicado na superfcie da pele, penetrar rapidamente e colorar o tecido subjacente. Este corante especfico
estvel a uma grande variedade de substncias qumicas e no afectado pelo processo de extraco acima
referido.
1.5.5.1. Aplicao e eliminao do corante sulforrodamina B
Depois da determinao da RET, a soluo de sulfato de magnsio removida do tubo e verifica-se
cuidadosamente se a pele apresenta danos evidentes. Se a pele no apresentar danos importantes evidentes,
aplica-se um volume de 150 l de uma soluo a 10 % (m/v) de corante sulforrodamina B (vermelho cido 52;
C.I. 45100; n.
o
EINECS 222-529-8; n.
o
CAS 3520-42-1), em gua destilada, superfcie epidrmica de cada
disco cutneo, durante duas horas. Lavam-se em seguida os discos em gua corrente, temperatura ambiente,
durante cerca de 10 segundos, a fim de remover o corante em excesso/no fixado. Retiram-se cuidadosamente
os discos cutneos de cada tubo de PTFE e colocam-se num recipiente (por exemplo, um frasco de vidro de 20
ml) com gua desionizada (8 ml). Agitam-se cuidadosamente os frascos durante 5 minutos, para remover os
restos de corante que eventualmente no se tenham fixado. Repete-se este procedimento de lavagem e
transferem-se os discos cutneos para frascos que contenham 5 ml de uma soluo a 30 % (m/v) de
dodecilsulfato de sdio em gua destilada, incubando-se a 60
o
C de um dia para o outro.
Depois da incubao, os discos cutneos so retirados e rejeitados e a soluo remanescente em cada frasco
centrifugada durante 8 minutos a 21
o
C (fora relativa de centrifugao: ~175 x g). Dilui-se ento 1:5 (v/v- ou
seja, 1 ml + 4 ml) uma amostra de 1 ml do lquido sobrenadante com uma soluo a 30 % (m/v) de
dodecilsulfato de sdio em gua destilada. Mede-se a densidade ptica da soluo resultante a 565 nm.
1.5.5.2. Clculo da concentrao de corante
A concentrao do corante sulforrodamina B por disco calculada a partir dos valores de densidade ptica (5)
(coeficiente de extino molar do corante sulforrodamina B a 565 nm = 8,7 x10
4
; massa molecular = 580).
Utilizando uma curva de calibrao apropriada, determina-se a concentrao de corante correspondente a cada
disco cutneo, calculando-se em seguida uma concentrao mdia de corante para os replicados.
2. RESULTADOS
Os valores de resistncia (em k) e os valores mdios da concentrao de corante (g/disco), se for caso disso,
correspondentes matria em estudo e s amostras de controlo positiva e negativa devem ser apresentados
num quadro recapitulativo de resultados individuais e de mdias desvio-padro (incluindo resultados dos
replicados/repeties e os valores individuais e mdios).
Os valores mdios de RET obtidos sero aceites se os valores das amostras de controlo positiva e negativa
correspondentes se encontrarem dentro dos intervalos aceitveis para o mtodo no laboratrio de ensaio. Os
intervalos de resistncia aceitveis para o mtodo e a montagem acima descritos so indicados no quadro
seguinte:
Amostra de controlo Substncia Intervalo de resistncia (k)
Positiva cido clordrico 10 M 0,5-1,0
Negativa gua destilada 10-25
Os valores mdios obtidos para a ligao do corante sero aceites se os valores das amostras de controlo
correspondentes se encontrarem dentro dos intervalos aceitveis para o mtodo. Os intervalos aceitveis de
concentrao de corante que se sugerem para as substncias de controlo, para o mtodo e a montagem acima
descritos, so indicados no quadro seguinte:
Amostra de controlo Substncia
Intervalo de concentrao de corante
(g/disco)
Positiva cido clordrico 10 M 40-100
Negativa gua destilada 15-35
A substncia em estudo ser considerada no corrosiva da pele:
i) Se o valor mdio de RET obtido para a substncia em estudo exceder 5 k, ou
ii) Se o valor mdio de RET foi inferior ou igual a 5 k, e
o disco cutneo no apresentar danos evidentes, e
a concentrao mdia de corante do disco for bastante inferior concentrao mdia de corante do
disco da amostra de controlo positiva de HC1 10 M correspondente.
A substncia em estudo ser considerada corrosiva da pele:
i) Se o valor mdio de RET foi inferior ou igual a 5 k e o disco cutneo apresentar danos evidentes, ou
ii) Se o valor mdio de RET foi inferior ou igual a 5 k, e
o disco cutneo no apresentar danos evidentes, mas
a concentrao mdia de corante do disco for igual ou superior concentrao mdia de corante
do disco da amostra de controlo positiva de HC1 10 M correspondente.
3. RELATRIOS
Substncias em estudo e de controlo:
Denominao ou denominaes qumicas (como as denominaes IUPAC ou CAS e o n.
o
CAS, se forem
conhecidos);
Grau de pureza e composio da substncia ou preparao (em percentagem ponderai), natureza fsica;
Propriedades fsico-qumicas (estado fsico, pH, estabilidade, hidrossolubilidade) relevantes para o
estudo;
Tratamento das substncias em estudo/de controlo antes do ensaio, se for o caso (por exemplo,
aquecimento, moagem);
Estabilidade, se for conhecida.
Linhagem e sexo utilizados;
Idade dos animais no momento em que foram dadores;
Provenincia, condies de alojamento, alimentao, etc.;
Pormenores sobre a preparao da pele.
Condies de ensaio:
Curvas de calibrao da montagem de ensaio;
Curvas de calibrao para o ensaio de ligao do corante;
Pormenores sobre o mtodo de ensaio utilizado na medio das RET;
Pormenores sobre o mtodo de ensaio utilizado na medio da ligao do corante, se tiver sido o caso;
Descrio de eventuais modificaes dos mtodos de ensaio;
Descrio dos critrios de avaliao utilizados.
Resultados:
Quadro recapitulativo dos resultados dos ensaios de determinao das RET e da ligao do corante (se
tiver sido o caso), por animal e amostra de pele;
Descrio dos efeitos eventualmente observados.
Concluses.
4. REFERNCIAS
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(11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro Skin Corrosion Test Guideline
Proposal, Berlin, 1st 2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th March 2002,
OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat
(12) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C., (1986) An in vitro skin corrosivity test -modificationsand
validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, p. 507-512.
(13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J.,
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(14) Worth A.P., Fentem J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile D.J., Liebsch, M., (1998)
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(15) Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, M., Whittle, E., York, M., (1997) The
classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, p. 845-852.
(16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C., (1988) An In Vitro model for identifying skin-corrosive
chemicals. I. Initial Validation. Toxicology In Vitro. 2, p. 7-17.
Figura 1
Montagem para o ensaio da RET em pele de rato
Figura 2
Dimenses do tubo de politetrafluoroetileno (PTFE) e do tubo receptor, bem como dos elctrodos utilizados
Factores crticos da montagem ilustrada:
Dimetro interno do tubo de PTFE;
Comprimento dos elctrodos em relao ao tubo de PTFE e ao tubo receptor, para que os elctrodos no
toquem no disco cutneo e de modo que um comprimento fixo de elctrodo esteja em contacto com a
soluo de MgSO
4
;
A quantidade de soluo de MgSO
4
no tubo receptor deve proporcionar um nvel de lquido, em relao
ao nvel no tubo de PTFE, conforme o ilustrado na figura 1;
O disco cutneo deve ser convenientemente fixado ao tubo de PTFE, para que a resistncia elctrica seja
uma medida fivel das propriedades da pele.
B.40.A. CORROSO DA PELE IN VITRO: ENSAIO EM MODELOS DE PELE HUMANA
1. MTODO
Este mtodo de ensaio equivalente ao OECD TG 431 (2004).
1.1. INTRODUO
Entende-se por corroso da pele a produo de danos irreversveis nos tecidos cutneos por aplicao de uma
matria em estudo (definida de acordo com o sistema harmonizado global de classificao e rotulagem das
misturas e substncias qumicas) (1). O presente mtodo de ensaio no requer a utilizao de animais vivos,
nem de tecidos animais, para a determinao da corrosividade cutnea.
A determinao da corrosividade cutnea tem normalmente feito uso de animais de laboratrio (2). A
preocupao com a dor e o sofrimento inerentes a esse processo levou reviso do mtodo de ensaio B.4,
tendo passado a ser possvel determinar a corroso da pele por mtodos alternativos (in vitro), que evitam a dor
e o sofrimento de animais.
A primeira etapa com vista definio de ensaios alternativos que pudessem ser utilizados na determinao da
corrosividade cutnea num contexto legislativo foi a realizao de estudos de pr-validao (3). Seguidamente,
foi realizado um estudo com vista validao formal de mtodos in vitro para a determinao da corroso da
pele (4) (5) (6) (7) (8). O resultado desses estudos e outra literatura publicada (9) conduziram recomendao
de que poderiam ser utilizados para determinar a corrosividade cutnea in vivo (10) (11) (12) (13) o ensaio em
modelos de pele humana (o presente mtodo) e o ensaio da resistncia elctrica transcutnea (ver o mtodo de
ensaio B.40).
Os estudos de validao concluram que os ensaios em modelos de pele humana (3) (4) (5) (9) permitem
distinguir com fiabilidade as substncias reconhecidamente corrosivas da pele das que o no so. O protocolo
de ensaio pode estabelecer igualmente uma primeira distino entre substncias muito corrosivas e menos
corrosivas da pele.
O ensaio descrito no presente mtodo permite identificar misturas e substncias qumicas corrosivas. Permite
igualmente identificar misturas e substncias qumicas no corrosivas, quando associado a outras informaes
disponveis (por exemplo, pH, relaes estrutura-actividade, dados humanos ou em animais) que corroborem
tais caractersticas (1) (2) (13) (14). O mtodo no permite normalmente obter informaes adequadas sobre a
irritao da pele, nem permite dividir as substncias corrosivas em categorias (como as previstas no sistema de
classificao harmonizado global) (1).
Para uma avaliao completa dos efeitos locais na pele aps uma exposio nica por via drmica recomenda-
-se a aplicao da estratgia de ensaio sequencial apensa ao mtodo de ensaio B.4 (2) e associada ao sistema
harmonizado global (1). Essa estratgia de ensaio inclui a realizao de ensaios de corroso da pele (descritos
no presente mtodo) e de irritao da pele in vitro antes de ser ponderada a realizao de ensaios em animais
vivos.
1.2. DEFINIES
Corroso da pele in vivo: Produo de danos irreversveis pele, nomeadamente a necrose visvel da epiderme,
prolongando-se para a derme, aps a aplicao de uma substncia em estudo durante um mximo de quatro
horas. So exemplos tpicos de reaces corrosivas as lceras, hemorragias e escaras sanguinolentas e, para o
final do perodo de observao de 14 dias, a descolorao, devido perda de pigmentao da pele, a formao
de zonas de alopecia total e a ocorrncia de cicatrizes. As leses duvidosas podero ser esclarecidas por
mtodos histopatolgicos.
Viabilidade celular: Parmetro que mede a actividade total de uma populao celular (por exemplo,
capacidade das desidrogenases mitocondriais celulares de reduzirem o pigmento vital MTT); consoante o
parmetro determinado e o tipo de ensaio realizado, possvel correlacionar a viabilidade celular com o
nmero total e/ou a vitalidade das clulas.
Quadro 1
Substncias qumicas de referncia
1,2-Diaminopropano 201-155-9 78-90-0 Extremamente corrosivo
cido acrlico 201-177-9 79-10-7 Extremamente corrosivo
2-terc-Butilfenol 201-807-2 88-18-6 Corrosivo
Hidrxido de potssio (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Corrosivo
cido sulfrico (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Corrosivo
cido octanico (cido caprlico) 204-677-5 124-07-02 Corrosivo
4-Amino-1,2,4-triazole 209-533-5 584-13-4 No corrosivo
Eugenol 202-589-1 97-53-0 No corrosivo
Brometo de fenetilo 203-130-8 103-63-9 No corrosivo
Tetracloroetileno 204-825-9 27-18-4 No corrosivo
cido isoesterico 250-178-0 30399-84-9 No corrosivo
4-(Metiltio)-benzaldedo 222-365-7 3446-89-7 No corrosivo
A maioria das substncias qumicas constantes do quadro foi retomada da lista seleccionada para o estudo de
validao internacional do ECVAM (4). A seleco baseia-se nos seguintes critrios:
i) Nmero idntico de substncias corrosivas e no corrosivas;
ii) Substncias disponveis no comrcio e da maioria das classes qumicas pertinentes;
iii) Incluso de substncias extremamente corrosivas e de substncias menos corrosivas, para possibilitar
uma diferenciao com base no poder corrosivo;
iv) Escolha de substncias qumicas que podem ser manuseadas no laboratrio sem outros perigos graves
alm da corrosividade.
A matria em estudo aplicada localmente num modelo tridimensional de pele humana que inclua, pelo
menos, uma epiderme reconstruda, com um stratum corneum funcional. As matrias corrosivas so
identificadas pela sua capacidade de diminuio da viabilidade celular [determinada, por exemplo, pelo ensaio
de reduo do MTT (15)] para valores inferiores a limites definidos aps perodos de exposio especificados. O
princpio do ensaio em modelos de pele humana baseia-se na hiptese de as substncias qumicas corrosivas
conseguirem penetrar o stratum corneum por difuso ou eroso, revelando-se citotxicas para as camadas
celulares subjacentes.
1.4.1. Mtodo
1.4.1.1. Modelos de pele humana
Os modelos de pele humana podem ser construdos ou obtidos comercialmente (por exemplo, os modelos
EpiDerm e EPISKIN) (16) (17) (18) (19) ou ser desenvolvidos ou construdos no laboratrio de ensaio
(20) (21). sabido que a utilizao de pele humana est sujeita a condies e consideraes nacionais e
internacionais de natureza tica. Os novos modelos devem ser sempre validados (pelo menos na perspectiva
descrita no ponto 1.4.1.1.2). Os modelos de pele humana utilizados no presente ensaio devem respeitar
obrigatoriamente as seguintes condies:
1.4.1.1.1. Cond i e s g e r a i s d o mod e l o
Na construo do epitlio devem ser utilizados queratincitos humanos. Devem estar presentes mltiplas
camadas de clulas epiteliais viveis, sob um stratum corneum funcional. O modelo cutneo tambm pode
compreender uma camada estromtica. O stratum corneum deve ter mltiplas camadas com o perfil lipdico
necessrio para produzir uma barreira funcional suficientemente robusta para resistir a uma penetrao rpida
de marcadores citotxicos. As propriedades de conteno do modelo devem impedir a passagem de matria
para o tecido vivel por contorno do stratum corneum. O contorno do stratum corneum pelas substncias
qumicas em estudo redundaria numa modelizao deficiente da exposio cutnea. O modelo cutneo no
deve estar contaminado por bactrias (incluindo micoplasmas) ou fungos.
1.4.1.1.2. Cond i e s f unc i ona i s d o mod e l o
O grau de viabilidade normalmente quantificado utilizando MTT ou outros corantes vitais convertidos por via
metablica. Nesses casos, a densidade ptica do corante (solubilizado) extrado da amostra de controlo negativa
de tecido deve ser, pelo menos, vinte vezes maior do que a densidade ptica do solvente de extraco
isoladamente [ver mais pormenores em (22)]. A amostra de controlo negativa de tecido deve ser estvel em
cultura (deve permitir obter medies de viabilidade similares) durante o perodo de exposio do ensaio. O
stratum corneum deve ser suficientemente robusto para resistir penetrao rpida de determinadas substncias
qumicas marcadoras citotxicas (por exemplo, o Triton X-10 a 1 %). Esta propriedade pode ser estimada
atravs do tempo de exposio necessrio para reduzir a viabilidade celular em 50 % (TE50) (no caso dos
modelos EpiDerm e EPISKIN, por exemplo, esse tempo superior a 2 horas). O tecido deve ser reprodutvel ao
longo do tempo e, de preferncia, de laboratrio para laboratrio. Deve, alm disso, permitir prever o poder
corrosivo das substncias qumicas de referncia (ver o quadro 1), quando utilizado no protocolo de ensaio
seleccionado.
1.4.1.2. Aplicao das substncias em estudo e de controlo
Em cada tratamento (tempo de exposio), incluindo no caso das amostras de controlo, utilizado um
duplicado de tecido. No caso das matrias lquidas, aplica-se uma quantidade de substncia em estudo suficiente
para cobrir uniformemente toda a superfcie de pele (no mnimo 25 l/cm
2
). No caso das matrias slidas,
aplica-se uniformemente uma quantidade de substncia em estudo suficiente para cobrir toda a pele, sendo a
mesma depois humidificada, com gua desionizada ou destilada, para garantir um bom contacto com a pele. Se
necessrio, os slidos sero reduzidos por moagem a uma forma pulverulenta antes da aplicao. O mtodo de
aplicao deve ser adequado substncia em estudo [ver, por exemplo, (5)]. Aps o perodo de exposio, a
matria em estudo deve ser cuidadosamente removida da superfcie da pele, por lavagem com uma soluo-
-tampo adequada ou NaCl a 0,9 %.
Para garantir a adequabilidade do modelo experimental, devem utilizar-se em paralelo, em cada estudo, uma
amostra de controlo positiva e uma amostra de controlo negativa. As substncias sugeridas para as amostras de
controlo positivas so o cido actico glacial ou KOH 8N. Para as amostras de controlo negativas so sugeridos
NaCl a 0,9 % ou gua.
1.4.1.3. Medio da viabilidade celular
Na medio da viabilidade celular s podero utilizar-se mtodos quantitativos validados. O tipo de medio de
viabilidade deve, alm disso, poder ser utilizado num tecido de construo tridimensional. No deve haver
interferncias de ligaes inespecficas de corantes na medio de viabilidade. Os corantes que se liguem a
protenas e os que no sofram converso metablica (por exemplo, o vermelho neutro) no so, portanto,
adequados. O ensaio mais frequentemente utilizado o da reduo do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-
-il)-2,5-difeniltetrazlio, azul de tiazolil; n.
o
EINECS 206-069-5; n.
o
CAS 298-93-1), que se demonstrou
permitir obter resultados rigorosos e reprodutveis (5), embora possam ser utilizados outros. Coloca-se a
amostra de pele numa soluo de MTT de concentrao apropriada (por exemplo, 0,3-1 mg/ml), a uma
temperatura de incubao adequada, durante 3 horas. O precipitado azul do derivado formazan depois
extrado com um solvente (isopropanol), medindo-se a concentrao do formazan por determinao da
densidade ptica a um comprimento de onda compreendido entre 540 nm e 595 nm.
A aco qumica da matria em estudo no corante vital pode assemelhar-se do metabolismo celular, da
resultando uma estimativa falsa de viabilidade. Demonstrou-se a ocorrncia deste fenmeno quando uma
matria em estudo com tais caractersticas no fora completamente removida da pele por lavagem (9). Se a
matria em estudo agir directamente sobre o corante vital, ser necessrio utilizar amostras de controlo
suplementares para detectar e corrigir a interferncia das substncias em estudo na medio da viabilidade (9)
(23).
2. RESULTADOS
Para cada tecido, os valores de densidade ptica e as percentagens calculadas de viabilidade celular
correspondentes matria em estudo e s amostras de controlo positiva e negativa devem ser apresentados
num quadro recapitulativo, incluindo os resultados dos replicados ou repeties, consoante o caso, e os valores
individuais e mdios.
Os valores de densidade ptica obtidos para cada amostra em estudo podem ser utilizados para calcular uma
percentagem de viabilidade em relao amostra de controlo negativa (que arbitrariamente fixada em 100 %).
A percentagem de viabilidade celular que estabelece a diferenciao entre as matrias em estudo corrosivas e
no corrosivas (ou entre diferentes classes de corrosividade) ou o(s) mtodo(s) estatstico(s) utilizado(s) para
avaliar os resultados e identificar as matrias corrosivas devem ser claramente definidos e documentados e deve
ser demonstrado que so adequados. Em geral, esses valores-limite de diferenciao so estabelecidos durante a
optimizao dos ensaios, testados durante uma fase de pr-validao e confirmados num estudo de validao.
A ttulo de exemplo, a previso de corrosividade associada ao modelo EpiDerm
TM
a seguinte (9):
A substncia em estudo ser considerada corrosiva da pele:
i) Se a viabilidade aps uma exposio de 3 minutos for inferior a 50 %; ou
ii) Se a viabilidade aps uma exposio de 3 minutos for igual ou superior a 50 % e a viabilidade aps uma
exposio de 1 hora for inferior a 15 %.
A substncia em estudo ser considerada no corrosiva da pele:
i) Se a viabilidade aps uma exposio de 3 minutos for igual ou superior a 50 % e a viabilidade aps uma
exposio de 1 hora for igual ou superior a 15 %.
3. RELATRIOS
Substncia em estudo e de controlo:
Denominao ou denominaes qumicas (como as denominaes IUPAC ou CAS e o n.
o
CAS, se forem
conhecidos);
Grau de pureza e composio da substncia ou preparao (em percentagem ponderal);
Propriedades fsico-qumicas (estado fsico, pH, estabilidade, hidrossolubilidade) relevantes para o
estudo;
Tratamento das substncias em estudo/de controlo antes do ensaio, se for o caso (por exemplo,
aquecimento, moagem);
Estabilidade, se for conhecida.
Justificao do modelo cutneo e do protocolo utilizados.
Condies de ensaio:
Sistema celular utilizado;
Informaes sobre a calibrao do equipamento de medio utilizado para medir a viabilidade celular
(por exemplo, espectrofotmetro);
Informaes completas que substanciem o modelo cutneo especfico utilizado, incluindo sobre a
validade do mesmo;
Pormenores sobre o mtodo de ensaio utilizado;
Doses de ensaio utilizadas;
Descrio de eventuais modificaes do mtodo de ensaio;
Referncia a dados anteriormente publicados sobre o modelo;
Descrio dos critrios de avaliao utilizados.
Resultados:
Quadro recapitulativo dos resultados correspondentes a cada amostra de ensaio;
Descrio de outros efeitos eventualmente observados.
Concluso.
4. REFERNCIAS
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for Human Health and Environmental
Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33.
ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
(2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/Corrosion.
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C.,
Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W.,
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(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P., and Worth, A.P., (1998) The ECVAM
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(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A.,
Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., and Zucco, F., (1995)
Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. Test report and recommendations of
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(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods)., (1997)
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/iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
(9) Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H., Uphill, P., Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C.,
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Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH
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B.41. ENSAIO DE FOTOTOXICIDADE IN VITRO 3T3 NRU
l. MTODO
Este mtodo equivalente ao OECD TG 432 (2004).
1.1. INTRODUO
A fototoxicidade definida como uma reaco txica a uma substncia aplicada ao corpo que desencadeada
ou intensificada (quando j se manifeste a doses inferiores) pela exposio subsequente luz, ou induzida pela
irradiao da pele depois da administrao sistmica da substncia.
O ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU utilizado para definir o potencial fototxico de uma substncia
em estudo, induzido pela substncia qumica excitada por exposio luz. O ensaio avalia a fototoxicidade
atravs da reduo relativa da viabilidade de clulas expostas substncia qumica na presena de luz,
comparativamente obscuridade. As substncias que respondam a este ensaio sero provavelmente fototxicas
in vivo, aps aplicao sistmica e difuso pela pele ou aps aplicao tpica.
Tm sido referidos os efeitos fototxicos induzidos por muitos tipos de substncias qumicas (1) (2) (3) (4). A
caracterstica comum dessas substncias a capacidade de absorverem energia luminosa da radiao solar. De
acordo com a primeira lei da fotoqumica (lei de Grotthaus-Draper), necessria a absoro de uma quantidade
suficiente de quanta de luz para que se observe uma fotorreaco. Antes de ser ponderada a realizao de
ensaios biolgicos , portanto, necessrio determinar, pelo mtodo OECD TG 101, o espectro de absoro no
UV/visvel da substncia qumica em estudo. Tem sido referido que, se o coeficiente de absoro/extino molar
for inferior a 10 l.mol
-1
.cm
-1
, a substncia qumica no ser provavelmente fotorreactiva. Uma substncia
qumica com tais caractersticas poder no necessitar de ser submetida ao ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3
NRU ou a qualquer outro ensaio biolgico para a determinao de efeitos fotoqumicos adversos (1) (5). Ver
igualmente o anexo 1.
A fiabilidade e pertinncia do ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU foram recentemente avaliadas (6) (7)
(8) (9). O ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU revelou-se capaz de prever efeitos fototxicos agudos em
animais e pessoas in vivo. O ensaio no se destina a prever outros efeitos adversos que possam resultar da aco
combinada de uma substncia qumica e da luz no trata, por exemplo, da fotogenotoxicidade, da fotoalergia
ou da fotocareinogenicidade , nem permite determinar o poder fototxico. O ensaio tambm no cobre
mecanismos indirectos de fototoxicidade, efeitos de metabolitos das substncias em estudo ou efeitos de
misturas.
Embora, de modo geral, seja necessrio recorrer a sistemas de activao metablica em todos os ensaios in vitro
de previso de potenciais genotxicos ou carcinognicos, no domnio da fototoxicologia so ainda raros os
exemplos de substncias qumicas que necessitem de transformao metablica para agirem como fototoxina in
vivo ou in vitro. No , portanto, considerado necessrio, nem cientificamente justificado, utilizar um sistema de
activao metablica no presente ensaio.
1.2. DEFINIES
Irradincia: Intensidade da radiao ultravioleta (UV) ou da luz visvel que incide numa superfcie, expressa em
W/m
2
ou mW/cm
2
.
Dose de radiao: Quantidade (= intensidade x tempo) de radiao ultravioleta (UV) ou de luz visvel que
incide numa superfcie, expressa em joules (= W x s) por unidade de superfcie (por exemplo, J/m ou J/cm
2
).
Bandas de comprimento de onda de radiao UV: As designaes recomendadas pela CIE (Commission
Internationale de l'clairage) so: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) e UVC (100-280 nm). Tambm se
utilizam outras designaes: a separao entre os UVB e os UVA frequentemente situada a 320 nm, podendo
as radiaes UVA subdividir-se em UV-A1 e UV-A2, com a separao a cerca de 340 nm.
Viabilidade celular: Parmetro que mede a actividade total de uma populao celular (por exemplo, absoro
do pigmento vital vermelho neutro pelos lisossomas celulares); consoante a varivel determinada e o tipo de
ensaio realizado, possvel correlacionar a viabilidade celular com o nmero total e/ou a vitalidade das clulas.
Viabilidade celular relativa: Viabilidade celular expressa em relao a amostras de controlo (negativas)
constitudas pelo solvente e submetidas a todo o procedimento de ensaio (+ Irr ou - Irr), excludo o tratamento
com a substncia em estudo.
PIF (photo irritation factor factor de fotoirritao): Factor obtido por comparao entre duas
concentraes citotxicas igualmente eficazes (CI50) da substncia qumica em estudo, respectivamente sem
(- Irr) e com (+ Irr) exposio a uma dose no citotxica de radiao UVA/luz visvel.
CI
50
: Concentrao da substncia qumica em estudo que reduz a viabilidade celular em 50 %.
MPE (mean photo effect fotoefeito mdio): Parmetro obtido por tratamento matemtico das duas curvas
de concentrao obtidas sem (- Irr) e com (+ Irr) exposio a uma dose no citotxica de radiao UVA/luz
visvel.
Fototoxicidade: Reaco txica aguda desencadeada pela primeira exposio da pele a determinadas
substncias qumicas, seguida de exposio luz, ou analogamente induzida por irradiao da pele depois da
administrao sistmica da substncia.
O ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU baseia-se na comparao da citotoxicidade de uma substncia
qumica com ou sem exposio a uma dose no citotxica de luz solar simulada. No mbito deste ensaio, a
citotoxicidade expressa pela reduo, funo da concentrao, da absoro do pigmento vital vermelho
neutro, medida 24 horas depois do tratamento com a substncia qumica em estudo e da irradiao (10). O
vermelho neutro (Neutral Red, NR) um corante catinico fraco que penetra facilmente nas membranas
celulares por um mecanismo distinto da difuso, acumulando-se nos lisossomas intracelulares. As alteraes da
superfcie da sensvel membrana dos lisossomas fragilizam estes ltimos e originam outras alteraes, que se
tornam gradualmente irreversveis. Essas alteraes resultantes da aco dos xenobiticos reduzem a absoro e
ligao do vermelho neutro. Pode, portanto, estabelecer-se uma distino entre clulas viveis, danificadas ou
mortas, base do presente ensaio.
Efectua-se uma cultura de clulas Balb/c 3T3 durante 24 h, para formao de monocamadas. Para cada
substncia qumica em estudo, procede-se pr-incubao, durante 1 h, de duas placas de 96 alvolos com oito
concentraes diferentes da substncia. A seguir, expe-se uma das placas mais elevada dose de irradiao no
citotxica e mantm-se a outra na obscuridade. Seguidamente, substitui-se o meio de tratamento por meio de
cultura em ambas as placas; aps nova incubao de 24 horas, determina-se a viabilidade celular atravs da
absoro do vermelho neutro. A viabilidade celular expressa em percentagem das amostras de solvente no
tratadas de controlo e calculada para cada concentrao de ensaio. Para a previso do potencial fototxico,
comparam-se as reaces, funo da concentrao, obtidas com e sem irradiao, em geral ao nvel CI
50
(concentrao que reduz a viabilidade celular a 50 %, relativamente s amostras de controlo no tratadas).
1.4.1. Preparaes
1.4.1.1. Clulas
No estudo de validao, foi utilizada uma linhagem celular permanente de fibroblastos de ratinho (Balb/c 3T3,
clone 31) proveniente da ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA) ou da ECACC (European
Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), a qual , portanto, recomendada, devendo ser
obtida de uma coleco de clulas adequadamente qualificada. Podem utilizar-se outras clulas ou linhagens
celulares, aplicando o mesmo procedimento de ensaio, se as condies de cultura forem adaptadas s
necessidades especficas das clulas em causa, embora deva, nesse caso, ser demonstrada a equivalncia.
Deve comprovar-se regularmente que as clulas no esto contaminadas por micoplasmas, s devendo as
mesmas ser utilizadas se esse tipo de microrganismo no for detectado (11).
importante comprovar periodicamente a sensibilidade das clulas s radiaes UV por aplicao do
procedimento de controlo de qualidade descrito no presente mtodo. Uma vez que a sensibilidade das clulas s
radiaes UVA pode aumentar com o nmero de repicagens, devem utilizar-se clulas Balb/c 3T3 que tenham
sido objecto do menor nmero possvel de repicagens (de preferncia menos de 100). (Ver o ponto 1.4.2.2.2 e
o anexo 2.)
Nas repicagens celulares de rotina e na execuo do ensaio, devem utilizar-se meios de cultura e condies de
incubao adequados; por exemplo, no caso das clulas Balb/c 3T3, recomenda-se a utilizao de DMEM
(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), enriquecido com soro de bovino recm-nascido (10 %), glutamina (4 mM),
penicilina (100 UI) e estreptomicina (100 g/ml), e a incubao em atmosfera hmida a 37
o
C, com 5 % a 7,5 %
de CO
2
, dependendo do tampo (ver o segundo pargrafo do ponto 1.4.1.4). particularmente importante que
as condies de cultura celular permitam manter o ciclo celular dentro dos valores normais publicados das
clulas ou linhagem celular utilizadas.
Inoculam-se num meio de cultura com a densidade adequada clulas provenientes de culturas-me congeladas,
efectuando-se pelo menos uma subcultura antes de as utilizar no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU.
Para o ensaio de fototoxicidade, inoculam-se as clulas num meio de cultura com a densidade apropriada, de
modo que as culturas no confluam durante o ensaio, ou seja, at determinao da viabilidade celular, 48 h
aps a inoculao das clulas. No caso das clulas Balb/c 3T3 cultivadas em placas de 96 alvolos, recomenda-
-se uma densidade de inoculao de 1 x 10 clulas por alvolo.
Para cada substncia qumica em estudo, inoculam-se as clulas de modo idntico em duas placas de 96
alvolos, mantendo-se depois as condies de cultura de ambas ao longo de todo o ensaio, excepto durante o
perodo de irradiao de uma das placas (+ Irr), durante o qual a outra mantida na obscuridade (- Irr).
1.4.1.4. Preparao da substncia em estudo
As substncias em estudo devem preparar-se de fresco, imediatamente antes da utilizao, excepto se se
mantiverem comprovadamente estveis na armazenagem. Recomenda-se que a manipulao da substncia
qumica e o tratamento inicial das clulas decorram sob condies de luz que evitem a fotoactivao ou
degradao da substncia em estudo antes da irradiao.
Dissolvem-se as substncias em estudo em tampes salinos, como o EBSS (Earle's Balanced Salt Solution) ou
outra soluo-tampo fisiologicamente equilibrada, isentos de componentes proteicos e de componentes que
absorvam a luz (por exemplo, corantes indicadores de pH ou vitaminas), para evitar interferncias durante a
irradiao. Dado que, durante a irradiao, as clulas so mantidas cerca de 50 minutos fora do incubador sob
atmosfera de CO
2
, necessrio tomar precaues para evitar a alcalinizao. Se forem utilizados tampes
fracos, como o EBSS, podero, para o efeito, incubar-se as clulas sob uma atmosfera com 7,5 % de CO
2
. Se as
clulas forem incubadas sob uma atmosfera com apenas 5 % de CO
2
, ser necessrio utilizar um tampo mais
forte.
As substncias qumicas em estudo fracamente solveis em gua devem ser dissolvidas num solvente adequado.
Caso se utilize um solvente, a sua concentrao volmica deve ser constante em todas as culturas, tanto nas
amostras de controlo negativas (solvente) como a todas as concentraes da substncia qumica em estudo, e o
solvente no deve ser citotxico quela concentrao. As concentraes da substncia qumica em estudo
devem ser escolhidas de modo a evitar precipitados ou turvaes.
Recomenda-se a utilizao de dimetilsulfxido (DMSO) e de etanol como solventes. Podem utilizar-se outros
solventes de baixa citotoxicidade. Antes de serem utilizados, devem, porm, avaliar-se determinadas
propriedades especficas, nomeadamente a reactividade com a substncia qumica em estudo, a atenuao do
efeito fototxico, propriedades de eliminao de radicais e/ou a estabilidade qumica no solvente.
Se necessrio, pode recorrer-se a um agitador mecnico e/ou a ultra-sons e/ou a aquecimento a temperaturas
apropriadas para facilitar a dissoluo, salvo se tal afectar a estabilidade da substncia qumica em estudo.
1.4.1.5. Condies de irradiao
1.4.1.5.1. F ont e l umi nos a
A escolha de uma fonte luminosa e de filtros adequados crucial nos ensaios de fototoxicidade. As regies do
visvel e do UVA encontram-se normalmente associadas a reaces fototxicas in vivo (3) (12), ao passo que os
UVB so, em geral, menos importantes a esse nvel, apresentando em contrapartida elevada citotoxicidade; esta
aumenta de um factor de 1 000 ao passar de um comprimento de onda de 313 nm para 280 nm (13). Os
critrios de seleco de uma fonte luminosa adequada devem incluir os requisitos da emisso de comprimentos
de onda que a substncia qumica em estudo absorva (espectro de absoro) e da obteno, num perodo de
exposio razovel, de doses de luz suficientes para a deteco das substncias qumicas fotocitotxicas
conhecidas. Alm disso, os comprimentos de onda e as doses utilizadas no devem causar danos desnecessrios
ao sistema em estudo, nomeadamente devido emisso de calor (regio do infravermelho).
Considera-se que a melhor fonte luminosa artificial constituda por simuladores de luz solar. A distribuio da
potncia de irradiao do simulador de luz solar com filtros deve ser prxima da correspondente luz solar ao
ar livre descrita em (14). Como simuladores de luz solar so utilizados arcos de xnon e arcos de mercrio
(dopado)-halogeneto metlico (15). Estes ltimos apresentam a vantagem de emitirem menos calor e de serem
mais econmicos, mas no reproduzem a luz solar to bem como os arcos de xnon. Dado que todos os
simuladores de luz solar emitem quantidades significativas de radiao UVB, devem utilizar-se filtros adequados
para atenuar os comprimentos de onda UVB, altamente citotxicos. Dado que o material de plstico utilizado
nas culturas celulares contm estabilizadores de UV, o espectro deve ser medido atravs do mesmo tipo de
cobertura das placas de 96 alvolos utilizado no ensaio. Independentemente das medidas tomadas para atenuar
partes do espectro com filtros e dos efeitos de filtro inevitveis do equipamento, o espectro registado aps os
filtros utilizados no deve desviar-se do espectro normalizado da luz solar ao ar livre (14). As referncias (8) e
(16) contm um exemplo da distribuio espectral da irradincia do simulador de luz solar com filtros utilizado
no estudo de validao do ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU. Ver igualmente a figura 1 do anexo 2.
1.4.1.5.2. Dos i me t r i a
Regularmente, antes de cada ensaio de fototoxicidade, deve comprovar-se a intensidade luminosa (irradincia)
com um medidor de UV de banda larga adequado. A intensidade deve ser medida atravs do mesmo tipo de
cobertura das placas de 96 alvolos utilizado no ensaio. O medidor de UV deve ter sido previamente calibrado
para a fonte luminosa. Deve comprovar-se o desempenho do medidor de UV, recomendando-se para tal a
utilizao de um segundo medidor de UV de referncia do mesmo tipo, calibrado do mesmo modo. O ideal
seria utilizar, mais espaadamente, um espectrorradimetro para medir o espectro de irradiao da fonte
luminosa filtrada e comprovar a calibrao do medidor de UV de banda larga.
Verificou-se que uma dose de 5 J/cm
2
(medida na regio UVA) no citotxica para as clulas Balb/c 3T3 e
suficientemente potente para excitar as substncias qumicas, desencadeando reaces fototxicas (6)(17); por
exemplo, para obter 5 J/cm
2
em 50 minutos, ajustou-se a irradincia a 1,7 mW/cm
2
. Ver igualmente a figura 2
do anexo 2. Caso se utilize outra linhagem celular ou outra fonte luminosa, pode ser necessrio regular a dose
irradiante, seleccionando-a de modo a que seja suficiente para excitar as fototoxinas de referncia sem danificar
as clulas. A durao da exposio luminosa calculada do seguinte modo:
tmin =
dose de irradiao J = cm
2
1000
irradincia mW = cm
2
60
(1 J = 1 W.s)
1.4.2.1. Concentraes da substncia em estudo
As gamas de concentrao da substncia qumica em estudo com (+ Irr) e sem (- Irr) irradiao devem ser
determinadas de forma adequada, em ensaios de determinao da gama de concentraes. Pode ser til
determinar a solubilidade de incio e aos 60 minutos (ou aps um perodo correspondente ao tempo de
tratamento a utilizar), pois esse parmetro pode variar ao longo do tempo ou durante a exposio. Para evitar
efeitos txicos induzidos por condies de cultura inadequadas ou por substncias qumicas muito cidas ou
muito alcalinas, o pH das culturas celulares com a substncia qumica em estudo deve situar-se entre 6,5 e 7,8.
A concentrao mais elevada da substncia qumica em estudo deve situar-se na gama de condies fisiolgicas
de ensaio; devem, nomeadamente, ser evitadas situaes de tenso osmtica ou de pH. Consoante a substncia
qumica em estudo, pode ser necessrio ter em conta outras propriedades fsico-qumicas como factor limitante
da concentrao de ensaio mais elevada. No caso das substncias relativamente insolveis que no sejam
txicas a concentraes at ao ponto de saturao, deve ser ensaiada a concentrao mxima possvel. Em geral,
deve ser evitada a precipitao da substncia qumica em estudo a qualquer concentrao de ensaio. A
concentrao mxima de uma substncia em estudo no deve exceder 1 000 g/ml; a osmolaridade no deve
exceder 10 mmolar. Deve ser utilizada uma srie geomtrica de diluies constituda por oito concentraes da
substncia em estudo, com um factor de diluio constante (ver segundo pargrafo do ponto 2.1).
Se existirem dados (obtidos num ensaio de determinao da gama de concentraes) que revelem que a
substncia qumica em estudo no citotxica at concentrao-limite no ensaio sem irradiao (- Irr), mas
fortemente citotxica quando irradiada (+ Irr), a gama de concentraes a seleccionar para o ensaio com
irradiao (+ Irr) pode diferir da gama de concentraes seleccionada para o ensaio sem irradiao, para
satisfazer os requisitos de adequabilidade da qualidade dos dados.
1.4.2.2. Amostras de controlo
1.4.2.2.1. S e ns i bi l i d a d e c e l ul a r r a d i a o, e s t a be l e c i me nt o d e d a d os d e r e f e r nc i a
A sensibilidade das clulas fonte luminosa deve ser verificada regularmente (aproximadamente todas as cinco
repicagens) determinando a viabilidade celular aps exposio a doses crescentes de irradiao. Nessa
determinao, devem ser utilizadas vrias doses de irradiao, incluindo nveis substancialmente superiores aos
utilizados no ensaio de fototoxicidade 3T3 NRU. Essas doses so mais facilmente quantificadas atravs de
medies na regio do ultravioleta da fonte luminosa. A densidade de inoculao das clulas deve ser idntica
que ser irradiada no dia seguinte no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU. A viabilidade celular
determinada no dia imediato com base na absoro do vermelho neutro. Deve ser demonstrado que a dose no
citotxica mais elevada resultante [5 J/cm
2
(UVA) no estudo de validao, por exemplo] se revelou suficiente
para classificar correctamente as substncias qumicas de referncia (quadro 1).
1.4.2.2.2. S e ns i bi l i d a d e r a d i a o no e ns a i o e m c ur s o
O ensaio satisfaz os critrios de qualidade se as amostras de controlo negativas (solvente) irradiadas revelarem
uma taxa de viabilidade superior a 80 %, comparativamente amostra de controlo negativa (solvente) no
irradiada.
1.4.2.2.3. Vi a bi l i d a d e a s s oc i a d a s a mos t r a s d e c ont r ol o c ons t i t u d a s pe l o s ol v e nt e
A densidade ptica absoluta (DO
540 NRU
) do vermelho neutro extrado das amostras de controlo constitudas
pelo solvente indica se as 1x10
4
clulas inoculadas em cada alvolo se reproduziram com um tempo de
duplicao normal durante os dois dias do ensaio. Um ensaio satisfaz os critrios de aceitao se a DO
540 NRU
mdia das amostras de controlo no tratadas for > 0,4 (ou seja, cerca de vinte vezes a absorvncia de fundo do
solvente).
1.4.2.2.4. Amos t r a s d e c ont r ol o pos i t i v a s
Paralelamente a cada ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU deve efectuar-se um ensaio com uma substncia
qumica fototxica conhecida. Recomenda-se a clorpromazina (CPZ). Foram definidos os seguintes critrios de
aceitao do ensaio para a utilizao de clorpromazina de acordo com o protocolo normalizado do ensaio de
fototoxicidade in vitro 3T3 NRU: CPZ irradiada (+ Irr), CI
50
= 0,1 a 2,0 g/ml; CPZ no irradiada (- Irr),
CI
50
= 7,0 a 90,0 g/ml. O factor de fotoirritao (PIF) deve ser superior a 6. Os resultados obtidos para as
amostras de controlo positivas devem ser acompanhados ao longo do tempo.
Em vez da clorpromazina podem utilizar-se nas amostras de controlo positivas submetidas em paralelo ao
ensaio outras substncias qumicas fototxicas adequadas categoria qumica ou s caractersticas de
solubilidade da substncia qumica em estudo.
1.4.3. Procedimento de ensaio (6) (7) (8) (16) (17)
1.4.3.1. Primeiro dia
Introduzir 100 l de meio de cultura nos alvolos perifricos de uma placa de microtitulao com 96 alvolos
para a cultura de tecidos (brancos). Nos restantes alvolos, introduzir 100 l de uma suspenso celular de 1
10
5
clulas/ml em meio de cultura (1 10
4
clulas por alvolo). Devem ser preparadas duas placas para cada
srie de concentraes da substncia em estudo e as amostras de controlo constitudas pelo solvente e positivas.
Incubar as clulas durante 24 h (ver o ponto 1.4.1.2), at formao de uma monocamada semiconfluente.
Este perodo de incubao permite a recuperao, a aderncia e o crescimento exponencial das clulas.
1.4.3.2. Segundo dia
Aps a incubao, decantar o meio de cultura das clulas e lavar cuidadosamente com 150 l da soluo
tamponada utilizada na incubao. Adicionar 100 l de tampo, com a concentrao adequada da substncia
qumica em estudo ou do solvente (amostra de controlo constituda pelo solvente). Constituir oito
concentraes diferentes da substncia qumica em estudo. Incubar as clulas com a substncia qumica em
estudo, na obscuridade, durante 60 minutos (ver o ponto 1.4.1.2 e o segundo pargrafo do ponto 1.4.1.4).
Das duas placas preparadas para cada srie de concentraes da substncia qumica em estudo e amostras de
controlo, uma seleccionada, em geral de forma aleatria, para a determinao da citotoxicidade (- Irr),
constituindo a placa de controlo, e a outra (a placa de tratamento) para a determinao da fototoxicidade (+ Irr).
No ensaio + Irr irradiam-se as clulas durante 50 minutos, temperatura ambiente, atravs da cobertura da
placa de 96 alvolos, com a dose mais elevada de radiao no citotxica (ver tambm o anexo 2). Manter as
placas no irradiadas (- Irr) na obscuridade, temperatura ambiente, durante 50 minutos (perodo idntico ao
da exposio luminosa).
Decantar a soluo de ensaio e lavar cuidadosamente duas vezes com 150 l da soluo tamponada utilizada
na incubao, mas sem a matria em estudo. Substituir o tampo por meio de cultura e incubar (ver o
ponto 1.4.1.2) de um dia para o outro (18 h a 22 h).
1.4.3.3. Terceiro dia
1.4.3.3.1. E x a me mi c r os c pi c o
Utilizando um microscpio de contraste de fase examinam-se o crescimento e a morfologia das clulas e a
integridade da monocamada celular. Registar as alteraes morfolgicas das clulas e os efeitos ao nvel do
crescimento celular.
1.4.3.3.2. E ns a i o d e a bs or o d o v e r me l ho ne ut r o
Lavar as clulas com 150 l de tampo pr-aquecido. Remover a soluo de lavagem batendo levemente.
Adicionar 100 l de vermelho neutro (NR, cloridrato de 3-amino-7-dimetilamino-2-metilfenazina, nmero
EINECS 209-035-8, nmero CAS 553-24-2; C.I. 50040) com a concentrao de 50 g/ml em meio sem soro
(16) e incubar conforme descrito no ponto 1.4.1.2 durante 3 horas. Depois da incubao, remover o meio com
vermelho neutro e lavar as clulas com 150 l de tampo. Decantar e remover o excesso de tampo por uma
tcnica de blotting ou por centrifugao.
Adicionar exactamente 150 l de soluo de dessoro do vermelho neutro (soluo preparada de fresco
constituda por 49 partes de gua, 50 partes de etanol e uma parte de cido actico).
Agitar cuidadosamente a placa de microtitulao num agitador prprio para esse tipo de placas, durante 10
minutos, at ao vermelho neutro ser extrado das clulas e formar uma soluo homognea.
Medir a densidade ptica do extracto de vermelho neutro a 540 nm num espectrofotmetro, utilizando os
brancos como referncia. Armazenar os resultados num ficheiro electrnico de formato adequado, para
tratamento posterior.
2. RESULTADOS
2.1. QUALIDADE E QUANTIDADE DOS RESULTADOS
Os resultados do ensaio devem permitir uma anlise significativa da resposta obtida s variaes de
concentrao com e sem irradiao, bem como, se possvel, da concentrao da substncia qumica em estudo
que reduz a viabilidade celular a 50 % (CI
50
). Caso se observe citotoxicidade, a gama de concentraes e o
intervalo entre as concentraes devem ser fixados de modo a possibilitar a adaptao de uma curva aos dados
experimentais.
No caso de resultados claramente positivos ou claramente negativos (ver o primeiro pargrafo do ponto 2.3),
pode bastar o ensaio primrio, apoiado num ou mais ensaios preliminares de determinao da gama de
concentraes.
Os resultados duvidosos, no limite ou pouco claros devem ser esclarecidos por novos ensaios (ver tambm o
segundo pargrafo do ponto 2.4). Nesses casos, deve ser ponderada a modificao das condies experimentais.
Entre as condies experimentais susceptveis de ser modificadas contam-se a gama de concentraes ou o
intervalo entre concentraes, o tempo de pr-incubao e o tempo de exposio irradiao. No caso das
substncias qumicas instveis na gua, pode ser adequado um tempo de exposio mais curto.
2.2. AVALIAO DOS RESULTADOS
Para possibilitar a avaliao dos resultados, pode ser calculado um factor de fotoirritao (PIF) ou um fotoefeito
mdio (MPE).
Para que os clculos baseados nas medies de fototoxicidade possam ser efectuados (ver abaixo), o conjunto
das respostas individuais obtidas em funo da concentrao deve ser traduzido por uma curva (modelo)
contnua de concentraes apropriada. O ajustamento da curva aos resultados normalmente efectuado por
um mtodo de regresso no linear (18). Para avaliar a influncia da variabilidade dos resultados na curva
ajustada recomenda-se uma tcnica de bootstrap.
O clculo do factor de fotoirritao (PIF) efectuado do seguinte modo:
PIF =
CI
50
Irr
CI
50
Irr
Se no for possvel calcular a CI
50
com irradiao ou a CI
50
sem irradiao, no se poder determinar o factor
de fotoirritao (PIF) para a matria em estudo. O fotoefeito mdio (MPE) baseia-se na comparao das curvas
de concentrao completas (19). definido como a mdia ponderada de um conjunto representativo de valores
de fotoefeito:
MPE =
n
i = l
w
i
PE
ci
n
i = l
w
i
O fotoefeito PE
C
concentrao C definido como o produto do efeito de resposta RE
C
pelo efeito de dose DE
C
,
ou seja: PE
C
= RE
C
DE
C
. O efeito de resposta RE
C
a diferena entre as respostas observadas com e sem
irradiao, isto : RE
C
= R
c
(- Irr) R
c
(+ Irr). O efeito de dose calculado do seguinte modo:
DE
c =
C=C
*
1
C=C
*
1
em que C* representa a concentrao de equivalncia, ou seja, a concentrao qual a resposta + Irr igual
resposta - Irr concentrao C. Se no for possvel determinar C* por os valores de resposta da curva + Irr
serem sistematicamente superiores ou inferiores curva de resposta - Irr, o efeito de dose ser fixado no valor
1. Os factores de ponderao w
i
so dados pelo valor de resposta mais elevado, ou seja: w
i
= MAX {R
i
(+ Irr),
R
i
(- Irr)}. Os valores C
i
de concentrao so escolhidos de modo que cada intervalo de concentrao definido
pelos valores de concentrao utilizados no ensaio contenha o mesmo nmero de pontos. O clculo do MPE
est limitado ao valor mximo de concentrao ao qual pelo menos uma das duas curvas exiba ainda um valor
de resposta mnimo de 10 %. Se essa concentrao mxima exceder a concentrao mxima utilizada no ensaio
+ Irr, a parte residual da curva + Irr ser convertida no valor de resposta 0. Consoante o valor de MPE for
maior ou menor do que um valor-limite de diferenciao convenientemente escolhido (MPE
C
= 0,15), assim a
substncia qumica ser ou no classificada de fototxica.
Em (20) est disponvel um programa para o clculo do PIF e do MPE.
Com base nas previses do estudo de validao (8), se o PIF for inferior a 2 ou o MPE menor do que 0,1 a
substncia em estudo ser no fototxica. Se o PIF for superior a 2 e inferior a 5 ou o MPE maior do que 0,1 e
menor do que 0,15, a substncia em estudo ser provavelmente fototxica. Se o PIF for superior a 5 ou o MPE
maior do que 0,15, a substncia ser fototxica.
Os laboratrios que comecem a utilizar o presente mtodo de ensaio devem ensaiar as matrias de referncia
constantes do quadro 1 antes de submeterem outras substncias a determinaes de fototoxicidade. Os valores
de PIF e MPE devem ser prximos dos indicados no quadro 1.
Quadro 1
Denominao qu-
mica
Nmero
EINECS
Nmero CAS PIF MPE
Pico de
absoro
Solvente (
1
)
Amiodarona
HC1
243-293-2 [19774-82-4] > 3,25 0,27- 0,54 242 nm
300 nm
(ombro)
Etanol
Cloropromazina
HC1
200-701-3 [69-09-0] > 14,4 0,33- 0,63 309 nm Etanol
Norfloxacina 274-614-4 [70458-96-7] > 71,6 0,34- 0,90 316 nm Acetonitrilo
Antraceno 204-371-1 [120-12-7] > 18,5 0,19- 0,81 356 nm Acetonitrilo
Protoporfirina IX,
dissdio
256-815-9 [50865-01-5] > 45,3 0,54- 0,74 402 nm Etanol
L-Histidina [7006-35-1] No
determi-
nvel
0,05- 0,10 211nm gua
Hexaclorofeno 200-733-8 [70-30-4] 1,1- 1,7 0,00- 0,05 299 nm
317nm
(ombro)
Etanol
Laurilsulfato de
sdio
205-788-1 [151-21-3] 1,0- 1,9 0,00- 0,05 No se
verifica
absoro
gua
(
1
) Solvente utilizado nas medies de absoro.
2.4. INTERPRETAO DE DADOS
Se os efeitos fototxicos s forem observados para a concentrao de ensaio mais elevada (sobretudo no caso
das substncias qumicas hidrossolveis), poder ser necessrio ponderar outros factores na avaliao dos
perigos da substncia. Pode ser o caso de dados de absoro ou acumulao cutneas da substncia qumica e/
/ou de outros ensaios, por exemplo do ensaio in vitro da substncia qumica em pele humana ou de animal ou
em modelos cutneos.
Se no for demonstrada a existncia de toxicidade (+ Irr e - Irr) e se uma baixa solubilidade limitar as
concentraes susceptveis de serem ensaiadas, poder ser posta em causa a compatibilidade da substncia em
estudo com o ensaio e dever ser ponderada a realizao de ensaios de confirmao, por exemplo com base
noutro modelo.
3. RELATRIOS
RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio deve incluir, pelo menos, as seguintes informaes:
Substncia em estudo:
Dados identificativos, denominaes genricas comuns e nmeros IUPAC e CAS, se forem conhecidos;
Natureza fsica e grau de pureza;
Propriedades fsico-qumicas relevantes para o estudo;
Espectro de absoro no visvel/UV;
Estabilidade e fotoestabilidade, se forem conhecidas.
Solvente:
Justificao da escolha do solvente;
Solubilidade da substncia em estudo no solvente;
Percentagem de solvente no meio de tratamento.
Clulas:
Tipo e origem das clulas;
Ausncia de micoplasmas;
Nmero de repicagens celulares, se for conhecido;
Sensibilidade celular radiao, determinada com o equipamento de irradiao utilizado no ensaio de
fototoxicidade in vitro 3T3 NRU.
Condies de ensaio 1) Incubao antes e depois do tratamento:
Tipo e composio do meio de cultura;
Condies de incubao (concentrao de CO
2
, temperatura e humidade);
Durao da incubao (antes e depois do tratamento).
Condies de ensaio 2) Tratamento com a substncia qumica:
Fundamentao da escolha das concentraes da substncia qumica em estudo utilizadas nos ensaios
com e sem irradiao;
Caso a substncia qumica em estudo seja fracamente solvel e no citotxica, fundamentao da
escolha da maior concentrao ensaiada;
Tipo e composio do meio de tratamento (tampo salino);
Durao do tratamento qumico.
Condies de ensaio 3) Irradiao:
Fundamentao da escolha da fonte luminosa utilizada;
Fabricante e tipo da fonte luminosa e do radimetro;
Caractersticas de irradincia espectral da fonte luminosa;
Caractersticas de transmisso e absoro do filtro ou filtros utilizados;
Caractersticas do radimetro e condies de calibrao do mesmo;
Distncia entre a fonte luminosa e o sistema de ensaio;
Irradincia UVA a essa distncia, expressa em mW/cm
2
;
Durao da exposio radiao UV/luz visvel;
Dose de radiao UVA (irradincia x tempo), expressa em J/cm
2
;
Temperatura das culturas celulares durante a irradiao e das culturas celulares mantidas paralelamente
na obscuridade.
Condies de ensaio 4) Ensaio de viabilidade com o vermelho neutro:
Composio do meio de tratamento com vermelho neutro;
Durao da incubao com vermelho neutro;
Condies de incubao (concentrao de CO
2
, temperatura e humidade);
Condies de extraco do vermelho neutro (agente de extraco, durao);
Comprimento de onda utilizado na leitura espectrofotomtrica da densidade ptica do vermelho neutro;
Segundo comprimento de onda (referncia), se for utilizado;
Composio do branco eventualmente utilizado no espectrofotmetro.
Resultados:
Viabilidade celular obtida para cada concentrao da substncia qumica em estudo, expressa em
percentagem da viabilidade mdia das amostras de controlo paralelas;
Curvas de concentrao (viabilidade celular relativa em funo da concentrao da substncia qumica
em estudo) obtidas nos ensaios + Irr e - Irr paralelos;
Anlise das curvas de concentrao: se possvel, clculo automtico/clculo manual de CI
50
(+ Irr) e de
CI
50
(- Irr);
Comparao das duas curvas de concentrao obtidas com e sem irradiao, por clculo do factor de
fotoirritao (PIF) ou do fotoefeito mdio (MPE);
Critrios de aceitao do ensaio amostra de controlo constituda pelo solvente paralela;
Viabilidade absoluta (densidade ptica do extracto de vermelho neutro) das clulas irradiadas e no
irradiadas;
Dados de referncia das amostras de controlo negativas (solvente); mdias e desvios-padro;
Critrios de aceitao do ensaio amostra de controlo positiva paralela;
CI
50
(+ Irr) e CI
50
(- Irr) e PIF/MPE da substncia qumica da amostra de controlo positiva;
Dados de referncia da substncia qumica da amostra de controlo positiva: CI
50
(+ Irr) e CI
50
(- Irr) e PIF/
/MPE; mdias e desvios-padro.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Lovell W.W., (1993) A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential.
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(2) Santamaria, L. and Prino, G., (1972) List of the photodynamic substances. In Research Progress in
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(4) Spikes, J.D., (1989) Photosensitisation. In The science of Photobiology Edited by K.C. Smith. Plenum
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(6) Spielmann, H., Balls, M., Dring, B., Holzhtter, H.G., Kalweit, S., Klecak, G., LEplattenier, H., Liebsch, M.,
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(8) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch, G. De Silva, O., Holzhtter, H.G., Clothier,
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(9) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test
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th
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(10) Borenfreund, E., and Puerner, J.A., (1985) Toxicity determination in vitro by morphological alterations
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(11) Hay, R.J., (1988) The seed stock concept and quality control for cell lines. Analytical Biochemistry 171,
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(12) Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A., (1996) Animal models for phototoxicity testing. In
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(13) Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of
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Res., 47, p. 1825-1829.
(14) ISO 10977., (1993) Photography Processed photographic colour films and paper prints Methods
for measuring image stability.
(15) Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, International Commission on Illumnation,
Publication No 90, Vienna, 1993, ISBN 3 900 734 275
(16) ZEBET/ECVAM/COLIPA Standard Operating Procedure: In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test. Final
Version, 7 September, 1998 (18 pginas).
(17) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, O., Holzhtter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M.,
Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U., (1998) A study on UV filter chemicals from Annex VII of the
European Union Directive 76/768/EEC, in the in vitro 3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, p. 679-708.
(18) Holzhtter, H.G., and Quedenau, J., (1995) Mathematical modeling of cellular responses to external
signals. J. Biol. Systems 3, p. 127-138.
(19) Holzhtter, H.G., (1997) A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response
curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, p. 445-462.
(20) http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377_2349687_1_1_1_1,00.html
ANEXO 1
Papel do ensaio de fitotoxicidade 3T3 NRU numa abordagem sequencial da determinao da fitotoxicidade de
substncias qumicas
ANEXO 2
Figura 1
Distribuio espectral da potncia de um simulador de luz solar com filtros
(Ver segundo pargrafo do ponto 1.4.1.5.)
A figura 1 apresenta um exemplo de uma distribuio espectral de irradincia aceitvel de um simulador de luz solar com
filtros, proveniente da fonte de halogeneto metlico dopada utilizada no estudo de validao do ensaio de fototoxicidade
3T3 NRU (6)(8)(17). Mostra-se o efeito de dois filtros diferentes e o efeito filtrante suplementar da cobertura da placa de
cultura celular com 96 alvolos. O filtro H2 s foi utilizado com sistemas de ensaio que toleram doses mais elevadas de UVB
(ensaio em modelo cutneo e ensaio da foto-hemlise de glbulos vermelhos). No ensaio de fototoxicidade 3T3 NRU foi
utilizado o filtro H1. A figura mostra que o efeito filtrante adicional da cobertura da placa sobretudo observado nos UVB e
que o espectro de irradiao continua a ter radiao UVB suficiente para excitar as substncias qumicas que absorvem
sobretudo nessa regio espectral, como a Amiodarona (ver quadro 1).
Figura 2
Sensibilidade das clulas Balb/c 3T3 irradiao (medida nos UVA)
Viabilidade celular (percentagem de absoro do vermelho neutro em relao s amostras de controlo mantidas na
obscuridade)
(Ver segundo pargrafo do ponto 1.4.1.5.2 e os pontos 1.4.2.2.1 e 1.4.2.2.2.)
Sensibilidade das clulas Balb/c 3T3 irradiao com o simulador de luz solar utilizado no estudo de validao do ensaio de
fototoxicidade 3T3 NRU, medida nos UVA. A figura mostra os resultados obtidos no estudo de pr-validao em sete
laboratrios distintos (1). As cinco curvas com smbolos a cheio dizem respeito a clulas com tolerncia aceitvel
irradiao; as outras duas curvas foram obtidas com clulas envelhecidas (resultantes de numerosas repicagens), que foi
necessrio substituir por novas clulas-me.
Com base nestes dados, foi determinada para dose mais elevada de irradiao no citotxica (linha vertical a tracejado) o
valor 5 J/cm. A linha horizontal a tracejado corresponde ao efeito mximo aceitvel da irradiao a que se refere o
ponto 1.4.2.2.
B.42. SENSIBILIZAO DA PELE: ENSAIO DE GNGLIO LINFTICO LOCAL
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O Ensaio de Gnglio Linftico Local (LLNA) tem sido suficientemente validado e aceite de modo a justificar a
sua adopo como um novo mtodo (1)(2)(3). Este ensaio o segundo mtodo para avaliar o potencial de
sensibilizao da pele de animais por produtos qumicos. O outro mtodo (B.6) utiliza ensaios com cobaias,
nomeadamente o ensaio de maximizao da cobaia e o ensaio de Buehler (4).
O LLNA constitui um mtodo alternativo a utilizar na identificao de produtos qumicos sensibilizantes da
pele e na confirmao da ausncia de um potencial significativo causador de sensibilizao da pele por parte de
certos produtos qumicos. Tal facto no implica necessariamente que o LLNA seja sempre utilizado em
substituio do ensaio com cobaia, mas apenas que o primeiro apresenta qualidades equivalentes ao segundo e
pode ser utilizado como uma alternativa em situaes nas quais no seja necessria confirmao posterior dos
resultados, quer estes sejam positivos ou negativos.
O LLNA apresenta determinadas vantagens no que diz respeito tanto ao progresso cientfico como proteco
dos animais. O mtodo estuda a fase de induo da sensibilizao da pele e proporciona dados quantitativos
adequados para a avaliao da resposta dosagem. Foram publicados dados detalhados sobre a validao do
LLNA e uma reviso do trabalho associado (5) (6) (7) (8). Alm disso, deve referir-se que os sensibilizadores
intermdios/moderados, que se recomendam como substncias adequadas para controlo positivo dos mtodos
de cobaia, so igualmente apropriados para utilizar com o LLNA (6) (8) (9).
O LLNA um mtodo in vivo e, consequentemente, no eliminar a utilizao de animais na avaliao da
actividade sensibilizante por contacto. Tem, no entanto, a vantagem de reduzir o nmero de animais requeridos
para esta avaliao. Alm disso, o LLNA apresenta uma melhoria substancial no modo como os animais so
utilizados nos ensaios de sensibilizao por contacto. O LLNA baseia-se na observao de acontecimentos
imunolgicos estimulados por produtos qumicos durante a fase de induo da sensibilizao. Ao contrrio dos
ensaios com cobaias, o LLNA no requer a ocorrncia de reaces de hipersensibilidade drmica provocadas
por um agente externo. Alm disso, o LLNA no implica que seja utilizado qualquer adjuvante, como acontece
no ensaio de maximizao da cobaia, reduzindo as perturbaes causadas ao animal. Apesar das vantagens do
LLNA em relao aos ensaios tradicionais com cobaias, importa reconhecer que existem certas limitaes neste
mtodo que podem exigir a utilizao de ensaios tradicionais com cobaias (por exemplo, falsos negativos no
LLNA para certos metais, falsos positivos para certos irritantes da pele) (10).
Ver igualmente a Introduo Geral, parte B.
O princpio bsico subjacente ao LLNA o de que os sensibilizadores induzem uma proliferao primria de
linfcitos no gnglio linftico que leva secagem do local de aplicao do produto qumico. Esta proliferao
proporcional dose aplicada (e potncia do alergeno) e constitui um modo simples de obter uma medida
quantitativa objectiva da sensibilizao. O LLNA avalia esta proliferao numa relao de dose/resposta na qual
a proliferao em grupos de ensaio comparada com a obtida em controlos tratados com o excipiente.
determinada a razo entre a proliferao nos grupos ensaiados e a observada em controlos tratados com o
excipiente. Esta razo denomina-se ndice de Estimulao e deve apresentar o valor de, pelo menos, trs para
que uma substncia de ensaio possa ser posteriormente avaliada como potencial sensibilizadora da pele. Os
mtodos descritos no presente documento baseiam-se na utilizao de marcao radioactiva para medir a
proliferao celular. Podem, no entanto, ser utilizados outros conceitos para a avaliao da proliferao desde
que existam justificao e apoio cientfico adequado, incluindo citaes integrais e uma descrio da
metodologia.
1.3.1. Preparativos
Os animais devem ser alojados individualmente. A temperatura do biotrio deve ser de 22
o
C ( 3
o
C). Embora
a humidade relativa deva ser de, pelo menos, 30 % e, de preferncia, no exceder os 70 % excepto durante o
perodo de limpezas, o valor pretendido deve ser de 50 %-60 %. A iluminao deve ser artificial, com uma
sequncia de 12 horas de luz seguidas de 12 horas de escurido. Na alimentao podem ser utilizadas dietas
convencionais de laboratrio e deve ser fornecida gua de beber sem restries.
Os animais so seleccionados aleatoriamente, marcados de modo a permitir a identificao individual (embora
nunca se deva recorrer a marcao nas orelhas) e mantidos em gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes do
incio da aplicao da dose, de modo a permitir a aclimatao s condies do laboratrio. Antes do incio do
tratamento todos os animais so examinados de modo a assegurar que no apresentam leses visveis da pele.
1.3.2.1. Animais experimentais
O rato a espcie de eleio para o presente ensaio. Utilizam-se fmeas adultas das estirpes CBA/Ca ou CBA/J,
nulparas e no grvidas. No incio do estudo os animais devem ter entre 8 e 12 semanas de idade e a variao
de peso dos animais deve ser mnima e no deve exceder 20 % do seu peso mdio. Podem ser utilizadas outras
estirpes e machos quando houver uma quantidade suficiente de dados que demonstrem no existirem
diferenas significativas na resposta ao LLNA relacionadas com a estirpe e/ou o gnero do animal.
1.3.2.2. Verificao da fiabilidade
Utilizam-se controlos positivos a fim de demonstrar o desempenho adequado do ensaio e a competncia do
laboratrio para levar a cabo o ensaio com sucesso. O controlo positivo deve produzir uma resposta LLNA
positiva ao nvel de exposio qual se espera um aumento do ndice de estimulao (SI) > 3 em relao ao
grupo do controlo negativo. A dose do controlo positivo deve ser escolhida de modo a que a induo seja
evidente mas no excessiva. As substncias preferidas so o aldedo hexilcinmico (nmero CAS 101-86-0,
nmero EINECS 202-983-3) e o mercaptobenzotiazole (nmero CAS 149-30-4, nmero EINECS 205-736-8).
Em certas circunstncias e perante justificao adequada podem ser utilizadas outras substncias de controlo
que cumpram os critrios supramencionados. Embora seja geralmente requerido um grupo de controlo
positivo para cada ensaio, podem ocorrer situaes nas quais os ensaios laboratoriais apresentem um historial
de dados de controlos positivos que documentem a consistncia de uma resposta satisfatria por um perodo
igual ou superior a seis meses. Nessas situaes, pode ser apropriado efectuar ensaios menos frequentes com
controlos positivos a intervalos no superiores a seis meses. Embora a substncia de controlo positivo deva ser
ensaiada no excipiente para a qual conhecida uma resposta consistente (por exemplo, acetona, azeite), podem
existir certas situaes regulamentares nas quais ser igualmente necessrio o ensaio com um excipiente no
convencional (formulao clnica e/ou quimicamente relevante). Nessas condies, deve ser ensaiada a possvel
interaco de um controlo positivo com este excipiente no convencional.
1.3.2.3. Nmero de animais, nveis de dosagem e seleco do excipiente
Utilizam-se quatro animais, no mnimo, em cada grupo de dosagem e um mnimo de trs concentraes da
substncia de ensaio, alm de um controlo negativo tratado apenas com o excipiente para a substncia de
ensaio e, caso seja apropriado, um controlo positivo. Nos casos em que devam ser recolhidos dados individuais
de cada animal, so utilizados, no mnimo, cinco animais por grupo de dosagem. Os animais nos grupos de
controlo devem ser manuseados de modo idntico ao usado para os animais nos grupos em tratamento, com
excepo da ausncia de tratamento com a substncia de ensaio.
A escolha da dosagem e do excipiente deve basear-se nas recomendaes fornecidas na referncia (1). As doses
so seleccionadas a partir da seguinte srie de concentraes: 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %,
etc. Devem ser considerados, desde que disponveis, quaisquer dados preexistentes referentes a toxicidade aguda
e irritao drmica, na escolha das trs concentraes consecutivas, de modo que a concentrao mais alta
maximize a exposio evitando ao mesmo tempo a toxicidade sistmica e a irritao local excessiva da pele (2)
(11).
O excipiente deve ser escolhido com base na maximizao das concentraes de ensaio e na solubilidade,
produzindo tambm uma soluo ou suspenso adequadas para aplicao da substncia de ensaio. Os
excipientes recomendados so, por ordem de preferncia, o sistema acetona/azeite (4:1 v/v), dimetilformamida,
metiletilcetona, propilenoglicol e dimetilsulfxido (2) (10), embora possam ser utilizados outros se forem
fornecidas bases cientficas suficientes. Em certas situaes, pode ser necessrio efectuar um controlo adicional
com um solvente clinicamente relevante ou uma formulao comercial na qual a substncia de ensaio
comercializada. Deve ser tomado especial cuidado de modo a assegurar que os materiais hidroflicos sejam
incorporados num sistema de excipiente que molhe a pele e no escorra imediatamente. Devem ser portanto
evitados os excipientes completamente aquosos.
1.3.3. Procedimento de ensaio
1.3.3.1. Calendrio experimental
O calendrio experimental do ensaio o seguinte:
Dia 1:
Identificar individualmente e anotar o peso de cada animal. Aplicar a descoberto no dorso de cada orelha 25 l
da diluio adequada da substncia de ensaio, do excipiente sozinho ou do controlo positivo (conforme o
caso).
Dias 2 e 3:
Repetir o procedimento de aplicao efectuado no dia 1.
Dias 4 e 5:
No se faz tratamento.
Dia 6:
Anotar o peso de cada animal. Injectar 250 l de tampo salino de fosfato (PBS) contendo 20 Ci (7,4e + 8 Bq)
de
3
H-metiltimidina em todos os ratos de ensaio e de controlo atravs da veia da cauda. Em alternativa, injectar
250 L de PBS contendo 2 Ci (7,4e + 7 Bq) de
125
I-iododeoxiuridina e 10
-5
M de fluorodeoxiuridina em
todos os ratos atravs da veia da cauda.
Cinco horas depois, matam-se os animais. Os gnglios linfticos auriculares em esvaziamento so cortados e
demolhados em PBS, reunindo-se aqueles de cada grupo experimental (procedimento de conjunto de grupo de
tratamento); em alternativa, podem cortar-se pares de gnglios linfticos de cada animal e reuni-los em PBS
para cada animal (procedimento de animal individual). Podem ser consultados pormenores e esquemas de
identificao de gnglios e sua disseco no anexo I da referncia 10.
1.3.3.2. Preparao das suspenses celulares
Prepara-se uma s suspenso de clulas de gnglio linftico (LNC), quer a partir do conjunto dos grupos de
tratamento, quer a partir dos animais individuais tratados bilateralmente, por desagregao mecnica suave
atravs de um peneiro de ao inoxidvel com uma malha de 200 m. As clulas de gnglio linftico so lavadas
duas vezes com excesso de PBS e precipitadas com uma soluo de 5 % em cido tricloroactico (TCA) a
4
o
C durante 18 horas (1). Os sedimentos podem ser ressuspendidos em 1 ml de TCA e transferidos para
frascos de contador de cintilaes contendo 10 ml de fluido de cintilao para contagem de
3
H ou transferidos
directamente para tubos de contagem gama para contagem de
125
I.
1.3.3.3. Determinao da proliferao celular (radioactividade incorporada)
A incorporao de
3
H-metiltimidina medida por contagem de cintilao em desintegraes por minuto
(DPM). A incorporao de
125
I-iododeoxiuridina medida por contagem de
125
I e exprime-se igualmente em
DPM. Consoante o procedimento seguido, a incorporao ser expressa em DPM/grupo de tratamento
(procedimento de conjunto) ou em DPM/animal (procedimento individual).
1.3.3.4. Observaes
1.3.3.4.1. Obs e r v a e s c l ni c a s
Os animais devem ser cuidadosamente observados uma vez por dia com vista deteco de quaisquer sinais
clnicos, quer de irritao local no ponto de aplicao, quer de toxicidade sistmica. Todas as observaes so
sistematicamente anotadas, devendo manter-se registos individuais para cada animal.
1.3.3.4.2. P e s os c or por a i s
Tal como mencionado na seco 1.3.3.1, deve ser medido o peso corporal de cada animal quer no incio do
ensaio quer na altura da sua morte.
1.3.4. Anlise dos resultados
Os resultados expressam-se em ndices de Estimulao (SI). Caso se utilize o procedimento de conjunto, o SI
obtm-se pela razo entre a incorporao conjunta de radioactividade para cada grupo de tratamento e a
incorporao conjunta do grupo de controlo com excipiente. O valor obtido corresponde ao SI mdio. Caso se
utilize o procedimento individual, o SI determinado dividindo a mdia do DPM/animal dentro de cada grupo
de tratamento e do grupo controlo positivo pela mdia da DPM/animal do grupo de controlo com solvente/
/excipiente. O SI mdio para os controlos tratados com excipiente deve ser 1.
A utilizao do procedimento individual para clculo do SI permitir que se efectue uma anlise estatstica dos
dados. Na escolha do mtodo de anlise estatstica mais apropriado, o investigador deve estar ciente das
possveis discrepncias das varincias e de outros problemas relacionados que possam exigir uma
transformao de dados ou uma anlise estatstica no paramtrica. Um procedimento adequado
interpretao dos dados consiste em avaliar individualmente todos os dados obtidos para os controlos tratados
e com excipiente e determinar a curva de resposta dosagem que melhor se ajustar a estes, tendo em conta os
limites de confiana (8) (12) (13). Contudo, o investigador deve estar atento a possveis respostas isoladas para
determinados animais dentro de um grupo, que podem implicar a utilizao de uma medida de resposta
alternativa (por exemplo, mediana em vez de mdia) ou a eliminao da resposta isolada.
O processo de deciso respeitante a uma resposta positiva inclui um ndice de estimulao > 3 conjuntamente
com a considerao da resposta dosagem e, quando apropriado, do grau de significncia estatstico (3) (6) (8)
(12) (14).
Se for necessria uma clarificao dos resultados obtidos, devem ser tidas em considerao as vrias
propriedades da substncia de ensaio, incluindo se esta possui uma estrutura qumica semelhante a
sensibilizadores conhecidos da pele, se causa irritao excessiva da pele e qual a natureza da resposta dosagem
observada. Estas e outras consideraes so analisadas detalhadamente na referncia (7).
2. DADOS
Os dados devem ser apresentados resumidamente sob a forma de uma tabela da qual constem os valores
mdios e individuais de DPM e os ndices de estimulao para cada grupo de doses (incluindo o controlo com
excipiente).
3. RELATRIO
RELATRIO DO ENSAIO
dados de identificao (por exemplo, nmero CAS, caso exista; origem; grau de pureza; impurezas
conhecidas; nmero de lote);
natureza fsica e propriedades fsico-qumicas (por exemplo, volatilidade, estabilidade, solubilidade);
caso seja uma mistura, composio e percentagens relativas dos seus componentes.
Excipiente:
dados de identificao (grau de pureza; concentrao, se adequado; volume utilizado);
Animais de ensaio:
estirpe dos ratos utilizados;
estado microbiolgico dos animais, caso seja conhecido;
origem dos animais, condies de alojamento, dieta, etc.
Condies do ensaio:
pormenores sobre a preparao e aplicao da substncia de ensaio;
justificao para a escolha de dosagens, incluindo os resultados do estudo de escolha de gama, caso tenha
sido efectuado; concentraes do excipiente e da substncia de ensaio utilizadas e quantidade total de
substncia aplicada;
pormenores sobre a qualidade do alimento e da gua (incluindo o tipo de dieta e a sua origem, origem da
gua).
Verificao da fiabilidade:
resumo dos resultados da ltima verificao de fiabilidade, incluindo informao sobre a substncia,
concentrao e excipiente utilizado;
dados de controlo concorrentes e/ou histricos positivos e negativos para o laboratrio de ensaios.
Resultados:
pesos de cada animal no incio da dosagem e na altura da sua morte;
tabela de valores mdios (procedimento de conjunto) ou individuais (procedimento individual) de DPM,
assim como os valores-limite para as duas aproximaes e os ndices de estimulao para cada grupo de
doses (incluindo o controlo com excipiente);
anlise estatstica, quando apropriado;
aparecimento e evoluo temporal de sinais de toxicidade, incluindo irritao drmica no local de
administrao, caso ocorra, para cada animal.
Anlise dos resultados:
inclui um comentrio breve sobre os resultados obtidos, a anlise da resposta dosagem, as anlises
estatsticas, caso sejam apropriadas, e uma concluso sobre se a substncia de ensaio deve ou no ser
considerada como sensibilizadora da pele.
4. REFERNCIAS
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alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, p. 985-997.
(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I., (1998) Strategies for identifying false positive responses in
predictive sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology. 36, p. 327-33.
(8) Van Och, F.M.M, Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J., Van Loveren, H., (2000) A quantitative method
for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay:
employement of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology,
146, p. 49-59.
(9) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I., (1998) Temporal stability of
local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18,
p. 281-4.
(10) National Institute of Environmental Health Sciences (1999) The Murine Local Lymph Node Assay: A Test
Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds: The Results of
an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the
Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the
Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494, Research
Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov).
(12) Basketter, D.A., Selbie, E., Scholes, E.W. Lees, D. Kimber, I. and Botham, P.A., (1993) Results with OECD
recommended positive control sensitisers in the maximisation, Buehler and local lymph node assays.
Food and Chemical Toxicology, 31, p. 63-67.
(13) Basketter D.A., Lea L.J., Dickens A., Briggs D., Pate I., Dearman R.J., Kimber I., (1999) A comparison of
statistical approaches to the derivation of EC
3
values from local lymph node assay dose responses. J.
Appl. Toxicology, 19, p. 261-266.
(14) Basketter D.A., Blaikie L., Derman R.J., Kimber I., Ryan C.A., Gerberick G.F., Harvey P., Evans P., White I.R.
and Rycroft R.T.G. (2000) Use of local lymph node assay for the estimation of relative contact allergenic
potency. Contact Dermatitis 42, p. 344-48.
B.43. ESTUDO DE NEUROTOXICIDADE EM ROEDORES
1. MTODO
O presente mtodo equivalente ao Test Guideline TG 424 da OCDE (1997).
O presente Mtodo de Ensaio foi concebido para obter a informao necessria para confirmar ou conseguir
uma melhor caracterizao da potencial neurotoxicidade de substncias qumicas em animais adultos. Pode ser
combinado com Mtodos de Ensaio para estudos de toxicidade de dose repetida ou efectuado como um estudo
independente. Recomenda-se a consulta do Documento de Orientao da OCDE sobre Estratgias e Mtodos de
Ensaios de Neurotoxicidade (1) para a concepo dos estudos baseados no presente Mtodo de Ensaio. Este
facto particularmente importante no caso de se considerarem alteraes das observaes ou dos
procedimentos de ensaio recomendados para uso rotineiro do presente mtodo. O Documento de Orientao
foi preparado para facilitar a seleco de outros procedimentos de ensaio para uso em circunstncias
especficas.
A avaliao de neurotoxicidade em relao ao desenvolvimento no abrangida pelo presente mtodo.
1.1. INTRODUO
Na avaliao das caractersticas txicas das substncias qumicas, importante considerar o potencial de efeitos
neurotxicos. O Mtodo de Ensaio para toxicidade sistmica de dose repetida inclui observaes conducentes
ao rastreio de neurotoxicidade potencial. O presente Mtodo de Ensaio pode ser utilizado na concepo de um
estudo para obteno de informao suplementar ou para confirmao dos efeitos observados nos estudos de
toxicidade sistmica de dose repetida. No entanto, uma ponderao da neurotoxicidade potencial de certo tipo
de substncias qumicas pode ser indicativa de esta ser avaliada mais apropriadamente utilizando o presente
mtodo, mesmo na ausncia de indicaes prvias de existncia de neurotoxicidade potencial provenientes de
estudos de toxicidade sistmica de dose repetida. Tal ponderao pode incluir, por exemplo:
observao dos sinais neurolgicos ou leses neuropatolgicas em estudos de toxicidade diferentes dos
estudos de toxicidade sistmica de dose repetida, ou
relao estrutural ou outra informao que estabelea uma ligao com outros neurotxicos conhecidos.
Alm disso, podem existir outras circunstncias para as quais apropriada a utilizao do presente Mtodo de
Ensaio. Para informao detalhada, consultar a referncia (1).
O presente mtodo foi desenvolvido de modo a poder ser adaptado s necessidades especficas para a
confirmao da neurotoxicidade histopatolgica e comportamental de uma substncia qumica, bem como a
permitir uma caracterizao e quantificao das respostas neurotxicas.
No passado, a neurotoxicidade foi identificada como neuropatia envolvendo leses neuropatolgicas ou
anomalias neurolgicas, tais como convulso, paralisia ou tremores. Apesar da neuropatia ser uma importante
manifestao de neurotoxicidade, actualmente claro que existem muitos outros sinais de toxicidade no
sistema nervoso (por exemplo, perda de coordenao motora, deficincias sensoriais, disfunes da
aprendizagem e da memria) que podem no se reflectir em neuropatia ou noutro tipo de estudos.
O presente Mtodo de Ensaio de neurotoxicidade foi concebido para detectar os principais efeitos
neurocomportamentais e neuropatolgicos em roedores adultos. Apesar de os efeitos comportamentais,
mesmo na ausncia de alteraes morfolgicas, poderem reflectir um impacto nefasto no organismo, nem
todas as alteraes comportamentais so especficas do sistema nervoso. Assim, quaisquer alteraes
observadas devem ser avaliadas em conjunto com os dados histopatolgicos, hematolgicos ou bioqumicos
relacionados, bem como com dados provenientes de outros tipos de toxicidade sistmica. O ensaio utilizado,
no presente mtodo, para fornecer uma caracterizao e quantificao das respostas neurotxicas inclui
procedimentos histopatolgicos e comportamentais especficos que podem ser confirmados por investigaes
electrofisiolgicas e/ou bioqumicas (1) (2) (3) (4).
Os neurotxicos podem actuar sobre o sistema nervoso em vrios alvos e por diversos mecanismos. Dado que
no possvel utilizar uma nica srie de ensaios para avaliar completamente o potencial neurotxico de todas
as substncias, pode ser necessrio utilizar outros ensaios in vivo ou in vitro especficos para o tipo de
neurotoxicidade observada ou prevista.
O presente Mtodo de Ensaio, pode tambm ser utilizado em conjunto com as orientaes estabelecidas pelo
Documento de Orientao da OCDE sobre Estratgias e Mtodos de Ensaios de Neurotoxicidade (1), para a
concepo de estudos destinados a uma caracterizao suplementar ou um aumento da sensibilidade da
quantificao da curva dose-efeito, de modo a obter uma melhor estimativa do nvel sem efeito adverso
observvel ou a confirmar a perigosidade conhecida ou prevista de uma substncia qumica. Por exemplo, os
estudos podem ser concebidos para identificar e avaliar o(s) mecanismo(s) neurotxico(s) ou para obter
informao suplementar sobre dados previamente disponveis a partir do uso de procedimentos de observao
neurocomportamental e neuropatolgica bsicos. Tais estudos necessitam de dados no replicados que seriam
obtidos pelo uso dos procedimentos padronizados recomendados no presente mtodo, caso esses dados no se
encontrem j disponveis e no sejam considerados necessrios para a interpretao dos resultados do estudo.
O presente estudo de neurotoxicidade, quer utilizado independentemente, quer em conjunto com outros
mtodos, permite obter informao para:
identificar se o sistema nervoso central afectado permanente ou reversivelmente pela substncia
qumica ensaiada;
contribuir para a caracterizao das alteraes do sistema nervoso central associadas exposio
substncia qumica e para a compreenso do mecanismo subjacente;
determinar as curvas dose-efeito e tempo-efeito, de modo a obter uma estimativa do nvel sem efeito
adverso observvel (que pode ser utilizado para estabelecer critrios de segurana para a substncia
qumica).
O presente mtodo utiliza a administrao oral da substncia de ensaio. Podem ser mais apropriadas outras vias
de administrao (por exemplo, drmica ou por inalao), pelo que podem ser necessrias modificaes dos
procedimentos recomendados. A seleco ponderada, da via de administrao, depende do perfil de exposio
humana e da informao toxicolgica e cintica disponvel.
1.2. DEFINIES
Efeito adverso: qualquer alterao normalidade relacionada com o tratamento que diminua a capacidade de
um organismo para sobreviver, reproduzir-se ou adaptar-se ao meio ambiente.
Dose: quantidade aplicada da substncia de ensaio. O valor da dose expresso em peso (g, mg) de substncia
de ensaio por unidade de peso de animal de ensaio (por exemplo, mg/kg) ou em concentraes dietticas
constantes (ppm).
Dosagem: termo geral que inclui a dose, a sua frequncia e a durao da aplicao da dose.
Neurotoxicidade: alterao adversa na estrutura ou funo do sistema nervoso que resulta da exposio a um
agente qumico, biolgico ou fsico.
Neurotxico: agente qumico, biolgico ou fsico que apresenta potencial para causar neurotoxicidade.
NSEAO: abreviatura para nvel sem efeito adverso observvel; corresponde maior dose ou ao maior nvel de
exposio para o qual no se observam efeitos adversos relacionados com o tratamento.
A substncia qumica de ensaio administrada por via oral ao longo de uma gama de doses a vrios grupos de
roedores de laboratrio. So normalmente necessrias doses repetidas e o regime de dosagem pode ser de 28
dias, subcrnico (90 dias) ou crnico (1 ano ou mais). Os procedimentos estabelecidos no presente Mtodo de
Ensaio podem tambm ser usados para um estudo de neurotoxicidade aguda. Os animais so ensaiados de
modo a permitir a deteco ou a caracterizao de anomalias comportamentais e/ou neurolgicas. Durante
cada perodo de observao avaliada uma gama de comportamentos que podem ser afectados por
neurotxicos. No final do ensaio, um subconjunto de animais de cada sexo e de cada grupo submetido a
perfuso in situ e so preparadas e examinadas seces do crebro, medula espinal e nervos perifricos.
No caso do estudo ser efectuado independentemente para rastreio de neurotoxicidade ou caracterizao dos
efeitos neurotxicos, os animais de cada grupo que no so utilizados para perfuso e histopatologia
subsequente (consultar tabela 1) podem ser utilizados em procedimentos neurocomportamentais,
neuropatolgicos, neuroqumicos e electrofisiolgicos especficos que podem complementar os dados obtidos
nos exames padronizados necessrios ao presente mtodo (1). Estes procedimentos suplementares podem ser
particularmente teis nos casos em que as observaes empricas ou os efeitos previstos revelam um tipo ou
alvo especficos de neurotoxicidade de determinado agente qumico. Alternativamente, os restantes animais
podem ser utilizados em avaliaes, tais como as necessrias aos Mtodos de Ensaio para estudos de dose
repetida em roedores.
No caso de se combinarem os procedimentos do presente Mtodo de Ensaio, com os de outros Mtodos de
Ensaio, necessrio um nmero suficiente de animais para satisfazer as necessidades de observaes de ambos
os estudos.
A espcie preferida de roedores para ensaio o rato, mas, caso seja apresentada uma justificao, podem ser
utilizadas outras espcies de roedores. Devem ser utilizadas estirpes laboratoriais de uso corrente e animais
adultos, jovens e saudveis. As fmeas devem ser nulparas e no devem estar grvidas. A aplicao da dose
deve comear o mais rapidamente possvel aps o desmame, preferencialmente com animais que no tenham
completado ainda seis semanas e sempre com animais com menos de nove semanas. No entanto, nos casos em
que o estudo combinado com outros estudos, pode ser necessrio ajustar este requisito de idade. No incio do
estudo a diferena de peso entre os animais dever ser mnima, no podendo ultrapassar 20 % do peso mdio
de cada sexo. No caso de se efectuar um estudo de dose repetida de curta durao, como estudo preliminar do
estudo de longo prazo, os animais utilizados em ambos os estudos devem ser da mesma estirpe e da mesma
provenincia.
o
C ( 3
o
dever ser 50 %-60 %, embora sejam aceitveis valores entre um mnimo de 30 % e um mximo que, de
preferncia, no dever exceder 70 %, salvo durante os perodos de limpeza do compartimento. A iluminao
deve ser artificial, com sequncias de 12 horas de luz e 12 horas de escurido. Os rudos intensos intermitentes
devem ser minimizados. A alimentao pode basear-se em dietas de laboratrio convencionais, com
fornecimento ilimitado de gua para beber. Quando a substncia de ensaio for administrada pela alimentao, a
escolha da dieta poder ser condicionada pela necessidade de assegurar a dosagem adequada. Os animais
podem ser alojados individualmente ou em pequenos grupos do mesmo sexo.
Os animais jovens e saudveis so distribudos aleatoriamente pelos grupos de tratamento e de controlo. As
gaiolas devem ser dispostas de forma a minimizar possveis efeitos derivados do seu posicionamento. Os
animais so marcados de modo a permitir uma identificao individualizada e mantidos nas suas gaiolas
durante, pelo menos, cinco dias antes do incio da administrao das doses, de modo a permitir que se
aclimatem s condies laboratoriais.
1.4.4. Via de administrao e preparao das doses
O presente Mtodo de Ensaio aborda especificamente a administrao oral da substncia de ensaio. A forma de
administrao pode ser por sonda esofgica, atravs da alimentao ou da gua de beber ou por cpsulas.
Podem ser mais apropriadas outras vias de administrao (por exemplo, drmica ou por inalao), pelo que
podem ser necessrias modificaes dos procedimentos recomendados. A seleco ponderada da via de
administrao depende do perfil de exposio humana e da informao toxicolgica e cintica disponvel.
Devem ser apresentadas uma justificao para a seleco da via de administrao, bem como as modificaes
dos procedimentos do Mtodo de Ensaio da resultantes.
Se for necessrio, a substncia de ensaio pode ser dissolvida ou suspensa num excipiente apropriado.
Recomenda-se que, sempre que possvel, seja considerada em primeiro lugar a utilizao de uma soluo/
/suspenso aquosa; caso tal no seja vivel, pode considerar-se o uso de uma soluo/suspenso em leo (por
exemplo, leo de milho); em ltimo caso, poder eventualmente recorrer-se ao uso de solues/suspenses
noutros excipientes. Devem conhecer-se as caractersticas txicas dos excipientes. Devero ser tomadas em
considerao as seguintes caractersticas do excipiente: efeitos na absoro, distribuio, metabolismo ou
reteno da substncia de ensaio, que possam modificar as suas caractersticas txicas e efeitos no consumo de
alimentos, na ingesto de gua ou no estado nutricional dos animais.
1.5. PROCEDIMENTOS
No caso de o estudo ser efectuado independentemente, devem ser utilizados pelo menos 20 animais (10 fmeas
e 10 machos) em cada grupo de dose e de controlo para a avaliao das observaes clnicas e funcionais
detalhadas. Pelo menos cinco machos e cinco fmeas, seleccionados dos grupos de 10 machos e 10 fmeas,
devem ser sujeitos a perfuso e utilizados para neuro-histopatologia detalhada no final do estudo. Nos casos em
que apenas observado um nmero limitado de animais, num determinado grupo de dose, para deteco de
efeitos neurotxicos, deve considerar-se a incluso destes animais no grupo seleccionado para perfuso. No
caso de o estudo ser efectuado em conjunto com um estudo de toxicidade de dose repetida, deve ser utilizado
um nmero de animais adequado de modo a cumprir os objectivos de ambos os estudos. Na tabela 1
apresentam-se os nmeros mnimos de animais por grupo para vrios estudos combinados. No caso de se
planearem grupos de mortes intermdias ou de recuperao para observao da reversibilidade, persistncia ou
ocorrncia retardada de efeitos txicos ps-tratamento ou quando so consideradas observaes
suplementares, o nmero de animais deve ser aumentado de modo a assegurar que se encontra disponvel
o nmero de animais necessrio para observao e histopatologia.
1.5.2. Grupos de ensaio e de controlo
Em geral devem ser utilizados pelo menos trs grupos de dose e um grupo de controlo, mas se pela avaliao
de outros dados no forem previstos quaisquer efeitos a uma dose repetida de 1 000 mg/kg de peso corporal/
/dia pode ser efectuado um teste-limite. Caso no se encontrem disponveis dados adequados, pode ser
efectuado um estudo preliminar de avaliao da gama, de modo a permitir a determinao das doses a utilizar.
Os animais do grupo de controlo devem ser tratados da mesma maneira que os animais dos grupos de ensaio,
com excepo do tratamento com a substncia de ensaio. Caso seja utilizado um excipiente, o grupo de
controlo dever receber o volume mximo de excipiente utilizado no ensaio.
1.5.3. Teste de fiabilidade
O laboratrio que efectua o estudo deve apresentar dados comprovativos da sua capacidade para efectuar o
estudo e relativos sensibilidade dos procedimentos utilizados. Tais dados devem provar a capacidade de
detectar e quantificar, como apropriadas, alteraes nos diferentes critrios especficos recomendados para
observao, tais como sinais autonmicos, reactividade sensorial, fora de preenso dos membros e actividade
motora. Podem ser consultadas as referncias 2 a 9 para informaes sobre substncias qumicas que provocam
diferentes respostas neurotxicas e que podem ser utilizadas como controlos positivos. Podem ser utilizados
dados histricos desde que os procedimentos experimentais no sejam alterados. Recomenda-se uma
actualizao peridica dos dados histricos. Caso o laboratrio executante modifique alguns elementos
essenciais da execuo do ensaio ou procedimentos, devem obter-se novos dados comprovativos de que a
sensibilidade dos procedimentos no foi alterada.
1.5.4. Seleco da dose
A escolha dos nveis de dose dever tomar em considerao todos os dados de toxicidade e cintica existentes
para a substncia de ensaio ou as substncias relacionadas. Deve ser seleccionado o nvel de dose mais elevado
que induza efeitos neurotxicos ou efeitos txicos sistmicos evidentes. Deve seleccionar-se uma sequncia
descendente de nveis de dose que permita detectar qualquer resposta relacionada com a dose e determinar o
nvel sem efeito adverso observvel (NSEAO) ao nvel de dose mais baixo. Em princpio, os nveis de dose
devem ser estabelecidos de modo a permitir distinguir entre os efeitos txicos primrios no sistema nervoso e
os efeitos relacionados com toxicidade sistmica. Em muitos casos, a melhor forma de estabelecer estas
sequncias consiste no espaamento das doses em dois a trs intervalos. A adio de um quarto grupo de
ensaio muitas vezes prefervel ao uso de intervalos muito grandes entre as dosagens (ou seja, com um factor
superior a 10). Nos casos em que existe uma estimativa razovel da exposio humana, esta deve tambm ser
tomada em considerao.
1.5.5. Teste-limite
Se um ensaio com um nvel de dose oral de pelo menos 1 000 mg/kg de peso corporal/dia, realizado de acordo
com os procedimentos descritos neste estudo, no provocar efeitos neurotxicos observveis e se, alm disso,
os dados existentes sobre compostos estruturalmente relacionados com a substncia de ensaio no sugerirem a
possvel ocorrncia de toxicidade, poder considerar-se desnecessrio realizar um ensaio completo com trs
nveis de dose. Nos casos em que se preveja exposio humana poder ser necessrio aumentar o nvel de dose
oral no ensaio-limite. Quando se usam outras formas de administrao, como inalao ou aplicao cutnea, as
propriedades fsico-qumicas da substncia de ensaio so muitas vezes indicativas e limitativas do nvel mximo
de exposio praticvel. Para a execuo do estudo oral agudo, a dose para o teste-limite deve ser, no mnimo,
de 2 000 mg/kg.
A aplicao da dose da substncia de ensaio nos animais efectuada diariamente, sete dias por semana, durante
um perodo de pelo menos 28 dias. O uso de um perodo de dosagem de cinco dias ou inferior deve ser
justificado. A administrao por sonda esofgica deve ser feita, de preferncia, numa toma nica, usando um
tubo estomacal ou uma cnula de intubao apropriada. O volume mximo de lquido que pode ser
administrado de cada vez depende do tamanho do animal de ensaio. O volume no deve exceder 1 ml/100 g de
peso corporal. Para solues aquosas, contudo, pode ser considerada a dose de 2 ml/100 g de peso corporal.
Deve minimizar-se a variabilidade do volume de ensaio efectuando ajustes nas concentraes, de forma a
assegurar a constncia do volume em todos os nveis de dose; exceptuam-se os casos em que se utilizam
substncias irritantes ou corrosivas, que normalmente exercem efeitos exacerbados quando aplicadas em
concentraes mais elevadas.
importante assegurar que as quantidades da substncia de ensaio administradas atravs da alimentao ou da
gua de beber no interferem nas exigncias normais de nutrio ou de consumo de gua. Quando a substncia
de ensaio for incorporada na alimentao pode utilizar-se uma concentrao alimentar constante (ppm) ou,
alternativamente, um nvel de dose constante em relao ao peso corporal dos animais; deve especificar-se o
mtodo escolhido para o ensaio. No caso de uma substncia administrada por sonda esofgica, a dose deve ser
administrada todos os dias mesma hora, devendo ser ajustada pelo menos uma vez por semana a fim de se
manter uma dose constante em relao ao peso corporal do animal. No caso de se efectuar um estudo de dose
repetida, como estudo preliminar de um estudo de longo prazo, deve utilizar-se uma dieta semelhante em
ambos os estudos. Nos estudos de toxicidade aguda, se no for possvel a administrao de uma toma nica, a
dose pode ser administrada em fraces menores ao longo de um perodo no superior a 24 horas.
1.6. OBSERVAES
1.6.1. Frequncia das observaes e ensaios
Nos estudos de dose repetida, o perodo de observao deve abranger o perodo de dosagem. Nos estudos de
toxicidade aguda deve ser observado um perodo de 14 dias aps o tratamento. As observaes devem tambm
abranger este perodo para os animais em grupos-satlite que foram mantidos sem exposio durante o perodo
aps o tratamento.
As observaes devem ser efectuadas com uma frequncia suficiente para maximizar a probabilidade de
deteco de qualquer anomalia comportamental e/ou neurolgica. As observaes devem ser, preferencial-
mente, efectuadas mesma hora, todos os dias, tendo em conta o perodo de pico previsto de efeitos aps
aplicao da dose. Na tabela 2 apresenta-se resumida a frequncia das observaes clnicas, bem como dos
ensaios funcionais. No caso de existirem dados cinticos ou outros dados obtidos em estudos prvios
indicativos da necessidade de se utilizarem diferentes momentos de observao, ensaios ou perodos de
observao posteriores, deve adoptar-se um calendrio alternativo de modo a obter o mximo de informao.
Deve apresentar-se uma justificao para as alteraes introduzidas no calendrio.
1.6.1.1. Observaes do estado de sade geral e da mortalidade/morbilidade
Todos os animais devem ser observados cuidadosamente, pelo menos uma vez por dia, para avaliar o seu
estado de sade geral, bem como, pelo menos duas vezes por dia, para avaliar a mortalidade e morbilidade.
1.6.1.2. Observaes clnicas pormenorizadas
Devem ser efectuadas observaes clnicas pormenorizadas em todos os animais seleccionados para este fim
(consultar a tabela 1), uma vez antes da primeira exposio (de modo a permitir a comparao entre os
diferentes animais) e, posteriormente, a diferentes intervalos, consoante a durao do estudo (consultar a tabe-
la 2). Devem ser tambm efectuadas observaes clnicas pormenorizadas nos grupos-satlite de recuperao
no final do perodo de recuperao. As observaes clnicas pormenorizadas devem ser efectuadas no exterior
do compartimento experimental, numa arena-padro. Devem ser registadas cuidadosamente utilizando
sistemas de pontuao que incluam escalas de critrios ou de pontuao para cada medio das observaes.
Os critrios ou escalas utilizados devem ser explicitamente definidos pelo laboratrio de ensaio. Deve
assegurar-se que as variaes das condies de ensaio so mnimas (no sistematicamente relacionadas com o
tratamento) e que as observaes so efectuadas por pessoal especializado sem conhecimento do tratamento
efectuado.
Recomenda-se que as observaes sejam efectuadas de um modo estruturado, em que se aplicam
sistematicamente critrios bem definidos (incluindo a definio de gama normal) a cada animal, em cada
observao. A gama normal deve ser apropriadamente documentada. Devem ser registados todos os sinais
observados. Sempre que possvel, deve tambm ser registada a intensidade dos sinais observados. As
observaes clnicas devem incluir, entre outros aspectos, alteraes na pele, plo, olhos, membranas mucosas,
ocorrncia de secrees e excrees e actividade autnoma (por exemplo, lacrimao, ereco pilosa, tamanho
da pupila, padro respiratrio anormal e/ou respirao pela boca, quaisquer sinais pouco usuais de urina ou
defecao e urina descorada).
Devem ser registadas quaisquer respostas pouco usuais relativas posio corporal, nvel de actividade (por
exemplo, maior ou menor explorao da arena-padro) e coordenao dos movimentos. Tambm devem ser
registadas alteraes na marcha (por exemplo, marcha bamboleante, ataxia), postura (por exemplo, dorso
arqueado) e reactividade ao manuseamento, colocao ou outros estmulos ambientais, bem como a presena
de movimentos clnicos ou tnicos, convulses ou tremores, esteretipos (por exemplo, higiene excessiva,
movimentos de cabea pouco usuais, locomoo em crculos repetitiva) ou comportamento anmalo (por
exemplo, morder ou lamber excessivamente, automutilao, andar para trs, vocalizao) ou agresso.
1.6.1.3. Ensaios funcionais
Tal como para o caso das observaes clnicas pormenorizadas, devem ser efectuados ensaios funcionais uma
vez antes da exposio e frequentemente aps a exposio nos animais seleccionados para este fim (consultar a
tabela 1). A frequncia dos ensaios funcionais depende tambm da durao do estudo (consultar a tabela 2).
Alm dos perodos de observao, estabelecidos na tabela 2, as observaes funcionais dos grupos-satlite de
recuperao devem tambm ser efectuadas o mais prximo possvel da morte terminal. Os ensaios funcionais
devem incluir a reactividade sensorial a estmulos de vrias tipos [por exemplo, estmulos auditivos, visuais e
proprioceptivos (5) (6) (7)], a avaliao da fora de preenso dos membros (8) e a avaliao da actividade
motora (9). A actividade motora deve ser medida com um dispositivo automtico capaz de detectar tanto
aumentos como diminuies de actividade. Caso seja utilizado outro sistema definido, este deve ser
quantitativo e a sua sensibilidade e fiabilidade devem ser comprovadas. Cada dispositivo deve ser ensaiado para
assegurar a fiabilidade ao longo do tempo e a consistncia entre os diferentes dispositivos. Nas respectivas
referncias apresenta-se informao detalhada sobre os procedimentos a seguir. Caso no existam quaisquer
dados (por exemplo, relaes estrutura-actividade, dados epidemiolgicos, outros estudos toxicolgicos)
indicativos dos potenciais efeitos neurolgicos, deve ser considerada a incluso de ensaios mais especializados
de funo sensorial e motora ou de aprendizagem e memria de modo a que estes possveis efeitos sejam
examinados mais pormenorizadamente. Na referncia (1) apresentam-se informaes adicionais sobre os
ensaios especializados e sua utilizao.
Excepcionalmente, os animais que apresentem sinais de toxicidade numa extenso que afecte significativamente
o ensaio funcional podem ser excludos deste ensaio. Deve ser apresentada uma justificao para a excluso de
animais do ensaio funcional.
1.6.2. Peso corporal e consumo de alimento/gua
Para estudos com durao at 90 dias, todos os animais devem ser pesados, pelo menos, uma vez por semana, e
devem ser feitas medies do consumo de alimentos (consumo de gua, caso a substncia de ensaio seja
administrada por este meio) pelo menos semanalmente. Para estudos de longo prazo, todos os animais devem
ser pesados pelo menos uma vez por semana durante as 13 primeiras semanas e seguidamente pelo menos de
4 em 4 semanas. Devem ser feitas medies do consumo de alimentos (consumo de gua, caso a substncia de
ensaio seja administrada por este meio), pelo menos semanalmente, nas primeiras 13 semanas, e seguidamente
com um intervalo de cerca de trs meses, excepto se o estado de sade ou as variaes de peso corporal
indicarem que se deve fazer com outra periodicidade.
1.6.3. Oftalmologia
Para estudos de durao superior a 28 dias deve ser efectuado um exame oftalmolgico, utilizando um
oftalmoscpio ou um instrumento equivalente adequado, antes da administrao da substncia de ensaio e no
final do estudo. Preferencialmente este exame deve ser feito a todos os animais ou, pelo menos, aos animais dos
grupos de doses elevadas e dos grupos de controlo. Todos os animais devem ser examinados caso sejam
detectadas alteraes oculares ou caso os sintomas clnicos assim o indiquem. Para estudos de longo prazo, o
exame oftalmolgico deve tambm ser efectuado no final de 13 semanas. No necessrio efectuar os exames
oftalmolgicos se existirem dados disponveis de outros estudos com durao semelhante e com nveis de dose
semelhantes.
1.6.4. Hemograma e qumica clnica
Se o estudo de neurotoxicidade for efectuado em conjunto com um estudo de toxicidade sistmica de dose
repetida, devem ser efectuadas anlises clnicas (hemograma e qumica clnica), tal como estabelecido no
respectivo mtodo do estudo de toxicidade sistmica. A recolha das amostras deve ser efectuada de modo a
minimizar quaisquer potenciais efeitos no comportamento neuronal.
1.6.5. Histopatologia
O exame neuropatolgico deve ser concebido a fim de complementar e aprofundar as observaes efectuadas
durante a fase in vivo do estudo. Os tecidos provenientes de, pelo menos, cinco animais de cada grupo do
mesmo sexo (consultar a tabela 1 e o pargrafo seguinte) devem ser fixados in situ por utilizao de tcnicas de
perfuso e fixao comummente adoptadas (consultar a referncia 3, captulo 5, e a referncia 4, captulo 50).
Devem ser registadas quaisquer alteraes importantes que sejam observadas. No caso de o estudo ser
efectuado independentemente para rastreio de neurotoxicidade ou para caracterizar efeitos neurotxicos, os
animais que no sejam utilizados podem s-lo em procedimentos neurocomportamentais (10) (11),
neuropatolgicos (10) (11) (12) (13), neuroqumicos (10) (11) (14) (15) e electrofisiolgicos especficos que
podem complementar os procedimentos e exames descritos ou podem ser acrescentados aos animais sujeitos a
exame histopatolgico. Estes procedimentos complementares tm um interesse especial quando as observaes
empricas ou os efeitos previstos so indicativos de um tipo ou alvo especficos para a neurotoxicidade (2) (3).
Os animais no utilizados podem, alternativamente, s-lo em avaliaes patolgicas de rotina tal como
descritas no mtodo para estudos de dose repetida.
Deve ser utilizada uma tcnica de colorao convencional, tal como hematoxilina ou eosina (H&E), em todas as
amostras de tecidos, que devem ser fixadas em parafina e examinadas ao microscpio. Caso sejam observados
sintomas de neuropatia perifrica ou haja suspeitas nesse sentido, devem ser examinadas amostras de tecido
nervoso perifrico fixado em plstico. Os sintomas clnicos podem igualmente sugerir o exame a locais
adicionais ou a utilizao de tcnicas de colorao especiais. Podem obter-se orientaes sobre os locais
adicionais a examinar em (3) e (4). Pode tambm ser til a utilizao de tcnicas de colorao especiais
apropriadas demonstrao de alteraes patolgicas especficas (18).
Os segmentos representativos dos sistemas nervosos central e perifrico devem ser sujeitos a exame
histopatolgico (consultar a referncia 3, captulo 5, e a referncia 4, captulo 50). As reas a examinar devem
normalmente incluir: o crebro anterior, o centro do crebro, incluindo uma seco atravs do hipocampo, o
mesencfalo, o cerebelo, a ponte de Varolio, a medulla oblongata, o olho, incluindo o nervo ptico e a retina, a
espinal medula ao nvel das protuberncias cervical e lombar, os gnglios da raiz dorsal, as fibras das razes
dorsal e ventral, o nervo citico proximal, o nervo tibial proximal (no joelho) e as ramificaes do nervo tibial
nos gmeos. Devem ser examinadas as seces coronal, transversal e longitudinal da espinal medula e dos
nervos perifricos. Deve ser dada especial ateno vasculatura do sistema nervoso. Deve ser igualmente
analisada uma amostra de msculo esqueltico, nomeadamente, gmeos. Deve ser prestada especial ateno aos
locais com estrutura e padro celular e fibroso bi SNC e SNP que se saiba serem particularmente vulnerveis a
substncias neurotxicas.
Podem obter-se orientaes sobre as alteraes neuropatolgicas que resultam tipicamente da exposio a
substncias txicas nas referncias (3) e (4). Recomenda-se um exame minucioso das amostras de tecidos, no
qual so inicialmente comparados os cortes seccionais obtidos no grupo de dose mais elevada com os obtidos
no grupo de controlo. Caso no sejam observadas quaisquer alteraes neuropatolgicas nas amostras
provenientes desses grupos, no necessrio efectuar quaisquer anlises subsequentes. Caso sejam observadas
alteraes neuropatolgicas no grupo de dose mais elevada, as amostras de cada um dos tecidos
potencialmente afectados provenientes dos grupos de doses intermdia e reduzida devem ser codificadas e
analisadas sequencialmente.
Caso sejam detectados, no decorrer do exame qualitativo, quaisquer sintomas de alteraes neuropatolgicas,
deve ser efectuado um segundo exame a todas as regies do sistema nervoso que apresentem tais alteraes.
Cortes seccionais provenientes de todos os grupos de dosagem de cada uma das regies potencialmente
afectadas devem ser codificados e examinados ao acaso, sem conhecimento do respectivo cdigo. Devem ser
registadas a frequncia e gravidade de cada leso detectada. Aps a classificao de todas as regies em todos os
grupos de dosagem, o cdigo pode ser revelado e pode ser efectuada a anlise estatstica de modo a avaliar as
relaes dose-efeito. Devem descrever-se exemplos para os diferentes graus de gravidade das vrias leses.
Os dados neuropatolgicas devem ser avaliados no contexto das observaes comportamentais e das medidas
efectuadas, assim como de quaisquer outros dados provenientes de estudos de toxicidade sistmica da
substncia de ensaio efectuados anterior ou simultaneamente.
2. DADOS
Devem apresentar-se os dados individuais. Alm disso, todos os dados devem ser resumidos em forma tabular,
indicando, para cada grupo de ensaio ou de controlo, o nmero de animais no incio do ensaio, o nmero de
animais encontrados mortos durante o ensaio ou sacrificados a fim de evitar dor, o momento de todas as
mortes (espontneas ou provocadas), o nmero de animais apresentando sintomas de toxicidade, uma
descrio dos sintomas de toxicidade observados (incluindo o momento do aparecimento, a durao, o tipo e a
gravidade), o nmero de animais que apresentam leses, incluindo o tipo e a gravidade de tais leses.
Os resultados do estudo devem ser avaliados em termos da incidncia, gravidade e correlao entre os efeitos
observados aos nveis neurocomportamental e neuropatolgico (assim como os efeitos neuroqumicos e
electrofisiolgicos, caso sejam efectuados quaisquer exames complementares) e quaisquer outros efeitos
adversos observados. Sempre que possvel, os resultados numricos devem ser avaliados atravs de um mtodo
estatstico adequado e de utilizao comum. Os mtodos estatsticos devem ser determinados durante o
planeamento do estudo.
3. RELATRIO
RELATRIO DO ENSAIO
natureza fsica (incluindo ismeros, pureza e propriedades fsico-qumicas);
dados de identificao.
justificao para escolha do excipiente.
Animais de ensaio:
provenincia, condies de alojamento, aclimatizao, dieta, etc.;
peso individual dos animais no incio do ensaio.
Condies do ensaio:
concentrao atingida, estabilidade e homogeneidade da preparao;
especificao das doses administradas, incluindo dados pormenorizados sobre o excipiente, volume e
forma fsica do material administrado;
justificaes para a escolha dos diferentes nveis de dosagem;
justificaes para a escolha da via de administrao e a durao do ensaio;
Observaes e procedimentos de ensaio:
informao pormenorizada sobre a atribuio dos animais de cada grupo aos diferentes subgrupos de
perfuso;
informao pormenorizada sobre os sistemas de classificao, incluindo escalas de classificao e
critrios para cada medida efectuada nas observaes clnicas aprofundadas;
informao pormenorizada sobre os ensaios funcionais da reaco sensorial aos estmulos de diferentes
origens (por exemplo, auditivos, visuais e proprioceptivos); da avaliao da fora de preenso dos
membros e da actividade motora (incluindo informao pormenorizada sobre dispositivos automticos
de deteco de actividade); e de outros procedimentos efectuados;
informao pormenorizada sobre os exames oftalmolgicos e, caso seja adequado, anlises clnicas
(hemograma e qumica clnica) com valores relevantes de linha de base;
informao pormenorizada sobre os procedimentos neurocomportamentais, neuropatolgicos,
neuroqumicos e electrofisiolgicos especficos.
Resultados:
peso corporal/alteraes do peso corporal, incluindo o peso corporal na altura da morte;
consumo de alimento e consumo de gua, sempre que necessrio;
dados sobre a resposta toxicidade para cada sexo e nvel de dosagem, incluindo sintomas de toxicidade
ou mortalidade;
natureza, gravidade e durao (momento do aparecimento e desenvolvimento subsequente) dos efeitos
detectados em observaes clnicas aprofundadas (reversveis ou no);
descrio pormenorizada de todos os resultados dos ensaios funcionais;
resultados da autpsia;
descrio pormenorizada de todos os dados neurocomportamentais, neuropatolgicos e neuroqumicos
ou electrofisiolgicos, caso estejam disponveis;
dados de absoro e metabolismo, caso estejam disponveis;
tratamento estatstico dos resultados, se apropriado.
Anlise dos resultados:
informao sobre a resposta dosagem;
relao entre quaisquer outros efeitos txicos de modo a tirar concluses sobre o potencial neurotxico
da substncia qumica de ensaio;
nvel sem efeito adverso observvel.
Concluses:
aconselha-se a incluso de uma declarao especfica sobre a neurotoxicidade global da substncia
qumica de ensaio.
4. REFERNCIAS
(1) OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris (em
preparao).
(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals
(em Teratology).
(3) World Health Organisation (WHO) (1986) Environmental Health Criteria document 60: Principles and
Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.
(4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H., (1980) Experimental and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S.
and Schaumburg, H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.
(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B., (1980) Utility of the Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol.
Exp., 40, p. 999-1003.
(6) Gad, S.C., (1982) A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9,
p. 691-704.
(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M., (1991) Rat Strain and Stock Comparisons Using a
Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., 108,
p. 267-283.
(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T., (1979) A Method for the Routine Assessment of
Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, p. 233-236.
(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C., (1991)
Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological
Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, p. 599-609.
(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds., (1992) Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press,
New York.
(11) Chang, L.W., ed., (1995) Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker, New York.
(12) Broxup, B., (1991) Neuopathology as a screen for Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10,
p. 689-695.
(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C., (1992) Comparison of Subchronic
Neurotoxicity of 2-Hydroxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, p. 343-352.
(14) O'Callaghan, J.P., (1988) Neurotypic and Gliotypic Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity.
Eurotoxicol. Teratol., 10, p. 445-452.
(15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B., (1988) Acute Exposure of the Neonatal Rat to Triethyltin Results in
Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, p. 368-378.
(16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G., (1982) Electrophysiological Techniques in Neurotoxi-
cology. In: Nervous System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, p. 299-335.
(17) Johnson, B.L., (1980) Electrophysiological Methods in neurotoxicity Testing. In: Experimental and
Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co., Baltimore/
/London, p. 726-742.
(18) Bancroft, J.D. and Steven A., (1990) Theory and Pratice of Histological Techniques. Chapter 17,
Neuropathological Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.
Tabela 1
Nmero mnimo de animais necessrios, em cada grupo, para se realizar o ensaio de neurotoxicidade de forma independente ou em conjunto
com outros estudos
MODO DE REALIZAO DO ESTUDO DE TOXICIDADE
Estudo independente
Em combinao com o estudo
de 28 dias
de 90 dias
de toxicidade crnica
Nmero total de animais por
grupo
10 machos e 10 fmeas 10 machos e 10 fmeas 15 machos e 15 fmeas 25 machos e 25 fmeas
Nmero de animais escolhidos
para ensaios funcionais, incluindo
observaes clnicas pormenoriza-
das
para perfuso in situ e neuro-
-histopatologia
para observaes de toxicidade
crnica, subcrnica ou relativa
dose, anlises clnicas (hemograma,
qumica clnica), histopatologia,
etc., tal como descrito nas respec-
tivas Orientaes
5 machos e 5 fmeas 10 machos e
10 fmeas
20 machos e 20 fmeas
Observaes complementares, se
apropriado
5 machos e 5 fmeas
Inclui cinco animais escolhidos para ensaios funcionais e observaes clnicas pormenorizadas como parte integrante do estudo de neurotoxicidade.
Tabela 2
Frequncia das observaes clnicas e dos ensaios funcionais
Tipo de observaes
Durao do estudo
Aguda 28 dias 90 dias Crnica
Em todos os animais Estado geral de sade diria diria diria diria
Mortalidade/morbili-
dade
duas vezes ao dia duas vezes ao dia duas vezes ao dia duas vezes ao dia
Nos animais escolhidos
para as observaes
funcionais
Observaes clnicas
pormenorizadas
antes do incio
do estudo
aps 8 horas da
administrao
da dose, no
momento em
que se espera
uma resposta
mxima
nos dias 7 e 14
aps a adminis-
trao da dose
antes do incio
do estudo
uma vez por
semana, da em
diante
antes do incio
do estudo
uma vez,
durante a pri-
meira ou
segunda
semana, aps o
incio do ensaio
uma vez por
ms, da em
diante
antes do incio do
estudo
uma vez decor-
rido um ms aps
o incio do ensaio
de trs em trs
meses, da em
diante
Ensaios funcionais antes do incio
do estudo
aps 8 horas da
administrao
da dose, no
momento em
que se espera
uma resposta
mxima
nos dias 7 e 14
aps a adminis-
trao da dose
antes do incio
do estudo
durante a quarta
semana de tra-
tamento e to
prximo quanto
possvel do final
do perodo de
ensaio
antes do incio
do estudo
uma vez,
durante a pri-
meira ou
segunda
semana, aps o
incio do ensaio
uma vez por
ms, da em
diante
antes do incio do
estudo
uma vez decor-
rido um ms aps
o incio do ensaio
de trs em trs
meses, da em
diante
B.44. ABSORO CUTNEA: MTODO IN VIVO
1. MTODO
O presente mtodo de ensaio equivalente ao mtodo OECD TG 427 (2004).
1.1. INTRODUO
Embora a exposio a numerosas substncias qumicas envolva sobretudo a pele, na maior parte dos estudos
toxicolgicos em animais de laboratrio utilizada a via de administrao oral. O estudo de absoro
percutnea in vivo a que se refere o presente mtodo constitui o elo necessrio para a extrapolao dos
resultados de estudos orais para a avaliao da inocuidade em caso de exposio cutnea.
Para atingir a corrente sangunea, uma substncia tem que atravessar numerosas camadas celulares da pele. A
camada limitante da velocidade de penetrao o estrato crneo, constitudo por clulas mortas. A
permeabilidade da pele depende da lipofilia da substncia qumica e da espessura da camada externa da
epiderme, e ainda de outros factores, como o peso molecular e a concentrao da substncia. A pele dos ratos e
dos coelhos , em geral, mais permevel do que a do homem, ao passo que a permeabilidade da pele das
cobaias e dos macacos se assemelha mais da pele humana.
Os mtodos de medio da absoro percutnea podem ser divididos em duas categorias: in vivo e in vitro. O
mtodo in vivo permite obter informaes fiveis sobre a absoro cutnea em vrias espcies de laboratrio.
Mais recentemente foram desenvolvidos mtodos in vitro baseados no transporte atravs de pele total ou de pele
de clivagem, humana ou de animais, para um reservatrio de fluido. O mtodo in vitro encontra-se descrito
num mtodo de ensaio distinto (1). Na escolha do mtodo mais apropriado para determinada situao
recomenda-se a consulta do documento de orientao da OCDE para a realizao de ensaios de absoro
cutnea (2), no qual tratada em mais pormenor a utilidade dos mtodos in vivo e in vitro.
O mtodo in vivo aqui descrito permite determinar a penetrao da substncia ensaiada no compartimento
sistmico atravs da pele. A tcnica tem sido amplamente utilizada desde h muitos anos (3) (4) (5) (6) (7).
Embora os estudos de absoro percutnea in vitro sejam muitas vezes adequados, pode haver situaes em que
s um estudo in vivo permitir obter os dados necessrios.
As vantagens do mtodo in vivo so a utilizao de um sistema fisiolgica e metabolicamente intacto, o uso da
mesma espcie em muitos estudos de toxicidade e a possibilidade de adaptao para utilizao com outras
espcies. As desvantagens so a utilizao de animais vivos, a necessidade de marcadores radioactivos para
facilitar a obteno de resultados fiveis, a dificuldade de determinao da fase inicial da absoro e as
diferenas de permeabilidade cutnea entre a espcie mais utilizada (rato) e o homem. A pele dos animais
normalmente mais permevel, o que pode levar a sobrestimar a absoro percutnea no homem (6) (8) (9). As
substncias custicas ou corrosivas no devem ser ensaiadas em animais vivos.
1.2. DEFINIES
Dose no absorvida: a que removida da superfcie cutnea aps a exposio, por lavagem, ou que esteja
eventualmente presente na cobertura no oclusiva, incluindo a que eventualmente se demonstre ter-se
volatilizado da pele durante a exposio.
Dose absorvida (in vivo): inclui a que est presente na urina, nos resduos de lavagem das gaiolas, nas fezes, no
ar expirado (se tiver sido determinada), no sangue, nos tecidos (caso se proceda sua colheita) e no resto da
carcaa, uma vez retirada a pele do local de aplicao.
Dose absorvvel: a que permanece na pele, ou superfcie desta, aps a lavagem.
A substncia a ensaiar, de preferncia marcada com um radioistopo, aplicada na pele tosquiada em dose(s)
adequada(s) na forma de uma preparao representativa, tal como normalmente utilizada. A preparao
ensaiada deixada em contacto com a pele durante um perodo determinado, coberta de forma adequada (no
oclusiva, semioclusiva ou oclusiva) para evitar que seja ingerida. Terminado o tempo de exposio, a pele
descoberta e limpa com um agente de limpeza adequado, conservando-se para anlise a cobertura e os
materiais utilizados na limpeza e tornando a aplicar-se uma cobertura limpa. Antes, durante e aps o perodo
de exposio, os animais so alojados em gaiolas de metabolismo individuais, devendo as excrees e o ar
expirado durante esse perodo ser recolhidos para anlise. A recolha do ar expirado pode ser omitida se os
dados existentes permitirem concluir que a formao de metabolito radioactivo voltil reduzida ou nula. Em
cada estudo, vrios grupos de animais sero normalmente expostos preparao ensaiada. Um dos grupos ser
sacrificado no final do perodo de exposio. Os restantes grupos sero sacrificados posteriormente, a
intervalos predeterminados (2). No final do perodo de amostragem, os animais restantes so sacrificados,
procedendo-se colheita de sangue e remoo do local de aplicao, para anlise, e pesquisa de material no
excretado na carcaa. Aps anlise das amostras por meios adequados feita a estimativa do grau de absoro
cutnea (6) (8) (9).
1.4.1. Escolha da espcie animal
O rato a espcie mais utilizada, mas podem igualmente usar-se estirpes glabras e espcies com taxas de
absoro cutnea mais semelhantes s do homem (3) (6) (7) (8) (9). Devem utilizar-se adultos saudveis, todos
do mesmo sexo (por defeito, machos), das estirpes correntemente utilizadas em laboratrio. No incio do
estudo, a variao no peso dos animais no deve exceder 20 % do peso mdio. Podem utilizar-se, por
exemplo, ratos machos de 200 g a 250 g, sobretudo aqueles cujo peso se situe na metade superior deste
intervalo.
Deve utilizar-se um grupo de pelo menos quatro animais, todos do mesmo sexo, por cada preparao ensaiada
e por cada um dos pontos terminais previstos. Cada grupo de animais ser sacrificado aps um intervalo
diferente, por exemplo, no termo do perodo de exposio (geralmente, 6 ou 24 horas) e de subsequentes
perodos equivalentes (48 e 72 horas, por exemplo). Caso existam dados comprovativos de diferenas
substanciais entre machos e fmeas, no que diz respeito toxicidade cutnea, deve escolher-se o sexo mais
sensvel. Caso no existam tais dados, pode ser utilizado qualquer um dos sexos.
o
C ( 3
o
dever ser de 50 %-60 %, embora sejam aceitveis valores entre um mnimo de 30 % e um mximo que,
preferivelmente, no dever exceder 70 %, salvo durante os perodos de limpeza do compartimento. A
iluminao deve ser artificial, com sequncias de 12 horas de luz e 12 horas de escurido. A alimentao, que
deve ser fornecida sem restries, pode basear-se em dietas de laboratrio convencionais, com fornecimento
ilimitado de gua para beber. Durante o estudo e, de preferncia, tambm durante a aclimatao, os animais
sero alojados em gaiolas de metabolismo individuais. Uma vez que o derrame de alimentos e gua pode
comprometer os resultados do estudo, conveniente reduzir ao mnimo a probabilidade da sua ocorrncia.
Os animais so marcados de forma a poderem ser identificados individualmente e mantidos nas gaiolas pelo
menos nos cinco dias anteriores ao incio do estudo, para se aclimatarem s condies do laboratrio.
Aps o perodo de aclimatao, e cerca de 24 horas antes da administrao, os animais sero tosquiados na
regio dos ombros e do dorso. Uma vez que as propriedades de permeao da pele lesada e da pele intacta so
diferentes, deve tomar-se cuidado para no lesar a pele. Aps a tosquia, e cerca de 24 horas antes de aplicar a
substncia a ensaiar (ver ponto 1.4.7), a superfcie da pele deve ser limpa com acetona, para retirar o sebo. No
aconselhvel lavar novamente com gua e sabo, j que quaisquer resduos de sabo podero favorecer a
absoro da substncia ensaiada. A rea deve ser suficiente para permitir uma estimativa fivel da quantidade de
substncia ensaiada que absorvida por cm
2
de pele de preferncia, 10 cm
2
, pelo menos, o que praticvel
em ratos com peso vivo entre 200 e 250 g. Aps a preparao, os animais voltam a ser colocados nas gaiolas
de metabolismo.
1.4.5. Substncia a ensaiar
A substncia a ensaiar a entidade de que se pretendem estudar as propriedades de penetrao. De preferncia,
a substncia a ensaiar deve ser marcada com um radioistopo.
1.4.6. Preparao a ensaiar
A preparao com a substncia a ensaiar (por exemplo, material puro, diludo ou formulado contendo a
substncia a ensaiar e que se aplica na pele) deve ser aquela a que podero estar expostos o homem ou outras
espcies potencialmente visadas, ou um substituinte realista da mesma. Qualquer mudana em relao
preparao tal como utilizada deve ser justificada. Se for necessrio, a substncia a ensaiar pode ser dissolvida
ou suspensa num excipiente apropriado. As caractersticas de absoro dos excipientes excepto a gua e a
sua eventual interaco com a substncia ensaiada devem ser conhecidos.
1.4.7. Aplicao na pele
Definir na superfcie da pele um local de aplicao com uma rea determinada. Aplicar em seguida nesse local,
uniformemente, uma quantidade conhecida da preparao a ensaiar. Normalmente, a quantidade aplicada deve
simular a exposio humana potencial, geralmente 1-5 mg/cm
2
para os slidos e 10 l/cm
2
para os lquidos. A
utilizao de outras quantidades deve ser justificada com base nas condies de utilizao previstas, nos
objectivos do estudo ou nas caractersticas fsicas da preparao a ensaiar. Aps a aplicao, o stio tratado deve
ser protegido, de forma a impedir que o animal se limpe. A figura 1 mostra um exemplo de dispositivo tpico.
O local de aplicao normalmente protegido por uma cobertura no oclusiva (gaze de nylon permevel, por
exemplo). Contudo, para aplicaes infinitas, a cobertura do local de aplicao deve ser oclusiva. Em caso de
ensaio de substncias semivolteis necessrio, se a evaporao provocar uma diminuio inaceitvel da taxa
de recuperao da substncia ensaiada (ver tambm o primeiro pargrafo do ponto 1.4.10), captar a substncia
evaporada num filtro de carvo que cubra o dispositivo de aplicao (ver figura 1). importante que o
dispositivo no danifique a pele, nem absorva a preparao ensaiada ou reaja com ela. Os animais so depois
novamente colocados nas gaiolas de metabolismo individuais, para recolha das excrees.
1.4.8. Durao da exposio e da amostragem
A durao da exposio o tempo que decorre entre a aplicao e a remoo da preparao ensaiada por
lavagem da pele. O perodo de exposio utilizado (geralmente, 6 ou 24 horas) deve ser adequado durao
provvel da exposio humana. Terminado o perodo de exposio, os animais so mantidos nas gaiolas de
metabolismo at ao termo previsto do ensaio. Os animais devem ser observados regularmente durante toda a
durao do estudo, para deteco de sinais de toxicidade ou de reaces anormais. No final do perodo de
exposio, a pele tratada deve ser observada para deteco de sinais visveis de irritao.
As gaiolas de metabolismo devem permitir a recolha individual da urina e das fezes durante todo o estudo.
tambm conveniente que possibilitem a recolha do dixido de carbono e compostos volteis marcados com
14
C, que devem ser analisados caso sejam produzidos em quantidade (> 5 %). A urina, as fezes e os fluidos
captados (dixido de carbono e compostos de carbono volteis marcados com
14
C, por exemplo) devem ser
recolhidos individualmente em cada grupo, aquando de cada amostragem. Se os dados existentes permitirem
concluir que a formao de metabolito radioactivo reduzida ou nula podem ser utilizadas gaiolas abertas.
As excrees so recolhidas durante o perodo de exposio, at 24 horas aps o contacto inicial com a pele e,
em seguida, diariamente at ao final da experincia. Embora trs intervalos de recolha de excrees sejam
normalmente suficientes, pode ser conveniente dispor de pontos experimentais mais adequados, ou mais
numerosos, atendendo finalidade a que se destina a preparao ensaiada ou aos dados cinticos existentes.
No final do perodo de exposio, o dispositivo de proteco de cada animal retirado e conservado
separadamente, para anlise. Em todos os animais, a pele tratada deve ser lavada pelo menos trs vezes com um
agente de limpeza, utilizando zaragatoas apropriadas. Deve ter-se cuidado para evitar contaminar outras partes
do corpo. O agente de limpeza deve ser representativo das prticas usuais de higiene uma soluo aquosa de
sabo, por exemplo. Por fim, a pele deve ser enxugada. Todas as zaragatoas e resduos da lavagem devem ser
conservados para anlise. Nos animais dos grupos correspondentes aos pontos experimentais mais tardios, o
stio tratado deve, antes do regresso s gaiolas individuais, tornar a ser protegido com uma cobertura limpa.
1.4.9. Procedimentos finais
Em cada grupo, os animais devem ser sacrificados no momento previsto, procedendo-se colheita de sangue
para anlise. A cobertura de proteco deve ser retirada para anlise. A pele do local de aplicao, bem como
uma rea semelhante de pele tosquiada no tratada, devem ser removidas de cada animal para serem analisadas
separadamente. A pele do local de aplicao pode ser clivada, para separar o estrato crneo da epiderme
subjacente, a fim de se obterem mais informaes sobre a distribuio da substncia em estudo. A
determinao da evoluo desta distribuio ao longo do tempo, aps o perodo de exposio, deveria dar
alguma indicao quanto ao destino da substncia qumica em estudo eventualmente presente no estrato
crneo. Para facilitar a clivagem da pele (aps a lavagem final da pele e o sacrifcio do animal), a cobertura de
proteco removida. A pele do local de aplicao, incluindo a coroa circular circundante, excisada do rato e
fixada com alfinetes numa placa. Aplicar uma fita adesiva sobre a pele, pressionando suavemente, e retirar a fita
adesiva, que trar consigo parte do estrato crneo. Repetir o processo com novas fitas adesivas at ao momento
em que, uma vez removido inteiramente o estrato crneo, a fita deixa de aderir pele. Todas as fitas adesivas
utilizadas para cada animal podem ser depositadas no mesmo recipiente, adicionando-se-lhes em seguida um
digestor de tecidos para solubilizao do estrato crneo. Os tecidos-alvo potenciais podem ser removidos para
medies separadas, antes da anlise do resto da carcaa para determinao da dose absorvida na carcaa. As
carcaas dos animais devem ser conservadas individualmente para anlise. A anlise do teor total ser,
normalmente, suficiente. Os rgos-alvo podem ser retirados para serem analisados individualmente (se outros
estudos assim o indicarem). A urina presente na bexiga aquando do sacrifcio programado deve ser adicionada
urina recolhida anteriormente. Aps a recolha das excrees presentes nas gaiolas de metabolismo no
momento do sacrifcio programado, as gaiolas e os sistemas de captao devem ser lavados com um solvente
adequado. O restante equipamento potencialmente contaminado deve tambm ser analisado.
1.4.10. Anlise
Em todos os estudos, deve obter-se uma taxa de recuperao adequada (a mdia a obter ser de 100 10 % da
radioactividade). Taxas de recuperao fora desse intervalo devem ser justificadas. A quantidade da dose
administrada presente em cada amostra deve ser determinada por processos devidamente validados.
A anlise estatstica deve incluir a determinao da varincia para as repeties de cada aplicao.
2. DADOS
Em relao a cada animal, e em cada amostragem para pesquisa da substncia ensaiada ou dos seus metabolitos,
devem ser feitas as seguintes determinaes (alm de serem apresentados individualmente, os dados devem
tambm ser agrupados por tempos de amostragem e apresentados sob forma de mdias):
quantidade associada aos dispositivos de proteco,
quantidade que pode ser retirada da pele,
quantidade presente na pele que no pode ser removida por lavagem,
quantidade presente no sangue colhido,
quantidade presente nas excrees e no ar expirado (se for caso disso),
quantidade restante na carcaa e em rgos eventualmente retirados para serem analisados
separadamente.
Com base na quantidade de substncia ensaiada e/ou dos seus metabolitos nas excrees, no ar expirado, no
sangue e na carcaa poder-se- determinar a quantidade total absorvida em cada um dos pontos experimentais.
Pode tambm ser calculada a quantidade de substncia ensaiada que foi absorvida por cm
2
de pele exposta, ao
longo do perodo de exposio.
3. RELATRIOS
O relatrio do ensaio deve incluir os requisitos especificados no protocolo, nomeadamente a justificao da
escolha do sistema experimental utilizado, devendo conter os seguintes elementos:
Substncia ensaiada:
dados relativos identificao [nmero CAS, se existir; provenincia; pureza (pureza radioqumica);
impurezas conhecidas; nmero do lote; etc.],
natureza fsica, propriedades fsico-qumicas (por exemplo, pH, volatilidade, solubilidade, estabilidade,
peso molecular e log P
oa
).
Preparao ensaiada:
formulao e justificao da utilizao,
informaes sobre a preparao ensaiada, quantidade aplicada, concentrao atingida, excipiente,
estabilidade e homogeneidade.
Animais experimentais:
provenincia, condies de alojamento, dieta, etc.,
peso de cada animal no incio do ensaio.
Condies experimentais:
informaes relativas administrao da preparao ensaiada (local de aplicao, mtodos de
determinao, ocluso ou no, volume, extraco, deteco),
informaes sobre a qualidade dos alimentos e da gua.
Resultados:
quaisquer sinais de toxicidade,
quadro dos valores de absoro (expressos em taxa, quantidade ou percentagem),
taxas de recuperao globais do ensaio,
interpretao dos resultados, comparao com dados eventualmente existentes sobre a absoro
percutnea do composto ensaiado.
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Mtodo de ensaio B.45. Absoro cutnea: mtodo in vitro.
(2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris.
(3) ECETOC, (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of
Chemicals, Monograph No 20.
(4) Zendzian, R.P., (1989) Skin Penetration Method suggested for Environmental Protection Agency
Requirements. J. Am. Coll. Toxicol. 8(5), p. 829-835.
(5) Kemppainen, B.W., Reifenrath WG (1990) Methods for skin absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.
(6) EPA, (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Applications. Exposure Assessment Group,
Office of Health and Environmental Assessment.
(7) EPA, (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, Dermal Penetration. Office of Prevention,
Pedsticides and Toxic Substances.
(8) Bronaugh, R.L., Wester, R.C., Bucks, D., Maibach H.I. and Sarason, R., (1990) In vivo percutaneous
absorption of fragrance ingredients in reshus monkeys and humans. Fd. Chem. Toxic. 28, p. 369-373.
(9) Feldman, R.J. and Maibach, H.I., (1970) Absorption of some organic compounds through the skin in
man. J. Invest Dermatol. 54, p. 399-404.
Figura 1
Exemplo de esquema de dispositivo tipicamente utilizado para definir e proteger o local de
aplicao cutnea nos estudos de absoro percutnea in vivo
B.45. ABSORO CUTNEA: MTODO IN VITRO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O presente mtodo foi concebido para a obteno de informaes sobre a absoro de uma substncia a
ensaiar quando aplicada em pele excisada; pode ser combinado com o Mtodo de absoro cutnea: mtodo in
vivo (1) ou utilizado separadamente. No delineamento de estudos baseados no presente mtodo, recomenda-se
a consulta do documento de orientao da OCDE para a realizao de ensaios de absoro cutnea (2). O
referido documento de orientao foi elaborado no intuito de facilitar a escolha de processos in vitro adequados
para utilizao em circunstncias especficas, de forma a garantir a fiabilidade dos resultados obtidos pelo
presente mtodo.
Os mtodos de medio da absoro cutnea e da transferncia atravs da pele podem dividir-se em duas
categorias: in vivo e in vitro. Os mtodos de absoro cutnea in vivo esto j consagrados, permitindo obter
dados farmacocinticos em diversas espcies animais. Num mtodo de ensaio distinto (1) feita a descrio de
um mtodo in vivo. Os mtodos in vitro so tambm utilizados h muitos anos para medir a absoro cutnea.
Embora no tenham sido efectuados estudos de validao formal dos mtodos in vitro abrangidos pelo presente
mtodo de ensaio, os peritos da OCDE acordaram em 1999 em que os dados avaliados existentes eram
suficientes para apoiar o mtodo in vitro (3). No documento de orientao (2) so fornecidos elementos
comprovativos adicionais, incluindo diversas comparaes directas de mtodos in vitro e in vivo. O assunto foi
tambm tratado em diversas monografias, que contm informaes bsicas pormenorizadas sobre o uso de um
mtodo in vitro (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12). Os mtodos in vitro medem a difuso de substncias qumicas
para a pele e, atravs desta, para um reservatrio de fluido, podendo ser utilizada pele no vivel, apenas para
medir a difuso, ou pele fresca, metabolicamente activa, para medir simultaneamente a difuso e o
metabolismo cutneo. Estes mtodos revelaram-se muito teis na triagem de diferentes formulaes quanto
sua utilidade na transferncia de substncias qumicas para a pele e atravs dela, podendo tambm constituir
modelos teis na avaliao da absoro percutnea no homem.
O mtodo in vitro pode no ser aplicvel em todas as situaes e a todos os tipos de substncias qumicas. Por
vezes pode utilizar-se o mtodo de ensaio in vitro para uma avaliao qualitativa inicial da penetrao cutnea.
Em certos casos, poder ser necessrio completar esta avaliao com dados in vivo. Para mais pormenores sobre
as situaes em que a utilizao do mtodo in vitro poder ser adequada, consultar o documento de orientao
(2). A referncia (3) contm informaes pormenorizadas adicionais de apoio deciso.
No presente mtodo so apresentados os princpios gerais em que assenta a medio da absoro cutnea e
subsequente transferncia atravs da pele de uma substncia a ensaiar, utilizando pele excisada. Pode ser
utilizada pele de muitas espcies de mamferos, incluindo o homem. As propriedades de permeabilidade da pele
mantm-se aps a exciso, porque o principal obstculo difuso o estrato crneo no vivel, no tendo sido
detectado o transporte percutneo activo de substncias qumicas. Apesar de ter sido demonstrado que a pele
capaz de metabolizar algumas substncias durante a absoro percutnea (6), trata-se de um processo que no
limitante em termos de dose efectivamente absorvida, embora possa afectar a natureza das substncias
introduzidas na corrente sangunea.
1.2. DEFINIES
Dose no absorvida: a que removida da superfcie cutnea aps a exposio, por lavagem, ou que esteja
eventualmente presente na cobertura no oclusiva, incluindo a que eventualmente se demonstre ter-se
volatilizado da pele durante a exposio.
Dose absorvida (in vitro): massa de substncia a ensaiar que atinge o fluido receptor ou a circulao sistmica
num perodo especificado.
Dose absorvvel (in vitro): a que permanece na pele, ou superfcie desta, aps a lavagem.
A substncia a ensaiar, que pode ser marcada com um radioistopo, aplicada na superfcie de uma amostra de
pele que separa as duas cmaras de uma clula de difuso. A substncia qumica permanece sobre a pele por
um perodo e em condies especificados, antes de ser retirada por um processo de limpeza adequado. A
intervalos determinados ao longo da experincia colhem-se amostras do fluido receptor, que so depois
analisadas para deteco da substncia a ensaiar e/ou dos seus metabolitos.
Caso se utilizem sistemas metabolicamente activos, os metabolitos da substncia a ensaiar podem ser
analisados por mtodos adequados. No final da experincia quantifica-se, se for caso disso, a distribuio da
substncia a ensaiar e dos seus metabolitos.
Utilizando condies adequadas, descritas no presente mtodo e no documento de orientao (2), a absoro
durante determinado perodo da substncia ensaiada medida por anlise do fluido receptor e da pele tratada.
A substncia ensaiada que permanece na pele deve ser considerada como absorvida, excepto se for possvel
demonstrar que a absoro pode ser determinada com base apenas nos valores relativos ao fluido receptor. A
anlise dos outros elementos (material removido da pele por lavagem, ou que permanece nas camadas da pele)
permite uma avaliao complementar dos resultados, nomeadamente por determinao da distribuio total da
substncia ensaiada e da taxa de recuperao.
Os resultados obtidos com substncias de referncia pertinentes devem encontrar-se disponveis e estar em
conformidade com a bibliografia relativa ao mtodo utilizado, a fim de demonstrar a eficincia e fiabilidade do
sistema de ensaio no laboratrio executante. Para o preenchimento desta condio pode ser efectuado
concomitantemente o ensaio de uma substncia de referncia adequada (de preferncia, com uma lipofilia
prxima da da substncia em ensaio) e da substncia a ensaiar, ou ser fornecidos dados anteriores adequados
para vrias substncias de referncia de lipofilias diferentes (por exemplo, cafena, cido benzico e
testosterona).
1.4.1. Clula de difuso
Uma clula de difuso constituda por uma cmara dadora e uma cmara receptora, estando a pele colocada
entre as duas cmaras (na figura 1 apresenta-se um exemplo de esquema tpico deste dispositivo). A clula deve
garantir uma boa vedao em torno da pele e permitir uma amostragem fcil e uma mistura eficaz da soluo
receptora em contacto com a face interna da pele, e um bom controlo da temperatura da clula e do seu
contedo. Podem ser utilizadas clulas de difuso estticas ou de fluxo. Normalmente, o compartimento dador
deixado descoberto durante a exposio a uma dose finita da preparao a ensaiar. Contudo, para aplicaes
infinitas e em certos casos de aplicaes finitas, as cmaras dadoras podem ser fechadas.
1.4.2. Fluido receptor
prefervel a utilizao de um fluido receptor fisiologicamente compatvel, embora possam tambm utilizar-se
outros, desde que a sua utilizao seja fundamentada. Deve ser dada a composio exacta do fluido receptor.
Deve ser demonstrada a solubilidade adequada da substncia a ensaiar no fluido receptor, de forma a que este
no constitua um obstculo absoro. Alm disso, o fluido receptor no deve afectar a integridade da
preparao de pele. Num sistema de fluxo, o dbito no deve dificultar a difuso da substncia a ensaiar no
fluido receptor. Num sistema de clula esttica, o fluido deve ser agitado continuamente, devendo colher-se
amostras a intervalos regulares. Caso esteja a ser estudado o metabolismo, o fluido receptor deve permitir
manter a viabilidade da pele durante toda a experincia.
1.4.3. Preparaes de pele
Pode ser utilizada pele de origem humana ou animal. Reconhece-se que a utilizao de pele humana est sujeita
a consideraes e condies ticas nacionais e internacionais. Embora seja prefervel pele vivel, pode ser
tambm utilizada pele no vivel, desde que a sua integridade possa ser demonstrada. Podem utilizar-se
membranas epidrmicas (separadas por mtodos enzimticos, trmicos ou qumicos) ou pele de clivagem
(geralmente com 200-400 m de espessura) preparada com um dermtomo. Pode ser utilizada pele total, mas
deve evitar-se uma espessura excessiva (superior a cerca de 1 mm), excepto quando seja especificamente exigida
para a determinao da substncia a ensaiar nas camadas da pele. A escolha da espcie, do local anatmico e da
tcnica de preparao deve ser justificada. Exigem-se dados aceitveis de um mnimo de quatro repeties por
preparao ensaiada.
1.4.4. Integridade da preparao de pele
essencial que a pele seja convenientemente preparada. Um manuseio incorrecto pode danificar o estrato
crneo, sendo necessrio, por conseguinte, verificar a integridade da pele depois de preparada. Caso esteja em
estudo o metabolismo cutneo, a pele recm-excisada deve ser utilizada o mais depressa possvel, em condies
que permitam comprovadamente manter a actividade metablica. A ttulo de orientao, a pele recm-excisada
deve em geral ser utilizada no prazo de 24 horas, embora o perodo de armazenagem aceitvel varie em funo
do sistema enzimtico que intervm na metabolizao e das temperaturas de armazenagem (13). Caso as
preparaes de pele tenham estado armazenadas antes de serem utilizadas, devero apresentar-se provas de que
a funo de barreira se mantm.
1.4.5. Substncia a ensaiar
A substncia a ensaiar a entidade de que se pretendem estudar as propriedades de penetrao. De preferncia,
a substncia a ensaiar deve ser marcada com um radioistopo.
1.4.6. Preparao a ensaiar
A preparao com a substncia a ensaiar (por exemplo, material puro, diludo ou formulado contendo a
substncia a ensaiar e que se aplica na pele) deve ser aquela a que podero estar expostos o homem ou outras
espcies potencialmente visadas, ou um substituinte realista da mesma. Qualquer mudana relativamente
preparao tal como utilizada deve ser justificada.
1.4.7. Concentraes e formulaes das substncias a ensaiar
Utilizam-se normalmente vrias concentraes da substncia a ensaiar, de forma a cobrir os valores mais
elevados de exposio humana potencial. Da mesma maneira, deve ser considerado o ensaio de vrias
formulaes tpicas.
1.4.8. Aplicao na pele
Em condies normais, o homem exposto a doses finitas de substncias qumicas. Deve utilizar-se, por
conseguinte, uma aplicao que simule as condies de exposio do homem, ou seja, normalmente, de 1-5
mg/cm
2
de pele para os slidos e de at 10 l/cm
2
para os lquidos. A quantidade deve ser justificada com base
nas condies de utilizao previstas, nos objectivos do estudo ou nas caractersticas da preparao a ensaiar.
Por exemplo, com a aplicao de grandes volumes por unidade de superfcie as aplicaes superfcie da pele
podem ser infinitas.
1.4.9. Temperatura
A temperatura afecta a difuso passiva das substncias qumicas e tambm, por conseguinte, a sua absoro
pela pele. A cmara de difuso e a pele devem ser mantidas a temperatura constante, prxima da temperatura
normal da pele, de 32 +/-1
o
C. A temperatura do banho-maria ou da manta de aquecimento que necessria
para manter o fluido receptor e a pele temperatura fisiolgica depender da concepo da clula. A humidade
deve, de preferncia, ser mantida entre 30 % e 70 %.
1.4.10. Durao da exposio e da amostragem
A exposio da pele preparao a ensaiar pode manter-se durante todo o ensaio ou limitar-se a perodos mais
curtos (para simular um tipo especfico de exposio do homem). A lavagem da pele para remover o excesso de
preparao a ensaiar deve ser feita com um agente de limpeza adequado, recolhendo-se o lquido de lavagem
para anlise. A forma de retirar a preparao a ensaiar depender das condies de utilizao previstas, e deve
ser justificada. O perodo de amostragem exigido normalmente de 24 h, perodo que permite caracterizar
convenientemente o perfil de absoro. Uma vez que a integridade da pele pode comear a deteriorar-se uma
vez excedidas 24 horas, a colheita de amostras no deve normalmente prolongar-se para alm deste prazo. Para
substncias de rpida penetrao cutnea, esse perodo pode no ser necessrio, mas para substncias de
penetrao lenta podem ser necessrios perodos mais longos. A frequncia de amostragem do fluido receptor
deve permitir a representao grfica do perfil de absoro da substncia a ensaiar.
1.4.11. Procedimentos finais
Todos os componentes do sistema de ensaio devem ser analisados, devendo determinar-se a taxa de
recuperao. Os componentes incluem a cmara dadora, o lquido de lavagem superficial da pele, a preparao
de pele, o fluido receptor e a respectiva cmara. Nalguns casos, a pele pode ser fraccionada em pele com a
superfcie exposta e pele sob a flange da clula, e em estrato crneo, epiderme e derme, analisando-se cada
fraco separadamente.
1.4.12. Anlise
Em todos os estudos, deve obter-se uma taxa de recuperao adequada (a mdia a obter ser de 100 +/- 10 % da
radioactividade, devendo os eventuais desvios ser justificados). A quantidade de substncia a ensaiar presente
no fluido receptor, na preparao de pele, no lquido de lavagem superficial da pele e no lquido de lavagem do
aparelho deve ser determinada por mtodo adequado.
2. RESULTADOS
Deve apresentar-se a anlise do fluido receptor, a distribuio da substncia qumica ensaiada no sistema de
ensaio e a evoluo da absoro ao longo do tempo. Caso sejam utilizadas condies de exposio a uma dose
finita, deve ser calculada a quantidade removida da pele por lavagem, a quantidade associada pele (e s suas
diferentes camadas, caso sejam analisadas) e a quantidade presente no fluido receptor (taxa, e quantidade ou
percentagem da dose aplicada). A absoro cutnea pode por vezes ser expressa utilizando apenas os dados do
fluido receptor. Contudo, caso a substncia ensaiada permanea na pele no final do ensaio, pode ser necessrio
inclu-la na quantidade total absorvida [ver ponto 66 da referncia (3)]. Quando se utilizem condies de
exposio a uma dose infinita os dados podem permitir o clculo de uma constante de permeabilidade (Kp).
Nestas ltimas condies, a percentagem absorvida irrelevante.
3. RELATRIOS
O relatrio do ensaio deve incluir os requisitos especificados no protocolo, nomeadamente a justificao da
escolha do sistema de ensaio utilizado, devendo conter os seguintes elementos:
Substncia a ensaiar:
natureza fsica, propriedades fsico-qumicas (pelo menos, peso molecular e log P
oa
), pureza (pureza
radioqumica),
dados relativos identificao (por exemplo, nmero do lote),
solubilidade no fluido receptor.
Preparao a ensaiar:
formulao e justificao da utilizao,
homogeneidade.
Condies do ensaio:
origem e local de provenincia da pele, mtodo de preparao, condies de armazenagem antes da
utilizao, eventuais pr-tratamentos (limpeza, tratamentos antibiticos, etc.), medies da integridade
da pele, estado metablico, justificao da utilizao,
concepo da clula, composio do fluido receptor, dbito do fluido receptor ou intervalos e processos
de amostragem,
informaes pormenorizadas quanto aplicao da preparao a ensaiar e quantificao da dose
aplicada,
durao da exposio,
informaes sobre a remoo da preparao a ensaiar da pele, por exemplo, por lavagem,
informaes sobre a anlise da pele e as tcnicas de clivagem eventualmente utilizadas na demonstrao
da distribuio cutnea,
processos de lavagem da clula e do equipamento,
mtodos de determinao analtica, tcnicas de extraco, limites de deteco e validao do mtodo
analtico.
Resultados:
taxas de recuperao globais do ensaio (Dose aplicada = Lquido de lavagem da pele + Pele + Fluido
receptor + Lquido de lavagem da clula),
quadro das taxas de recuperao em cada compartimento da clula,
perfil de absoro,
quadro dos valores de absoro (expressos em taxa, quantidade ou percentagem).
Concluses.
4. REFERNCIAS
(1) Mtodo de ensaio B.44. Absoro cutnea: Mtodo in vivo.
(2) OECD, (2002) Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris.
(3) OECD, (2000) Report of the Meeting of the OECD Extended Steering Committee for Percutaneous Absorption
Testing, Annex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.
(4) Kemppainen B.W. and Reifenrath W.G., (1990) Methods for skin absorption. CRC Press, Boca Raton.
(5) Bronaugh R.L. and Collier, S.W., (1991) Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Studies, in In vitro
Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals and Applications, RL Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press,
Boca Raton, p. 237-241.
(6) Bronaugh, R.L. and Maibach H.I., (1991) In vitro Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals and Applications.
CRC Press, Boca Raton.
(7) European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, (1993) Monograph No 20, Percutaneous
Absorption, ECETOC, Brussels.
(8) Diembeck, W., Beck, H., Benech-Kieffer, F., Courtellemont, P., Dupuis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W
(1999). Test Guidelines for In Vitro Assessment of Dermal Absorption and Percutaneous Penetration of
Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, p. 191-205.
(9) Recommended Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61,
No 65.
(10) Howes, D., Guy, R., Hadgraft, J., Heylings, J.R. et al. (1996). Methods for assessing Percutaneous absorption.
ECVAM Workshop Report ATLA 24, 81 R10.
(11) Schaefer, H. and Redelmeier, T.E., (1996). Skin barrier: principles of percutaneous absorption. Karger, Basel.
(12) Roberts, M.S. and Walters, K.A., (1998). Dermal absorption and toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.
(13) Jewell, C., Heylings, J.R., Clowes, H.M. and Williams, F.M. (2000). Percutaneous absorption and metabolism of
dinitrochlorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74, p. 356-365.
Figura 1
Exemplo de esquema tpico de uma clula de difuso esttica para estudos de absoro
percutnea in vitro
PARTE C: MTODOS PARA A DETERMINAO DA ECOTOXICIDADE
NDICE
C.1. TOXICIDADE AGUDA PARA OS PEIXES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 446
C.2. ENSAIO DE IMOBILIZAO AGUDA DA DAPHNIA SP. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 456
C.3. TESTE DE INIBIO PARA ALGAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 464
C.4. DETERMINAO DA BIODEGRADABILIDADE FCIL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 473
PARTE I. CONSIDERAES GERAIS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 473
PARTE II. ENSAIO DA REDUO GRADUAL DO COD (mtodo C.4-A) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 480
PARTE III. TESTE DE DESPISTE DA OCDE MODIFICADO (mtodo C.4-B) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 484
PARTE IV. ENSAIO DA LIBERTAO DE CO
2
(mtodo C.4-C) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 488
PARTE V. ENSAIO DE RESPIROMETRIA MANOMTRICA (mtodo C.4-D) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 493
PARTE VI. ENSAIO EM FRASCO FECHADO (mtodo C.4-E) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 497
PARTE VII. ENSAIO DE M.I.T.I. (mtodo C.4-F) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502
C.5 DEGRADAO CARNCIA BIOQUMICA DE OXIGNIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514
C.6. DEGRADAO CARNCIA QUMICA DE OXIGNIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 516
C.7. DEGRADAO DEGRADAO ABITICA: HIDRLISE EM FUNO DO PH . . . . . . . . . . . . . . . 518
C.8. TOXICIDADE EM RELAO S MINHOCAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 533
C.9. BIODEGRADAO ENSAIO DE ZAHN E WELLENS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 538
C.10. BIODEGRADAO ENSAIOS DE SIMULAO DE LAMAS ACTIVADAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 545
C.11. BIODEGRADAO LAMAS ACTIVADAS: ENSAIOS DE INIBIO DA RESPIRAO . . . . . . . . 559
C.12. BIODEGRADAO ENSAIO L.A.S.C. MODIFICADO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 564
C.13. BIOCONCENTRAO: ENSAIO DINMICO COM PEIXE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 571
C.14. ENSAIO DE CRESCIMENTO JUVENIL EM PEIXE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 590
C.15. ENSAIO DE TOXICIDADE DE CURTO PRAZO NOS PEIXES EM ESTDIO EMBRIONRIO E
RECM-NASCIDOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 603
C.16. ABELHAS DOMSTICAS ENSAIO DE TOXICIDADE ORAL AGUDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 618
C.17. ABELHAS DOMSTICAS ENSAIO DE TOXICIDADE AGUDA POR CONTACTO . . . . . . . . . . . . . . 623
C.18. ADSORO/DESSORO POR RECURSO A UM MTODO DE EQUILBRIO POR LOTES DE
SOLO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 627
C.19. ESTIMATIVA DO VALOR DO COEFICIENTE DE ADSORO (K
OC
) EM SOLOS E EM LAMAS DE
DEPURAO POR CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (HPLC) . . . . . . . . . . . . . . . . . 666
C.20. ENSAIO SOBRE A REPRODUO DA DAPHNIA MAGNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 674
C.21. MICROORGANISMOS NO SOLO: ENSAIO DE TRANSFORMAO DE AZOTO . . . . . . . . . . . . . . . . 693
C.22. MICROORGANISMOS NO SOLO: ENSAIO DE TRANSFORMAO DE CARBONO . . . . . . . . . . . . . 701
C.23. TRANSFORMAES AERBIAS E ANAERBIAS NO SOLO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 709
C.24. TRANSFORMAES AERBIAS E ANAERBIAS EM SISTEMAS DE SEDIMENTOS AQUTICOS 724
C.1. TOXICIDADE AGUDA PARA OS PEIXES
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O objectivo deste ensaio consiste em determinar a toxicidade letal aguda de uma substncia para os peixes de
gua-doce. Tanto quanto possvel desejvel possuir informaes sobre a solubilidade na gua, a presso de
vapor, a estabilidade qumica, as constantes de dissociao e a biodegradabilidade da substncia para auxiliar a
seleccionar o mtodo de ensaio mais apropriado (esttico, semiesttico ou por escoamento) para garantir
concentraes constantes satisfatrias da substncia de ensaio durante o perodo desse ensaio.
Ao fazer-se o planeamento do ensaio e a interpretao dos resultados devem tomar-se em considerao as
informaes adicionais disponveis (por exemplo, frmula estrutural, grau de pureza, natureza e percentagem
das impurezas significativas, presena e quantidades de aditivos, coeficiente de partio n-octanol/gua).
A toxicidade aguda o efeito adverso perceptvel induzido num organismo ao fim de um curto perodo de
tempo (alguns dias) de exposio a uma substncia. Neste ensaio, exprime-se a toxicidade aguda pelo valor da
concentrao letal cinquenta (CL
50
), isto , a concentrao em gua que mata 50 % dos peixes que constituem o
grupo submetido a ensaio decorrido um perodo contnuo de exposio o qual deve ser especificado.
Todas as concentraes da substncia de ensaio so dadas em peso por volume (miligramas por litro). As
concentraes tambm podem ser expressas em peso por peso (mg/kg
-1
).
Pode fazer-se o ensaio com uma substncia de referncia para se demonstrar que, sob as condies de ensaio
laboratoriais, a resposta das espcies testadas no se modificou significativamente.
Para este ensaio no esto especificadas quaisquer substncias de referncia.
Pode efectuar-se um teste-limite para a concentrao de 100 mg por litro no sentido de se demonstrar que o
valor CL
50
superior a esta concentrao.
Os peixes so expostos substncia de ensaio misturada com gua, num determinado intervalo de
concentraes, durante um perodo de 96 horas. Procede-se ao registo do nmero de mortes em intervalos de
24 horas pelo menos e calcula-se, sempre que possvel, as concentraes que matam 50 % dos peixes (CL
50
) em
cada momento de observao.
Os critrios de qualidade devero ser aplicados ao teste-limite e tambm no mtodo do teste global.
A mortalidade nos controlos no deve exceder o valor de 10 % (ou um peixe no caso de se utilizar menos de
dez peixes) no termo do ensaio.
A concentrao do oxignio dissolvido deve ser superior a 60 % do valor da saturao com ar.
A concentrao da substncia de ensaio dever ser mantida a cerca de 80 % do valor da concentrao inicial, ao
longo do perodo de durao do ensaio.
Para as substncias que se dissolvem facilmente no meio de ensaio, dando origem a solues estveis, isto ,
para as substncias que no so significativamente volatilizveis, degradveis, hidrolisveis ou adsorvidas, pode
considerar-se a concentrao inicial como equivalente ao valor da concentrao nominal. Dever-se-
demonstrar que as concentraes foram mantidas durante todo o ensaio e que os critrios de qualidade foram
satisfeitos.
Para as substncias que so:
i) fracamente solveis no meio de ensaio, ou
ii) susceptveis de formar emulses ou disperses estveis, ou
iii) instveis em solues aquosas,
pode considerar-se a concentrao inicial como sendo a concentrao medida na soluo (ou, no caso de ser
tecnicamente impossvel, medida na coluna de gua) no incio do ensaio. A concentrao dever ser
determinada aps um perodo de equilbrio, mas antes da introduo dos peixes de ensaio.
Em quaisquer desses casos necessrio efectuar outras medies durante o ensaio, para se confirmar que as
concentraes da exposio e os critrios de qualidade foram respeitados.
O valor do pH no dever variar mais de uma unidade.
possvel utilizar trs tipos de procedimentos:
Ensaio esttico:
Trata-se de um ensaio de toxicidade em que no ocorre qualquer fluxo da soluo de ensaio. (As solues
permanecem inalteradas durante o perodo do ensaio.)
Ensaio semiesttico:
Trata-se de um ensaio sem fluxo da soluo de ensaio, mas com renovao regular das solues de ensaio aps
perodos prolongados (por exemplo, 24 horas).
Ensaio por escoamento:
Trata-se de um ensaio de toxicidade em que a gua renovada constantemente nas cmaras de ensaio, sendo a
substncia qumica de ensaio transportada com a gua utilizada para renovar o meio de ensaio.
1.6.1. Reagentes
1.6.1.1. Solues das substncias de ensaio
As solues de reserva com a concentrao pretendida so preparadas dissolvendo a substncia em gua
desionizada ou simplesmente em gua, de acordo com o ponto 1.6.1.2.
As concentraes escolhidas para o ensaio so preparadas por diluio da soluo de reserva. Se se realiza um
ensaio com concentraes elevadas, a substncia pode ser diluda directamente na gua de diluio.
Normalmente as substncias apenas devero ser testadas at ao limite de solubilidade. Para algumas substncias
(por exemplo, substncias que possuem fraca solubilidade em gua, ou com um valor P
ow
elevado, ou para
aquelas que formam disperses estveis em vez de uma verdadeira soluo em gua), aceitvel efectuar a
experincia com uma concentrao superior ao limite de solubilidade da substncia para garantir a obteno da
mxima concentrao solvel/estvel. Todavia importante que essa concentrao no perturbe, por qualquer
forma, o sistema de ensaio (por exemplo, formao de uma pelcula da substncia sobre a superfcie da gua
evitando a sua oxigenao, etc.).
possvel recorrer disperso ultra-snica, a solventes orgnicos, a emulsionantes ou a dispersantes para
auxiliar a preparao das solues de reserva de substncias com fraca solubilidade na gua ou para auxiliar a
disperso dessas substncias no meio de ensaio. Quando se utilizam essas substncias auxiliares todas as
concentraes de ensaio devero conter a mesma quantidade de substncia auxiliar e dever-se- expor os peixes
de ensaio de controlo adicional a uma concentrao da substncia auxiliar idntica utilizada nas sries de
ensaio. A concentrao dessas substncias auxiliares dever ser mnima e em caso algum deve exceder 100 mg
por litro de meio de ensaio.
O ensaio deve ser efectuado sem ajustamento do valor de pH. Se houver sinais evidentes de uma alterao ntida
dos valores de pH, aconselhvel repetir o ensaio com ajustamento desses valores e efectuar-se o registo dos
resultados. Nesse caso ajustar-se- o valor do pH da soluo de reserva para o valor de pH da gua de diluio,
salvo se houver razes especficas para no se proceder desse modo. Para satisfazer este objectivo prefervel
utilizar HC1 e NaOH. Este ajustamento do valor do pH dever ser efectuado de tal modo que a concentrao da
substncia de ensaio na soluo de reserva no varie significativamente. No caso de ocorrer qualquer reaco
qumica ou precipitao do composto de ensaio, provocada por esse ajustamento, deve descrever-se tal facto.
1.6.1.2. gua de confinao e de diluio
Utiliza-se uma fonte de gua potvel (no contaminada por concentraes potencialmente nocivas de cloro, de
metais pesados ou de outras substncias), gua natural de boa qualidade ou gua reconstituda (ver apndice 1).
prefervel utilizar guas com uma dureza total compreendida entre 10 e 250 mg de CaCO
3
por litro e com
um valor de pH compreendido entre 6,0 e 8,5.
1.6.2. Aparelho
Todos os aparelhos devem ser feitos com materiais quimicamente inertes.
sistema de diluio automtico (para o ensaio por escoamento),
medidor de oxignio,
equipamento para a determinao da dureza da gua,
aparelho adequado para o controlo de temperatura,
medidor de pH.
1.6.3. Peixes de experincia
Os peixes devem estar em boas condies de sade e no devem ser portadores de qualquer defeito fsico
aparente.
As espcies utilizadas devero ser seleccionadas tomando como base critrios prticos tais como a sua fcil
disponibilidade ao longo do ano, a facilidade da sua manuteno, a convenincia de os submeter a ensaio, a sua
sensibilidade relativa s substncias qumicas, e quaisquer factores econmicos, biolgicos ou ecolgicos
significativos. Quando se faz a seleco das espcies de peixes deve ter-se presente a necessidade de efectuar um
estudo comparando os resultados obtidos com os resultados existentes relativos harmonizao internacional
(referncia 1).
No apndice 2 encontra-se uma listagem das espcies de peixes recomendadas para a realizao deste ensaio; as
espcies preferenciais so o peixe-zebra e a truta-arco-ris.
1.6.3.1. Confinao
Preferencialmente os peixes devero ser provenientes de uma reserva nica em que todos possuem a mesma
idade e comprimento. Os peixes devem ser confinados durante pelo menos 12 dias nas condies seguintes:
Carga:
apropriada ao sistema (recirculao ou escoamento) e s espcies de peixes;
gua:
ver ponto 1.6.1.2;
Luz:
fotoperodo dirio de 12 a 16 horas;
Concentrao do oxignio dissolvido:
pelo menos 80 % do valor da saturao com ar;
Alimentao:
trs vezes por semana ou diariamente, cessando 24 horas antes do incio do ensaio.
1.6.3.2. Mortalidade
Aps um perodo de ajustamento de 48 horas procede-se ao registo das mortalidades aplicando os critrios
seguintes:
superior a 10 % da populao, em sete dias:
rejeio de todo o lote,
entre 5 % e 10 % da populao:
prolonga-se o perodo de confinao durante mais sete dias.
Se no houver mais mortalidades, o lote aceitvel; caso contrrio deve ser rejeitado,
menos do que 5 % da populao:
aceita-se o lote.
1.6.4. Adaptao
Os peixes devem ser mantidos, nas condies do ensaio relativas qualidade da gua e temperatura, durante
pelo menos sete dias antes do incio deste.
Antes do ensaio definitivo pode efectuar-se um ensaio preliminar no sentido de se obter informao sobre as
concentraes que devem ser utilizadas no ensaio principal.
Para alm das sries de ensaio efectua-se uma experincia de controlo sem a substncia de ensaio, e, se for
relevante, efectua-se tambm uma experincia de controlo contendo a substncia auxiliar.
Consoante as propriedades fsicas e qumicas do composto de ensaio, assim ser seleccionado um ensaio
esttico, semiesttico ou por escoamento, para satisfazer os critrios de qualidade.
Os peixes so expostos substncia de ensaio conforme a seguir descrito:
durao: 96 horas,
nmero de animais: pelo menos sete para cada concentrao,
tanques: com capacidade adequada em relao carga recomendada,
carga: recomenda-se uma carga mxima de 1,0 g por litro para os ensaios esttico e semiesttico; para os
sistemas de escoamento aceitvel uma carga superior,
concentrao de ensaio: utilizar-se-o pelo menos cinco concentraes afastadas entre si por um factor
constante inferior a 2,2, e abrangendo tanto quanto possvel o intervalo de mortalidade compreendido
entre 0 e 100 %,
gua: ver ponto 1.6.1.2,
luz: fotoperodo dirio de 12 a 16 horas,
temperatura: apropriada s espcies (apndice 2) no variando de 1
o
C para cada ensaio particular,
concentrao do oxignio dissolvido: no inferior a 60 % do valor da saturao com ar, para o valor de
temperatura seleccionado,
alimentao: nenhuma.
Os peixes so inspeccionados decorridas as duas a quatro horas iniciais e pelo menos em intervalos de 24
horas. Considera-se que os peixes esto mortos se o toque no pednculo caudal no produzir qualquer reaco
e se no houver movimentos respiratrios visveis. Regista-se o nmero de peixes mortos e faz-se a sua
remoo. Regista-se tambm as anomalias visveis (por exemplo, perda de equilbrio, alteraes do
comportamento natatrio, funo respiratria, pigmentao, etc.).
Diariamente proceder-se- medio dos valores de pH, do oxignio dissolvido e da temperatura.
Teste-limite
Utilizando o procedimento descrito neste mtodo de ensaio possvel efectuar um teste-limite para a
concentrao de 100 mg por litro no sentido de se demonstrar que o valor CL
50
Se a natureza da substncia for tal que no seja possvel obter uma concentrao de 100 mg por litro, o teste-
-limite dever ser efectuado para um valor de concentrao igual solubilidade da substncia (ou igual
concentrao mxima que forma uma disperso estvel) no meio utilizado (ver tambm o ponto 1.6.1.1).
O teste-limite dever ser efectuado utilizando sete a dez peixes, utilizando-se o mesmo nmero nos controlos.
(A teoria do binmio estabelece que no caso de se utilizar dez peixes com mortalidade 0, existe um intervalo de
confiana de 99,9 % em que o valor CL
50
superior concentrao utilizada no teste-limite. Com sete, oito ou
nove peixes, a ausncia de mortalidade proporciona um intervalo de confiana de pelo menos 99 % em que o
valor CL
50
superior concentrao utilizada.)
Se houver mortalidade deve efectuar-se um estudo completo. No caso de serem observados efeitos subletais,
estes devero ser registados.
2. RESULTADOS E AVALIAO
Para cada perodo de observaes registadas (24, 48, 72 e 96 horas), traa-se a curva da percentagem de
mortalidade para cada perodo de exposio recomendada em funo da concentrao utilizando papel
logartmico/probabilidade.
Sempre que possvel e para cada momento de observao deve estimar-se o valor CI.
50
e os limites de confiana
(p = 0,05), utilizando procedimentos normalizados; esses valores devero ser aproximados para um ou, no
mximo, dois algarismos significativos (exemplos de arredondamento para dois algarismos: de 173,5 para 174;
de 0,127 para 0,13; de 1,21 para 1,2).
Nos casos em que o declive da curva de resposta concentrao/percentagem muito acentuado para permitir o
clculo do valor CL
50
, considera-se suficiente uma estimativa grfica deste valor.
No caso de duas concentraes consecutivas, sendo a razo entre elas 2,2, proporcionarem apenas
mortalidades de 0 e 100 %, considera-se que esses dois valores so suficientes para indicar o intervalo de
localizao do valor CL
5O
.
No caso de se verificar que a estabilidade ou a homogeneidade da substncia de ensaio no pode ser mantida,
dever-se- descrever esse facto e necessrio tomar precaues na interpretao dos resultados.
3. RELATRIO
informao sobre o peixe de ensaio (designao cientfica, estirpe, fornecedor, qualquer tratamento
prvio, dimenses e nmero utilizado para cada concentrao de ensaio),
fonte da gua de diluio e caractersticas qumicas principais (pH, dureza, temperatura),
no caso de uma substncia de fraca solubilidade aquosa, indicar-se- o mtodo de preparao das
solues de reserva e de ensaio,
concentrao de quaisquer substncias auxiliares,
enumerao das concentraes utilizadas e qualquer informao disponvel sobre a estabilidade para
essas concentraes da substncia qumica de ensaio, na soluo de ensaio,
no caso de se efectuarem anlises qumicas, indicar os mtodos utilizados e os resultados,
resultados do teste-limite, se existirem,
razes para a escolha e pormenores sobre o procedimento de ensaio utilizado (por exemplo, mtodo
esttico, semiesttico, razo entre doses, dbito do escoamento, arejamento, nmero de peixes, etc.),
descrio do equipamento de ensaio,
regime de exposio luz,
concentraes do oxignio dissolvido, valor de pH e temperaturas das solues de ensaio em cada 24
horas,
provas demonstrativas de que os critrios de qualidade foram cumpridos,
um quadro apresentando a mortalidade cumulativa para cada concentrao e para o controlo (e, se
necessrio, para o controlo com a substncia auxiliar) em cada um dos momentos de observao
recomendados,
grfico da curva de resposta concentrao/percentagem no fim do ensaio,
sempre que possvel, os valores CL
50
em cada um dos momentos de observao recomendados (com
limites de confiana de 95 %),
procedimentos estatsticos para a determinao dos valores CL
50
,
no caso de se utilizar uma substncia de referncia, os resultados obtidos,
valor da mais elevada concentrao de ensaio que no provoca mortalidade durante o perodo do ensaio,
valor da mais fraca concentrao que provoca 100 % de mortalidade durante o perodo do ensaio.
4. REFERNCIAS
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.
(2) AFNOR Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio Static and Flow
Through methods NFT 90-303 June 1985.
(3) AFNOR Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri Static and Flow
Through methods NFT 90-305 June 1985.
(4) ISO 7346/1,/2 and/3 Water Quality Determination of the acute lethal toxicity of substances to a
fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part
2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.
(5) Eidgenssisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien fur Probenahme und Normung von
Wasseruntersuchungsmethoden Part II 1974.
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15).
(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.
(8) NEN 6506 Water Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.
(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and
amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research
Series EPA-660-75-009, 1975.
(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research
and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.
(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.
(12) Standard methods for the examination of water and wastewater, 14th edition, APHA-AWWA-WPCF,
1975.
(13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the
ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R.
kocoxikologie, Grundlagen fr die kotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem
Chemikaliengesetz, ecomed 1986.
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharm,
Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.
(16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.
(17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res.,
1969, vol. 3, 793-821.
(18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water
Res. 1970, vol. 4, 3-32.
(19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC
50
. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by
F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.
(20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R.W. A computer program for calculating an
LC
50
. US EPA.
Apndice 1
gua reconstituda
Exemplo de uma gua adequada para diluio
Todas as substncias qumicas devem ser de qualidade analtica.
A gua deve ser destilada e de boa qualidade, ou desionizada com uma condutividade inferior a 5 Scm
-1
.
O aparelho para a destilao da gua no deve conter quaisquer partes feitas de cobre.
Solues de reserva
CaCl
2
. 2H
2
O (cloreto de clcio dihidratado):
Dissolve-se em gua e ajusta-se o volume at 1 litro utilizando gua.
11,76 g
MgSO
4
. 7H
2
O (sulfato de magnsio heptahidratado):
4,93 g
NaHCO
3
(hidrogenocarbonato de sdio):
2,59 g
KCl (cloreto de potssio):
0,23 g
gua de diluio reconstituda
Mistura-se 25 ml de cada uma das quatro solues de reserva e ajusta-se o volume at 1 litro utilizando gua.
Faz-se o arejamento at que a concentrao do oxignio dissolvido seja igual ao valor da saturao com ar.
O pH deve ser 7,8 0,2.
Se necessrio ajusta-se o valor do pH com NaOH (hidrxido de sdio) ou com HCl (cido clordrico).
A gua para diluio assim preparada colocada parte durante 12 horas e no deve ser mais arejada.
A soma dos ies Ca e Mg nesta soluo de 2,5 mmol por litro. A razo entre os ies Ca:Mg de 4:1 e entre os ies Na:K
de 10:1. A alcalinidade total desta soluo de 0,8 mmol por litro.
Qualquer desvio na preparao da gua de diluio no deve modificar a composio ou as propriedades da gua.
Apndice 2
Espcies de peixes recomendadas para ensaio
Espcies recomendadas
Intervalo recomendado para as
temperaturas de ensaio (
o
C)
Comprimento total recomen-
dado para os animais do ensaio
(cm)
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) (Hamil-ton-Buchanan)
Peixinho-zebra
20 a 24 3,0 0,5
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafi-nesque) Pei-
xinho-cabea-gorda
20 a 24 5,0 2,0
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus 1758) Carpa 20 a 24 6,0 2,0
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliiae) Cyprinodonti-dae (Tom-
minck et Schlegel 1850) Peixe-arroz-do-Ja-po
20 a 24 3,0 1,0
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters 1859) Gupi 20 a 24 3,0 1,0
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchdae) (Rafinesque
Linnaeus 1758) Perca-azul
20 a 24 5,0 2,0
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum 1988)
Truta-arco-ris
12 a 17 6,0 2,0
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus 1758) Escalo-
-prateado
20 a 24 6,0 2,0
Obteno dos peixes
Os peixes acima enumerados so fceis de criar e amplamente disponveis ao longo do ano. fcil cri-los e mant-los em
instalaes pisccolas ou em laboratrios, sob condies de controlo de doenas e de parasitas, de tal modo que os animais
sejam saudveis e de origem conhecida. Estes peixes existem em muitas partes do mundo.
Apndice 3
Exemplo de concentrao: mortalidade percentual
Exemplo da determinao do valor CL
50
utilizando papel log-probit
C.2. ENSAIO DE IMOBILIZAO AGUDA DA DAPHNIA SP.
1. MTODO
O presente mtodo de ensaio de imobilizao aguda equivalente ao descrito na publicao OECD TG 202
(2004).
1.1. INTRODUO
O presente mtodo descreve um ensaio de toxicidade aguda para avaliao dos efeitos das substncias qumicas
nos dafndeos. Na medida do possvel, foram utilizados mtodos de ensaio j existentes (1) (2) (3).
1.2. DEFINIES
NO MBITO DO PRESENTE MTODO, UTILIZAM-SE AS SEGUINTES DEFINIES:
CE
50
: estimativa da concentrao necessria para imobilizar 50 % dos dafndeos num dado perodo de
exposio. Caso seja utilizada outra definio, a definio utilizada e a respectiva referncia devem ser
especificadas.
Imobilizao: Os animais incapazes de nadar decorridos 15 segundos, aps agitao suave do recipiente de
ensaio, so considerados imobilizados.
Dafndeos jovens, com menos de 24 horas no incio do ensaio, so expostos por um perodo de 48 horas a
diferentes concentraes da substncia a ensaiar. Decorridas 24 horas e 48 horas, respectivamente, a
imobilizao registada e comparada com valores-testemunha. Os resultados so depois analisados para
clculo da CE
50
s 48h (para as definies, ver ponto 1.2). A determinao da CE
50
s 24h facultativa.
1.4. INFORMAO SOBRE A SUBSTNCIA A ENSAIAR
A solubilidade em gua e a presso de vapor da substncia a ensaiar devero ser conhecidas, devendo existir um
mtodo analtico fivel para a quantificao da substncia nas solues de ensaio, relativamente ao qual estejam
descritos a eficincia de recuperao e o limite de determinao. A frmula estrutural, o grau de pureza, a
estabilidade em gua ou a estabilidade luz, o P
ow
e os resultados de um ensaio de biodegradabilidade fcil da
substncia a ensaiar constituem informaes teis (ver mtodo C.4).
Nota: Na referncia (4) so dadas orientaes para o ensaio de substncias cujas propriedades fsico-qumicas
dificultam o respectivo ensaio.
Pode fazer-se a determinao da CE
50
duma substncia de referncia, para garantia da fiabilidade das condies
de ensaio. Recomendam-se, para este efeito, os txicos utilizados em ensaios interlaboratoriais (1) (5) (
1
).
Recomenda-se repetir o ensaio das substncias de referncia mensalmente ou, no mnimo, duas vezes por ano.
Um ensaio considerado vlido quando satisfaz os seguintes critrios:
nos tratamentos-testemunha, incluindo o que contm o agente solubilizante, a proporo de dafndeos
imobilizados no excede 10 %,
a concentrao de oxignio dissolvido no final do ensaio > 3 mg/l, tanto nos recipientes das
testemunhas como nos dos tratamentos.
(
1
) De acordo com estes ensaios interlaboratoriais, bem como com a rectificao tcnica norma ISO 6341, a CE
50
24 h do dicromato de
potssio (K
2
Cr
2
O
7
) est compreendida entre 0,6 mg/l e 1,7 mg/l.
Nota: Em relao ao primeiro critrio, a proporo de dafndeos-testemunha imobilizados ou com outros sinais
de doena ou distrbios por exemplo, alteraes da cor ou comportamentos anmalos, tais como reteno
superfcie da gua no deve exceder 10 %.
1.7.1. Equipamento
Os recipientes de ensaio, e restante equipamento que entre em contacto com as solues de ensaio, devem ser
exclusivamente de vidro ou outro material quimicamente inerte. Para o ensaio utilizar-se-o normalmente
tubos de ensaio ou copos, que devem ser limpos antes de cada utilizao seguindo procedimentos normais de
laboratrio. Os recipientes de ensaio devem ser tapados mas no vedados, de forma a reduzir a perda de gua
por evaporao e evitar que entre poeira nas solues. O ensaio de substncias volteis deve ser feito em
recipientes completamente cheios e fechados, suficientemente grandes para que o teor de oxignio no se torne
limitante ou demasiado baixo (ver ponto 1.6 e primeiro pargrafo do ponto 1.8.3).
Utilizar-se- ainda o seguinte equipamento, na totalidade ou em parte: medidor de oxignio (com
microelctrodo ou outro equipamento adequado para a medio do oxignio dissolvido em amostras de
volume reduzido); medidor de pH; aparelho adequado para o controlo da temperatura; equipamento para a
determinao da concentrao de carbono orgnico total (COT); equipamento para a determinao da carncia
qumica de oxignio (CQO); equipamento para a determinao da dureza, etc.
1.7.2. Organismos experimentais
A espcie preferida a Daphnia magna Straus, embora possam tambm utilizar-se outras espcies adequadas de
Daphnia (por exemplo, Daphnia pulex). No incio do ensaio, os animais devem ter menos de 24 horas de vida; a
fim de reduzir a variabilidade, recomenda-se vivamente que no provenham da primeira postura do progenitor.
Devem provir de uma populao saudvel [isto , no evidenciar sinais de distrbios, tais como elevada
mortalidade, presena de machos e ovos de resistncia (ephippia), atraso na primeira postura, animais com
alteraes na cor, etc.]. Todos os organismos utilizados num determinado ensaio devem provir de culturas da
mesma populao de dafndeos. Os animais dessa populao devem ser mantidos em condies de cultura (luz,
temperatura, meio) semelhantes s que iro ser utilizadas no ensaio. Se o meio de cultura a utilizar no ensaio
for diferente do normalmente utilizado para a cultura de dafndeos, aconselhvel prever um perodo de
aclimatao antes do ensaio. Para o efeito, os dafndeos devem ser mantidos em gua de diluio temperatura
do ensaio pelo menos durante as 48 horas anteriores ao incio do ensaio.
1.7.3. guas de cultura e de diluio
Para a cultura e a diluio pode utilizar-se gua natural (superficial ou subterrnea), gua reconstituda ou gua
da torneira desclorada, desde que os dafndeos sobrevivam durante todo o perodo de cultura, de aclimatao e
de ensaio sem evidenciar sinais de distrbios. Qualquer gua conforme s caractersticas qumicas de uma gua
de diluio aceitvel, enunciadas no apndice 1, adequada para o ensaio. A qualidade de gua deve ser
mantida constante durante o decorrer do ensaio. A gua reconstituda pode ser preparada juntando a gua
desionizada ou destilada quantidades determinadas de reagentes de qualidade analtica reconhecida. Nos
documentos indicados nas referncias (1) e (6) e no apndice 2 so dados exemplos de gua reconstituda.
Saliente-se que os meios contendo quelantes conhecidos, tais como os meios M4 e M7 do apndice 2, devem
ser evitados no ensaio de substncias que contenham metais. O pH deve estar compreendido no intervalo de 6
a 9. Recomenda-se uma dureza compreendida entre 140 e 250 mg/l (expressa em CaCO
3
), para a Daphnia
magna, ao passo que para outras espcies de Daphnia podem ser tambm adequadas durezas menores. A gua
de diluio pode ser arejada antes da utilizao no ensaio, de forma a que a concentrao de oxignio dissolvido
atinja a saturao.
Se for utilizada gua natural, os parmetros de qualidade devem ser medidos pelo menos duas vezes por ano,
ou sempre que haja suspeita de que as caractersticas indicadas (ver pargrafos anteriores e apndice 1)
possam ter variado de modo significativo. Deve tambm determinar-se o teor de metais pesados (Cu, Pb, Zn,
Hg, Cd, Ni, etc.). Se for utilizada gua da torneira desclorada, aconselhvel determinar diariamente o teor de
cloro. Se a gua de diluio provier de um manancial subterrneo ou superficial, devem ser determinados a
condutividade e o carbono orgnico total (COT) ou a carncia qumica de oxignio (CQO).
1.7.4. Solues de ensaio
De um modo geral, as solues de ensaio com as concentraes escolhidas so preparadas por diluio de uma
soluo-padro. As solues-padro devem ser preparadas, de preferncia, por dissoluo da substncia a
ensaiar na gua de diluio. Deve evitar-se, tanto quanto possvel, a utilizao de solventes, emulsionantes ou
dispersantes. No entanto, tais compostos podem ser necessrios, em alguns casos, para produzir uma soluo-
-padro com a concentrao adequada. O documento indicado na referncia (4) contm orientaes quanto aos
solventes, emulsionantes e dispersantes mais adequados. Em qualquer dos casos, o teor de substncia ensaiada
presente nas solues de ensaio nunca deve exceder o limite de solubilidade na gua de diluio.
O ensaio deve ser efectuado sem ajustamento do pH. Se o pH no se mantiver no intervalo de 6 a 9 ser
efectuado outro ensaio, ajustando o pH da soluo-padro ao da gua de diluio antes da adio da substncia
a ensaiar. O ajustamento do pH deve ser efectuado de modo a no provocar alterao significativa da
concentrao da soluo-padro, nem causar qualquer reaco qumica ou precipitao da substncia ensaiada.
Devem utilizar-se, de preferncia, HCl e NaOH.
1.8. PROCEDIMENTO
1.8.1. Condies de exposio
1.8.1.1. Grupos tratados e grupos-testemunha
Encher os recipientes de ensaio com volumes adequados de gua de diluio e de solues da substncia a
ensaiar. A relao ar/gua, em volume, deve ser a mesma nos recipientes dos grupos tratados e dos grupos-
-testemunha. Colocar, em seguida, os dafndeos nos recipientes de ensaio. Para cada concentrao ensaiada e
para os grupos-testemunha devem ser utilizados pelo menos 20 animais, de preferncia divididos em quatro
grupos de cinco animais. Deve haver um volume de pelo menos 2 ml de soluo de ensaio por animal (ou seja,
um volume de 10 ml para cinco dafndeos por recipiente). O ensaio pode ser realizado utilizando o sistema de
renovao semiesttico ou, quando a concentrao da substncia ensaiada no for estvel, o sistema de
escoamento.
A par da srie de tratamentos, deve ser realizada uma srie-testemunha com gua de diluio e, se aplicvel,
uma srie-testemunha com o agente de solubilizao.
1.8.1.2. Concentraes ensaiadas
Pode ser realizado um ensaio prvio para determinao da gama de concentraes a utilizar no ensaio
propriamente dito, excepto nos casos em que existam informaes quanto toxicidade da substncia a ensaiar.
Para o efeito, os dafndeos devem ser expostos a concentraes da substncia a ensaiar bastante espaadas entre
si. Devem ser expostos a cada concentrao ensaiada cinco dafndeos, durante 48 horas ou menos, no sendo
necessrias repeties. O perodo de exposio pode ser encurtado (por exemplo, 24 horas ou menos) se for
possvel obter em menos tempo as informaes necessrias determinao da gama de concentraes a
utilizar.
Devem ser ensaiadas pelo menos cinco concentraes, numa progresso geomtrica cuja razo no deve, de
preferncia, ser superior a 2,2. Deve fornecer-se uma justificao quando se utilizem menos de cinco
concentraes. De preferncia, a concentrao mxima deveria resultar em 100 % de imobilizao e a
concentrao mnima no ter efeitos observveis.
1.8.1.3. Condies de incubao
A temperatura deve estar compreendida no intervalo de 18
o
C a 22
o
C, no devendo a variao em cada ensaio
exceder 1
o
C. Recomenda-se um ciclo de 16 horas de luz e 8 horas de escurido. Pode tambm optar-se pela
escurido completa, sobretudo se a substncia ensaiada for instvel luz.
Os recipientes no devem ser arejados durante o ensaio. O ensaio efectuado sem ajustamento do pH. Os
dafndeos no devem ser alimentados durante o ensaio.
1.8.1.4. Durao
A durao do ensaio de 48 horas.
1.8.2. Observaes
24 horas e 48 horas aps o incio do ensaio, os recipientes devem ser observados para contagem dos dafndeos
imobilizados (ver definies no ponto 1.2). Alm da imobilizao, deve ser registado tambm qualquer
comportamento ou aspecto anmalo.
1.8.3. Determinaes analticas
O oxignio dissolvido e o pH so determinados no incio e no fim do ensaio, nas testemunhas e no tratamento
com maior concentrao de substncia ensaiada. A concentrao de oxignio dissolvido nos recipientes dos
grupos-testemunha deve estar em conformidade com o critrio de validade (ver ponto 1.6). A variao do pH
em cada ensaio no deve, normalmente, exceder 1,5 unidades. A temperatura normalmente medida nos
recipientes-testemunha ou no ar ambiente, devendo, de preferncia, ser registada continuamente durante o
ensaio ou, no mnimo, no incio e no fim do mesmo.
A concentrao de substncia ensaiada deve ser medida, no mnimo, nos tratamentos com maior e menor
concentrao, no incio e no fim do ensaio (4). Recomenda-se que os resultados se baseiem em concentraes
medidas. No entanto, caso seja possvel demonstrar que a concentrao da substncia a ensaiar na soluo se
manteve, durante o ensaio, no intervalo de 20 % do valor nominal ou do valor da concentrao inicial
medida, os resultados podero basear-se em valores nominais ou nos valores iniciais medidos.
1.9. ENSAIO-LIMITE
Pode ser efectuado, utilizando os procedimentos descritos no presente mtodo, um ensaio-limite com uma
concentrao de 100 mg/l da substncia a ensaiar, ou at ao respectivo limite de solubilidade no meio de
ensaio, se este for inferior, a fim de demonstrar que a CE
50
superior quela concentrao. O ensaio-limite deve
ser efectuado com 20 dafndeos (de preferncia, divididos em quatro grupos de cinco), utilizando-se o mesmo
nmero nos grupos-testemunha. Se houver alguma ocorrncia de imobilizao, dever realizar-se um estudo
completo. Qualquer comportamento anmalo deve ser registado.
2. DADOS
Os dados devem ser resumidos num quadro, indicando, para cada grupo de tratamento e cada grupo-
-testemunha, o nmero de dafndeos usados e a imobilizao em cada momento de observao. As
percentagens de imobilizados registadas s 24 horas e s 48 horas so depois representadas num grfico, em
funo das concentraes ensaiadas. Os dados so em seguida analisados por mtodos estatsticos adequados
(por exemplo, anlise probit, etc.) para clculo dos coeficientes angulares e da CE
50
, com um intervalo de
confiana de 95 % (p = 0,05) (7) (8).
Quando no sejam aplicveis aos dados obtidos os mtodos usuais de clculo da CE
50
, a maior concentrao
que no provoque imobilizao e a menor concentrao que provoque 100 % de imobilizao devem ser
usadas como valores aproximados para o clculo da CE
50
, que ser considerada como sendo a mdia
geomtrica daquelas duas concentraes.
3. RELATRIOS
O relatrio do ensaio deve incluir o seguinte:
Substncia ensaiada:
natureza fsica e propriedades fsico-qumicas relevantes,
dados relativos identificao qumica, incluindo a pureza.
Espcie experimental:
espcie de Daphnia utilizada e sua origem, fornecedor original (se for conhecido) e condies de cultura
utilizadas (incluindo a origem, tipo e quantidade de alimentos e a frequncia com que so fornecidos).
Condies experimentais:
descrio dos recipientes de ensaio: tipo de recipiente, volume de soluo, nmero de dafndeos por
recipiente, nmero de recipientes (repeties) por concentrao,
mtodos de preparao das solues-padro e das solues de ensaio, incluindo a utilizao de solventes
ou dispersantes, concentraes utilizadas,
informaes respeitantes gua de diluio: origem e parmetros de qualidade (pH, dureza, razo Ca/Mg,
razo Na/K, alcalinidade, condutividade, etc.); composio da gua reconstituda, caso tenha sido
utilizada,
condies de incubao: temperatura, intensidade e periodicidade da iluminao, oxignio dissolvido, pH,
etc.
Resultados:
nmero e percentagem de dafndeos imobilizados ou nos quais foram detectados efeitos nocivos
(incluindo anomalias de comportamento) nos grupos-testemunha e em cada um dos grupos tratados, em
cada uma das observaes efectuadas, bem como uma descrio da natureza dos efeitos observados,
resultados e data do ensaio da substncia de referncia, caso existam,
concentraes nominais ensaiadas e resultado de todas as anlises efectuadas para determinao da
concentrao da substncia ensaiada nos recipientes de ensaio; devem tambm ser indicados a eficincia
de recuperao do mtodo e o limite de determinao,
todas as medies fsico-qumicas da temperatura, do pH e do oxignio dissolvido efectuadas durante o
ensaio,
o valor da CE
50
de imobilizao s 48 h, com intervalos de confiana e grficos do modelo ajustado
utilizados no respectivo clculo, os coeficientes angulares das linhas dose/resposta e respectivo desvio-
-padro, os mtodos estatsticos utilizados na determinao da CE
50
(os mesmos dados devem tambm ser
indicados para a imobilizao s 24 h, se tiverem sido medidos),
explicao dos eventuais desvios relativamente ao Mtodo de ensaio, e da medida em que afectaram os
resultados do ensaio.
4. REFERNCIAS
(1) ISO 6341. (1996). Water quality Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna
Straus (Cladocera, Crustacea) Acute toxicity test. Third edition, 1996.
(2) EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guidelines Aquatic Invertebrate Acute Toxicity
Test, Freshwater Daphnids.
(3) Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute Lethality Test Using Daphnia spp. EPS 1/RM/
/11. Environment Canada, Ottawa, Ontario, Canada.
(4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD
Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris, 2000.
(5) Commission of the European Communities. Study D8369. (1979). Inter-laboratory Test Programme
concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to Daphnia.
(6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211: Daphnia magna Reproduction Test,
adopted September 1998.
(7) Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC
50
. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation
(edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 American Society for Testing and Materials.
Pp 65-84
(8) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3
rd
ed. London. Griffin, Weycombe, UK.
Apndice 1
ALGUMAS CARACTERSTICAS QUMICAS DE UMA GUA DE DILUIO ACEITVEL
Substncia Concentrao
Partculas em suspenso < 20 mg/l
Carbono orgnico total < 2 mg/l
Amonaco (no ionizado) < 1 g/l
Cloro residual < 10 g/l
Total de pesticidas organofosforados < 50 ng/l
Total de pesticidas organoclorados + bifenilos policlorados < 50 ng/l
Cloro orgnico total < 25 ng/l
Apndice 2
EXEMPLOS DE GUA RECONSTITUDA ADEQUADA PARA O ENSAIO
gua de ensaio ISO (1)
Solues-padro (uma s substncia)
Para preparar a gua reconstituda, juntar a 1 litro de
gua os seguintes volumes de solues-padro (*)
Substncia
Quantidade adicionada a 1 litro de
gua (*)
Cloreto de clcio
CaCl
2
2H
2
O
11,76 g 25 ml
Sulfato de magnsio
MgSO
4
7H
2
O
4,93 g 25 ml
Bicarbonato de sdio
NaHCO
3
2,59 g 25 ml
Cloreto de potssio
KCl
0,23 g 25 ml
(*) gua de pureza adequada, por exemplo, desionizada, destilada ou tratada por osmose inversa, de preferncia com condutividade no
superior a 10 S.cm
-1
.
Meios Elendt M7 e M4
Aclimatao aos meios Elendt M4 e M7
Alguns laboratrios tiveram dificuldades na transferncia directa de Daphnia para os meios M4 e M7. No entanto, obteve-se
algum sucesso com uma aclimatao gradual, isto , transferindo do meio prprio para meio Elendt a 30 %, a 60 % e, por
fim, a 100 %. Os perodos de aclimatao necessrios podem atingir um ms.
Preparao
Oligoelementos
Preparar separadamente solues-padro (I) de cada oligoelemento em gua de pureza adequada, por exemplo, desionizada,
destilada ou tratada por osmose inversa. Com estas solues-padro (I), preparar uma segunda soluo-padro nica (II)
contendo todos os oligoelementos (soluo combinada), ou seja:
Soluo(es)-padro I (uma s
substncia)
Quantidade adicionada
gua (mg/l)
Concentrao (em
relao ao meio M4)
Para preparar a soluo-padro combinada II, juntar
a seguinte quantidade de soluopadro I gua (ml/
/l)
M4 M7
H
3
BO
3
57 190 20 000 vezes 1,0 0,25
MnCl
2
4H
2
O 7 210 20 000 vezes 1,0 0,25
LiCl 6 120 20 000 vezes 1,0 0,25
RbCl 1 420 20 000 vezes 1,0 0,25
SrCl
2
6H
2
O 3 040 20 000 vezes 1,0 0,25
NaBr 320 20 000 vezes 1,0 0,25
Na
2
MoO
4
2H
2
O 1 230 20 000 vezes 1,0 0,25
CuCl
2
2H
2
O 335 20 000 vezes 1,0 0,25
ZnCl
2
260 20 000 vezes 1,0 1,0
CoCl
2
6H
2
O 200 20 000 vezes 1,0 1,0
Soluo(es)-padro I (uma s
substncia)
gua (mg/l)
Concentrao (em
relao ao meio M4)
Para preparar a soluo-padro combinada II, juntar
a seguinte quantidade de soluopadro I gua (ml/
/l)
M4 M7
KI 65 20 000 vezes 1,0 1,0
Na
2
SeO
3
43,8 20 000 vezes 1,0 1,0
NH
4
VO
3
11,5 20 000 vezes 1,0 1,0
Na
2
EDTA 2H
2
O 5 000 2 000 vezes
FeSO
4
7H
2
O 1 991 2 000 vezes
As solues Na
2
EDTA e FeSO
4
so preparadas separadamente, depois vertidas no mesmo recipiente e imediatamente
esterilizadas em autoclave,
obtendo-se assim:
21 de soluo Fe-EDTA 1 000 vezes 20,0 5,0
Meios M4 e M7
Os meios M4 e M7 so preparados a partir da soluo-padro II, dos macronutrientes e das vitaminas, do seguinte modo:
gua (mg/l)
Concentrao (em
relao ao meio M4)
Quantidade de soluo II adicionada para prepara-
o do meio (ml/l)
M4 M7
Soluo-padro II (combi-
nao de oligoelementos)
20 vezes 50 50
Solues-padro de
macronutrientes (uma s
substncia)
CaCl
2
2H
2
0 293 800 1 000 vezes 1,0 1,0
MgSO
4
7H
2
O 246 600 2 000 vezes 0,5 0,5
KCl 58 000 10 000 vezes 0,1 0,1
NaHCO
3
64 800 1 000 vezes 1,0 1,0
Na
2
SiO
3
9H
2
O 50 000 5 000 vezes 0,2 0,2
NaNO
3
2 740 10 000 vezes 0,1 0,1
KH
2
PO
4
1 430 10 000 vezes 0,1 0,1
K
2
HPO
4
1 840 10 000 vezes 0,1 0,1
Soluo-padro de vitami-
nas
10 000 vezes 0,1 0,1
A soluo-padro de vitaminas prepara-se juntando as trs vitaminas a 1 litro de gua conforme indicado a seguir:
Cloridrato de tiamina 750 10 000 vezes
Cianocobalamina (B
12
) 10 10 000 vezes
Biotina 7,5 10 000 vezes
A soluo-padro de vitaminas armazenada e congelada em pequenas alquotas. As vitaminas so adicionadas ao meio
imediatamente antes da utilizao.
N.B.: Para evitar a precipitao dos sais quando se prepara o meio completo, adicionar as alquotas de solues de reserva
a cerca de 500-800 ml de gua desionizada e perfazer at 1 l.
N.B: A primeira publicao relativa ao meio M4 tem a seguinte referncia: Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in
crustacea; an ultrastructual approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
C.3. TESTE DE INIBIO PARA ALGAS
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O objectivo do presente ensaio consiste em determinar os efeitos de uma dada substncia sobre o crescimento
de espcies de algas verdes unicelulares. Ensaios relativamente curtos (72 horas) permitem avaliar efeitos ao
longo de vrias geraes. O presente mtodo pode ser adaptado a diferentes espcies de algas unicelulares e,
neste caso, deve ser fornecida uma descrio do mtodo utilizado com o relatrio do ensaio.
O presente mtodo aplica-se mais facilmente a substncias solveis em gua que, nas condies do ensaio, so
susceptveis de permanecer na gua.
Pode tambm ser utilizado para substncias que no interfiram directamente com a medio do crescimento
das algas.
desejvel possuir, tanto quanto possvel, informaes sobre a solubilidade em gua, a presso de vapor, a
estabilidade qumica, as constantes de dissociao e a biodegradabilidade da substncia antes de se iniciar o
ensaio.
Ao fazer-se o planeamento do ensaio e a interpretao dos resultados deve levar-se em considerao todas as
informaes adicionais (por exemplo, frmula estrutural, grau de pureza, natureza e percentagem de impurezas
significativas, presena e quantidade de aditivos e coeficiente de partio n-octanol/gua).
Densidade celular: nmero de clulas por mililitro;
Crescimento: o aumento da densidade celular ao longo do perodo de ensaio;
Taxa de crescimento: o aumento da densidade celular por unidade de tempo;
CE
50
: de acordo com este mtodo a concentrao da substncia de ensaio que provoca uma reduo de 50 %
quer no crescimento (C
b
E
50
) quer na taxa de crescimento (C
r
E
50
) em relao ao controlo;
CSEO (concentrao sem efeito observvel): de acordo com este mtodo a mais elevada concentrao de
ensaio com a qual no se observou uma inibio significativa do crescimento relativamente ao controlo.
Todas as concentraes da substncia de ensaio so dadas em peso por volume (miligramas por litro). Essas
concentraes tambm podem ser expressas em peso por peso (mg/kg
-1
).
Pode fazer-se o ensaio com uma substncia de referncia para se demonstrar que, sob as condies de ensaio
laboratoriais, a sensibilidade da espcie de ensaio no se alterou significativamente.
No caso de se utilizar uma substncia de referncia, os resultados observados devero constar do relatrio do
ensaio. Pode utilizar-se dicromato de potssio como substncia de referncia, mas a sua cor pode afectar a
qualidade e a intensidade da luz que atinge as clulas e tambm as determinaes espectrofotomtricas, se for
caso disso. O dicromato de potssio tem sido utilizado em ensaios internacionais interlaboratoriais (ver
referncia 3 e apndice 2).
Pode efectuar-se um teste-limite com a concentrao de 100 mg por litro no sentido de se demonstrar que o
valor CE
50
superior a essa concentrao.
Expem-se culturas de algas verdes seleccionadas, em fase de crescimento exponencial, em condies definidas,
a diferentes concentraes da substncia de ensaio, durante diversas geraes.
Faz-se a incubao das solues de ensaio durante um perodo de 72 horas, durante o qual se mede a densidade
celular em cada soluo, pelo menos em cada 24 horas. Determina-se a inibio do crescimento em relao a
uma cultura de controlo.
Os critrios de qualidade devero ser aplicados ao teste-limite e tambm no mtodo do teste global.
A densidade celular nas culturas de controlo dever aumentar pelo menos 16 vezes no perodo de trs dias.
A concentrao da substncia de ensaio dever ser mantida a mais de 80 % do valor da concentrao inicial, ao
longo do perodo de durao do ensaio.
Para as substncias que se dissolvem facilmente no meio de ensaio formando solues estveis, isto , para as
substncias que no so significativamente volatilizveis, degradveis, hidrolisveis ou adsorvidas, pode
considerar-se a concentrao inicial como equivalente ao valor da concentrao nominal. Dever-se-
demonstrar que as concentraes foram mantidas durante todo o ensaio e que os critrios de qualidade foram
satisfeitos.
Para as substncias que so:
i) fracamente solveis no meio de ensaio, ou
ii) susceptveis de formar emulses ou disperses estveis, ou
iii) instveis em solues aquosas,
dever considerar-se como concentrao inicial o valor da concentrao medida no incio do ensaio. A
concentrao deve ser determinada aps um perodo de equilbrio.
Em quaisquer desses casos necessrio efectuar outras medies durante o ensaio, para se confirmar que as
concentraes da exposio e os critrios de qualidade foram respeitados.
Sabe-se que quantidades significativas da substncia de ensaio podem ser incorporadas na biomassa das algas
durante o perodo do ensaio. Em consequncia, com o objectivo de se demonstrar compatibilidade com os
anteriores critrios de qualidade, dever-se- tomar em considerao tanto a substncia incorporada na biomassa
das algas como a substncia em soluo (ou, se no for tecnicamente possvel, medida na coluna de gua).
Todavia, uma vez que a determinao da concentrao da substncia na biomassa das algas pode colocar
problemas tcnicos significativos, pode demonstrar-se a compatibilidade com os critrios de qualidade fazendo
uma experincia num vaso de ensaio com o valor mais elevado de concentrao da substncia mas sem algas e
medindo as concentraes na soluo (ou, se no for tecnicamente possvel, na coluna de gua) no incio e no
termo do perodo de ensaio.
1.6. DESCRIO DO PROCEDIMENTO DE ENSAIO
1.6.1. Reagentes
1.6.1.1. Solues das substncias de ensaio
As solues de reserva com a concentrao pretendida so preparadas dissolvendo a substncia em gua
desionizada ou simplesmente em gua, de acordo com o ponto 1.6.1.2.
As concentraes de ensaio escolhidas so preparadas adicionando quantidades alquotas adequadas s pr-
-culturas de algas (ver apndice 1).
Normalmente as substncias apenas devero ser testadas at ao limite de solubilidade. Para algumas substncias
(por exemplo, substncias que possuem fraca solubilidade em gua, ou um valor P
oa
elevado, ou para aquelas
que formam disperses estveis em vez de uma verdadeira soluo em gua), aceitvel efectuar a experincia
com uma concentrao superior ao limite de solubilidade da substncia para garantir a obteno da mxima
concentrao solvel/estvel. Todavia importante que essa concentrao no perturbe, por qualquer forma, o
sistema de ensaio (por exemplo, formao de uma pelcula da substncia sobre a superfcie da gua evitando a
sua oxigenao, etc.).
possvel recorrer disperso ultra-snica, aos solventes orgnicos, aos emulsionantes ou dispersantes para
auxiliar a preparao de solues de reserva das substncias com fraca solubilidade na gua ou para auxiliar a
fazer a disperso dessas substncias no meio de ensaio. Quando se utilizam essas substncias auxiliares todas as
concentraes de ensaio devero conter a mesma quantidade de substncia auxiliar e dever-se- expor os
controlos adicionais a uma concentrao da substncia auxiliar idntica utilizada nas sries de ensaio. A
concentrao dessas substncias auxiliares dever ser mnima e em caso algum deve exceder 100 mg por litro
de meio de ensaio.
O ensaio deve ser efectuado sem ajustamento do valor de pH. Se houver sinais evidentes de uma alterao ntida
dos valores de pH, aconselhvel repetir o ensaio com ajustamento desses valores e efectuar-se- o registo dos
resultados. Nesse caso ajustar-se- o valor do pH da soluo de reserva para o valor de pH da gua de diluio,
salvo se houver razes especficas para no se proceder desse modo. Para satisfazer este objectivo prefervel
utilizar HC1 e NaOH. Este ajustamento do valor do pH dever ser efectuado de tal modo que a concentrao da
substncia de ensaio na soluo de reserva no varie significativamente. No caso de ocorrer qualquer reaco
qumica ou precipitao do composto de ensaio, provocada por esse ajustamento, deve descrever-se tal facto.
1.6.1.2. Meio de ensaio
A gua deve ser destilada e de boa qualidade, ou desionizada com uma condutividade inferior a 5 Scm
-1
. O
aparelho para a destilao da gua no deve conter quaisquer partes feitas de cobre.
Recomenda-se a utilizao do meio a seguir descrito.
Faz-se a preparao de quatro solues de reserva de acordo com o quadro que se apresenta a seguir. As
solues de reserva so esterilizadas por filtrao atravs de membrana ou por tratamento em autoclave e
devem ser armazenadas no escuro temperatura de 4
o
C. A soluo de reserva n.
o
4 deve ser esterilizada apenas
por filtrao atravs de membrana. Estas solues de reserva so diludas para se obter nas solues de ensaio
as concentraes finais de nutrientes.
Nutrientes Concentrao na soluo de reserva Concentrao final na soluo de ensaio
Soluo de reserva n.
o
1: macro-
nutrientes
NH
4
C1 1,5 g/l 15 mg/l
MgCl
2
.6H
2
O 1,2 g/l 12 mg/l
CaCl
2
.2H
2
O 1,8 g/l 18 mg/l
MgSO
4
.7H
2
O 1,5 g/l 15 mg/l
KH
2
PO
4
0,16 g/l 1,6 mg/l
Soluo de reserva n.
o
2:
FeCl
3
.6H
2
O 80 mg/l 0,08 mg/l
Na
2
EDTA.2H
2
O 100 mg/l 0,1 mg/l
Soluo de reserva n.
o
3: micro-
nutrientes
H
3
BO
3
185mg/l 0,185 mg/l
MnCl
2
.4H
2
O 415 mg/l 0,415 mg/l
ZnCl
2
3 mg/l 3 x 10
-3
mg/l
CoCl
2
.6H
2
O 1,5 mg/l 1,5 x 10
-3
mg/l
CuCl
2
.2H
2
O 0,01 mg/l 10
-5
mg/l
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 7 mg/l 7 x 10
-3
mg/l
Soluo de reserva n.
o
4: NaHCO
3
NaHCO
3
50 g/l 50 mg/l
O valor do pH do meio, aps o equilbrio com o ar, aproximadamente 8.
1.6.2. Aparelho
equipamento normal de laboratrio,
frascos de ensaio com um volume adequado (por exemplo, os frascos cnicos de 250 ml so adequados
quando o volume da soluo de ensaio de 100 ml). Todos os frascos de ensaio devem ser idnticos no
que diz respeito ao material e s dimenses,
aparelho para desenvolver as culturas: um compartimento ou cmara em que seja possvel manter a
temperatura no intervalo entre 21
o
C e 25
o
C 2
o
C com iluminao uniforme contnua na banda dos 400
a 700 nm. Se as algas das culturas de controlo tiverem atingido as taxas de crescimento recomendadas,
pode considerar-se que as condies para o crescimento, incluindo a intensidade luminosa, so
adequadas.
Recomenda-se a utilizao, ao nvel mdio das solues de ensaio, de uma intensidade luminosa no
intervalo entre 60 e 120 E.m
-2
.s
-1
(35 a 70 x 10
18
fotes.m
-2
.
-1
), fazendo-se a medio na banda entre
400 e 700 nm, utilizando um receptor apropriado. Para os instrumentos de medio da luz calibrados
em Lux, considera-se aceitvel o intervalo equivalente entre 6 000 e 10 000 Lx.
A intensidade luminosa pode ser obtida utilizando quatro a sete lmpadas fluorescentes de 30 W
geradoras de luz branca universal (a temperatura de cor aproximadamente 4 000 K), a uma distncia de
0,35 m da cultura de algas,
As medies de densidade celular devem ser efectuadas recorrendo a um mtodo de contagem directa das
clulas vivas, por exemplo, um microscpio com cmaras de contagem. Contudo possvel utilizar
outros procedimentos (fotometria, turbidimetria, ...) se forem suficientemente sensveis e no caso de se
demonstrar que esto suficientemente bem correlacionados com a densidade celular.
1.6.3. Organismos de ensaio
Sugere-se que a espcie de algas verdes utilizadas seja uma espcie de crescimento rpido conveniente para ser
desenvolvida em cultura e para ensaio. D-se preferncia s espcies seguintes:
Selenastrum capricornutum, v.g. ATCC 22662 ou CCAP 278/4,
Scenedesmus subspicatus, v.g. 86.81 SAG.
Nota:
ATCC = American Type Culture Collection (U.S.A.)
CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (U.K.)
SAG = Collection of algal culture (Gttingen, F.R.G.)
No caso de se utilizar outras espcies, deve indicar-se a estirpe.
O intervalo de concentraes no qual provvel a ocorrncia de efeitos, determina-se com base em ensaios
preliminares para a determinao das concentraes.
As duas medies de crescimento (biomassa e taxa de crescimento) podem originar valores altamente
discrepantes da inibio do crescimento; devero ser utilizadas ambas no ensaio preliminar para a
determinao de concentraes para se garantir que a progresso geomtrica das concentraes permitir
estimar os dois valores C
b
E
50
e C
r
E
50
.
Densidade celular inicial
Recomenda-se que a densidade celular inicial nas culturas de ensaio seja aproximadamente de 10
4
clulas/ml
para Selenastrum capricornutum e Scenedesmus subspicatus. No caso de se utilizar outras espcies a biomassa deve
ser equivalente.
Concentraes da substncia de ensaio
Para o ensaio faz-se a preparao de pelo menos cinco concentraes numa srie geomtrica cuja razo entre
concentraes no exceda 2,2. O menor valor da concentrao ensaiada no dever provocar efeitos
observveis sobre o desenvolvimento das algas. A concentrao mais elevada ensaiada dever inibir o
crescimento em pelo menos 50 % relativamente ao controlo e, preferencialmente dever interromper
totalmente o crescimento.
Repeties e controlos
O ensaio deve incluir trs repeties de cada concentrao ensaiada. Faz-se a experincia com trs controlos
sem substncia de ensaio e, se for relevante, faz-se a experincia tambm com trs controlos contendo a
substncia auxiliar. Se se justificar, o ensaio pode ser alterado no sentido de aumentar o nmero de
concentraes e reduzir o nmero de repeties por concentrao.
Execuo do ensaio
Para se prepararem as culturas de ensaio contendo as concentraes desejadas da substncia de ensaio e a
quantidade desejada de inculo de algas, adiciona-se quantidades alquotas das solues de reserva da
substncia de ensaio a quantidades adequadas de pr-culturas de algas (ver apndice 1).
Os frascos de ensaio da cultura so agitados e colocados no aparelho destinado cultura. As clulas das algas
so mantidas em suspenso agitando, mexendo ou fazendo borbulhar ar, no sentido de melhorar as trocas
gasosas e reduzir a variao do pH das solues de ensaio. As culturas devero ser mantidas a uma temperatura
compreendida entre 21
o
C e 25
o
C, controlada a 2
o
C.
Determina-se a densidade celular em cada frasco de ensaio decorridas pelo menos 24, 48 e 72 horas aps o
incio do ensaio. Utiliza-se o meio de algas filtrado contendo uma concentrao apropriada da substncia
qumica de ensaio, para se determinar a concentrao espontnea quando se recorre a medies da densidade
celular diferentes dos mtodos de contagem directa.
Mede-se o valor do pH no incio do ensaio e decorridas 72 horas.
O valor do pH dos controlos no dever variar normalmente mais do que 1,5 unidades durante o ensaio.
Ensaio de substncias volteis
At ao presente no existe qualquer mtodo geralmente aceite para ensaiar substncias volteis. Quando se sabe
que uma substncia tem tendncia para se vaporizar pode recorrer-se utilizao de frascos de ensaio fechados
com maior espao vazio. Deve tomar-se em considerao a possibilidade de haver falta de CO
2
quando se
calcula o espao vazio dos bales de ensaio fechados. Foram j propostas variaes deste mtodo (ver refern-
cia 4).
Deve-se procurar determinar a quantidade de substncia que permanece nas solues e aconselha-se extrema
precauo na interpretao dos resultados dos ensaios com produtos qumicos volteis quando se utilizam
sistemas fechados.
Teste-limite
Utilizando o procedimento descrito neste mtodo de ensaio possvel efectuar um teste-limite para a
concentrao de 100 mg por litro no sentido de se demonstrar se o valor CE
50
Se a natureza da substncia for tal que no seja possvel obter uma concentrao de 100 mg por litro, o teste-
-limite dever ser efectuado para um valor de concentrao igual solubilidade da substncia (ou igual
concentrao mxima que forma uma disperso estvel) no meio utilizado (ver tambm o ponto 1.6.1.1).
O teste-limite deve ser efectuado pelo menos em triplicado, com o mesmo nmero de controlos. No teste-
-limite devem ser utilizadas as duas medies do crescimento (biomassa e taxa de crescimento).
Se num teste-limite se verificar uma diminuio mdia igual ou superior a 25 %, tanto para a biomassa como
para a taxa de crescimento, entre este teste-limite e o controlo, necessrio efectuar um ensaio completo.
A densidade celular medida nas culturas do ensaio e de controlo apresentada em quadros conjuntamente com
as concentraes da substncia de ensaio e os tempos de medio. O valor mdio da densidade celular para
cada uma das concentraes da substncia de ensaio e para os controlos representado graficamente em
funo do tempo (0-72 horas) obtendo-se deste modo curvas de crescimento.
Para se determinar a relao concentrao/efeito devem ser utilizados os dois mtodos adiante descritos.
Algumas substncias podem estimular o crescimento, com baixos valores de concentrao. Apenas devero ser
considerados os dados que indicam uma inibio entre 0 e 100 %.
2.1. COMPARAO DAS REAS SOB AS CURVAS DE CRESCIMENTO
A rea existente entre as curvas de crescimento e a linha horizontal N = N
0
pode ser calculada de acordo com a
frmula seguinte:
A=
N
1
N
0
2
t
1

N
1
N
2
2N
0
2
t
2
t
1

N
n 1
N
n
2N
0
2
t
n
t
n 1

em que
A = rea,
N
0
= nmero de clulas/mililitro contadas no instante t
0
(incio do ensaio),
N
l
l
,
N
n
n
,
t
1
= tempo da primeira medio aps o incio do ensaio,
t
n
= tempo da medio aps o incio do ensaio,
n = nmero de medies efectuadas aps o incio do ensaio.
A percentagem de inibio do crescimento celular para cada uma das concentraes da substncia de ensaio (I
A
)
calcula-se pela frmula:
I
A =
A
c
A
t
A
c
100
em que
A
c
= rea entre a curva de crescimento no grupo de controlo e a linha horizontal N = N
O
.
A
t
= rea entre a curva de crescimento para o valor da concentrao t e a linha horizontal N = N
0
.
=
Os valores I
A
so representados graficamente em papel semilogartmico ou em papel semilogartmico-probit
em funo das correspondentes concentraes. Se os pontos forem representados graficamente em papel
probit traa-se uma recta por estimativa ou atravs dos dados de regresso calculados por computador.
O valor CE
50
estimado a partir da linha de regresso por leitura da concentrao que equivalente a uma
inibio de 50 % (I
A
= 50 %). Para designar o valor obtido por este mtodo de clculo, sem ambiguidade,
prope-se a utilizao do smbolo C
b
E
50
. essencial que o smbolo C
b
E
50
fique associado com o perodo de
exposio apropriado, por exemplo, C
b
E
50
(0-72 horas).
2.2. COMPARAO DAS TAXAS DE CRESCIMENTO
A taxa de crescimento especfico mdia () para culturas em crescimento exponencial pode ser calculada do
seguinte modo:
=
ln N
n
ln N
0
t
n
t
0
em que t
0
representa o instante do incio do ensaio.
Outro mtodo para se calcular a taxa de crescimento especfico mdia, consiste em determinar o declive da
recta de regresso resultante da representao grfica de ln N em funo do tempo.
A percentagem de inibio da taxa de crescimento especfico para cada uma das concentraes da substncia de
ensaio (I
t
) calcula-se de acordo com a frmula seguinte:
I
t =
c

t
c
100
em que
c
= taxa de crescimento especfico do controlo
t
= taxa de crescimento especfico mdia para a concentrao t de ensaio
A percentagem de reduo da taxa de crescimento especfico mdia para cada uma das concentraes da
substncia de ensaio comparada com o valor do controlo representada graficamente em funo do logaritmo
da concentrao. Os valores CE
50
podem ser lidos a partir do grfico resultante. Para se designar sem
ambiguidades o valor CE
50
obtido por este mtodo, prope-se a utilizao do smbolo C
r
E
50
. Devem ser
indicados os instantes de medio, por exemplo, se aquele valor disser respeito aos momentos de observao
correspondentes a 0 e 72 horas, o smbolo ser C
r
E
50
(0-72 horas).
Nota: A taxa de crescimento especfico um valor logartmico, pelo que pequenas alteraes no valor da taxa de
crescimento podem conduzir a grandes alteraes no valor da biomassa. Por conseguinte os valores C
b
E e C
r
E
no so numericamente comparveis.
2.3. CLCULO DA CSEO
Determina-se a concentrao sem efeito observvel recorrendo a um procedimento estatstico adequado para
comparao de amostras mltiplas (por exemplo, anlise de varincia e teste de Dunnett), utilizando os valores
das repeties individuais relativos s reas sob as curvas de crescimento A (ver ponto 2.1) ou as taxas de
crescimento especfico (ver ponto 2.2).
3. RELATRIO
substncias de ensaio: dados relativos identificao qumica,
organismos utilizados no ensaio: origem, cultura de laboratrio, nmero da estirpe, mtodo de cultura,
condies do ensaio:
data do incio e do termo do ensaio e respectiva durao,
temperatura,
composio do meio,
aparelho para a cultura,
pH das solues no incio e no termo do ensaio (deve ser fornecida uma explicao se forem
observados desvios de pH superiores a 1,5 unidades),
veculo e mtodo utilizados para solubilizar a substncia de ensaio e concentrao do veculo nas
solues de ensaio,
intensidade e natureza da luz,
concentraes ensaiadas (medidas ou nominais).
Resultados:
densidade celular em cada um dos frascos de ensaio para cada um dos pontos de medio e mtodo
para a medio da densidade celular,
valores mdios da densidade celular,
curvas de crescimento,
representao grfica da relao concentrao/efeito,
valores CE e mtodo para o seu clculo,
CSEO,
outros efeitos observados.
4. REFERNCIAS
(2) U mweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag Hemmung der Zellvermehrung bei der Grunalge
Scenedesntus subspicatus, in: Rudolph/Boje: kotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
(3) ISO 8692 Water qualily Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and
Selenastrum capricornutum.
(4) S.Galassi and M.Vighi Chemosphere, 1981, vol.10, 1123-1126.
Apndice 1
Exemplo de um procedimento para a cultura de algas Observaes gerais
O objectivo de se fazer uma cultura com base no procedimento a seguir descrito consiste em proporcionar culturas de algas
para ensaios de toxicidade.
Dever-se-o utilizar mtodos adequados para garantir que as culturas de algas no so infectadas com bactrias (ISO 4833).
As culturas axnicas podem ser desejveis mas as culturas de algas de uma nica espcie so essenciais.
Todas as operaes devero ser efectuadas sob condies estreis, no sentido de se evitar a contaminao com bactrias ou
com outras algas. As culturas contaminadas devem ser rejeitadas.
Procedimentos para a obteno de culturas de algas
Preparao das solues de nutrientes (meio de cultura):
O meio de cultura pode ser preparado diluindo as solues de nutrientes concentradas de reserva. Para um meio slido
adiciona-se 0,8 % de gar. O meio utilizado deve ser estril. A esterilizao em autoclave pode originar a libertao de NH
3
.
Cultura de reserva:
As culturas de reserva so pequenas culturas de algas que so regularmente transferidas para um meio fresco a fim de
servirem de material de ensaio inicial. Se as culturas no forem regularmente utilizadas, so conservadas em tubos de gar
inclinados. So transferidas para um meio fresco pelo menos de dois em dois meses.
As culturas de reserva so cultivadas em frascos de ensaio contendo o meio adequado (com o volume aproximado de
100 ml). Quando as algas so incubadas temperatura de 20
o
C com iluminao contnua necessrio fazer uma
transferncia semanal.
Durante a transferncia, uma determinada quantidade de cultura antiga transferida por meio de pipetas esterilizadas para
um frasco de ensaio contendo o meio fresco, de modo a que a concentrao inicial, para as espcies em crescimento rpido,
seja cerca de 100 vezes inferior verificada na cultura antiga.
A taxa de crescimento de uma espcie pode ser determinada a partir da curva de crescimento. Uma vez conhecida, possvel
estimar a densidade para a qual a cultura deve ser transferida para o novo meio, o que deve ser feito antes de a cultura
alcanar a fase de morte.
Pr-cultura:
Pretende-se que a pr-cultura fornea uma adequada quantidade de algas para a inoculao das culturas de ensaio. A pr-
-cultura incubada nas condies do ensaio e utilizada quando ainda se encontra em fase exponencial de crescimento,
normalmente aps um perodo de incubao de cerca de trs dias. Quando as culturas de algas apresentam clulas
deformadas ou anormais, devem ser rejeitadas.
Apndice 2
A norma ISO 8692 qualidade da gua o ensaio de inibio do crescimento de algas em gua doce com as espcies
Scenedesmus subspicatus e Selenastrum capricornutum deu origem aos resultados que a seguir se apresentam, num ensaio
interlaboratorial desenvolvido por 16 laboratrios, testando-se o dicromato de potssio).
Mdias (mg/l) Intervalo (mg/l)
C
r
E
50
(0-72 h) 0,84 0,60 a 1,03
C
b
E
50
(0-72 h) 0,53 0,20 a 0,75
C.4. DETERMINAO DA BIODEGRADABIL1DADE FCIL
PARTE I. CONSIDERAES GERAIS
I.1. INTRODUO
Descrevem-se seis mtodos de ensaio que permitem fazer o despiste da biodegradabilidade fcil de substncias
qumicas, num meio aquoso aerbio:
a) Reduo gradual do Carbono Orgnico Dissolvido (COD) (mtodo C.4-A);
b) Mtodo de despiste da OCDE modificado reduo gradual do COD (mtodo C.4-B);
c) Libertao de dixido de carbono (CO
2
) (teste de Sturm modificado) (mtodo C.4-C);
d) Respirometria manomtrica (mtodo C.4-D);
e) Frasco fechado (mtodo C.4-E);
f) MITI (Ministrio do Comrcio Internacional e da Indstria Japo) (mtodo C.4-F).
As consideraes gerais e tambm as consideraes comuns aos seis testes figuram na parte I do mtodo. Os
aspectos especficos de cada mtodo so descritos nas partes II a VII. Os apndices contm definies, frmulas
e anotaes informativas.
Um exerccio comparativo interlaboratorial organizado pela OCDE, efectuado em 1988, demonstrou que os
mtodos permitem obter resultados consistentes. Todavia, consoante as caractersticas fsicas da substncia que
se pretende testar, assim se dar preferncia a um ou outro mtodo.
I.2. SELECO DO MTODO APROPRIADO
No sentido de se seleccionar o mtodo mais adequado, essencial dispor de informaes sobre a solubilidade, a
presso de vapor e as caractersticas de adsoro das substncias qumicas. A estrutura qumica ou a frmula
qumica devem ser conhecidas para o clculo dos valores tericos e/ou confirmao dos valores medidos dos
parmetros caractersticos, por exemplo, CTeO, CO
2
Te, COD, COT, CQO (ver apndices 1 e 2).
As substncias qumicas de ensaio que forem solveis em gua na proporo de pelo menos 100 mg/l podem
ser avaliadas por todos os mtodos, desde que no sejam volteis e no sejam adsorventes. Para as substncias
qumicas que forem pouco solveis em gua, volteis ou adsorventes, os mtodos adequados so indicados no
quadro 1. No apndice 3 descrito o modo de proceder com as substncias qumicas pouco solveis em gua e
com as substncias qumicas volteis. As substncias qumicas moderadamente volteis podem ser testadas pelo
mtodo de reduo gradual do COD, se existir espao livre suficiente para o gs nos recipientes de ensaio (os
quais devem estar adequadamente tapados). Neste caso deve ser efectuado um controlo abitico que permita
detectar eventuais perdas fsicas.
Quadro I
aplicabilidade dos mtodos de ensaio
Teste Mtodo analtico
Adequado para substncias que so:
pouco
solveis
volteis adsorvveis
Reduo gradual do COD Carbono orgnico dissol-
vido
+/-
Reduo gradual do COD/
/mtodo OCDE
Carbono orgnico dissol-
vido
+/-
Libertao de CO
2
Respirometria: libertao
de CO
2
+ +
Respirometria manomtrica Respirometria manom-
trica: consumo de oxignio
+ +/- +
Teste Mtodo analtico
Adequado para substncias que so:
pouco
solveis
volteis adsorvveis
Frasco fechado Respirometria: oxignio
dissolvido
+/- + +
MITI Respirometria: consumo
de oxignio
+ +/- +
necessrio dispor de informaes sobre a pureza ou sobre as propores relativas dos componentes
principais do material de ensaio para interpretar os resultados obtidos, especialmente quando os resultados so
baixos ou marginais.
O facto de se dispor de informaes sobre a toxicidade da substncia qumica de teste em relao s bactrias
(apndice 4) pode ser muito til para seleccionar concentraes de ensaio adequadas e pode ser essencial para a
interpretao correcta de valores baixos de biodegradao.
I.3. SUBSTNCIAS DE REFERNCIA
Para se controlar o processo testam-se substncias qumicas de referncia que satisfaam os critrios de
biodegradabilidade fcil, realizando uma experincia num frasco adequado, em paralelo com os procedimentos
normais.
As substncias qumicas adequadas so a anilina (recentemente destilada), o acetato de sdio e o benzoato de
sdio. Todas estas substncias qumicas de referncia degradam-se ao serem submetidas a estes mtodos,
mesmo quando nenhum inculo deliberadamente adicionado.
Foi sugerida a utilizao de uma substncia qumica de referncia que fosse facilmente biodegradvel, mas que
necessitasse da adio de um inculo. Foi sugerida a utilizao de hidrogenoftalato de potssio mas necessrio
obter mais provas de eficcia com esta substncia, antes que possa ser aceite como substncia de referncia.
Nos ensaios respiromtricos, os compostos que contm azoto podem afectar o consumo de oxignio devido
nitrificao (ver apndices 2 e 5).
I.4. PRINCPIO DOS MTODOS DE ENSAIO
Faz-se a inoculao de uma soluo ou suspenso da substncia de ensaio num meio mineral e, depois,
procede-se incubao sob condies aerbias, ao abrigo da luz ou sob luz difusa. A quantidade de COD na
soluo de ensaio originada pelo inculo dever ser mantida o mais baixo possvel relativamente quantidade
de COD originada pela substncia de ensaio. Tem-se em conta a actividade endgena do inculo efectuando
ensaios paralelos em branco, com inculo, mas sem a substncia de ensaio, embora a actividade endgena das
clulas na presena da substncia no seja exactamente a mesma que no controlo endgeno. Efectua-se um
ensaio em paralelo com a substncia de referncia, para verificao do processo.
Em geral, acompanha-se a degradao determinando parmetros caractersticos, tais como o COD, a produo
de CO
2
e o consumo de oxignio, efectuando-se medies com suficiente frequncia, de modo a identificar o
incio e o fim da biodegradao. Com os respirmetros automticos as medies so contnuas. O COD por
vezes medido em conjunto com outro parmetro mas normalmente isso s sucede no incio e no fim do
ensaio. Tambm se pode recorrer a anlises qumicas especficas para avaliar a degradao primria da
substncia de ensaio e para se determinar a concentrao de quaisquer substncias intermdias formadas
(obrigatrio no teste de MITI).
Normalmente, o ensaio prolonga-se por 28 dias. Todavia, os ensaios podem ser terminados antes de decorridos
28 dias, isto , logo que a curva de biodegradao tenha atingido um patamar que envolva pelo menos 3
determinaes. Os ensaios tambm podem ser prolongados para alm do perodo de 28 dias, no caso de a
curva mostrar que se iniciou a biodegradao mas que o patamar no foi atingido at ao 28.
o
dia.
I.5. CRITRIOS DE QUALIDADE
I.5.1. Reprodutibilidade
Devido natureza da biodegradao e das populaes bacterianas mistas utilizadas como inculos, as
determinaes devem ser efectuadas pelo menos em duplicado.
Sabe-se pela experincia que, quanto maior for a concentrao de microorganismos adicionados inicialmente
ao meio de ensaio, menores sero as diferenas entre repeties. Ensaios interlaboratoriais demonstram
tambm que pode haver grandes diferenas entre os resultados obtidos em laboratrios diferentes, embora se
obtenha, normalmente, uma boa concordncia quando se utilizam compostos facilmente biodegradveis.
I.5.2. Validade do ensaio
Considera-se que um ensaio vlido se a diferena entre valores extremos de repeties de desaparecimento da
substncia qumica de ensaio, no patamar, no fim do teste ou no final dos 10 dias, for inferior a 20 % e se a
percentagem de degradao da substncia de referncia atingir o nvel de biodegradabilidade fcil ao fim de 14
dias. Se qualquer uma destas condies no for satisfeita, o ensaio deve ser repetido. Devido especificidade
dos mtodos, os valores baixos no significam necessariamente que a substncia de ensaio no seja
biodegradvel nas condies ambientais, mas significa que sero necessrios novos estudos para se provar a
biodegradabilidade.
Se num ensaio de toxicidade, contendo tanto a substncia de ensaio como a substncia qumica de referncia,
ocorrer uma degradao inferior a 35 % (tomando como base o COD) ou inferior a 25 % (tomando como base
CTeO ou CO
2
Te) decorridos 14 dias, pode admitir-se que as substncias qumicas de ensaio so inibidoras (ver
tambm o apndice 4). As sequncias de ensaio devero ser repetidas, utilizando, se possvel, uma concentrao
inferior da substncia qumica de ensaio e/ou uma concentrao superior de inculo, mas no superior a 30 mg
de slidos/litro.
I.6. PREPARAES E PROCEDIMENTOS GERAIS
As condies gerais aplicveis aos ensaios so resumidas no quadro 2. O equipamento e outras condies
experimentais correspondentes especificamente a um determinado ensaio so descritas depois, sob o ttulo
desse ensaio.
Quadro 2
condies de ensaio
Ensaio
Reduo
gradual de
COD
Libertao de
CO
2
Respirome-
tria
manomtrica
Despiste da
OCDE
modificado
Frasco
fechado
M1T1 (I)
Concentrao
da substncia
de ensaio
mg/l 100 210 100
mg COD/l 1040 1020 1040
mg CTeO/l 50100 510
Concentrao
do inculo (em
clulas/l, apro-
ximadamente)
30 mg/l SS
ou 100 ml de efluente/l
(10
7
- 10
8
)
0,5 ml de
efluente
secund-
rio/l
(10
5
)
< 5 ml de
efluente/l
(10
4
- 10
6
)
30 mg/l SS
(10
7
- 10
8
)
Concentrao
de elementos
no meio mine-
ral (em mg/l):
P 116 11,6 29
N 1,3 0,13 1,3
Na 86 8,6 17,2
K 122 12,2 36,5
Mg 2,2 2,2 6,6
Ca 9,9 9,9 29,7
Fe 0,05-0,1 0,05-0,1 0,15
pH 7,4 0,2 preferencial-
mente 7,0
Ensaio
Reduo
gradual de
COD
Libertao de
CO
2
Respirome-
tria
manomtrica
Despiste da
OCDE
modificado
Frasco
fechado
M1T1 (I)
Temperatura 22 2
o
C 25 1
o
C
COD = Carbono Orgnico Dissolvido CTeO = Carncia Terica de
Oxignio
SS =
I.6.1. gua de diluio
usada gua desionizada ou destilada, livre de substncias txicas (por exemplo ies Cu
+ +
) em concentraes
inibidoras. No deve conter mais do que 10 % do teor de carbono orgnico introduzido pela substncia de
ensaio. necessria uma elevada pureza para a gua de ensaio para evitar um elevado nmero de valores em
branco. A contaminao pode resultar de impurezas inerentes e tambm de resinas de permuta inica e do
material lisado de bactrias e algas. Para cada srie de ensaios utiliza-se apenas um lote de gua, controlada
previamente por anlise do COD. Tal controlo no necessrio no teste do frasco fechado, mas o consumo de
oxignio da gua deve ser baixo.
I.6.2. Solues de reserva de componentes minerais
Para se preparar as solues de ensaio recorre-se a utilizao de solues de reserva com concentraes
apropriadas de componentes minerais. possvel utilizar as seguintes solues de reserva (com diversos
factores de diluio) para os mtodos de reduo gradual do COD, despiste da OCDE modificado, libertao de
CO
2
, respirometria manomtrica, ensaio em frasco fechado.
Os factores de diluio e, no caso do ensaio de MITI, a preparao especfica do meio mineral, so indicados
sob os ttulos dos ensaios especficos.
Solues de reserva:
Preparam-se as seguintes solues de reserva utilizando reagentes da qualidade analtica.
a) Dihidrogeno-ortofosfato monopotssico, KH
2
PO
4
8,50 g
Monohidrogeno-ortofosfato dipotssico, K
2
HPO
4
21,75 g
Monohidrogeno-ortofosfato dissdico dihidratado, Na
2
HP0
4
. 2H
2
O 33,40 g
Cloreto de amnio, NH
4
Cl
Dissolver em gua e ajustar at ao volume de 1 litro. O pH da soluo dever ser
7,4;
b) Cloreto de clcio anidro, CaCl
2
27,50 g
ou cloreto de clcio dihidratado, CaCl
2
. 2H
2
O 36,40 g
Dissolver em gua e ajustar o volume at 1 litro;
c) Sulfato de magnsio heptahidratado, MgSO
4
. 7H
2
O 22,50 g
Dissolver em gua e ajustar o volume at 1 litro;
d) Cloreto de ferro (III) hexahidratado, FeCl
3
. 6H
2
O 0,25 g
Dissolver em gua e ajustar o volume at 1 litro.
Nota: Para no se ter de preparar esta soluo imediatamente antes da sua utilizao adiciona-se-lhe uma gota
de HC1 concentrado ou 0,4 g do sal dissdico do cido etilenodiarninatetractico (EDTA) por litro.
I.6.3. Solues de reserva das substncias qumicas
Quando a solubilidade for superior a 1 g/l, dissolver 1-10 g, por exemplo, conforme for apropriado, da
substncia qumica de ensaio ou de referncia em gua desionizada e ajustar o volume a 1 litro. Caso contrrio,
preparar solues de reserva em meio mineral e adicionar a substncia qumica directamente ao meio mineral.
Para o caso de substncias qumicas de menor solubilidade veja-se o apndice 3; no teste do MITI (mtodo C.4-
-F) no sero utilizados nem solventes nem agentes emulsionantes.
I.6.4. Inculos
O inculo pode ser obtido a partir de uma diversidade de origens: lamas activadas, efluentes de esgotos (no
clorados), solos e guas superficiais ou a partir de uma mistura dessas origens. Para os ensaios de reduo
gradual do COD, de libertao de CO
2
e de respirometria manomtrica, no caso de se utilizarem lamas
activadas estas devem ser obtidas a partir de uma estao de tratamento ou de uma unidade laboratorial que
receba essencialmente guas residuais domsticas. Verificou-se que os inculos provenientes de outras origens
provocam uma maior disperso de resultados. Nos ensaios de despiste da OCDE modificado e de frasco fechado
necessrio um inculo mais diludo, sem partculas de lama, sendo a fonte preferencial um efluente
secundrio proveniente de uma estao de tratamento de resduos domsticos ou de uma unidade laboratorial.
No caso do ensaio de MITI, o inculo provm de uma mistura de origens, sendo descrito sob o ttulo do ensaio
especfico.
I.6.4.1. Inculo de lamas activadas
Recolher uma amostra de lamas activadas recentes, provenientes de um tanque de arejamento de uma estao
de tratamento de esgotos ou de uma unidade laboratorial que trate essencialmente esgotos domsticos.
Remover as partculas grosseiras, se necessrio por filtrao atravs de um crivo fino, e manter posteriormente
as lamas em estado aerbio.
Em alternativa, deixar sedimentar ou centrifugar (por exemplo, a 1 100 g durante 10 minutos) depois da
remoo de todas as partculas grosseiras. Rejeitar o sobrenadante. As lamas podem ser lavadas em meio
mineral. Preparar uma suspenso das lamas concentradas em meio mineral, para se obter uma concentrao de
3-5 g de slidos em suspenso/l e efectuar o arejamento enquanto for necessrio.
As lamas devem ser obtidas a partir de uma adequada estao de tratamento. Se as lamas forem obtidas de uma
estao de tratamento de grandes caudais ou nas quais se admite a presena de inibidores, devem ser lavadas.
Deixar sedimentar ou centrifugar as lamas da nova suspenso aps mistura profunda, rejeitar o sobrenadante e
preparar outra suspenso das lamas lavadas num novo volume de meio mineral. Repetir este procedimento at
se concluir que as lamas no possuem inibidor ou substrato em excesso.
Depois de se ter obtido uma nova suspenso, ou quando se utilizam lamas no tratadas, retirar uma amostra
imediatamente antes da sua utilizao para determinao do resduo seco correspondente s substncias slidas
em suspenso.
Outra alternativa consiste em homogeneizar as lamas activadas (3-5 g de slidos em suspenso/l). Tratar as
lamas num misturador mecnico durante 2 minutos, a uma velocidade mdia. Deixar sedimentar a mistura de
lamas durante 30 minutos ou durante um perodo mais longo, se necessrio, e decantar o lquido para
utilizao como inculo na proporo de 10 ml/l de meio mineral.
I.6.4.2. Outras fontes de inculo
Este pode ser obtido a partir de um efluente secundrio de uma estao de tratamento ou de uma unidade
laboratorial que receba essencialmente resduos domsticos. Recolher uma amostra fresca e conserv-la
aerobicamente durante o transporte. Deixar sedimentar durante uma hora ou filtrar atravs de papel de filtro
para partculas grosseiras e conservar aerobicamente o efluente decantado ou o filtrado, enquanto for
necessrio. Pode utilizar-se at 100 ml deste tipo de inculo para cada litro de meio.
As guas superficiais constituem uma fonte adicional de inculo. Nesse caso, recolher uma amostra de uma
gua superficial adequada, por exemplo, dos rios ou dos lagos e conserv-la em estado aerbio enquanto for
necessrio. Se tal se justificar, concentrar o inculo por filtrao ou por centrifugao.
I.6.5. Pr-condicionamento dos inculos
Os inculos podem ser pr-condicionados para as condies experimentais mas no podem ser pr-adaptados
substncia qumica de ensaio. O pr-condicionamento consiste em arejar as lamas activadas em meio mineral
ou efluente secundrio durante cinco a sete dias, temperatura de ensaio. Por vezes, o pr-condicionamento
melhora a preciso dos mtodos de ensaio pelo facto de reduzir os valores dos brancos. desnecessrio pr-
-condicionar o inculo para o mtodo de MITI.
I.6.6. Controlos abiticos
Sempre que necessrio, verificar a possvel degradao abitica da substncia de ensaio, determinando a
remoo do COD, o consumo de oxignio ou a libertao de dixido de carbono em controlos estreis que no
contenham inculo. Esterilizar por filtrao atravs de uma membrana (0,2- 0,45 mcron) ou adicionando uma
substncia txica adequada numa concentrao conveniente. Se usada membrana de filtrao, colhem-se as
amostras assepticamente para que se mantenha a esterilidade. A menos que se tenha excludo previamente a
adsoro da substncia de ensaio, os testes para a medio da biodegradao por remoo do COD,
especialmente com inculo de lamas activas, devero incluir um controlo abitico, o qual inoculado e
contaminado.
I.6.7. Nmero de frascos
O nmero de frascos numa experincia-tipo descrito nos ttulos de cada ensaio.
Podem usar-se os seguintes tipos de frascos:
suspenso de ensaio: substncia de ensaio e inculo,
branco de inculo: somente o inoculo,
controlo do processo: substncia de referncia e inculo,
controlo abitico estril: substncia de ensaio, estril (ver ponto I.6.6),
controlo de adsoro: substncia de ensaio, inculo e agente esterilizante,
controlo de toxicidade: substncia de ensaio, substncia de referncia e inculo.
As determinaes na suspenso de ensaio e no branco do inculo devero obrigatoriamente ser feitas em
paralelo. tambm aconselhvel fazer as determinaes noutro frasco, em paralelo.
Todavia, isto nem sempre possvel. Garantir que so preparadas amostras suficientes ou efectuadas leituras
suficientes de modo que possa avaliar-se a remoo percentual no perodo dos 10 dias.
I.7. RESULTADOS E AVALIAO
No clculo do valor D
t
, degradao percentual, utilizam-se os valores mdios das medies em duplicado dos
parmetros tanto nos recipientes de ensaio como no branco do inculo. As frmulas so apresentadas a seguir,
nas seces correspondentes sobre os ensaios especficos. A evoluo da degradao representada
graficamente, sendo indicado o perodo dos 10 dias. Calcular e registar a remoo percentual alcanada no final
do perodo dos 10 dias e o valor no patamar ou no final do ensaio, conforme o caso.
Nos ensaios respiromtricos os compostos que contm azoto podem afectar o consumo de oxignio, devido a
fenmenos de nitrificao (ver os apndices 2 e 5).
I.7.1. Degradao medida atravs da determinao do COD
Para o clculo da percentagem de degradao (D
t
), colhida uma amostra num dado momento, o qual dever
ser calculado separadamente para cada um dos frascos que contm a substncia a testar, usando os valores
mdios das medies em duplicado do COD, com o fim de se poder avaliar a validade do teste (ver ponto I.5.2).
Para o clculo usa-se a seguinte equao:
D
t = 1
C
t
C
bt
C
o
C
b0
_ _
100
em que:
D
t
= % de degradao no momento t,
C
o
= concentrao mdia inicial de COD no meio de cultura inoculado que contm a substncia de ensaio
(mg de COD/l),
C
t
= concentrao mdia de COD no meio de cultura inoculado que contm a substncia de ensaio, no
momento t (mg de COD/l),
C
bo
= concentrao mdia inicial de COD no branco de meio mineral inoculado (mg de COD/l),
C
bt
= concentrao mdia de COD no branco de meio mineral inoculado no momento t (mg de COD/l).
Todas as concentraes so medidas experimentalmente.
I.7.2. Degradao medida atravs de anlise especfica
No caso de existirem dados analticos especficos, calcular a biodegradao primria pela frmula:
D
t =
S
b
S
a
S
b
100
em que:
D
t
= % de degradao no momento t, normalmente aps 28 dias,
S
a
= quantidade residual de substncia de ensaio no meio inoculado no final do ensaio (mg),
S
b
= quantidade residual de substncia de ensaio no teste em branco que utiliza gua/meio a que apenas se
adicionou a substncia de ensaio (mg).
I.7.3. Degradao abitica
Quando usado um controlo estril abitico, usa-se para o clculo da percentagem de degradao abitica, a
frmula seguinte:
% de degradao abitica =
C
so
C
st
C
so
100
em que:
C
s(o)
= concentrao COD no controlo estril no dia zero,
C
s(t)
= concentrao COD no controlo estril no dia t.
I.8. RELATRIO
O relatrio de ensaio dever conter, se possvel, as informaes seguintes:
substncias qumicas de ensaio e de referncia e o seu grau de pureza,
condies de ensaio,
inculo: natureza e locais de amostragem, concentrao e qualquer tratamento de pr-condicionamento,
proporo e natureza dos resduos industriais existentes nas guas residuais, se forem conhecidas,
durao e temperatura do ensaio,
nos casos das substncias qumicas de ensaio pouco solveis, qual o tratamento efectuado,
mtodo de ensaio aplicado; devero ser apresentadas e explicadas as razes cientficas de qualquer
modificao de procedimento,
folha de dados,
qualquer fenmeno de inibio observado,
qualquer degradao abitica observada,
dados analticos qumicos especficos, se os houver,
dados analticos qumicos sob intermedirios, se os houver,
o grfico da degradao percentual em funo do tempo para as substncias de ensaio e de referncia, a
fase de latncia, a fase de degradao, o perodo dos 10 dias e o declive, devero ser claramente indicados
(apndice 1). Se o teste foi sujeito a um critrio de validade, as percentagens mdias de degradao nos
frascos com a substncia de ensaio podem ser usadas para o grfico,
a remoo percentual depois do perodo dos 10 dias, e no patamar ou no final do ensaio.
PARTE II. ENSAIO DA REDUO GRADUAL DO COD (mtodo C.4-A)
II.1. PRINCPIO DO MTODO
Ao abrigo da luz ou sob luz difusa e temperatura de 22 2 C faz-se o arejamento de um determinado
volume de meio mineral inoculado, contendo uma concentrao conhecida da substncia de ensaio (10-40 mg
COD/l) como nica fonte nominal de carbono orgnico.
Acompanha-se a degradao por anlise frequente do COD ao longo de um perodo de 28 dias. Calcula-se o
grau de biodegradao, exprimindo a concentrao de COD removido (corrigida em funo do branco de
inculo de controlo) em percentagem da concentrao inicialmente presente. O grau de biodegradao
primria tambm pode ser calculado atravs de uma anlise qumica complementar efectuada no incio e no
fim da incubao.
II.2. DESCRIO DO MTODO
II.2.1. Equipamento
a) Frascos cnicos, por exemplo, com capacidade entre 250 ml e 2 1, consoante o volume necessrio para a
anlise do COD;
b) Mquina agitadora para os frascos cnicos, com controlo automtico de temperatura ou, em
alternativa, utilizada a uma temperatura ambiente constante, e com potncia suficiente para manter
condies aerbias em todos os frascos;
c) Equipamento de filtrao, com membranas adequadas;
d) Analisador de COD;
e) Equipamento para determinar o oxignio dissolvido;
f) Centrifugadora.
II.2.2. Preparao do meio mineral
Para a preparao da soluo de reserva, ver ponto I.6.2.
Misturar 10 ml de soluo (a) com 800 ml de gua de diluio, adicionar 1 ml das solues (b) a (d) e ajustar o
volume a 1 litro com gua de diluio.
II.2.3. Preparao e pr-condicionamento do inculo
O inculo pode ser obtido de vrias origens: lamas activadas; efluentes de esgotos; guas de superfcie; solos ou
misturas destes.
Ver pontos I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 e 1.6.5.
II.2.4. Preparao dos frascos
A ttulo de exemplo, introduzir quantidades de 800 ml de meio mineral em frascos cnicos com a capacidade
de 2 litros e adicionar volumes suficientes das solues de reserva que contm as substncias de ensaio e de
referncia a frascos separados, para se obter uma concentrao de substncia qumica equivalente a 10-40 mg
de COD/l. Controlar os valores do pH e ajust-los, se necessrio, para 7,4. Inocular os frascos com lamas
activadas ou com outra fonte de inculos (ver ponto I.6.4), para se obter uma concentrao final no superior a
30 mg de slidos em suspenso/l. Preparar tambm os controlos de inculo em meio mineral mas sem a
substncia qumica de ensaio ou de referncia.
Se necessrio, utilizar um recipiente para verificao do possvel efeito inibidor da substncia qumica de
ensaio, inoculando uma soluo que contenha, num meio mineral, concentraes comparveis das substncias
qumicas de ensaio e de referncia.
Ainda no caso de ser necessrio, preparar outro frasco estril para verificar se a substncia qumica de ensaio se
degrada abioticamente, utilizando uma soluo no inoculada contendo a substncia qumica (ver ponto I.6.6).
Para alm disso, no caso de se suspeitar que a substncia qumica de ensaio significativamente adsorvida pelo
vidro, lamas, etc., efectuar uma avaliao preliminar para se determinar o grau provvel da adsoro e,
consequentemente, se determinar se o ensaio adequado substncia qumica (ver quadro 1). Preparar um
frasco com a substncia de ensaio, o inculo e o agente esterilizante.
Ajustar os volumes em todos os frascos a 1 litro, utilizando meio mineral e, depois de se misturar, retirar uma
amostra de cada frasco para determinar a concentrao inicial de COD (ver apndice 2.4). Tapar as aberturas
dos frascos, por exemplo com folha de alumnio, de modo a permitir a permuta livre de ar entre o frasco e a
atmosfera envolvente. Colocar depois os recipientes na mquina agitadora e iniciar o ensaio.
II.2.5. Nmero de frascos numa experincia-tipo
De preferncia:
Frascos 1 e 2: suspenso de ensaio;
Frascos 3 e 4: branco do inculo;
Frasco 5: controlo.
Se necessrio, ainda:
Frasco 6: controlo abitico estril;
Frasco 7: controlo da adsoro;
Frasco 8: controlo da toxicidade.
Ver ponto I.6.7.
II.2.6. Realizao do ensaio
Ao longo do ensaio, determinar as concentraes de COD em cada frasco em duplicado, a intervalos de tempo
conhecidos suficientemente frequentes que permitam determinar o incio do perodo dos 10 dias e a remoo
percentual no final do perodo dos 10 dias. Utilizar apenas o volume mnimo de suspenso de ensaio
necessrio para cada determinao.
Antes da colheita de amostras, repor as perdas dos frascos por evaporao, adicionando gua de diluio
(ponto I.6.1) na quantidade requerida, se for necessrio. Homogeneizar o meio de cultura antes de se retirar a
amostra e garantir que o material aderente s paredes dos recipientes dissolvido ou se mantm em suspenso
antes da colheita de amostras. Filtrar atravs de membranas ou centrifugar (ver apndice 2.4), imediatamente
aps a colheita de amostras. Analisar no mesmo dia as amostras filtradas ou centrifugadas ou, caso contrrio,
armazen-las temperatura de 2-4
o
C durante um perodo mximo de 48 horas, ou a uma temperatura inferior
a 18
o
C no caso de um perodo mais longo.
II.3. RESULTADOS E RELATRIO
II.3.1. Tratamento dos resultados
Calcular a percentagem de degradao no momento t conforme referido no ponto I.7.1 (determinao do
COD) e, facultativamente, conforme referido no ponto I.7.2 (anlise especfica).
Registar todos os resultados nas folhas de dados fornecidas.
II.3.2. Validade dos resultados
Ver ponto I.5.2.
II.3.3. Relatrio
Ver ponto I.8.
II.4. FOLHA DE DADOS
Como exemplo de folha de dados apresenta-se a seguinte:
ENSAIO DE REDUO GRADUAL DO COD
1. LABORATRIO
2. DATA DO INCIO DO ENSAIO
3. SUBSTNCIA DE ENSAIO
Nome:
Concentrao da soluo de reserva: ... mg/l da substncia
Concentrao inicial no meio, t
o
: ... mg/l da substncia
4. INCULO
Origem:
Tratamento efectuado:
Pr-condicionamento, se o houver:
Concentrao das substncias slidas em suspenso na mistura reaccional: mg/l
5. DETERMINAES DE CARBONO
Analisador de carbono:
N
o
do frasco
COD decorridos n dias (mg/l)
0 n
1
n
2
n
3
n
x
Substncia qumica
de ensaio e inculo
1
a
1
a
2
a, mdia
C
a(t)
2
b
1
b
2
b, mdia
C
b(t)
N
o
do frasco
0 n
1
n
2
n
3
n
x
Branco de inculo
sem substncia de
ensaio
3
c
1
c
2
c, mdia C
c(t)
4
d
1
d
2
d, mdia
C
d(t)
C
blt =
C
ct
C
dt
2
6. AVALIAO DOS DADOS BSICOS
N
o
do frasco
% de degradao decoridos n dias
0 n
1
n
2
n
3
n
4
1
D
1 = 1
C
at
C
blt
C
ao
C
blo
_ _
100
0
2
D
2 = 1
C
bt
C
blt
C
bo
C
blo
_ _
100
0
Mdia (*)
D=
D
1
D
2
2
0
(*) D
1
e D
2
no devem ser ponderados, se h uma diferena considervel.
Nota: possvel utilizar frmulas idnticas para a substncia qumica de referncia e para os controlos de
toxicidade.
7. CONTROLO ABITICO (facultativo)
Tiempo (das)
0 t
conc. de COD (mg/l) en el control estril C
s(o)
C
s(t)
C
so
C
st
C
so
100
8. ANLISE QUMICA ESPECFICA (facultativa)
Quantidade residual da
subastncia de ensaio no final do
teste (mg/l)
% degradao
Controlo estri S
b
Quantidade residual da
subastncia de ensaio no final do
teste (mg/l)
% degradao
Meio de ensaio inoculado S
a
S
b
S
a
S
b
100
PARTE III. TESTE DE DESPISTE DA OCDE MODIFICADO (mtodo C.4-B)
III.1. PRINCPIO DO MTODO
Utilizando 0,5 ml de efluente por litro de meio faz-se a inoculao de um determinado volume de meio
mineral, contendo uma concentrao conhecida da substncia de ensaio (10-40 mg de COD/l) como nica
fonte nominal de carbono orgnico. Faz-se o arejamento da mistura ao abrigo da luz ou sob luz difusa,
temperatura de 22 2
o
C.
Acompanha-se a degradao por anlise frequente do COD ao longo de um perodo de 28 dias. Calcula-se o
grau de biodegradao, exprimindo a concentrao de COD removido (corrigida em funo do branco de
inculo de controlo) em percentagem da concentrao inicialmente presente. O grau de biodegradao
primria tambm pode ser calculado atravs de uma anlise qumica complementar efectuada no incio e no
fim da incubao.
III.2. DESCRIO DO MTODO
III.2.1. Equipamento
a) Frascos cnicos, por exemplo, com capacidade entre 250 ml e 2 1, consoante o volume necessrio para a
anlise do COD;
b) Mquina agitadora para os frascos cnicos, com controlo automtico de temperatura ou, em
alternativa, utilizada a uma temperatura ambiente constante, e com potncia suficiente para manter
condies aerbias em todos os frascos;
c) Equipamento de filtrao, com membranas adequadas;
d) Analisador de COD;
e) Equipamento para determinar o oxignio dissolvido;
f) Centrifugadora.
III.2.2. Preparao do meio mineral
Para a preparao da soluo de reserva, ver ponto I.6.2.
volume a 1 litro com a gua de diluio.
Neste mtodo utiliza-se como inculo apenas 0,5 ml de efluente/litro pelo que pode ser necessrio reforar o
meio com oligoelementos e factores de crescimento. Esta operao efectua-se adicionando 1 ml de cada uma
das solues a seguir indicadas por litro de meio final.
Soluo de oligoelementos:
Sulfato de mangans tetrahidratado, MnSO
4
. 4H
20
39,9 mg
cido brico, H
3
BO
3
57,2 mg
Sulfato de zinco heptahidratado, ZnSO
4
. 7H
20
42,8 mg
Heptamolibdato de amnio, (NH
4
)
6
Mo
7
O
24
34,7 mg
Quelato de Fe (FeCl
3
cido etilenodiaminatetractico) 100,0 mg
Dissolver e ajustar o volume a 1 000 ml com gua de diluio
Soluo vitamnica:
Extracto de levedura 15,0 mg
Dissolver o extracto de levedura em 100 ml de gua. Esterilizar, fazendo passar atravs de uma membrana de
0,2 mcron ou preparar de fresco.
III.2.3. Preparao e pr-condicionamento do inculo
O inculo derivado de um efluente secundrio de uma estao de tratamento ou laboratrio, que recebe
predominantemente esgotos domsticos. Ver pontos I.6.4.2 e I.6.5.
Utiliza-se 0,5 ml por litro de meio mineral.
III.2.4. Preparao dos frascos
A ttulo de exemplo, introduzir quantidades de 800 ml de meio mineral em frascos cnicos com a capacidade
de 2 litros e adicionar volumes suficientes das solues de reserva que contm as substncias de ensaio e de
referncia a frascos separados, para se obter uma concentrao de substncia qumica equivalente a 10-40 mg
de COD/l. Controlar o valor do pH e ajust-lo, se necessrio, para 7,4. Inocular os frascos com efluente de
guas residuais para se obter uma concentrao de 0,5 ml/litro (ver ponto I.6.4.2). Preparar tambm os
controlos de inculo em meio mineral mas sem a substncia qumica de ensaio ou de referncia.
Se necessrio, utilizar um recipiente para verificao do possvel efeito inibidor da substncia qumica do
ensaio, inoculando uma soluo que contenha, num meio mineral, concentraes comparveis das substncias
qumicas de ensaio e de referncia.
Ainda se necessrio, preparar outro frasco estril para verificar se a substncia qumica de ensaio se degrada
abioticamente, utilizando uma soluo no inoculada contendo a substncia qumica (ver ponto 1.6.6).
Para alm disso, no caso de se suspeitar que a substncia qumica de ensaio significativamente adsorvida pelo
vidro, lamas, etc., efectuar uma avaliao preliminar para se determinar o grau provvel de adsoro e,
consequentemente, se determinar se o ensaio adequado substncia qumica (ver quadro 1). Preparar um
frasco com a substncia de ensaio, o inculo e o agente esterilizante.
Ajustar os volumes em todos os frascos a 1 litro, utilizando meio mineral e, depois de se misturar, retirar uma
amostra de cada frasco para determinar a concentrao inicial de COD (ver apndice 2.4). Tapar as aberturas
dos frascos, por exemplo com folha de alumnio, de modo a permitir a permuta livre de ar entre o frasco e a
atmosfera envolvente. Colocar depois os recipientes na mquina agitadora e iniciar o ensaio.
III.2.5. Nmero de frascos numa experincia-tipo
De preferncia:
Frascos 1 e 2: suspenso de ensaio,
Frascos 3 e 4: branco do inculo,
Frasco 5: controlo;
Frasco 6: controlo abitico estril, Frasco 7: controlo da adsoro,
Ver ainda o ponto I.6.7.
III.2.6. Realizao do ensaio
Ao longo do ensaio, determinar as concentraes de COD em cada frasco em duplicado, a intervalos de tempo
conhecidos suficientemente frequentes que permitam determinar o incio do perodo dos 10 dias e a remoo
percentual no final do perodo dos 10 dias. Utilizar apenas o volume mnimo de suspenso de ensaio
necessrio para cada determinao.
Antes da colheita de amostras, repor as perdas dos frascos por evaporao, adicionando gua de diluio
(ponto I.6.1) na quantidade requerida, se for necessrio. Homogeneizar o meio de cultura antes de se retirar a
amostra e garantir que o material aderente s paredes dos recipientes dissolvido ou se mantm em suspenso
antes da colheita de amostras. Filtrar atravs de membranas ou centrifugar (ver apndice 2.4), imediatamente
aps a colheita de amostras. Analisar no mesmo dia as amostras filtradas ou centrifugadas ou, caso contrrio,
armazen-las temperatura de 2-4
o
C durante um perodo mximo de 48 horas, ou a uma temperatura inferior
a 18
o
C no caso de um perodo mais longo.
III.3. RESULTADOS E RELATRIO
III.3.1. Tratamento dos resultados
Calcular a percentagem de degradao no momento t conforme referido no ponto I.7.1 (determinao do
COD) e, facultativamente, conforme referido no ponto I.7.2 (anlise especfica).
Registar todos os resultados nas folhas de dados fornecidas.
III.3.2. Validade dos resultados
Ver ponto I.5.2.
III.3.3. Relatrio
Ver ponto I.8.
III.4. FOLHA DE DADOS
ENSAIO DE DESPISTE DA OCDE MODIFICADO
1. LABORATRIO
Nome:
Concentrao da soluo de reserva: mg/l da substncia
Concentrao inicial no meio, t
o
:mg/l da substncia
4. INCULO
Origem:
5. DETERMINAES DE CARBONO
N
o
do frasco
0 n
1
n
2
n
3
n
x
Substncia qumica
de ensaio e inculo
1
a
1
a
2
a, mdia
C
a(t)
2
b
1
b
2
b, media
C
b(t)
Branco de inculo
sem substncia de
ensao
3
c
1
c
2
c, media C
b(t)
4
d
1
d
2
d, media
C
b(t)
C
blt =
C
ct
C
dt
2
6. AVALIAO DOS DADOS BSICOS
N
o
do frasco
% de degradao decorridos n dias
0 n
1
n
2
n
3
n
4
1
D
1 = 1
C
at
C
blt
C
ao
C
blo
_ _
100
0
2
D
2 = 1
C
bt
C
blt
C
bo
C
blo
_ _
100
0
Mdia (*)
D=
D
1
D
2
2
0
(*) D
1
e D
2
Nota: possvel utilizar frmulas idnticas para a substncia qumica de referncia e para os controlos de
toxicidade.
7. CONTROLO ABITICO (facultativo)
Tempo (dias)
0 t
Concentrao do COD (mg/l) no controlo
estril
C
s(o)
C
s(t)
C
so
C
st
C
so
100
8. ANLISE QUMICA ESPECFICA (facultativa)
Quantidade residual da substncia
de ensaio no final do teste
% degradao primria
Controlo estril S
b
Meio de ensaio inoculado S
a S
b
S
a
S
b
100
PARTE IV. ENSAIO DA LIBERTAO DE CO
2
(mtodo C.4-C)
IV.1. PRINCPIO DO MTODO
s escuras ou sob luz difusa faz-se passar um caudal controlado de ar isento de dixido de carbono, para o
arejamento de um volume determinado de meio mineral inoculado, contendo uma concentrao conhecida da
substncia qumica de ensaio (10-20 mg de COD ou de COT/l) como nica fonte nominal de carbono
orgnico. Acompanha-se a degradao ao longo de 28 dias, determinando o dixido de carbono produzido, o
qual retido em hidrxido de brio ou em hidrxido de sdio e medido por titulao do hidrxido residual
ou na forma de carbono inorgnico. A quantidade de dixido de carbono produzido pela substncia qumica de
ensaio (corrigida em funo dos valores obtidos a partir do branco de inculo) exprime-se em percentagem do
valor CO
2
Te. O grau de biodegradao tambm pode ser calculado por uma anlise complementar do COD
efectuada no incio e no fim da incubao.
IV.2. DESCRIO DO MTODO
IV.2.1. Equipamento
a) Frascos de 2-5 litros, cada um deles munido de um tubo de arejamento que atinge as proximidades do
fundo do recipiente e com uma abertura de sada;
b) Agitadores magnticos, quando se fizer a avaliao de substncias qumicas pouco solveis;
c) Frascos de absoro de gs;
d) Dispositivo para controlar e medir o fluxo de ar;
e) Equipamento para remoo do dixido de carbono, para obteno de ar isento de dixido de carbono;
em alternativa, utilizar uma mistura de oxignio isento de CO
2
e de azoto isento de CO
2
, provenientes de
garrafas, nas propores correctas (20 % de O
2
: 80 % de N
2
);
f) Dispositivo para a determinao do dixido de carbono, recorrendo a titulao (volumetria) ou
utilizando algum tipo de analisador do carbono inorgnico;
g) Dispositivo de filtrao por membranas (facultativo);
h) Analisador de COD (facultativo).
IV.2.2. Preparao do meio mineral
Para a preparao das solues de reserva ver ponto I.6.2.
IV.2.3. Preparao e pr-condicionamento do inculo
misturas destes.
Ver pontos I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 e I.6.5.
IV.2.4. Preparao dos frascos
A ttulo de exemplo, os volumes e massas a seguir indicados representam valores para frascos de 5 litros que
contenham 3 litros de suspenso. No caso de se utilizarem volumes menores, modificar os correspondentes
valores em conformidade mas garantir que o dixido de carbono formado possa ser medido com exactido.
A cada frasco de 5 litros adicionar 2 400 ml de meio mineral. Adicionar um volume adequado das lamas
activadas preparadas (ver ponto I.6.4.1 e I.6.5) para se obter uma concentrao de substncias slidas em
suspenso no superior a 30 mg/l, no volume final de 3 l de mistura inoculada. Em alternativa, diluir primeiro
as lamas preparadas, de modo a obter-se uma suspenso de 500-1 000 mg/l em meio mineral, antes de se
adicionar uma alquota ao contedo do balo de 5 litros, de modo a obter-se uma concentrao de 30 mg/l;
esta operao garante uma grande preciso. possvel utilizar outras fontes de inculo (ver ponto I.6.4.2).
Arejar estas misturas inoculadas, utilizando ar isento de CO
2
, durante a noite, para purgar o dixido de carbono
do sistema.
Adicionar a substncia de ensaio e a substncia de referncia, separadamente, a partir de volumes conhecidos
das solues de reserva, a frascos idnticos repetidos, para se obterem concentraes, modificadas pelas
substncias qumicas adicionadas, de 10 a 20 mg de COD ou de COT/l; no adicionar substncias qumicas a
alguns dos frascos para serem utilizados como controlos do inculo. Adicionar as substncias qumicas de
ensaio pouco solveis directamente aos frascos, tomando como base a sua massa ou volume, ou proceder
conforme descrito no apndice 3.
Se necessrio, utilizar um frasco para verificar o possvel efeito inibidor da substncia qumica de ensaio,
adicionando as substncias qumicas de ensaio e de referncia nas mesmas concentraes dos outros frascos.
Se necessrio, utilizar tambm um frasco estril para verificar se a substncia qumica de ensaio se degrada
abioticamente, utilizando uma soluo no inoculada da substncia qumica (ver ponto I.6.6.). Esterilizar
adicionando urna substncia txica numa concentrao adequada.
Ajustar os volumes das suspenses em todos os frascos a 3 litros, adicionando meio mineral previamente
arejado com ar isento de CO
2
. Facultativamente, podem retirar-se amostras para anlise do COD (ver apn-
dice 2.4) e/ou para anlises especficas. Ligar os recipientes de absoro s sadas de ar dos frascos.
No caso de se utilizar hidrxido de brio, ligar em srie trs frascos de absoro, contendo cada um 100 ml de
uma soluo de hidrxido de brio 0,0125 M, a cada frasco de 5 litros. A soluo deve estar isenta de sulfatos e
carbonatos precipitados e a sua concentrao deve ser determinada imediatamente antes da utilizao. No caso
de se utilizar hidrxido de sdio, ligar dois frascos colectores, actuando o segundo como elemento de controlo
para demonstrar que todo o dixido de carbono foi absorvido no primeiro. Nos frascos de absoro as rolhas
de frascos de soro so adequadas. Adicionar 200 ml de uma soluo de hidrxido de sdio 0,05 M a cada
frasco, quantidade que suficiente para absorver a quantidade total de dixido de carbono libertado at
degradao completa da substncia qumica de ensaio. A soluo de hidrxido de sdio, ainda que
recentemente preparada, conter vestgios de carbonatos; efectua-se a correco correspondente, deduzindo os
carbonatos do branco.
IV.2.5. Nmero de frascos numa experincia-tipo
Balo 1 e 2: suspenso de ensaio;
Balo 3 e 4: branco do inculo;
Frasco 5: controlo.
De preferncia e se necessrio, ainda:
Ver tambm ponto I.6.7.
IV.2.6. Realizao do ensaio
Iniciar o ensaio fazendo borbulhar ar isento de CO
2
nas suspenses, com um caudal de 30-100 ml/minuto.
Retirar periodicamente amostras do absorvente do dixido de carbono, para anlise do teor de CO
2
. Durante os
primeiros 10 dias recomenda-se que as anlises sejam feitas de dois em dois ou de trs em trs dias e, depois, de
cinco em cinco dias at ao 28.
o
dia, de modo que seja possvel identificar o perodo dos 10 dias.
Ao 28.
o
dia, retirar amostras (facultativo) para anlise do COD e/ou anlises especficas, medir o pH das
suspenses e adicionar a cada frasco 1 ml de cido clordrico concentrado; arejar os frascos durante a noite para
remoo do dixido de carbono existente nas suspenses de ensaio. No 29.
o
dia efectuar a ltima anlise do
dixido de carbono libertado.
Nos dias das medies de CO
2
, desligar o dispositivo de absoro de hidrxido de brio mais prximo do frasco
e fazer a titulao da soluo de hidrxido, utilizando HCl 0,05 M e fenolftalina como indicador. Deslocar os
outros dispositivos de absoro para uma posio mais prxima do frasco e colocar um novo dispositivo de
absoro, contendo 100 ml de hidrxido de brio 0,0125 M recente, na extremidade mais afastada da srie.
Efectuar as titulaes conforme necessrio, por exemplo, quando se observar uma precipitao substancial no
primeiro frasco de absoro e antes que seja evidente qualquer precipitao no segundo ou logo que a se note
uma precipitao fraca. Em alternativa, utilizando NaOH como absorvente, retirar com uma seringa uma
pequena amostra (depende das caractersticas do analisador de carbono utilizado) da soluo de hidrxido de
sdio do dispositivo de absoro mais prximo do frasco. Injectar a amostra na zona correspondente ao CI do
analisador de carbono para analisar directamente o dixido de carbono libertado.
Analisar o teor no segundo frasco de absoro apenas no final do ensaio para corrigir qualquer passagem de
dixido de carbono.
IV.3. RESULTADOS E RELATRIO
IV.3.1. Tratamento dos resultados
A quantidade de CO
2
retida num dispositivo de absoro, quando titulada, dada por:
mgCO
2
= (100 C
B
0,5 V C
A
) 44
em que:
V = volume de HCl utilizado na titulao dos 100 ml existentes no dispositivo de absoro (ml),
C
B
= concentrao da soluo de hidrxido de brio (M),
C
A
= concentrao da soluo de cido clordrico (M),
se C
B
for 0,0125 M e C
A
for 0,05 M, a titulao, para 100 ml de hidrxido de brio, ser de 50 ml, e a massa de
CO
2
ser dada por:
0,05
2
44 ml de HCl titulado = 1,1 ml HCI
Sendo assim, no caso presente, para se converter o volume de HCl titulado em mg de CO
2
produzido, utiliza-se
o factor 1,1.
Calcular a massa do CO
2
produzido a partir do inculo isolado e a partir do inculo e da substncia qumica de
ensaio, utilizando os respectivos valores de titulao, correspondendo a diferena massa de CO
2
produzido
apenas a partir da substncia qumica de ensaio.
Por exemplo, se o inculo isoladamente conduzir a uma titulao de 48 ml e o inculo e a substncia qumica
de ensaio conduzirem a uma titulao de 45 ml, ento:
CO
2
proveniente do inculo = 1,1 (50-48) = 2,2 mg
CO
2
proveniente do inculo e da substncia qumica de ensaio = 1,1 (50-45) = 5,5 mg
pelo que a massa do CO
2
produzido a partir da substncia qumica de ensaio ser de 3,3 mg.
A percentagem de biodegradao calcula-se pela expresso:
% de degradao =
mg de CO
2
produzido 100
CO
2
Te mg substncia qumica de ensaio adicionada
ou
% de degradao =
mg de CO
2
produzido 100
mg de COT adicionado no ensaio 3,67
sendo o valor 3,67 o factor de converso (44/12) de carbono em dixido de carbono.
Obtm-se a percentagem de degradao decorrido qualquer intervalo de tempo, somando as percentagens de
CO
2
Te, cujo clculo foi efectuado em cada um dos dias at ao momento em que se faz a medio.
Para os dispositivos de absoro de hidrxido de sdio, calcular a quantidade de dixido de carbono produzida,
expressa em Cl (mg), multiplicando a concentrao de CI no absorvente pelo volume desse absorvente.
Calcular a percentagem de degradao pela expresso:
% de CO
2
Te =
mg CI do frasco de ensaio mg CI do branco
MG COT adicionado como substncia qumica de ensaio
100
Calcular as variaes de COD (facultativo) conforme descrito no ponto I.7. Registar este e todos os outros
resultados na folha de dados fornecida.
IV.3.2. Validade dos resultados
O teor de Cl da suspenso da substncia qumica de ensaio em meio mineral, no incio do ensaio, deve ser
inferior a 5 % do valor do CT, e a libertao total de CO
2
no branco de inculo, no final do ensaio, no deve
normalmente exceder 40 mg/l de meio. No caso de serem obtidos valores superiores a 70 mg de CO
2
/l, dever
fazer-se uma anlise crtica dos resultados e da tcnica experimental.
Ver tambm o ponto I.5.2.
IV.3.3. Relatrio
Ver ponto I.8.
IV.4. FOLHA DE DADOS
Como exemplo de uma folha de dados apresenta-se a seguinte.
ENSAIO DA LIBERTAO DE DIXIDO DE CARBONO
1. LABORATRIO
Nome:
Concentrao inicial no meio: mg/l da substncia
C total adicionado ao frasco: mg de C
CO
2
Te: mg de CO
2
4. INCULO
Origem:
5. PRODUO DE DIXIDO DE CARBONO E DEGRADABILIDADE
Mtodo: Ba(OH)
2
/NaOH/outro ...
Tempo
(dia)
CO
2 formado enso
(mg)
CO
2 formado bianco
(mg)
C0
2
formado acu-
mulado (mg)
(ensaio menos
branco)
% de CO
2
Te
CO
2
acumulado
ThCO
2
100
1
2
mdia
3
4
mdia 1 2 1 2 mdia
0
n
1
n
2
n
3
28
Nota: Podem ser utilizados esquemas idnticos para a substncia qumica de referncia e para os controlos de
toxicidade.
6. ANLISE DO CARBONO (facultativa)
Tempo (dia) Branco mg/l Substncia qumica de ensaio mg/l
0 C
b(o)
C
o
28 (*)
C
b(t)
C
t
(*) ou no final da incubao.
% de COD removido = 1
C
t
C
bt
C
o
C
bo
_ _
100
7. DEGRADAO ABITICA (facultativo)
formao de CO
2
em frasco estril decorridos ki dias mg
CO
2
Te mg
100
PARTE V. ENSAIO DE RESPIROMETRIA MANOMTRICA (mtodo C.4-D)
V.1. PRINCPIO DO MTODO
Agita-se um volume determinado de meio mineral inoculado, contendo uma concentrao conhecida da
substncia qumica de ensaio (substncia de ensaio na concentrao de 100 mg/l, para dar pelo menos 50-100
mg de CTeO/l) como nica fonte nominal de carbono orgnico, num frasco fechado, a uma temperatura
constante ( 1
o
C ou mais precisa), durante um perodo de 28 dias. Determina-se o consumo de oxignio,
medindo a quantidade de oxignio (produzido electroliticamente) necessria para manter constante o volume
de gs no frasco do respirmetro, ou, em alternativa, recorrendo variao de volume ou de presso (ou a uma
combinao de ambas) no aparelho. O dixido de carbono libertado absorvido por uma soluo de hidrxido
de potssio ou por outro absorvente adequado. A quantidade de oxignio consumida pela substncia qumica
de ensaio (corrigida em funo do consumo paralelo do branco de inculo) exprime-se em percentagem de
CTeO ou CQO. Facultativamente, a biodegradao primria tambm pode ser calculada atravs de uma anlise
especfica suplementar, efectuada no incio e no fim da incubao, e a biodegradao total por anlise do COD.
V.2. DESCRIO DO MTODO
V.2.1. Equipamento
a) Respirmetro adequado;
b) Controlo de temperatura, a 1
o
C ou mais precisa;
c) Dispositivo de filtrao por membranas (facultativo);
d) Analisador de carbono (facultativo).
V.2.2. Preparao do meio mineral
Para a preparao das solues de reserva ver ponto I.6.2.
Misturar 10 ml da soluo (a) com 800 ml de gua de diluio, adicionar 1 ml das solues (b) a (d) e ajustar o
V.2.3. Preparao e pr-condicionamento do inculo
misturas destes.
Ver pontos I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 e I.6.5.
V.2.4. Preparao dos frascos
Preparar solues das substncias qumicas de ensaio e de referncia, em lotes separados, em meio mineral, com
uma concentrao, em geral, de 100 mg de substncia qumica/l, para dar pelo menos 50-100 mg de CTeO/l,
utilizando as solues de reserva.
Calcular o valor de CTeO com base na formao de sais de amnio, a no ser que se preveja a existncia de
nitrificao, caso em que o clculo dever basear-se na formao de nitrato (ver apndice 2.2).
Determinar os valores do pH e, se necessrio, ajust-los a 7,4 0,2.
As substncias pouco solveis devem ser adicionadas numa fase posterior (ver adiante).
No caso de se pretender determinar a toxicidade da substncia qumica de ensaio, preparar outra soluo em
meio mineral, contendo as substncias qumicas de ensaio e de referncia em concentraes idnticas s das
solues individuais.
Se for necessrio efectuar a medio do consumo fsico-qumico de oxignio, preparar uma soluo da
substncia qumica de ensaio, normalmente na concentrao de 100 mg de CTeO/l, previamente esterilizada
por adio de uma substncia txica adequada (ver I.6.6).
Introduzir o volume necessrio das solues das substncias de ensaio e de referncia nos frascos
correspondentes, pelo menos em duplicado. Adicionar a outros frascos apenas meio mineral (para os controlos
de inculo) e, se necessrio, a soluo mista das substncias qumicas de ensaio/referncia e a soluo estril.
Se a substncia qumica de ensaio for pouco solvel, adicion-la directamente nesta fase, tomando como base a
massa ou o volume, ou proceder conforme descrito no apndice 3. Adicionar hidrxido de potssio, grnulos
de soda ou outro absorvente aos compartimentos do dispositivo de absoro de CO
2
.
V.2.5. Nmero de frascos numa experincia-tipo
De preferncia:
Frascos 1 e 2: suspenso de ensaio;
Frascos 3 e 4: branco do inculo;
Frasco 5: controlo;
V.2.6. Realizao do ensaio
Deixar que os recipientes atinjam a temperatura desejada e inocular os recipientes adequados com as lamas
activadas preparadas ou com outra fonte de inculo, para se obter uma concentrao de substncias slidas em
suspenso no superior a 30 mg/l. Montar o equipamento, iniciar a agitao, verificar a estanquidade e comear
a medir o consumo de oxignio. Normalmente, no necessria maior ateno do que efectuar as leituras
necessrias e efectuar verificaes dirias para se poder actuar no sentido de se manter a temperatura correcta e
uma agitao adequada.
Calcular o consumo de oxignio a partir das leituras efectuadas a intervalos de tempo regulares e frequentes,
utilizando os mtodos fornecidos pelo fabricante do equipamento. No final da incubao, normalmente
decorridos 28 dias, medir o valor do pH do contedo dos frascos, especialmente no caso de os consumos de
oxignio serem baixos ou superiores ao valor da CTeO
NH4
(para os compostos que contm azoto).
Se necessrio, retirar amostras dos frascos do respirmetro, na fase inicial e na fase final, para anlise do COD
ou da substncia qumica especfica (ver apndice 2.4). No momento da recolha da amostra inicial, garantir que
se conhece o volume da suspenso de ensaio que permanece no frasco. Quando o oxignio consumido por
uma substncia de ensaio que contenha azoto, determinar o acrscimo da concentrao de nitrito e de nitrato
ao longo de 28 dias e calcular a correco decorrente do oxignio consumido por nitrificao (apndice 5).
V.3. RESULTADOS E RELATRIO
V.3.1. Tratamento dos resultados
Dividir o consumo de oxignio (mg) da substncia qumica de ensaio decorrido um determinado perodo
(corrigido em funo do branco de inculo de controlo correspondente ao mesmo perodo) pela massa da
substncia qumica de ensaio utilizada. Deste modo, obtm-se o valor CBO, expresso em mg de oxignio/mg de
substncia qumica de ensaio, ou seja:
CBO=
mg O
2
consumido pela subst: de ensaio mg O
2
consumido pelo branco
_ _
mg de substncia de ensaio no frasco
= mg de O
2
por mg de substncia de ensaio no frasco
Calcula-se a percentagem de biodegradao pela expresso:
% de biodegradao = % CTeO=
CBO mg O
2
=mg de substncia qumica
_ _
CTeO mg O
2
de substncia qumica
_ _ 100
ou pela expresso:
% CQO=
CBO mg O
2
_ _
CQO mg O
2
de substncia qumica
_ _ 100
Note-se que estes dois mtodos no conduziro necessariamente ao mesmo valor, sendo prefervel utilizar o
primeiro.
Utilizar o valor apropriado da CTeO (NH
4
ou NO
3
), consoante se conhea ou se preveja a ocorrncia da
nitrificao (apndice 2.2). Se ocorrer nitrificao mas esta no for completa, calcular a correco decorrente
do oxignio consumido por nitrificao, a partir das variaes na concentrao de nitrito e nitrato (apndice 5).
Quando se fazem determinaes facultativas de carbono orgnico e/ou de substncias qumicas especficas,
calcular a percentagem de degradao conforme descrito no ponto I.7.
Registar todos os resultados nas folhas de dados anexas.
V.3.2. Validade dos resultados
O consumo de oxignio pelo branco de inculo , normalmente, de 20-30 mg de O
2
/l e no dever ser
superior a 60 mg/l em 28 dias. Os valores superiores a 60 mg/l exigem uma anlise crtica dos resultados e das
tcnicas experimentais. Se o valor do pH estiver fora do intervalo 6-8,5 e se o consumo de oxignio pela
substncia qumica de ensaio for inferior a 60 %, o ensaio deve ser repetido com uma concentrao inferior de
substncia qumica de ensaio.
V.3.3. Relatrio
Ver ponto I.8.
V.4. FOLHA DE DADOS
ENSAIO DE RESPIROMETRIA MANOMTRICA
1. LABORATRIO
Nome:
Concentrao da soluo de reserva: ... mg/l
Concentrao inicial no meio, C
o
: ...mg/l
Volume no frasco de ensaio (V): ...ml
CTeO ou CQO: ...mg O
2
/mg de substncia de ensaio (NH
4
, NO
3
)
4. INCULO
Origem: ...
Tratamento efectuado: ...
Pr-condicionamento, se o houver: ...
Concentrao das substncias slidas em suspenso na mistura reaccional: ...mg/l
5. CONSUMO DE OXIGNIO: BIODEGRADABILIDADE
Tempo (das)
0 7 14 21 28
O
2
consu-
mido (mg),
substncia de
ensaio
1
2
a, mdia
O
2
consu-
mido (mg)
branco
3
4
b, mdia
CBO corri-
gida (mg)
(a
1
b
m
)
(a
2
b
m
)
CBO por mg
de substncia
de ensaio
a
1
b
C
o
V
a
2
b
C
o
V
% degradao
CBO
CTeO
100
D
1
(a
1
)
D
2
(a
2
)
Mdia (*)
V = volume de meo no frasco de ensaio.
(*) D
1
e D
2
N.B: Podem ser utilizados esquemas idnticos para a substncia qumica de referncia e para os controlos de
toxicidade.
6. CORRECO PARA A NITRIF1CAO (ver apndice 5)
Dia 0 28 Diferena
i) Concentrao de nitrato (mg N/l) (N)
ii) Equivalente de oxignio (4,57 X N V) (mg)
iii) Concentrao de nitrito (mg N/l) (N)
iv) Equivalente de oxignio (3,43 N X V) (mg)
ii) + iv) Total de equivalente de oxignio
7. ANLISE DO CARBONO (facultativa)
Tempo (dia) Branco mg/l Substncia qumica de ensaio mg/l
0 C
b(o)
C
o
28 (*) C
b(t)
C
t
(*) ou no final da incubao.
% de COD removido = 1
C
t
C
blt
C
o
C
blo
_ _
100
8. SUBSTNCIA QUMICA ESPECFICA (facultativo)
S
b
= concentrao no controlo fsico-qumico (estril) decorridos 28 dias,
S
a
= concentrao no frasco inoculado decorridos 28 dias,
% de biodegradao =
S
b
S
a
S
b
100
9. DEGRADAO ABIT1CA (facultativo)
a = consumo de oxignio em frascos estreis decorridos 28 dias (mg)
consumo de oxignio por mg de substncia qumica de ensaio =
a 100
C
o
V
(ver seces 1 e 3),
a 100
C
o
V CTeO
PARTE VI. ENSAIO EM FRASCO FECHADO (mtodoC.4-E)
VI.1. PRINCPIO DO MTODO
Faz-se a inoculao da soluo da substncia qumica de ensaio em meio mineral, normalmente na
concentrao de 2-5 mg/l, utilizando um nmero relativamente pequeno de microorganismos provenientes de
uma populao mista e mantm-se em frascos fechados, completamente cheios, ao abrigo da luz e a uma
temperatura constante. Acompanha-se a degradao pela anlise do oxignio dissolvido ao longo de um
perodo de 28 dias. A quantidade de oxignio consumido pela substncia qumica de ensaio, corrigida em
funo do consumo paralelo do branco de inculo, exprime-se em percentagem dos valores CTeO ou CQO.
VI.2. DESCRIO DO MTODO
VI.2.1. Equipamento
a) Frascos para CBO com rolhas de vidro, por exemplo, com a capacidade de 250-300 ml;
b) Banho ou incubador, para manter os frascos a uma temperatura constante ( 1
o
C ou mais precisa), ao
abrigo da luz;
c) Frascos de vidro grandes (2-5 1) para a preparao dos meios e para enchimento dos frascos para CBO;
d) Elctrodo de oxignio e medidor, ou equipamento e reagentes para a titulao de Winkler.
VI.2.2. Preparao do meio mineral
Para a preparao da soluo de reserva ver ponto I.6.2.
Misturar 1 ml das solues (a) a (d) e ajustar o volume a 1 litro com gua de diluio.
VI.2.3. Preparao do inculo
O inculo normalmente obtido dum efluente secundrio duma estao de tratamento ou duma unidade
laboratorial, que recebe predominantemente esgotos domsticos. Uma origem alternativa para o inculo a
gua de superfcie. Usa-se normalmente de uma gota (0,05 ml) a 5 ml de filtrado por litro de meio. Podem ser
necessrias vrias tentativas para se descobrir o volume ptimo de dado efluente (ver pontos I.6.4.2 e I.6.5).
VI.2.4. Preparao dos frascos
Arejar fortemente o meio mineral durante pelo menos 20 minutos. Efectuar cada srie de ensaios com meio
mineral proveniente do mesmo lote. De um modo geral, o meio estar pronto para utilizao depois de ter
estado em repouso durante 20 horas, temperatura de ensaio. Determinar a concentrao do oxignio
dissolvido para efeitos de controlo; esse valor deve ser de aproximadamente 9 mg/l temperatura de 20
o
C.
Efectuar todas as operaes de transferncia e de enchimento de meio saturado com ar sem formao de
bolhas, por exemplo, utilizando sifes.
Paralelamente, preparar outros grupos de frascos para CBO, para a determinao das substncias qumicas de
ensaio e de referncia em sries experimentais simultneas. Preparar um nmero suficiente de frascos para
CBO, incluindo os brancos de inculo, de modo que possam efectuar-se as medies de consumo de oxignio,
pelo menos em duplicado, com os intervalos de ensaio desejados, por exemplo, decorridos 0, 7, 14, 21 e 28
dias. Para se assegurar a identificao do perodo dos 10 dias, podem ser necessrios mais frascos.
Adicionar meio mineral completamente arejado aos frascos grandes de modo que estes fiquem cheios at um
tero. Adicionar depois quantidade suficiente das solues de reserva da substncia qumica de ensaio e da
substncia qumica de referncia a frascos grandes distintos, de modo que a concentrao final das substncias
qumicas no seja normalmente superior a 10 mg/l. No adicionar nenhuma substncia qumica ao branco de
controlo do meio, contido noutro frasco grande.
Para no se limitar a actividade do inculo, garantir que a concentrao do oxignio dissolvido no desa
abaixo de 0,5 mg/l nos frascos para CBO. Isto limita a concentrao da substncia qumica de ensaio a cerca de
2 mg/l. Contudo, nos casos de compostos dificilmente degradveis e dos que tm um valor de CTeO baixo,
pode prever-se 5-10 mg/l. Em alguns casos, aconselhvel efectuar uma srie de experincias paralelas, com a
substncia qumica de ensaio em duas concentraes diferentes, por exemplo, 2 e 5 mg/l. Normalmente,
calcula-se o valor da CTeO com base na formao de sais de amnio mas, se se souber que h nitrificao ou se
esta for previsvel, efectua-se o clculo com base na formao de nitrato (CTeO
NO3
: ver apndice 2.2). Todavia,
havendo nitrificao mas no sendo esta completa, efectua-se a correco em funo das variaes da
concentrao de nitrito e de nitrato, determinadas por anlise (ver apndice 5).
No caso de se pretender investigar a toxicidade da substncia qumica de ensaio (por exemplo, no caso de se ter
verificado previamente um fraco valor de biodegradabilidade), necessria outra srie de frascos.
Preparar outro frasco grande para meio mineral arejado (cheio at um tero do seu volume), mais a substncia
qumica de ensaio e a substncia qumica de referncia com os valores finais de concentrao, normalmente
idnticos aos dos outros frascos grandes.
Inocular as solues dos frascos grandes com efluente secundrio (uma gota, ou cerca de 0,05 ml, at 5 ml/l)
ou de outra origem, tal como a gua dos rios (ver ponto I.6.4.2). Finalmente, ajustar o volume das solues
com meio mineral arejado, utilizando um tubo que atinja o fundo do frasco de modo a obter-se uma mistura
adequada.
VI.2.5. Nmero de frascos numa experincia-tipo
Numa experincia-tipo utilizam-se os frascos seguintes:
pelo menos 10 contendo a substncia qumica de ensaio e o inculo (suspenso de ensaio),
pelo menos 10 contendo apenas inculo (branco de inculo),
pelo menos 10 contendo a substncia qumica de referncia e o inculo (controlo),
e, se necessrio, seis frascos contendo a substncia qumica de ensaio, a substncia qumica de referncia e
o inculo (controlo de toxicidade). Contudo, para se assegurar a identificao do perodo dos 10 dias,
ser necessrio utilizar o dobro dos frascos.
VI.2.6. Realizao do ensaio
Distribuir imediatamente cada soluo preparada pelo respectivo grupo de frascos para CQO, utilizando um
tubo que mergulhe at um quarto do fundo (e no no fundo) do frasco grande, de modo que todos os frascos
para CQO fiquem completamente cheios. Bater suavemente para remover quaisquer bolhas de ar. Verificar, logo
no momento inicial, a existncia de oxignio dissolvido nos frascos, recorrendo a anlises, pelos mtodos de
Winkler ou do elctrodo. O contedo dos frascos pode ser conservado para anlise posterior pelo mtodo de
Winkler, adicionando sulfato de mangans (II) e hidrxido de sdio (o primeiro o reagente de Winkler).
Armazenar os frascos cuidadosamente tapados, contendo o oxignio retido na forma de xido de mangans
(III) hidratado, que castanho, ao abrigo da luz e temperatura de 10
o
C-20
o
C, durante um perodo inferior a
24 horas, antes de continuar com os outros passos do mtodo de Winkler. Rolhar os restantes frascos em
duplicado, garantindo que no contm bolhas de ar, e incubar temperatura de 20
o
C, ao abrigo da luz. Cada
srie deve ser acompanhada por uma outra srie paralela completa, para as determinaes no branco de meio
inoculado. De cada srie, retirar pelo menos dois frascos idnticos para anlise do oxignio dissolvido, a
intervalos de tempo regulares (pelo menos semanalmente) durante os 28 dias de incubao.
A amostragem semanal deve permitir avaliar a remoo percentual num perodo de 14 dias, ao passo que as
amostras recolhidas cada trs, quatro dias devem permitir identificar o perodo dos 10 dias, o que exigir o
dobro dos frascos.
Para as substncias de ensaio que contm azoto, devem ser feitas correces que dem conta do consumo de
oxignio provocado por qualquer fenmeno de nitrificao que possa ocorrer. Para efectuar esta operao,
recorrer ao mtodo do elctrodo de O
2
para a determinao da concentrao do oxignio dissolvido e, depois,
retirar uma amostra do frasco para a CBO, para a anlise de nitrito e de nitrato. A partir do acrscimo na
concentrao de nitrito e de nitrato, calcular o oxignio utilizado (ver apndice 5).
VI.3. RESULTADOS E RELATRIO
VI.3.1. Tratamento dos resultados
Calcular primeiro a CBO que se manifesta aps cada perodo, subtraindo a reduo de oxignio (mg de O
2
/l) no
branco de inculo do valor determinado para a substncia qumica de ensaio. Dividir esta reduo corrigida
pela concentrao (mg/l) da substncia qumica de ensaio, para se obter o valor CBO especfico, em miligrama
de oxignio por miligrama de substncia qumica de ensaio. Calcular a percentagem de biodegradabilidade,
dividindo o valor CBO especfico pelo valor CTeO especfico (calculado em conformidade com o apndice 2.2)
ou pelo valor CQO (determinado por anlise, ver apndice 2.3) ou seja:
CBO=
mg O
2
2
_ _
= mg de O
2
por mg de substncia de ensaio
% de degradao =
CBO mg O
2
=mg de substncia de ensaio
_ _
CTeO mg O
2
=mg de substncia de ensaio
_ _ 100
ou
% de degradao =
CBO mg O
2
=mg de substncia ensaio
_ _
CQO mg O
2
=mg de substncia ensaio
_ _ 100
Note-se que estes dois mtodos no conduziro necessariamente ao mesmo valor, sendo prefervel utilizar o
primeiro.
Para as substncias de ensaio que contm azoto, utilizar os valores CTeO adequados (NH
4
ou NO
3
) conforme
exista ou se admita que possa ocorrer nitrificao (apndice 2.2). Se houver nitrificao, no sendo esta
completa, calcular a correco decorrente do oxignio consumido por nitrificao, a partir da variao na
concentrao de nitrito e de nitrato (apndice 5).
VI.3.2. Validade dos resultados
A reduo do oxignio no branco de inculo no deve exceder 1,5 mg de oxignio dissolvido/l decorridos 28
dias. Valores superiores a esse exigem uma anlise cuidadosa das tcnicas experimentais. A concentrao de
oxignio residual nos frascos de ensaio no dever descer abaixo de 0,5 mg/litro em nenhuma ocasio. Esses
nveis baixos de oxignio apenas so vlidos se o mtodo utilizado para a determinao do oxignio dissolvido
permitir medir tais nveis com exactido.
VI.3.3. Relatrio
Ver I.8.
VI.4. FOLHA DE DADOS
Como exemplo de folha de dados apresenta-se a que se segue.
ENSAIO DO FRASCO FECHADO
1. LABORATRIO
Nome: ...
Concentrao da soluo de reserva: ... mg/l
Concentrao inicial no frasco: ... mg/l
CTeO ou CQO: mg 0
2
/mg de substncia de ensaio
4. INCULO
Origem: ...
Tratamento efectuado: ...
Pr-condicionamento, se o houver: ...
Concentraes das substncias slidas em suspenso na mistura reaccional: ... ml/l
5. DETERMINAES DO OD
Mtodo: Winkler/elctrodo.
Anlises em frasco
Tempo de incubao (d)
DO (mg/l)
0 n
1
n
2
Branco (sem sub-
stncia qumica)
1 C
1
2 C
2
Mdia
m
b =
C
1
C
2
2
Substncia de
ensaio
1 a
1
2 a
2
Mdia
m
t =
a
1
a
2
2
NB: Podem ser utilizados esquemas idnticos para a substncia qumica de referncia e para os controlos de
toxicidade
6. CORRECO DEVIDA A NITRIFICAO (ver apndice 5)
Tempo de incubao (d) 0 n
1
n
2
n
3
i) Concentrao de nitrato (mg N/l)
ii) Variao na concentrao de nitrato (mg N/l)
iii) Equivalente de oxignio (mg/l)
iv) Concentrao de nitrito (mg N/l)
v) Variao na concentrao de nitrito (mg N/l)
vi) Equivalente de oxignio (mg/l N/l)
iii) + vi) Equivalente de oxignio total (mg/l)
7. REDUO DO OD: % DE DEGRADAO
Reduo decorridos n dias (mg/l))
n
1
n
2
n
3
Frasco 1: (m
to
m
tx
) (m
bo
m
bx
)
Frasco 2: (m
to
m
tx
) (m
bo
m
bx
)
Frasco 1:
% D
1 =
m
to
m
tx
m
bo
m
bx

conc: de ensaio CTeO da subs: qum:
100
Frasco 2:
% D
2 =
m
to
m
tx
m
bo
m
bx

conc: de ensaio CTeO da subs: qum
100
% D mdia (*) =
D
1
D
2
2
(*) No retomar o valor mdio, se existirem diferenas considerveis entre os duplicados.
m
to
= valor no frasco de ensaio no tempo 0,
m
tx
= valor no frasco de ensaio no tempo x,
m
bo
= valor mdio do branco no tempo 0,
m
bx
= valor mdio do branco no tempo x.
Aplicar tambm a correco decorrente da nitrificao, com base em iii) + vi) da seco 6.
8. REDUES DE OD NO BRANCO
Consumo de oxignio no branco: (m
bo
m
b28
) mg/l. Este consumo importante para a validade do
ensaio. Deve ser inferior a 1,5 mg/l.
PARTE VII. ENSAIO DE MITI (mtodo C.4-F)
VII.1. PRINCPIO DO MTODO
Mede-se automaticamente a absoro de oxignio por uma soluo ou suspenso agitada, contendo a
substncia qumica de ensaio num meio mineral, inoculada com microorganismos inadaptados e especialmente
desenvolvidos, durante um perodo de 28 dias, num respirmetro encerrado, ao abrigo da luz e temperatura
de 25 1
o
C. A absoro do dixido de carbono libertado faz-se com cal sdica. Exprime-se a
biodegradabilidade pela percentagem do consumo de oxignio (corrigida em funo do consumo do branco)
em relao ao consumo terico (CTeO). Calcula-se tambm a percentagem de biodegradabilidade primria, a
partir de uma anlise qumica especfica complementar, efectuada no incio e no fim da incubao, por
exemplo, por anlise do COD.
VII.2. DESCRIO DO MTODO
VII.2.1. Equipamento
a) Medidor de CBO electroltico automtico ou respirmetro, normalmente equipado com seis frascos de
300 ml cada um e tambm equipado com recipientes para o absorvente de CO
2
;
b) Sal. de temperatura constante e/ou banho temperatura de 25 1
o
C ou mais precisa;
c) Dispositivo de filtrao por membranas (facultativo);
d) Analisador de carbono (facultativo).
VII.2.2. Preparao do meio mineral
Preparar as seguintes solues de reserva, utilizando reagentes de qualidade analtica e gua (ponto I.6.1):
a) Dihidrogeno-ortofosfato monopotssico, KH
2
PO
4
8,50 g
Monohidrogeno-ortofosfato dipotssico, K
2
HPO
4
21,75 g
Monohidrogeno-ortofosfato dissdico dodecahidratado, Na
2
HPO
4
12 H
2
O 44,60 g
Cloreto de amnio, NH
4
Cl 1,70 g
Dissolver em gua e ajustar o volume a 1 litro.
O valor do pH da soluo deve ser de 7,2;
b) Sulfato de magnsio heptahidratado, MgSO
4
7 H
2
O 22,50 g
Dissolver em gua e ajustar o volume a 1 litro;
c) Cloreto de clcio anidro, CaCl
2
27,50 g
Dissolver em gua e ajustar o volume a 1 litro;
d) Cloreto de ferro (III) hexahidratado, FeCl
3
. 6 H
2
O 0,25 g
Dissolver em gua e ajustar o volume a 1 litro.
Retirar 3 ml de cada uma das solues a), b), c) e d) e ajustar o volume a 1 litro.
VII.2.3. Preparao do inculo
Recolher amostras recentes em pelo menos dez locais, sobretudo em reas onde sejam utilizados e
descarregados diversos produtos qumicos. Em locais tais como as estaes de tratamento de guas residuais,
estaes de tratamento de esgotos industriais, rios, lagos, mar, recolher 1 litro de amostras de lamas, solo
superficial, gua, etc., e misturar tudo muito bem. Aps a remoo dos materiais flutuantes, deixar repousar e
ajustar o pH do sobrenadante a 7 1, utilizando hidrxido de sdio ou cido fosfrico.
Utilizar um volume adequado de sobrenadante filtrado para encher um recipiente prprio para lamas activadas
com dispositivo de enchimento e esvaziamento. Arejar o lquido durante cerca de 23,5 horas. Trinta minutos
aps a interrupo do arejamento, rejeitar cerca de um tero do volume total do sobrenadante e adicionar igual
volume de uma soluo (pH 7) contendo glucose, peptona e ortofosfato monopotssico de concentrao 0,1 %
em qualquer destes componentes, ao material sedimentado, e recomear o processo de arejamento. Repetir este
procedimento uma vez por dia. A unidade de lamas deve operar de acordo com as seguintes boas prticas: os
efluentes devero ser lmpidos, a temperatura dever ser mantida a 25 2
o
C e o pH dever ser 7 1, a
sedimentao das lamas dever ser boa, arejamento suficiente para manter a mistura permanentemente em
condies aerbias, presena de protozorios, devendo testar-se a actividade das lamas por comparao com
uma substncia de referncia, pelo menos cada trs meses. No utilizar lamas como inculo sem que tenha
decorrido pelo menos um ms de operao, mas no mais do que quatro meses. Seguidamente, colher
amostras em pelo menos 10 locais a intervalos regulares, uma vez em cada trs meses.
Para se manter a mesma actividade nas lamas frescas e nas antigas, misturar o sobrenadante filtrado de lamas
activadas em utilizao com igual volume de sobrenadante filtrado de uma mistura recentemente obtida a
partir de dez origens e fazer a cultura do caldo combinado conforme anteriormente descrito. Recolher as lamas
para utilizao como inculo decorridas 18-24 horas sobre a alimentao da unidade de lamas.
VII.2.4. Preparao dos frascos
Preparar os seis frascos seguintes:
N.
o
1: substncia qumica de ensaio em gua de diluio, a 100 mg/l
N.
os
2, 3 e 4: substncia qumica de ensaio em meio mineral, a 100 mg/l
N.
o
5: substncia qumica de referncia (por exemplo, anilina) em meio mineral, a 100 mg/l
N.
o
6: apenas meio mineral
Adicionar directamente as substncias qumicas de ensaio pouco solveis, com base na sua massa ou volume
ou proceder conforme descrito no apndice 3, com a excepo de no ser conveniente utilizar nem solventes
nem agentes emulsionantes. Adicionar o absorvente de CO
2
a todos os frascos, colocando-o nos recipientes
especiais existentes. Ajustar o valor do pH a 7,0, nos frascos n.
os
2, 3 e 4.
VII.2.5. Realizao do ensaio
Inocular os frascos n.
os
2, 3 e 4 (suspenses de ensaio), n.
o
5 (controlo de actividade) e n.
o
6 (branco de inculo)
com um pequeno volume de inculo, para se obter uma concentrao de slidos em suspenso de 30 mg/l.
No se adiciona nenhum inculo ao frasco n.
o
1, que serve como controlo abitico. Montar o equipamento,
verificar a sua estanquidade, pr os agitadores em movimento e comear a medio do consumo de oxignio
ao abrigo da luz. Verificar diariamente a temperatura, os agitadores e o registador coulombimtrico do
consumo de oxignio, e registar quaisquer modificaes de cor no contedo dos frascos. Fazer a leitura dos
consumos de oxignio referentes aos seis frascos directamente, por um mtodo apropriado, por exemplo a
partir dos seis grficos do registador das curvas de CBO. No final da incubao, normalmente decorridos 28
dias, medir o valor do pH do contedo dos frascos e determinar a concentrao residual da substncia qumica
de ensaio e de qualquer produto intermedirio e, no caso de substncias solveis na gua, a concentrao do
COD (apndice 2.4). Tomar precaues especiais no caso das substncias qumicas volteis. No caso de se
prever nitrificao, determinar a concentrao de nitrato e de nitrito, se possvel.
VII.3. RESULTADOS E RELATRIO
VII.3.1. Tratamento dos resultados
Dividir o consumo de oxignio (mg) da substncia qumica de ensaio, correspondente a um determinado
perodo, pela massa da substncia qumica de ensaio utilizada, corrigindo aquele com o valor referente ao
branco de inculo de controlo correspondente ao mesmo perodo. Obtm-se assim a CBO, expressa em mg de
oxignio/mg de substncia qumica de ensaio, ou seja:
CBO=
mg O
2
2
_ _
= mg de O
2
/mg de substncia de ensaio
Deste modo, obtm-se a percentagem de biodegradao pela expresso:
% biodegradaco = % CTeO=
CBO mg O
2
_ _
CTeO mg O
2
_ _ 100
Para misturas, calcular a CTeO por anlise elementar, tal como para um composto nico. Utilizar o valor de
CTeO adequado (CTeO
NH4
ou CTeO
NO3
) consoante no haja nitrificao ou esta seja completa (apndice 2.2).
Todavia, se houver nitrificao mas se esta for incompleta, efectuar uma correco decorrente do oxignio
consumido por nitrificao, calculado a partir das variaes nas concentraes de nitrito e de nitrato (apn-
dice 5).
Calcular a percentagem de biodegradao primria a partir das perdas da substncia qumica especfica
(original) (ver ponto I.7.2).
D
t =
S
b
S
a
S
b
100 %
Se tiver havido uma perda de substncia qumica de ensaio no frasco n.
o
1, medir a variao fsico-qumica,
registar esse facto e utilizar a concentrao da substncia qumica de ensaio (Sb) decorridos 28 dias, nesse
frasco, para calcular a percentagem de biodegradao.
No caso de se efectuarem determinaes de COD (facultativas), calcular a percentagem de biodegradao final
pela expresso:
D
t = 1
C
t
C
bt
C
o
C
bo
_ _
100 %
conforme descrito no ponto I.7.1. Se tiver havido uma perda de COD no frasco n.
o
1, ao medir-se a remoo
por via fsico-qumica, deve utilizar-se a concentrao de GOD nesse frasco para calcular a percentagem de
biodegradao.
Registar todos os resultados na folha de dados anexa.
VII.3.2. Validade dos resultados
O oxignio consumido pelo branco de inculo , normalmente, de 20-30 mg de O
2
/l e no dever ser superior
a 60 mg/l em 28 dias. Os valores superiores a 60 mg/l exigem uma anlise crtica dos resultados e das tcnicas
experimentais. No caso de o valor do pH estar fora do intervalo 6-8,5 e se o oxignio consumido pela
substncia de ensaio for inferior a 60 %, o ensaio dever ser repetido com uma concentrao inferior de
substncia qumica de ensaio.
Se a percentagem de degradao da anilina, calculada a partir do consumo de oxignio, no exceder 40 %,
decorridos sete dias, e 65 %, decorridos catorze dias, o ensaio no deve ser considerado vlido.
VII.3.3. Relatrio
Ver ponto I.8.
VII.4. FOLHA DE DADOS
ENSAIO DO MITI (I)
1. LABORATRIO
Nome:
Concentrao inicial no meio, C
o
: mg/l da substncia
Volume da mistura reaccional: ml
CTeO: mg O
2
/l
4. INCULO
Locais de colheita das amostras de lama:
1. ... 6. ...
2. ... 7. ...
3. ... 8. ...
4. ... 9. ...
5. ... 10. ...
Concentrao de slidos em suspenso nas lamas activadas depois de aclimatizao com guas residuais
sintticas = mg/l,
Volume de lamas activadas por litro de meio final = ml,
Concentrao de lamas no meio final = mg/l.
5. CONSUMO DE OXIGNIO: BIODEGRADABILIDADE
Tipo de respirmetro utilizado:
Tempo (dias)
0 7 14 21 28
O
2
consumido (mg) pela
substncia de ensaio
a
1
a
2
a
3
O
2
consumido (mg) pelo
branco
b
O
2
consumido (mg) cor-
rigido
(a
1
b)
(a
2
b)
(a
3
b)
CBO por mg de substn-
cia qumica de ensaio
a b
C
o
V
Frasco 1
Frasco 2
Frasco 3
Tempo (dias)
0 7 14 21 28
% de degradao
CBO
CTeO
100
1
2
3
mdia (*)
(*) No retomar o valor mdio, se existirem diferenas considerveis entre os duplicados.
NB: Podem ser utilizados esquemas idnticos para a substncia qumica de referncia.
6. ANLISE DE CARBONO (opcional)
Frasco
COD
% de COD remo-
vido
Mdia
Medido Corrigido
gua + substncia de
ensaio
a
Lamas + substncia de
ensaio
b
1
b
1
c
ensaio
b
2
b
2
c
ensaio
b
3
b
3
c
Branco de controlo c
% de COD removido
a
1
b c
a
100
7. DADOS ANALTICOS ESPECFICOS DA SUBSTNCIA QUMICA
Quantidade residual de substncia de ensaio
no final do teste
% de degradao
ensaio em branco com gua S
b
meio inoculado
S
a1
S
a2
S
a3
% de degradao =
S
b
S
a
S
b
100
Calcular a percentagem de degradao para os frascos a
1
, a
2
e a
3
, respectivamente.
8. OBSERVAES
Deve anexar-se a curva de CBO em funo do tempo, se existir.
Apndice 1
ABREVIATURAS E DEFINIES
OD: O oxignio dissolvido (mg/l) a concentrao do oxignio dissolvido numa amostra aquosa.
CBO: A carncia bioqumica de oxignio (g) a quantidade de oxignio consumida pelos microorganismos ao
metabolizarem um composto de ensaio; tambm se exprime em g de oxignio consumido por g de composto de
ensaio (ver mtodo C.5).
CQO: A carncia qumica de oxignio (g) a quantidade de oxignio consumida durante a oxidao de um composto de
ensaio com dicromato cido a quente; permite medir a quantidade de matrias oxidveis presentes; tambm se
exprime em g de oxignio consumido por g de composto de ensaio (ver mtodo C.6).
COD: O carbono orgnico dissolvido o carbono orgnico presente na soluo ou que passa atravs de um filtro de
0,45 microns ou que permanece no sobrenadante aps centrifugao a 40 000 m.s
-2
( 4 000 g) durante 15
minutos.
CTeO: A carncia terica de oxignio (mg) a quantidade de oxignio necessria para oxidar completamente uma
substncia qumica; calcula-se a partir da frmula molecular (ver apndice 2.2) e tambm se exprime em mg de
oxignio necessrio por mg de composto de ensaio.
CO
2
Te: O dixido de carbono terico (mg) a quantidade calculada do dixido de carbono que seria produzido a partir
do teor de carbono medido ou conhecido do composto de ensaio, quando totalmente mineralizado; tambm se
exprime em mg de dixido de carbono libertado por mg de composto de ensaio.
COT: O carbono orgnico total de uma substncia a soma do carbono orgnico em soluo e em suspenso.
CI: Carbono inorgnico.
CT: Carbono total, a soma do carbono orgnico e inorgnico presente na amostra.
Biodegradao primria:
a alterao da estrutura qumica de uma substncia efectuada por aco biolgica, tendo como resultado a perda de
propriedades especficas dessa substncia.
Biodegradao total (aerbia):
o nvel de degradao alcanado quando o composto de ensaio totalmente utilizado pelos microorganismos, produzindo
dixido de carbono, gua, sais minerais e novos constituintes celulares microbianos (biomassa).
Facilmente biodegradvel:
uma classificao arbitrria para as substncias qumicas que passaram nos diversos ensaios especficos de despiste da
biodegradabilidade total; dado que esses ensaios so to exigentes, assumiu-se que essas substncias sero biodegradadas
fcil e completamente em ambiente aqutico, sob condies aerbias.
Intrinsecamente biodegradvel:
uma classificao de substncias qumicas relativamente s quais existem provas inequvocas de biodegradao (primria e
total) num qualquer ensaio reconhecido de biodegradabilidade.
Tratveis:
a possibilidade de certos compostos serem removidos durante o tratamento biolgico de guas residuais sem afectarem
desfavoravelmente o funcionamento normal do processo de tratamento. De um modo geral, os compostos facilmente
biodegradveis so tratveis mas o mesmo no sucede com todos os compostos intrinsecamente biodegradveis. Tambm
podem ser utilizados processos abiticos.
Tempo de latncia:
o tempo decorrido desde a inoculao, num ensaio de reduo gradual, at que a percentagem de degradao tenha
aumentado pelo menos at 10 %. O tempo de latncia normalmente bastante varivel e pouco reprodutvel.
Tempo de degradao:
o tempo decorrido desde o final do tempo de latncia at ao momento em que se atinge 90 % do nvel mximo de
degradao.
Perodo dos dez dias:
o perodo de dez dias que se segue imediatamente a um nvel de degradao de 10 %.
Apndice 2
CLCULO E DETERMINAO DE PARMETROS CARACTERSTICOS ADEQUADOS
Consoante o mtodo escolhido, assim sero necessrios determinados parmetros caractersticos. Na seco seguinte
descreve-se o modo de obter esses valores. A utilizao desses parmetros foi descrita em cada um dos mtodos.
1. Teor de carbono
Calcula-se o teor de carbono a partir da composio elementar conhecida ou determina-se por anlise elementar da
substncia de ensaio.
2. Carncia terica de oxignio (CTeO)
A carncia terica de oxignio (CTeO) pode ser calculada se for conhecida a composio elementar ou pode ser
determinada por anlise elementar. Para o seguinte composto genrico
C
c
H
h
Cl
cl
N
n
Na
na
O
o
P
p
S
s
sera:
sem nitrificao,
ThOD
NH4 =
16 2 c 1=2 h cl 3 n 3 s 5=2 p 1=2 na o
Massa molecular
mg/mg
ou, com nitrificao,
ThOD
NO3 =
16 2 c 1=2 h cl 5=2 n 3 s 5=2 p 1=2 na o
Massa molecular
mg/mg
3. Carncia qumica de oxignio (CQO)
A carncia qumica de oxignio (CQO) determina-se em conformidade com o mtodo C.6.
4. Carbono orgnico dissolvido (COD)
Por definio, o carbono orgnico dissolvido (COD) o carbono orgnico de qualquer substncia qumica ou de
qualquer mistura em gua que no relido por um filtro de 0,45 microns.
Retiram-se amostras dos recipientes de ensaio e filtram-se imediatamente no equipamento de filtrao, utilizando um
filtro de membrana adequado. Os primeiros 20 ml (esta quantidade pode ser reduzida quando se utilizam filtros
pequenos) de filtrado so rejeitados. Retm-se volumes de 10-20 ml ou inferiores, se forem injectados (volume
dependente da quantidade necessria para o analisador de carbono), para anlise de carbono. Determina-se a
concentrao de COD por meio de um analisador de carbono orgnico capaz de medir com exactido uma
concentrao de carbono equivalente ou inferior a 10 % da concentrao do COD inicial utilizada no ensaio.
As amostras filtradas que no possam ser analisadas no prprio dia do trabalho podem ser conservadas num
frigorfico temperatura de 2-4
o
C, durante 48 horas, ou a temperaturas inferiores a 18
o
C durante perodos mais
longos.
Observaes:
Os filtros de membrana so frequentemente impregnados com agentes tensioactivos para hidrofilizao. Deste modo,
o filtro pode conter at alguns mg de carbono orgnico solvel que pode interferir com as determinaes de
biodegradabilidade. Os agentes tensioactivos e outros compostos orgnicos solveis so removidos dos filtros por
fervura em gua desionisada durante trs perodos de uma hora. Depois, os filtros podem ser mantidos em gua
durante uma semana. No caso de se utilizarem embalagens de filtros descartveis, cada lote deve ser verificado para se
confirmar que no liberta carbono orgnico solvel.
A substncia qumica de ensaio pode ser retida por adsoro, dependendo do tipo de filtro de membrana. Por esse
motivo, aconselhvel garantir que a substncia qumica de ensaio no retida pelo filtro.
Em vez da filtrao, pode recorrer-se a centrifugao a 40 000 m.s
-2
(4 000 g), durante 15 minutos, para diferenciar o
COD do COT. Este mtodo no fivel para uma concentrao inicial < 10 mg de COD/l uma vez que nem todas as
bactrias so removidas, nem o carbono que faz parte do plasma bacteriano redissolvido.
BIBLIOGRAFIA
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Oll.
control Fed., Oxygen Demand, 1965, p. 65.
Wagner, R. Von Wasser, 1976, Vol. 46, 139.
DIN-Entwurf 38409 Teil 41 Deutsche Einhcitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersu-
chung, Summarische Wirkungs- und Stoffkenngren (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbe-
darfs (CSB) (H 41), Normenausschu Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut fr Normung e.v.
Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, Vol. 13 (1),
169.
Apndice 3
AVALIAO DA BIODEGRADABILIDADE DE SUBSTNCIAS POUCO SOLVEIS
Nos ensaios de biodegradabilidade com substncias pouco solveis necessrio prestar especial ateno aos aspectos que se
seguem.
Embora os lquidos homogneos raramente apresentem problemas de amostragem, recomenda-se que se faa a
homogeneizao das substncias slidas por meios adequados, para evitar erros devidos a heterogeneidade. necessrio
tomar cuidados especiais quando se pretendem amostras representativas de alguns miligramas, obtidas a partir de misturas
de substncias qumicas ou de outras substncias com grandes quantidades de impurezas.
Podem utilizar-se diversas formas de agitao durante os ensaios. necessrio ter a precauo de utilizar apenas a agitao
suficiente para manter as substncias qumicas dispersas e para evitar sobreaquecimento, excessiva formao de espuma e
foras de corte excessivas.
Pode ser utilizado um emulsionante que produza uma disperso estvel da substncia qumica. No deve ser txico para as
bactrias e no deve ser biodegradado ou provocar espuma nas condies de ensaio.
Aos solventes, aplica-se o mesmo critrio dos emulsionantes.
No se recomenda a utilizao de veculos slidos para as substncias de ensaio no estado slido embora possam ser
adequados para as substncias oleosas.
No caso de se utilizarem substncias auxiliares, tais como os emulsionantes, solventes e veculos, deve efectuar-se tambm
uma experincia com um branco que contenha a substncia auxiliar.
Pode ser utilizado qualquer um dos trs ensaios respiromtricos de CO
2
, CBO e MITI, para estudar a biodegradabilidade de
compostos pouco solveis.
BIBLIOGRAFIA
de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, Vol. 16, 833.
Gerike, P. The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, Vol. 13, 169.
Apndice 4
AVALIAO DA BIODEGRADABILIDADE DE SUBSTNCIAS QUMICAS QUE POSSAM SER TXICAS PARA
O INCULO
Quando se submete uma substncia qumica a um ensaio de biodegradabilidade fcil e esta no , aparentemente,
biodegradvel, recomenda-se o procedimento seguinte, no caso de se pretender estabelecer uma distino entre inibio e
inrcia (Reynolds et al., 1987).
Para os ensaios de toxicidade e de biodegradao devem ser utilizados inculos semelhantes ou idnticos.
Para se avaliar a toxicidade de substncias qumicas de ensaio atravs de ensaios de biodegradabilidade fcil, sugere-se a
aplicao de um ou de uma combinao do mtodo de inibio da taxa respiratria das lamas (ensaio de inibio da
respirao em lamas activadas Dir 88/302/CEE), do CBO e/ou da inibio do crescimento.
No caso de se pretender evitar a inibio decorrente da toxicidade, sugere-se que as concentraes da substncia de ensaio
utilizadas no ensaio de biodegradabilidade fcil sejam inferiores a 1/10 dos valores CE
50
(ou inferiores aos valores de CE
20
),
obtidos em ensaios de toxicidade. No provvel que os compostos com um valor de CE
50
superior a 300 mg/l possuam
efeitos txicos em ensaios de biodegradabilidade imediata.
provvel que valores de CE
50
inferiores a 20 mg/l causem grandes problemas na continuao dos testes. Devem ser
utilizadas baixas concentraes de ensaio, sendo necessrio recorrer ao ensaio rigoroso e sensvel do frasco fechado ou
utilizar material marcado com
14
C. Em alternativa, um inculo aclimatizado pode permitir a utilizao de concentraes
mais elevadas da substncia de ensaio. Contudo, neste ltimo caso, perde-se o critrio especfico do ensaio de
biodegradabilidade imediata.
BIBLIOGRAFIA
Reynolds, L. et al. Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, Vol. 16,
2259.
Apndice 5
CORRECO DO CONSUMO DE OXIGNIO DECORRENTE DA INTERFERNCIA POR NITRIFICAO
Os erros provocados por no se considerar a nitrificao na avaliao da biodegradabilidade das substncias de ensaio que
no contm azoto atravs do consumo de oxignio so marginais (no superiores a 5 %), mesmo no caso de a oxidao do
azoto do amnio do meio ocorrer irregularmente, tal como sucede em relao aos recipientes de ensaio e ao branco.
Contudo, para as substncias de ensaio que contm azoto, podem surgir erros graves.
Se houver nitrificao mas esta no for completa, o consumo de oxignio pela mistura reaccional pode ser corrigido em
funo da quantidade de oxignio utilizada para oxidar amnio em nitrito e nitrato, se as variaes de concentrao do
nitrito e do nitrato durante a incubao forem determinadas tendo em conta as equaes seguintes:
2 NH
4
Cl + 3 O
2
= 2 HNO
2
+ 2 HC1 + 2 H
2
O (1)
2 HNO
2
+ O
2
= 2 HNO
3
(2)
Globalmente :
2 NH
4
C1 + 4 O
2
= 2 HNO
3
+ 2 HC1 + 2 H
2
O (3)
A partir da equao (1) verifica-se que o consumo de oxignio por cada 28 g de azoto contido no cloreto de amnio
(NH
4
C1) oxidado a nitrito 96 g, isto , um factor de 3,43 (96/28). De modo idntico, a partir da equao (3), verifica-se
que o consumo de oxignio por cada 28 g de azoto oxidado a nitrato 128 g, isto , traduz-se por um factor de 4,57 (128/
/28).
Uma vez que as reaces so sequenciais, sendo provocadas por espcies caractersticas e diferentes de bactrias, possvel
que a concentrao de nitrito aumente ou diminua; neste ltimo caso, formar-se-ia uma concentrao equivalente de nitrato.
Deste modo, o oxignio consumido na formao de nitrato o acrscimo da concentrao de nitrato multiplicado por 4,57,
ao passo que o oxignio associado formao de nitrito o acrscimo da concentrao de nitrito multiplicado por 3,43 ou,
se houver diminuio da sua concentrao, a perda de oxignio o decrscimo de concentrao multiplicado por - 3,43.
Dito de outro modo:
O
2
consumido na formao de nitrato = 4,57 acrscimo na concentrao de nitrato-N (4)
e
O
2
consumido na formao de nitrito = 3,43 acrscimo na concentrao de nitrito-N (5)
e
perda de O
2
por reaco com nitrito = 3,43 acrscimo na concentrao de nitrito-N (6)
pelo que consumo de
O
2
devido nitrificao = - 3,43 variao da concentrao de nitrito-N + 4,57 acrscimo na concentrao de
nitrato-N
(7)
e, portanto, consumo de
O
2
devido a oxidao de C = consumo total observado consumo devido nitrificao (8)
Em alternativa, se apenas se determinar o azoto oxidado total, o consumo de oxignio devido nitrificao pode considerar-
-se igual, em primeira aproximao, a 4,57 acrscimo do azoto oxidado.
O valor corrigido em funo do consumo de oxignio provocado pela oxidao do carbono ento comparado com o valor
CTeO
NH4
, conforme foi calculado no apndice 2.
C.5. DEGRADAO CARNCIA BIOQUMICA DE OXIGNIO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O objectivo deste mtodo consiste em medir a carncia bioqumica de oxignio (CBO) de substncias orgnicas
slidas ou lquidas.
Os dados elaborados com este ensaio relacionam-se com os compostos solveis em gua; todavia, em princpio
pelo menos, possvel ensaiar tambm compostos volteis e compostos de fraca solubilidade em gua.
O mtodo aplica-se apenas aos materiais de ensaio orgnicos que no sejam inibidores das bactrias nas
concentraes utilizadas no ensaio. No caso de o material de ensaio no ser solvel para valores da
concentrao de ensaio, ser necessrio recorrer a aces especiais tais como a disperso ultra-snica para se
conseguir uma boa disperso do material de ensaio.
A informao sobre a toxicidade do composto qumico pode ser til para a interpretao de resultados
insuficientes e para a seleco das concentraes de ensaio apropriadas.
Define-se a CBO como sendo a massa de oxignio dissolvido necessria para o processo de oxidao
bioqumica de um volume especfico de soluo da substncia sob as condies prescritas.
Os resultados exprimem-se em gramas de CBO por grama de substncia ensaiada.
desejvel a utilizao de uma substncia de referncia adequada para verificao da actividade do inculo.
Inocula-se com microorganismos uma quantidade predeterminada da substncia dissolvida ou dispersa num
meio adequado e bem arejado e depois faz-se a incubao ao abrigo de luz e a uma temperatura ambiente
previamente definida e constante.
Determina-se a CBO pela diferena entre o teor em oxignio dissolvido no incio e no termo do ensaio. A
durao do ensaio deve ser de pelo menos 5 dias e no deve exceder 28 dias.
Numa experincia paralela deve efectuar-se um ensaio em branco sem conter qualquer substncia de ensaio.
A determinao da CBO no pode ser considerada uma determinao vlida da biodegradabilidade de uma
substncia. Este ensaio apenas pode ser considerado como um ensaio de pesquisa preliminar.
Prepara-se uma soluo ou disperso preliminar da substncia para se obter uma concentrao da CBO
compatvel com o mtodo utilizado. Determina-se depois a CBO utilizando qualquer mtodo adequado
nacional ou internacionalmente normalizado.
Calcula-se a CBO existente na soluo preliminar de acordo com o mtodo normalizado seleccionado e
converte-se em gramas de CBO por grama de substncia ensaiada.
3. RELATRIO
O mtodo utilizado dever ser especificado.
O valor da carncia bioqumica de oxignio dever ser uma mdia de pelo menos trs medies vlidas.
Todas as informaes e observaes relevantes para a interpretao dos resultados devem ser descritas,
especialmente no que diz respeito a impurezas, estado fsico, efeitos txicos e composio inerente da
substncia, que possa afectar os resultados.
Deve anotar-se a utilizao de um aditivo para inibir a nitrificao biolgica.
4. REFERNCIAS
Enumerao de mtodos normalizados, por exemplo:
NF T 90-103: Determination of the biochemical oxygen demand.
NBN 407: Biochemical oxygen demand.
NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik (BZV).
The determination of biochemical oxygen demand, Methods for the examination of water and associated
materials, HMSO, London.
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.
C.6. DEGRADAO CARNCIA QUMICA DE OXIGNIO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O objectivo deste mtodo consiste em medir a carncia qumica de oxignio (CQO) de substncias orgnicas
slidas ou lquidas por um processo arbitrrio normalizado, sob condies laboratoriais previamente
estabelecidas.
A informao sobre a frmula da substncia ser til para efectuar este ensaio e para interpretar os resultados
obtidos (por exemplo, sais de halogneos, sais ferrosos de compostos orgnicos, compostos organoclorados).
A carncia qumica de oxignio uma medida da oxidabilidade de uma substncia, e exprime-se pela
quantidade equivalente de oxignio de um reagente oxidante, consumido pela substncia, sob condies
laboratoriais previamente determinadas.
Exprime-se o resultado em gramas de CQO por grama da substncia ensaiada.
No necessrio utilizar substncias de referncia em todos os casos quando se investiga uma substncia nova.
Elas devero servir essencialmente para calibrar o mtodo de vez em quando e para permitir a comparao dos
resultados quando se aplicar outro mtodo.
Utilizando dicromato de potssio em cido sulfrico concentrado e utilizando sulfato de prata como
catalisador, oxida-se uma quantidade predeterminada da substncia, dissolvida ou dispersa em gua, e levada a
refluxo, durante duas horas. Determina-se o dicromato residual por um processo de titulao com um padro
de sulfato de amnio ferroso.
No caso das substncias que contm cloro, adiciona-se sulfato mercrico (
1
) para reduzir a interferncia.
Devido ao processo arbitrrio de determinao, o valor da CQO constitui um indicador de oxidabilidade e
como tal utiliza-se como um mtodo prtico para a medio de matria orgnica.
Os cloretos podem interferir com este ensaio; a reduo inorgnica ou os agentes oxidantes podem interferir
tambm com a determinao da CQO.
Alguns compostos cclicos e muitas substncias volteis (por exemplo, os cidos gordos de baixo peso
molecular) no so oxidados totalmente neste ensaio.
Prepara-se uma soluo ou disperso preliminar da substncia de ensaio para se obter uma CQO entre 250 e
600 mg por litro.
Anotaes:
No caso das substncias fracamente solveis ou no dispersveis, pode pesar-se uma quantidade da substncia
finamente pulverizada ou da substncia lquida, correspondente a cerca de 5 mg da CQO, e depois coloca-se no
aparelho experimental com gua.
(
1
) Aps a utilizao, as solues que contm sais de mercrio devero ser tratadas para evitar a contaminao do ambiente com mercrio.
A carncia qumica de oxignio (CQO) determinada frequente e especialmente no caso das substncias
fracamente solveis, recorrendo s vantagens de uma variante do mtodo, isto , num sistema fechado com um
igualizador de presso (H. Kelkenberg, 1975). De acordo com esta modificao, possvel quantificar
frequentemente com sucesso os compostos para os quais as determinaes so muito difceis pelo mtodo
convencional (por exemplo, o cido actico). Contudo, o mtodo fracassa tambm no caso da piridina. Se a
concentrao do dicromato de potssio, conforme prescrito na referncia (1), aumentar para 0,25 N (0,0416
M), fica facilitada a pesagem directa de 5-10 mg de substncia o que essencial para a determinao da CQO de
substncias fracamente solveis em gua (referncia 2).
Caso contrrio, determina-se depois a CQO utilizando qualquer mtodo adequado nacional ou
internacionalmente normalizado.
Calcula-se a CQO existente no balo de ensaio experimental utilizando o mtodo normalizado seleccionado e
depois converte-se em gramas de CQO por grama de substncia ensaiada.
3. RELATRIO
Dever especificar-se o mtodo de referncia utilizado.
A carncia qumica de oxignio dever ser a mdia de pelo menos trs medies. Toda a informao e
anotaes relevantes para a interpretao dos resultados devero ser descritas, especialmente no que diz
respeito a impurezas, estado fsico e propriedades inerentes substncia (se forem conhecidas) que possam
afectar os resultados.
Deve ser mencionada a utilizao de sulfato mercrico para minimizar a interferncia dos cloretos.
4. REFERNCIAS
(1) Kelkenberg, H. (1975). Z. von Wasser und Abwasserforscnung, 8, 146.
(2) Gerike, P. (1984). The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 13,
169.
Enumerao de mtodos normalizados, por exemplo:
NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen demand.
ISBN 0 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate value) of polluted and waste waters.
NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.
DS 217 = water analysis Determination of the chemical oxygen demand.
DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen demand (COD) within the range above 15 mg
per litre.
NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.
ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichromate methods.
C.7. DEGRADAO DEGRADAO ABITICA: HIDRLISE EM FUNO DO PH
1. MTODO
1.1. INTRODUO
As substncias qumicas podem afluir s guas de superfcie por vias tais como a aplicao directa, a disperso
de pulverizados, a escorrncia, a drenagem, a eliminao de resduos, os efluentes industriais, domsticos e
agrcolas e a deposio atmosfrica, podendo ser transformados nas referidas guas por processos qumicos
(por exemplo hidrlise ou oxidao), fotoqumicos e/ou microbianos. A presente directriz descreve um mtodo
de ensaio laboratorial com o objectivo de avaliar as transformaes por hidrlise abitica de substncias
qumicas em sistemas aquticos com valores de pH correntes (pH 4 9) e baseia-se nas directrizes em vigor (1)
(2) (3) (4) (5) (6) (7).
O objectivo dos ensaios consiste em determinar (i) a velocidade de hidrlise da substncia em estudo em funo
do pH e (ii) a identidade ou natureza, bem como as velocidades de formao e transformao, dos produtos de
hidrlise a que os organismos possam ser expostos. Os estudos em causa podem ser necessrios no caso de
substncias qumicas directamente aplicadas na gua ou que possam afectar o ambiente pelas outras vias atrs
referidas.
Ver o apndice 2.
1.3. APLICABILIDADE DO MTODO
O mtodo aplicvel, de forma geral, a substncias qumicas (marcadas ou no) para as quais exista um mtodo
analtico de preciso e sensibilidade suficientes. aplicvel a compostos ligeiramente volteis e no volteis de
solubilidade suficiente em gua, no devendo ser aplicado a substncias altamente volteis em meio aquoso
(nomeadamente fumigantes e solventes orgnicos), dado que as mesmas no podem ser mantidas em soluo
nas condies experimentais do ensaio. A realizao do ensaio com substncias de solubilidade mnima em
gua poder revelar-se difcil (8).
Procede-se adio da substncia em estudo a solues-tampo aquosas estreis de diversos valores de pH
(pH 4, 7 e 9), seguida de incubao ao abrigo da luz em condies laboratoriais controladas (a temperaturas
constantes). Aps intervalos de tempo adequados, analisam-se as solues-tampo para a pesquisa da
substncia em estudo, bem como de produtos de hidrlise. O recurso a substncias de ensaio marcadas (por
exemplo com
14
C) permite obter um balano de massas com maior facilidade.
O mtodo de ensaio concebido numa forma progressiva que se ilustra e elucida no apndice 1. Cada nvel
condicionado pelos resultados do nvel anterior.
1.5. INFORMAES SOBRE A SUBSTNCIA EM ESTUDO
As substncias em estudo a utilizar para a determinao da velocidade de hidrlise podem ser marcadas ou no.
As substncias marcadas so especialmente teis para o estudo do mecanismo da hidrlise e para o
estabelecimento do balano de massas; todavia, em alguns casos especiais, a marcao poder no ser
totalmente indispensvel. Recomenda-se a marcao com
14
C, embora o recurso a outros istopos,
nomeadamente
13
C,
15
N e
3
H, possa revelar-se tambm til. Na medida do possvel, a marcao deve ser
posicionada na parte ou nas partes mais estveis da molcula. Por exemplo, se a substncia em causa contiver
um anel, necessria a marcao do mesmo; se a substncia contiver dois ou mais anis, poder ser necessrio
efectuar ensaios separados para avaliar o comportamento de cada anel marcado e obter informaes adequadas
sobre a formao dos produtos de hidrlise. A substncia em estudo deve ter uma pureza mnima de 95 %.
Antes da realizao de um ensaio de hidrlise, devem conhecer-se os seguintes dados sobre a substncia em
estudo:
a) Solubilidade em gua [mtodo de ensaio A.6];
b) Solubilidade em solventes orgnicos;
c) Presso de vapor [mtodo de ensaio A.4] e/ou constante de Henry;
d) Coeficiente de partio n-octanol/gua [mtodo de ensaio A.8];
e) Constante de dissociao (pK
a
) [Directriz OECD 112] (9);
f) Velocidade de fototransformao directa e indirecta em gua, se adequado.
Devem existir mtodos analticos para a quantificao da substncia em estudo e, caso seja relevante, para a
identificao e quantificao dos produtos de hidrlise em soluo aquosa (ver tambm a seco 1.7.2).
Sempre que possvel, devero utilizar-se substncias de referncia para a identificao e quantificao dos
produtos de hidrlise por mtodos espectroscpicos e cromatogrficos ou outros mtodos de sensibilidade
adequada.
1.7.1. Recuperao
A anlise, pelo menos em duplicado, das solues-tampo ou extractos das mesmas imediatamente aps a
adio da substncia em estudo fornece uma primeira indicao da repetibilidade do mtodo analtico e da
uniformidade do procedimento de adio da substncia. Nas fases posteriores dos ensaios, as recuperaes
decorrem dos balanos de massas (em caso de utilizao de substncias marcadas). As recuperaes devero
situar-se entre 90 % e 110 %, para substncias marcadas ou no (7). Caso seja tecnicamente difcil atingir este
intervalo, aceitvel uma recuperao de 70 % no caso de substncias no marcadas, devendo, contudo,
apresentar-se uma justificao.
1.7.2. Repetibilidade e sensibilidade do mtodo analtico
A repetibilidade do(s) mtodo(s) analtico(s) utilizado(s) para a quantificao da substncia em estudo e,
posteriormente, dos produtos de hidrlise pode ser comprovada pela anlise em duplicado das mesmas
solues-tampo (ou de extractos das mesmas) aps a formao de uma quantidade suficiente de produtos de
hidrlise para quantificao.
O mtodo analtico deve ser suficientemente sensvel para quantificar a substncia em estudo em concentraes
da ordem de 10 % ou menos da concentrao inicial. Se pertinente, os mtodos analticos devero tambm ser
suficientemente sensveis para quantificar quaisquer produtos de hidrlise que constituam 10 % ou mais da
quantidade adicionada (em qualquer fase do ensaio) at 25 % ou menos da concentrao mxima.
1.7.3. Intervalos de confiana para os dados de cintica da hidrlise
Os intervalos de confiana devem ser objecto de tratamento informtico de forma a obter os coeficientes de
regresso, as constantes de velocidade, os tempos de semitransformao e quaisquer outros parmetros
cinticos (por exemplo, DT50).
1.8.1. Equipamento e aparelhagem
O ensaio deve ser realizado em recipientes de vidro (tubos de ensaio ou recipientes pequenos) ao abrigo da luz
e em condies estreis, se necessrio, excepto se existirem dados (por exemplo, coeficiente de partio n-
-octanol-gua) que indiquem a possibilidade de a substncia em estudo aderir ao vidro. Nesse caso, dever
estudar-se a possibilidade de utilizar materiais alternativos (nomeadamente Teflon). A adeso da substncia ao
vidro poder tambm ser minimizada por recurso a um ou mais dos seguintes mtodos:
determinao da massa de substncia em estudo e dos produtos de hidrlise aderentes ao recipiente de
ensaio,
uso de um banho de ultra-sons,
lavagem com solvente do material de vidro com aps a anlise de cada amostra,
uso de produtos na forma de formulaes,
aumento da quantidade de co-solvente utilizada para a adio da substncia em estudo ao sistema; em
caso de utilizao de um co-solvente, este no dever hidrolisar a substncia em estudo.
Em geral, necessrio utilizar agitadores mecnicos de banhos-maria com controlo de temperatura ou
incubadores com controlo termosttico para a incubao das solues em estudo.
O equipamento de laboratrio de uso corrente dever incluir, nomeadamente, o seguinte:
- medidor de pH,
instrumentos de anlise tais como aparelhos de GC, HPLC, TLC, incluindo sistemas adequados de
deteco para a anlise de substncias marcadas ou no com radioistopos ou pelo mtodo de diluio
isotpica inversa,
instrumentos de identificao (MS, GC-MS, HPLC-MS, RMN, etc.),
contador de cintilao lquida,
ampolas de decantao para extraco lquido-lquido,
instrumentos para a concentrao das solues e extractos (por exemplo, evaporador rotativo),
dispositivo de controlo da temperatura (por exemplo, banho-maria).
Os reagentes incluem, nomeadamente:
solventes orgnicos de qualidade analtica (hexano, diclorometano, etc.),
lquido de cintilao,
solues-tampo (ver seco 1.8.3).
O material de vidro, a gua de qualidade analtica e as solues-tampo a utilizar nos ensaios de hidrlise
devem ser esterilizados.
1.8.2. Adio da substncia em estudo
A substncia em estudo, na forma de soluo aquosa, adicionada s diversas solues-tampo (ver apn-
dice 3). Caso tal seja necessrio a uma dissoluo adequada, permitida a utilizao de pequenas quantidades
de solventes miscveis com gua (tais como acetonitrilo, acetona e etanol) para a adio e difuso da substncia
em estudo, que no devem contudo exceder, em geral, 1 % (v/v). O recurso a uma concentrao mais elevada de
solvente (por exemplo, no caso de a substncia em estudo ter uma solubilidade reduzida) apenas permitida se
for provado que o solvente no tem efeitos na hidrlise da substncia em estudo.
No se recomenda o uso rotineiro de produtos na forma de formulaes, dado que no de excluir a
possibilidade de os ingredientes da formulao interferirem no processo de hidrlise. A utilizao dos produtos
em causa poder contudo ser uma alternativa adequada no caso de substncias em estudo de solubilidade
reduzida em gua ou que adiram ao vidro (ver a seco 1.8.1).
Deve usar-se uma concentrao nica da substncia em estudo, que no dever exceder 0,01 M ou metade da
concentrao de saturao (ver o apndice 1).
1.8.3. Solues-tampo
O ensaio de hidrlise dever ser realizado a pH 4, 7 e 9. Para tal, devem preparar-se solues-tampo por
recurso a produtos com pureza de reagente e gua. O apndice 3 apresenta alguns sistemas-tampo teis. De
referir que o sistema-tampo utilizado poder influenciar a velocidade de hidrlise, caso em que dever utilizar-
-se um sistema-tampo alternativo (
1
).
(
1
) Mabey e Mill recomendam o uso de tampes de borato ou acetato em vez de fosfato (11).
O pH de cada soluo-tampo dever ser comprovado com o auxlio de um medidor de pH com uma preciso
mnima de 0,1, temperatura requerida.
1.8.4.1. Temperatura
Os ensaios de hidrlise devem ser realizados a temperaturas constantes. Para fins de extrapolao, importante
manter a temperatura com uma aproximao mnima de 0,5
o
C.
Caso o comportamento hidroltico da substncia em estudo seja desconhecido, dever proceder-se a um ensaio
preliminar (nvel 1) temperatura de 50
o
C. Devem realizar-se ensaios cinticos de nvel superior a, pelo
menos, trs temperaturas (incluindo o ensaio a 50
o
C), excepto se o ensaio de nvel 1 tiver demonstrado a
estabilidade hidroltica da substncia em estudo. Sugere-se uma gama de temperaturas compreendida entre 10 e
70
o
C (em princpio, dever realizar-se pelo menos um ensaio a uma temperatura inferior a 25
o
C), que abrange
a temperatura de referncia de 25
o
C e a maioria das temperaturas registadas em campo.
1.8.4.2. Luz e oxignio
Nos ensaios de hidrlise devero utilizar-se quaisquer mtodos adequados para evitar os efeitos fotolticos. Deve
recorrer-se a todas as medidas adequadas para evitar a oxigenao (por exemplo, fazendo borbulhar hlio, azoto
ou rgon durante 5 minutos antes de preparar a soluo).
1.8.4.3. Durao do ensaio
O ensaio preliminar dever ser realizado em 5 dias; os ensaios de nvel superior devero ser realizados at se
verificar a hidrlise de 90 % da substncia em estudo ou em 30 dias, consoante o que ocorrer primeiro.
1.8.5.1. Ensaio preliminar (Nvel 1)
O ensaio preliminar realizado a 50 0,5
o
C e pH 4,0, 7,0 e 9,0. Se, aps 5 dias, a extenso da hidrlise no
exceder 10 % (t
0,5 25
o
C
> 1 ano), a substncia em estudo considerada hidroliticamente estvel, no sendo
necessrio proceder a ensaios complementares. Se for conhecida a instabilidade da substncia a temperaturas
relevantes no plano ambiental (
1
), no necessrio realizar o ensaio preliminar. O mtodo analtico dever ser
suficientemente preciso e sensvel para detectar uma reduo de 10 % da concentrao inicial.
1.8.5.2. Hidrlise de substncias instveis (Nvel 2)
O ensaio de nvel superior (ensaio avanado) dever realizar-se a valores de pH aos quais a substncia em
estudo se revelou instvel no ensaio preliminar. As solues tamponadas da substncia em estudo devem ser
termostatadas s temperaturas escolhidas. No caso da pesquisa de reaces de primeira ordem, cada soluo
dever ser analisada a intervalos de tempo que permitam obter, no mnimo, seis valores (pontos)
compreendidos, em princpio, entre 10 % e 90 % da hidrlise da substncia em estudo. Remover as amostras
individuais mltiplas (deve proceder-se, no mnimo, anlise de duplicados em recipientes de reaco
separados) e analisar o contedo correspondente a cada um dos seis tempos de reaco (desta forma, obtm-se,
no mnimo, doze pontos). Considera-se inadequada a utilizao de uma soluo-me da qual se retiram
alquotas da soluo em estudo em cada intervalo de amostragem, dado que no permite a anlise da
variabilidade dos dados e pode levar contaminao da soluo em estudo. Devem realizar-se ensaios de
confirmao da esterilidade no final do ensaio de nvel superior (90 % de hidrlise ou 30 dias). Todavia, estes
ensaios no so necessrios se no tiver sido observada qualquer transformao.
1.8.5.3. Identificao dos produtos de hidrlise (Nvel 3)
Todos os principais produtos de hidrlise, designadamente os que representam um teor igual ou superior a
10 % da dose adicionada, devem ser identificados por mtodos analticos adequados.
1.8.5.4. Ensaios facultativos
As substncias hidroliticamente instveis podero necessitar de ensaios complementares a valores de pH
diversos de 4, 7 e 9. Para fins fisiolgicos, por exemplo, poder ser necessrio efectuar um ensaio em condies
mais cidas (por exemplo, pH 1,2) a uma nica temperatura fisiologicamente relevante (37
o
C).
(
1
) A informao em causa pode provir de outras fontes, nomeadamente dados sobre a hidrlise de compostos estruturalmente afins obtidos
na literatura ou dados de outros ensaios preliminares de hidrlise escala semiquantitativa com a substncia em estudo num estdio de
desenvolvimento mais elementar.
2. DADOS
Se pertinente, as quantidades de substncias em estudo e produtos de hidrlise devem ser expressas em
percentagem da concentrao inicial adicionada e, se adequado, em mg/l, para cada intervalo de amostragem,
cada pH e cada temperatura de ensaio. Alm disso, no caso da utilizao de uma substncia marcada, deve
apresentar-se um balano de massa expresso em percentagem da concentrao inicial adicionada.
Deve apresentar-se uma representao grfica dos logaritmos das concentraes da substncia em estudo em
funo do tempo. Os principais produtos de hidrlise (os que representem, pelo menos, 10 % da dose
adicionada) devem ser identificados, procedendo-se representao grfica dos logaritmos das suas
concentraes em funo do tempo tal como no caso da substncia de origem, de forma a evidenciar as
suas velocidades de formao e transformao.
possvel efectuar determinaes mais precisas dos tempos de semitransformao ou dos parmetros DT
50
por
recurso a clculos com modelos cinticos adequados. Devem comunicar-se, para cada pH e temperatura, os
tempos de semitransformao e/ou os parmetros DT
50
(incluindo os limites de confiana), juntamente com
uma descrio domodelo utilizado, a ordem cintica e o coeficiente de determinao (r
2
). Se adequado, os
clculos devero tambm abranger os produtos de hidrlise.
No caso do estudo de velocidades de reaco efectuados a temperaturas diferentes, as constantes de hidrlise de
pseudoprimeira ordem (k
obs
) devem ser descritas em funo da temperatura. Os clculos devero basear-se, por
um lado, na decomposio de k
obs
em constantes de velocidade de hidrlise catalisada em meio cido, neutro
ou bsico (k
H
, k
neutro
e k
OH
respectivamente) e, por outro, na equao de Arrhenius:
k
obs = k
H
H
k
neutro
k
OH
OH
=
i = H,neutro,OH
A
i
e
Bi =T
em que A
i
e B
i
so as constantes de regresso decorrentes, respectivamente, do declive e da ordenada na origem
da linha mais adequada obtida por regresso linear ln k
i
em funo do inverso da temperatura absoluta,
expressa em Kelvin (T). A aplicao da equao de Arrhenius hidrlise catalisada em meio cido, neutro e
bsico permite calcular as constantes de velocidade de pseudoprimeira ordem e, consequentemente, as meias
vidas, para temperaturas s quais a determinao directa da constante de velocidade no vivel na prtica (10).
A maioria das reaces de hidrlise apresenta uma cintica aparente de primeira ordem, pelo que os tempos de
semitransformao so independentes da concentrao (ver a equao 4 do apndice 2). Tal facto permite, em
geral, a extrapolao dos resultados laboratoriais determinados com concentraes de 10
-2
-10
-3
M s condies
ambientais (< 10
-6
M) (10). Mabey e Mill (11) comunicaram vrios exemplos de bom acordo entre as
velocidades de hidrlise de diversas substncias qumicas determinadas em guas puras e naturais, a pH e
temperaturas bem determinados.
3. RELATRIOS
3.1. RELATRIO DE ENSAIO
O relatrio de ensaio dever incluir, no mnimo, as seguintes informaes:
Substncia em estudo:
denominao comum, denominao qumica, nmero CAS, frmula estrutural (com indicao da
posio marcada, caso se utilizem radioistopos) e propriedades fsico-qumicas relevantes (ver a
seco 1.5),
pureza da substncia (presena de impurezas),
pureza declarada da substncia marcada e respectiva actividade molar (se pertinente).
Solues-tampo:
datas e pormenores de preparao,
tampes e gua utilizados,
molaridade e pH das solues-tampo.
Condies de ensaio:
data da realizao dos estudos,
quantidade de substncia em estudo adicionada,
mtodo e solventes (tipo e quantidade) utilizados para a adio da substncia em estudo,
volume de solues tamponadas da substncia em estudo incubadas,
descrio do sistema de incubao utilizado,
pH e temperatura durante o estudo,
cronologia da colheita de amostras,
mtodo(s) de extraco,
mtodos de quantificao e identificao da substncia em estudo e dos seus produtos de hidrlise nas
solues-tampo,
nmero de amostras mltiplas.
Resultados:
repetibilidade e sensibilidade dos mtodos de anlise utilizados,
recuperaes (apresentam-se na seco 1.7.1 os valores percentuais relativos a um ensaio vlido),
dados e mdias respeitantes s amostras mltiplas, apresentados na forma de quadros,
balano de massas durante e no final do estudo (caso se utilize uma substncia marcada),
resultados do ensaio preliminar,
discusso e interpretao dos resultados,
dados e valores originais.
As informaes que se seguem apenas so necessrias caso se determine a velocidade de hidrlise:
representao grfica das concentraes da substncia em estudo e, se pertinente, dos produtos de
hidrlise, em funo do tempo, a cada pH e temperatura,
tabelas de resultados da equao de Arrhenius temperatura de 20
o
C/25
o
C,
especificando o pH, a constante de velocidade [h
-1
ou dia
-1
], o tempo de semitransformao ou o DT50,
as temperaturas [
o
C], incluindo os limites de confiana e os coeficientes de correlao (r
2
), ou dados
similares,
mecanismo de hidrlise proposto.
4. REFERNCIAS
(1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guideline for Testing of Chemicals Nr. 111,
adoptado em 12 de Maio de 1981.
(2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25
o
C.
Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
(3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate Guidelines for registration of pesticides in
Canada.
(4) Unio Europeia (UE) (1995). Directiva 95/36/CE da Comisso que altera a Directiva 91/414/CEE relativa
colocao dos produtos fitofarmacuticos no mercado. Anexo V: destino e comportamento no
ambiente.
(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). Application for registration of a pesticide.
Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
(6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prfung des Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im
Wasser (Outubro de 1980).
(7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R.
Lynch, Ed.
(8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures, OECD
Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No 23.
(9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to
Guidelines for the Testing of Chemicals.
(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) Recommended changes in pesticide fate study
guidelines for improving input to computer models (texto de uma exposio oral no 14.
o
Encontro
Anual da Society of Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, November 1993).
(11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis of organic compounds in water under
environmental conditions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383-415.
Apndice 1
Representao esquemtica do ensaio de hidrlise progressivo
Apndice 2
Definies e unidades
Devem usar-se sistematicamente unidades do Sistema Internacional (SI).
Substncia em estudo: substncia de origem ou produtos de transformao relevantes.
Produtos de transformao: quaisquer substncias resultantes da transformao bitica ou abitica da substncia em
estudo.
Produtos de hidrlise: quaisquer substncias resultantes de reaces de transformao hidroltica da substncia em estudo.
Hidrlise: reaco de uma substncia em estudo RX com gua, com troca do grupo X com um grupo OH:
RX + HOH ROH + HX [1]
De forma simplificada, a velocidade de reduo da concentrao de RX dada por
velocidade = k [H
2
O] [RX] reaco de segunda ordem
ou
velocidade = k [RX] reaco de primeira ordem
em funo do passo determinante da velocidade. Uma vez que a gua se encontra presente em grande excesso relativamente
substncia em estudo, o tipo de reaco em causa geralmente descrito como de pseudoprimeira ordem. A constante de
velocidade observada expressa do seguinte modo
k
obs
= k [H
2
O] [2]
e pode ser determinada por recurso expresso (*)
k
obs =
1
t
ln
C
o
C
t
[3]
em que
t = tempo
C
o
, C
t
= concentraes de RX nos instantes 0 e t.
A constante tem dimenses de (tempo)
-1
; o tempo de semitransformao (tempo necessrio para a reaco de 50 % da
substncia RX) dada por
t
0,5 =
ln2
k
obs
[4]
Tempo de semitransformao: (t
0,5
) tempo necessrio hidrlise de 50 % da substncia em estudo, no caso de uma
reaco com cintica de primeira ordem. independente da concentrao.
DT
50
(Tempo de semi-reaco): tempo necessrio a uma reduo de 50 % da concentrao da substncia em estudo.
diferente do tempo de semitransformao, t
0,5
, se a reaco no apresentar uma cintica de primeira ordem.
(*) Se a representao dos logaritmos das concentraes em funo do tempo no for uma funo linear (facto que traduz uma cintica de
primeira ordem), o recurso equao [3] no adequado determinao da constante de velocidade da hidrlise da substncia em
estudo.
Estimativa de k a uma temperatura diferente
Sempre que sejam conhecidas as constantes de velocidade a duas temperaturas, as constantes a outras temperaturas podem
ser calculadas por recurso equao de Arrhenius:
k = A e
E
RT ou ln k =
E
R T
ln A
Por representao de ln k em funo de 1/T obtm-se uma recta com declive -E/R
em que:
k = constante de velocidade, determinada a temperaturas diferentes
E = energia de activao [kJ/mol]
T = temperatura absoluta [K]
R = constante dos gases [8,314 J/mol.K]
A energia de activao foi calculada por anlise da seguinte equao por regresso linear:
E = R
ln k
2
ln k
1
1
T
1
1
T
2
_ _
em que: T
2
> T
1
.
Apsndice 3
Sistemas-tampo
A. CLARK E LUBS:
Misturas-tampo de CLARK e LUBS (*)
Composio pH
0,2 N HCl E 0,2 N KCl A 20
o
C
47,5 ml HC1 + 25 ml KC1 dil. para 100 ml 1,0
0,1 M biftalato de potssio + 0,1 N HC1 a 20
o
C
46,70 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato dil. para 100 ml 2,2
0,1 M biftalato de potssio + 0,1 N NaOH a 20
o
C
0,40 ml 0,1 N NaOH +50 ml biftalato dil. para 100 ml 4,0
(*) Os valores de pH constantes dos quadros foram calculados com base em determinaes potenciomtricas, por recurso s equaes-
-padro de Srensen (1909). Os valores de pH correspondentes so superiores em 0,04 aos valores constantes dos quadros.
Composio pH
0,1 M fosfato monopotssico + 0,1 N NaOH a 20
o
C
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato dil. para 100 ml 6,0
0,1 M H
3
B0
3
em 0,1 M KCl + 0,1 N NaOH a 20
o
C
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cido brico dil. para 100 ml 7,8
B. KOLTHOFF AND VLEESCHHOUWER:
Tampes de citrato de KOLTHOFF e VLEESCHHOUWER
Composio pH
0,1 M citrato monopotssico e 0,1 N HCl a 18
o
C (*)
49,7 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato dil. para 100 ml 2,2
0,1 M citrato monopotssico e 0,1 N NaOH a 18
o
C (*)
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato dil. para 100 ml 3,8
(*) Deve adicionar-se um pequeno cristal de timol ou de uma substncia afim para evitar a formao de depsitos molds.
C. SRENSEN:
Misturas de boratos de SRENSEN
Composio
Srensen
18
o
C
Walbum, pH a
ml Borax
ml HC1/
/NaOH
10
o
C 40
o
C 70
o
C
0,05 M borax + 0,1 N HCl
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95
6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08
6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28
7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40
7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50
8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59
8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67
9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74
9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86
0,05 M borax + 0,1 N NaOH
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94
8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02
7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12
6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
Misturas de fosfatos de SRENSEN
Composio pH
0,0667 M fosfato monopotssico + 0,0667 M fosfato dissdico a 20
o
C
99,2 ml KH
2
PO
4
+ 0,8 ml Na
2
HPO
4
5,0
98,4 ml KH
2
PO
4
+ 1,6 ml Na
2
HPO
4
5,2
97,3 ml KH
2
PO
4
+ 2,7 ml Na
2
HPO
4
5,4
95,5 ml KH
2
PO
4
+ 4,5 ml Na
2
HPO
4
5,6
92,8 ml KH
2
PO
4
+ 7,2 ml Na
2
HPO
4
5,8
88,9 ml KH
2
PO
4
+ 11,1 ml Na
2
HPO
4
6,0
83,0 ml KH
2
PO
4
+ 17,0 ml Na
2
HPO
4
6,2
75,4 ml KH
2
PO
4
+ 24,6 ml Na
2
HPO
4
6,4
65,3 ml KH
2
PO
4
+ 34,7 ml Na
2
HPO
4
6,6
53,4 ml KH
2
PO
4
+ 46,6 ml Na
2
HPO
4
6,8
41,3 ml KH
2
PO
4
+ 58,7 ml Na
2
HPO
4
7,0
29,6 ml KH
2
PO
4
+ 70,4 ml Na
2
HPO
4
7,2
19,7 ml KH
2
PO
4
+ 80,3 ml Na
2
HPO
4
7,4
12,8 ml KH
2
PO
4
+ 87,2 ml Na
2
HPO
4
7,6
7,4 ml KH
2
PO
4
+ 92,6 ml Na
2
HPO
4
7,8
3,7 ml KH
2
PO
4
+ 96,3 ml Na
2
HPO
4
8,0
C.8. TOXICIDADE EM RELAO S MINHOCAS
ENSAIO UTILIZANDO SOLO ARTIFICIAL
1. MTODO
1.1. INTRODUO
Neste ensaio laboratorial, a substncia de ensaio adicionada a um solo artificial no qual so colocadas
minhocas durante 14 dias. Aps este perodo (e, facultativamente, aps 7 dias) examina-se o efeito letal da
substncia nas minhocas. O ensaio fornece um mtodo para a avaliao, num prazo relativamente curto, do
efeito dos produtos qumicos nas minhocas, por absoro via cutnea e alimentar.
1.2. DEFINIO E UNIDADE
Cl
50
: a concentrao de uma substncia que se considera responsvel pela morte de 50 % dos animais de ensaio
durante o perodo de ensaio.
utilizada periodicamente uma substncia de referncia com o objectivo de demonstrar que a sensibilidade do
sistema de ensaio no variou significativamente.
Recomenda-se como substncia de referncia a cloroacetamida de pureza analtica.
O solo constitui um meio varivel e, por essa razo, utilizado neste ensaio um solo franco artificial
cuidadosamente definido. As minhocas adultas da espcie Eisenia foetida (ver nota em apndice) so mantidas
num solo artificial, tratado com diferentes concentraes da substncia de ensaio. O contedo dos recipientes
espalhado sobre um tabuleiro 14 dias (e facultativamente sete dias) aps o incio do ensaio e contam-se as
minhocas sobreviventes, para cada uma das concentraes.
Pretende-se que o ensaio seja o mais reprodutvel possvel no que diz respeito ao substrato e ao organismo a
ensaiar. A mortalidade nos controlos no deve exceder 10 % no termo do ensaio, caso contrrio este no
vlido.
1.6.1. Materiais
1.6.1.1. S ubs t r a t o pa r a o e ns a i o
utilizado como substrato de base para o ensaio um solo artificial de constituio bem definida.
a) Substrato de base (as percentagens so expressas em termos de peso seco):
10 % de turfa de esfagno (to prximo quanto possvel do pH 5,5- 6,0, sem resduos vegetais
visveis e finamente modo),
20 % de argila caulintica, de preferncia com mais de 50 % de caulinite,
cerca de 69 % de areia industrial com quartzo (predominncia de areia fina com mais de 50 % de
partculas de granulometria 0,05- 0,2 mm). Se a substncia no for suficientemente dispersvel em
gua, necessrio dispor de 10 g por recipiente de ensaio para misturar posteriormente com a
substncia de ensaio,
cerca de 1 % de carbonato de clcio (CaCO
3
) pulverizado e quimicamente puro para ajustar o pH a
6,0 0,5;
b) Substrato para o ensaio
O substrato para o ensaio contm substrato de base, a substncia de ensaio e gua desionizada.
O teor em gua deve corresponder a cerca de 25-42 % do peso seco do substrato de base. O teor em gua
do substrato determina-se por secagem da amostra a 105
o
C at se obter um peso constante. O critrio-
-chave que o solo artificial seja humedecido at sua saturao. Deve-se proceder sua mistura
cuidadosamente de modo a obter uma distribuio uniforme da substncia de ensaio e do substrato.
Deve ser referido o modo como introduzida a substncia de ensaio no substrato;
c) Substrato de controlo
O substrato de controlo contm o substrato de base e gua. Se se utilizar um aditivo, um substrato de
controlo suplementar dever conter idntica quantidade do aditivo.
1.6.1.2. Re c i pi e nt e s d e e ns a i o
Recipientes em vidro, com uma capacidade aproximada de um litro (adequadamente cobertos com tampas de
plstico, discos ou filme de plstico perfurados para efeitos de ventilao) cheios com uma dada quantidade de
substrato hmido para ensaio ou substrato de controlo, equivalente a 500 g de substrato seco.
Os recipientes devem ser mantidos em cmaras climatizadas a uma temperatura de 20 2
o
C com luz contnua.
A intensidade da luz deve situar-se entre 400 e 800 luz.
A durao do ensaio de 14 dias, mas pode-se optar por avaliar a mortalidade aps terem decorrido 7 dias
desde o incio do ensaio.
1.6.3. Mtodo de ensaio
Conc e nt r a e s d e e ns a i o
As concentraes da substncia de ensaio so expressas em peso de substncia por unidade de peso seco do
substrato de base (mg/kg).
E ns a i o d e d e t e r mi n a o d e c onc e nt r a e s
O intervalo de concentraes susceptvel de provocar mortalidades de zero a 100 % pode ser determinado num
ensaio de determinao de concentraes, com o objectivo de fornecer informaes relativas ao intervalo de
concentraes a utilizar no ensaio definitivo.
A substncia deve ser ensaiada nas seguintes concentraes: 1 000; 100; 10; 1; 0,1 mg substncia/kg de
substratode ensaio (peso seco).
Se se efectuar um ensaio definitivo completo, um meio de ensaio por cada concentrao e um meio para o
controlo no tratado, cada um dos quais com dez minhocas, pode ser suficiente para o ensaio de determinao
de concentraes.
E ns a i o d e f i ni t i v o
Os resultados do ensaio de determinao de concentraes so utilizados para escolher pelo menos cinco
concentraes segundo uma srie geomtrica que provoquem uma mortalidade de 0 a 100 %, diferindo entre si
de um factor constante no superior a 1,8.
Um ensaio que utilize estas sries de concentrao deve permitir avaliar com a maior preciso possvel o valor
de CL
50
e os respectivos limites de confiana.
No ensaio definitivo utilizam-se pelo menos quatro meios de ensaio por concentrao e quatro meios de
controlo sem tratamento, cada um deles com dez minhocas. Os resultados das repeties destes meios so
expressos em termos de mdia e desvio padro.
Quando duas concentraes consecutivas, com uma razo de 1,8 entre si, do apenas mortalidades de 0 % e
100 %, esses dois valores so suficientes para determinar o intervalo em que se situa a CL
5()
.
Mi s t ur a d o s ubs t r a t o d e ba s e pa r a o e ns a i o e d a s ubs t nc i a d e e ns a i o
5empre que possvel, o substrato para o ensaio deve ser preparado sem quaisquer aditivos alm de gua.
Prepara-se uma emulso ou disperso da substncia de ensaio em gua desionizada ou outro solvente e,
imediatamente antes do incio do ensaio, mistura-se com o substrato de base para o ensaio, ou pulveriza-se
uniformemente sobre ele, com um dispositivo de pulverizao para cromatografia fina ou outro semelhante.
Se a substncia de ensaio for insolvel em gua, pode ser dissolvida num determinado volume, o mais pequeno
possvel, de um solvente orgnico adequado (por exemplo, hexano, acetona ou clorofrmio).
Para solubilizar, dispersar ou emulsionar a substncia de ensaio apenas se podem utilizar agentes que se
volatilizem facilmente. O substrato para o ensaio deve ser arejado antes de ser utilizado. A quantidade de gua
evaporada deve ser substituda. O controlo deve conter a mesma quantidade de qualquer aditivo.
Se a substncia de ensaio no for solvel, dispersvel ou emulsionvel, em solventes orgnicos, misturam-se
490 g de substrato de ensaio seco com 10 g de uma mistura de areia fina com quartzo e uma quantidade de
substncia de ensaio correspondente dose necessria para tratar 500 g de solo artificial seco.
Para cada meio de ensaio, so colocados, em cada recipiente de vidro, uma dada quantidade de substrato
hmido para o ensaio, equivalente a 500 g de peso seco e, sobre a superfcie do substrato para o ensaio, 10
minhocas. Estas minhocas foram acondicionadas durante 24 horas num substrato de base hmido semelhante
ao de ensaio, aps o que foram rapidamente lavadas e a gua em excesso absorvida com um papel de filtro
antes da utilizao.
Os recipientes so cobertos com tampas de plstico, discos ou filmes de plstico perfurados para evitar que o
substrato seque e so mantidos nas condies de ensaio durante 14 dias.
A avaliao deve ser efectuada 14 dias (e facultativamente sete dias) aps o incio do ensaio. O substrato
espalhado sobre uma placa de vidro ou ao inoxidvel. Examinam-se ento as minhocas e determina-se o
nmero de sobreviventes. Considera-se que as minhocas esto mortas se no reagirem a um ligeiro estmulo
mecnico aplicado na extremidade frontal.
Quando o exame efectuado no 7.
o
dia, o recipiente enche-se novamente com substrato e as minhocas
sobreviventes so de novo colocadas na mesma superfcie do substrato de ensaio.
1.6.4. Organismos a utilizar no ensaio
Os organismos a utilizar no ensaio devem ser adultos da espcie Eisenia foetida (ver nota em apndice) (pelo
menos com 2 meses de vida e com clitelo), com peso hmido de 300 a 600 mg (ver mtodo de reproduo em
apndice).
2. DADOS
2.1. PROCESSAMENTO E AVALIAO DE RESULTADOS
As concentraes da substncia de ensaio apresentam-se em funo das percentagens correspondentes de
minhocas mortas.
Quando os dados so adequados, o valor CL
50
e os limites de confiana (p = 0,05) devem ser determinados
utilizando mtodos padro (Litchfield e Wilcoxon, 1949, ou mtodo equivalente). O valor CL
50
deve ser expresso
em mg de substncia de ensaio por kg de substrato de ensaio (peso seco).
Nos casos em que o declive da curva de concentraes demasiado abrupto para permitir o clculo da CL
50
,
suficiente uma estimativa grfica deste valor.
Quando duas concentraes consecutivas com uma razo de 1,8 entre si provocam 0 % e 100 % de
mortalidade, estes dois valores so suficientes para indicar o intervalo entre o qual se situa a CL
50.
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio deve incluir, se possvel, as seguintes informaes:
referir se o ensaio foi efectuado de acordo com os critrios de qualidade acima mencionados,
tipo de ensaio (ensaio de determinao de concentraes e/ou ensaio definitivo),
descrio exacta das condies de ensaio ou referir se o ensaio foi efectuado de acordo com o mtodo;
devem ser referidos todos os desvios em relao ao mtodo indicado,
descrio exacta do modo como a substncia de ensaio foi misturada com o substrato de base para o
ensaio,
informaes relativas aos organismos utilizados no ensaio (espcie, idade, peso mdio e intervalo de
variao do peso, condies de reproduo e manuteno, fornecedor),
mtodo utilizado na determinao da CL
50
,
resultados dos ensaios, incluindo todos os dados utilizados,
descrio dos sintomas ou alteraes do comportamento observados nos organismos utilizados no
ensaio,
mortalidade nos controlos,
CL
50
ou a mais elevada concentrao ensaiada que no provocou mortalidade e a concentrao ensaiada
mais baixa que provocou urna mortalidade de 100 %, catorze dias (e facultativamente sete dias) aps o
incio do ensaio,
representao grfica da curva concentrao-resposta,
resultados obtidos com a substncia de referncia quer em relao ao presente ensaio quer provenientes
de anteriores ensaios de controlo de qualidade.
4. REFERNCIAS
(1) OCDE, Paris, 1981, Test Guideline 207, Deciso C(81) 30 final do Conselho.
(2) Edwards, C. A. and Lofty, J. R. Biology of Earthworms, Chapman and Hall, London, 331 pp.
(3) Bouche, M. B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie et Systematique, Institut National de la Recherche
Agronomique, 671 pp.
(4) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method of evaluating dose effect experiments, J. Pharm. Exp.
Therap., vol. 96, 1949, p. 99.
(5) Comisso das Comunidades Europeias, Development of a standardized laboratory method for assessing the
toxicology of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt fur Land- und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrens-
-vorschlag Toxizittstest am Regenwurm Eisenia foetida in knstlichem Boden, in: Rudolph/Boje,
kotoxikologie, ecomed. Landsberg, 1986.
Apndice
Reproduo e manuteno das minhocas antes do ensaio
Para reproduzir os animais, colocar 30 a 50 minhocas adultas numa caixa de reproduo com substrato fresco e remov-las
ao fim de 14 dias,.Estes animais podem ser utilizados para futuros lotes de reproduo. As posturas so utilizadas no ensaio
quando atingirem a maturidade (nos termos das condies determinadas, ao fim de 2 a 3 meses).
Condies de reproduo e manuteno
Cmara climatizada: temperatura 20 2
o
C, de preferncia dispondo de luz contnua (de intensidade 400 a 800 lux).
Caixas de reproduo: recipientes adequados de pequena profundidade, com um volume de 10 a 20 1.
Substrato: Eisenia foetida pode ser criada em vrios excrementos animais. Recomenda-se como meio de
reproduo a utilizao de uma mistura de 50 % de turfa e 50 % de estrume de cavalo ou vaca. O
meio deve ter um pH de aproximadamente 6 a 7 (ajustado com carbonato de clcio) e baixa
condutividade inica (inferior a 6 mmhos ou 0,5 % de concentrao de sais).
O substrato deve ser hmido, mas no demasiado molhado.
Alm do mtodo acima referido, podem ser utilizados com xito outros processos.
Nota: Eisenia foetida existe sob a forma de duas subespcies que alguns taxionomistas separaram em espcies (Bouche, 1972).
So morfologicamente semelhantes mas uma delas, a Eisenia foetida foetida, apresenta como caracterstica listas ou bandas
transversais sobre os segmentos e a outra, a Eisenia foetida andrei, no possui tal caracterstica, apresentando uma colorao
avermelhada matizada. Sempre que possvel, deve-se utilizar a Eisenia foetida andrei. Podem ser utilizadas outras espcies
desde que se disponha da necessria metodologia.
C.9. BIODEGRADAO
ENSAIO DE ZAHN E WELLENS
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O objectivo do presente mtodo a avaliao da biodegradao final potencial de substncias orgnicas, no
volteis, solveis em gua quando so expostas a concentraes relativamente elevadas de microorganismos
num ensaio esttico.
Pode-se verificar adsoro fsico-qumica sobre os slidos em suspenso, o que deve ser tomado em
considerao na interpretao dos resultados (ver 3.2),
As substncias a estudar so utilizadas em concentraes que correspondem a valores de COD que vo de 50 a
400 mg/litro ou a valores de CQO situados entre 100 e 1 000 mg/l (COD = carbono orgnico dissolvido;
CQO = carncia qumica de oxignio). Estas concentraes relativamente elevadas asseguram uma boa
confiana analtica. Os compostos dotados de propriedades txicas podem atrasar ou inibir o processo de
degradao.
No presente mtodo, utiliza-se a medio da concentrao do carbono orgnico dissolvido ou a carncia
qumica de oxignio para avaliar a biodegradao final da substncia de ensaio.
A utilizao simultnea de um mtodo analtico especfico pode permitir a avaliao da biodegradao primria
da substncia (desaparecimento da estrutura qumica inicial).
O mtodo apenas se aplica s substncias orgnicas que, na concentrao utilizada no ensaio:
so solveis em gua nas condies do ensaio,
tm uma presso de vapor negligencivel nas condies do ensaio,
no exercem efeitos inibidores sobre as bactrias,
no sofrem uma adsoro importante pelo equipamento de ensaio,
no desaparecem da soluo de ensaio devido a formao de espuma.
Na interpretao dos resultados obtidos, especialmente nos casos em que estes resultados so baixos ou
marginais, til conhecer as propores relativas dos principais elementos constituintes da substncia de
ensaio.
Na interpretao de resultados pouco elevados e na seleco das concentraes de ensaio adequadas, desejvel
dispor de informaes relativas toxicidade da substncia em relao aos microorganismos.
A taxa de degradao alcanada no final do ensaio constitui a Biodegradao no ensaio de Zahn e Wellens:
D
T
% = 1
C
T
C
B

C
A
C
BA

_ _
100
em que:
D
T
= biodegradao (%) no instante T.
C
A
= Valores do COD (ou da CQO) da mistura de ensaio medidos trs horas aps o incio do ensaio (mg/l)
(COD = carbono orgnico dissolvido, CQO = carncia qumica do oxignio),
C
T
= valores do COD ou da CQO na mistura do ensaio no momento da colheita da amostra (mg/l),
C
B
= valor do COD ou da CQO do ensaio em branco no momento da colheita da amostra,
C
BA
= valor do COD ou da CQO do ensaio em branco, medido trs horas aps o incio do ensaio (mg/l).
A taxa de degradao obtida arredondada at ao valor inteiro da percentagem mais prxima.
A percentagem de degradao definida como sendo a percentagem de remoo de COD (ou da CQO) da
A diferena entre o valor medido aps 3 horas e o valor inicial calculado ou de preferncia, medido, pode
fornecer informaes teis relativas eliminao da substncia (ver 3.2, Interpretao dos resultados).
No estudo de novas substncias, podem por vezes ser teis substncias de referencia; contudo, ainda no
podem ser recomendadas substncias de referncia especficas.
Colocam-se num recipiente de vidro de 1 a 4 litros de capacidade, munida de um agitador e de um arejador,
uma soluo aquosa de lamas activadas, substncias nutritivas minerais e a substncia de ensaio que constituem
a nica fonte de carbono. A mistura agitada e arejada a uma temperatura de 20 a 25
o
C, sob uma iluminao
difusa ou numa cmara escura durante um perodo que pode ir at vinte e oito dias. Acompanha-se o processo
de degradao determinando o valor do COD (ou da CQO) na soluo filtrada, diariamente ou segundo uma
outra periodicidade adequada. Aps cada perodo, o COD (ou a CQO) eliminado referido ao valor verificado
trs horas aps o incio do ensaio e expresso em percentagem de biodegradao; isto constitui a medida da taxa
de degradao nesse momento. O resultado representado graficamente em funo do tempo, o que permite
obter a curva de biodegradao.
Se se utiliza um mtodo analtico especfico, podem-se medir as variaes da concentrao da molcula original
atribuveis biodegradao (biodegradao primria).
A reprodutibilidade do presente mtodo foi provada num ensaio de intercalibrao.
A sensibilidade do mtodo largamente determinada pela variabilidade do ensaio em branco e, em menor
extenso, pela preciso da determinao do carbono orgnico dissolvido e da concentrao da substncia de
ensaio no meio.
1.6.1. Preparaes
1.6.1.1. Re a g e nt e s
gua utilizada no ensaio: gua de beber contendo menos de 5 mg/l de carbono orgnico. A concentrao total
de ies, clcio e magnsio no deve ultrapassar 2,7 mmoles/l; se no for o caso, corrigir a diluio com a
necessria quantidade de gua desionizada ou destilada.
Acido sulfrico de pureza analtica (P.A.): 50 g/l.
Soluo de hidrxido de sdio P.A.: 40 g/l.
Soluo nutritiva mineral: dissolver num litro de gua desionizada:
cloreto de amnio, NH
4
Cl, P.A.: 38,50 g,
dihidrogenofosfato de sdio, NaH
2
PO
4
.2H
2
0, P.A.: 33,40 g,
dihidrogenofosfato de potssio KH
2
PO
4
, P.a.: 8,50 g,
monohidrogenofosfato de dipotssio K
2
HPO
4
, P.A.: 21,75 g.
A mistura serve simultaneamente de meio nutritivo e soluo tampo.
1.6.1.2. E q ui pa me nt o
Recipientes de vidro com uma capacidade de 1 a 4 litros (por exemplo, recipientes cilndricos).
Dispositivos de agitao com um agitador em vidro ou em metal fixado a uma haste adequada (o agitador deve
descrever um movimento rotativo a cerca de 5 a 10 cm do fundo do recipiente). Pode-se utilizar igualmente um
agitador magntico com 7 a 10 cm de comprimento.
Tubo de arejamento em vidro com 2 a 4 mm do dimetro interno. A abertura do tubo deve situar-se cerca de
1 cm acima do fundo do recipiente.
Centrfuga (cerca de 3 550 g).
Potencimetro.
Aparelho para a medio do oxignio dissolvido.
Papis de filtro.
Aparelho de filtrao por membrana.
Membranas filtrantes de porosidade 0,45 m. As membranas filtrantes so adequadas se no libertarem
carbono e no absorverem a substncia na fase da filtrao.
Material de anlise para a dosagem do carbono orgnico e a determinao da carncia qumica de oxignio.
1.6.1.3. P r e pa r a o d o i nc ul o
Lavar as lamas activadas provenientes de uma estao de tratamento biolgica por sucessivas centrifugaes ou
decantaes com gua do ensaio (ver acima).
As lamas activadas devem possuir as caractersticas adequadas. Esta lama pode ser obtida numa estao de
tratamento de guas residuais em boas condies de funcionamento. Para dispor do maior nmero possvel de
diferentes espcies ou de estirpes de bactrias, pode ser prefervel misturar os inculos provenientes de
diferentes fontes (por exemplo, de diferentes estaes de tratamento, extractos de solo, gua de rios, etc.). A
mistura deve ser tratada tal como acima indicado.
Para o controlo da actividade das lamas activadas, ver abaixo Controlo funcional.
1.6.1.4. P r e pa r a o d a s s ol u e s d e e ns a i o
Num recipiente de ensaio, adicionar 500 ml de gua de ensaio, 2,5 ml/l de soluo mineral nutritiva e uma
quantidade de lamas activadas correspondente a 0,2 a 1,0 g/l de matria seca na mistura final. Adicionar uma
quantidade suficiente de soluo de reserva da substncia de ensaio de modo a obter, na mistura final, uma
concentrao de COD de 50 a 400 mg/l. Os valores correspondentes de CQO so 100 a 1 000 mg/l. Adicionar
gua at um volume total de 1 a 4 litros. O volume total escolhido depende do nmero de amostras a colher
para a determinao do COD ou da CQO e do volume necessrio para a anlise.
Normalmente consideram-se dois litros como o volume satisfatrio. Para cada srie de ensaios, preparar pelo
menos um recipiente controlo (branco) contendo apenas as lamas activadas e a soluo mineral nutritiva,
diludas com gua de ensaio, at se dispor de um volume total idntico ao dos recipientes de ensaio.
1.6.2. Execuo do ensaio
Agitam-se os recipientes de ensaio com agitadores magnticos ou agitadores a hlice, sob iluminao difusa ou
numa cmara escura, a uma temperatura de 20 a 25
o
C. O arejamento processa-se por injeco de ar
comprimido purificado por um filtro de algodo em rama e, se necessrio, por um frasco de lavagem. Deve-se
garantir que a lama no se deposite e que a concentrao de oxignio no desa abaixo de 2 mg/l,
O valor de pH deve ser verificado a intervalos regulares (por exemplo, diariamente) e ajustado a pH 7 a 8, se
necessrio.
As perdas devidas a evaporao so compensadas, imediatamente antes de cada colheita de amostras, com gua
desionizada ou destilada nas quantidades adequadas. Um bom mtodo consiste em marcar o nvel do lquido
no recipiente antes de dar incio ao ensaio. Aps cada colheita, marcam-se de novo os recipientes (sem
arejamento nem agitao). As primeiras amostras so sempre colhidas trs horas aps o incio do ensaio, de
modo a permitir detectar uma adsoro da substncia de ensaio pelas lamas activadas.
degradao da substncia de ensaio segue-se a dosagem do COD ou da CQO, diariamente, ou a outro
intervalo regular. Filtrar as amostras provenientes do recipiente de ensaio e do recipiente de controlo (branco)
atravs de um papel de filtro cuidadosamente lavado. Rejeitar os primeiros 5 ml do filtrado da soluo de
ensaio. As lamas dificilmente filtrveis podem ser previamente eliminadas por uma centrifugao de 10
minutos. As determinaes do COD e da CQO efectuam-se pelo menos em duplicado. A durao dos ensaios
prolonga-se at 28 dias.
Observao: As amostras que permanecem turvas so filtradas atravs de filtros de membrana. Estes no devem
libertar nem adsorver matrias orgnicas.
Cont r ol o f unc i ona l d e l a ma s a c t i v a d a s
Por cada srie de ensaios necessrio prever um recipiente que contenha uma substncia conhecida de forma a
poder verificar a capacidade funcional de lamas activadas. O dietilcnoglicol revelou-se til para este efeito.
Ad a pt a o
Se as anlises so efectuadas a intervalos relativamente curtos (por exemplo, diariamente), a curva de
degradao pode fazer salientar claramente um fenmeno de adaptao (ver figura 2). O ensaio no dever,
portanto, ser iniciado imediatamente antes de um fim-de-semana.
Se a adaptao tem lugar nos ltimos dias do ensaio, este deve ser prolongado at degradao completa.
Observao: Se for necessrio um melhor conhecimento do comportamento da lama, as mesmas lamas
activadas so expostas de novo mesma substncia de ensaio de acordo com o seguinte processo:
Parar o agitador e o arejador e deixar precipitar as lamas activadas. Retirar o sobrenadante, encher com gua de
ensaio at perfazer dois litros, agitar durante 15 minutos e deixar de novo precipitar. Retirar de novo o
sobrenadante e utilizar as restantes lamas para repetir o ensaio com a mesma substncia, em conformidade
com os pontos 1.6.1.4 e 1.6.2 anteriores. As lamas activadas podem igualmente ser separadas por
centrifugao em vez de precipitao.
As lamas adaptadas podem ser misturadas com as lamas frescas para atingir 0,2 a 1 g de matria seca/litro.
An l i s e s
De um modo geral as amostras so filtradas atravs de um papel de filtro cuidadosamente lavado com gua
desionizada.
As amostras que permanecem turvas so filtradas atravs de filtros de membrana (0,45 m).
Determinar a concentrao de COD em duplicado nos filtrados das amostras (rejeitar os primeiros 5 ml) com o
auxlio de um aparelho de medio do TOC. Se a anlise do filtrado no puder ser efectuada no prprio dia,
conserv-la no frigorfico at ao dia seguinte. No aconselhvel conserv-la mais tempo.
Determinar a concentrao da CQO nos filtrados das amostras com o auxlio do dispositivo de anlise da CQO,
em conformidade com o procedimento descrito no ponto 2 seguinte.
Proceder a, pelo menos, duas determinaes da concentrao do COD e da CQO nas amostras, em
conformidade com as indicaes acima fornecidas em 1.6.2. Calcular a percentagem de degradao no instante
T de acordo com a frmula (com as suas definies) dada no ponto 1.2 anteriormente indicado.
Arredondar a taxa de degradao at unidade de percentagem mais prxima. A taxa de degradao atingida
no final do ensaio constitui a Biodegradao no ensaio de Zahn-Wellens.
Observao: Se se realiza a degradao completa antes do final da durao do ensaio e se este resultado for
confirmado por uma segunda anlise efectuada no dia seguinte, pode-se dar o ensaio por concludo.
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio, deve incluir, se possvel, as seguintes informaes:
a concentrao inicial da substncia,
quaisquer outras indicaes e os resultados experimentais relativos substncia ensaiada, substncia de
referncia eventualmente usada e ao ensaio de controlo (branco),
a concentrao aps trs horas,
a curva de biodegradao com a respectiva descrio,
a data e o local de colheita dos organismos de ensaio, fase de adaptao, concentrao utilizada, etc.,
as razes cientficas de eventuais alteraes ao mtodo de ensaio.
A eliminao do COD (ou da CQO) que se produz gradualmente durante um determinado nmero de dias ou
de semanas indica que a substncia ensaiada se degrada biologicamente.
Contudo, uma adsoro fsico-qumica pode desempenhar um papel em determinados casos, o que indicado
quando se verifica uma remoo total ou parcial da substncia desde o incio, durante as primeiras trs horas, e
a diferena entre os licores sobrenadantes de ensaio e de controlo permanecem a um nvel inesperadamente
baixo.
So necessrios ensaios suplementares se se pretender estabelecer a distino entre biodegradao (ou
biodegradao parcial) e adsoro.
Existem diversos mtodos para estabelecer tal distino, sendo o melhor a utilizao do sobrenadante como
inculo num ensaio preliminar (de preferncia um ensaio respiromtrico).
As substncias de ensaio que conduzem a uma elevada remoo neste ensaio, no associada adsoro do
COD (ou do CQO), devem ser consideradas como potencialmente biodegradveis. Uma eliminao parcial, no
associada adsoro, indica que o produto qumico , pelo menos, biodegradvel em determinada extenso.
Uma eliminao baixa ou nula de COD (ou de CQO) pode ser atribuda inibio dos microorganismos pela
substncia ensaiada, o que pode ser tambm revelado pela lise e perda de lamas, dando origem a sobrenadantes
turvos. O ensaio deve ser repetido utilizando uma menor concentrao da substncia de ensaio.
A utilizao de um mtodo analtico especfico em relao a um composto ou de uma substncia de ensaio
marcada com
14
C pode permitir uma maior sensibilidade. No caso dos compostos marcados com
14
C, a
recuperao do
14
CO
2
confirmar que se verificou biodegradao.
Quando os resultados se exprimem em termos de biodegradao primria, deve ser dada, se possvel, uma
explicao relativa modificao de estrutura qumica que conduz a uma diminuio da resposta da substncia
original.
A validade do mtodo analtico deve ser acompanhada da indicao da resposta encontrada no ensaio de
controlo (branco).
4. REFERNCIAS
(1) OCDE, Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Deciso C(81) 30 final do Conselho.
(2) Annex V C.9 Degradation: Chemical Oxygen Demand, Directiva 84/449/CEE da Comisso (JO L 251 de
19.9.1984, p. 1).
Apndice
EXEMPLO DE UMA AVALIAO
Composto orgnico: cido 4-etoxibenzico
Concentrao terica no ensaio: 600 mg/l
COD terico: 390 mg/l
Inculo: estao de tratamento de guas residuais de
Concentrao: 1 grama matria seca/litro
Estado de adaptao: no adaptado
Anlise: determinao do COD
Volume da amostra: 3 ml
Substncia de controlo: dietilenoglicol
Toxicidade do composto: sem efeitos txicos para valores inferiores a 1 000 mg/l
Ensaio realizado: ensaio em tubos de fermentao
Instante do ensaio
Substncia de controlo Substncia de ensaio
Branco
COD (
1
)
mg/l
COD (
1
)
mg/l
COD
lquido mg/l
Degradao
%
COD (
1
)
mg/l
COD lquido
mg/l
Degradao
%
0 300,0 390,0
3 horas 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6
1 dia 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6
2 dias 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9
5 dias 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52
6 dias 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65
7 dias 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76
8 dias 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87
9 dias 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97
10 dias 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
(
1
) Valores mdios de trs determinaes.
Figura 1
Exemplos de curvas de biodegradao
Figura 2
Exemplos de adaptao das lamas
C.10. BIODEGRADAO
ENSAIOS DE SIMULAO DE LAMAS ACTIVADAS
1. MTODO
1.1. INTRODUO
1.1.1. Observaes gerais
Este mtodo aplica-se apenas s substncias orgnicas que nas concentraes utilizadas no teste:
so suficientemente solveis em gua para permitir a preparao das solues de ensaio,
tm uma presso de vapor negligencivel nas condies do ensaio,
no provocam um efeito inibidor sobre as bactrias.
Na interpretao dos resultados obtidos, especialmente nos casos em que os resultados so pouco elevados ou
marginais, sero teis as informaes respeitantes s propores relativas dos principais componentes da
Para a interpretao dos resultados pouco elevados e na seleco das adequadas concentraes de ensaio, so
desejveis informaes relativas toxicidade da substncia para os microorganismos.
1.1.2. Determinao da biodegradao final (anlises COD/CQO)
O objectivo do presente mtodo determinar a biodegradao final medindo a remoo da substncia e
quaisquer metabolitos num modelo de uma estao de lamas activadas a uma concentrao correspondente a
mais de 12 mg COD/l (ou aproximadamente 40 mg de CQO/l). Parece ser 20 mg COD/l o valor ptimo.
(COD = carbono orgnico dissolvido; CQO = carncia qumica de oxignio).
Deve ser determinado o teor em carbono orgnico (ou a carncia qumica de oxignio) de uma substncia a
ensaiar.
1.1.3. Determinao da biodegradao primria (anlise especfica)
O objectivo do mtodo determinar o biodegradao primria de uma substncia num modelo de uma estao
de lamas activadas, a uma concentrao de cerca de 20 mg/l, utilizando um mtodo analtico especifico (podem
utilizar-se concentraes maiores ou menores se o mtodo analtico e as caractersticas de toxicidade o
permitirem), o que torna possvel a avaliao da biodegradao primria de uma substncia (desaparecimento
da estrutura qumica inicial).
O objectivo do presente mtodo no a determinao da mineralizao da substncia de ensaio.
Deve ser possvel dispor de um mtodo analtico adequado para a determinao da substncia de ensaio.
1.2.1. Anlise COD/CQO
A taxa de remoo de uma substncia dada pela frmula:
TR=
T E E
o

T
100 %
[1(a)]
em que:
TR = taxa de remoo em percentagem de COD (ou de CQO) ao longo de um dado tempo de reteno mdio
da substncia de ensaio,
T = concentrao da substncia de ensaio no afluente, em mg de COD/l (ou mg de CQO/l),
E = concentrao de COD (ou CQO) no efluente da unidade de ensaio, em mg de COD/l (ou em mg de
CQO/l),
E
O
= concentrao de COD (ou CQO) no efluente da unidade em branco, em mg COD/l (ou CQO/l).
A degradao expressa em termos de percentagem de remoo de COD (ou de CQO) no decurso de um dado
tempo de reteno da substncia de ensaio.
1.2.2. Anlise especfica
A percentagem de eliminao da substncia de ensaio da fase aquosa (R
w
) durante um dado tempo de reteno
mdio dada pela frmula:
R
W =
C
l
C
O
C
l
100 %
[1(b)]
em que:
CI = concentrao da substncia no afluente da unidade de ensaio (mg de substncia/l, determinada por
anlise especfica),
C
o
= concentrao da substncia no efluente da unidade de ensaio (mg de substncia/l, determinada por
anlise especfica).
Quando se estuda uma nova substncia, podem, por vezes, revelar-se teis substncias de referncia; contudo,
ainda no podem ser recomendadas substncias de referncia especiais.
1.4. PRINCPIOS DOS MTODOS DE ENSAIO
Para a determinao da biodegradao final utilizam-se em paralelo duas unidades-piloto de lamas activadas
(ensaio de confirmao OCDE ou unidades de vasos porosos). A substncia de ensaio adicionada ao afluente
(guas residuais sintticas ou domsticas) de uma das unidades, enquanto a outra recebe apenas as guas
residuais. Para a determinao da biodegradao primria, com uma anlise especfica do afluente e do
efluente, apenas se utiliza uma unidade.
As concentraes de COD (ou de CQO) so medidas nos efluentes, ou recorre-se a anlises especficas para
determinao das concentraes da substncia.
O COD atribuvel substncia de ensaio no determinado, mas simplesmente referido.
Quando se efectuam medies do COD (ou de CQO), considera-se que a diferena entre as concentraes
mdias do efluente do ensaio e do efluente do controlo devida substncia de ensaio no degradada.
Quando se efectuam anlises especficas, podem ser medidas variaes de concentrao da molcula-me
(biodegradao primria).
As unidades podem funcionar segundo o mtodo das unidades interligadas, atravs de um processo de
transinoculao.
A concentrao inicial da substncia depende do tipo de anlise efectuada e respectivas limitaes.
1.6.1. Preparao
1.6.1.1. E q ui pa me nt o
necessrio um par de unidades do mesmo tipo, excepto quando so efectuadas anlises especficas. Podem ser
utilizados dois tipos de equipamento:
Ensaio de confirmao da OCDE
O equipamento (apndice 1) consiste num recipiente de armazenagem (A) para as guas residuais sintticas,
uma bomba de doseamento (B), um recipiente de arejamento (C), um decantador (D), uma bomba de ar
comprimido (E) para reciclar as lamas activadas e um recipiente (F) para a recolha do efluente tratado.
Os recipientes (A) e (F) devem ser de vidro ou de uma matria plstica adequada e com uma capacidade de pelo
menos 24 litros. A bomba (B) deve fornecer ao recipiente de arejamento um fluxo constante de guas residuais
sintticas; pode ser utilizado qualquer sistema adequado, desde que se assegure o fluxo de entrada e a
concentrao. Durante o funcionamento normal, a altura do decantador (D) fixada de modo a que o volume
contido no recipiente de arejamento seja de 3 litros de licor misto. suspenso no recipiente (C), por cima do
cone, um arejador poroso (G). A quantidade de ar insuflada atravs do arejador deve ser registada por meio de
um medidor de fluxo.
A bomba de ar comprimido (E) fixada de modo a que as lamas activadas provenientes do decantador sejam
continua e regularmente recicladas para o recipiente de arejamento (C).
Vaso poroso
O vaso poroso constitudo por folhas de polietileno poroso (2 mm de espessura, dimetro mximo dos poros
95 m), enroladas de forma a constituir um cilindro de 14 cm de dimetro, com uma base cnica de 45
o
(figuras 1 e 2 do apndice 2). O vaso poroso colocado dentro de um recipiente estanque em matria plstica
adequada com 15 cm de dimetro e com um orifcio na parte cilndrica a 17,2 cm da base do cilindro que
determina a capacidade (3 l) do vaso. volta do topo do vaso interior existe um anel de suporte rgido, em
matria plstica adequada de modo a que exista um espao para o efluente de 0,5 cm entre os recipientes
interior e exterior.
Os vasos porosos podem ser colocados na base de um banho de gua controlado termostaticamente. Na base
do vaso interior so colocados difusores adequados de modo a haver um fornecimento de ar na base.
Os recipientes (A) e (E) devem ser de vidro ou de matria plstica adequada com uma capacidade de, pelo
menos, 24 litros. A bomba (B) deve fornecer ao recipiente de arejamento um fluxo constante de guas residuais
sintticas; pode ser utilizado qualquer sistema adequado, desde que sejam assegurados o fluxo de entrada e a
concentrao.
So necessrios vasos porosos interiores de reserva para substituir qualquer um que eventualmente seja
obstrudo durante a utilizao; os vasos obstrudos podem ser limpos por imerso durante 24 horas numa
soluo de hipoclorito, seguida de uma lavagem cuidadosa com gua da torneira.
1.6.1.2. F i l t r a o
Aparelho de filtrao de membrana e filtros de membrana, com uma porosidade de 0,45 m. Os filtros de
membrana so adequados se se garantir que no libertam carbono nem adsorvem a substncia de ensaio na
fase de filtrao.
1.6.1.3. g ua s r e s i d ua i s
Pode ser utilizado quer um efluente sinttico adequado quer guas residuais domsticas.
Exemplo de um efluente sinttico
Dissolver por cada litro de gua da torneira:
Peptona: 160 mg,
Extracto de carne: 110 mg,
Ureia: 30 mg,
NaCl: 7 mg,
CaCl
2
.2H
2
O: 4 mg,
MgSO
4
.7H
2
O: 2 mg,
K
2
HPO
4
: 28 mg.
guas residuais domsticas
Devem ser diariamente colhidas do sobrenadante do tanque de decantao primria de uma estao de
tratamento que trate predominantemente guas residuais domsticas.
1.6.1.4. S ol u o d e r e s e r v a d a s ubs t nc i a d e e ns a i o
Deve ser preparada uma soluo da substncia de ensaio, por exemplo a 1 % , para se adicionar a concentrao
da substncia de modo a que se conhea o volume adequado a adicionar gua residual ou directamente
unidade, atravs de uma segunda bomba que fornea a concentrao de ensaio necessria.
1.6.1.5. l nc ul o
Observao: Quando se utilizam guas residuais domsticas, no se justifica a utilizao de um inculo com uma
baixa concentrao de bactrias, mas podem-se utilizar lamas activadas.
Pode-se utilizar uma grande variedade de inculos.
Apresentam-se trs exemplos de inculos adequados:
a) Inculo do efluente secundrio
O inculo deve ser recolhido de um efluente secundrio de boa qualidade, proveniente de uma estao de
tratamento que trate predominantemente guas residuais domsticas. O efluente deve ser mantido em
condies aerbias no perodo entre a colheita das amostras e a sua utilizao. Para preparar o inculo
filtra-se a amostra atravs de um filtro grosseiro e rejeitam-se os primeiros 200 ml. Mantm-se o filtrado
em condies aerbias at ser utilizado. Deve-se utilizar o inculo no prprio dia da sua colheita e na
inoculao devem-se utilizar pelo menos 3 ml.
b) Inculo composto
Inculo de efluente secundrio:
Ver a descrio anterior.
Inculo do solo:
Faz-se a suspenso de 100 g de terra de jardim (frtil, no esterilizada) em 1 000 ml de gua de beber
isenta de cloro. (No so adequados solos com uma fraco extremamente elevada de argila, areia ou
hmus), Aps agitar a suspenso, deixa-se sedimentar durante 30 minutos. Filtra-se o sobrenadante
atravs de um papel de filtro grosseiro, rejeitando-se os primeiros 200 ml. Areja-se imediatamente o
filtrado e mantm-se arejado at ao momento da sua utilizao. Deve-se utilizar o inculo no prprio dia
da sua colheita.
Inculo de uma gua superficial:
Obtm-se um outro inculo parcial a partir de uma gua superficial mesossaprbica. Filtra-se a amostra
atravs de um papel de filtro grosseiro, rejeitando os primeiros 200 ml. Mantm-se o filtrado em
condies aerbias at ao momento da sua utilizao. Deve-se utilizar o inculo no prprio dia da sua
colheita.
Juntam-se volumes iguais das trs amostras de inculos parciais, misturam-se cuidadosamente e retira-se
o inculo final desta mistura. Deve-se utilizar na inoculao pelo menos 3 ml.
c) Inculo de lamas activadas
Pode ser utilizado como inculo um determinado volume (no superior a 3 litros) de lamas activadas
(teor em slidos suspensos at a 2,5 g/l) colhidos de um tanque de arejamento de uma estao que trate
predominantemente guas residuais domsticas.
1.6.2. Mtodo
O ensaio efectuado temperatura ambiente, que deve ser mantida entre 18
o
C e 25
o
C.
Se tal for conveniente, o ensaio pode ser efectuado a uma temperatura inferior (at 10
o
C); se a substncia se
degradar, no ser normalmente exigida qualquer outra operao. Se, contudo, a substncia no for degradada,
o ensaio deve ser prosseguido a uma temperatura constante entre 18
o
C e 25
o
C.
1.6.2.1. P e r od o i ni c i a l : f or ma o d a s l a ma s / e s t a bi l i z a o d a s uni d a d e s
O perodo de crescimento/estabilizao das lamas o perodo durante o qual a concentrao de slidos
suspensos nas lamas activadas e a eficincia das unidades evolui at uma fase estacionria nas condies de
funcionamento utilizadas.
O perodo inicial o perodo que se estende desde o momento em que a substncia de ensaio adicionada pela
primeira vez at ao instante em que a sua remoo atinge uma fase estacionria (valor relativamente constante).
Este perodo no deve ultrapassar seis semanas.
O perodo de avaliao de trs semanas, a contar do momento em que a remoo da substncia de ensaio
atinge um valor relativamente constante e, em geral, elevado. Para as substncias que apresentam uma
degradao baixa ou nula durante as primeiras seis semanas, o perodo de avaliao considera-se como sendo
as trs semanas seguintes.
Comear por encher a(s) unidade(s) necessria(s) a um ensaio com o inculo misturado com o afluente.
Accionam-se ento o arejador [e a bomba de ar comprimido (E) no caso do ensaio de confirmao da OCDE] e
a bomba de doseamento (B).
O afluente, sem a substncia a ensaiar, deve passar atravs do recipiente de arejamento (C) quer velocidade de
um litro por hora quer velocidade de meio litro por hora, o que d um tempo de reteno mdio de trs ou
seis horas.
A taxa de arejamento deve ser regulada de modo a que o contedo do recipiente (C) se mantenha
constantemente em suspenso enquanto o teor em oxignio dissolvido seja pelo menos de 2 mg/l.
Deve-se evitar a formao de espuma mediante meios adequados. No devem ser utilizados agentes para evitar
a formao de espumas que inibam as lamas activadas.
As lamas que se depositarem em torno do topo do recipiente de arejamento (C) [e no ensaio de confirmao da
OCDE, na base do recipiente de decantao (D) e no circuito de circulao] devem ser de novo misturadas com
o licor misto pelo menos uma vez por dia mediante raspagem ou qualquer outro meio adequado.
Quando as lamas j no conseguirem depositar-se, a sua densidade pode ser aumentada adicionando fraces
de 2 ml de uma soluo de cloreto de ferro a 5 %, quantas vezes for necessrio.
O efluente recolhido no recipiente (E ou F) durante vinte a vinte e quatro horas e colhe-se uma amostra depois
de o misturar cuidadosamente. Deve-se proceder a uma cuidadosa limpeza do recipiente (E ou F).
Para vigiar e controlar a eficincia do processo mede-se a carncia qumica de oxignio (CQO) ou o carbono
orgnico dissolvido (COD) do filtrado do efluente acumulado pelo menos duas vezes por semana e igualmente
do afluente filtrado [utilizando uma membrana de porosidade igual a 0,45 m, so rejeitados
(aproximadamente) os primeiros 20 ml do filtrado].
A reduo de CQO e COD deve estabilizar-se quando se atingir uma degradao diria regular.
O teor das lamas activadas em matria seca no recipiente de arejamento deve ser determinado duas vezes por
semana (em g/l). Pode-se fazer funcionar as unidades de uma das duas seguintes maneiras: determinar duas
vezes por semana quer o teor em matria seca das lamas activadas e no caso de ser superior a 2,5 g/l retirar as
lamas activadas em excesso quer retirar diariamente 500 ml de licor misto de cada recipiente de modo a obter
um tempo de reteno mdio das lamas de seis dias.
Quando os parmetros estimados e medidos [eficincia do processo (em termos de remoo de CQO e COD),
concentrao das lamas, decantabilidade das lamas, turvao dos efluentes, etc.] das duas unidades so
suficientemente estveis, a substncia de ensaio pode ser adicionada ao afluente de uma das unidades, seguindo
o ponto 1.6.2.2.
A substncia de ensaio pode ser adicionada, alternativamente, no incio do perodo de crescimento das lamas
(1.6.2.1), em especial quando as lamas so introduzidas como inculo.
1.6.2.2. M t od o d e e ns a i o
Mantm-se as condies de funcionamento do perodo inicial e adiciona-se ao afluente da unidade de ensaio
uma quantidade suficiente de soluo-me (aproximadamente 1 %) da substncia de ensaio de modo a que se
obtenha a concentrao desejvel da substncia de ensaio (aproximadamente 10 a 20 mg COD/l ou 40 mg
CQO/l) nas guas residuais, o que pode ser feito misturando diariamente a soluo-me nas guas residuais ou
mediante um sistema de bombagem separado. Esta concentrao pode ser atingida progressivamente. Se no se
verificarem efeitos txicos da substncia de ensaio sobre as lamas activadas podem experimentar-se
concentraes mais elevadas.
A unidade em branco alimentada apenas com afluente isento de substncias adicionadas. Colhem-se volumes
adequados de efluentes para anlise e filtram-se atravs de filtros de membrana (0,45 m), rejeitando os
primeiros 20 ml (aproximadamente) de filtrado.
As amostras filtradas devem ser analisadas no prprio dia ou ento devem ser conservadas mediante qualquer
mtodo adequado, por exemplo, utilizando 0,05 ml de uma soluo de cloreto mercrico (HgCl
2
) a 1 % por
cada 10 ml de filtrado ou armazenando o filtrado entre 2 a 4
o
C at um mximo de 24 horas ou abaixo de
18
o
C para perodos de tempo mais longos.
O perodo ao longo do qual se estende a experincia, que inclui a adio da substncia de ensaio, no deve
ultrapassar seis semanas e o perodo de avaliao no deve ser inferior a trs semanas, ou seja, deve-se poder
dispor de cerca de 14 a 20 determinaes para o clculo do resultado final.
Interligao das unidades
A interligao das unidades obtm-se trocando entre si, uma vez por dia, 1,5 l de licor misto (incluindo lamas)
proveniente dos recipientes de arejamento das lamas activadas de duas unidades. No caso das substncias de
ensaio serem fortemente adsorventes, retiram-se apenas 1,5 l do lquido sobrenadante dos recipientes de
decantao e deitam-se para o recipiente com lamas activadas da outra unidade.
1.6.2.3. An l i s e
Para acompanhar o comportamento da substncia, podem ser efectuados dois tipos de anlise:
COD ou CQO
As concentraes de COD so determinadas em duplicado com o analisador de carbono e/ou os valores da
CQO so determinados em conformidade com a referncia (2).
Anlise especfica
As concentraes da substncia de ensaio so determinadas mediante um mtodo analtico adequado. Sempre
que possvel, deve efectuar-se uma determinao especfica da substncia adsorvida nas lamas.
2.1. INTERLIGAO DAS UNIDADES
Quando se utiliza a interligao das unidades calculam-se as taxas de remoo TR dirias em % de acordo
com 1.2.1.
Estas taxas de remoo TR dirias so corrigidas em termos de TRc para o material transferido devido ao
processo de transinoculao atravs da equao [2] para um tempo de reteno mdio de trs horas ou da
equao [3] para um tempo de reteno mdio de 6 horas.
DRc =
4
3
DR
100
3
[2]
DRc =
8
7
DR
100
7
[3]
Calcula-se a mdia das sries dos valores TRc e ainda o desvio-padro de acordo com a equao 4:
S
DRc =
n
i = 1
DR
c DRc
i
_ _
2
n 1
_
[4]
em que:
S
TRc
= desvio-padro das sries de valores TRc
TRc = mdia do valor TRc
n = nmero de determinaes
Rejeitam-se os valores discrepantes das sries TRc segundo um processo estatstico adequado, por exemplo, o
de Nalimov [6] para um nvel de probabilidade de 95 % e calcula-se de novo a mdia e o desvio-padro do
conjunto de dados, TRc sem os valores discrepantes.
Calcula-se ento o resultado final recorrendo equao [5]:
TRc = TRc
t
n 1
;
S
n
p TRc [5]
em que:
t
n
1
;a
= valor tabelado de t para n pares de valores de E e E
o
e confiana estatstica P (P = 1 ) pelo que P
fixado a 95 % (1).
O resultado expresso pela mdia com limites de tolerncia ao nvel de probabilidade de 95 %, o desvio-padro
e o nmero de dados da srie das TRc menos os valores discrepantes, e o nmero de valores discrepantes, por
exemplo:
TRc = 98,6 2,3 % da remoo de COD,
s = 4,65 % da remoo de COD,
n = 18,
x = nmero de valores discrepantes.
2.2. UNIDADES NO INTERLIGADAS
O rendimento das unidades pode ser verificado do seguinte modo:
% de remoo de CQO ou COD=
CODorDOCsewage CODorDOCeffluent
CODorDOCsewage
100
Esta remoo diria pode ser representada graficamente para permitir identificar qualquer tipo de tendncia,
por exemplo, climatizao.
2.2.1. Utilizao da determinao da CQO/COD
A taxa diria de remoo em % TR calcula-se segundo 1.2.1.
Calcula-se a mdia da srie de valores TR e ainda o seu desvio-padro segundo a frmula seguinte:
S
TR =
n
i = 1
TR TR
i
_ _
2
n 1
_
[6]
em que:
S
TR
= desvio-padro da srie de valores TR
i
TR = mdia dos valores TR
i
n = nmero de determinaes.
Eliminam-se os valores discrepantes da srie TR de acordo com um mtodo estatstico adequado, por exemplo,
o de Nalimov [6], ao nvel de probabilidade de 95 % e calcula-se de novo o desvio-padro da srie de dados TR,
menos os valores discrepantes.
O resultado final calculado por meio de equao [7]:
TR= TR
t
n 1
;
S
n
p TR [7]
em que:
t
n-1
; = valor tabelado de t para n pares de valores de E e E
o
e confiana estatstica P (P = 1-
) em que P fixado
a 95 % (1).
O resultado expresso como a mdia com limites de tolerncia ao nvel de probabilidade de 95 %, o respectivo
desvio-padro e o nmero de dados da srie dos TR menos os valores discrepantes, e o nmero de valores
discrepantes, por exemplo:
TR = (98,6 2,3 %) de remoo de COD,
5 = 4,65 % de remoo de COD,
n = 18,
x = nmero de valores discrepantes.
2.2.2. Utilizao de anlise especfica
Calcula-se a percentagem de eliminao da substncia a ensaiar da fase aquosa (R
w
) de acordo com 1.2.2.
3. RELATRIO
o formulrio includo no apndice 3, indicando as condies de funcionamento do ensaio,
o equipamento escolhido (ensaio de confirmao da OCDE ou ensaio de vaso poroso),
o modo de funcionamento escolhido: unidades interligadas ou no,
as guas residuais: sintticas ou domsticas,
no caso das guas residuais domsticas: data e local de colheita da amostra,
o inculo com data e local de colheita da amostra,
uma descrio do mtodo de anlise, se forem efectuadas anlises especficas,
a representao grfica da remoo CQO ou COD em funo do tempo durante o perodo inicial e o
perodo de avaliao,
recuperao analtica da substncia de ensaio na forma de CQO ou COD na soluo-me,
se foram efectuadas anlises especificas, a representao grfica da percentagem de remoo da
substncia a ensaiar da fase aquosa em funo do tempo (perodo inicial e perodo da avaliao),
a remoo mdia de COD ou de CQO da substncia a ensaiar e o desvio-padro calculado a partir dos
resultados do perodo de avaliao, ou seja, quando h uma remoo regular da substncia a ensaiar ou se
verifica um perodo de funcionamento estacionrio,
a representao grfica da concentrao das lamas activadas em funo do tempo,
qualquer observao relativa s lamas activadas (rejeio de um excesso de lama, presena de um
aglomerado, FeC1
3
, etc.),
concentrao da substncia utilizada no ensaio,
todos os resultados relativos anlise efectuada nas lamas,
todas as informaes e resultados experimentais relativos substncia ensaiada e, se for caso disso,
substncia de referncia,
as razes cientficas de quaisquer modificaes da metodologia.
Uma remoo baixa da substncia ensaiada da fase aquosa pode ser devida a uma inibio dos
microorganismos pela substncia ensaiada, o que pode igualmente traduzir-se por uma lise e perda de lamas,
dando origem a um sobrenadante turvo, e por uma diminuio da eficincia da instalao-piloto do ponto de
vista da remoo do COD (ou CQO).
A adsoro fsico-qumica pode, por vezes, ter influncia. As diferenas entre a aco biolgica na molcula e a
adsoro fsico-qumica podem ser reveladas por uma anlise efectuada nas lamas aps uma desoro
adequada.
So necessrios ensaios complementares, se se pretender estabelecer uma distino entre biodegradao (ou
biodegradao parcial) e adsoro, o que pode ser feito de diferentes maneiras, mas a mais conveniente consiste
em utilizar o sobrenadante como inculo num ensaio preliminar (de preferncia ensaio respiromtrico).
Se se observarem remoes acentuadas de COD ou CQO, estas so devidas a biodegradao enquanto que para
as remoes baixas no possvel distinguir entre biodegradao e eliminao. Por exemplo, se um composto
solvel apresenta uma constante de adsoro elevada de 98 % e se a taxa diria de rejeio de lamas
excedentrias de 10 %, possvel uma eliminao que atinja 40 % no mximo; para uma taxa de rejeio de
lamas excedentrias de 30 %, a eliminao devida adsoro e rejeio de lamas excedentrias pode atingir
65 % (4).
No caso de uma anlise especfica, conveniente ter em ateno a relao entre a estrutura da substncia e a
anlise especfica efectuada. Nesse caso, o fenmeno observado no pode ser interpretado como uma
mineralizao da substncia.
4. REFERNCIAS
(1) OCDE, Paris, 1981, Test Guideline 303 A, Deciso C(81) 30 final do Conselho.
(2) Annex V C9 Degradation: Chemical Oxygen Demand, Directiva 84/449/CEE da Comisso (JO L 251 de
19.9.1984, p. 1).
(3) Painter H. A., King E. F., WRC Porous-Pot method for assessing biodegradability, Technical Report TR70,
Junho 1978, Water Research Center, United Kingdom.
(4) Wierich, P., Gerike, P., The Fate of Soluble. Recalcitrant, and Adsorbing Compounds in Acrivated Sludge
Plants, Ecotoxicology and Environmental Safety, vol. 5, n
o
2, Junho 1981, p. 161-171.
(5) Directivas 82/242/CEE e 82/243/CEE do Conselho (JO L 109 de 22.4.1982, p. 1), que altera as Directivas
73/404/CEE e 73/405/CEE do Conselho: Biodegradabilidade dos detergentes (JO L 347 de 17.12.1973,
p. 51).
(6) Streuli, H., Fehlerhafte Interpretation und Anwendung von Ausreiertests, insbesondere bei Ringversu-
chen zur Uberprfung analytisch-chemischer Untersuchungsmethoden, Fesenius-Zeitschrift fr Analytische
Chemie 303(1980), p. 406-408.
Apndice 1
Figura 1
Figura 2
Apndice 2
Figura 1
Equipamento utilizado na avaliao da biodegradao
Figura 2
Pormenor do vaso poroso de arejamento de trs litros
Apndice 3
Condies de funcionamento do ensaio de simulao das lamas activadas
Verificar em cada grupo
Equipamento
Confirmao OCDE
Vaso poroso
Modo de funcionamento
Unidade simples
Unidades interligadas
Unidades no interligadas
Transinoculao
Inexistente
Lamas activadas
Sobrenadante
Tempo mdio de reteno
trs horas
seis horas
Elemento nutritivo de base
guas residuais domsticas
guas residuais sintticas
Inculo
Efluente secundrio
Compsito
Lamas activadas
Adio da substncia a ensaiar
Desde o incio
Aumento progressivo
Aps formao das lamas
Anlise
Especfica
CQO
COD
C.11. BIODEGRADAO
LAMAS ACTIVADAS: ENSAIO DE INIBIO DA RESPIRAO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O mtodo descrito avalia o efeito da substncia de ensaio sobre os microorganismos medindo a taxa
respiratria em condies determinadas, na presena de diferentes concentraes da substncia de ensaio.
O objectivo do presente mtodo fornecer um processo de seleco rpido que permita identificar as
substncias de ensaio que podem afectar negativamente o funcionamento das estaes de tratamento
microbiano aerbio e indicar as concentraes adequadas no inibidoras das substncias de ensaio a utilizar nas
experincias de biodegradao.
Um ensaio (preliminar) pode preceder o ensaio final, o qual fornecer informaes relativas gama de
concentraes a utilizar no ensaio principal,
Alm dos ensaios com a substncia a estudar, incluem-se no protocolo experimental dois controlos, um no
incio e outro no final da srie de experincias. Cada lote de lamas activadas deve igualmente ser testado
utilizando uma substncia de referncia.
O presente mtodo aplica-se sobretudo a substncias que, em virtude da sua solubilidade na gua e fraca
volatilidade, so susceptveis de permanecer na gua. Para as substncias cuja solubilidade no meio do ensaio
limitada, pode no ser possvel determinar a CE
50
.
Os resultados baseados no consumo de oxignio podem conduzir a concluses errneas quando a substncia
de ensaio tem tendncia a romper a fosforilao oxidativa.
Para efectuar o ensaio, til dispor das seguintes informaes:
solubilidade na gua,
presso de vapor,
frmula de estrutura,
pureza da substncia de ensaio.
Recomendao:
As lamas activadas podem conter organismos potencialmente patognicos e devem ser manipuladas com
prudncia.
A laxa respiratria o consumo de oxignio dos microorganismos aerbios contidos nas lamas das guas
residuais, expresso geralmente em mg O
2
por mg de lamas por hora.
Para calcular o efeito inibidor de uma substncia de ensaio numa dada concentrao; exprime-se a taxa
respiratria sob a forma de percentagem da mdia:
1
2R
s
Rc
1
Rc
2
_ _
100 = percentagem de inibio
em que:
R
s
= taxa de consumo de oxignio da substncia de ensaio a uma dada concentrao,
Rc
1
= taxa de consumo de oxignio do controlo 1,
Rc
2
= taxa de consumo de oxignio do controlo 2.
Neste mtodo, a CE
50
a concentrao da substncia de ensaio para a qual a taxa respiratria 50 % da
verificada no controlo, nas condies descritas neste mtodo.
Recomenda-se a utilizao como substncia de referncia do 3,5-diclorofenol, um conhecido inibidor da
respirao e para cada lote de lamas activadas, determina-se a CE
50
dessa substncia a fim de avaliar se a
sensibilidade das lamas no anormal.
Mede-se a taxa respiratria das lamas activadas alimentadas com uma quantidade-padro de guas residuais
sintticas aps um tempo de contacto de 30 minutos ou de trs horas, ou de ambos. Por outro lado, mede-se
igualmente a taxa respiratria das mesmas lamas activadas em presena de diversas concentraes da
substncia de ensaio em condies idnticas. O efeito inibidor da substncia de ensaio a uma determinada
concentrao expresso como uma percentagem do valor mdio das taxas respiratrias dos dois controlos.
Calcula-se um valor de CE
50
a partir das determinaes feitas a diferentes concentraes.
Os resultados do ensaio so vlidos se:
as taxas respiratrias dos dois controlos no diferirem entre si mais de 15 %,
a CE
50
(30 minutos e/ou trs horas) do 3,5-diclorofenol se situa num intervalo aceitvel de 5 a 30 mg/l.
1.6.1. Reagentes
1.6.1.1. S ol u e s d a s ubs t nc i a d e e ns a i o
Preparam-se solues frescas da substncia de ensaio no incio deste a partir de uma soluo-me. adequada
uma soluo-me com a concentrao de 0,5 g/l quando se utiliza a metodologia a seguir indicada.
1.6.1.2. S ol u o d a s ubs t nc i a d e c ont r ol o
Pode-se preparar, por exemplo, uma soluo de 3,5-diclorofenol dissolvendo 0,5 g de 3,5 diclorofenol em
10 ml de 1M NaOH, diluindo depois em gua destilada at perfazer aproximadamente 30 ml e adicionando, ao
mesmo tempo que se agita, 0,5 M H
2
SO
4
at ao incio da precipitao so necessrios aproximadamente
8 ml de 0,5 M H
2
SO
4
e por fim, dilui-se a mistura com gua destilada at perfazer 1 litro. O pH dever ento
estar compreendido entre 7 e 8.
1.6.1.3. g ua s r e s i d ua i s s i nt t i c a s
Prepara-se uma alimentao de guas residuais sintticas dissolvendo as seguintes quantidades de substncias
num litro de gua:
16 g de peptona,
11 g de extracto de carne,
3 g de ureia,
0,7 g de NaCl,
0,4 g de CaCl
2
.2H
2
O,
0,2 g de MgSO
4
.7H
2
O,
2,8 g de K
2
HPO
4
.
Nota 1: Esta gua residual sinttica 100 vezes mais concentrada do que a descrita no relatrio tcnico da
OCDE Mtodo proposto para a determinao da biodegradao dos agentes tensioactivos utilizados nos
detergentes sintticos, de 11 de Junho de 1976, com a adio de hidrogenofosfato de dipotssio.
Nota 2: Se o meio que se preparou no for utilizado imediatamente, deve ser guardado em condies de
obscuridade, temperatura de 0 a 4
o
C, por um perodo mximo de uma semana, em condies em que no se
verifique qualquer alterao da sua composio. Antes de se proceder ao seu armazenamento, o meio pode
igualmente ser esterilizado ou proceder-se adio da peptona e do extracto de carne um pouco antes de
efectuar o ensaio. Antes de utilizar este meio, deve-se misturar completamente e ajustar-se o pH.
1.6.2. Equipamento
Aparelho de medio: no essencial uma concepo especfica do aparelho. Contudo, no deve existir
qualquer espao vazio por cima do lquido e o elctrodo deve adaptar-se perfeitamente ao gargalo do frasco de
medio.
E necessrio um equipamento normal de laboratrio e especialmente os seguintes instrumentos:
aparelho de medio,
dispositivo de arejamento,
elctrodo e aparelho de medio do pH,
elctrodo de oxignio.
1.6.3. Preparao do inculo
Como inculo microbiano para o ensaio, utilizam-se lamas activadas provenientes de uma estao de
tratamento de guas residuais que trate predominantemente guas residuais domsticas.
Se necessrio, no laboratrio, as partculas grosseiras podem ser removidas por sedimentao durante um curto
perodo de tempo, por exemplo de 15 minutos, e decantando posteriormente o sobrenadante, contendo os
slidos mais finos, para ser utilizado no ensaio. Alternativamente, podem-se misturar as lamas durante alguns
segundos recorrendo a um misturador.
Alm disso, se se suspeitar que se encontram presentes substncias inibidoras, as lamas devem ser lavadas com
gua da torneira ou com uma soluo isotnica. Aps centrifugao, o sobrenadante decantado (repete-se
este processo trs vezes).
Pesa-se e seca-se uma pequena quantidade de lamas. A partir deste resultado, pode-se calcular a quantidade de
lamas hmidas que devem ser dispersas em gua de modo a obter lamas activadas com uma concentrao de
slidos suspensos no licor misto entre 2 e 4 g/l. Este valor conduz a uma concentrao no meio de 0,8 a 1,6g/l
se se seguir a metodologia abaixo recomendada.
Se as lamas no puderem ser utilizadas no prprio dia da sua colheita, adicionam-se 50 ml de guas residuais
sintticas a cada litro de lamas activadas preparadas da forma acima descrita e arejam-se durante a noite
temperatura de 20 2
o
C. Conservam-se arejadas para serem utilizadas durante o dia. Antes da sua utilizao,
verifica-se o pH e, se necessrio, ajusta-se a pH 6,0 a 8,0. Os slidos suspensos no licor misto devem ser
determinados tal como foi descrito no pargrafo anterior.
Se for necessrio utilizar o mesmo lote de lamas durante vrios dias consecutivos (quatro dias no mximo)
adiciona-se uma outra dose de 50 ml de gua residual sinttica por litro de lamas no final de cada dia de
trabalho.
Durao/tempo de contacto: 30 minutos e/ou trs horas, durante as quais o meio de ensaio arejado
gua: gua de beber (desclorada, se necessrio)
Fornecimento de ar: ar limpo, sem leo. Caudal de ar de 0,5 a 1 l/minuto
Aparelho de medio: frasco de fundo plano tal como o destinado medio da DBO
Medidor de oxignio: elctrodo de oxignio adequado com um registador
Soluo nutritiva: guas residuais sintticas (ver acima)
Substncia de ensaio: a soluo de ensaio fresca preparada no incio do ensaio
Substncia de referncia: por exemplo, 3,5 diclorofenol (em pelo menos trs concentraes)
Controlos: amostra inoculada, sem substncia de ensaio
Temperatura: 20 2
o
C.
Sugere-se seguidamente um mtodo experimental que pode ser aplicado tanto substncia de ensaio como
substncia de referncia para um tempo de contacto de trs horas.
Utilizam-se vrios recipientes (por exemplo, provetas de um litro). .
Devem-se utilizar pelo menos cinco concentraes, espaadas entre si por um factor constante que, de
preferncia, no deve ultrapassar 3,2.
No instante 0, a 16 ml de gua residual sinttica adiciona-se gua at perfazer 300 ml. Juntam-se 200 ml de
inculo microbiano e deita-se a mistura (500 ml) para um primeiro recipiente (primeiro controlo C
1
).
Os recipientes de ensaio devem ser continuamente arejados de modo a garantir que o O
2
dissolvido no desa
abaixo de 2,5 mg/l e que, imediatamente antes da medio da taxa respiratria, a concentrao de O
2
seja de
cerca de 6,5 mg/l.
Ao fim de 15 minutos (15 minutos um intervalo arbitrrio, mas conveniente), repete-se o procedimento
anterior com a excepo de que se adicionam 100 ml da soluo de reserva da substncia de ensaio a 16 ml de
gua residual sinttica, antes de proceder adio de gua at perfazer 300 ml e do inculo microbiano at aos
500 ml. Esta mistura em seguida deitada para um segundo recipiente e arejada tal como anteriormente.
Repete-se este procedimento de quinze em quinze minutos com diferentes volumes da soluo-me da
substncia de ensaio a fim de obter uma srie de recipientes com diferentes concentraes da substncia de
ensaio. Por fim, prepara-se um segundo controlo (C
2
).
Ao fim de trs horas regista-se o pH, deita-se uma amostra bem misturada do contedo do primeiro recipiente
no aparelho de medio e mede-se a taxa respiratria durante um perodo mximo de 10 minutos.
Repete-se esta determinao com o contedo de cada recipiente a intervalos de quinze minutos de modo a que
o tempo de contacto em cada recipiente seja de trs horas.
A substncia de referncia ensaiada de modo idntico com cada lote de inculo microbiano.
Ser necessrio um processo diferente (por exemplo, mais do que um aparelho de medio de oxignio) quando
se efectuarem as medies aps 30 minutos de contacto.
Se for necessrio determinar o consumo de oxignio, preparam-se recipientes suplementares contendo a
substncia de ensaio, gua residual sinttica e gua, mas sem lamas activadas. O consumo de oxignio medido
e registado aps um tempo de arejamento de 30 minutos e/ou trs horas (tempo de contacto).
A taxa respiratria calcula-se a partir do traado do registador para as medies compreendidas
aproximadamente entre 6,5 mg de O
2
/l e 2,5 mg de O
2
/l ou durante um perodo de dez minutos quando a
taxa respiratria baixa. A parte da curva respiratria sobre a qual se mede a taxa respiratria deve ser linear.
Se as taxas respiratrias dos dois controlos diferirem entre si de mais de 15 % ou se a CE
50
(30 minutos e/ou
trs h) da substncia de referncia no se encontrar no intervalo aceitvel (5 a 30 mg/l para o 3,5
diclorofenol), o ensaio no vlido e deve ser repetido.
Calcula-se a percentagem de inibio para cada concentrao de ensaio (ver 1.2). Representa-se graficamente
em papel log-normal (ou log-probabilidade) a percentagem de inibio em funo da concentrao e deduz-se
o valor de CE
50
.
Podem ser determinados os intervalos de confiana a 95 % para os valores de CE
50
segundo os mtodos
normalmente utilizados.
3. RELATRIO
substncia de ensaio: dados de identificao qumica,
sistema de ensaio: origem, concentrao e eventual tratamento prvio das lamas activadas,
condies de ensaio:
pH da mistura de reaco antes da medio da respirao,
temperatura de ensaio,
durao do ensaio,
substncia de referncia e respectiva CE
50
,
consumo abitico de oxignio (se se verificar),
resultados:
todos os dados determinados,
curva de inibio e mtodo de clculo da CE
50
,
CE
50
e, se possvel, intervalos de confiana a 95 %, CE
20
e CE
80
,
todas as observaes e quaisquer desvios em relao ao presente mtodo de ensaio que
poderiam ter influenciado os resultados.
O valor da CE
50
deve ser apenas considerado como uma indicao da toxicidade provvel da substncia de
ensaio quer para o tratamento das guas residuais por lamas activadas quer para os microorganismos das guas
residuais, uma vez que as complexas interaces que se verificam no ambiente no podem ser simuladas com
preciso num ensaio de laboratrio. Alm disso, as substncias de ensaio que podem ter um efeito inibidor na
oxidao do amonaco podem tambm produzir curvas de inibio atpicas. Por conseguinte, tais curvas devem
ser cuidadosamente interpretadas.
4. REFERNCIAS
(1) Internacional Standard ISO 8192-1986.
(2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, p. 165.
(3) Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, p. 245.
(4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries) Recommended
Method n
o
103, also described by:
(5) Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, p. 80.
(6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, p. 247.
(7) OCDE, Paris, 1981, Test Guideline 209, Deciso C(81) 30 final do Conselho.
C.12. BIODEGRADAO
ENSAIO LASC MODIFICADO
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O objectivo do mtodo avaliar a biodegradao final potencial de substncias orgnicas solveis em gua e
no volteis quando expostas a concentraes relativamente elevadas de microorganismos durante um longo
perodo de tempo. Durante este perodo, a viabilidade dos microorganismos mantida atravs da adio diria
de uma alimentao de guas residuais decantadas. (Para conservao das guas residuais durante o fim-de-
-semana as mesmas podero ser guardadas a 4
o
C. Podem-se utilizar alternativamente as guas residuais
sintticas do ensaio de confirmao da OCDE.)
Pode verificar-se uma adsoro fsico-qumica aos slidos suspensos, o que deve ser tomado em considerao
na interpretao dos resultados (ver 3.2).
Devido ao extenso perodo de reteno da fase lquida (36 horas) e adio intermitente de nutrientes, o ensaio
no simula as condies que ocorrem numa estao de tratamento de guas residuais. Os resultados obtidos
com vrias substncias de ensaio indicam que o ensaio apresenta um elevado potencial de biodegradao.
As condies do ensaio so altamente favorveis seleco e/ou adaptao de microorganismos capazes de
degradar o composto ensaiado. (O procedimento pode igualmente ser utilizado na produo de inculos
adaptados para utilizao em outros ensaios.)
No presente mtodo, utiliza-se a medida da concentrao de carbono orgnico dissolvido na avaliao da
biodegradao final das substncias de ensaio. prefervel determinar o COD aps acidificao e purificao do
que atravs da diferena de C
total
C
inorgnico
.
A utilizao simultnea de um mtodo analtico especfico pode permitir a avaliao da degradao primria da
substncia (desaparecimento da estrutura qumica original).
O mtodo apenas se aplica s substncias orgnicas de ensaio que, nas concentraes utilizadas no ensaio:
so solveis em gua (pelo menos 20 mg de carbono orgnico dissolvido/l),
possuem uma presso de vapor negligencivel,
no adsorvem significativamente no sistema de ensaio,
no se perdem na soluo de ensaio devido a formao de espuma,
no exercem efeitos inibidores sobre as bactrias.
Deve ser determinado o teor em carbono orgnico da substncia de ensaio,
As informaes respeitantes s propores relativas dos componentes principais das substncias de ensaio
sero teis na interpretao dos resultados obtidos, especialmente nos casos em que os resultados so baixos ou
marginais.
As informaes relativas toxicidade da substncia para os microorganismos podem ser teis na interpretao
dos resultados baixos e na seleco das concentraes de ensaio adequadas.
C
E
= concentrao do composto ensaiado em carbono orgnico presente ou adicionado s guas residuais
decantadas no incio do perodo de arejamento (mg/l),
C
e
= concentrao do carbono orgnico dissolvido presente no licor sobrenadante do ensaio no final do
perodo de arejamento (mg/l),
C
c
= concentrao do carbono orgnico dissolvido presente no licor sobranadante do controlo no final do
perodo de arejamento (mg/l).
No presente mtodo a biodegradao definida como o desaparecimento de carbono orgnico. A
biodegradao pode ser expressa em:
1. Remoo em percentagem D
ad
da quantidade de substncia adicionada diariamente:
D
da =
C
T
C
T
C
c

C
T
100
[1]
em que:
D
ad
= degradao/adio diria.
2. A remoo em percentagem D
ad
da quantidade de substncia presente no incio de cada dia:
D
ssd =
2C
T
C
ti
C
ci
3C
t i1
3C
c i1
2C
T
C
ti
C
ci
100
[2(a)]
2C
T
2 C
t
C
c

2C
T
C
t
C
c

100
[2(b)]
em que:
D
ad
= degradao/substncia no incio do dia;
em que os ndices i e (i + l)se referem ao dia da medio.
A equao 2(a) recomendada se o COD do efluente variar de um dia para outro, enquanto a equa-
o 2(b) pode ser utilizada quando o COD do efluente permanece relativamente constante de um dia
para o outro.
Em alguns casos, quando se investiga uma nova substncia, podem ser teis substncias de referncia; contudo,
no se recomenda aqui qualquer substncia de referncia especfica.
Fornecem-se dados relativos a diversos compostos avaliados em ensaios de intercalibrao (ver apndice 1) de
modo a que se possa fazer a calibrao do mtodo de tempos a tempos e a permitir a comparao dos
resultados quando se utiliza outro mtodo.
1.4. PRINCIPIO DO MTODO DE ENSAIO
Numa unidade de lamas activadas semicontnua (LASC), colocam-se lamas activadas provenientes de uma
estao de tratamento de guas residuais. Adicionam-se o composto a ensaiar e as guas residuais domsticas
decantadas e a mistura arejada durante 23 horas. Pra-se depois o arejamento, permitindo a sedimentao das
lamas e retira-se o licor sobrenadante.
As lamas que permanecem no tanque de arejamento so ento misturadas com outra alquota do composto de
ensaio e guas residuais e repete-se o processo.
Avalia-se a biodegradao atravs da determinao do teor em carbono orgnico dissolvido no licor
sobrenadante. Compara-se este valor com o que se obtm para o licor proveniente de um tubo de controlo
contendo apenas guas residuais decantadas.
Quando se utiliza um mtodo analtico especfico, podem medir-se alteraes na concentrao da molcula
original devido a biodegradao (Biodegradao primria).
A reprodutibilidade do presente mtodo baseado na remoo do carbono orgnico dissolvido ainda no foi,
estabelecida. (Quando se considera a biodegradao primria, obtm-se dados muito precisos para substncias
que so consideravelmente degradadas.)
A sensibilidade do mtodo determinada em larga medida pela variabilidade do ensaio em branco e, em menor
extenso, pela preciso da determinao do carbono orgnico dissolvido e teor do composto de ensaio no licor,
no incio de cada ciclo.
1.6. DETENO DO MTODO DE ENSAIO
1.6.1. Preparaes
Ligam-se um nmero suficiente de unidades de arejamento limpas (pode-se utilizar alternativamente a unidade
de ensaio de 1,51 de LASC inicial) e tubos para entrada do ar (figura 1) para cada substncia de ensaio e
controlo. O ar comprimido fornecido s unidades de ensaio, limpo atravs de um filtro de algodo, deve ser
isento de carbono orgnico e pr-saturado com gua de modo a reduzir as perdas por evaporao.
De uma estao de lamas activadas que trate predominantemente guas residuais domsticas, retira-se uma
amostra de licor misto contendo 1 a 4 g de slidos suspensos/l. So necessrios por cada unidade de
arejamento cerca de 150 ml de licor misto.
Preparam-se solues de reserva da substncia de ensaio em gua destilada; a concentrao normalmente
exigida de 400 mg/l como carbono orgnico o que d uma concentrao no composto de ensaio de 20 mg/l
de carbono no incio de cada ciclo de arejamento se no se verificar biodegradao.
possvel utilizar concentraes mais elevadas se a toxicidade em relao aos microorganismos o permitir.
Mede-se o teor em carbono orgnico nas solues de reserva.
O ensaio deve efectuar-se a 20 a 25
o
C.
Utiliza-se uma concentrao elevada de microorganismos aerbios (de 1 a 4 g/l de slidos suspensos) e o
perodo de reteno efectiva de 36 horas. As substncias carbonadas presentes nas guas residuais de
alimentao so largamente oxidadas, em geral no espao de oito horas aps o incio de cada cicio de
arejamento. Em seguida, verifica-se uma respirao endgena das lamas durante o restante perodo de
arejamento, no decurso do qual o nico substrato disponvel o composto de ensaio a no ser que este seja
tambm rapidamente metabolizado. Estas caractersticas associadas a uma reinoculao diria do ensaio
quando so utilizadas como meio guas residuais domsticas fornecem condies altamente favorveis tanto
para a adaptao como para elevados graus de biodegradao.
Retira-se uma amostra de licor misto de uma unidade laboratorial ou estao de lamas activadas
predominantemente domstica e conserva-se em condies aerbias at ser utilizada no laboratrio. Cada
uma das unidades de arejamento e de controlo so cheios com 150 ml de licor misto (se se utilizar a unidade de
ensaio LASC, multiplicar por 10 os volumes dados) e d-se incio ao arejamento. Aps 23 horas, interrompe-se
o arejamento e deixam-se sedimentar as lamas durante 45 minutos. Abrem-se sucessivamente as torneiras de
cada um dos recipientes e rejeitam-se fraces de 100 ml do licor sobrenadante. Recolhe-se uma amostra de
guas residuais domsticas decantadas imediatamente antes da utilizao e adicionam-se 100 ml s lamas
remanescentes em cada unidade de arejamento. Recomea-se de novo o arejamento. Nesta fase, no se
adicionam quaisquer substncias de ensaio e as unidades so diariamente alimentadas com guas residuais
domsticas apenas at ao momento em que se obtm na decantao um licor sobrenadante lmpido. Este
processo demora geralmente duas semanas, no fim das quais o carbono orgnico dissolvido no licor
sobrenadante no final de cada ciclo de arejamento se aproxima de um valor constante.
No final deste perodo, misturam-se as lamas decantadas separadamente e adicionam-se a cada unidade 50 ml
das lamas compostas resultantes.
Adicionam-se s unidades de controlo 95 ml de guas residuais decantadas mais 5 ml de gua e s unidades de
ensaio 95 ml mais 5 ml da soluo adequada de reserva do composto de ensaio (400 mg/l). Recomea-se de
novo o are|2mento que prossegue durante 23 horas. Deixam-se ento sedimentar as lamas durante 45 minutos
e o sobrenadante retirado e analisado o seu teor em carbono orgnico dissolvido.
Este processo de enchimento e esvaziamento repetido diariamente ao longo do ensaio.
Antes da sedimentao pode ser necessrio limpar as paredes das unidades de modo a evitar a acumulao de
slidos acima do nvel do lquido. Para evitar uma contaminao cruzada, utilizam-se raspadores ou escovas
individuais para cada unidade.
O ideal seria determinar diariamente o carbono orgnico dissolvidos nos licores sobrenadantes, embora sejam
admissveis anlises menos frequentes. Antes da anlise, os licores so filtrados atravs de filtros limpos de
membrana de 0,45 mm ou centrifugados. Os filtros de membrana so adequados se se garantir que nem
libertam carbono nem absorvem a substncia durante o processo de filtrao. A temperatura da amostra no
deve exceder 40
o
C quando se encontra na centrfuga.
A durao do ensaio para compostos que apresentam uma biodegradao fraca ou nula indeterminada, mas a
experincia sugere que deve ser, em geral, de pelo menos 12 semanas, mas nunca mais de 26 semanas.
Representam-se graficamente, em funo do tempo, os valores de carbono orgnico dissolvido nos licores
sobrenadantes das unidades de ensaio e das unidades de controlo.
medida que ocorre a biodegradao, o nvel obtido no ensaio aproximar-se- do obtido no controlo. Quando
se verificar que a diferena entre os dois nveis constante ao longo de trs medies consecutivas, efectua-se o
nmero de medies posteriores que seja necessrio para permitir o tratamento estatstico dos dados e calcula-
-se a percentagem de biodegradao do composto de ensaio (D
ad
, D
sid
, ver 1.2).
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio, deve incluir, se possvel, as seguintes informaes:
todas as informaes relativas natureza das guas residuais, tipo de unidade utilizada e resultados
experimentais respeitantes substncia ensaiada, substncia de referncia se utilizada e ensaio em branco,
a temperatura,
a curva de remoo com a descrio e processo de clculo (ver 1.2),
data e local onde foram recolhidas as lamas activadas e as guas residuais, estado de adaptao,
concentrao, etc.,
razes cientficas de quaisquer alteraes da metodologia,
assinatura e data.
Uma vez que a substncia a ser ensaiada atravs do presente mtodo no ser imediatamente biodegradvel,
qualquer remoo do COD devido apenas biodegradao ser normalmente gradual ao longo de vrios dias
ou semanas, excepto nos casos em que a adaptao repentina, tal como indicado por uma remoo abrupta
que ocorra aps algumas semanas.
Todavia, a adsoro fsico-qumica pode, por vezes, desempenhar um papel importante; isto verifica-se quando
h uma remoo total ou parcial do COD adicionado no incio. O que acontece posteriormente depende de
factores tais como os graus de adsoro e a concentrao dos slidos em suspenso no efluente rejeitado. Em
geral, a diferena entre a concentrao de COD nos licores sobrenadantes do controlo e do ensaio aumenta
gradualmente a partir de um valor inicial baixo e esta diferena mantm-se ento ao nvel do novo valor
durante o resto da experincia, a menos que tenha lugar a adaptao.
Se for necessrio estabelecer uma distino entre biodegradao (ou biodegradao parcial) e adsoro, so
necessrios outros ensaios. Esta distino pode ser obtida de diferentes modos mas o mais convincente
utilizar como inculo o licor sobrenadante, ou as lamas, num mtodo de base (de preferncia um ensaio
respiromtrico).
As substncias de ensaio que no presente ensaio apresentam remoes elevadas de COD no devidas a
adsoro devem ser consideradas como potencialmente biodegradveis.
Uma remoo parcial no devida a adsoro indica que a substncia sujeita pelo menos a alguma
biodegradao. Uma remoo baixa ou nula de COD pode ser devida a inibio dos microorganismos pela
substncia de ensaio e isto pode tambm ser demonstrado pela lise e perda de lamas, dando origem a
sobrenadantes turvos. O ensaio deve ser repetido, utilizando uma concentrao mais baixa de substncia de
ensaio.
A utilizao de um mtodo analtico especfico ou da substncia de ensaio marcada com
14
C pode permitir
uma maior sensibilidade. No caso do composto de ensaio marcado com
14
C, a recuperao de
l4
CO
2
confirmar que se verificou biodegradao.
Quando os resultados se expressam tambm em termos de biodegradao primria, deve ser fornecida, se
possvel, uma explicao relativa alterao de estrutura qumica que conduz perda de resposta da substncia
de ensaio original.
Avalidao do mtodo analtico deve ser fornecida conjuntamente com a resposta obtida no ensaio em branco.
4. REFERNCIAS
(1) OCDE, Paris, 1981, Test Guideline 302 A, Deciso C(81) 30 final do Conselho.
Apndice 1
Ensaio LASC: EXEMPLOS DE RESULTADOS
Substncias
C
E
(mg/l)
c
e
c
c
(mg/l)
Percentagem de
biodegradao
Durao de ensaio
(dias)
Sulfonato de 4-acetilaminobenzeno 17,2 2,0 85 40
Sulfonato de tetrapropilenobenzeno 17,3 8,4 51,4 40
4-nitrofenol 16,9 0,8 95,3 40
Dietilenoglicol 16,5 0,2 98,8 40
Anilina 16,9 1,7 95,9 40
Tetracarboxilato de ciclopentano 17,9 3,2 81,1 120
Apndice 2
Exemplo de equipamento
Figure 1
C.13. BIOCONCENTRAO: ENSAIO DINMICO COM PEIXES
1. MTODO
O presente mtodo idntico ao mtodo OCDE TG 305 (1996).
1.1. INTRODUO
O presente mtodo descreve um processo para a caracterizao da bioconcentrao potencial de determinadas
substncias em peixes, em condies dinmicas. Embora seja largamente prefervel o recurso a regimes
dinmicos, podem tambm utilizar-se regimes semiestticos, na condio de serem satisfeitos os critrios de
validade.
O mtodo fornece informaes suficientes para a realizao do ensaio, permitindo todavia, em larga medida, a
adaptao das condies experimentais ao perfil dos laboratrios e s caractersticas das substncias em estudo.
O mtodo destina-se particularmente a substncias orgnicas estveis com log P
ow
compreendido entre 1,5 e
6,0 (1), podendo, no entanto, aplicar-se tambm a substncias superlipfilas (log P
ow
> 6,0). A estimativa
preliminar do factor de bioconcentrao (BCF) das referidas substncias superlipfilas, por vezes designado K
B
,
, em geral, superior ao factor de bioconcentrao do estado estacionrio (BCF
SS
) obtido por via experimental.
A equao de Bintein et al. (2) permite obter uma estimativa preliminar do factor de bioconcentrao de
substncias orgnicas com P
ou
da ordem de 9,0. Os parmetros que caracterizam o potencial de
bioconcentrao incluem a constante de velocidade de fixao (k
1
), a constante de velocidade de depurao
(k
2
) e o factor BCF
SS
.
A utilizao de marcadores radioactivos poder facilitar a anlise de amostras de gua e de peixes, bem como a
determinao da necessidade de identificar e quantificar os produtos de degradao. Caso se determinem os
resduos radioactivos totais (nomeadamente por combusto ou solubilizao de tecidos), o factor BCF
calculado com base na substncia de origem, nos metabolitos fixados e no carbono assimilado, no sendo, por
tal facto, directamente comparvel ao factor decorrente de anlise qumica especfica da substncia de origem.
Nos ensaios com radiomarcadores podem utilizar-se mtodos de depurao, determinando o factor BCF com
base da substncia de origem e procedendo, se necessrio, caracterizao dos metabolitos. tambm possvel
combinar um estudo de metabolismo dos peixes com um estudo de bioconcentrao, mediante a anlise e
identificao dos resduos em tecidos.
A bioconcentrao/bioacumulao consiste no aumento da concentrao da substncia em estudo num
determinado organismo ou em determinados tecidos do mesmo, relativamente respectiva concentrao no
meio circundante.
O factor de bioconcentrao (BCF ou K
B
) em qualquer momento da fase de fixao do ensaio de acumulao
consiste no quociente entre a concentrao da substncia em estudo nos peixes ou em determinados tecidos
dos mesmos [C
t
expressa em g/g (ppm)] e a respectiva concentrao no meio circundante [C
w
, expressa em g/
/ml (ppm)].
O factor de bioconcentrao num estado estacionrio (BCF
SS
ou K
B)
no sofre uma alterao significativa num
perodo longo, uma vez que a concentrao da substncia em estudo no meio circundante constante no
perodo em causa.
Um estado estacionrio atingido sempre que a representao grfica da concentrao da substncia em estudo
nos peixes (C
t
) em funo do tempo consista numa linha paralela ao eixo dos tempos e trs determinaes
sucessivas de C
t
em amostras recolhidas com intervalos de, pelo menos, dois dias, apresentem valores que no
difiram em mais de 20 %, na ausncia de diferenas significativas entre os trs perodos de amostragem. No
caso das amostras combinadas, so necessrias, pelo menos, quatro determinaes. No caso de substncias
recolhidas de forma lenta, o intervalo mais adequado de sete dias.
O factor de bioconcentrao calculado directamente a partir das constantes cinticas (k
1
/k
2
) constitui o factor
de concentrao cintica, BCF
k
.
O coeficiente de partio octanol-gua (P
ow
), tambm designado K
ow
, consiste no quociente entre a solubilidade
de uma substncia em n-octanol e em gua, em condies de equilbrio (mtodo A.8). O logaritmo de P
ov

utilizado como indicador de potencial qumico de bioconcentrao em organismos aquticos.
A fase de exposio ou de fixao consiste no tempo de exposio dos peixes substncia em estudo.
A constante de velocidade de fixao (k
1
) consiste no valor numrico que define a taxa de aumento da
concentrao da substncia em estudo nos peixes ou em determinados tecidos dos mesmos, sempre que se
encontrem expostos substncia em causa (a constante k
1
expressa em dias
-1
).
A fase de ps-exposio ou de depurao consiste no perodo durante o qual se estuda a depurao da
substncia pelos peixes ou por tecidos especficos dos mesmos, na sequncia da transferncia dos animais de
um meio que contenha a substncia em estudo para um meio que a no contenha.
A constante de velocidade de depurao (k
2
) o valor numrico que define a velocidade de reduo da
concentrao da substncia em estudo nos peixes ou em determinados tecidos dos mesmos, na sequncia da
transferncia dos animais de um meio que contenha a substncia em estudo por um meio que a no contenha
(a constante k
2
expressa em dias
-1
).
O ensaio constitudo por duas fases, designadamente a fase de exposio (fixao) e a fase de ps-exposio
(depurao). Durante a fase de fixao, diversos grupos de peixes de uma determinada espcie so expostos a,
pelo menos, duas concentraes da substncia em estudo. Seguidamente, os animais so transferidos para um
meio isento da referida substncia, onde decorre a fase de depurao. Esta ltima sempre necessria, excepto
no caso de a quantidade de substncia absorvida na fase de fixao ser desprezvel (BCF < 10). A concentrao
da substncia em estudo no peixe ou em determinados tecidos do mesmo acompanhada em ambas as fases
do ensaio. Alm dos grupos expostos s duas concentraes de ensaio, submete-se um grupo de peixes a
condies idnticas, excepto no que respeita substncia em estudo, que omitida, de modo a estabelecer uma
correlao entre os eventuais efeitos negativos observados no ensaio de bioconcentrao com um grupo de
controlo de referncia e a obter as concentraes de fundo da substncia em estudo.
A fase de fixao dever durar 28 dias, excepto se o equilbrio for atingido antes. A equao que se apresenta no
apndice 3 permite prever a durao da fase de fixao, bem como o surgimento da fase estacionria. O
perodo de depurao inicia-se com a transferncia dos peixes para um meio idntico que no contenha a
substncia em estudo, num recipiente limpo. Sempre que possvel, deve calcular-se o factor de bioconcentrao
na forma de quociente (BCF
SS
) das concentraes nos peixes (C
t
) e na gua (C
u
, num estado estacionrio
aparente, e tambm o factor de bioconcentrao cintico (BCF
k
, que consiste no quociente entre as constantes
de velocidade de fixao (k
1
) e de depurao (k
2
), assumindo um processo cintico de primeira ordem. Caso o
processo no apresenta uma cintica de primeira ordem, devem aplicar-se modelos mais complexos (ver
apndice 5).
Caso no se atinja o estado estacionrio em 28 dias, a fase de fixao deve ser prolongada, at um mximo de
60 dias, iniciando-se ento a fase de depurao.
A constante de velocidade de fixao, a constante de velocidade de depurao, as constantes decorrentes da
aplicao de modelos mais complexos, o factor de bioconcentrao e, sempre que possvel, os intervalos de
confiana de cada parmetro, devem ser calculados com base no modelo mais adequado descrio das
concentraes da substncia em estudo nos peixes e na gua.
O factor BCF expresso em funo da massa hmida total dos peixes. Todavia, podem utilizar-se, para fins
especficos, determinados tecidos ou rgos (por exemplo, tecido muscular ou fgado), caso as dimenses dos
animais o permitam, podem tambm dividir-se os peixes em pores comestveis e no comestveis (vsceras).
Uma vez que, no que respeita a muitas substncias orgnicas, existe uma ntida relao entre o potencial de
bioconcentrao e a lipofilia, existe tambm uma relao entre o teor de lpidos dos peixes em estudo e a
bioconcentrao das substncias em causa. De modo a reduzir a variabilidade dos resultados, no que respeita s
substncias com elevada lipofilia (log P
ow
> 3), a bioconcentrao deve ser expressa em funo de teor de
lpidos, bem como da massa corprea total.
Sempre que tal seja vivel, deve determinar-se o teor de lpidos do material biolgico utilizado para determinar
a concentrao da substncia em estudo.
1.4. INFORMAES RELATIVAS SUBSTNCIA EM ESTUDO
Antes de realizar o ensaio de bioconcentrao, devem possuir-se as seguintes informaes relativas a substncia
em estudo:
a) Solubilidade em gua;
b) Coeficiente de partio octanol-gua, P
ow
(tambm designado K
ow
), determinado por HPLC de acordo
com o mtodo A.8;
c) Hidrlise;
d) Fotossensibilidade em gua, determinada por irradiao solar natural ou simulada, bem como nas
condies de irradiao do ensaio de bioconcentrao (3);
e) Tenso superficial (no caso de substncias cujo log P
ow
no possa ser determinado);
f) Presso de vapor;
g) Biodegradabilidade natural (se adequado).
A toxicidade para a espcie utilizada no ensaio constitui outra das informaes necessrias, devendo conferir-se
especial ateno toxicidade assinttica (isto , independente do tempo) LC
50
. Para a quantificao da
substncia em estudo nas solues, bem como no material biolgico, deve utilizar-se um mtodo analtico
adequado, de exactido, preciso e sensibilidade conhecidas, devendo possuir-se informaes pormenorizadas
sobre a preparao e armazenagem da amostra. Deve tambm conhecer-se o limite de deteco da substncia
em estudo na gua e nos tecidos dos peixes. Caso se utilize uma substncia marcada com
14
C, necessrio
conhecer a percentagem de radioactividade associada s impurezas.
1.5. VALIDADE DO ENSAIO
Para que o ensaio seja vlido, devem satisfazer-se as seguintes condies:
as variaes de temperatura devem ser inferiores a 2
o
C,
a concentrao de oxignio dissolvido no deve ser inferior a 60 % da concentrao de saturao,
a variao da concentrao da substncia em estudo nas clulas no deve exceder 20 % da mdia dos
valores determinados na fase de fixao,
a mortalidade ou quaisquer outros efeitos nocivos registados no final do ensaio, tanto no que respeita ao
lote de controlo como ao lote de ensaio, deve ser inferior a 10 %; caso o ensaio se prolongue por vrias
semanas ou meses, os referidos factores no devem exceder 5 % por ms e 30 % na totalidade.
A utilizao de substncias de referncia de potencial de bioconcentrao conhecido apresenta utilidade na
comprovao do procedimento experimental, sempre que necessrio. Todavia, no se afigura ainda possvel
recomendar substncias especficas.
1.7.1. Equipamento
No que respeita ao equipamento, deve evitar-se a utilizao de materiais que apresentem riscos de dissoluo,
absoro ou lixiviao, ou possam apresentar efeitos nocivos nos animais. Podem utilizar-se tanques em forma
de paraleleppedo ou cilindro, de um material quimicamente inerte, com capacidade adequada populao.
Deve evitar-se tanto quanto possvel o uso de tubos de plstico flexvel, recorrendo-se, de preferncia, a tubos
de teflon (R), ao inoxidvel e/ou vidro. A experincia tem demonstrado que, no caso de substncias com
coeficientes de adsoro elevados, nomeadamente os piretrides sintticos, pode ser necessrio utilizar vidro
silanizado. Em tais casos, o equipamento deve ser descartado aps o uso.
1.7.2. gua
Em princpio, o ensaio deve utilizar gua natural proveniente de uma fonte no contaminada e de qualidade
uniforme. A qualidade da gua de diluio deve permitir a sobrevivncia da espcie durante as fases de
aclimatao e de ensaio sem que os animais adquiram uma aparncia ou um comportamento anormais. Em
condies ideais, a espcie em causa deve poder sobreviver, desenvolver-se e reproduzir-se na gua de diluio
(nomeadamente em cultura laboratorial ou num ensaio de toxicidade em toda a vida). Devem conhecer-se, pelo
menos, os seguintes parmetros: pH, dureza, slidos totais, carbono orgnico total, bem como, se possvel,
amnio, nitritos, alcalinidade e, no caso de ensaios com espcies marinhas, salinidade. Os parmetros que
possuem importncia para o bem-estar dos animais so bem conhecidos; contudo, o apndice 1 apresenta as
concentraes mximas recomendadas de diversos factores em guas doces e salgadas.
A qualidade da gua deve manter-se constante no decurso do ensaio. O pH deve oscilar entre 6,0 e 8,5, embora,
no decurso de um determinado ensaio, a respectiva variao no deva exceder 0,5. De modo a assegurar que
a gua de diluio no afecta os resultados (nomeadamente devido complexao da substncia em estudo) ou
o comportamento dos animais, devem recolher-se periodicamente amostras da mesma para anlise,
procedendo-se determinao dos metais pesados (Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), principais anies e caties (Ca
2 +
,
Mg
2 +
, Na - , K -, Cl-, SO
4
2-
), pesticidas (nomeadamente pesticidas organofosforados totais e organoclorados
totais), carbono orgnico total e slidos em suspenso, com uma frequncia aproximadamente trimestral, caso
a qualidade da gua de diluio seja relativamente constante. Se a referida qualidade se revelar constante num
perodo no inferior a um ano, as determinaes podem ser menos frequentes, efectuando-se com intervalos
alargados (por exemplo, semestrais).
O teor de partculas naturais, bem como de carbono orgnico total, da gua de diluio deve ser to reduzido
quanto possvel, de modo a evitar a adsoro de substncia em estudo pela matria orgnica, reduzindo a sua
biodisponibilidade (4). O valor mximo aceitvel de 5 mg/l, no caso das partculas (matrias secas que no
passem atravs de um filtro de 0,45 m) e 2 mg/l no caso do carbono orgnico total (ver apndice 1). Se
necessrio, a gua dever ser filtrada antes do uso. A contribuio das excrees dos peixes e dos resduos
alimentares para o teor de carbono orgnico total deve ser to reduzida tanto quanto possvel. No decurso do
ensaio, a concentrao de carbono orgnico no recipiente no deve exceder a concentrao de carbono
orgnico proveniente da substncia em estudo e do agente de solubilizao (se utilizado) em mais de 10 mg/l (
20 %).
Prepara-se uma soluo-me da substncia em estudo, de concentrao adequada, de preferncia misturando
ou agitando a substncia com a gua de diluio. No aconselhvel utilizar solventes ou dispersantes (agentes
de solubilizao) embora, em determinados casos, possa recorrer-se aos mesmos para obter uma concentrao
adequada. Os solventes que podem ser utilizados so o etanol, o metanol os teres mono e dimetlico do
etilenoglicol a dimetilformamida e o trietilenoglicol. No que respeita aos dispersantes, podem utilizar-se o
Cremophor RH40, o Tween 80, a metilcelulose a 0,01 % e o HCO-40. Os agentes que apresentem
biodegradabilidade natural devem utilizar-se com precauo, uma vez que podem originar problemas de
crescimento bacteriano nos ensaios dinmicos. A substncia em estudo pode ser marcada com um
radioistopo, devendo ser de um grau de pureza elevado (de preferncia superior a 98 %).
Em ensaios dinmicos, necessrio utilizar um sistema de fornecimento e diluio contnuos da soluo-me
da substncia em estudo (por exemplo, bomba com regulao de caudal, diluidor proporcional, sistema de
saturao), de modo a alimentar os recipientes de ensaio. De preferncia, devem efectuar-se diariamente pelo
menos cinco renovaes do volume de cada recipiente de ensaio. Em princpio, devem utilizar-se condies
dinmicas; todavia, se tal no se afigurar possvel (por exemplo, caso os animais sejam afectados) pode recorrer-
-se a uma tcnica semiesttica, na condio de serem satisfeitos os critrios de validade. Os caudais da soluo-
-me e da gua de diluio devem ser verificados 48 horas antes do incio do ensaio e com uma frequncia pelo
menos diria no decurso do mesmo, A referida verificao inclui a determinao do caudal em cada recipiente
de ensaio, devendo assegurar-se que o mesmo no regista uma variao superior a 20 % num determinado
recipiente ou entre dois recipientes.
1.7.4. Seleco das espcies
Os principais critrios de seleco das espcies consistem na sua fcil disponibilidade, nas dimenses adequadas
e na facilidade de manuteno no laboratrio. Outros critrios incluem o interesse recreativo e comercial e a
importncia ecolgica, bem como a sensibilidade relativa, os antecedentes de utilizao, etc.
O apndice 2 refere as espcies recomendadas. Podem utilizar-se outras espcies, devendo, contudo, adaptar-se
os procedimentos de modo a obter condies de ensaio adequadas. Em tais casos, deve apresentar-se o
fundamento da seleco da espcie e do mtodo experimental.
1.7.5. Tratamento dos peixes
Deve aclimatar-se a populao de ensaio durante, pelo menos, duas semanas, temperatura de ensaio,
alimentando-a com uma dieta idntica utilizada no decurso do ensaio.
Aps um perodo de adaptao de 48 horas, regista-se a mortalidade, aplicando os seguintes critrios:
caso a mortalidade exceda 10 % da populao em sete dias, desprezar a totalidade do lote,
caso a mortalidade se situe entre 5 e 10 % da populao em sete dias, aclimatar os peixes por um perodo
de sete dias suplementares,
caso a mortalidade seja inferior a 5 % da populao em sete dias, aproveitar o lote; se a mortalidade
registada no segundo perodo de sete dias for superior a 5 %, desprezar a totalidade do lote.
Os animais a utilizar nos ensaios no devem apresentar doenas ou perturbaes observveis. Devem rejeitar-se
quaisquer animais doentes. Alm disso, os peixes no devem ser objecto de tratamento contra eventuais
afeces nas duas semanas que procedem o ensaio e durante o mesmo.
1.8. REALIZAO DO ENSAIO
1.8.1. Ensaio preliminar
Poder ser til efectuar um ensaio preliminar com o objectivo de optimizar as condies do ensaio definitivo
no que respeita, nomeadamente, seleco da concentrao da substncia em estudo e durao das fases de
fixao e de depurao.
1.8.2.1. Dur a o d a f a s e d e f i x a o
Pode obter-se uma estimativa da durao da fase de fixao com base na experincia prtica (por exemplo,
dados decorrentes de um estudo prvio ou dados relativos acumulao de uma substncia afim), bem como
em determinadas relaes empricas que utilizam conhecimentos decorrentes da solubilidade da substncia em
gua ou do respectivo coeficiente de partio octanol/gua (ver apndice 3).
A fase de fixao deve durar, pelo menos, 28 dias, excepto se o equilbrio for atingido antes. Se o estado
estacionrio no for atingido em 28 dias, deve prolongar-se a fase de fixao, procedendo a determinaes
complementares, at um mximo de 60 dias.
1.8.2.2. Dur a o d a f a s e d e d e pur a o
Em geral, um perodo com uma durao de ordem de metade da fase de fixao suficiente para uma reduo
adequada (isto , cerca de 95 %) da carga corporal da substncia em estudo (ver o apndice 3 para uma
especificao da estimativa). Se o perodo necessrio para a referida reduo de 95 % exibir urna extenso que o
torne impraticvel (mais de 56 dias), pode utilizar-se um perodo mais curto (ou seja, at que a concentrao da
substncia em estudo seja inferior a 10 % da concentrao do estado estacionrio). Todavia, no caso de
substncias com perfis de fixao e de depurao mais complexos que no caso de modelos com uma cintica de
primeira ordem, devem adaptar-se perodos de depurao alargados, e modo a determinar a velocidade do
processo. O perodo em causa pode ser definido pelo perodo em que a concentrao da substncia em estudo
nos peixes permanece superior ao limite de deteco.
1.8.2.3. Nme r o d e a ni ma i s
O nmero de peixes a utilizar por concentrao de ensaio deve ser seleccionado de forma a que se disponha de
quatro animais por amostragem. Se for exigido um rigor estatstico superior, deve dispor-se de mais peixes por
amostragem.
Caso se utilizem peixes adultos, deve especificar-se o respectivo sexo. Caso se utilizem animais de ambos os
sexos, as diferenas entre os respectivos teores de lpidos antes do incio da exposio no devem ser
significativas, podendo ser necessrio reunir os machos e as fmeas.
Em qualquer ensaio, seleccionam-se peixes de massa semelhante, de modo que a massa do mais leve no seja
inferior a 2/3 da massa do mais pesado. Os peixes devem ser de mesma coorte (classe etria) e da mesma
provenincia. Uma vez que a massa e a idade dos peixes parecem, por vezes, apresentar um efeito significativo
nos valores do factor BCF (1), devem registar-se de forma precisa os pormenores em causa. Recomenda-se a
pesagem de uma amostra do lote de peixes, de modo a calcular a massa mdia.
1.8.2.4. I nt r od u o d os a ni ma i s
Devem utilizar-se rcios elevados gua/peixes, de modo a minimizar a reduo de C
w
determinada pela
introduo dos peixes no incio do ensaio, bem como do decrscimo da concentrao do oxignio dissolvido. A
taxa de carga deve ser adequada s espcies utilizadas. Recomenda-se, em geral, uma taxa diria de 0,1 a 1,0 g
de peixes (massa hmida) por litro de gua. Caso a concentrao requerida da substncia em estudo no registe
uma variao superior a 20 % e a quantidade de oxignio dissolvido no atinja valores inferiores a 60 % da
concentrao de saturao, podem utilizar-se taxas de carga mais elevadas.
Na seleco dos regimes de carga adequados deve ter-se em conta o habitat normal das espcies em causa. Por
exemplo, as espcies bentnicas necessitam de aqurios com maior rea de base que as espcies pelgicas, para
o mesmo volume de gua.
1.8.2.5. Al i me nt a o
Durante os perodos de aclimatao e de ensaio, os peixes so alimentados com uma dieta adequada, de teor
total de lpidos e de protenas conhecido, numa quantidade suficiente para mant-los em condies saudveis e
manter constante a respectiva massa corporal. Os animais so alimentados diariamente, sendo a quantidade de
alimentos fornecida de ordem de 1 a 2 % da massa corporal/dia, o que permite manter a concentrao de
lpidos da maioria das espcies a nveis relativamente constantes, durante o ensaio. A quantidade de alimentos
deve ser reavaliada com uma frequncia, por exemplo, semanal, de modo a manter constantes a massa corporal
e o teor de lpidos. Para tal, pode estimar-se a massa dos peixes de cada clula de ensaio com base na massa do
peixe retirado mais recentemente da mesma. No devem pesar-se os peixes que permanecem nas clulas.
Os alimentos remanescentes e as fezes so removidos diariamente das clulas de ensaio, 30 minutos a 1 hora
aps o fornecimento dos alimentos. As clulas devem manter-se to limpas quanto possvel ao longo do ensaio,
de modo a que a concentrao de matrias orgnicas seja mantida aos nveis mais reduzidos, uma vez que a
presena de carbono orgnico pode limitar a biodisponibilidade da substncia em estudo (1).
Uma vez que muitos alimentos contm ingredientes base de peixe, deve averiguar-se a ocorrncia da
substncia em estudo nos mesmos. Deve tambm pesquisar-se a ocorrncia de pesticidas e metais pesados nos
alimentos.
1.8.2.6. I l umi na o e t e mpe r a t ur a
O perodo de irradiao , em geral, de 12 a 16 horas, devendo a temperatura, cuja variao no deve exceder
2
o
C, ser adequada s espcies em estudo (ver apndice 2). Deve especificar-se o tipo e as caractersticas da
iluminao e atender-se eventual fotlise da substncia em estudo nas condies de irradiao do ensaio.
Devem utilizar-se fontes de iluminao adequadas, de modo a evitar a exposio dos animais a produtos de
fotlise no naturais. Em alguns casos, pode afigurar-se adequado utilizar um filtro que elimine as radiaes
ultravioletas de comprimento de onda inferior a 290 nm.
1.8.2.7. Conc e nt r a e s d e e ns a i o
Os peixes so expostos, em condies dinmicas, a, pelo menos, duas concentraes da substncia em estudo
em gua. Em geral, a concentrao mais elevada deve ser da ordem de 1 % da concentrao LC
50
aguda
assinttica e, pelo menos, dez vezes superior ao limite de deteco em gua do mtodo analtico utilizado.
A concentrao mais elevada pode tambm ser calculada atravs do quociente de LC
50
em 96 horas por um
rcio concentrao aguda/crnica (os rcios adequados a determinadas substncias podem variar de 3 a 100).
Sempre que possvel, as restantes concentraes devem diferir da concentrao mais elevada num factor de 10.
Caso a aplicao dos critrios baseados no parmetro LC
50
e no limite de deteco no se afigure vivel, pode
utilizar-se um factor inferior a 10 ou, em alternativa, recorrer a uma substncia marcada com
14
C. No devem
utilizar-se concentraes superiores solubilidade da substncia em estudo.
Caso se utilize um agente de solubilizao, a respectiva concentrao no deve exceder 0,1 ml/l, devendo ser
idntica em todos os recipientes. Deve conhecer-se a contribuio do referido agente, juntamente com a
substncia em estudo, por o teor de carbono orgnico total da gua. Deve, contudo, evitar-se ao mximo a
utilizao de tais substncias.
1.8.2.8. Cont r ol os
Alm das sries de ensaio, deve efectuar-se um controlo com gua de diluio ou, se adequado, com o agente de
solubilizao, na condio de este ltimo no apresentar efeitos negativos nos peixes. Caso contrrio, devem
efectuar-se ambos os controlos.
1.8.3. Frequncia das determinaes da qualidade da gua
Durante o ensaio, devem determinar-se em todos os recipientes o oxignio dissolvido, o carbono orgnico
total, o pH e a temperatura. Alm disso, devem determinar-se a dureza e, se for caso disso, a salinidade, das
amostras de controlo e da gua de um dos recipientes em que a concentrao da substncia em estudo seja
mais elevada. O oxignio dissolvido e, se for caso disso, a salinidade, devem ser determinados, no mnimo, trs
vezes durante o perodo de fixao (no incio, na fase intermdia e no final) e com uma frequncia semanal no
decurso da fase de depurao. O carbono orgnico total deve ser determinado no incio do ensaio (48 h e 24 h
antes do incio), antes da colocao dos peixes nos recipientes e, pelo menos, uma vez por semana no decurso
das fases de fixao e depurao. Deve determinar-se a temperatura diariamente, o pH no incio e no final da
cada perodo e a dureza uma vez em cada ensaio. Deve determinar-se a temperatura em contnuo pelo menos
num dos recipientes.
1.8.4. Amostragem e anlise dos peixes e da gua
1.8.4.1. Ca l e nd r i o d a r e c ol ha d e a mos t r a s d e pe i x e s e d e g ua
Devem recolher-se amostras de gua para a determinao da concentrao da substncia em estudo antes da
colocao dos peixes nos recipientes, bem como no decurso das fases de fixao e depurao. As amostras de
gua devem, no mnimo, ser recolhidas em simultneo com os peixes e antes da alimentao. Durante a fase de
fixao, as concentraes da substncia em estudo so determinadas de modo a verificar o respeito dos critrios
de validade.
Os peixes so recolhidos em, pelo menos, cinco ocasies no decurso da fase de fixao e em, pelo menos,
quatro ocasies, durante a fase de depurao. Uma vez que, por vezes, se torna difcil efectuar uma estimativa
razoavelmente precisa do factor BCF com base no nmero de amostras, em especial no caso de a depurao
envolver processos que no apresentem uma cintica de primeira ordem, aconselhvel recolher amostras com
uma frequncia superior, em ambos os perodos (ver apndice 4). As amostras suplementares so armazenadas,
sendo apenas analisadas se os resultados da primeira srie de determinaes forem insuficientes para o clculo
do referido factor com a preciso desejada.
O apndice 4 apresenta um exemplo de calendrio de amostragem. Podem elaborar-se outros calendrios
mediante a utilizao de outros valores do P
ow
para o clculo do tempo de exposio necessrio a uma fixao
de 95 %.
A amostragem deve prosseguir durante a fase de fixao at ser atingido o estado estacionrio, num mximo de
28 dias. Caso o estado estacionrio no seja atingido em 28 dias, a amostragem dever prosseguir at um
mximo de 60 dias. Antes do incio da fase de depurao, os peixes so transferidos para clulas limpas.
1.8.4.2. Re c ol ha e pr e pa r a o d a s a mos t r a s
As amostras de gua para anlise so recolhidas, por exemplo, por bombagem atravs de tubos inertes, a partir
de um ponto central na clula de ensaio. Uma vez que nem sempre se afigura possvel separar as fraces no
biodisponvel e biodisponvel da substncia em estudo por filtrao ou centrifugao (em especial no caso de
substncias superlipfilas, isto , substncias com log P
ow
> 5) (1) (5).
As amostras no devem ser sujeitas a tais processos, devendo adoptar-se medidas para manter as clulas to
limpas quanto possvel e determinar-se o teor de carbono orgnico em ambas as fases (fixao e depurao).
Em cada amostragem, recolhe-se um nmero adequado de peixes (de modo geral, igual ou superior a 4) das
clulas de ensaio. Os animais em causa so lavados rapidamente com gua, secos, mortos instantaneamente,
por recurso a mtodos humanos, e pesados.
aconselhvel analisar os peixes e a gua imediatamente aps a recolha das amostras, de modo a evitar
eventuais efeitos, nomeadamente devidos degradao, calculando as taxas de fixao e depurao
aproximadas em funo do avano do ensaio. A anlise imediata permite tambm identificar prontamente o
incio de uma fase estacionria.
Caso no se proceda anlise imediata, as amostras so armazenadas de acordo com um mtodo adequado.
Antes do incio do ensaio, devem obter-se dados relativos armazenagem adequada da substncia em estudo,
nomeadamente por ultracongelao, manuteno a 4
o
C, extraco, etc., bem como durao da mesma.
1.8.4.3. Qua l i d a d e d o m t od o a na l t i c o
Uma vez que o processo global determinado essencialmente pela exactido, preciso e sensibilidade do
mtodo analtico utilizado, deve comprovar-se experimentalmente a adequao ao mesmo da preciso e
reprodutibilidade deste ltimo, bem como do mtodo de recolha da substncia em estudo a partir da gua e dos
peixes, ao referido mtodo. Deve tambm comprovar-se a no detectabilidade da substncia em estudo na gua
de diluio.
Se necessrio, os valores de C
w
e C
f
obtidos no ensaio so corrigidos de modo a ter em conta as recuperaes e
as concentraes de fundo dos controlos. As amostras de peixes e de gua devem ser manipuladas de modo a
minimizar contaminaes e perdas, resultantes, nomeadamente, da adsoro pelos equipamentos de
amostragem.
1.8.4.4. An l i s e d a s a mos t r a s d e pe i xe s
Caso se utilizem radiomarcadores, pode determinar-se a radioactividade total (isto , da substncia de origem e
dos seus metabolitos) ou, como alternativa, tratar as amostras de modo a que a substncia de origem seja
analisada separadamente. Alm disso, os principais metabolitos podem ser caracterizados no estado
estacionrio ou no final da fase de fixao, consoante o que ocorrer primeiro. Se o factor BCF calculado com
base nos resduos radioactivos totais for igual ou superior a 1 000 %, pode ser aconselhvel e mesmo, no caso
de determinadas categorias de substncias, tais como os pesticidas, fortemente recomendvel, identificar e
quantificar os produtos de degradao que representem 10 % ou mais da totalidade dos resduos nos tecidos
dos peixes, no estado estacionrio. Caso se identifiquem e quantifiquem os produtos de degradao que
representam 10 % ou mais dos resduos totais marcados com radioistopos nos tecidos dos peixes, recomenda-
-se tambm a identificao e quantificao dos produtos de degradao na gua do ensaio.
Em geral, deve determinar-se a concentrao da substncia em estudo para cada peixe pesado. Se tal no for
possvel, podem combinar-se as amostras em cada amostragem, sem prejuzo do tratamento estatstico dos
dados. Caso a especificidade e o rigor do mtodo estatstico sejam importantes, deve utilizar-se no ensaio um
nmero adequado de peixes, de modo a adaptar o procedimento de combinao ao rigor do mtodo (6) (7).
O factor BCF deve ser expresso em funo da massa hmida total e, no caso de substncias altamente lipfilas,
em funo tambm do teor de lpidos. O teor de lpidos dos peixes deve ser determinado, se possvel, em cada
amostragem, devendo, para tal, utilizar-se mtodos adequados (ver os pontos 8 e 2 do apndice 3). Como
mtodo-padro, pode recomendar-se a extraco com clorofrmio/metanol (9). A aplicao de mtodos
diversos no conduz a resultados idnticos (10), pelo que devem fornecer-se pormenores sobre o mtodo
utilizado. Sempre que possvel, deve efectuar-se a determinao dos lpidos no extracto utilizado para a anlise
da substncia em estudo, uma vez que, com frequncia, necessrio remover os mesmos do extracto antes da
anlise cromatogrfica deste ltimo. O teor de lpidos dos peixes no final da experincia, expresso em mg/kg,
no deve diferir do teor inicial em mais de 25 %. Deve tambm referir-se a percentagem de matria seca nos
tecidos, de modo a permitir converter o teor de lpidos em relao massa hmida no teor relativo massa
seca.
2. RESULTADOS
A curva de fixao da substncia em estudo obtida atravs da representao grfica da respectiva
concentrao nos peixes ou em determinados tecidos dos mesmos na fase de fixao, em funo do tempo,
numa escala aritmtica. Quando se observar o incio do estado estacionrio, isto , quando a curva se tornar
aproximadamente assinttica relativamente ao eixo dos tempos, calcula-se o factor BCF
ss
do seguinte modo:
C
f
no estado estacionrio mdia
C
w
no estado estacionrio mdia
Se no for atingido o estado estacionrio, pode calcular-se um factor BCF
ss
suficientemente preciso para a
avaliao dos riscos assumindo um estado estacionrio virtual, a 80 % (1,6/k
2
) ou 95 % (3,0/k
2
) do equilbrio.
O factor de concentrao (BCF
k
) consiste no quociente das constantes cinticas de primeira ordem, k
1
/k
2
. De
modo geral, a constante de velocidade de depurao (k
2
) determinada com base na curva de depurao
(representao grfica do decrscimo da concentrao da substncia em estudo nos peixes em funo do
tempo), calculando-se a constante de velocidade de fixao (k
1
) com base em k
2
e num valor de C
t
obtido da
curva de fixao (ver tambm o apndice 5). O mtodo mais aconselhvel para obter o factor BCF
k
e as
constantes k
1
e k
2
consiste no recurso a mtodos computacionais de estimativa no linear de parmetros (11).
Caso contrrio, podem utilizar-se mtodos grficos para o clculo das constantes cinticas. Se a curva de
depurao revelar de modo inequvoco que o processo no segue uma cintica de primeira ordem, h que
recorrer a modelos mais complexos (ver referncias no apndice 3), procurando a orientao de um perito em
bioestatstica.
Sempre que as concentraes das solues de ensaio sejam prximas do limite de deteco do mtodo analtico
utilizado, os resultados devem ser interpretados com precauo.
A obteno de curvas de fixao e de depurao bem definidas constitui um indicador da qualidade dos dados
relativos bioconcentrao. A variao das velocidades de fixao e depurao obtidas com ambas as
concentraes de ensaio deve ser inferior a 20 %, devendo registar-se e tentar explicar-se a ocorrncia de
variaes significativas das referidas velocidades. O intervalo de confiana dos valores de BCF obtidos em
estudos adequados , em geral, da ordem de 20 %.
3. RELATRIO
3.1. SUBSTNCIA EM ESTUDO
natureza fsica e, se adequado, propriedades fsico-qumicas,
dados decorrentes de anlise qumica (incluindo o teor de carbono orgnico, se adequado),
no caso da utilizao de radiomarcadores, posio do(s) tomo(s) substitudo(s) e percentagem de
radioactividade associada s impurezas.
3.2. ESPCIES ANIMAIS UTILIZADAS
denominao cientfica, variedade, origem, pr-tratamento eventual, aclimatao, idade, gama de
dimenses, etc.
3.3. CONDIES DE ENSAIO
tipo de procedimento utilizado (ensaio dinmico ou semiesttico),
tipo e caractersticas da iluminao utilizada e respectivo perodo,
concepo do ensaio (nmero e dimenses das clulas de ensaio, taxa de renovao do volume de gua,
nmero de replicados, nmeros de peixes por replicado, nmero de concentraes de ensaio, durao das
fases de fixao e depurao, frequncia de amostragem de peixes e de gua),
mtodo de preparao das solues-me e frequncia de renovao (caso se utilize um agente de
solubilizao, deve fornecer-se a respectiva concentrao, bem como a contribuio do mesmo para o
teor de carbono orgnico da gua),
concentraes de ensaio nominais, mdia e desvio-padro dos valores determinados e mtodo de
obteno dos mesmos,
fonte de gua de diluio, descrio do eventual pr-tratamento desta ltima, resultados de quaisquer
ensaios destinados a comprovar a adequao da gua aos peixes e caractersticas da gua: pH, dureza,
temperatura, concentrao de oxignio dissolvido, cloro residual (se determinado), carbono orgnico
total, slidos em suspenso, salinidade (se adequado) e quaisquer outras determinaes efectuadas,
qualidade da gua nos recipientes de ensaio (pH, dureza, carbono orgnico total, temperatura e
concentrao de oxignio dissolvido),
informaes pormenorizadas sobre a alimentao dos animais (por exemplo, tipo de alimentos, origem e
composio dos mesmos se possvel, apresentar, pelo menos, o respectivo teor de lpidos e protenas
, quantidade fornecida e frequncia),
informaes sobre o tratamento das amostras de peixes e de gua, incluindo pormenores relativos
preparao, armazenagem e extraco, bem como mtodos analticos aplicados substncia em estudo e
eventual determinao do teor de lpidos, incluindo a respectiva preciso.
3.4. RESULTADOS
resultados de quaisquer estudos preliminares efectuados,
mortalidade dos peixes do lote de controlo e dos peixes expostos substncia, bem como qualquer
comportamento anormal observvel,
teor de lpidos dos peixes (se determinado no decurso do ensaio),
curvas de fixao e de depurao da substncia em estudo pelos peixes, exibindo os valores determinados
e incluindo o intervalo de surgimento do estado estacionrio,
concentraes C
f
e C
w
(incluindo os respectivos desvios-padro e gama, se adequado) para todos os
perodos de amostragem. Deve exprimir-se a concentrao C
f
em g/g (ppm) de massa hmida do animal
na sua totalidade ou de determinados tecidos do mesmo, nomeadamente tecidos ricos em lpidos; o valor
C
w
expresso em g/ml (ppm). Devem tambm apresentar-se os valores de C
w
relativos s sries de
controlo, bem como as concentraes de fundo,
factor de bioconcentrao no estado estacionrio (BCF
SS
), e/ou factor de concentrao cintico (BCF
k
),
bem como, se for caso disso, os intervalos de confiana (95 %) das constantes de velocidade de fixao e
depurao (expressos em relao massa hmida dos peixes e ao teor total de lpidos, se determinado,
dos animais ou de determinados tecidos dos mesmos), intervalos de confiana e desvio-padro (se
disponveis). Devem tambm referir-se os mtodos computacionais e/ou de anlise de dados aplicados a
cada concentrao da substncia em estudo,
caso se utilizem radiomarcadores, pode, se necessrio, apresentar-se a acumulao de quaisquer
metabolitos detectados,
devem referir-se quaisquer ocorrncias especiais registadas no decurso do ensaio, bem como quaisquer
desvios relativamente ao procedimento ou outras informaes de relevo.
O nmero de resultados classificados de no detectados no limite de deteco deve ser minimizado mediante
o desenvolvimento de um mtodo e de um protocolo experimental preliminares; os referidos resultados no
podem ser utilizados para o clculo das constantes de velocidade.
4. REFERNCIAS
(1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev.
Environ. Contam. Toxicol. 102, p. 117-156.
(2) Bintein S., Devillers, J. and Karcher W. (1993). Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-
-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, p. 29-390.
(3) OECD, Paris (1996). Direct Phototransformation of Chemicals in Water. Environmental Health and Safety
Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.
(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: Comparison of bioconcentration factors derived from
OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of
chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
(5) US EPA 822-R-94-002 (1994). Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Doc. for the
Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.
(6) US FDA, (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane,
Rockville, MD 20852, July 1975.
(7) US EPA (1974). Section 5, A(l). Analysis of Human Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in
Human and Evironmental Samples, Thompson J.F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.
(8) Compaan H. (1980). in The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic
environment: degradation, toxicity, bioaccumulation. Ch. 2.3, Part II. Government Publisshing Office,
the Hague, The Netherlands.
(9) Gardner et al., (1995). Limn. & Oceanogr. 30, p. 1099-1105.
(10) Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for
normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, p. 1431-1436.
(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method-Ring Test Programme,
1984-1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm.
(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with
Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.
Apndice 1
Caractersticas qumicas de uma gua de diluio adequada
Substncia Concentrao limite
1 Teor de partculas 5 mg/l
2 Carbono orgnico total 2 mg/l
3 Amonaco no ionizado 1 g/l
4 Cloro residual 10 g/l
5 Pesticidas organofosforados totais 50 ng/l
6 Pesticidas organoclorados totais e bifenilos policlorados 50 ng/l
7 Cloro orgnico total 25 ng/l
8 Alumnio 1 g/l
9 Arsnio 1 g/l
10 Crmio 1 g/l
11 Cobalto l g/l
12 Cobre 1 g/l
13 Ferro 1 g/l
14 Chumbo 1 g/l
15 Nquel 1 g/l
16 Zinco 1 g/l
17 Cdmio 100 ng/l
18 Mercrio 100 ng/l
19 Prata 100 ng/l
Apndsice 2
Espcies recomendadas para o ensaio
Espcies recomendadas
Gama de tempe-
raturas de ensaio
recomendadas
(
o
C)
Comprimento
recomendado dos
animais de ensaio
(cm)
1 Danio rerio (
1
) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) 20-25 3,0 0,5
2 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) 20-25 5,0 2,0
3 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) 20-25 5,0 3,0
4 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck and Schlegel) 20-25 4,0 1,0
5 Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) 20-25 3,0 1,0
6 Lepomis macroehirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque) Bluegill 20-25 5,0 2,0
7 Oncorbynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) 13-17 8,0 4,0
8 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus) 18-20 3,0 1,0
(
1
) Meyer A., Orti G. (1993). Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231.
Diversas espcies estuarinas e marinhas foram utilizadas em pases diferentes, nomeadamente:
Leiostomus xanthurus
Cyprinodon variegatus
Menidia beryllina
Cymatogaster aggregata
Parophrys vetulus
Leptocottus armatus
Gasteroteus aculeatus
Dicentracus labrax
Alburnus alburnus.
Obteno dos peixes
Os peixes de gua doce referidos no quadro supra so de fcil reproduo, encontrando-se disponveis todo o ano, enquanto
que a disponibilidade de algumas das espcies marinhas e estuarinas se encontra limitada a determinados pases. Os peixes
de gua doce podem ser criados em exploraes pisccolas ou no laboratrio, em condies controladas no que respeita a
doenas e parasitas, de modo a produzir animais saudveis com uma linha parental conhecida. Estas espcies encontram-se
disponveis em vrias partes do mundo.
Apndice 3
Previso da durao das fases de fixao e depurao
1. Estimativa da durao da fase de fixao
Antes de realizar o ensaio, pode obter-se uma estimativa de k
2
e, consequentemente, do tempo necessrio para atingir
o estado estacionrio, com base em relaes empricas entre k
2
e o coeficiente de partio n-octanol/gua (P
ow
) ou
entre k
2
e a solubilidade em gua(s).
A relao emprica que se segue permite obter, nomeadamente, uma estimativa de k
2
(expressa em dias
-1
) (1):
log
10
k
2
= 0,414 log
10
(P
ow
) + 1,47 (r
2
= 0,95) (equao 1)
A referncia (2) inclui outras equaes.
Caso o coeficiente de partio (P
ow
) no seja conhecido, pode obter-se uma estimativa (3) com base na solubilidade em
gua da substncia em estudo:
log
10
(P
ow
) = 0,862 log
10
(s) + 0,710 (r
2
= 0,994) (equao 2)
em que
s = solubilidade (moles/l): (n = 36).
As equaes apenas so aplicveis a substncias com valores de log P
ow
compreendidos entre 2 e 6,5 (4).
Pode obter-se o tempo necessrio para atingir uma determinada percentagem do estado estacionrio a partir do valor
de k
2
estimado, com base na equao cintica que descreve a fixao e a depurao (assumindo uma cintica de
primeira ordem):
dC
f
dt
= k
1
C
w
k
2
C
f
ou, para C
w
constante:
C
f =
k
1
k
2
C
w
1 e
k2t
_ _
(equao 3)
Na vizinhana do estado estacionrio (t ), a equao 3 pode reduzir-se a (5) (6):
C
f =
k
1
k
2
: C
w
ou C
f
/C
w
= k
1
/k
2
= BCF
O valor k
1
/k
2
. C
w
constitui uma estimativa da concentrao nos peixes no estado estacionrio virtual (C
fs
).
A equao 3 pode transformar-se em:
C
f = C
f,s
1 e
k2t
_ _
or
C
f
C
fs
= 1 e
k2t
(equao 4)
Aplicando a equao 4, pode prever-se o tempo necessrio para atingir uma determinada percentagem do estado
estacionrio, utilizando o valor de k
2
determinado por intermdio da equao 1 ou 2.
Do ponto de vista estatstico, a durao ptima da fase de fixao para a obteno de dados estatsticos fiveis (BCF
k
)
consiste no perodo necessrio para que a curva decorrente da representao grfica do logaritmo da concentrao da
substncia em estudo nos peixes em funo do tempo, numa escala aritmtica, atinja o ponto mdio, ou 1,6/k
2
, ou
80 % do estado estacionrio, mas no mais de 3,0/k
2
, ou 95 % do estado estacionrio (7).
O tempo necessrio para atingir 80 % do estado estacionrio dado por (equao 4):
0,80 = 1 e
k2t80
or t
80 =
1,6
k
2
(equao 5)
Do mesmo modo, o tempo necessrio para atingir 95 % do estado estacionrio dado por:
t
95 =
3,0
k
2
(equao 6)
Por exemplo, a durao da fase de fixao (up) de uma substncia com log P
ow
= 4, calculada do seguinte modo, por
recurso s equaes 1, 5 e 6:
log
10
k
2
= - 0,414.(4) + 1,47 k
2
= 0,652 dias
up (80 %) = 1,6/0,652, ou seja, 2,45 dias (59 horas)
ou up (95 %) = 3,0/0,652, ou seja, 4,60 dias (110 horas)
Do mesmo modo, a durao da fase de fixao de uma substncia com s = 10
-5
mal/l [log(s) = - 5,0], calculada por
recurso as equaes 1, 2, 5 e 6:
log
10
(P
ow
) = - 0,862 . (- 5,0) + 0,710 = 5,02
log
10
k
2
= - 0,414 . (5,02)+ 1,47
k
2
= 0,246 dias
-1
up (80 %) = 1,6/0,246, ou seja, 6,5 dias (156 horas)
ou up (95 %) = 3,0/0,246, ou seja, 12,2 dias (293 horas)
Como alternativa,
t
eq
= 6,54 10
3
P
ow
+ 55,31 (horas)
pode utilizar-se a expresso seguinte para o clculo do tempo necessrio para atingir o estado estacionrio real (4):
2. Estimativa da durao da fase de depurao
Com base na equao geral que descreve a fixao e a depurao de acordo com uma cintica de primeira ordem, pode
obter-se uma estimativa do tempo necessrio para reduzir a carga corporal de uma determinada percentagem da
concentrao inicial (1) (8).
Na fase de depurao, a concentrao C
w
deve ser nula, pelo que a equao pode reduzir-se a:
dC
f
dt
= k
2
C
f
or C
f = C
f,o
e
k2t
em que C
f.o
representa a concentrao no incio do perodo de depurao. O tempo necessrio para atingir 50 % da
depurao (t
50
) dado por:
C
f
C
f,o
=
1
2
= e
k2t50
or t
50 =
0,693
k
2
Do mesmo modo, o tempo necessrio para atingir 95 % de depurao ser:
t
95 =
3,0
k
2
Caso se utilize um valor correspondente a 80 % da fixao no primeiro perodo (1,6/k
2
) e a 95 % da depurao na fase
respectiva (3,0/k
2
), a durao da fase de depurao aproximadamente dupla da durao da fase de fixao.
Deve sublinhar-se, todavia, que as estimativas em causa apenas so vlidas para perfis de fixao e depurao que
sigam uma cintica de primeira ordem. Caso se demonstre que tal no sucede, deve recorrer-se a modelos mais
complexos [por exemplo, referncia (1)].
Referncias
(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish.
Environ. Toxicol. and Chem. 1, p. 309-320.
(2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration is fish: comparison of BCF's derived from OECD and ASTM testing
methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.
(3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ:
Sci. Technol. 16 (1), p. 4-10.
(4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on
bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), p. 701-707.
(5) Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society,
104 (4), p. 785-792.
(6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic Organisms. In: Appraisal of tests to predict the environne- mental
behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H., Part 4.4, p. 243-255. SCOPE,
1985, John Wiley & Sons Ltd, New York.
(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff M.W. (1977), Guidelines for the optimal design
of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, p. 614-622.
(8) Knemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of Six
Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, p. 3-19.
Apndsice 4
Exemplo de calendrio de amostragem aplicvel aos ensaios de bioconcentrao de substncias com log P
ow
= 4
Recolha de amostras de
peixes
Calendrio de amostragem
Nmero de amostras
adicionais
Nmero de peixes por
amostra
Frequncia mnima
necessria (dias)
Recolha de amostras
adicionais
Fase de fixao 1
0
2 (*)
2
45-80 peixes
1.
a
0,3 0,4 2
(2)
4
(4)
2.
a
0,6 0,9 2
(2)
4
(4)
3.
a
1,2 1,7 2
(2)
4
(4)
4.
a
2,4 3,3 2
(2)
4
(4)
5.
a
4,7 2 6
Fase de depurao Transferncia dos pei-
xes para uma clula
com gua isenta da
substncia em estudo
6.
a
5,0 5,3 4
(4)
7.
a
5,9 7,0 4
(4)
8.
a
9,3 11,2 4
(4)
9.
a
14,0 17,5 6
(4)
(*) Recolher as amostras de gua aps, pelo menos, trs renovaes do volume da clula.
Os valores entre parntesis correspondem ao nmero de amostras de gua e de peixes a recolher caso se proceda a uma amostragem
suplementar.
Nota:: O valor estimado de k
2
para log P
ow
= 4,0 de0,652dias
-1
. A durao total do ensaio dada por: 3 up = 3 4,6 dias = 14 dias. Para o
clculo do factor up, consultar o apndice 3.
Apndice 5
Descrio do modelo
Considera-se que a maioria dos dados referentes bioconcentrao so razoavelmente descritos por recurso a um modelo
simples do tipo dois compartimentos/dois parmetros, baseado na linearidade da curva obtida na representao grfica em
papel semilogartmico das concentraes nos peixes durante a fase de depurao em funo do tempo. Caso no se obtenha
uma curva linear, devem utilizar-se processos mais complexos, nomeadamente o processo descrito por Spacie e Hamelink
(referncia 1 do apndice 3).
Mtodo grfico para a determinao da constante de velocidade de depurao, k
2
Representar graficamente, em papel semilogartmico, a concentrao da substncia em estudo nas diversas amostras de
peixe em funo dos tempos de amostragem. O declive da curva obtida fornece o valor de k
2
.
k
2 =
ln C
f1
=C
f2

t
2
t
1
Deve sublinhar-se que quaisquer eventuais desvios linearidade podem constituir indicao de um perfil de depurao mais
complexo que o descrito por uma cintica de primeira ordem, podendo tambm aplicar-se mtodos grficos no caso de
processos de depurao que no exibam uma cintica de primeira ordem.
Mtodo grfico para a determinao da constante de velocidade de fixao, k
1
Conhecida a constante k
2
calcular k
1
do seguinte modo:
k
1 =
C
f
k
2
C
w
1 e
k2t

equao 1
O valor de C
f
obtido a partir do ponto mdio da curva de fixao obtida na representao grfica do logaritmo da
concentrao em funo do tempo.
Mtodo computacional para o clculo das constantes de velocidade de fixao e de depurao
O processo mais adequado para obter o factor de bioconcentrao, bem como as constantes k
1
e k
2
, consiste no recurso a
mtodos computacionais de estimativa no linear. Os programas utilizados permitem obter valores para k
1
e k
2
a partir de
uma srie sequencial de dados tempo/concentrao, aplicando o seguinte modelo terico:
C
f = C
w

k
1
k
2
1 e
k2t
_ _
0 < t < t
c
equao 2
C
f = C
w

k
1
k
2
e
k2 t tc
e
k2t
_ _
t > t
c
equao 3
em que t
c
= tempo decorrido at ao final da fase de fixao.
A abordagem em causa permite obter uma estimativa de k
1
e k
2
com base no desvio-padro.
Uma vez que, na maioria dos casos, a constante k
2
pode ser estimada a partir da curva de depurao com uma preciso
relativamente elevada, determinando-se em simultneo a forte correlao existente entre os parmetros k
1
e k
2
, pode ser
aconselhvel comear por calcular k
2
apenas com base nos dados de depurao, calculando posteriormente k
1
a partir dos
dados de fixao, por recurso a um mtodo de regresso no linear.
C.14. ENSAIO DE CRESCIMENTO JUVENIL EM PEIXES
1. MTODO
O presente mtodo de ensaio de toxicidade no crescimento baseia-se na publicao OECD TG 215 (2000)
(normas de ensaio da OCDE).
1.1. INTRODUO
O presente ensaio, concebido para avaliar os efeitos da exposio prolongada a substncias qumicas no
crescimento de peixes juvenis, baseia-se num mtodo desenvolvido e testado na Unio Europeia atravs de um
ensaio interlaboratorial (1) (3) e destinado a determinar os efeitos de substncias qumicas no crescimento de
juvenis de truta arco-ris (Oncorynchus mykiss) em condies de escoamento. Podem usar-se para ensaio outras
espcies relativamente s quais existam obras de referncia. As publicaes sobre ensaios de crescimento em
peixe-zebra (Danio rerio) (2) (4) (5) e em peixinho dos arrozais (Oryzias latipes) (6) (7) (8), por exemplo, contm
informaes teis para este tipo de estudos.
Ver tambm a introduo geral, parte C.
1.2. DEFINIES
Menor concentrao com efeito observvel (MCCEO): a menor concentrao de ensaio da substncia a
ensaiar para a qual se observa um efeito significativo (a p < 0,05) quando comparado com o controlo. No
entanto, todas as concentraes de ensaio superiores MCCEO devem ter um efeito prejudicial igual ou
superior ao verificado com a MCCEO.
Concentrao sem efeito observvel (CSEO): a concentrao de ensaio cujo valor se situa imediatamente
abaixo do valor da MCCEO.
EC
x
no presente mtodo de ensaio, a concentrao da substncia de ensaio que causa uma variao de x % na
taxa de crescimento dos peixes relativamente aos controlos.
Taxa de carga: o peso fresco de peixe por volume de gua.
Densidade de ocupao: o nmero de peixes por volume de gua.
Taxa especfica de crescimento individual de um peixe: expressa a taxa de crescimento de um indivduo
relativamente ao seu peso inicial.
Taxa especfica mdia de crescimento de um tanque: expressa a taxa mdia de crescimento da populao de
um tanque para uma dada concentrao da substncia de ensaio.
Taxa de crescimento pseudo-especfica: expressa a taxa de crescimento individual relativamente ao valor
mdio do peso inicial da populao do tanque.
Os peixes juvenis em fase exponencial de crescimento so pesados, colocados em cmaras de ensaio e expostos
a uma gama de concentraes subletais da substncia de ensaio dissolvida em gua. O ensaio dever realizar-se
preferencialmente em condies de escoamento; se tal no for possvel, podero usar-se condies semiestticas
(esttico renovao) apropriadas. A durao do ensaio de 28 dias. Os peixes so alimentados diariamente.
A quantidade de alimento fornecido aos peixes calculada com base no seu peso inicial e pode ser reavaliada
decorridos 14 dias de ensaio. No final do ensaio, os peixes so pesados novamente. Os efeitos nas taxas de
crescimento so analisados por meio de um modelo de regresso, de forma a estimar a concentrao que
provocaria uma variao de x % na taxa de crescimento, ou seja, CEx (por exemplo, CE10, CE20 ou CE30). Em
alternativa, os dados podem ser comparados com valores de controlo, de modo a determinar a menor
concentrao com efeito observvel (MCCEO) e, a partir desse valor, a concentrao sem efeito observvel
(CSEO).
1.4. INFORMAO SOBRE A SUBSTNCIA DE ENSAIO
Devero estar disponveis resultados de um ensaio de toxicidade aguda (ver mtodo de ensaio C.1.) realizado de
preferncia com a espcie escolhida para este ensaio, o que implica que a solubilidade em gua e a presso de
vapor da substncia de ensaio so conhecidas, e que existe um mtodo analtico fivel para a quantificao da
substncia nas solues a ensaiar, relativamente ao qual a exactido e o limite de deteco so conhecidos e se
encontram descritos.
A frmula estrutural, o grau de pureza, a estabilidade em gua, a estabilidade luz, os valores de pK
a
e P
ow
e os
resultados de um ensaio de biodegradabilidade fcil da substncia de ensaio constituem informaes teis (ver
mtodo de ensaio C.4).
Um ensaio considerado vlido quando so cumpridas as seguintes condies:
no(s) controlo(s), a mortalidade no final do ensaio no dever ser superior a 10 %,
o aumento do peso mdio dos peixes no(s) controlo(s) dever ser suficiente para permitir a deteco da
mnima variao da taxa de crescimento considerada significativa. Os resultados de um ensaio
interlaboratorial (3) demonstraram que, para a truta arco-ris, o peso mdio dos peixes nos controlos
deve sofrer, ao longo de 28 dias, um aumento que seja, no mnimo, equivalente a metade (isto , a 50 %)
do seu peso mdio inicial; por exemplo, peso inicial: 1 g/peixe (= 100 %), peso final aps 28 dias: 1,5 g/
/peixe ( 150 %),
a concentrao do oxignio dissolvido deve ser igual ou superior a 60 % do valor da saturao com ar
(VSA) ao longo de todo o ensaio,
a variao da temperatura da gua no deve ser superior a 1
o
C entre as diferentes cmaras de ensaio em
qualquer momento do ensaio nem dever ultrapassar um intervalo de 2
o
C dentro das gamas de
temperatura especificadas para as espcies a ensaiar (apndice 1).
1.6.1. Equipamento
Equipamento normal de laboratrio e, mais especificamente, o seguinte:
a) Medidores de oxignio e de pH;
b) Equipamento para determinao da dureza e alcalinidade da gua;
c) Aparelhos apropriados para o controlo da temperatura e que permitam, de preferncia, a sua
monitorizao contnua;
d) Tanques construdos com um material quimicamente inerte e de capacidade adequada carga e
densidade de ocupao recomendadas (ver ponto 1.8.5 e apndice 1);
e) Balana de preciso apropriada (isto , com uma exactido de 0,5 %).
1.6.2. gua
Qualquer gua que sustente a sobrevivncia e o crescimento adequados a longo prazo, da espcie em ensaio,
poder ser utilizada como gua de ensaio. A qualidade da gua deve ser mantida constante durante o ensaio. Os
valores de pH devem situar-se entre 6,5 e 8,5, no devendo, num dado ensaio, sofrer variaes superiores a
0,5 pH unidades. Recomenda-se uma dureza superior a 140 mg/l (expressos em CaCO
3
). Para assegurar que a
gua de diluio no influencie indevidamente o resultado do ensaio (por complexao da substncia de ensaio,
por exemplo), devero ser regularmente retiradas amostras para anlise. Devem efectuar-se medies de metais
pesados (por exemplo, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd e Ni), principais anies e caties (por exemplo, Ca, Mg, Na, K, Cl e
SO
4
), pesticidas (por exemplo, pesticidas organofosforados totais e organoclorados totais), carbono orgnico
total e slidos em suspenso. Nos casos em que se sabe que a gua de diluio mantm uma qualidade
relativamente constante, estas medies devero ser efectuadas, por exemplo, de trs em trs meses. Caso se
demonstre que a qualidade da gua se mantm inalterada durante, pelo menos, um ano, as determinaes
podem ser menos frequentes (de seis em seis meses, por exemplo). No apndice 2 apresentam-se algumas
caractersticas qumicas de uma gua de diluio aceitvel.
As solues de ensaio com as concentraes escolhidas so preparadas por diluio de uma soluo de reserva.
A soluo de reserva deve ser preparada, preferencialmente, apenas por mistura ou agitao da substncia de
ensaio na gua de diluio, utilizando meios mecnicos (agitao ou disperso ultra-snica, por exemplo).
Podem ser utilizadas colunas de saturao (colunas de solubilidade) para obter uma soluo de reserva
concentrada adequada.
Em alguns casos, pode ser necessrio utilizar solventes ou dispersantes (agentes solubilizantes) para produzir
uma soluo de reserva com a concentrao adequada. A acetona, o etanol, o metanol, o dimetilsulfxido, a
dimetilformamida e o trietilenoglicol so exemplos de solventes adequados. Dispersantes adequados so, por
exemplo, o Cremofor RH40, o Tween 80, a metilcelulose a 0,01 % e o HCO-40. Deve ter-se cuidado ao utilizar
agentes facilmente biodegradveis (como a acetona, por exemplo) e/ou compostos altamente volteis, uma vez
que estes podem causar problemas relacionados com o desenvolvimento de bactrias nos ensaios em que for
utilizado o mtodo de escoamento. Quando se utiliza um agente solubilizante, este no deve afectar de forma
significativa o crescimento dos peixes, nem produzir efeitos adversos observveis nos juvenis, de acordo com
um controlo na presena apenas do solvente.
Para os ensaios por escoamento, necessrio utilizar um sistema que distribua e dilua continuamente a soluo
de reserva da substncia de ensaio (por exemplo, uma bomba de medio, um diluidor proporcional ou um
sistema saturador), por forma a fornecer uma srie de concentraes s cmaras de ensaio. As taxas de fluxo
das solues de reserva e da gua de diluio devem ser verificadas a intervalos regulares durante o ensaio, de
preferncia diariamente, e no devem variar mais do que 10 % ao longo do ensaio. Os resultados de um ensaio
interlaboratorial demonstraram que, para a truta arco-ris, adequado utilizar uma frequncia de remoo de
gua de 6 l/g de peixe/dia (ver ponto 1.8.2.2).
Para os ensaios semiestticos (de renovao), a frequncia de renovao do meio depender da estabilidade da
substncia de ensaio. No entanto, recomenda-se uma renovao diria da gua. Se, a partir de ensaios de
estabilidade preliminares (ver ponto 1.4), se demonstrar que a concentrao da substncia de ensaio no
estvel (isto , se estiver fora da gama de 80-120 % do valor nominal ou se for inferior a 80 % da concentrao
medida inicialmente) durante o perodo de renovao, deve considerar-se a utilizao de um ensaio por
escoamento.
1.6.4. Seleco de espcies
A espcie recomendada para o presente ensaio a truta arco-ris (Oncorhynchus mykiss), uma vez que a maior
parte da informao disponvel foi obtida a partir de ensaios interlaboratoriais realizados com esta espcie (1)
(3). Podem ser usadas outras espcies relativamente s quais exista documentao de referncia embora o
mtodo de ensaio possa ter de ser adaptado de modo a proporcionar as condies de ensaio adequadas. Por
exemplo, existem obras de referncia relativas ao peixe-zebra (Danio rerio) (4) (5) e ao peixinho dos arrozais
(Oryzias latipes) (6) (7) (8). Neste caso, o relatrio dever indicar o critrio para a seleco das espcies e o
mtodo experimental .
1.6.5. Confinao dos peixes
Os peixes de ensaio devem ser seleccionados a partir da populao de uma nica reserva (de preferncia
proveniente da mesma desova), que tenha sido mantida em condies de qualidade da gua e de iluminao
idnticas s usadas no ensaio durante, pelo menos, as duas semanas anteriores sua realizao. Durante o
perodo de confinao e no decorrer do ensaio, os peixes devem ser alimentados preferencialmente com uma
rao equivalente a 4 % do peso corporal por dia; no mnimo, a rao diria dever corresponder a 2 % do peso
corporal.
Decorrido um perodo inicial de 48 h dever registar-se a mortalidade e aplicar os seguintes critrios:
mortalidade superior a 10 % da populao num perodo de sete dias: o lote rejeitado na sua totalidade,
mortalidade de 5 % a 10 % da populao: aclimatao durante um perodo adicional de sete dias: caso se
verifique mortalidade superior a 5 % durante este segundo perodo, dever rejeitar-se a totalidade do lote,
mortalidade inferior a 5 % da populao num perodo de sete dias: o lote aceite.
Os peixes no devem receber qualquer tratamento de doenas nas duas semanas anteriores ao ensaio nem
durante a realizao do mesmo.
1.7. PLANEAMENTO DO ENSAIO
O planeamento do ensaio consiste na escolha do nmero e intervalos das concentraes de ensaio, do
nmero de tanques para cada concentrao e do nmero de peixes por tanque. Um planeamento de ensaio
correctamente elaborado dever considerar os seguintes aspectos:
a) O objectivo do estudo;
b) O mtodo de anlise estatstica a utilizar;
c) A disponibilidade e o custo dos meios experimentais.
A definio do objectivo dever, se possvel, especificar o rigor estatstico para o qual necessrio ocorrer uma
determinada diferena, de modo a ser detectada (na taxa de crescimento, por exemplo). Em alternativa, poder
especificar a preciso com que ser necessrio determinar a CE
X
de modo a permitir a sua estimativa (por
exemplo, com x = 10, 20 ou 30; de preferncia, o valor de x no deve ser inferior a 10). Se nenhuma destas
informaes for disponibilizada, no ser possvel dar uma indicao correcta da dimenso do estudo.
Importa ter presente que um planeamento considerado ptimo (ou seja, o que utiliza da melhor forma os
recursos disponveis) para anlise atravs de um dado mtodo estatstico poder no o ser para outro mtodo.
Assim, um planeamento concebido para determinao da MCCEO/CSEO no ser idntico a um outro
concebido para anlise por regresso.
Na maioria dos casos, pelas razes analisadas por Stephan e Rogers (9), considera-se que a anlise de regresso
prefervel anlise de varincia. No entanto, no caso de no se encontrar um modelo de regresso adequado
(r
2
< 0,9), dever usar-se a estimativa de CSEO/MCCEO.
1.7.1. Planeamento para anlise por regresso
O planeamento de um ensaio a analisar por regresso dever considerar os seguintes aspectos:
a) As concentraes testadas no ensaio devero, obrigatoriamente, incluir as concentraes s quais se
observam determinadas percentagens de efeito (por exemplo, CE
10,20,30
) e abranger a gama de
concentraes para as quais o efeito da substncia de ensaio significativo. As estimativas das
concentraes responsveis por determinadas percentagens de efeito podero ser feitas com maior
preciso se os respectivos valores se localizarem a meio da gama de concentraes ensaiadas. A realizao
de um ensaio preliminar para determinao da gama de concentraes poder ser til na escolha das
concentraes de ensaio apropriadas;
b) De modo a permitir a aplicao de um modelo estatstico, o ensaio deve incluir, no mnimo, um tanque
de controlo e cinco tanques adicionais com diferentes concentraes da substncia de ensaio. Caso se
utilize um agente solubilizante, o ensaio dever incluir, alm da srie de ensaio, um controlo contendo o
agente solubilizante na maior das concentraes testadas no ensaio (ver pontos 1.8.3 e 1.8.4);
c) Embora se possam utilizar sries geomtricas ou sries logartmicas adequadas (10) (ver apndice 3),
recomenda-se o espaamento logartmico das concentraes de ensaio;
d) Se existirem mais do que seis tanques, os tanques excedentes devem ser usados para repetio ou
distribudos ao longo da gama de concentraes de forma a reduzir o intervalo entre nveis. No h
preferncia por qualquer destes procedimentos.
1.7.2. Planeamento para a estimativa de CSEO/MCCEO atravs de anlise de varincia (ANOVA)
Sempre que possvel, devem usar-se repeties dos tanques correspondentes a cada concentrao; a anlise
estatstica deve efectuar-se ao nvel de cada tanque (11). Sem repeties, no possvel analisar a variabilidade
entre tanques, mas apenas a atribuvel variabilidade entre cada um dos elementos da populao. No entanto,
os resultados de um estudo publicado (12) demonstraram que, no caso examinado, a variabilidade entre
tanques era muito pequena quando comparada com a variabilidade dentro de cada tanque (isto , entre os
peixes de um tanque). Assim, considera-se a realizao de anlise estatstica a nvel individual uma alternativa
relativamente aceitvel.
Convencionalmente, utilizam-se pelo menos cinco concentraes de ensaio de uma srie geomtrica com um
factor que, de preferncia, no dever ser superior a 3,2.
Em geral, em ensaios com tanques repetidos, o nmero de repeties de tanques de controlo (e portanto, o
nmero de peixes) dever ser o dobro do usado em cada uma das concentraes de ensaio, as quais devero ser
de dimenso idntica (13) (14) (15). Em contrapartida, na ausncia de tanques repetidos, o nmero de peixes
no grupo de controlo deve ser idntico ao usado em cada concentrao de ensaio.
Caso se utilize uma ANOVA baseada em tanques e no em indivduos (o que implicaria a marcao individual
dos peixes ou o uso de taxas de crescimento pseudo-especficas (ver ponto 2.1.2), o ensaio dever incluir as
repeties necessrias para a determinao do desvio-padro relativo aos tanques nas mesmas concentraes.
Assim sendo, a estimativa do erro na anlise de varincia dever considerar, no mnimo, cinco graus de
liberdade (11). Se o ensaio incluir apenas repeties dos controlos, a variabilidade do erro poder ser desviada,
uma vez que pode aumentar com o valor mdio da taxa de crescimento em questo. Dado ser provvel que a
taxa de crescimento diminua com o aumento da concentrao, esta situao poder conduzir a uma
sobrestimao da variabilidade.
1.8. PROCEDIMENTO
1.8.1. Seleco e pesagem dos peixes de ensaio
importante minimizar a variao entre o peso de cada peixe no incio do ensaio. O apndice 1 contm as
gamas de pesos aceitveis para as diferentes espcies recomendadas para uso neste ensaio. A gama de pesos
individuais em todo o lote de peixes no incio do ensaio deve situar-se, de preferncia, dentro dos limites de
10 % da mdia aritmtica dos pesos, no devendo, em circunstncia alguma, exceder os 25 %. Por forma a
estimar o peso mdio, recomenda-se a pesagem de uma amostra do lote de peixe antes de dar incio ao ensaio.
A populao de reserva deve ser privada de alimento durante as 24 horas que antecedem o incio do ensaio. Os
peixes devero ento ser escolhidos de forma aleatria. Utilizando um anestsico geral (por exemplo, uma
soluo aquosa de 100 mg/l de metanosulfonato de tricana [MS 222], neutralizada por adio de duas partes
de bicarbonato de sdio por cada parte de MS 222), os peixes devem ser pesados individualmente por forma a
determinar o peso fresco (secos com papel absorvente) com a preciso indicada no apndice 1. Os peixes cujo
peso se encontre dentro da gama pretendida so seleccionados e distribudos aleatoriamente pelos recipientes
de ensaio. Deve registar-se o peso fresco total dos peixes em cada recipiente. O uso de anestsicos e a
manipulao (incluindo a secagem com papel e a pesagem) podem causar tenso ou danos fsicos nos peixes
juvenis, especialmente em espcies de pequeno tamanho. Por essa razo, a manipulao dos juvenis dever ser
feita com o mximo cuidado para se evitarem esses efeitos nos animais do ensaio.
Os peixes voltam a ser pesados no 28.
o
dia de ensaio (ver ponto 1.8.6). No entanto, caso se considere
necessrio recalcular a rao alimentar, pode efectuar-se uma pesagem adicional no 14.
o
dia de ensaio (ver
ponto 1.8.2.3). A deteco de alteraes no tamanho dos peixes, a partir dos quais se possam ajustar as raes
alimentares, poder ser efectuada atravs de outros mtodos, tais como a fotografia.
1.8.2.1. Durao
A durao mnima do ensaio de 28 dias.
1.8.2.2. Taxas de carga e densidades de ocupao
importante que a taxa de carga e a densidade de ocupao sejam adequadas espcie usada no ensaio (ver
apndice 1). Uma densidade de ocupao demasiado elevada poder dar origem a perturbaes por
superlotao, causadoras de redues nas taxas de crescimento e, possivelmente, de doenas. Por outro lado, o
uso de baixas densidades de ocupao poder induzir comportamentos territoriais, que podero tambm
afectar o crescimento. Em todo o caso, a taxa de carga dever ser suficientemente baixa para permitir manter
uma concentrao de oxignio dissolvido de pelo menos 60 % VSA sem arejamento. Um ensaio
interlaboratorial (3) demonstrou que, para a truta arco-ris, adequado utilizar uma taxa de carga de 16
trutas de 3-5 g num volume de 40 1. A frequncia de remoo de gua recomendada durante o perodo de
ensaio de 6 l/g de peixe/dia.
1.8.2.3. Alimentao
Os peixes devem ser nutridos com um alimento apropriado (apndice 1), administrado a um ritmo suficiente
para induzir uma taxa de crescimento aceitvel. Devero ser tomadas as precaues necessrias para evitar o
crescimento de microorganismos e a turbidez da gua. No caso da truta arco-ris, considera-se adequada uma
quantidade diria correspondente a 4 % do seu peso corporal (3) (16) (17) (18). A rao diria pode ser dividida
em duas pores iguais, que sero fornecidas aos peixes em duas tomas separadas por um intervalo mnimo de
cinco horas. O clculo da rao baseia-se no peso total inicial dos peixes em cada recipiente. No caso de se
efectuar uma segunda pesagem dos peixes no 14.
o
dia de ensaio, poder efectuar-se um novo clculo da rao
alimentar. Os peixes devem ser privados de alimento durante o perodo de 24 horas que antecede a pesagem.
Os alimentos no consumidos e a matria fecal devem ser removidos diariamente dos recipientes de ensaio,
limpando-se cuidadosamente o fundo de cada tanque com um sistema de suco.
1.8.2.4. Luz e temperatura
O fotoperodo e a temperatura da gua do ensaio devem ser apropriados para a espcie de ensaio (apndice 1).
1.8.3. Concentraes de ensaio
Normalmente, devero ser utilizadas cinco concentraes da substncia de ensaio, independentemente do
planeamento do ensaio (ver ponto 1.7.2). O conhecimento prvio da toxicidade da substncia de ensaio (obtido
a partir de um ensaio de toxicidade aguda e/ou de um ensaio para determinao de gama de concentraes, por
exemplo) dever ajudar na seleco das concentraes de ensaio apropriadas. Deve fornecer-se uma justificao
quando se utilizam menos de cinco concentraes. A concentrao de ensaio mais elevada no dever exceder
o limite de solubilidade da substncia em gua.
Quando se utiliza um agente solubilizante para facilitar a preparao de solues de reserva, a sua concentrao
final no deve ser superior a 0,1 ml/l e, de preferncia, dever ser a mesma em todos os recipientes de ensaio
(ver ponto 1.6.3). No entanto, devem fazer-se todos os esforos para evitar a utilizao destes produtos.
1.8.4. Controlos
O nmero de controlos em gua de diluio depende do planeamento do ensaio (ver pontos 1.7-1.7.2). Se se
utilizar um agente solubilizante, o ensaio dever incluir controlos com essa substncia em nmero idntico aos
controlos em gua de diluio.
1.8.5. Frequncia das determinaes analticas e medies
Durante o ensaio, as concentraes da substncia de ensaio devero ser determinadas a intervalos regulares (ver
abaixo).
Nos ensaios por escoamento, as taxas de fluxo das solues de reserva do agente de diluio e da substncia
txica devem ser verificadas a intervalos regulares, de preferncia diariamente, no devendo variar mais do que
10 % ao longo do ensaio. Nos ensaios em que se espera que as concentraes da substncia de ensaio se
mantenham dentro de um intervalo de 20 % dos valores nominais (isto , dentro da gama 80-120 %; ver
pontos 1.6.2 e 1.6.3), recomenda-se que, no mnimo, a maior e a menor das concentraes de ensaio sejam
analisadas no incio do estudo e, a partir da, semanalmente. Para os ensaios em que no se espera que a
concentrao da substncia de ensaio se mantenha dentro do intervalo de 20 % do valor nominal (com base
nos dados de estabilidade da substncia), ser necessrio analisar todas as concentraes de ensaio, seguindo o
mesmo regime.
Nos ensaios semiestticos (de renovao), em que se espera que a concentrao da substncia de ensaio se
mantenha dentro de um intervalo de 20 % do valor nominal, recomenda-se que, no mnimo, a maior e a
menor das concentraes de ensaio sejam analisadas logo aps a sua preparao e imediatamente antes da
renovao, no incio do estudo e, a partir da, semanalmente. Para os ensaios em que no se espera que a
concentrao da substncia de ensaio se mantenha dentro do intervalo de 20 % do valor nominal, ser
necessrio analisar todas as concentraes de ensaio, seguindo um regime idntico ao recomendado para
substncias mais estveis.
Recomenda-se que os resultados se baseiem em concentraes medidas. No entanto, caso existam provas de
que a concentrao da substncia a ensaiar na soluo se manteve, durante o ensaio, no intervalo de 20 % do
valor nominal ou do valor da concentrao inicial medida, os resultados podero basear-se em valores
nominais ou em valores medidos.
As amostras podem precisar de ser centrifugadas ou filtradas (utilizando um poro com 0,45 m, por exemplo).
Embora a centrifugao seja o procedimento recomendado, as amostras podem ser filtradas desde que o
material de ensaio no adsorva aos filtros.
Durante o ensaio, o oxignio dissolvido, o pH e a temperatura devem ser medidos em todos os recipientes de
ensaio. A dureza total, a alcalinidade e a salinidade (se relevante) devem ser medidas nos controlos e num
recipiente com a concentrao mais elevada. O oxignio dissolvido e a salinidade (se relevante) devem ser
medidos trs vezes (no incio, a meio e no fim do ensaio). Nos ensaios semiestticos, recomenda-se que o
oxignio dissolvido seja medido com maior frequncia, de preferncia antes e aps cada renovao da gua ou,
pelo menos, uma vez por semana. O pH deve ser medido no incio e no fim de cada renovao da gua nos
ensaios de renovao esttica e, pelo menos, semanalmente nos ensaios por escoamento. A dureza e a
alcalinidade devem ser medidas uma vez em cada ensaio. A temperatura dever ser, de preferncia,
monitorizada continuamente, pelo menos, num recipiente de ensaio.
1.8.6. Observaes
Peso: No fim do ensaio, todos os peixes sobreviventes devem ser pesados, avaliando-se o peso fresco (seco com
papel absorvente). A pesagem pode ser feita individualmente ou em grupos por recipiente de ensaio; este
ltimo procedimento prefervel, uma vez que a pesagem em separado exige a marcao individual dos peixes.
Se for necessrio efectuar pesagens individuais para determinar taxas especficas de crescimento de cada um dos
peixes, a tcnica de marcao adoptada dever evitar perturbar os animais (podero utilizar-se alternativas a
marcao por congelao, tais como a utilizao de linha de pesca fina colorida).
Durante o perodo do ensaio, os peixes devem ser observados diariamente, devendo ser assinaladas quaisquer
anomalias externas (tais como hemorragia, descolorao) ou comportamentos anmalos. A mortalidade dever
ser registada, e os peixes mortos retirados o mais rapidamente possvel. Os peixes mortos no so substitudos,
uma vez que a taxa de carga e a densidade de ocupao so suficientes para impedir que alteraes no nmero
de peixes por tanque afectem o crescimento. No entanto, a taxa de alimentao dever ser reajustada.
2. DADOS E RELATRIO
Recomenda-se que um tcnico estatstico participe tanto no planeamento como na anlise do ensaio, uma vez
que o mtodo permite variaes considerveis no plano experimental no que se refere, por exemplo, ao
nmero de recipientes de ensaio, ao nmero de concentraes de ensaio, ao nmero de peixes, etc. Devido s
opes disponveis quanto ao planeamento do ensaio, no se fornece qualquer orientao especfica
relativamente aos procedimentos estatsticos.
As taxas de crescimento no devem ser calculadas em recipientes de ensaio em que a mortalidade seja superior
a 10 %. No entanto, deve indicar-se a taxa de mortalidade para todas as concentraes de ensaio.
Seja qual for o mtodo utilizado na anlise dos dados, o conceito fundamental a taxa especfica de
crescimento r entre os tempos t
1
e t
2
. Esta pode ser definida de vrias formas, dependendo de os peixes serem
ou no marcados individualmente, bem como da necessidade de determinar uma mdia por tanque.
r
1 =
log
e
W
2
log
e
W
1
t
2
t
1
100
r
2 =
log
e
W
2
log
e
W
1
t
2
t
1
100
r
3 =
log
e
W
2
log
e
W
1
t
2
t
1
100
em que
r
1
= taxa especfica de crescimento individual
r
2
= taxa especfica de crescimento mdia por tanque
r
3
= taxa pseudo-especfica de crescimento
w
1
, w
2
= pesos de determinado peixe nos tempos t
1
e t
2
, respectivamente
log
e
w
1
= logaritmo do peso de um indivduo no incio do perodo de estudo
log
e
w
2
= logaritmo do peso de um indivduo no final do perodo de estudo
log
e
W
1
= mdia dos logaritmos dos valores de w
1
para os peixes do tanque no incio do perodo de estudo
log
e
W
2
= mdia dos logaritmos dos valores de w
2
para os peixes do tanque no final do perodo de estudo
t
1
, t
2
= tempo (em dias) no incio e no final do perodo de estudo
As taxas r
1
, r
2
, r
3
podem ser calculadas para o perodo dia 0-dia 28, e, quando apropriado (isto , quando se
efectuaram medies no 14.
o
dia de ensaio), para os perodos dia 0-dia 14 e dia 14-dia 28.
2.1.1. Anlise de resultados por regresso (modelo concentrao-resposta)
Este mtodo de anlise estabelece uma relao matemtica adequada entre a taxa especfica de crescimento e a
concentrao, permitindo a determinao da CE
x
, ou seja, de qualquer valor de CE. Utilizando este mtodo
no necessrio calcular o valor individual de r (r
1
) e, em vez disso, a anlise pode basear-se no valor mdio de
r por tanque (r
2
). Este ltimo procedimento considerado prefervel, e tambm mais adequado a espcies de
menores dimenses.
As taxas especficas de crescimento mdias por tanque (r
2
) devem ser representadas graficamente em funo da
concentrao, de forma a observar a relao concentrao-resposta.
A relao entre r
2
e a concentrao deve ser expressa atravs de um modelo apropriado, cuja escolha deve ser
bem fundamentada.
Se os nmeros de peixes sobreviventes em cada tanque forem diferentes, o procedimento de ajuste do modelo
(seja este simples ou no linear) dever ser ponderado por forma a permitir grupos de diferentes dimenses.
O mtodo de ajuste do modelo deve permitir estimar, por exemplo, o valor de CE
20
e da respectiva disperso
(erro-padro ou intervalo de confiana). O grfico do modelo ajustado deve ser apresentado em conjunto com
os dados, de modo a permitir observar a adequao do ajuste realizado (9) (19) (20) (21).
2.1.2. Anlise de resultados para a determinao da MCCEO
Caso o ensaio tenha includo repeties dos tanques para todas as concentraes, a estimativa da MCCEO pode
basear-se numa anlise de varincia (ANOVA) da taxa especfica de crescimento mdia dos tanques (ver
ponto 2.1), seguida da aplicao de um mtodo apropriado de comparao entre o r mdio para cada
concentrao e o r mdio dos controlos [por exemplo, o teste de Dunnett ou o teste de Williams (13) (14) (15)
(22)], a fim de identificar a menor concentrao para a qual a diferena entre os dois valores significativa a
uma probabilidade de 0,05. Se no se verificarem os requisitos exigidos pelos mtodos paramtricos
distribuio no normal (teste de Shapiro-Wilk, por exemplo) ou varincia heterognea (teste de Bartlett) ,
poder ser equacionada a transformao dos dados de forma a homogeneizar as varincias antes de efectuar a
ANOVA. Em alternativa, poder realizar-se uma ANOVA ponderada.
Na ausncia de repeties dos tanques para cada concentrao, uma ANOVA com base em dados de tanques
ser insensvel ou impossvel. Nestes casos, um compromisso aceitvel ser a realizao da ANOVA com base
nos valores individuais da taxa pseudo-especfica de crescimento r
3
.
O valor mdio de r
3
para cada concentrao de ensaio poder depois ser comparado com o valor mdio de r
3
para os controlos, podendo a MCCEO ser determinada de acordo com o procedimento acima descrito. Importa
salientar que este mtodo no tem em conta a variabilidade entre tanques, para alm da que devida
variabilidade entre indivduos. No entanto, os resultados de um estudo publicado (9) demonstraram que a
variabilidade entre tanques era muito pequena quando comparada com a variabilidade em cada tanque (ou seja,
entre os peixes de um tanque). Se a anlise no considerar os peixes de forma individual, dever ser indicado o
mtodo de identificao de aberraes, bem como uma justificao para a sua utilizao.
Os resultados devem ser interpretados com precauo quando as concentraes txicas medidas nas solues
de ensaio ocorrem em nveis perto do limite de deteco do mtodo analtico. A interpretao dos resultados
de ensaios semiestticos, em que a concentrao da substncia de ensaio diminui entre o momento em que a
soluo preparada e a renovao, deve igualmente ser efectuada com precauo.
2.3.1. Substncia de ensaio:
dados de identificao qumica, incluindo o grau de pureza e o mtodo analtico de quantificao da
substncia de ensaio, quando apropriado.
2.3.2. Espcie de ensaio:
nome cientfico, se possvel,
estirpe, dimenses, fornecedor, tratamentos prvios, etc.
2.3.3. Condies de ensaio:
procedimento de ensaio utilizado (por exemplo, semiesttico/renovao, por escoamento, carga,
densidade de ocupao, etc.),
planeamento do ensaio (por exemplo, o nmero de recipientes de ensaio, concentraes de ensaio e
repeties, nmero de peixes por recipiente),
mtodo de preparao das solues de reserva e frequncia de renovao (quando utilizados, o agente
solubilizante e a sua concentrao devem ser indicados),
valores nominais das concentraes de ensaio, mdias dos valores medidos nos recipientes de ensaio e
respectivos desvios-padro, bem como o mtodo atravs do qual estes foram obtidos; devem ainda ser
fornecidas provas de que as medies se referem s concentraes da substncia de ensaio em verdadeira
soluo,
caractersticas da gua de diluio: pH, dureza, alcalinidade, temperatura, concentrao do oxignio
dissolvido, nveis de cloro residual (caso tenham sido medidos), carbono orgnico total, slidos em
suspenso, salinidade do meio de ensaio (caso tenha sido medida) e quaisquer outras medies
efectuadas,
qualidade da gua dentro dos recipientes de ensaio: pH. dureza, temperatura e concentrao do oxignio
dissolvido,
informaes pormenorizadas sobre a alimentao [por exemplo, tipo de alimento(s), provenincia,
quantidade fornecida e frequncia de administrao].
2.3.4. Resultados:
prova de que os controlos satisfazem os critrios de validade relativos sobrevivncia, bem como dados
sobre a mortalidade observada em qualquer uma das concentraes ensaiadas,
mtodos de anlise estatstica utilizados, dados usados na anlise estatstica (repeties ou peixes),
tratamento dos dados e justificao das tcnicas usadas,
tabelas contendo os dados relativos aos pesos individuais e mdios dos peixes nos dias 0, 14 (caso
tenham sido medidos) e 28, bem como os valores das taxas de crescimento mdias por tanque ou
pseudo-especficas (conforme seja apropriado) referentes aos perodos dia 0-dia 28, ou, se possvel, dia
0-dia 14 e dia 14-dia 28,
resultados da anlise estatstica (isto , anlise de regresso ou ANOVA), apresentados, de preferncia, em
tabelas de forma grfica, bem como a MCCEO (p = 0,05) e a CSEO ou a CE
X
; sempre que possvel e
apropriado, devero indicar-se os erros-padro,
incidncia de quaisquer reaces invulgares manifestadas pelos peixes e de quaisquer efeitos visveis
produzidos pela substncia de ensaio.
3. REFERNCIAS
(1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test
of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Eish. WRc Report No PRD
1388-M/2.
(2) Meyer, A., Bierman, C. H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a
model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B.
252, pp. 231-236.
(3) Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J. (1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of
Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities.
WRc Report No EEC 2600-M.
(4) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere,
14, p. 1855-1870.
(5) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M, Munk R., Scholz N. and Hfte B. B. (1991). Effect
of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative
laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, p. 15 7-164.
(6) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and
strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.
(7) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (1995). Acute
and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Environ. Conta.
Toxicol. 28, p. 287-297.
(8) Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests
with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91-063. US Environmental
Protection Agency, Duluth, Minnesota.
(9) Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of
chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891,
R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia, p. 328-338.
(10) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish
(rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS l/
/RM/28, 81 p.
(11) Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.
(12) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on
the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology,
WRc Medmenham, UK, 10-12 December 1991.
(13) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a
Control, J. Amer. Statist. Assoc, 50, p. 1096-1121.
(14) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, p. 482-491.
(15) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are
compared with a zero dose control. Biometrics, 27, p. 103-117.
(16) Johnston, W. L., Atkinson, J. I.., Glanville N. T. (1994). A technique using sequential feedings of different
coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding
level. Aquaculture 120, p. 123-133.
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(18) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H.
Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA, 288 pp.
(19) Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data.
Environ. Toxicol. Chem. 11, pp. 1485-1494.
(20) DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L, Reichenbach, J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O.
(1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and
interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric
Power Research Institute, Palo Alto, CA.
(21) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US
Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-
-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 pp.
(22) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28,
p. 510-531.
Apndice I
ESPCIES DE PEIXES RECOMENDADAS PARA ENSAIO E CONDIES DE ENSAIO APROPRIADAS
Espcie
Gama de
temperaturas
recomendada
(
o
C)
Fotoperodo
(horas)
Gama de pesos
iniciais dos peixes
recomendada
(g)
Preciso de medio
exigida
Taxa de carga
(g/l)
Densidade de
ocupao
(por litro)
Alimentao
Durao do ensaio
(dias)
Espcie recomendada:
Oncorhynchus mykiss
Truta arco-ris
12,5-16,0 12-16 1-5 100 mg 1,2-2,0 4 Alimento seco (comercial), prepa-
rado a partir de salmondeos jovens
28
Outras espcies sobre as quais
existe documentao:
Danio rerio
Peixe-zebra
21-25 12-16 0,050-0,100 1 mg 0,2-1,0 5-10 Alimento vivo (Brachionus, Artemia) 28
Oryzias latipes
Peixinho dos arrozais
21-25 12-16 0,050-0,100 1 mg 0,2-1,0 5-20 Alimento vivo (Brachionus, Artemia) 28
L
1
4
2
/
6
0
0
P
T
J
o
r
n
a
l
O
f
i
c
i
a
l
d
a
U
n
i
o
E
u
r
o
p
e
i
a
3
1
.
5
.
2
0
0
8
Apndice 2
Substncia Concentraes
Partculas < 20 mg/l
Amnia no ionizada < 1 g/l
Total de pesticidas organofosforados < 50 ng/1
Total de pesticidas organoclorados + bifenilos policlorados < 50 ng/1
Cloro orgnico total < 25 ng/1
Apndice 3
Sries logartmicas de concentraes apropriadas para ensaio de toxicidade (9)
Coluna (nmero de concentraes entre 100 e 10 ou entre 10 e 1) (*)
1 2 3 4 5 6 7
100 100 100 100 100 100 100
32 46 56 63 68 72 75
10 22 32 40 46 52 56
3,2 10 18 25 32 37 42
1,0 4,6 10 16 22 27 32
2,2 5,6 10 15 19 24
1,0 3,2 6,3 10 14 18
1,8 4,0 6,8 10 13
1,0 2,5 4,6 7,2 10
1,6 3,2 5,2 7,5
1,0 2,2 3,7 5,6
1,5 2,7 4,2
1,0 1,9 3,2
1,4 2,4
1,0 1,8
1,3
1,0
(*) Pode escolher-se uma srie de cinco (ou mais) concentraes sucessivas de uma coluna. Os pontos intermdios entre as concentraes de
uma coluna (x) encontram-se na coluna (2x + 1). Os valores listados podem representar concentraes expressas em percentagem por
volume ou peso (mg/l ou g/l). Os valores podem ser multiplicados ou divididos por qualquer potncia de 10, conforme seja apropriado.
Caso exista uma incerteza considervel relativamente ao nvel de toxicidade, pode usar-se a coluna 1.
C.15. ENSAIO DE TOXICIDADE DE CURTO PRAZO NOS PEIXES EM ESTDIO EMBRIONRIO E RECM-
-NASCIDOS
1. MTODO
O presente mtodo de ensaio de toxicidade de curto prazo baseia-se na publicao OECD TG 212 (1998)
(normas de ensaio da OCDE).
1.1. INTRODUO
O presente ensaio de toxicidade a curto prazo nos peixes em estdio embrionrio e recm-nascidos um ensaio
de curto prazo, em que se testa a exposio em todas as fases do ciclo de vida desde o ovo recm-fertilizado at
ao fim da fase de recm-nascido. Uma vez que, neste ensaio, no fornecido qualquer alimento aos embries e
peixes recm-nascidos, o ensaio deve ser finalizado enquanto os peixes recm-nascidos ainda se alimentam a
partir do saco vitelino.
Este ensaio destina-se a definir os efeitos letais e, at certo ponto, subletais de determinados produtos qumicos
nos estdios e espcies ensaiados. A informao obtida ser til na medida em que permite a) estabelecer uma
ligao entre os ensaios letais e subletais; b) ser utilizado como um ensaio de despiste tanto para um ensaio
relativo s primeiras fases de vida como para ensaios de toxicidade crnica; e c) ser utilizado para ensaios em
espcies para as quais as tcnicas de criao no estejam suficientemente avanadas de modo a abrangerem o
perodo de mudana da alimentao endgena para a exgena.
Importa ter presente que, de um modo geral, s os ensaios que abrangem todos os estdios do ciclo de vida dos
peixes so susceptveis de proporcionar uma estimativa exacta da toxicidade crnica dos produtos qumicos
para estes animais e que a reduo da exposio em qualquer estdio pode reduzir a sensibilidade e, por
conseguinte, subestimar a toxicidade crnica. ento de esperar que os ensaios em embries e peixes recm-
-nascidos sejam menos sensveis que um ensaio que englobe todas as fases iniciais de vida, particularmente no
respeitante a produtos qumicos com elevada lipofilicidade (log P
ow
> 4) e produtos qumicos com um
mecanismo especfico de aco txica. No entanto, para produtos qumicos com um mecanismo de aco
narctico no especfico, esperam-se menores diferenas entre os dois ensaios em termos de sensibilidade (1).
Antes da publicao deste ensaio, a maior parte das experincias com embries e peixes recm-nascidos foram
realizadas com o peixe de gua doce Danio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae; nome comum peixe-
-zebra). Por esta razo, fornecida no apndice 1 uma orientao mais pormenorizada sobre o ensaio com esta
espcie, o que no exclui a utilizao de outras espcies ensaiadas e relativamente s quais existem obras de
referncia (quadros 1A e 1B).
1.2. DEFINIES
Menor concentrao com efeito observvel (LOEC): a menor concentrao de ensaio da substncia a
ensaiar para a qual se observa um efeito significativo (a p < 0,05) quando comparado com o controlo. No
entanto, todas as concentraes de ensaio superiores LOEC devem ter um efeito prejudicial igual ou superior
ao verificado com a NOEC.
Concentrao sem efeito observvel (NOEC): a concentrao de ensaio cujo valor se situa imediatamente
abaixo do valor da LOEC.
1.3. PRINCPIO DO ENSAIO
Os peixes em estdio embrionrio e recm-nascidos so expostos a uma gama de concentraes da substncia
de ensaio dissolvida em gua. No mbito do protocolo, possvel escolher entre um mtodo semi-esttico e um
mtodo por escoamento. A escolha depende da natureza da substncia de ensaio. O ensaio inicia-se colocando
ovos fertilizados nas cmaras de ensaio e termina imediatamente antes de o saco vitelino de qualquer larva em
qualquer das cmaras de ensaio ter sido completamente absorvido ou antes de ocorrer mortalidade nos
controlos por falta de alimento. Os efeitos letais e subletais so avaliados e comparados com os valores de
controlo de modo a determinar a menor concentrao com efeito observvel e, a partir da, a concentrao sem
efeito observvel. Em alternativa, podem ser analisados utilizando um modelo de regresso para estimar a
concentrao que provocaria uma dada percentagem de efeito (isto a CL/CE
X
, em que x uma % de efeito
definido).
Devero estar disponveis resultados de um ensaio de toxicidade aguda (ver mtodo C.1) realizado de
preferncia com a espcie escolhida para este ensaio. Os resultados podem ser teis para a seleco de uma
gama apropriada das concentraes a testar no ensaio sobre as fases iniciais de vida. A solubilidade em gua
(incluindo a solubilidade na gua do ensaio) e a presso de vapor da substncia de ensaio devem ser conhecidas.
Deve ser possvel utilizar um mtodo analtico fivel para a quantificao da substncia nas solues a ensaiar,
relativamente ao qual a exactido e o limite de deteco sejam conhecidos e se encontrem descritos.
A frmula estrutural da substncia de ensaio, o seu grau de pureza, estabilidade luz, estabilidade nas
condies do ensaio, pKa, P
ow
e os resultados de um ensaio para a biodegradabilidade fcil so informaes
teis para o planeamento do ensaio (ver mtodo C.4).
Um ensaio considerado vlido quando so cumpridas as seguintes condies:
o nmero total de ovos fertilizados vivos no grupo de controlo e, quando aplicvel, nos recipientes-
-controlo para o solvente, deve ser igual ou superior aos limites definidos nos apndices 2 e 3,
a concentrao do oxignio dissolvido deve situar-se entre 60 e 100 % do valor da saturao com o ar
(VSA) ao longo de todo o ensaio,
a temperatura da gua no deve variar mais do que 1,5
o
C entre as diferentes cmaras de ensaio ou entre
dias sucessivos, em qualquer momento do ensaio, devendo ainda situar-se na gama de temperaturas
especificada para as espcies a ensaiar (apndices 2 e 3).
1.6.1. Cmaras de ensaio
Podem ser utilizados quaisquer recipientes de vidro ou outros recipientes em material quimicamente inerte. A
dimenso dos recipientes deve ser suficiente para permitir cumprir os requisitos relativos carga (ver
ponto 1.7.1.2). Recomenda-se que as cmaras de ensaio sejam posicionadas de forma aleatria na rea de
ensaio. Quando em presena de efeitos sistemticos no laboratrio que possam ser controlados mediante a
disposio por agrupamento, prefervel aplicar um esquema aleatrio de disposio por agrupamento, com
cada tratamento est presente em cada grupo, do que um esquema totalmente aleatrio. A disposio das
cmaras de ensaio por agrupamento, se utilizada, deve ser tomada em considerao na posterior anlise de
dados. As cmaras de ensaio devem estar protegidas contra perturbaes indesejveis.
1.6.2. Seleco das espcies de peixes
As espcies de peixes recomendadas encontram-se indicadas no quadro 1A. Podero ser utilizadas outras
espcies (exemplos no quadro 1B), mas o mtodo de ensaio poder ter de ser adaptado de modo a proporcionar
condies de ensaio adequadas. Neste caso, o critrio para a seleco das espcies e o mtodo experimental
devero ser indicados no relatrio.
1.6.3. Confinao da descendncia dos peixes
Podero ser encontradas indicaes teis sobre a confinao dos alevins em condies adequadas no OECD TG
210 (
1
) e nas referncias bibliogrficas (2), (3), (4), (5) e (6).
1.6.4. Manuseamento de embries e larvas
Dentro do recipiente principal, os embries e as larvas podem ser colocados em recipientes menores com as
partes laterais ou extremidades em rede, de modo a permitir um fluxo da soluo de ensaio atravs do
recipiente. Uma forma de provocar o fluxo, sem turbulncia, consiste em pendurar estes pequenos recipientes
num brao que se movimente para cima e para baixo, desde que os organismos sejam mantidos sempre
submersos. Poder tambm utilizar-se um sistema de fluxo por efeito de sifo. Os ovos fertilizados de peixes
salmondeos podem ser colocados em suportes ou redes com orifcios suficientemente largos para permitir que
as larvas saiam aps a ecloso. Nos ensaios semi-estticos com renovao diria total, a remoo dos embries
e das larvas poder ser feita de forma apropriada utilizando pipetas Pasteur (ver ponto 1.6.6).
Quando se utilizam recipientes de ovos, grades ou redes para confinar os ovos no recipiente principal de ensaio,
estas vedaes devem ser removidas aps a ecloso (
1
) das larvas, com excepo das redes, que devem ser
mantidas para evitar que os peixes escapem. Se houver necessidade de transferir as larvas, estas no devem ser
expostas ao ar e no se devem utilizar redes para soltar os peixes dos recipientes de ovos (tal precauo pode
no ser necessria para algumas espcies menos frgeis, como a carpa, por exemplo). O momento adequado
para efectuar esta transferncia varia em funo das espcies utilizadas, havendo casos em que a transferncia
poder no ser necessria. Para o mtodo semi-esttico, podem ser utilizados copos ou recipientes pouco
fundos e, se necessrio, equipados com uma peneira de rede ligeiramente elevada acima do fundo do copo. Se o
volume destes recipientes for suficiente para obedecer aos requisitos de carga, poder no ser necessrio
efectuar a transferncia de embries ou larvas (ver ponto 1.7.1.2).
1.6.5. gua
Qualquer gua adequada como gua de ensaio, desde que esteja em conformidade com as caractersticas
qumicas de uma gua de diluio aceitvel, como indicado no apndice 4, e desde que a taxa de sobrevivncia
das espcies a ensaiar seja, nos controlos, pelo menos to satisfatria como a descrita nos apndices 2 e 3. A
qualidade de gua deve ser mantida constante durante o decorrer do ensaio. A variao do valor de pH no
dever ser superior a 0,5 unidades. De modo a assegurar que a gua de diluio no influencie indevidamente
(
1
) OECD, Paris, 1992. Test Guideline 210, Fish, Early-life Stage Toxicity Test.
o resultado do ensaio (por complexao da substncia de ensaio, por exemplo) ou afecte de forma desfavorvel
o desempenho do lote de descendentes, devero ser retiradas amostras regularmente para anlise. Devem
efectuar-se medies de metais pesados (por exemplo Cu, Pb, Zn, Hg, Cd e Ni), anies e caties principais (por
exemplo Ca, Mg, Na, K, Cl e SO
4
), pesticidas (por exemplo pesticidas organofosforados totais e organoclorados
totais), carbono orgnico total e slidos em suspenso, por exemplo, de trs em trs meses nos casos em que se
sabe que a gua de diluio mantm uma qualidade relativamente constante. Se se demonstrar que a qualidade
da gua se mantm inalterada durante, pelo menos, um ano, as determinaes podem ser menos frequentes (de
seis em seis meses, por exemplo).
As solues de ensaio com as concentraes escolhidas so preparadas por diluio da soluo de reserva.
A soluo de reserva deve ser preparada, preferencialmente, apenas por mistura ou agitao da substncia de
ensaio na gua de diluio, utilizando meios mecnicos (agitao e disperso ultra-snica, por exemplo). Podem
ser utilizadas colunas de saturao (colunas de solubilidade) para obter uma soluo de reserva concentrada
adequada. Deve evitar-se, tanto quanto possvel, a utilizao de solventes ou dispersantes (agentes
solubilizantes). No entanto, tais compostos podem ser necessrios, em alguns casos, para produzir uma
soluo de reserva com a concentrao adequada. A acetona, o etanol, o metanol, a dimetilformamida e o
trietilenoglicol so exemplos de solventes adequados. Dispersantes adequados so, por exemplo, o Cremofor
RH40, o Tween 80, a metilcelulose 0,01 % e o HCO-40. Deve ter-se cuidado ao utilizar agentes facilmente
biodegradveis (como a acetona, por exemplo) e/ou altamente volteis, uma vez que estes podem causar
problemas com o desenvolvimento de bactrias nos ensaios em que for utilizado o mtodo de escoamento.
Quando se utiliza um agente solubilizante, este no deve ter um efeito significativo na sobrevivncia, nem um
efeito adverso observvel nas fases iniciais de vida, de acordo com o controlo em presena apenas do solvente.
No entanto, como se referiu acima, devem fazer-se todos os esforos para evitar utilizar tais produtos.
Para o mtodo semi-esttico, podem seguir-se dois procedimentos de renovao diferentes: i) podem preparar-
-se novas solues de ensaio em recipientes limpos e transferir suavemente os ovos e larvas sobreviventes para
estes recipientes, num pequeno volume da soluo velha e evitando a exposio ao ar, ou ii) podem manter-se
os organismos a ensaiar nos recipientes enquanto uma proporo da gua de ensaio (pelo menos trs quartos)
mudada. A frequncia de renovao do meio depender da estabilidade da substncia de ensaio, mas
recomenda-se uma renovao diria da gua. Se, a partir de ensaios de estabilidade preliminares (ver ponto 1.4),
se demonstrar que a concentrao da substncia de ensaio no estvel (isto , se estiver fora da gama de 80-
-120 % do valor nominal ou for inferior a 80 % da concentrao medida inicialmente) durante o perodo de
renovao, deve considerar-se a utilizao de um ensaio por escoamento. Em qualquer dos casos, deve ter-se
cuidado para evitar a perturbao das larvas durante a operao de renovao da gua.
Para os ensaios por escoamento, necessrio utilizar um sistema que distribua e dilua continuamente a soluo
de reserva da substncia de ensaio (uma bomba de medio, um diluidor proporcional, um sistema saturador,
por exemplo), por forma a fornecer uma srie de concentraes s cmaras de ensaio. As taxas de fluxo das
solues de reserva e da gua de diluio devem ser verificadas a intervalos regulares, de preferncia
diariamente, e no devem variar mais do que 10 % ao longo do ensaio. Considera-se adequada uma taxa de
fluxo equivalente a, pelo menos, o volume de cinco cmaras de ensaio em 24 horas (2).
1.7. PROCEDIMENTO
Existem trabalhos publicados que contm informaes teis sobre a realizao de ensaios de toxicidade em
embries de peixe e peixes recm-nascidos, dos quais alguns so indicados na bibliografia apresentada no final
(7), (8) e (9).
1.7.1.1. Durao
O ensaio deve iniciar-se de preferncia 30 minutos aps a fertilizao dos ovos. Os embries so imersos na
soluo de ensaio antes ou o mais cedo possvel depois do incio da fase de segmentao discoidal mas, de
qualquer forma, sempre antes do incio da fase de gstrula. Nos casos em que os ovos utilizados forem obtidos
atravs de um fornecedor comercial, poder no ser possvel iniciar o ensaio imediatamente aps a fertilizao.
O ensaio deve iniciar-se nas oito horas subsequentes fertilizao, porque qualquer atraso pode influenciar
significativamente a sensibilidade. Uma vez que as larvas no so alimentadas durante o perodo de exposio,
o ensaio deve terminar imediatamente antes que o saco vitelino de qualquer larva em qualquer das cmaras de
ensaio tenha sido completamente absorvido ou antes que se registe mortalidade por falta de alimento. O tempo
de exposio depender da espcie utilizada. Nos apndices 2 e 3, apresentam-se algumas recomendaes
relativas ao perodo de exposio.
1.7.1.2. Carga
O nmero de ovos fertilizados no incio do ensaio dever ser suficiente para permitir o cumprimento dos
requisitos estatsticos. Os ovos devem ser distribudos aleatoriamente pelos grupos de tratamento e, pelo
menos. 30 ovos fertilizados devero ser repartidos de forma equitativa (ou da forma mais equitativa possvel,
uma vez que difcil obter lotes iguais quando se utilizam algumas espcies) pelo menos por trs cmaras de
ensaio (repeties) para cada concentrao. A taxa de carga (biomassa por volume de soluo de ensaio) deve
ser suficientemente pequena para permitir manter uma concentrao de oxignio dissolvido de pelo menos
60 % VSA sem arejamento. Para os ensaios por escoamento, foi recomendada uma taxa de carga que nunca
dever exceder 0,5 g/l em 24 horas, nem 5 g/l de soluo (2).
1.7.1.3. Luz e temperatura
O fotoperodo e a temperatura da gua do ensaio devem ser apropriados para a espcie a ensaiar (apndices 2 e
3). Poder ser apropriado utilizar um recipiente de ensaio adicional para a monitorizao da temperatura.
Normalmente, devero ser utilizadas cinco concentraes da substncia de ensaio espaadas por um factor
constante no superior a 3,2. Na escolha da gama de concentraes do ensaio, deve considerar-se a curva que
relaciona a CL
50
com o perodo de exposio no estudo de toxicidade aguda. Nalgumas circunstncias, poder
ser apropriado utilizar menos de cinco concentraes (em testes-limite, por exemplo) e um intervalo de
concentrao mais estreito. Deve fornecer-se uma justificao quando se utilizam menos de cinco
concentraes. As concentraes da substncia superiores ao valor CL
50
aps 96 horas ou a 100 mg/l (a
mais reduzida das duas), no necessitam de ser ensaiadas. As substncias no devem ser ensaiadas acima do seu
limite de solubilidade na gua de ensaio.
Quando se utiliza um agente solubilizante para facilitar a preparao de solues de ensaio (ver ponto 1.6.6), a
sua concentrao final nos recipientes de ensaio no deve ser superior a 0,1 ml/l e deve ser a mesma em todos
os recipientes de ensaio.
1.7.3. Controlos
Alm dos ensaios principais, devem ser utilizados um controlo da gua destilada (com as repeties
apropriadas) e, se relevante, um controlo contendo o agente solubilizante (com as repeties apropriadas).
Durante o ensaio, as concentraes da substncia de ensaio devero ser determinadas a intervalos regulares.
No ensaio semi-esttico, em que se espera que a concentrao da substncia de ensaio se mantenha dentro de
um intervalo de 20 % do valor nominal (isto , dentro da gama 80-120 %; ver ponto 1.4 e 1.6.6),
recomenda-se que, no mnimo, a maior e a menor concentraes de ensaio sejam analisadas quando acabam de
ser preparadas e imediatamente antes da renovao em, pelo menos, trs ocasies a intervalos regulares durante
o ensaio (isto as anlises devem ser realizadas numa amostra da mesma soluo quando esta acaba de ser
preparada e no momento da renovao).
Para os ensaios em que no se espera que a concentrao da substncia de ensaio se mantenha dentro do
intervalo de 20 % do valor nominal (com base nos dados de estabilidade da substncia), necessrio analisar
todas as concentraes de ensaio, logo aps a sua preparao e antes da renovao, mas seguindo o mesmo
regime (isto , em pelo menos trs ocasies a intervalos regulares durante o ensaio). A determinao das
concentraes da substncia de ensaio antes da renovao s necessita de ser realizada numa das repeties
para cada concentrao de ensaio. O intervalo entre as determinaes no deve exceder sete dias. Recomenda-
-se que os resultados se baseiem em concentraes medidas. No entanto, os resultados podem basear-se em
valores nominais ou valores iniciais medidos, se existirem provas de que a concentrao da substncia a ensaiar
na soluo se manteve no intervalo de 20 % do valor nominal ou do valor da concentrao inicial medida
durante o ensaio.
Para os ensaios por escoamento, apropriado um regime de amostragem semelhante ao descrito para os
ensaios semi-estticos (embora a medio das solues usadas no seja aplicvel neste caso). No entanto, se o
ensaio se prolongar por mais de sete dias, poder ser aconselhvel aumentar o nmero de amostras analisadas
durante a primeira semana (efectuando trs conjuntos de medies, por exemplo) de forma a assegurar que as
concentraes de ensaio se mantm estveis.
As amostras podem precisar de ser centrifugadas ou filtradas (utilizando um poro com 0,45 m de tamanho,
por exemplo). No entanto, como nem sempre a centrifugao ou a filtrao separam a fraco no
biodisponvel da fraco biodisponvel da substncia de ensaio, as amostras podero no ser sujeitas a estes
tratamentos.
Durante o ensaio, o oxignio dissolvido, o pH e a temperatura devem ser medidos em todos os recipientes de
ensaio. A dureza total e a salinidade (se relevante) devem ser medidas nos controlos e num recipiente com a
concentrao mais elevada. O oxignio dissolvido e a salinidade (se relevante) devem ser medidos, no mnimo,
trs vezes (no incio, a meio e no fim do ensaio). Nos ensaios semi-estticos, recomenda-se que o oxignio
dissolvido seja medido com maior frequncia, de preferncia antes e aps cada renovao da gua ou, pelo
menos, uma vez por semana. O pH deve ser medido no incio e no fim de cada renovao da gua nos ensaios
semi-estticos e, pelo menos, semanalmente nos ensaios por escoamento. A dureza deve ser medida uma vez
em cada ensaio. A temperatura deve ser medida diariamente e, de preferncia, monitorizada continuamente
pelo menos num recipiente de ensaio.
1.7.5. Observaes
1.7.5.1. Estdio de desenvolvimento embrionrio
O estdio embrionrio (isto , o estdio de gstrula) no incio da exposio substncia de ensaio deve ser
verificado de forma to precisa quanto possvel. Poder-se- utilizar para o efeito uma amostra representativa
dos ovos adequadamente conservados e limpos. A bibliografia apresentada no final poder tambm ser
consultada para a descrio e ilustrao dos estdios embrionrios (2), (5), (10) e (11).
1.7.5.2. Ecloso e sobrevivncia
A ecloso e a sobrevivncia devero ser observadas e registadas, pelo menos diariamente. No incio do ensaio,
poder ser til efectuar observaes mais frequentes (de 30 em 30 minutos durante as primeiras trs horas, por
exemplo), uma vez que, em alguns casos, o perodo de sobrevivncia pode ser mais relevante do que apenas o
nmero de mortes (quando existem efeitos txicos agudos, por exemplo). Os embries e as larvas mortos
devem ser retirados logo aps a sua observao, uma vez que podem decompor-se rapidamente. A remoo
dos indivduos mortos dever ser extremamente cuidadosa, de forma a no provocar danos fsicos nos ovos/
/larvas vizinhos, j que estes so extremamente frgeis e sensveis. Os critrios de morte variam de acordo com
o estdio de vida:
para os ovos: particularmente nos estdios iniciais, uma acentuada perda de translucidez e alterao na
colorao, causada por coagulao e/ou precipitao de protena e conduzindo a um aspecto branco
opaco,
para os embries: ausncia de movimento e/ou ausncia de batimentos cardacos e/ou descolorao
opaca nas espcies com embries normalmente translcidos,
para as larvas: imobilidade e/ou ausncia de movimentos respiratrios e/ou ausncia de batimentos
cardacos e/ou colorao branca opaca do sistema nervoso central e/ou falta de reaco a estmulos
mecnicos.
1.7.5.3. Aspecto anmalo
O nmero de larvas que apresentam uma forma corporal e/ou uma pigmentao anmalos, assim como o
estado de absoro do saco vitelino devero ser registados a intervalos de tempo adequados em funo da
durao do ensaio e da natureza da anomalia descrita. importante notar que o aparecimento de embries e
larvas com anomalias um fenmeno que ocorre naturalmente, podendo nalgumas espcies afectar uma
percentagem significativa do(s) controlo(s). Os animais que apresentem um aspecto anmalo s devem ser
retirados dos recipientes de ensaio quando estiverem mortos.
1.7.5.4. Comportamento anmalo
Anomalias tais como a hiperventilao, as alteraes no comportamento natatrio e o estado de passividade
anormal, devero ser registadas a intervalos de tempo adequados, em funo da durao do ensaio. Embora
estes efeitos sejam difceis de quantificar, a sua observao pode ajudar na interpretao dos dados relativos
mortalidade, isto , podem fornecer informao sobre o mecanismo de aco txica da substncia.
1.7.5.5. Comprimento
Recomenda-se que, no fim do ensaio, se proceda medio do comprimento de cada indivduo. Os
comprimentos a medir podero ser o normalizado, o comprimento at extremidade da barbatana caudal ou o
comprimento total. Se, no entanto, as barbatanas caudais dos peixes apresentarem sinais de apodrecimento ou
eroso, o comprimento a medir ser o normalizado. Normalmente, num ensaio bem realizado o coeficiente da
variao de comprimento entre as repeties dos controlos deve ser 20 %.
1.7.5.6. Peso
No fim do ensaio, os indivduos podero ser pesados separadamente, sendo prefervel o peso seco (24 horas a
60
o
C) ao peso fresco (seco com papel absorvente). Normalmente, num ensaio bem realizado, o coeficiente de
variao de peso entre as repeties dos controlos deve ser 20 %.
A partir destas observaes, devero ser elaborados todos ou parte dos seguintes dados, que sero objecto de
anlise estatstica:
mortalidade acumulada,
nmeros de larvas saudveis no fim do ensaio,
incio e fim do perodo de ecloso (isto 90 % de ecloso em cada repetio),
nmeros de larvas eclodidas por dia,
comprimento (e peso) dos animais sobreviventes no fim do ensaio,
nmeros de larvas que apresentam deformaes ou um aspecto anmalo,
nmeros de larvas que apresentam um comportamento anmalo.
2. DADOS E RELATRIO
Recomenda-se que um tcnico estatstico participe tanto no planeamento como na anlise do ensaio, uma vez
que o mtodo permite variaes considerveis no planeamento experimental no que se refere, por exemplo, ao
nmero de cmaras de ensaio, ao nmero de concentraes de ensaio, ao nmero inicial de ovos fertilizados e
aos parmetros medidos. Devido s inmeras opes disponveis quanto ao planeamento do ensaio, no se
fornece qualquer orientao especfica relativamente aos procedimentos estatsticos.
Se se pretender determinar a LOEC/NOEC, ser necessrio analisar as variaes dentro de cada conjunto de
repeties, utilizando uma anlise de varincia (ANOVA) ou procedimentos de tabelas de contingncia. O
mtodo de Dunnett (12) (13) pode ser til para efectuar uma comparao mltipla entre os resultados das
concentraes individuais e os dos controlos. Existem igualmente outros exemplos teis (14) (15). A dimenso
do efeito detectvel utilizando o mtodo ANOVA ou outros procedimentos (isto a capacidade do ensaio)
dever ser calculada e descrita. Importa salientar que nem todas as observaes descritas no ponto 1.7.5.6 so
adequadas para a anlise estatstica utilizando a ANOVA. A mortalidade acumulada e os nmeros de larvas
saudveis no fim do ensaio podem ser analisados utilizando mtodos probit, por exemplo.
Se se pretender determinar os valores CL/CE
X
, a(s) curva(s) adequada(s), como a curva logstica, deve(m) ser
ajustada(s) aos dados relevantes utilizando um mtodo estatstico (como o mtodo dos mnimos quadrados ou
dos mnimos quadrados no linear). A(s) curva(s) deve(m) ser parametrizada(s) de modo a que os valores CL/
/CE
X
de interesse e o seu desvio-padro possam ser estimados directamente. Isto facilitar enormemente o
clculo dos limites de confiana em volta dos valores CL/CE
X
. A no ser que haja boas razes para preferir
limites de confiana diferentes, devem ser utilizados limites de confiana de mais ou menos 95 %. O
procedimento de ajuste deve, preferencialmente, permitir avaliar a significncia da falta de ajuste. Podem
utilizar-se mtodos grficos de ajuste de curvas. A anlise de regresso adequada para todas as observaes
descritas no ponto 1.7.5.6.
Os resultados devem ser interpretados com precauo quando as concentraes txicas medidas nas solues
de ensaio ocorrem em nveis situados perto do limite de deteco do mtodo analtico. A interpretao dos
resultados para concentraes superiores ao limite de solubilidade da substncia na gua deve igualmente ser
efectuada com precauo.
dados de identificao qumica, incluindo o grau de pureza e o mtodo analtico para a quantificao das
substncias de ensaio, quando apropriado.
nome cientfico, estirpe, nmero de peixes progenitores (isto nmero de fmeas utilizadas para fornecer
o nmero de ovos necessrios ao ensaio), fonte e mtodo de recolha dos ovos fertilizados e posterior
manuseamento.
2.3.3. Condies de ensaio:
o procedimento de ensaio utilizado (semi-esttico ou por escoamento, perodo de tempo desde a
fertilizao at ao incio do ensaio, carga, etc.),
o(s) fotoperodo(s),
o planeamento do ensaio (por exemplo, o nmero de cmaras de ensaio e repeties, o nmero de
embries por repetio),
o mtodo de preparao das solues de reserva e a frequncia de renovao (quando utilizados, o agente
solubilizante e a sua concentrao devem ser indicados),
os valores nominais das concentraes de ensaio, os valores medidos, as suas mdias e os respectivos
desvios-padro nos recipientes de ensaio, o mtodo atravs do qual estes foram obtidos e, se a substncia
de ensaio for solvel na gua em concentraes inferiores s ensaiadas, as provas de que as medies se
referem s concentraes da substncia de ensaio na soluo,
caractersticas da gua de diluio: o pH, a dureza, a temperatura, a concentrao do oxignio dissolvido,
os nveis de cloro residual (caso tenham sido medidos), o carbono orgnico total, os slidos em
suspenso, a salinidade do meio de ensaio (caso tenha sido medida) e quaisquer outras medies
efectuadas,
a qualidade da gua dentro dos recipientes de ensaio: o pH, a dureza, a temperatura e a concentrao do
oxignio dissolvido.
2.3.4. Resultados:
resultados de qualquer estudo preliminar sobre a estabilidade da substncia de ensaio,
prova de que os controlos esto de acordo com o padro de aceitao de sobrevivncia total da espcie de
ensaio (apndices 2 e 3),
dados sobre a mortalidade/sobrevivncia nos estdios embrionrio e larvar e sobre a mortalidade/
/sobrevivncia total,
dias at ecloso e nmero de ecloses,
dados sobre o comprimento (e peso),
incidncia e descrio de anomalias morfolgicas, caso tenham sido observadas,
incidncia e descrio de efeitos comportamentais, caso tenham sido observados,
anlise estatstica e tratamento de dados,
para ensaios analisados utilizando o mtodo ANOVA, a menor concentrao com efeito observvel
(LOEC) a p = 0,05 e a concentrao sem efeito observvel (NOEC) para cada resposta avaliada, incluindo
uma descrio dos procedimentos estatsticos utilizados e uma indicao da dimenso do efeito que pode
ser detectado,
para os ensaios analisados utilizando tcnicas de regresso, a CL/CE
X
e os intervalos de confiana, bem
como o grfico do modelo ajustado utilizado para o seu clculo,
explicao dos motivos para qualquer desvio a este mtodo de ensaio.
3. REFERNCIAS
(1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to
other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 p. June
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Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-O11,
Duluth, Minnesota.
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p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
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Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, p. 328-330.
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(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with
Control. J. Amer. Statist. Assoe, 50, p. 1096-1121.
(13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, p. 482-491.
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(15) Van Leeuwen C. J., Aderna D. M. M. and Hermes J. (1990). Quantitative Structure-Activity Relationships
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(24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary
perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 p.
(25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, in: W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish
Physiology, Vol. XIA, Academic press, p. 1-58.
Quadro 1A
Espcies de peixes recomendadas para os ensaios
gua doce
Oncorhynchus mykiss
Truta arco-ris (9) (16)
Danio rerio
Peixe-zebra (7) (17) (18)
Cyprinus caprio
Carpa (8) (19)
Oryzias latipes
Peixinho dos arrozais (20) (21)
Pimephales promelas
(8) (22)
Quadro 1B
Exemplos de outras espcies que tambm j foram utilizadas e sobre as quais existe
documentao
gua doce gua salgada
Carassius auratus
Pimpo (8)
Menidia peninsulae
(23) (24) (25)
Lepomis macrochirus
(8)
Clupea harengus
Arenque (24) (2 5)
Gadus morhua
Bacalhau (24) (25)
Cyprinodon variegatus
(23) (24) (25)
Apnsdice 1
ORIENTAO SOBRE A REALIZAO DE UM ENSAIO DE TOXICIDADE EM EMBRIES E RECM-
-NASCIDOS DE PEIXE-ZEBRA (BRACHYDANIO RERIO)
INTRODUO
O peixe-zebra originrio da costa Coromandel, na ndia, onde habita em riachos de correntes rpidas. um peixe vulgar de
aqurio da famlia das carpas, sendo possvel encontrar informao acerca dos procedimentos relativos ao seu tratamento e
cultura em livros de referncia sobre peixes tropicais. A sua biologia e utilizao na investigao pisccola foram revistas por
Laale (1).
O peixe raramente excede os 45 mm em comprimento. O corpo cilndrico com sete a nove riscas horizontais azul-escuro
prateadas. Estas riscas prolongam-se pelas barbatanas ventrais e caudais. A regio posterior verde azeitona. Os machos so
mais magros do que as fmeas. As fmeas so mais prateadas e o seu abdmen apresenta uma forma dilatada,
particularmente antes da desova.
Os peixes adultos toleram grandes variaes de temperatura, pH e dureza. No entanto, devem ser criadas condies ptimas
para obter peixes saudveis que produzam ovos de boa qualidade.
Durante a desova o macho persegue e atinge a fmea, sendo os ovos fertilizados medida que vo sendo expelidos. Os ovos,
que so transparentes e no aderentes, caem para o fundo onde podem ser comidos pelos progenitores. A desova
influenciada pela luz. Se a luz da manh for adequada, o peixe geralmente desova nas primeiras horas a seguir ao amanhecer.
Uma fmea pode produzir semanalmente lotes de vrias centenas de ovos.
CONDIES PARA OS PEIXES PROGENITORES, A REPRODUO E AS FASES INICIAIS DE VIDA
Seleccionar um nmero adequado de peixes saudveis e mant-los numa gua adequada (nas condies descritas no
apndice 4, por exemplo) durante, pelo menos, duas semanas antes da desova pretendida. Deve permitir-se que o grupo de
peixes se reproduza pelo menos uma vez antes de produzir o lote de ovos utilizados no ensaio. A densidade dos peixes
durante este perodo no deve exceder 1 grama por litro. A mudana regular da gua ou a utilizao de sistemas de
purificao permitiro que a densidade seja mais elevada. A temperatura nos tanques de conservao deve ser mantida a
25 2
o
C. Deve fornecer-se aos peixes uma dieta variada, que poder consistir, por exemplo, em alimentos comerciais secos
apropriados, larvas vivas recm-eclodidas, Artemia, chironomus, Daphnia, ou Enchytraeus.
So indicados em seguida dois procedimentos que, na prtica, permitiram obter um lote de ovos fertilizados saudveis
adequado realizao de um ensaio:
i) Colocam-se oito fmeas e 16 machos num tanque contendo 50 litros de gua de diluio, protegidos da luz directa e
mantidos, tanto quanto possvel, sem perturbaes durante pelo menos 48 horas. Na tarde do dia anterior ao incio do
ensaio, coloca-se um tabuleiro de desova no fundo do aqurio. O tabuleiro de desova consiste numa moldura de plexi-
-glass ou outro material adequado com 5 a 7 cm de altura, com uma rede grosseira de malha de 2 a 5 mm presa no
topo, e uma rede fina (malha de 10 a 30 m) no fundo. Prende-se rede grosseira da estrutura uma srie de rvores
de desova, que consistem em pedaos de corda de nylon desenrolada. Aps o peixe ter permanecido num ambiente
sem luz durante 12 horas, acende-se uma luz tnue que provocar o incio da desova. Duas a quatro horas aps a
desova, remove-se o tabuleiro e recolhem-se os ovos. O tabuleiro de desova evitar que o peixe coma os ovos e, ao
mesmo tempo, permitir a sua fcil recolha. O grupo de peixes dever ter desovado pelo menos uma vez antes da
desova que originar os ovos a utilizar no ensaio;
ii) Cinco a dez peixes machos e fmeas so mantidos individualmente pelo menos duas semanas antes da desova
pretendida. Aps cinco a dez dias, o abdmen das fmeas estar distendido e as suas papilas genitais visveis. Os
machos no tm papila. A desova realizada em tanques de desova equipados com um fundo falso em rede (como
descrito anteriormente). Enche-se o tanque com gua de diluio, de modo a que a altura da gua acima da rede seja de
5 a 10 cm. Colocam-se uma fmea e dois machos no tanque um dia antes da desova pretendida. Aumenta-se
gradualmente a temperatura da gua um grau acima da temperatura de aclimatizao. Apaga-se a luz e o tanque
mantido com a mnima perturbao possvel. De manh, acende-se uma luz tnue que ir provocar o incio da desova.
Aps duas a quatro horas, removem-se os peixes e recolhem-se os ovos. Se uma s fmea no produzir lotes com
nmero suficiente de ovos, podem preparar-se, em paralelo, tantos tanques de desova quantos os necessrios. Os
registos sobre o nvel de reproduo individual das fmeas antes do ensaio (tamanho do lote e qualidade) podero
servir para seleccionar as fmeas com maior sucesso reprodutivo.
Os ovos devem ser transferidos para os recipientes de ensaio utilizando tubos de vidro (com um dimetro interno no
inferior a 4 mm) adaptados a uma ampola de suco flexvel. A quantidade de gua que acompanha os ovos aquando da sua
transferncia dever ser reduzida ao mnimo possvel. Os ovos so mais pesados do que a gua e afundam-se caindo do
tubo. Deve ter-se cuidado para evitar que os ovos (e as larvas) entrem em contacto com o ar. O exame microscpico de
amostra(s) do(s) lote(s) deve ser realizado para assegurar que no h irregularidades nos primeiros estdios de
desenvolvimento. No permitida a desinfeco dos ovos.
A taxa de mortalidade dos ovos mais elevada durante as primeiras 24 horas aps a fertilizao, perodo durante o qual se
observa, geralmente, uma taxa de mortalidade de 5 a 40 %. por cento. Os ovos degeneram em consequncia do insucesso da
fertilizao ou de alterao no desenvolvimento. A qualidade do lote de ovos parece depender do peixe fmea, uma vez que
algumas fmeas produzem consistentemente ovos de boa qualidade, enquanto que outras nunca o fazem. As taxas de
desenvolvimento e de ecloso variam igualmente de lote para lote. Os ovos fertilizados com sucesso e as larvas com saco
vitelino sobrevivem bem, normalmente com taxas acima dos 90 %. A 25
o
C, os ovos eclodiro trs a cinco dias aps a
fertilizao e o saco vitelino ser absorvido cerca de 13 dias aps a fertilizao.
O desenvolvimento embrionrio foi descrito de forma muito completa por Hisaoka e Battle (2). Devido transparncia dos
ovos e das larvas ps-ecloso, o desenvolvimento dos peixes pode ser seguido e a presena de malformaes observada.
Aproximadamente quatro horas aps a desova, possvel distinguir os ovos fertilizados dos no fertilizados (3). Para
efectuar este exame, os ovos e as larvas so colocados em recipientes de ensaio de pequeno volume e estudados ao
microscpio.
As condies de ensaio aplicveis s fases iniciais de vida encontram-se descritas no apndice 2. Os valores ptimos para o
pH e a dureza da gua de diluio so, respectivamente, 7,8 e 250 mg CaCO
3
/l.
CLCULOS E ESTATSTICA
Prope-se uma abordagem em duas fases. Primeiro, so analisados estatisticamente os dados sobre a mortalidade, o
desenvolvimento anmalo e o tempo de ecloso. Depois, para as concentraes em que no se detectaram efeitos adversos
em quaisquer destes parmetros, avalia-se estatisticamente o comprimento do corpo. Aconselha-se esta abordagem, uma vez
que o produto txico pode matar selectivamente peixes menores, atrasar o tempo de ecloso e induzir malformaes graves,
conduzindo assim a desvios s medies de comprimento. Alm disso, existiro aproximadamente o mesmo nmero de
peixes a medir por tratamento, o que garante a validade da estatstica do ensaio.
DETERMINAO DA CL
50
E DA CE
50
A percentagem de ovos e de larvas sobreviventes calculada e corrigida para a mortalidade nos controlos, de acordo com a
frmula de Abbott (4):
P = 100
C P
C
100
_ _
em que
P = % sobrevivncia corrigida
P' = % sobrevivncia observada com a concentrao de ensaio
C = % sobrevivncia no controlo
Se possvel, a CL
50
deve ser determinada atravs de um mtodo adequado no fim do ensaio.
Se for desejvel incluir as anomalias morfolgicas na estatstica de CE
50
, o trabalho de Stephan (5) poder fornecer
orientaes teis.
ESTIMATIVAS DA LOEC E NOEC
Um dos objectivos do ensaio em ovos e peixes recm-nascidos comparar as concentraes diferentes de zero com o
controlo, isto , determinar a LOEC, pelo que devero ser utilizados os mtodos de comparao mltipla indicados nas
obras de referncia (6) (7) (8) (9) (10).
REFERNCIAS
(1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review.
J. Fish Biol. 10, p. 121-173.
(2) Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-
-Buchanan) J. Morph., 102, 311 p.
(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabrbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan).
Journal of Applied Ichthyology, 2, p. 173-181.
(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, p. 1-333.
(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment:
Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and
Materials, p. 69-81.
(6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer.
Statist. Assoc., 50, p. 1096-1121.
(7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, p. 482-491.
(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with
a Zero Dose Control. Biometrics, 27, p. 103-117.
(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. Biometrics 28, p. 519-531.
(10) Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W. H.
Freeman and Co., San Francisco.
Apndice 2
CONDIES DE ENSAIO, DURAO E CRITRIO DE SOBREVIVNCIA PARA AS ESPCIES RECOMENDADAS
Espcie
Temperatura
(
o
C)
Salinidade
(0/00)
Fotoperodo
(horas)
Durao dos estdios
(dias)
Durao tpica do ensaio
Taxa de sobrevivncia nos controlos
(mnima %)
Embries Recm-nascidos
Sucesso da eclo-
so
Ps-ecloso
GUA DOCE
Brachydanio rerio Pei
xe-zebra
25 1 12-16 3-5 8-10 To cedo quanto possvel aps a fertilizao
(estdio de gstrula inicial) at cinco dias aps a
ecloso (8-10 dias)
80 90
Oncorhynchus mykiss
Truta arco-ris
10 1 (
1
)
12 1 (
2
)
0 (
a
) 30-35 25-30 To cedo quanto possvel aps a fertilizao
(estdio de gstrula inicial) at 20 dias aps a
ecloso (50-55 dias)
66 70
Cyprinus carpio
Carpa
21-25 12-16 5 > 4 To cedo quanto possvel aps a fertilizao
(estdio de gstrula inicial) at quatro dias aps a
ecloso (8-9 dias)
80 75
Oryzias latipes
Peixinho dos arrozais
24 1 (
1
)
23 1 (
2
)
12-16 8-11 4-8 To cedo quanto possvel aps a fertilizao
ecloso (13-16 dias)
80 80
Pimephales promelas 25 + 2 16 4-5 5 To cedo quanto possvel aps a fertilizao
ecloso (8-9 dias)
60 70
(
1
) Para embries.
(
2
) Para larvas.
(
a
) Escurido para o embrio e as larvas at uma semana aps a ecloso, excepto quando estes esto a ser inspeccionados. A partir da, deve utilizar-se luz fraca ao longo do ensaio.
3
1
.
5
.
2
0
0
8
P
T
J
o
r
n
a
l
O
f
i
c
i
a
l
d
a
U
n
i
o
E
u
r
o
p
e
i
a
L
1
4
2
/
6
1
5
Apndice 3
Condies de ensaio, durao e critrios de sobrevivncia para outras espcies relativamente s quais existem trabalhos de referncia
Espcie
Temperatura
(DC)
Salinidade (0/
/00)
Fotoperodo
(horas)
Durao dos estdios (dias)
Durao tpica do ensaio de embries e recm-nascidos
Taxa de sobrevivncia nos controlos ( %
mnima)
Embries
Ensaio recm-
-nascidos
Sucesso da eclo-
so
Ps-ecloso
GUA DOCE
Carassius auratus
Pimpo
24 1 3-4 > 4 To cedo quanto possvel aps a fertilizao
ecloso (sete dias)
80
Leopomis macrochirus 21 1 16 3 > 4 To cedo quanto possvel aps a fertilizao
ecloso (sete dias)
75
GUA SALGADA
Menidia peninsulae 22-25 15-22 12 1,5 10 To cedo quanto possvel aps a fertilizao
ecloso (6-7 dias)
80 60
Clupea harengus
Arenque
10 1 8-15 12 20-25 3-5 To cedo quanto possvel aps a fertilizao
(estdio de gstrula inicial) at trs dias aps a
ecloso (23-27 dias)
60 80
Gadus morhua
Bacalhau
5 1 5-30 12 14-16 3-5 To cedo quanto possvel aps a fertilizao
(estdio de gstrula inicial) at trs dias aps a
ecloso (18 dias)
60 80
Cyprinodon variegatus 25 1 15-30 12 To cedo quanto possvel aps a fertilizao
(estdio de gstrula inicial) at 4-7 dias aps a
ecloso (28 dias)
> 75 80
L
1
4
2
/
6
1
6
P
T
J
o
r
n
a
l
O
f
i
c
i
a
l
d
a
U
n
i
o
E
u
r
o
p
e
i
a
3
1
.
5
.
2
0
0
8
Apndisce 4
Substncia Concentraes
Partculas < 20 mg/l
Amnia no ionizada < 1 g/l
Total de pesticidas organofosforados < 50 ng/l
Total de pesticidas organoclorados + bifenis policlorados < 50 ng/l
Cloro orgnico total < 25 ng/l
C.16. ABELHAS DOMSTICAS ENSAIO DE TOXICIDADE ORAL AGUDA
1. MTODO
O presente mtodo de ensaio de toxicidade aguda baseia-se na publicao OECD TG 213 (1998) (normas de
ensaio da OCDE).
1.1. INTRODUO
O presente ensaio de toxicidade constitui um mtodo laboratorial destinado a avaliar a toxicidade oral aguda de
produtos fitofarmacuticos e outras substncias qumicas para as abelhas domsticas obreiras adultas.
Os processos de avaliao e verificao das caractersticas txicas de substncias podem exigir a determinao
da toxicidade oral aguda para as abelhas domsticas. Esta situao verifica-se, por exemplo, quando h uma
probabilidade de exposio de abelhas a um produto qumico especfico. O ensaio de toxicidade oral aguda
permite determinar a toxicidade de pesticidas e outras substncias qumicas para as abelhas. Os seus resultados
condicionaro a necessidade de efectuar ulteriores avaliaes. O mtodo especialmente adequado para uso em
programas passo-a-passo, destinados a avaliar os efeitos perigosos de pesticidas para as abelhas. Estes
programas baseiam-se numa progresso sequencial de ensaios de toxicidade, que evolui de ensaios laboratoriais
para experincias parcial ou totalmente realizadas no campo (1). Os pesticidas podem ser submetidos a ensaio
sob a forma de substncias activas (s.a.) ou de produtos formulados.
A sensibilidade das abelhas e o rigor do procedimento experimental devem ser verificados pela incluso de um
padro txico nos ensaios.
1.2. DEFINIES
Toxicidade oral aguda: conjunto dos efeitos adversos que se manifestam num perodo mximo de 96 horas
aps a administrao oral de uma dose nica da substncia de ensaio.
Dose: quantidade consumida da substncia de ensaio. A dose expressa em massa (g) de substncia de ensaio
por animal (g/abelha). O facto de as abelhas serem alimentadas de forma colectiva no permite calcular a dose
efectiva por cada animal. No entanto, possvel determinar a dose mdia (massa total de substncia em ensaio
consumida/nmero de abelhas em ensaio em cada gaiola).
DL
50
(dose letal mdia) oral: dose nica, calculada estatisticamente, de uma substncia susceptvel de causar a
50
expresso em g de substncia
de ensaio por abelha. Em ensaios de pesticidas, a substncia de ensaio pode ser uma substncia activa (s.a.) ou
um produto formulado, que contm uma ou vrias substncias activas.
Mortalidade: um animal considerado morto quando permanece completamente imvel.
O mtodo baseia-se na exposio de abelhas domsticas (Apis mellifera) obreiras adultas a uma gama de doses
da substncia de ensaio dispersa numa soluo de sacarose. Aps a administrao das doses, as abelhas so
alimentadas com a mesma soluo, sem a substncia de ensaio. A mortalidade das abelhas registada
diariamente, num perodo nunca inferior a 48 horas, sendo depois comparada com valores de controlo. Caso a
taxa de mortalidade aumente entre 24 e 48 horas aps a administrao das doses, mantendo-se a mortalidade
dos controlos num nvel aceitvel (ou seja, 10 %), o ensaio dever ser prolongado at um mximo de 96
horas. Os resultados devero ser analisados de forma a calcular a DL
50
s 24 horas e s 48 horas e, em caso de
prolongamento do ensaio, s 72 horas e s 96 horas.
O ensaio ser considerado vlido, desde que se verifiquem as seguintes condies:
a mortalidade mdia na totalidade dos controlos no final do ensaio no dever ser superior a 10 %,
a DL
50
do padro txico dever enquadrar-se na gama de concentraes especificada.
1.5.1. Recolha de abelhas
O ensaio deve ser realizado com obreiras adultas jovens da mesma raa, isto , abelhas da mesma idade, em
idnticas condies de alimentao, etc. As abelhas devem provir de colnias governadas por rainhas, bem
alimentadas, saudveis, tanto quanto possvel isentas de doenas e com historial e estado fisiolgico
conhecidos. As abelhas podem ser recolhidas na manh do dia do ensaio ou na noite anterior, desde que
permaneam nas condies de ensaio at realizao deste. Consideram-se adequadas para o ensaio as abelhas
recolhidas de favos sem postura. Devido ao facto de as abelhas sofrerem alteraes fisiolgicas no incio da
Primavera e no final do Outono, devero evitar-se recolhas durante estes perodos. Caso seja necessrio realizar
ensaios nestas pocas do ano, podem usar-se abelhas eclodidas numa incubadora e alimentadas com plen
colhido da colmeia e soluo de sacarose durante uma semana. As abelhas tratadas com substncias qumicas
(tais como antibiticos, produtos varroacidas, etc.) no devem ser usadas em ensaios de toxicidade at quatro
semanas aps o final do ltimo tratamento.
Devem usar-se gaiolas bem ventiladas e fceis de limpar. As gaiolas podem ser construdas com quaisquer
materiais apropriados, tais como ao inoxidvel, tela de arame ou plstico. Podem ainda ser usadas gaiolas de
madeira descartveis. Por norma, cada gaiola dever conter, de preferncia, um grupo de dez abelhas. As gaiolas
usadas nos ensaios devem possuir dimenses adequadas ao nmero de abelhas a alojar, de modo a
proporcionarem espao suficiente.
As abelhas devem ser mantidas no escuro, numa sala de ensaios, temperatura de 25 2
o
C. A humidade
relativa, normalmente de cerca de 50-70 %, dever ser registada ao longo do ensaio. Os procedimentos de
manipulao, incluindo o tratamento e as observaes, podero ser efectuados com iluminao (natural). As
abelhas so alimentadas com uma soluo aquosa de sacarose a uma concentrao de 500 g/l (50 % p/v). Aps
a administrao das doses de ensaio, as abelhas devem dispor de alimento ad libitum. Deve usar-se um sistema
de alimentao que permita registar a quantidade de alimento consumido em cada gaiola (ver ponto 1.6.3.1).
Para tal, pode utilizar-se um tubo de vidro, com cerca de 50 mm de comprimento e 10 mm de largura e a
extremidade aberta estreitada para cerca de 2 mm de dimetro.
1.5.3. Preparao das abelhas
As abelhas recolhidas so distribudas aleatoriamente por gaiolas de ensaio, as quais, por sua vez, so dispostas
ao acaso na sala de ensaios.
Antes do ensaio, as abelhas podem ser privadas de alimento por um perodo no superior a duas horas. Este
tratamento recomendvel, uma vez que assegura que, no incio do ensaio, todas as abelhas se encontram em
idnticas condies no que respeita ao contedo intestinal. Antes de dar incio ao ensaio, as abelhas
moribundas devem ser retiradas e substitudas por abelhas saudveis.
Caso a substncia a testar seja miscvel com gua, poder ser directamente dispersa numa soluo de sacarose a
50 %. No caso de produtos industriais e substncias de baixa solubilidade em gua, podem usar-se outros
veculos, tais como solventes orgnicos, emulsionantes ou dispersantes de baixa toxicidade para as abelhas (por
exemplo, acetona, dimetilformamida, dimetilsulfxido), A concentrao do veculo depende da solubilidade da
substncia de ensaio, devendo ser idntica para todas as concentraes testadas. Na generalidade dos casos,
adequado utilizar (e no ultrapassar) uma concentrao de 1 %.
Devem preparar-se as solues de controlo apropriadas, ou seja, utilizando um solvente ou dispersante para
tornar a substncia de ensaio solvel. Assim, devero ser administradas, a dois grupos de controlo distintos,
duas solues: uma em gua e outra em gua com sacarose, ambas contendo o solvente/veculo na mesma
concentrao que as solues de dosagem.
1.6. PROCEDIMENTO
O nmero de doses e de repeties usado no ensaio dever satisfazer os requisitos estatsticos para a
determinao das DL
50
, com limites de confiana de 95 %. De uma forma geral, necessrio usar cinco doses
em srie geomtrica, com um factor no superior a 2,2 e cobrindo uma gama de concentraes que abranja a
DL
50
. No entanto, o factor de diluio e o nmero de concentraes por dosagem devero ser determinados em
funo do declive da curva de toxicidade (dose versus mortalidade) e tomando em considerao o mtodo
estatstico adoptado para a anlise dos resultados. Um ensaio de determinao de gama de concentraes
permitir escolher as concentraes apropriadas para a dosagem.
Cada concentrao a testar deve ser aplicada em, pelo menos, trs grupos idnticos, cada um constitudo por
10 abelhas. Alm da srie em ensaio, devem ser testados pelo menos trs grupos de controlo, formados por 10
abelhas cada um. Devem ainda ser includos os grupos de controlo apropriados para os solventes/veculos
usados (ver ponto 1.5.4).
1.6.2. Padro txico
A srie em ensaio deve incluir um padro txico. Devem seleccionar-se pelo menos trs doses deste padro, de
modo a abranger o valor previsto para a DL
50
. Para cada dose de ensaio, devem usar-se, pelo menos, trs gaiolas
idnticas, cada uma contendo dez abelhas. O padro txico mais vulgarmente utilizado o dimetoato. A DL
50
oral s 24 horas descrita para este composto situa-se na gama de 0,10 a 0,35 g s.a./abelha (2). No entanto,
podem ser usados outros padres txicos, desde que existam dados suficientes para verificar a resposta prevista
dose administrada (por exemplo, paratio).
1.6.3. Exposio
1.6.3.1. Administrao de doses
A cada grupo de abelhas em ensaio, devem ser administrados 100-200 l de soluo aquosa de sacarose a
50 %, contendo a substncia de ensaio na concentrao apropriada. No ensaio de produtos de baixa
solubilidade, toxicidade ou concentrao no preparado, ser necessrio aumentar a proporo dos mesmos na
soluo de sacarose e utilizar volumes superiores. Dever controlar-se a quantidade de soluo tratada,
consumida por cada grupo. Uma vez consumido o alimento tratado (normalmente num perodo de trs a
quatro horas), o sistema de alimentao deve ser retirado da gaiola e substitudo por outro contendo apenas
soluo de sacarose, a qual dever ser fornecida ento ad lbitum. Em alguns casos, poder ocorrer a rejeio das
doses correspondentes s concentraes mais elevadas da de ensaio, o que ter como resultado um consumo de
alimento reduzido ou nulo. Aps um lapso mximo de seis horas, a soluo tratada que no tenha sido
consumida dever ser substituda pela soluo de sacarose sem aditivos. Deve avaliar-se a quantidade da soluo
tratada consumida, medindo, por exemplo, o volume ou o peso da soluo no consumida.
1.6.3.2. Durao
O ensaio dever prolongar-se, de preferncia, at 48 horas aps a substituio da soluo em ensaio pela
soluo de sacarose sem aditivos. Se, aps as primeiras 24 horas, a mortalidade continuar a aumentar em mais
de 10 %, o ensaio dever ser prolongado at um mximo de 96 horas, desde que a mortalidade nos controlos
no exceda 10 %.
1.6.4. Observaes
Devem efectuar-se registos de mortalidade decorridas quatro horas, 24 horas e 48 horas aps o incio do ensaio
(ou seja, aps a administrao da dose). Em caso de prolongamento do perodo de observao, devero realizar-
-se avaliaes suplementares a intervalos de 24 horas, at um mximo de 96 horas, desde que a mortalidade dos
grupos de controlo no exceda 10 %.
Dever ser determinada a quantidade de soluo consumida por cada grupo. A comparao entre as taxas de
consumo de soluo tratada e no tratada durante o perodo de seis horas em que esta fornecida aos animais
poder dar informaes sobre a palatabilidade do alimento tratado.
Devero ser objecto de registo todas as eventuais anomalias de comportamento verificadas durante o perodo
do ensaio.
1.6.5. Teste-limite
Em determinadas circunstncias (por exemplo, quando se prev que a substncia de ensaio apresente um baixo
nvel de toxicidade), pode efectuar-se um teste-limite, usando 100 g s.a./abelha, de forma a certificar-se de que
a DL
50
superior a este valor. Deve seguir-se um procedimento idntico ao descrito acima, incluindo o uso de
trs grupos duplicados para a dose de ensaio, a realizao dos controlos relevantes e a avaliao da quantidade
de alimento tratado consumida, assim como o uso de um padro txico. Se ocorrer mortalidade, dever
realizar-se um estudo completo. Todos os efeitos subletais, caso existam, devero ser registados (ver
ponto 1.6.4).
2. DADOS E RELATRIO
2.1. DADOS
Os dados devem ser resumidos num quadro, indicando, para cada grupo em tratamento (e para os grupos de
controlo e os associados ao padro txico), o nmero de abelhas usado e a mortalidade em cada momento de
observao, bem como o nmero de abelhas que apresentam um comportamento anmalo. Os dados relativos
mortalidade devem ser analisados mediante mtodos estatsticos adequados (por exemplo, anlise probit,
mdia mvel, teoria do binmio relativamente probabilidade) (3) (4). Devem ser traadas curvas dose-
-resposta para cada tempo de observao recomendado, procedendo-se depois ao clculo dos respectivos
declives e determinao das doses letais mdias (DL
50
) com limites de confiana de 95 %. Podem efectuar-se
correces na mortalidade dos grupos de controlo, usando os valores de correco de Abbott (4) (5). Nos casos
em que o alimento tratado no tenha sido totalmente consumido, dever determinar-se a dose de substncia de
ensaio consumida por cada grupo. A DL
50
dever ser expressa em g de substncia de ensaio por abelha.
natureza fsica e propriedades fsico-qumicas relevantes (por exemplo, estabilidade na gua, presso de
vapor),
dados de identificao qumica, incluindo a frmula estrutural, o grau de pureza [ou seja, no caso de
pesticidas, a identidade e a concentrao da(s) substncia(s) activa(s)].
2.2.2. Espcies submetidas a ensaio:
nome cientfico, estirpe, idade aproximada (em semanas), mtodo de recolha, data da recolha,
dados informativos sobre as colnias usadas para recolha das abelhas submetidas a ensaio, incluindo o
estado de sade, a ocorrncia de doenas de adultos, eventuais tratamentos previamente aplicados, etc.
temperatura e humidade relativa da sala de ensaios,
condies de alojamento, incluindo o tipo, as dimenses e o material de construo das gaiolas,
mtodos de preparao das solues-me e solues de ensaio (em caso de utilizao de um solvente no
aquoso, deve indicar-se a sua natureza e a respectiva concentrao),
planeamento do ensaio, ou seja, o nmero de concentraes de ensaio e os respectivos valores, bem
como o nmero de controlos; para cada concentrao de ensaio e para cada controlo, dever indicar-se o
nmero de gaiolas em duplicado e o nmero de abelhas em cada uma delas,
data do ensaio.
2.2.4. Resultados:
em caso de realizao de um estudo preliminar para determinao da gama de concentraes de ensaio,
os respectivos resultados,
dados no processados: mortalidade correspondente a cada dose de ensaio em cada momento de
observao,
representao grfica das curvas dose-resposta no final do ensaio,
valores DL
50
. com limites de confiana de 95 %, para cada perodo de observao recomendado, tanto
para a substncia de ensaio, como para o padro txico,
tratamentos estatsticos usados para a determinao da DL
50
,
outros efeitos biolgicos observados ou medidos, como, por exemplo, anomalias no comportamento das
abelhas (incluindo rejeio da dose de ensaio), taxa de consumo de alimento em grupos tratados e em
grupos no tratados,
qualquer desvio em relao aos procedimentos aqui descritos, assim como quaisquer outras informaes
relevantes.
3. REFERNCIAS
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmenta! Risk Assessment of
Plant Protection Products Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1, p. 151-165. March 1993.
(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in
laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981-1992. Journal of Apicultural
Research, 22, p. 119-125.
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour.
Pharmacol. and Exper. Ther., 96, p. 99-113.
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol.,
18, p. 265-267.
C.17. ABELHAS DOMSTICAS ENSAIO DE TOXICIDADE AGUDA POR CONTACTO
1. MTODO
O presente mtodo de ensaio de toxicidade aguda baseia-se na publicao OECD TG 214 (1998) (normas de
ensaio da OCDE).
1.1. INTRODUO
O presente ensaio de toxicidade constitui um mtodo laboratorial, destinado a avaliar a toxicidade aguda por
contacto de produtos fitofarmacuticos e outras substncias qumicas para as abelhas domsticas obreiras
adultas.
Os processos de avaliao e verificao das caractersticas txicas de substncias podem exigir a determinao
da toxicidade aguda por contacto para as abelhas domsticas. Esta situao verifica-se, por exemplo, quando h
a probabilidade de exposio de abelhas a um produto qumico especfico. O ensaio de toxicidade aguda por
contacto permite determinar a toxicidade de pesticidas e outras substncias qumicas para as abelhas. Os seus
resultados condicionaro a necessidade de efectuar ulteriores avaliaes. O mtodo especialmente adequado
para uso em programas passo-a-passo, destinados a avaliar os efeitos perigosos de pesticidas para as abelhas.
Estes programas baseiam-se numa progresso sequencial de ensaios de toxicidade, que evolui de ensaios
laboratoriais para experincias parcial ou totalmente realizadas no campo (1). Os pesticidas podem ser
submetidos a ensaio sob a forma de substncias activas (s.a.) ou de produtos formulados.
A sensibilidade das abelhas e o rigor do procedimento experimental devem ser verificados pela incluso de um
padro txico nos ensaios.
1.2. DEFINIES
Toxicidade aguda por contacto: conjunto dos efeitos adversos que se manifestam num perodo mximo de
96 horas aps a aplicao tpica de uma dose nica de uma substncia.
Dose: quantidade aplicada da substncia de ensaio. O valor da dose expresso em massa (g) de substncia de
ensaio por animal (g/abelha).
DL
50
(dose letal mdia) por contacto: dose nica, calculada estatisticamente, de uma substncia susceptvel
de causar a morte de 50 % dos animais quando administrada por contacto. O valor da DL
50
expresso em g
de substncia de ensaio por abelha. Em ensaios de pesticidas, a substncia de ensaio pode ser uma substncia
activa (s.a) ou um produto formulado, contendo uma ou vrias substncias activas.
Mortalidade: um animal considerado morto quando permanece completamente imvel.
O mtodo baseia-se na exposio de abelhas domsticas (Apis mellifera) obreiras adultas a uma gama de doses
da substncia de ensaio dissolvida num veculo adequado e aplicada directamente no trax (em gotculas). O
ensaio tem a durao de 48 horas. Caso a taxa de mortalidade aumente entre 24 e 48 horas aps a aplicao
das doses, mantendo-se a mortalidade dos controlos num nvel aceitvel (ou seja, < 10 %), o ensaio dever ser
prolongado at um mximo de 96 horas. A mortalidade das abelhas registada diariamente e comparada com
valores de controlo. Os resultados devero ser analisados de forma a calcular a DL
50
s 24 horas e s 48 horas
e, em caso de prolongamento do ensaio, s 72 horas e s 96 horas.
O ensaio ser considerado vlido, desde que se verifiquem as seguintes condies:
a mortalidade mdia na totalidade dos controlos no final do ensaio no dever ser superior a 10 %,
a DL
50
do padro txico dever enquadrar-se na gama de concentraes especificada.
1.5.1. Recolha de abelhas
O ensaio deve ser realizado com obreiras adultas jovens, ou seja, abelhas da mesma idade, em idnticas
condies de alimentao, raa idntica, etc. As abelhas devem provir de colnias governadas por rainhas, bem
alimentadas, saudveis, tanto quanto possvel isentas de doenas e com historial e estado fisiolgico
conhecidos. As abelhas podem ser recolhidas na manh do dia do ensaio ou na noite anterior, desde que se
mantenham nas condies de ensaio at sua realizao. Consideram-se adequadas para o ensaio as abelhas
recolhidas de favos sem postura. Devido ao facto de as abelhas sofrerem alteraes fisiolgicas no incio da
Primavera e no final do Outono, devero evitar-se recolhas durante estes perodos. Caso seja necessrio realizar
ensaios nestas pocas do ano, podem usar-se abelhas eclodidas numa incubadora e alimentadas durante uma
semana com plen colhido da colmeia e soluo de sacarose. As abelhas tratadas com substncias qumicas
(tais como antibiticos, produtos varroacidas, etc.) no devem ser usadas para ensaios de toxicidade at quatro
semanas aps o final do ltimo tratamento.
Devem usar-se gaiolas bem ventiladas e fceis de limpar. As gaiolas podem ser construdas com quaisquer
materiais apropriados, tais como ao inoxidvel, tela de arame ou plstico. Podem ainda ser usadas gaiolas de
madeira descartveis. As gaiolas usadas nos ensaios devem possuir dimenses adequadas ao nmero de abelhas
a alojar, de modo a proporcionarem espao suficiente. Por norma, cada gaiola dever conter um grupo de dez
abelhas.
As abelhas devem ser mantidas no escuro, numa sala de ensaios, temperatura de 25 2
o
C. A humidade
relativa, normalmente de cerca de 50-70 %, dever ser registada ao longo do ensaio. Os procedimentos de
manipulao, incluindo o tratamento e as observaes, podero ser efectuados com iluminao (natural). As
abelhas so alimentadas com uma soluo aquosa de sacarose a uma concentrao de 500 g/l (50 % p/v), que
deve ser fornecida ad libitum durante todo o ensaio por meio de um sistema de alimentao de abelhas. Para tal,
pode utilizar-se um tubo de vidro com cerca de 50 mm de comprimento e 10 mm de largura e a extremidade
aberta estreitada para cerca de 2 mm de dimetro.
1.5.3. Preparao das abelhas
Para a aplicao da substncia de ensaio, as abelhas recolhidas so anestesiadas, podendo usar-se dixido de
carbono ou azoto para o efeito. Dever minimizar-se a quantidade usada e o tempo de exposio ao anestsico.
Antes de dar incio ao ensaio, as abelhas moribundas devem ser retiradas e substitudas por abelhas saudveis.
A substncia de ensaio dever ser aplicada na forma de soluo num veculo, ou seja, num solvente orgnico ou
numa soluo aquosa contendo um agente molhante. O solvente orgnico mais vulgarmente utilizado a
acetona. No entanto, podem utilizar-se outros compostos de baixa toxicidade para as abelhas, como, por
exemplo, dimetilformamida ou dimetilsulfxido. A aplicao de produtos formulados dispersos em gua ou de
substncias orgnicas de elevada polaridade insolveis em solventes orgnicos pode tornar-se mais fcil se as
respectivas solues forem preparadas numa soluo diluda de um agente molhante comercial (por exemplo,
Agrai, Cittowett, Lubrol, Triton ou Tween).
As solues de controlo devem ser preparadas de forma adequada, isto , utilizando um solvente ou dispersante
para tornar a substncia de ensaio solvel. Devero ser utilizados dois grupos de controlo distintos, um tratado
com gua e o outro com o solvente ou dispersante.
1.6. PROCEDIMENTO
O nmero de doses e repeties usados no ensaio dever satisfazer os requisitos estatsticos para a
determinao da DL
50
, com limites de confiana de 95 %. De uma forma geral, necessrio usar cinco doses
em srie geomtrica, com um factor no superior a 2,2 e cobrindo uma gama de concentraes que abranja a
DL
50
. No entanto, o nmero de doses dever ser determinado em funo do declive da curva de toxicidade
(dose versus mortalidade) e tendo em considerao o mtodo estatstico adoptado para a anlise dos resultados.
Um ensaio de determinao de gama de concentraes permitir escolher as doses apropriadas.
Cada concentrao de ensaio deve ser aplicada em, pelo menos, trs grupos idnticos, cada um constitudo por
dez abelhas.
Alm da srie em ensaio, devem ser testados pelo menos trs grupos de controlo, cada um formado por dez
abelhas. Sempre que se utilize um solvente orgnico ou um agente molhante, devero ser includos trs grupos
de controlo adicionais para estas substncias, constitudos por dez abelhas cada.
1.6.2. Padro txico
A srie em ensaio deve incluir um padro txico. Devem seleccionar-se pelo menos trs doses deste padro, de
modo a abranger o valor previsto para a DL
50
. Para cada dose de ensaio, devem usar-se pelo menos trs gaiolas,
cada uma contendo dez abelhas. O padro txico mais vulgarmente utilizado o dimetoato. A DL
50
por
contacto s 24 horas descrita para este composto situa-se na gama de 0,10 a 0,30 g s.a./abelha (2). No
entanto, podem ser usados outros padres txicos, desde que existam dados suficientes para verificar a resposta
prevista dose aplicada (por exemplo, paratio).
1.6.3. Exposio
1.6.3.1. Administrao de doses
As abelhas anestesiadas so tratadas individualmente por aplicao tpica. As diferentes doses de ensaio e os
controlos so distribudos de forma aleatria pelas abelhas. As doses so aplicadas com o auxlio de um
microaplicador no lado dorsal do trax de cada abelha, em alquotas de 1 l de uma soluo contendo a
substncia de ensaio na concentrao apropriada. Caso se justifique, podero ser usados outros volumes. Aps
a aplicao, as abelhas so colocadas em gaiolas de ensaio e alimentadas com solues de sacarose.
1.6.3.2. Durao
O ensaio dever durar, de preferncia, 48 horas. Caso a mortalidade aumente em mais de 10 % entre 24 e 48
horas aps a aplicao, o ensaio dever ser prolongado at um mximo de 96 horas, desde que a mortalidade
nos controlos no exceda 10 %.
1.6.4. Observaes
Devem efectuar-se registos de mortalidade decorridas quatro, 24 e 48 horas aps o incio do ensaio. Em caso
de prolongamento do perodo de observao, devero realizar-se avaliaes suplementares com intervalos de
24 horas, at um mximo de 96 horas, desde que a mortalidade dos grupos de controlo no exceda 10 %.
Devero ser objecto de registo todas as eventuais anomalias de comportamento verificadas durante o perodo
do ensaio.
1.6.5. Teste-limite
Em determinadas circunstncias (por exemplo, quando se prev que a substncia de ensaio apresente um baixo
nvel de toxicidade), pode efectuar-se um teste-limite, usando 100 g s.a./abelha, de forma a certificar-se de que
a DL
50
superior a este valor. Deve seguir-se um procedimento semelhante ao descrito acima, incluindo o uso
de trs grupos duplicados para a dose de ensaio e a realizao dos controlos relevantes, assim como o uso de
um padro txico. Se ocorrer mortalidade, dever realizar-se um estudo completo. Todos os efeitos subletais,
caso existam, devero ser registados (ver ponto 1.6.4).
2. DADOS E RELATRIO
2.1. DADOS
Os dados devem ser resumidos num quadro, indicando, para cada grupo de tratamento (e para os grupos de
controlo e os associados ao padro txico), o nmero de abelhas usadas e a mortalidade em cada momento de
observao, bem corno o nmero de abelhas que apresentam um comportamento anmalo. Os dados de
mortalidade devem ser analisados mediante mtodos estatsticos adequados (por exemplo, anlise probit, mdia
mvel, teoria do binmio relativa probabilidade) (3) (4). Devem ser traadas curvas dose-resposta para cada
tempo de observao recomendado (ou seja, 24 horas, 48 horas e, se for relevante, 72 horas e 96 horas),
procedendo-se depois ao clculo dos respectivos declives e determinao das doses letais mdias (DL
50
) com
limites de confiana de 95 %. Podem efectuar-se correces na mortalidade dos controlos, usando os valores de
correco de Abbott (4) (5). A DL
50
dever ser expressa em g de substncia de ensaio por abelha.
natureza fsica e propriedades fsico-qumicas (por exemplo, estabilidade na gua, presso de vapor),
dados de identificao qumica, incluindo a frmula estrutural, o grau de pureza [ou seja, no caso de
pesticidas, a identidade e a concentrao da(s) substncia(s) activa(s)].
2.2.2. Espcies submetidas a ensaio:
nome cientfico, raa, idade aproximada (em semanas), mtodo de recolha, data da recolha,
dados informativos sobre as colnias usadas para recolha das abelhas submetidas a ensaio, incluindo o
estado de sade, a ocorrncia de doenas de adultos, eventuais tratamentos previamente aplicados, etc.
temperatura e humidade relativa da sala de ensaios,
condies de alojamento, incluindo o tipo, as dimenses e o material de construo das gaiolas,
mtodos de administrao da substncia de ensaio (indicando, por exemplo, o solvente usado como
veculo, o volume aplicado da soluo de ensaio e os anestsicos usados),
planeamento do ensaio, ou seja, o nmero de doses de ensaio e as respectivas concentraes, bem como
o nmero de controlos; para cada dose de ensaio e para cada controlo, dever indicar-se o nmero de
gaiolas em duplicado e o nmero de abelhas em cada uma delas,
data do ensaio.
2.2.4. Resultados:
em caso de realizao de um estudo preliminar para determinao da gama de concentraes de ensaio,
os respectivos resultados,
dados no processados: mortalidade correspondente a cada concentrao de ensaio em cada momento de
observao,
representao grfica das curvas dose-resposta no final do ensaio,
valores de DL
50
, com limites de confiana de 95 %, para cada perodo de observao recomendado, tanto
para a substncia de ensaio, como para o padro txico,
tratamentos estatsticos usados para a determinao da DL
50
,
outros efeitos biolgicos observados ou medidos e qualquer reaco anormal das abelhas,
qualquer desvio em relao aos procedimentos aqui descritos, assim como quaisquer outras informaes
relevantes.
3. REFERNCIAS
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of
Plant Protection Products Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, p. 1 51-165. March 1993.
(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C, Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in
laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981-1992. Journal of Apicultural
Research 22, p. 119-125.
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour.
Pharmacol. and Exper. Ther., 96, p. 99-11 3.
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol.
18, p. 265-267.
C.18. ADSORO/DESSORO POR RECURSOAUM MTODO DE EQUILBRIO POR LOTES DE SOLOS
1. MTODO
O presente mtodo uma reproduo do mtodo OCDE TG 106, para a determinao da adsoro/dessoro
em solos por recurso a um mtodo de equilbrio por lotes (2000).
1.1. INTRODUO
O presente mtodo baseia-se em ensaios especficos, bem como nos resultados de um seminrio (workshop)
para a seleco de solos, com vista ao desenvolvimento de um ensaio de adsoro (1) (2) (3) (4). O mtodo tem
tambm em conta as directrizes em vigor a nvel nacional (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11).
Os estudos de adsoro/dessoro permitem obter informaes essenciais sobre a mobilidade dos produtos
qumicos e sua distribuio nos diversos componentes da biosfera (edfico, aqutico e atmosfrico) (12) (13)
(14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). As informaes recolhidas podem ser utilizadas na previso ou
estimativa, nomeadamente, da disponibilidade de uma substncia qumica para degradao (22) (23),
transformao e absoro pelos organismos vivos (24), do perfil de lixiviao pelos solos (16) (18) (19) (21)
(25) (26) (27) (28), da volatilidade nos solos (21) (29) (30) e da transferncia da superfcie de solos para guas
naturais (18) (31) (32). Os dados de adsoro podem ser utilizados para fins comparativos, bem como de
modelizao (19) (33) (34) (35).
A distribuio de uma substncia qumica entre o solo e uma fase aquosa constitui um processo complexo que
depende de diversos factores, designadamente a natureza qumica da substncia (12) (36) (37) (38) (39) (40), as
caractersticas do solo (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) e factores climticos tais
como a pluviosidade, a temperatura, a exposio ao sol e os ventos. Deste modo, os numerosos fenmenos e
mecanismos envolvidos no processo de adsoro de uma substncia pelo solo no podem ser totalmente
definidos por um modelo laboratorial simplificado do tipo descrito no presente mtodo. Todavia, embora a
presente contribuio no abranja todos os casos possveis no domnio ambiental, fornece informaes
valiosas sobre o impacto ambiental da adsoro de uma substncia.
Ver tambm a introduo geral.
1.2. MBITO
O presente mtodo visa determinar o comportamento de uma substncia no solo em termos de adsoro/
/dessoro. O objectivo consiste em obter um parmetro que possa ser utilizado para prever a partio em
diversas condies ambientais; para tal, determinam-se os coeficientes de adsoro em equilbrio de um
produto qumico em vrios solos, em funo das caractersticas destes ltimos (por exemplo, teor de carbono
orgnico, teor de argila, textura e pH). Devem utilizar-se diferentes tipos de solos, de modo a abranger tanto
quanto possvel as interaces de uma determinada substncia com solos de ocorrncia natural.
No presente mtodo, a adsoro entendida como o processo de ligao de uma substncia superfcie dos
solos, no se efectuando qualquer distino entre os diversos processos de adsoro (adsoro fsica e qumica),
bem como entre os processos de degradao superficial catalisada, adsoro na massa e reaco qumica. No
tida em conta a adsoro em partculas coloidais (dimetro < 0,2 m) produzidas nos solos.
Os parmetros referentes ao solo considerados mais importantes no contexto da adsoro so os seguintes: teor
de carbono orgnico (3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) (44) (45) (46) (47) (48), teor de argila e textura dos solos (3)
(4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) e pH, no caso de compostos ionizveis (3) (4) (42). Outros parmetros
que podem apresentar um impacto na adsoro-dessoro do solo so a capacidade de permuta catinica
efectiva (ECHC), o teor de ferro amorfo e de xidos de alumnio, em especial em solos vulcnicos e tropicais (4),
bem como a superfcie especfica (49).
O ensaio foi concebido para avaliar a adsoro de uma substncia em vrios tipos de solos, com diversos teores
de carbono orgnico, argila, textura e pH, sendo constitudo por trs fases:
Fase 1: Estudo preliminar para a determinao:
da razo solo/soluo,
do tempo necessrio para atingir o equilbrio de adsoro, bem como da quantidade de
substncia teste adsorvida no estado de equilbrio,
da adsoro da substncia em estudo na superfcie dos recipientes de ensaio, bem como da
estabilidade da substncia durante o perodo de ensaio.
Fase 2: Ensaio de seleco: estuda-se a cintica de adsoro a concentrao constante em cinco tipos diferentes
de solos, determinando-se os coeficientes de distribuio K
d
e K
oc
.
Fase 3: Determinao das isotrmicas de adsoro de Freundlich, de modo a avaliar a influncia da
concentrao na extenso da adsoro nos solos.
Estudo da dessoro atravs da respectiva cintica, bem como das isotrmicas de dessoro de
Freundlich (apndice 1).
Smbolo Definio Unidades
A
ti
percentagem de adsoro no instante t
i
%
A
eq
percentagem de adsoro no estado de equilbrio de adsoro %
m
ads
s
t
i

massa de substncia em estudo adsorvida no solo no instante t
i
g
m
ads
s
t
i

massa de substncia em estudo adsorvida no solo no intervalo de
tempo At
i
g
m
ads
s
eq
massa de substncia em estudo adsorvida no solo no estado de
equilbrio de adsoro
g
m
0
massa de substncia em estudo no recipiente de ensaio, no incio
do mesmo
g
m
ads
m
t
i
massa de substncia em estudo determinada numa alquota (v
A
a
)
no instante t
j
g
m
ads
aq
eq
massa de substncia em estudo na soluo, no estado de
equilbrio de adsoro
g
m
solo
quantidade de fase edfica, expressa em massa seca g
C
st
concentrao mssica da soluo-me da substncia g cm
-3
C
0
concentrao mssica inicial da soluo de ensaio em contacto
com o solo
g cm
-3
C
ads
aq
t
i

concentrao mssica da substncia na fase aquosa no instante t
i
em que a anlise efectuada
g cm
-3
C
ads
s
eq
teor de substncia adsorvida no solo no estado de equilbrio de
adsoro
g g
-1
C
ads
aq
eq
concentrao mssica da substncia na fase aquosa no estado de
equilbrio de adsoro
g cm
-3
V
0
volume inicial da fase aquosa em contacto com o solo durante o
ensaio de adsoro
cm
3
v
A
a
volume da alquota em que se determina a substncia de ensaio cm
3
coeficiente de distribuio da adsoro cm
3
g
-1
coeficiente de adsoro normalizado relativo ao carbono
orgnico
cm
3
g
-1
coeficiente de adsoro normalizado da matria orgnica cm
3
g
-1
K
ads
F
coeficiente de adsoro de Freundlich g
-1
l/n expoente de Freundlich
D
ti
percentagem de dessoro no instante t
i
%
D
ti
percentagem de dessoro no intervalo t
i
%
K
des
coeficiente de dessoro aparente cm
3
g
-1
K
des
F
coeficiente de dessoro de Freundlich g
1-1/n
(cm
3
)
1/n
g
-1
m
des
aq
t
i

massa de substncia de ensaio dessorvida do solo no instante t
i
g
m
des
m
t
i

massa de substncia de ensaio dessorvida do solo no intervalo t
j
g
m
des
m
eq
massa de substncia determinada analiticamente na fase aquosa
no estado de equilbrio de dessoro
g
m
des
aq
eq
massa total de substncia em estudo no estado de equilbrio de
dessoro
g
Smbolo Definio Unidades
m
des
s
t
i

massa de substncia que permanece adsorvida no solo aps o
intervalo At
i
g
m
A
aq
massa de substncia remanescente do equilbrio de adsoro
devido a uma substituio incompleta de volumes
g
C
des
s
eq
teor de substncia em estudo que permanece adsorvida no solo
no estado de equilbrio de dessoro
g g
-1
concentrao mssica de substncia de ensaio na fase aquosa no
estado de equilbrio de dessoro
g cm
3
V
T
volume total da fase aquosa em contacto com o solo durante o
ensaio de cintica de dessoro efectuado pelo mtodo sequencial
cm
3
volume de sobrenadante removido do tubo aps atingir o estado
de equilbrio de adsoro e substitudo por igual volume de
soluo de CaCl
2
0,01 M
cm
3
v
D
a
volume da alquota recolhida para fins analticos a partir do
instante (i), durante o ensaio de cintica de dessoro efectuado
pelo mtodo sequencial
cm
3
V
r
r
volume de soluo recolhida do tubo (i) para a determinao da
substncia em estudo, no ensaio de cintica de dessoro (mtodo
paralelo)
cm
3
V
F
r
volume de soluo recolhida do tubo para a determinao da
substncia em estudo, no estado de equilbrio de dessoro
cm
3
MB balano de massas %
m
E
massa total de substncia em estudo extrada do solo e das
paredes do recipiente de ensaio em duas etapas
g
V
rec
volume de sobrenadante recolhido aps atingir o estado de
equilbrio de adsoro
cm
3
P
ow
coeficiente de partio octanol/gua
pKa constante de dissociao
S
w
solubilidade em gua g l
-1
Adicionam-se a amostras de solos de massa seca conhecida, previamente equilibradas com CaCl
2
, 0,01 M,
volumes conhecidos de solues da substncia em estudo em CaCl
2
, 0,01 M, de concentrao conhecida,
marcadas ou no com radioistopos. A mistura agitada durante um perodo adequado. As suspenses de solo
so separadas por centrifugao e eventualmente filtradas, procedendo-se anlise da fase aquosa. A
quantidade de substncia em estudo adsorvida pela amostra de solo calculada na forma de diferena entre a
quantidade de substncia inicialmente presente na soluo e a quantidade remanescente no final do ensaio
(mtodo indirecto).
Como alternativa, pode determinar-se directamente a quantidade de substncia em estudo adsorvida, mediante
a anlise do solo (mtodo directo). Este processo, que implica a extraco do solo, por etapas, com solventes
adequados, recomendado nos casos em que no possa determinar-se com rigor a diferena das concentraes
da substncia na soluo. A adsoro da substncia na superfcie dos recipientes de ensaio, a instabilidade da
substncia no perodo de ensaio, bem como uma adsoro fraca que determine apenas alteraes ligeiras da
concentrao da soluo ou uma forte adsoro que origine concentraes demasiado reduzidas para serem
determinadas com rigor, constituem exemplos de tais casos. Se se utilizarem substncias marcadas com
radioistopos, pode evitar-se a extraco do solo mediante a anlise da fase edfica por combusto seguida de
contagem com um contador de cintilao lquida. Trata-se, todavia, de uma tcnica no especfica, que no
permite distinguir as substncias iniciais dos produtos de transformao, pelo que deve ser utilizada apenas se a
substncia em estudo for estvel no perodo de durao do ensaio.
1.5. INFORMAES RELATIVAS SUBSTNCIA EM ESTUDO
Os reagentes devem ser de qualidade analtica. No caso de substncias em estudo de composio conhecida no
marcadas, recomenda-se um grau de pureza mnimo de 95 %; no caso de substncias marcadas com
radioistopos, a pureza deve ser de grau radioqumico. Se os istopos radioactivos possurem uma meia vida
reduzida, devem utilizar-se parmetros de correco.
Antes de efectuar um ensaio de adsoro-dessoro, devem conhecer-se as seguintes informaes relativas
substncia em estudo:
a) Solubilidade em gua (A.6);
b) Presso de vapor (A.4) e/ou constante da lei de Henry;
c) Degradao abitica: hidrlise em funo do pH (C.7);
d) Coeficiente de partio (A.8);
e) Biodegradabilidade fcil (C.4) ou transformao aerbia/anaerbia no solo;
f) pKa das substncias ionizveis presentes;
g) Fotlise directa em gua (por exemplo, espectro de absoro UV-Vis em gua, rendimento quntico) e
fotodegradao no solo.
1.6. APLICABILIDADE DO ENSAIO
O ensaio aplicvel a substncias qumicas para as quais existe um mtodo analtico suficientemente rigoroso.
A estabilidade da substncia no perodo de ensaio um parmetro susceptvel de influenciar a fiabilidade dos
resultados, em especial quando se utiliza o mtodo indirecto. Deve, pois, efectuar-se um ensaio preliminar com
o objectivo de verificar a estabilidade; caso ocorra uma transformao no perodo de ensaio, recomenda-se a
anlise do solo e das fases aquosas no ensaio principal.
Podem surgir dificuldades na conduo do ensaio em substncias de solubilidade reduzida em gua (S
w
< 10
-4
g
l
-1
), bem como em substncias com carga elctrica elevada, pode determinar dificuldades, uma vez que a
determinao analtica da concentrao da fase aquosa no pode ser efectuada com rigor suficiente. Nestes
casos, necessrio adoptar medidas adicionais. Nas seces relevantes do presente mtodo fornecem-se
orientaes para a resoluo dos problemas em causa.
Caso se utilizem substncias volteis, devem evitar-se perdas durante o processo.
1.7.1. Equipamento e reagentes
Equipamento corrente de laboratrio, nomeadamente:
a) Tubos ou recipientes de ensaio, que devem possuir as seguintes caractersticas:
ser directamente adaptveis centrifugadora. de modo a minimizar os erros de manipulao e
transferncia,
ser feitos de um material inerte, de modo a minimizar a adsoro da substncia em estudo na sua
superfcie;
b) Dispositivo de agitao: agitador vertical ou equipamento equivalente; o dispositivo de agitao deve
manter a amostra de solo em suspenso durante o processo;
c) Centrifugadora: preferentemente de alta velocidade (por exemplo, fora centrfuga > 3 000 g), com
controlo de temperatura e capacidade de remover da soluo aquosa partculas de dimetro superior a
0,2 m. Os tubos ou recipientes devem ser tapados durante a agitao e centrifugao, de modo a evitar
perdas por volatilizao ou perdas de gua; com vista a minimizar a adsoro nos tubos ou recipientes,
devem utilizar-se tampas activadas, nomeadamente de teflon;
d) Dispositivo de filtrao (opcional): filtros com poros de 0,2 m, esterilizados e descartveis. Devem
adoptar-se precaues especiais na seleco dos materiais de filtrao, de modo a evitar perdas da
substncia em estudo; no caso de substncias pouco solveis, no recomendvel o uso de filtros de
matrias orgnicas;
e) Equipamento analtico adequado determinao da concentrao da substncia em estudo;
f) Estufa com possibilidade de manter a temperatura entre 103
o
C e 110
o
C.
1.7.2. Caracterizao e seleco dos solos
Os solos devem ser caracterizados pelos trs principais parmetros considerados responsveis pela capacidade
de adsoro: teor de carbono orgnico, teor de argila, textura do solo e pH. Como referido supra (mbito),
devem ter-se em conta quaisquer outras propriedades fsico-qumicas do solo que possam apresentar impacto
na adsoro/dessoro de uma determinada substncia.
Os mtodos utilizados para a caracterizao dos solos so bastante importantes, podendo influenciar os
resultados de modo significativo. Deste modo, recomenda-se a determinao do pH do solo numa soluo de
CaCl
2
, 0,01 M (soluo utilizada no ensaio de adsoro/dessoro) de acordo com o mtodo ISO
correspondente (ISO-10390-1). Recomenda-se tambm a determinao de outras propriedades importantes do
solo por recurso a mtodos normalizados (por exemplo manual ISO de anlise dos solos Handbook of Soil
Analysis); a anlise dos dados de adsoro/dessoro poder assim basear-se em parmetros globalmente
normalizados. As referncias (50-52) fornecem algumas directrizes referentes aos mtodos normalizados
existentes para a anlise e caracterizao dos solos. No que respeita calibrao dos mtodos de ensaio
aplicveis aos solos, recomenda-se o uso de amostras de solos de referncia.
O quadro 1 fornece directrizes para a seleco dos solos a utilizar nos ensaios de adsoro/dessoro. Os sete
tipos de solos seleccionados so caractersticos das regies temperadas. No caso da utilizao de substncias
ionizveis, os solos seleccionados devem possuir uma gama alargada de pH, de modo a que possa avaliar-se a
adsoro da substncia nas suas formas ionizada e no ionizada. Na seco 1.9 (Realizao do ensaio)
apresentam-se orientaes relativas ao nmero de solos diferentes que devem ser utilizados nas vrias fases do
ensaio.
Caso se utilizem outros tipos de solos, estes ltimos devem ser caracterizados pelos mesmos parmetros,
devendo as suas propriedades apresentar uma variao semelhante dos solos descritos no quadro 1, mesmo
que no satisfaam os critrios de forma rigorosa.
Quadro 1
Directrizes para a seleco das amostras de solos a utilizar nos ensaios de adsoro-dessoro
Tipo de solo
Gama de pH (em
CaCl
2
0,01 M)
Teor de carbono
orgnico (%)
Teor de argila (%) Textura (
1
)
1 4,5- 5,5 1,0- 2,0 65-80 argilosa
2 > 7,5 3,5- 5,0 20-40 argilo-limosa
3 5,5- 7,0 1,5- 3,0 15-25 franco-limosa
4 4,0- 5,5 3,0- 4,0 15-30 limosa
5 < 4,0 - 6,0 (
2
) < 0,5- 1,5 (
2
) (
3
) < 10-15 (
2
) limo-arenosa
6 > 7,0 < 0,5- 1,0 (
2
) (
3
) 40-65 argilo-limosa/argi-
losa
7 < 4,5 > 10 < 10 arenosa/limo-are-
nosa
(
1
) Em conformidade com o sistema da FAO e dos Estados Unidos (85).
(
2
) As variveis respectivas devem, preferencialmente, exibir valores includos nas gamas indicadas. Todavia, caso se observem
dificuldades em encontrar solos adequados, podem utilizar-se valores inferiores aos mnimos indicados.
(
3
) A utilizao de solos com teor de carbono orgnico inferior a 0,3 % poder perturbar a correlao entre o referido teor e a
adsoro. Recomenda-se, pois, a utilizao de solos com um teor mnimo de carbono orgnico de 0,3 %.
1.7.3. Recolha e armazenagem das amostras de solos
1.7.3.1. Recolha
No se recomendam tcnicas ou instrumentos especficos de amostragem; a tcnica a utilizar depende do
objectivo do ensaio (53) (54) (55) (56) (57) (58).
Deve ter-se em conta o seguinte:
a) So necessrias informaes pormenorizadas sobre a histria do local de recolha, nomeadamente a
localizao, o tipo de vegetao presente, o eventual tratamento com pesticidas e/ou adubos, a adio de
matria biolgica e a contaminao acidental. No que respeita descrio do referido local, devem seguir-
-se as recomendaes da norma ISO relativa recolha de amostras de solos (ISO 10381-6);
b) O local de recolha das amostras deve ser definido por UTM (Universal Transversal Mercator-Projection/
/European Horizontal Datum) ou por coordenadas geogrficas; o que permitir a recolha futura de tipos
especficos de solos ou contribuir para a definio dos solos em diversos sistemas de classificao
utilizados em pases diferentes. As amostras devem ser recolhidas apenas em horizontes A, at uma
profundidade mxima de 20 cm. Se, no caso particular do solo n.
o
7, se encontrar presente uma
componente de horizonte O
h
, a mesma deve ser includa na amostragem.
As amostras de solo devem ser transportadas em recipientes e a temperaturas tais que as suas propriedades no
sofram alteraes significativas.
1.7.3.2. Armazenagem
prefervel a utilizao de solos recentemente recolhidos. Nos casos em que tal no for possvel, os solos
podem ser armazenados temperatura ambiente, numa atmosfera seca. No se recomenda qualquer perodo-
-limite de armazenagem; contudo, no caso dos solos armazenados h mais de trs anos, deve determinar-se o
teor de carbono orgnico, o pH e CEC antes da utilizao.
1.7.3.3. Manuseamento das amostras de solos e sua preparao para o ensaio
Os solos so mantidos numa atmosfera seca, temperatura ambiente (de preferncia, entre 20 e 25
o
C). Devem
aplicar-se foras de desagregao mnimas, de modo a manter tanto quanto possvel a textura original dos
solos. Os solos so crivados a uma granulometria inferior ou igual a 2 mm; o processo de crivagem deve ser
conforme s recomendaes da norma ISO relativa recolha de amostras de solos (ISO 10381-6). Recomenda-
-se uma homogeneizao cuidadosa, de modo a aumentar a reprodutibilidade dos resultados. O teor de
humidade dos solos determinado com trs alquotas, por aquecimento a 105
o
C at no se observarem
alteraes de massa significativas (cerca de 12 h). Para efeitos de clculo, utiliza-se a massa de solo seco na
estufa, isto a massa corrigida do teor de humidade.
1.7.4. Preparao da substncia em estudo para aplicao no solo
A substncia dissolvida numa soluo de CaCl
2
, 0,01 M em gua destilada ou desionizada; a soluo de CaCl
2
utilizada como fase aquosa com o objectivo de melhorar a centrifugao e minimizar a permuta catinica. De
preferncia, a concentrao da soluo-me deve ser trs ordens de grandeza acima do limite de deteco do
mtodo analtico utilizado. Este limiar garante o rigor das determinaes no mbito da metodologia do
presente mtodo; alm disso, a concentrao da soluo-me deve ser inferior solubilidade da substncia em
estudo em gua.
A soluo-me deve ser preparada, preferencialmente, imediatamente antes da aplicao nas amostras de solos,
devendo ser mantida fechada e na ausncia de luz, a 4
o
C. O tempo de armazenagem depende da estabilidade da
substncia e da sua concentrao na soluo.
No caso de substncias pouco solveis (S
w
< 10-
4
g l
-1
), pode ser necessrio utilizar um agente de solubilizao
adequado. Este ltimo: a) deve ser miscvel com a gua (por exemplo, metanol ou acetonitrilo); b) a sua
concentrao no deve exceder 1 % do volume total da soluo-me e deve ser inferior concentrao da
substncia de ensaio em contacto com o solo (de preferncia menos de 0,1 %); c) no deve ser tensioactivo nem
susceptvel de participar em processos de solvlise com a substncia em estudo. A utilizao de um agente de
solubilizao deve ser justificada de modo pormenorizado no relatrio de ensaio.
A dopagem por adio da substncia em estudo constitui outra alternativa aplicvel a substncias pouco
solveis. Neste caso, a substncia em estudo dissolvida num solvente orgnico, sendo adicionada uma
alquota ao sistema constitudo pelo solo e a soluo de CaCl
2
0,01 M em gua destilada ou desionizada. O teor
de solvente orgnico na fase aquosa dever ser mantido a nveis to reduzidos quanto possvel, no devendo,
em geral, exceder 0,1 %. A tcnica em causa tem como desvantagem a no reprodutibilidade dos volumes: o
facto de a concentrao da substncia em estudo e do co-solvente no ser idntica em todos os ensaios poder
representar um factor de erro adicional.
1.8. REQUISITOS PRVIOS PARA A REALIZAO DOS ENSAIOS DE ADSORO/DESSORO
1.8.1. Mtodo analtico
Os principais parmetros que podem influenciar o rigor das determinaes de adsoro/dessoro incluem a
preciso do mtodo de anlise da soluo e da fase adsorvida, a estabilidade e pureza da substncia em estudo,
o tempo necessrio para atingir o equilbrio de adsoro/dessoro, a amplitude da variao de concentrao da
soluo, a razo solo/soluo e as alteraes na estrutura do solo durante o processo de equilbrio (35) (59-62).
O apndice 2 fornece alguns exemplos ligados preciso das determinaes.
Deve verificar-se a fiabilidade do mtodo analtico para a gama de concentraes susceptveis de ocorrer
durante o ensaio. O experimentador deve ser livre de desenvolver um mtodo com exactido, preciso,
reprodutibilidade, limites de deteco e recuperao adequados. A descrio infra fornece directrizes sobre o
modo de execuo do ensaio em causa.
Agita-se um volume adequado (por exemplo, 100 cm
3
) de CaCl
2
0,01 M, durante quatro horas, com uma
massa de solo (por exemplo, 20 g) de elevada capacidade de adsoro, isto , com um teor elevado de carbono
orgnico e de argila. As massas e volumes referidos podem variar em funo das necessidades analticas; uma
razo solo/soluo de 1:5 constitui, em geral, um valor inicial adequado. A mistura centrifugada, podendo
filtrar-se a fase aquosa. Adiciona-se mistura um determinado volume de soluo-me da substncia em
estudo, de modo a obter uma concentrao nominal includa na gama de concentraes susceptveis de ocorrer
durante o ensaio. O referido volume no dever exceder 10 % do volume final da fase aquosa, de modo a alterar
to pouco quanto possvel a natureza da soluo de pr-equilbrio. Procede-se anlise da soluo.
Deve efectuar-se um ensaio em branco com o sistema constitudo pelo solo e a soluo de CaCl
2
(suprimindo a
substncia em estudo), de modo a averiguar a existncia de anomalias no mtodo analtico, bem como
possveis efeitos matriciais causados pelo solo.
Os mtodos analticos que podem ser utilizados para as determinaes de adsoro/dessoro incluem a
cromatografia gs-lquido (GLC), a cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC), a espectrometria
(espectrometria de massa acoplada GLC e HPLC) e a contagem por cintilao lquida (no caso de substncias
marcadas com radioistopos). Independentemente do mtodo analtico utilizado, considera-se que o mesmo
adequado se as recuperaes forem da ordem de 90 % a 110 % do valor nominal. De modo a permitir efectuar
a deteco e avaliao aps a partio, os limites de deteco do mtodo analtico devem ser inferiores
concentrao nominal em, pelo menos, duas ordens de grandeza.
As caractersticas e limites de deteco do mtodo analtico utilizado nos estudos de adsoro desempenham
um papel importante na definio das condies de ensaio e no desempenho global do mesmo. O presente
mtodo constitui uma abordagem experimental, fornecendo recomendaes e directrizes para o
desenvolvimento de solues alternativas caso o mtodo analtico e as condies laboratoriais imponham
limitaes.
1.8.2. Seleco das razes solo/soluo adequadas
A seleco das razes solo/soluo adequadas aos estudos de adsoro/dessoro depende do coeficiente de
distribuio K
d
e do grau de adsoro relativa pretendido. A alterao da concentrao da substncia na soluo
determina o rigor estatstico da determinao, baseado na forma da equao de adsoro e do limite da
metodologia analtica. Na prtica, conveniente adoptar uma srie de razes fixas, relativamente s quais a
percentagem adsorvida seja superior a 20 % e, preferentemente, a 50 % (62), devendo procurar manter-se a
concentrao da substncia em estudo na fase aquosa a nveis que possam ser determinados com rigor. Tal
facto particularmente importante no caso de se observarem percentagens de adsoro elevadas.
A estimativa do valor de K
d
, quer atravs de estudos preliminares quer por tcnicas de estimativa consagradas
(apndice 3). fornece uma abordagem conveniente da seleco das razes solo/gua adequadas. A seleco de
uma razo pode ser efectuada com base numa representao das razes solo/soluo em funo dos valores de
K
d
, para percentagens fixas de adsoro (figura 1), presumindo a linearidade da equao de adsoro (
1
). A
relao aplicvel obtida atravs do rearranjo da equao (4), de modo a obter a equao (1):
V
0
m
solo
=
m
0
m
ads
s
eq
1
_ _
K
d
[1]
(
1
) C
ads
s
eq = K
d
C
ads
aq
eq :
ou, na forma logartmica, assumndo que R = m
solo
/V
0
c A
eq
%/100 =
m
ads
s
eq
m
0
:
logR= logK
d
log
A
eq
%=100
_ _
1 A
eq
%=100
_ _
_ _
[2]
Figura 1. Relao entre as razes solo/soluo e K
d
, para diferentes percentagens de substncia
em estudo adsorvida
A figura 1 apresenta as razes solo/soluo necessrias em funo de K
d
, para diversos nveis de adsoro. Por
exemplo, com uma razo solo/soluo de 1:5 e um K
d
de 20, a percentagem de adsoro ser da ordem de
80 %. Para obter uma percentagem de adsoro de 50 %, com um idntico valor de K
d
, deve utilizar-se uma
razo de 1:25. Esta abordagem de seleco das razes solo/soluo adequadas fornece ao investigador a
flexibilidade necessria satisfao das exigncias experimentais.
As zonas de abordagem analtica mais difcil so aquelas em que a substncia apresenta uma adsoro ligeira ou
bastante elevada. Em caso de adsoro reduzida, recomenda-se a utilizao de uma razo solo/soluo de 1:1,
embora, para solos com elevado teor de matria orgnica, possa revelar-se necessrio utilizar razes inferiores,
de modo a obter uma massa pastosa. Devem adoptar-se precaues com a metodologia analtica para a
determinao de pequenas alteraes de concentrao, sem o que o clculo da adsoro ser inexacto. Por
outro lado, no caso de coeficientes de partio K
d
bastante elevados, pode utilizar-se uma razo solo/soluo de
1:100, de modo a que permanea na soluo uma quantidade aprecivel da substncia. Contudo, devem
adoptar-se precaues no sentido de assegurar uma homogeneizao adequada, devendo prever-se o tempo
necessrio ao equilbrio do sistema. A previso do valor de K
d
por recurso a tcnicas de estimativa baseadas, por
exemplo, nos valores de P
ow
(apndice 3) constitui uma abordagem alternativa, que pode ser utilizada,
nomeadamente, no caso de substncias polares ou com adsoro reduzida, bem como com valores de P
ow
inferiores a 20, e no caso de substncias lipfilas/ou de elevada adsoro com P
ow
> 10
4
.
1.9. REALIZAO DO ENSAIO
Todos os ensaios devem ser realizados temperatura ambiente e, se possvel, a uma temperatura constante
compreendida entre 20
o
C e 25
o
C.
As condies de centrifugao devem permitir remover da soluo partculas de granulometria superior a
0,2 m. Este valor representa a granulometria mnima para que uma partcula seja considerada slida,
constituindo o limite entre as partculas slidas e coloidais. O apndice 4 fornece directrizes para a
determinao das condies de centrifugao.
Se o equipamento de centrifugao no garantir a remoo de partculas de granulometria superior a 0,2 m,
pode combinar-se a centrifugao com uma filtrao com filtros de 0,2 um de porosidade. Os filtros devem ser
feitos de um material inerte adequado, de modo a evitar quaisquer perdas da substncia em estudo. Em
qualquer caso, deve provar-se a no ocorrncia de perdas da substncia durante a filtrao.
1.9.2. Etapa 1 Ensaio preliminar
O objectivo da realizao de um ensaio preliminar foi j referido na seco mbito. Fornecem-se de seguida
directrizes para o estabelecimento das condies do referido ensaio.
1.9.2.1. Seleco das razes solo/soluo adequadas
Utilizam-se dois tipos de solos e trs razes solo/soluo (seis ensaios). Um dos tipos de solos dever possuir
um teor elevado de carbono orgnico e um teor reduzido de argila; o outro solo dever possuir um teor
reduzido de carbono orgnico e um elevado teor de argila. Recomendam-se as seguintes razes:
50 g de solo e 50 cm
3
de soluo aquosa da substncia em estudo (razo 1/1),
10 g de solo e 50 cm
3
de soluo aquosa da substncia em estudo (razo 1/5),
2 g de solo e 50 cm
3
de soluo aquosa da substncia em estudo (razo 1/25).
A quantidade mnima de solo necessria para efectuar o ensaio depende das condies laboratoriais e do
desempenho dos mtodos analticos utilizados. Recomenda-se, contudo, a utilizao de, pelo menos, 1 g, e, de
preferncia, 2 g, de modo a obter resultados fiveis.
Uma amostra de controlo, contendo a substncia em estudo dissolvida na soluo de CaCl
2
0,01 M, na
ausncia de solo, sujeita ao mesmo tratamento que os sistemas de ensaio, com o objectivo de verificar a
estabilidade da substncia em estudo na soluo de CaCl
2
, bem como a sua eventual adsoro na superfcie dos
recipientes de ensaio.
Deve efectuar-se um ensaio em branco para cada tipo de solo, aplicando um procedimento idntico a uma
amostra constituda pela mesma quantidade de solo e um volume total de 50 cm
3
de soluo de CaCl
2
0,01 M,
na ausncia da substncia em estudo. O ensaio em branco possui uma funo de controlo do processo
analtico, permitindo detectar a presena de substncias interferentes ou de contaminantes dos solos.
Todos os ensaios, incluindo os de controlo e brancos, devem ser realizados pelo menos em duplicado. O
nmero total de amostras a preparar para o ensaio pode ser calculado em funo da metodologia utilizada.
Os mtodos utilizados no ensaio preliminar e no ensaio principal so, de modo geral, idnticos, referindo-se as
excepes sempre que for caso disso.
Antes da realizao do ensaio, as amostras de solos secas ao ar so equilibradas por agitao, durante 12 h, com
um volume mnimo de 45 cm
3
de CaCl
2
0,01 M. Seguidamente, adiciona-se um volume determinado de
soluo-me da substncia em estudo, de modo a ajustar o volume final para 50 cm
3
. O volume de soluo-
-me a adicionar: a) no deve exceder 10 % do volume final (50 cm
3
) da fase aquosa, de modo a alterar to
pouco quanto possvel a natureza da soluo de pr-equilbrio: b) deve, de preferncia, resultar numa
concentrao inicial da substncia em estudo em contacto com o solo (C
0
) superior ao limite de deteco do
mtodo analtico em, pelo menos, duas ordens de grandeza; este limiar garante a possibilidade de efectuar
determinaes rigorosas mesmo em caso de ocorrncia de uma forte adsoro (> 90 %), bem corno o clculo
posterior das isotrmicas de adsoro. Recomenda-se tambm, na medida do possvel, que a concentrao
inicial da substncia em estudo (C
0
) no exceda metade do seu limite de solubilidade.
Apresenta-se de seguida um exemplo do clculo da concentrao da soluo-me (C
st
). Assume-se que o limite
de deteco de 0,01 g cm
-3
e a taxa de adsoro de 90 %; nestas condies, a concentrao inicial da
substncia em estudo em contacto com o solo deve, preferentemente, ser de 1 g cm
-3
(superior ao limite de
deteco em duas ordens de grandeza). Supondo que se adiciona o volume mximo recomendvel de soluo-
-me, isto , 5 a 45 cm
3
de soluo de CaCl
2
0,01 M (= 10 % de soluo-me a um volume total da fase aquosa
de 50 cm
3
), a concentrao da soluo-me deve ser de 10 g cm
-3
, ou seja, superior ao limite de deteco do
mtodo analtico em trs ordens de grandeza.
Deve determinar-se o pH da fase aquosa antes e aps o contacto com o solo. uma vez que desempenha um
papel importante em todo o processo de adsoro, especialmente no caso das substncias ionizveis.
A mistura agitada at ser atingido o equilbrio de adsoro. O tempo necessrio para atingir o equilbrio no
solo bastante varivel, dependendo da natureza da substncia e do tipo de solo; um perodo de 24 h , em
geral, suficiente (77). No estudo preliminar, recomenda-se a adopo de uma amostragem sequencial nas 48 h
subsequentes mistura (por exemplo, aps quatro, oito, 24 e 48 h). Deve, contudo, adoptar-se uma relativa
flexibilidade no que respeita durao do ensaio, tendo em conta a programao do trabalho de laboratrio.
Existem duas opes para a anlise da substncia em estudo na soluo aquosa: a) mtodo paralelo b) mtodo
sequencial. Deve sublinhar-se que, embora no plano experimental o mtodo paralelo seja mais fastidioso, o
tratamento matemtico dos resultados mais simples (ver apndice 5). Todavia, a escolha da metodologia a
adoptar deixada ao critrio do experimentador, que dever ter em conta as condies e os recursos
laboratoriais disponveis.
a) Mtodo paralelo: preparam-se amostras com a mesma razo solo/soluo, em nmero igual aos
intervalos de tempo em que pretende estudar-se a cintica de adsoro. Aps centrifugao e, se
necessrio, filtrao, a fase aquosa do primeiro tubo recolhida to completamente quanto possvel e
sujeita a anlise aps, por exemplo, quatro h, sendo a fase aquosa do segundo tubo recolhida aps oito h,
a do terceiro tubo aps 24, etc.;
b) Mtodo sequencial: prepara-se uma nica amostra em duplicado por cada razo solo/soluo. A mistura
centrifugada a intervalos regulares, de modo a separar as fases. Determina-se de imediato a substncia
em estudo numa pequena alquota da fase aquosa, prosseguindo-se o ensaio com a mistura original. Caso
se recorra filtrao aps a centrifugao, as condies do laboratrio devem permitir filtrar alquotas
aquosas de volume reduzido. Recomenda-se que o volume total de alquotas recolhidas no exceda 1 %
do volume total da soluo, de modo a no alterar significativamente a razo solo/soluo e reduzir a
massa de soluto disponvel para adsoro durante o ensaio.
Calcula-se a percentagem de adsoro A
ti
em cada instante (t
i
) com base na concentrao inicial nominal e na
concentrao determinada no instante de amostragem (t
j
), corrigida do valor referente amostra em branco. A
representao grfica A, em funo! do tempo (figura 1 do apndice 5) permite obter uma estimativa do tempo
necessrio para atingir o patamar de equilbrio (
1
), bem como calcular o valor de K
d
no estado de equilbrio.
Com base no valor de K
d
, seleccionam-se da figura l razes solo/soluo adequadas, que determinem uma
percentagem de adsoro superior a 20 % e, preferentemente, superior a 50 % (61). As equaes a aplicar e
princpios de representao grfica so fornecidos na seco Apresentao dos resultados e no apndice 5.
1.9.2.2. Determinao do tempo necessrio para atingir o equilbrio de adsoro e da quantidade de substncia em estudo adsorvida
no estado de equilbrio
Como referido supra, a representao grfica de A
ti
ou C
ads
aq
em funo do tempo permite obter uma estimativa
do instante em que atingido o equilbrio de adsoro, bem como da quantidade de substncia em estudo
adsorvida no estado de equilbrio. As figuras 1 e 2 do apndice 5 fornecem exemplos das referidas
representaes. O tempo necessrio para atingir o equilbrio traduz-se no tempo de que o sistema necessita
para atingir o patamar de equilbrio.
Se, no caso de um determinado solo, no se observar a ocorrncia de qualquer patamar, mas antes um aumento
constante, tal facto pode ser devido a factores de perturbao tais como a biodegradao ou difuso lenta. Pode
averiguar-se a ocorrncia de biodegradao repetindo o ensaio com uma amostra de solo esterilizada. Caso no
se observe tambm qualquer patamar, o experimentador deve averiguar a ocorrncia de outro fenmeno
possvel no caso especfico em questo, procedendo a alteraes adequadas das condies experimentais
(temperatura, tempos de agitao, razes solo/soluo). Compete ao experimentador decidir o prosseguimento
do ensaio apesar da eventual impossibilidade de atingir o equilbrio.
1.9.2.3. Adsoro na superfcie do recipiente de ensaio e estabilidade da substncia em estudo
A anlise das amostras de controlo permite obter informaes sobre a adsoro da substncia em estudo na
superfcie dos recipientes de ensaio, bem como sobre a respectiva estabilidade. Caso se observe uma perda
superior ao erro-padro do mtodo analtico utilizado, esta pode dever-se a uma degradao abitica e/ou
adsoro na superfcie do recipiente de ensaio. Estes fenmenos so distinguveis mediante a lavagem das
paredes do recipiente com um volume conhecido de um solvente adequado, seguida de determinao da
substncia em estudo na soluo resultante da lavagem. Se no ocorrer adsoro na superfcie do recipiente de
ensaio, a perda reflecte a instabilidade abitica da substncia em estudo. Caso se observe a ocorrncia de
adsoro, necessrio utilizar recipientes de outro material. De referir que os dados relativos adsoro na
superfcie dos recipientes de ensaio assim obtidos no so directamente extrapolveis para o ensaio solo/
/soluo, uma vez que a presena de solo afecta o processo de adsoro.
(
1
) A representao grfica da concentrao da substncia de ensaio na fase aquosa ( C
ads
aq
_ _
) em funo do tempo pode tambm ser utilizada
na estimativa do instante em que atingido o patamar de equilbrio (ver figura 2 do apndice 5).
Podem obter-se informaes adicionais sobre a estabilidade da substncia em estudo atravs do clculo do
balano de massas em funo do tempo. Tal implica a determinao da substncia em estudo na fase aquosa,
em extractos do solo e nas paredes do recipiente de ensaio. A diferena entre a massa de substncia em estudo
adicionada e a soma das massas da mesma substncia na fase aquosa, nos extractos de solo e no recipiente de
ensaio corresponde massa degradada e/ou volatilizada e/ou no extrada. A determinao do balano de
massas apenas deve ser efectuada se o equilbrio de adsoro tiver sido atingido no perodo de ensaio.
O balano de massas determinado para ambos os solos, bem como para uma razo solo/soluo por solo
com uma perda superior a 20 % e, preferentemente, superior a 50 %, no estado de equilbrio. Aps a anlise da
ltima amostra de fase aquosa, decorridas 48 h do incio do ensaio, as fases so separadas por centrifugao e
eventualmente filtradas. A fase aquosa recuperada na maior extenso possvel, adicionando-se de seguida ao
solo um solvente de extraco adequado, com um coeficiente de extraco mnimo de 95 %, de modo a extrair
a substncia em estudo. Recomenda-se a realizao de duas extraces sucessivas. Determina-se ento a
quantidade de substncia em estudo presente no solo e nos extractos dos recipientes, procedendo-se ao clculo
do balano de massas (equao 10 da seco Apresentao dos resultados). Caso o referido balano seja
inferior a 90 %, a substncia deve considerar-se instvel no intervalo de durao do ensaio. Podem, contudo,
prosseguir-se os estudos, tendo em devida conta a referida instabilidade; neste caso, recomenda-se a anlise de
ambas as fases no ensaio principal.
1.9.3. Etapa 2 Cintica de adsoro para uma determinada concentrao da substncia em estudo
Utilizam-se cinco solos, seleccionados com base no quadro 1. conveniente utilizar alguns dos solos (ou
mesmo todos) utilizados no ensaio preliminar. Neste caso, no dever repetir-se a etapa 2 para os solos
utilizados no referido ensaio.
O tempo necessrio para atingir o equilbrio, a razo solo/soluo, a massa da amostra de solo, o volume de
fase aquosa em contacto com o solo e a concentrao da substncia em estudo na soluo so seleccionados
com base nos resultados do ensaio preliminar. De preferncia, deve efectuar-se a anlise aps um tempo de
contacto aproximado de duas, quatro, seis, oito (eventualmente tambm 10) e 24 h; caso os resultados dos
ensaios de das razes mostrem que um determinado produto necessita de tempos de exposio superiores, o
tempo de agitao pode ser aumentado para, no mximo, 48 h. O estabelecimento dos referidos tempos deve,
contudo, ser encarado de modo flexvel.
Cada ensaio com um tipo especfico de solo e uma soluo deve ser efectuado pelo menos em duplicado, de
modo a permitir estimar a varincia dos resultados. Deve tambm realizar-se em cada caso um ensaio em
branco, utilizando uma massa de amostra de solo e um volume de soluo de CaCl
2
0,01 M idnticos aos
utilizados no ensaio principal, na ausncia da substncia em estudo. Deve aplicar-se o mesmo procedimento de
ensaio a uma amostra de controlo contendo apenas a substncia em estudo dissolvida na soluo de CaCl
2
0,01 M, na ausncia de solo, como medida de precauo contra factores imprevistos.
A percentagem de adsoro calculada em cada instante A
ti
e/ou em cada intervalo A
ti
(de acordo com as
necessidades), sendo representada graficamente em funo do tempo. Calcula-se tambm o coeficiente de
distribuio no equilbrio, K
d
, bem como o coeficiente de adsoro normalizado em relao ao carbono
orgnico, K
oc
(aplicvel a substncias orgnicas no polares).
Resultados do ensaio de cintica de adsoro
De modo geral, o valor linear de K
d
suficientemente preciso para descrever o comportamento do solo em
termos de adsoro/dessoro (35) (78), constituindo uma expresso da mobilidade caracterstica da substncia
no solo. Considera-se, por exemplo, que as substncias com K
d
1 cm
3
g
-1
apresentam uma mobilidade
qualitativa aprecivel. Alm disso, MacCall et al. (16) desenvolveram um mtodo de classificao da mobilidade
com base nos valores de K
oc
. Existem tambm sistemas de classificao da lixiviao baseados na relao entre
K
oc
e DT-50 (
1
) (32) (79).
Por outro lado, de acordo com os estudos de anlise de erros (61), os valores de K
d
inferiores a 0,3 cm
3
g
-1
no
podem ser estimados de forma rigorosa com base no decrscimo da concentrao da fase aquosa, mesmo
quando se utiliza a razo solo/soluo mais favorvel do ponto de vista da preciso, ou seja, 1:1. Neste caso,
recomenda-se proceder anlise de ambas as fases (solo e soluo).
Relativamente s observaes supra, recomenda-se que o estudo do comportamento da substncia no solo em
termos de adsoro, bem como da sua mobilidade potencial, seja seguido da determinao das isotrmicas de
adsoro de Freundlich para os sistemas que permitam uma determinao rigorosa de K
d
atravs do protocolo
experimental descrito no presente mtodo. Essta determinao possvel caso o valor resultante da
multiplicao de K
d
pela razo solo/soluo seja superior a 0,3, sempre que as determinaes sejam baseadas
no decrscimo de concentrao da fase aquosa (mtodo indirecto), ou superior a 0,1, quando se procede
anlise de ambas as fases (mtodo directo) (61).
(
1
) DT-50: tempo necessrio para a degradao de 50 % da substncia em estudo.
1.9.4. Etapa 3 Isotrmicas de adsoro e cintica de dessoro/isotrmicas de dessoro
1.9.4.1. I s ot r mi c a s d e a d s or o
Utilizam-se cinco concentraes da substncia em estudo, que devero abranger, de preferncia, duas ordens de
grandeza; na seleco das referidas concentraes, devem ter-se em conta a solubilidade em gua e as
concentraes de equilbrio resultantes. Para cada solo, deve utilizar-se ao longo de todo o ensaio a mesma
razo solo/soluo. O ensaio de adsoro efectuado do modo descrito supra, embora a fase aquosa seja
analisada uma nica vez, aps o tempo necessrio para atingir o equilbrio, estabelecido na etapa 2.
Determinam-se as concentraes da soluo no equilbrio, calculando-se a quantidade adsorvida com base na
perda da substncia em estudo na soluo ou pelo mtodo directo. Representa-se graficamente a massa
adsorvida por unidade de massa do solo em funo da concentrao de equilbrio da substncia em estudo (ver
seco Apresentao dos resultados).
Resultados do ensaio para a determinao das isotrmicas de adsoro
De entre os diversos modelos matemticos de adsoro propostos, a isotrmica de Freundlich constitui um dos
mais frequentemente utilizados para descrever os processos de adsoro. As referncias (41) (45) (80) (81) (82)
fornecem informaes mais pormenorizadas sobre a interpretao e importncia dos modelos de adsoro.
Nota: Deve referir-se que a comparao dos valores de K
F
(coeficiente de adsoro de Freundlich) de diversas
substncias apenas possvel se os referidos valores forem expressos nas mesmas unidades (83).
1.9.4.2. Ci n t i c a d e d e s s or o
O objectivo do ensaio consiste em averiguar a reversibilidade ou irreversibilidade da adsoro de uma
substncia no solo, informao importante na medida em que o processo de dessoro desempenha um papel
considervel no comportamento da substncia no solo. Alm disso, os dados de dessoro so utilizados na
modelizao por computador de processos de lixiviao e escoamento de substncias dissolvidas. Caso se
pretenda efectuar um estudo de dessoro, recomenda-se a aplicao do protocolo descrito infra a cada sistema
relativamente ao qual foi possvel efectuar uma determinao rigorosa de K
d
no ensaio de cintica de adsoro
precedente.
Tal como no estudo de cintica de adsoro, existem duas opes para efectuar o ensaio de cintica de
dessoro: a) mtodo paralelo; b) mtodo sequencial. A seleco da metodologia a adoptar deixada ao critrio
do experimentador, que dever ter em conta as condies e os recursos laboratoriais disponveis.
a) Mtodo paralelo: para cada tipo de solo seleccionado para o ensaio de dessoro, preparam-se amostras
com a mesma razo solo/soluo em nmero igual ao nmero de intervalos de tempo em que pretende
estudar-se a cintica de dessoro. Devem usar-se, de preferncia, os intervalos de tempo do ensaio de
cintica de adsoro; pode, contudo, prolongar-se de forma adequada o tempo total, de modo a permitir
que o sistema atinja o equilbrio de dessoro. Deve efectuar-se um ensaio em branco para cada tipo de
solo e concentrao da soluo, utilizando uma massa de solo e um volume de soluo de CaCl
2
0,01 M
idnticos aos do ensaio principal, na ausncia da substncia em estudo. Deve ainda aplicar-se o mesmo
procedimento de ensaio a uma amostra de controlo contendo apenas a substncia em estudo dissolvida
na soluo de CaCl
2
0,01 M, na ausncia de solo. Agitam-se as misturas solo-soluo at atingir o
equilbrio de adsoro, como determinado na etapa 2. Procede-se de seguida separao das fases por
centrifugao, recolhendo as fases aquosas na maior extenso possvel. Os volumes de soluo recolhidos
so substitudos por iguais volumes de CaCl
2
0,01 M, na ausncia de substncia em estudo, agitando de
novo. Removem-se as fases aquosas de modo to completo quanto possvel, efectuando-se determinaes
aps, por exemplo, duas h, no caso do primeiro tubo, quatro h no caso do segundo, seis h no caso do
terceiro, etc. at atingir o equilbrio de dessoro;
b) Mtodo sequencial: aps o ensaio de cintica de adsoro, a mistura centrifugada e a fase aquosa remo
vida na maior extenso possvel. O volume de soluo removida substitudo por igual volume de CaCl
2
0,01 M, na ausncia da substncia em estudo. A nova mistura agitada at atingir o equilbrio de
dessoro. Durante este perodo, procede-se centrifugao da mistura a intervalos regulares, de modo a
separar as fases. Determina-se de imediato a substncia em estudo numa pequena alquota da fase aquosa,
prosseguindo o ensaio com a mistura original. O volume de cada alquota recolhida deve ser inferior a
1 % do volume total. Adiciona-se mistura uma quantidade igual de soluo de CaCl
2
0,01 M, com o
objectivo de manter a razo solo/soluo, mantendo a agitao at ao prximo intervalo.
Calcula-se a percentagem de dessoro em cada instante ( D
ti
) e/ou intervalo ( D
ti
) (de acordo com o
objectivo do estudo), representando-a graficamente em funo do tempo. Calcula-se tambm o coeficiente de
dessoro no equilbrio, K
des
. As equaes a aplicar so fornecidas na seco Apresentao dos resultados e no
apndice 5.
Resultados do ensaio de cintica de dessoro
A representao grfica da percentagem de dessoro D
ti
e adsoro A
ti
em funo do tempo permite estimar a
reversibilidade do processo de adsoro. Caso o equilbrio de dessoro seja atingido, mesmo num tempo
duplo do tempo de equilbrio de adsoro, e a dessoro total seja superior a 75 % da quantidade adsorvida, o
processo de adsoro considerado reversvel.
1.9.4.3. I s ot r mi c a s d e d e s s or o
As isotrmicas de dessoro de Freundlich so determinadas nos solos utilizados no ensaio das isotrmicas de
adsoro. O ensaio de dessoro efectuado em conformidade com o protocolo descrito na seco Cintica de
dessoro, com a nica diferena de que a fase aquosa analisada uma nica vez, no estado de equilbrio de
dessoro. Calcula-se a quantidade de substncia em estudo dessorvida, representando graficamente o teor de
substncia em estudo que permanece adsorvida no solo no estado de equilbrio de dessoro em funo da
concentrao de equilbrio da substncia em estudo na soluo (ver a seco Apresentao dos resultados e o
apndice 5).
2. APRESENTAO DOS RESULTADOS
Os dados analticos so apresentados na forma de quadro (ver apndice 6). Deve fornecer-se os resultados das
vrias determinaes e as mdias calculadas, bem como as representaes grficas das isotrmicas de adsoro.
Os clculos so efectuados do modo descrito infra.
Para os fins do ensaio, considera-se que 1 cm
3
de soluo aquosa possui a massa de 1 g. Deste modo, a razo
solo/soluo pode ser expressa em massa/massa ou massa/volume com o mesmo valor numrico.
2.1. ADSORO
A adsoro (A
ti
) definida como a percentagem de substncia adsorvida no solo, relativamente quantidade
presente no incio do ensaio e nas condies em causa. Caso a substncia em estudo seja estvel e no ocorra
uma adsoro significativa nas paredes do recipiente, o valor de A
ti
em cada instante t
i
calculado atravs da
equao:
A
ti
=
m
ads
s
t
i
100
m
0
%
(3)
em que:
A
ti
= percentagem de adsoro no instante t
i
(%);
m
ads
s
t
i

= massa de substncia em estudo adsorvida no solo no instante t
i
(g);
m
0
= massa de substncia em estudo presente no recipiente de ensaio, no incio do mesmo (g).
O apndice 5 fornece informaes pormenorizadas sobre o modo de clculo da percentagem de adsoro A
ti
tanto no caso do mtodo paralelo corno do mtodo sequencial.
O coeficiente de distribuio K
d
a razo entre o teor de substncia na fase edfica e a concentrao mssica da
mesma na soluo aquosa ao atingir o equilbrio de adsoro, nas condies de ensaio.
K
d =
C
ads
s
eq
C
ads
aq
eq
=
m
ads
s
eq
m
ads
aq
eq

V
0
m
soil
(cm
3
g
-1
)
(4)
em que:
C
ads
s
eq
= teor de substncia adsorvida no solo no estado de equilbrio de adsoro (g g
-1
);
C
ads
aq
eq
= concentrao mssica da substncia na fase aquosa no estado de equilbrio de adsoro (g cm-
3
),
cuja determinao analtica tem em conta os valores obtidos nos ensaios em branco;
m
ads
s
eq
= massa de substncia adsorvida no solo no estado de equilbrio de adsoro (g);
m
ads
aq
eq
= massa de substncia presente na soluo, no estado de equilbrio de adsoro (g);
m
solo
= quantidade de fase edfica, expressa em massa seca de solo (g);
V
0
= volume inicial de fase aquosa em contacto com o solo (cm
3
).
A relao entre A
eq
e K
d
dada por:
K
d =
A
eq
100 A
eq
V
0
m
soil
(cm
3
g
-1
)
(5)
em que:
A
eq
= percentagem de adsoro no estado de equilbrio de adsoro, %.
O coeficiente de adsoro normalizado relativo ao carbono orgnico K
oc
exprime o coeficiente de distribuio
K
d
em funo do teor de carbono orgnico da amostra de solo:
K
oc = K
d

100
%OC
(cm
3
g
-1
)
(6)
em que:
%OC = percentagem de carbono orgnico na amostra de solo (g g-
1
).
O coeficiente K
oc
constitui um parmetro caracterstico da partio do carbono orgnico entre o solo ou
sedimento e a gua, nomeadamente no caso de compostos orgnicos no polares. Existe uma correlao entre a
adsoro das referidas substncias e o teor de carbono orgnico do slido adsorvente (7); os valores de K
nc
dependem das caractersticas especficas das fraces hmicas cuja capacidade de adsoro diferem de modo
considervel, devido, nomeadamente, sua origem ou gnese diversa.
2.1.1. Isotrmicas de adsoro
A equao que exprime as isotrmicas de adsoro de Freundlich relaciona a quantidade de substncia em
estudo adsorvida com a concentrao da substncia em estudo na soluo, no estado de equilbrio (equao 8).
Os dados so processados de modo idntico ao descrito na seco Adsoro, calculando-se, para cada
recipiente de ensaio, o teor de substncia em estudo adsorvida no solo aps o ensaio de adsoro [C
ads
s
eq , por
vezes designado por x/m]. Presume-se que o equilbrio foi atingido e que C
ads
s
eq representa o valor no estado
de equilbrio:
C
ads
s
eq =
m
ads
s
eq
m
soil
=
C
0
C
ads
aq
eq
_ _
:V
0
m
soil
(g g
-1
)
(7)
A equao de adsoro de Freundlich dada por (8):
C
ads
s
eq = K
ads
F
:C
ads
aq
eq
1=n
(g g
-1
)
(8)
ou, na forma linear:
logC
ads
s
eq = logK
ads
F
1=nlogC
ads
aq
eq
(9)
em que:
K
ads
F
= Coeficiente de adsoro de Freundlich, cujas dimenses so de cm
3
g
-1
apenas nos casos em que l/n = 1:
em todos os restantes casos, o declive l/n introduzido na dimenso de K
ads
F
(g
1-1/n
(cm
3
)
1/n
g
-1
);
n = constante de regresso; l/n situa-se, de modo geral, entre 0,7 e 1,0, mostrando que os dados de
adsoro/dessoro so, com frequncia, ligeiramente no lineares.
Aplicam-se as equaes (8) e (9), sendo os valores de K
ads
F
e l/n calculados por regresso linear, com o auxlio da
equao 9. Calcula-se tambm o coeficiente de correlao r
2
da equao logartmica. A figura 2 fornece um
exemplo das representaes em causa.
Figura 2. Grficos de adsoro de Freundlich (normal e linearizado)
2.1.2. Balano de massas
O balano de massas (MB) definido como a percentagem de substncia inicialmente presente que pode ser
analiticamente recuperada na sequncia de um ensaio de adsoro.
O tratamento dos dados diferente no caso de solventes totalmente miscveis em gua, podendo aplicar-se o
mtodo descrito na seco Dessoro para determinar a quantidade de substncia recuperada por extraco
com solvente. Se o solvente for menos miscvel em gua, deve determinar-se a quantidade recuperada.
O balano de massas MB do processo de adsoro calculado do modo que se segue; assume-se que o termo
(m
E
) corresponde soma das massas da substncia em estudo extradas do solo e das paredes do recipiente de
ensaio com um solvente orgnico:
MB =
V
rec
C
ads
aq
eq m
E
_ _
100
V
0
C
0
%
(10)
em que:
MB = balano de massas (%);
m
L
= massa total de substncia em estudo extrada do solo e das paredes do recipiente de ensaio em duas
etapas (g);
C
0
= concentrao inicial da soluo de ensaio em contacto com o solo (g cm
-3
):
V
rec
= volume de sobrenadante recuperado aps atingir o equilbrio de adsoro (cm
-3
).
2.2. DESSORO
A dessoro (D) definida como a percentagem dessorvida de substncia em estudo, relativamente
quantidade previamente adsorvida, nas condies de ensaio:
D
ti
=
m
des
aq
t
i

m
ads
s
eq
100 %
(11)
em que:
D
ti
= percentagem de dessoro no instante t
i
(%);
m
des
aq
t
i

= massa de substncia em estudo dessorvida do solo no instante t
i
(g);
m
ads
s
eq
= massa de substncia em estudo adsorvida no solo no estado de equilbrio de adsoro (g).
O apndice 5 fornece directrizes para o clculo da percentagem de dessoro D
t
i no caso dos mtodos paralelo
e sequencial.
O coeficiente de dessoro aparente (K
des
) a razo entre a quantidade de substncia que permanece na fase
edfica e a concentrao mssica da substncia dessorvida na soluo aquosa, ao atingir o estado de equilbrio
de dessoro, nas condies de ensaio:
K
des =
m
ads
s
eq m
des
aq
eq
m
des
aq
eq
V
T
m
soil
(cm
3
g
-1
)
(12)
em que:
K
des
= coeficiente de dessoro (cm
3
g-
1
);
m
des
aq
eq
= massa total de substncia em estudo dessorvida do solo no estado de equilbrio de dessoro (g);
V
t
= volume total da fase aquosa em contacto com o solo durante o ensaio de cintica de dessoro
(cm
3
).
A seco Dessoro do apndice 5 fornece directrizes para o clculo de m
des
aq
eq .
Nota:
Caso o ensaio de adsoro precedente tenha sido efectuado pelo mtodo paralelo, considera-se que o volume
V
T
da equao (12) igual a V
0
.
2.2.1. Isotrmicas de dessoro
A equao que exprime as isotrmicas de dessoro de Freundlich relaciona o teor de substncia em estudo que
permanece adsorvida no solo com a concentrao de substncia em estudo presente na soluo no estado de
equilbrio de dessoro (equao 16).
Para cada recipiente de ensaio, o teor de substncia que permanece adsorvida no solo no estado de equilbrio de
dessoro calculado atravs da equao:
C
des
s
eq =
m
ads
s
eq m
des
aq
eq
m
soil
(g g
-1
)
(13)
m
des
aq
eq definida como:
m
des
aq
eq = m
des
m
eq
V
0
V
F
r
m
A
aq
(g)
(14)
em que:
C
des
s
eq
= teor de substncia em estudo que permanece adsorvida no solo no estado de equilbrio de
dessoro (g g
-1
):
m
des
m
eq
= massa de substncia determinada analiticamente na fase aquosa, no estado de equilbrio de
dessoro (g);
m
A
aq
= massa de substncia em estudo remanescente do equilbrio de adsoro devido a uma substituio
incompleta de volumes (g);
m
des
aq
eq
= massa de substncia na soluo no estado de equilbrio de adsoro (g);
m
A
aq
= m
ads
aq
eq
V
0
V
R
V
0
_ _
(15)
V
F
r
= volume de soluo recolhido do recipiente para determinao da substncia em estudo, no estado de
equilbrio de dessoro (cm
3
);
V
R
= volume de sobrenadante removido do tubo ao atingir o estado de equilbrio de adsoro e substitudo
pelo mesmo volume de soluo de CaCl
2
0,01 M (cm
3
);
A equao de dessoro de Freundlich dada por (16):
C
des
s
eq = K
des
F
C
des
aq
eq
1=n
(g g
-1
)
(16)
ou, na forma linear:
logC
des
s
eq = logK
des
F
1=nlogC
des
aq
eq
(17)
em que:
K
des
F
= coeficiente de dessoro de Freundlich;
n = constante de regresso;
C
des
aq
eq
= concentrao mssica da substncia na fase aquosa, no estado de equilbrio de dessoro (g cm
-3
).
As equaes (16) e (17) podem ser representadas graficamente, calculando-se os valores de K
des
F
e l/n por
regresso linear, atravs da equao 17.
Nota:
Caso o expoente l/n da equao de adsoro ou dessoro de Freundlich seja unitrio, a constante de adsoro
ou dessoro de Freundlich (K
ads
F
e K
des
F
) igual constante de equilbrio de adsoro ou dessoro (K
d
e K
des)
,
respectivamente, sendo lineares as representaes de C
s
em funo de C
aq
. Caso os referidos expoentes sejam
diferentes de 1, a representao de C
s
versus C
aq
ser no linear, variando as constantes de adsoro e dessoro
ao longo das isotrmicas.
2.2.2. Relatrio do ensaio
Identificao completa das amostras de solo utilizadas, incluindo:
identificao geogrfica do local (latitude, longitude),
data de recolha das amostras,
perfil de utilizao do solo (por exemplo, solo agrcola, florestal, etc.),
profundidade da recolha de amostras,
teor de areia/sedimentos/argila,
valores de pH (em soluo de CaCl
2
0,01 M),
teor de carbono orgnico,
teor de matria orgnica,
teor de azoto,
razo C/N,
capacidade de permuta catinica (mmol/kg),
todas as informaes relativas recolha e armazenagem das amostras de solo,
se adequado, quaisquer informaes relevantes para a interpretao dos processos de adsoro-dessoro
da substncia em estudo,
referncia aos mtodos utilizados para a determinao de cada parmetro,
informaes adequadas sobre a substncia em estudo,
temperatura de ensaio,
condies de centrifugao,
processo analtico utilizado para a anlise da substncia em estudo,
justificao do eventual recurso a um agente de solubilizao na preparao da soluo-me da
substncia em estudo,
explicao das correces efectuadas nos clculos, se for caso disso,
dados apresentados em conformidade com o formulrio do apndice 6 e representaes grficas,
quaisquer informaes e observaes teis para a interpretao dos resultados do ensaio.
3. REFERNCIAS
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Apndice 1
Protocolo de ensaio
Apndice 2
INFLUNCIA DO RIGOR DO MTODO ANALTICO E DAS ALTERAES DE CONCENTRAO NOS
RESULTADOS DE ADSORO
A anlise do quadro infra (84) torna evidente que, caso a diferena entre a massa inicial (m
0
= 110 g) e a massa de
equilbrio (m
ads
aq
eq = 100 g] da substncia em estudo na soluo seja bastante reduzida, um erro de 5 % na determinao
da concentrao de equilbrio resulta num erro de 50 % no clculo do teor de substncia adsorvida no solo (m
ads
s
eq e de
52,4 % no clculo de K
d
.
Quantidade de solo m
solo
= 10 g
Volume de soluo V
0
=100 cm
3
m
ads
aq
eq
(g)
C
ads
aq
eq
(g cm-
3
)
R
m
ads
s
eq *
(g)
C
ads
s
eq *
(g g
-1
)
R K
d
* R
A = 9 %
m
0
=
1
1
0
g
o
u
C
0
=
1
,
1
0
0
g
/
c
m
3
100 1,000 valor real 10 1,00 valor real 1
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 %
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 %
109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %
A = 55 %
m
0
=
1
1
0
g
o
u
C
0
=
1
,
1
0
0
g
/
c
m
350,0 0,500 valor real 60,0 6,00 valor real 12,00
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 %
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 %
55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %
A = 99 %
m
0
=
1
1
0
g
o
u
C
0
=
1
,
1
0
0
g
/
c
m
3
1,100 0,011 valor real 108,9 10,89 valor real 990
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 %
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 %
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 %
onde:
*m
ads
s
eq = m
0
m
ads
aq
eq , C
ads
s
eq =
C
0
C
ads
aq
eq
_ _
V
0
m
soil
: Kd =
m
ads
s
eq
m
ads
aq
eq
V
0
m
soil
m
ads
s
eq = massa da substncia em estudo no solo, no estado de equilbrio, g
m
ads
aq
eq = massa da substncia em estudo na fase aquosa, no estado de equilbrio, g
C
ads
s
eq = teor da substncia em estudo no solo, no estado de equilbrio, g g
-1
C
ads
aq
eq = concentrao mssica da substncia em estudo na fase aquosa, no estado de equilbrio, g cm-
3
R = erro analtico na determinao de m
ads
aq
eq ;
R = erro calculado devido ao erro analtico R.
Apndice 3
TCNICAS DE ESTIMATIVA DE K
D
1. O recurso a tcnicas de estimativa permite prever o valor de K
d
com base na correlao, nomeadamente com os
valores de P
ow
(12) (39) (63-68), solubilidade em gua (12) (19) (21) (39) (68-73) ou polaridade decorrentes da anlise
por HPLC de fase reversa (74-76) Como se mostra nos quadros 1 e 2, os valores de K
oc
e K
om
so calculados com base
nas equaes que se seguem, sendo o valor de K
d
determinado de forma indirecta:
K
oc = K
d

100
%oc
cm
3
g
1
K
om =
K
d
1,724

100
%oc
cm
3
g
1

2. As referidas correlaes baseiam-se em dois pressupostos: (1) o teor de matria orgnica de um solo o principal
factor determinante da adsoro de uma substncia nesse solo: (2) as interaces envolvidas so principalmente no
polares. Em consequncia, as referidas correlaes: (1) no so aplicveis, ou apenas so parcialmente aplicveis, a
substncias polares: (2) no so aplicveis aos casos em que o teor de matria orgnica dos solos seja bastante
reduzido (12). Alm disso, embora seja possvel obter correlaes satisfatrias entre os valores de P
ow
e da adsoro
(19), o mesmo no sucede no que respeita relao entre a solubilidade em gua e a extenso da adsoro (19) (21):
os estudos realizados at ao presente tm-se revelado bastante contraditrios.
3. Os quadros 1 e 2, respectivamente, fornecem alguns exemplos de correlaes entre os coeficientes de adsoro e os
coeficientes de partio octanol-gua, bem como a solubilidade em gua.
Quadro 1.
Exemplos de correlaes entre o coeficiente de distribuio de adsoro e o coeficiente de partio octanol-
-gua: para mais exemplos, ver as referncias (12) (68)
Substncias Correlaes Autores
Diversos pesticidas log K
om
= 0,69 + 0,52 log P
ow
Briggs (1981) (39)
Compostos aromticos clo-
rados
log K
oc
= - 0,779 + 0,904 log P
ow
Chiou et al. (1983) (65)
om
= 4,4 + 0,72 log P
ow
Gerstl e Mingelgrin (1984) (66)
Hidrocarbonetos aromticos log K
oc
= - 2,53 + 1,15 log P
ow
Vowles e Mantoura (1987) (67)
Quadro 2.
Exemplos de correlaes entre o coeficiente de distribuio de adsoro e a solubilidade em gua; para mais
exemplos, ver as referncias (68) (69)
Substncias Correlaes Autores
om
= 3,8 - 0,561 log S
w
Gerstl e Mingelgrin (1984) (66)
Compostos alifticos e aro-
mticos clorados
log K
om
= (4,040 +/- 0,038) - (0,557 +/-
0,012) log S
w
Chiou et al. (1979) (70)
-naphtol logK
oc
= 4,273 - 0,686 log S
w
Hasset et al. (1981) (71)
Compostos cclicos (alifti-
cos e aromticos
logK
oc
= - 1,405 - 0,921 log S
w
-
-0,00953 (mp-25)
Karickhoff (1981) (72)
Diversas substncias log K
om
= 2,75 - 0,45 log S
w
Moreale van Blade (1982) (73)
Apndice 4
CLCULOS PARA A DEFINIO DAS CONDIES DE CENTRIFUGAO
1. O tempo de centrifugao dado pela seguinte frmula, presumindo que as partculas possuem forma esfrica:
t =
9
2
2
rp
2
s

aq
_ _
_
_
_
_
ln R
b
=R
t

(1)
Por motivos de simplificao, todos os parmetros so apresentados em unidades no pertencentes ao SI (g, cm).
=velocidade angular (=2 rpm/60), rad s
-1
;
rpm =rotaes por minuto;
=viscosidade da soluo, g s
-1
cm
-1
;
r
p
=raio das partculas, cm;
p
s
=densidade do solo, g cm
-3
;
p
aq
=densidade da soluo, g cm
-3
;
R
t
=distncia do centro do rotor da centrifugadora ao topo da soluo no tubo de ensaio, cm;
R
b
=distncia do centro do rotor da centrifugadora base do tubo de ensaio, cm;
R
b
-R
t
=altura da mistura solo/soluo no tubo de ensaio, cm.
Na prtica, devem utilizar-se tempos duplos dos calculados, de modo a garantir a separao completa.
2. A equao (1) pode ser simplificada, considerando que a viscosidade () e a densidade (p
aq
) da soluo so iguais
viscosidade e densidade da gua a 25
o
C; obtm-se, assim, n = 8,95 10
-3
g s
-1
cm
-1
and p
aq
= 1,0 g, cm
-3
.
O tempo de centrifugao dado pela frmula (2):
t =
3:7
rpm
2
:r
2
p

s
l
_ _ln
Rb
Rt
(2)
3. A equao 2 mostra a importncia de dois parmetros, designadamente o tempo (t) e a velocidade (rpm), na definio
das condies de centrifugao tendo cm vista a separao de partculas de dimenses especficas (no caso em estudo
0,1 um radianos): (1) a densidade do solo e (2) a altura da mistura no tubo de ensaio (R
b
-R
t
), ou seja, a distncia entre o
topo da soluo e a base do tubo; como bvio, para um determinado volume, a altura da mistura no tubo depende
do quadrado do respectivo raio.
4. A figura 1 apresenta o grfico da variao do tempo de centrifugao (t) em funo da velocidade de centrifugao
(rpm), para solos de densidades diversas (p
s
) (fig. 1a) e diversas alturas da mistura nos tubos de ensaio (fig. lb). A figura
1a evidencia a influncia da densidade do solo; por exemplo, para um perfil de centrifugao clssico de 3 000 rpm o
tempo de centrifugao da ordem de 240 minutos para um solo de 1,2 g cm
3
de densidade, sendo de apenas
50 minutos para uma densidade de 2,0 g cm
3
. Do mesmo modo, a figura lb mostra que, para um perfil de
centrifugao clssico de 3 000 rpm o tempo de centrifugao de cerca de 50 minutos para uma altura da mistura
de 10 cm e apenas 7 minutos para uma altura de 1 cm. Todavia, conveniente adoptar um equilbrio adequado entre
o requisito de menor altura possvel na centrifugao e a facilidade de manipulao pelo experimentador na separao
das fases aps a centrifugao.
5. Alm disso, na definio das condies experimentais para a separao de fases solo/soluo conveniente ter em
conta a possvel existncia de uma pseudofase coloidal. As partculas coloidais, de dimetro inferior a 0,2 m,
podem apresentar um impacto considervel no mecanismo de adsoro de uma substncia numa suspenso de solo.
Sempre que se executa uma centrifugao do modo descrito supra, os colides permanecem na fase aquosa, sendo
objecto de anlise juntamente com esta ltima. Perdem-se, pois, as informaes referentes ao seu impacto.
Caso o laboratrio possua condies para efectuar ultracentrifugao ou ultrafiltrao, a adsoro/dessoro de uma
substncia no solo pode ser estudada de modo mais aprofundado, permitindo obter informaes sobre a adsoro da
substncia nos colides. Neste caso, deve efectuar-se uma ultracentrifugao a 60 000 rpm/minuto ou uma
ultrafiltrao com um filtro de 100 000 Daltons de porosidade, de modo a separar as trs fases (solo, colides,
soluo). O protocolo de ensaio deve tambm ser alterado de modo a assegurar a determinao da substncia em
estudo nas trs fases.
Fig. 1a.
Variao do tempo de centrifugao (t) em funo da velocidade de centrifugao (rpm), para
solos de diversas densidades (
s
). R
t
= 10 cm, R
b
-R
t
= 10 cm, = 8,95 10
-3
g s
-1
cm
-1
e
aq
=
1,0 g.cm
-3
a 25
o
C.
Fig. lb.
Variao do tempo de centrifugao (t) em funo da velocidade de centrifugao (rpm) para
diversas alturas da mistura nos tubos de ensaio (R|,-R,) - L; R
t
= 10 cm, = 8,95 10
-3
g s
-1
cm
-
-1
,
aq
= 1,0 g.cm
-3
a 25
o
C e
s
= 2,0 g cm
-3
.
Apndice 5
CLCULO DA ADSORO A ( %) E DA DESSORO D ( %)
O esquema cronolgico do ensaio o seguinte:
Em todos os clculos, presume-se que a substncia de ensaio estvel e no exibe uma adsoro significativa nas paredes do
recipiente.
ADSORO A (A %)
a) Mtodo paralelo
Para cada tubo de ensaio (i), a percentagem de adsoro em cada instante (t
j
) calculada de acordo com a equao:
A
ti
=
m
ads
s
t
i
100
m
0
(%)
(1)
Os termos da equao podem ser calculados do seguinte modo:
m
0
= C
0
V
0
(g) (2)
m
ads
s
t
i
= m
0
C
ads
aq
t
i
V
0
(g)
(3)
em que:
A
ti
= percentagem de adsoro ( %) no instante t
j
;
m
ads
s
t
i

= massa da substncia em estudo presente no solo no instante t
j
em que a anlise efectuada (g)
m
0
= massa da substncia em estudo presente no tubo de ensaio no incio do mesmo (g)
C
0
= concentrao ponderal inicial da soluo em contacto com o solo (g cm
-3
)
C
ads
aq
t
i

= concentrao ponderal da substncia na fase aquosa no instante t
i
em que a anlise efectuada (g cm
-3
): a
determinao analtica desta concentrao tem em conta os valores obtidos nos ensaios em branco.
V
0
= volume inicial de soluo em contacto com o solo (cm
3
).
Os valores relativos percentagem de adsoro A
tj
ou C
ads
aq
t
j
_ _
so representados graficamente em funo do tempo,
determinando-se o tempo necessrio para atingir o estado de equilbrio. As figuras 1 e 2, respectivamente, fornecem
exemplos das representaes em causa.
Figura 1.
Representao grfica do equilbrio de adsoro
Fig. 2.
Concentrao mssica da substncia em estudo na fase aquosa (C
aq
) em funo do tempo
b) Mtodo sequencial
As equaes que se seguem tm em considerao o facto de o ensaio de adsoro se basear em determinaes da
substncia em estudo em pequenas alquotas da fase aquosa, a intervalos especficos.
A quantidades de substncia adsorvida no solo em cada intervalo calculada do seguinte modo:
princiro intervalo t
1
= t
1
- t
0
m
ads
s
t
1
= m
0
m
ads
m
t
1

V
0
v
A
a
_ _
(4)
segundo intervalo t2 = t
2
- t
1
m
ads
s
t
2
= m
ads
m
t
1

V
0
v
A
a
_ _
m
ads
m
t
2

V
0
v
A
a
v
A
a
_ _
(5)
terceiro intervalo t3 = t
3
t
2
m
ads
s
t
3
= m
ads
m
t
2

V
0
v
A
a
v
A
a
_ _
m
ads
m
t
3

V
0
2 v
A
a
v
A
a
_ _
(6)
ensimo intervalo tn = t
n
t
n-1
m
ads
s
t
n
= m
ads
m
t
n 1

V
0
n 2 v
A
a
v
A
a
_ _
m
ads
m
t
n

V
0
n 1 v
A
a
_ _
v
A
a
_
_
_
_
(7)
A percentagem de adsoro em cada intervalo, A
ti
, calculada por recurso seguinte equao:
A
ti
=
m
ads
s
t
i

m
0
100 (%)
(8)
enquanto que a percentagem de adsoro A
ti
no instante t
i
dada por:
A
ti
=
t
i
j = t1
m
ads
s
j
m
0
100 (%)
(9)
Os valores correspondentes adsoro, A
ti
ou A
ti
(de acordo com o objectivo do estudo) so representados
graficamente em funo do tempo, determinando-se o tempo necessrio para atingir o estado de equilbrio.
No instante de equilbrio t
eq
:
a massa de substncia em estudo adsorvida no solo dada por:
m
ads
s
eq =
n
ti = 1
m
ads
s
t
i

(10)
a massa de substncia em estudo na soluo dada por:
m
ads
aq
eq = m
0

n
ti = 1
m
ads
s
t
i

(11)
a percentagem de adsoro no estado de equilbrio calculada com base na equao:
A
eq =
m
ads
s
eq
m
0
100 (%)
(12)
Os parmetros utilizados so definidos do seguinte modo:
m
ads
s
t
1
, m
ads
s
t
2
, :::, m
ads
s
t
n

= massa de substncia adsorvida no solo nos intervalos
t1
,
t2
,...,
tn
respectivamente (g);
m
ads
m
t
1
, m
ads
m
t
2
, :::, m
ads
n
t
n

= massa de substncia em estudo determinada numa alquota v
A
a
nos intervalos
t
1
, t
2
,t
n
m
ads
s
eq
= massa de substncia adsorvida no solo no estado de equilbrio de adsoro (g);
m
ads
aq
eq
= massa de substncia presente na soluo no estado de equilbrio de adsoro
(g);
v
A
a
= volume da alquota em que se determina a substncia em estudo (cm
3
);
A
ti
= percentagem de adsoro correspondente ao intervalo t
i
( %);
A
eq
= percentagem de adsoro no estado de equilbrio de adsoro ( %).
DESSORO D ( %)
Considera-se que o ensaio de cintica de dessoro tem incio no instante t
0
em que o volume mximo recuperado da
soluo da substncia em estudo (aps atingir o equilbrio de adsoro) substitudo pelo mesmo volume de soluo de
CaCl
2
, 0,01 M.
a) Mtodo paralelo
Num determinado instante t
i
, determina-se a massa da substncia em estudo presente na fase aquosa recolhida do
tubo i (V
i
r
), calculando-se a massa dessorvida de acordo com a equao:
m
des
aq
t
i
= m
des
m
t
i

V
0
v
i
r
_ _
m
A
aq
(13)
No estado de equilbrio de dessoro, t
i
= t
eq
e, portanto, m
des
aq
t
i
= m
des
aq
eq
A massa de substncia em estudo dessorvida no intervalo At
i
dada pela equao:
m
des
aq
t
i
= m
des
aq
t
i

i = 1
j = 1
m
des
aq
j
(14)
A percentagem de dessoro calculada do seguinte modo:
num instante t
i
, com base na equao:
D
ti
=
m
des
aq
t
i

m
ads
s
eq
100 (%)
(15)
num intervalo At
i
, com base na equao:
D
ti
=
m
des
aq
t
i

m
ads
s
eq
100 (%)
(16)
em que:
D
ti
= percentagem de dessoro no instante t
i
(%);
D
ti
= percentagem de dessoro correspondente ao intervalo t
i
(%);
m
des
aq
t
1

= massa de substncia em estudo dessorvida no instante t
i
, (g);
m
des
aq
t
1

= massa de substncia em estudo dessorvida no intervalo t
i
(g);
m
des
m
t
i

= massa de substncia em estudo determinada analiticamente no instante t
i
num volume V
i
r
,de soluo
recolhida para anlise (g);
m
A
aq
= massa de substncia em estudo excluda do equilbrio de adsoro devido a substituio incompleta de
volumes (g).
m
A
aq
= m
ads
aq
eq
V
0
V
R
V
0
_ _
(17)
m
ads
aq
eq
= massa de substncia em estudo presente na soluo no estado equilbrio de adsoro (g).
V
R
= volume de sobrenadante removido do tubo depois de atingido o estado de equilbrio de adsoro e
substitudo pelo mesmo de soluo de CaCl
2
0,01 M (cm
3
):
V
i
r
= volume de soluo recolhido do tubo (i) para a determinao da substncia em estudo, no ensaio de
cintica de dessoro (cm
3
)
Os valores correspondentes dessoro D
t
i or D
t
i (de acordo com o objectivo do estudo) so representados
graficamente em funo do tempo, determinando-se o tempo necessrio para atingir o estado de equilbrio.
b) Mtodo sequencial
As equaes que se seguem tm em considerao o facto de o ensaio de adsoro precedente se basear em
determinaes da substncia em estudo em pequenas alquotas ( v
A
a
_ _
) da fase aquosa (mtodo sequencial descrito na
seco 1.9. Realizao do ensaio). Presume-se que: a) o volume de sobrenadante removido do tubo na sequncia do
ensaio de cintica de adsoro foi substitudo pelo mesmo volume de soluo de CaCl
2
0,01 M (V
R
); e b) o volume
total da fase aquosa em contacto com o solo (V
T
) durante o ensaio de cintica de dessoro permanece constante,
sendo dado pela equao:
V
T = V
0

n
i = 1
v
A
a
i
(18)
Num determinado instante t
i
:
Determina-se a massa da substncia em estudo presente numa pequena alquota ( v
D
a
_ _
), calculando-se a massa
dessorvida de acordo com a equao:
m
des
aq
t
i
= m
des
m
t
i

V
T
v
D
a
_ _
m
A
aq
V
T
i 1 v
D
a
_ _
V
T
_ _
(19)
No estado de equilbrio de dessoro t
i
= t
eq
e, portanto, m
des
aq
t
i
= m
des
aq
eq .
A percentagem de dessoro D
ti
calculada por recurso equao:
D
ti
=
m
des
aq
t
i

m
ads
s
eq
100 (%)
(20)
Num intervalo (t
i
):
A quantidade de substncia dessorvida em cada intervalo calculada do seguinte modo:
primeiro intervalo t
i
= t
1
-t
0
m
des
aq
t
1
= m
des
m
t
1

V
T
v
D
a
_ _
m
A
aq
and m
des
s
t
1
= m
aq
s
eq m
des
aq
t
1

(21)
segundo intervalo t
i
= t
2
-t
1
m
des
aq
t
2
= m
des
m
t
2

V
T
v
D
a
_ _
m
des
aq
t
1

V
T
v
D
a
_ _
V
T
_ _
m
A
aq

V
T
v
D
a
_ _
V
T
_ _
and
m
des
s
t
2
= m
ads
s
eq m
des
aq
t
1
m
des
aq
t
2

_ _
(22)
ensimo intervalo t
n
= t
n
-t
n-1
m
des
aq
t
n
= m
des
m
t
n

V
T
v
D
a
_ _
m
A
aq

V
T
n 1 v
D
a
_ _
V
T
_ _

n 1
i = 1,n1
V
T
n i v
D
a
_ _
V
T
m
des
aq
t
i

_ _ _ _
and
m
des
s
t
n
= m
ads
s
eq
n
i = 1,n1
m
des
aq
t
i

(23)
Por fim, a percentagem de dessoro em cada intervalo, D
ti
, calculada por recurso seguinte equao:
D
ti
=
m
des
aq
t
i
m
ads
s
eq
100%
(24)
enquanto que a percentagem de dessoro D
ti
no instante t
i
dada por:
D
ti
ti
j = t1
m
des
aq
j
m
ads
s
eq
100 =
m
des
aq
t
i
m
ads
s
eq
100%
(25)
os parmetros supra so definidos do seguinte modo:
m
des
s
t
1
, m
des
s
t
2
,... , m
des
s
t
n
= massa de substncia que permanece adsorvida no solo nos intervalos t

1
,
t
2
,..., t
n
m
des
aq
t
1
, m
des
aq
t
2
,... , m
des
aq
t
n
= massa de substncia em estudo dessorvida nos intervalos t

1
, t
2
,..., t
n
m
des
m
t
1
, m
des
m
t
2
,... , m
des
m
t
n
= massa de substncia determinada numa alquota v

D
a
_ _
nos instantes t
1
,t
2
,..., t
n
,
V
T
= volume total da fase aquosa em contacto com o solo durante o ensaio de
cintica de dessoro efectuado pelo mtodo sequencial (cm
3
);
m
A
aq
= massa de substncia em estudo excludo do equilbrio de adsoro devido a
substituio incompleta de volumes (g)
m
A
aq
=
V
0

n
i = 1
v
A
a
i
_ _
V
R
V
0

n
i = 1
v
A
a
i
_ _
_
_
_
_
_
_
_
_
m
ads
aq
eq (26)
V
R
= volume de sobrenadante removido do tubo aps atingir o estado de equilbrio
de adsoro e substitudo pelo mesmo volume de soluo de CaCl
2
0,01 M
(cm
3
)
v
D
a
= volume da alquota recolhida do tubo para fins analticos (i), durante o ensaio
de cintica de dessoro efectuado pelo mtodo sequencial (cm
3
);
v
D
a
0,02 V
T
(27)
Apndice 6
ADSORO-DESSORO EM SOLOS: FICHA DE APRESENTAO DOS RESULTADOS
Substncia ensaiada:
Solo ensaiado:
Massa seca do solo (105
o
C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %
Temperatura:
o
C
Adequabilidade do mtodo analtico
Massa da amostra de solo g
Massa seca de solo g
Volume de soluo de CaCl
2
cm
3
Concentrao nominal final da soluo g cm
-3
Concentrao analtica final da soluo g cm
-3
Princpio do mtodo analtico utilizado:
Calibrao do mtodo analtico:
Substncia ensaiada:
Solo ensaiado:
o
C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
o
C
Metodologia analtica adoptada: Mtodo
indirecto
Mtodo
paralelo
Mtodo
sequencial
Mtodo
directo
Ensaio de adsoro: amostras

Smbolo Unidades
Tempo neces-
srio para
atingir o equi-
lbrio
Tempo neces-
srio para
atingir o equi-
lbrio
Tempo neces-
srio para
atingir o equi-
lbrio
Tempo necess-
rio para atingir o
equilbrio
Tubo n.
o
Solo: massa determinada g
Solo: massa seca m
solo
g
Volume calculado de humidade
no solo
V
ws
cm
3
Smbolo Unidades
Tempo neces-
srio para
atingir o equi-
lbrio
Tempo neces-
srio para
atingir o equi-
lbrio
Tempo neces-
srio para
atingir o equi-
lbrio
Tempo necess-
rio para atingir o
equilbrio
2
0,01 M necessrio para equili-
brar o solo
cm
3
Volume de soluo-me cm
3
Volume total da fase aquosa em
contacto com o solo
v
0
cm
3
Concentrao inicial da soluo
de ensaio
c
0
g cm
3
Massa de substncia em estudo
no incio do ensaio
m
0
g
Aps agitao e centrifugao
MTODO INDIRECTO
Mtodo paralelo
Concentrao da substncia em
estudo na fase aquosa,
incluindo d correco deco-
rrente do ensaio em branco
C
ads
aq
t
i
g cm
-3
Mtodo sequencial
Massa de substncia em estudo
determinada na alquota V
A
a
m
ads
m
t
i
g
MTODO DIRECTO
Massa da substncia em estudo
adsorvida no solo
m
ads
s
t
i
g
Clculo da adsoro
Adsoro A
ti
%
A
ti
%
Mtodo
Coeficiente de adsoro K
d
cm
3
g
-1
Mtodo
Coeficiente de adsoro K
oc
cm
3
g
-1
Mtodo
Substncia ensaiada:
Solo ensaiado:
Massa seca de solo (105
o
C, 1 2 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
o
C
Adsoro: ensaios em branco e de controlo
Sm-
bolo
Unidades Branco Branco Controlo
Tubo n.
o
Massa da amostra de solo g 0 0
Teor de humidade calculado no solo cm
3

2
0,01 M
adicionado
cm
3
Volume de soluo-me da substncia
em estudo adicionado
cm
3
0 0
Volume total da fase aquosa (calcu-
lado)
cm
3

Concentrao inicial da substncia em
estudo na fase aquosa
g cm
-3
Concentrao da fase aquosa g cm
-3
Nota: Aditar colunas suplementares, se necessrio.
Substncia ensaiada:
Solo ensaiado:
o
C, 1 2 h): %
Temperatura:
o
C
Balano de massas
Smbolo
Unida-
des
Tubo n.
o
Massa seca de solo m
solo
g
Volume de gua calculado no solo V
WS
ml
2
0,01 M
necessrio para equilibrar o solo
ml
Volume de soluo-me cm
3
Volume total de fase aquosa em contacto
com o solo
v
0
cm
3
Concentrao inicial da soluo de ensaio C
0
g cm
-3
Tempo necessrio para atingir o equilbrio h
Concentrao da substncia em estudo na
fase aquosa no estado de equilbrio de
adsoro, incluindo a correco decorrente
do ensaio em branco
C
ads
aq
eq
g cm
3
Tempo necessrio para atingir o equilbrio t
eq
h
Primeira diluio com solvente
Volume de fase aquosa removido V
rec
cm
3
Volume de solvente adicionado V cm
3
Primeira extraco com solvente
Intensidade do sinal do detector (solvente) s
EI
var.
Concentrao da substncia em estudo no
solvente
C
EI
g cm
-3
Massa de substncia extrada do solo e das
paredes do recipiente
m
E1
g
Segunda diluio com solvente com solvente
Volume de solvente removido V
s
cm
3
Volume de solvente adicionado V' cm
3
Segunda extraco com solvente
intensidade do sinal do detector (solvente) S
E2
var.
Concentrao da substncia em estudo no
solvente
C
E2
g cm
-3
Massa de substncia extrada do solo e das
paredes do recipiente
m
E2
g
Massa total de substncia em estudo
extrada nas duas etapas
m
E
g
Balano de massas MB %
Substncia ensaiada:
Solo ensaiado:
Massa seca de solo (105
o
C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
o
C
Isotrmicas de adsoro
Smbolo
Unida-
des
Tubo n.
o
Massa seca de solo E g
Smbolo
Unida-
des
Volume de gua calculado no
solo
V
ws
cm
3
2
0,01 M necessrio para equili-
brar o solo
cm
3
Volume de soluo-me adi-
cionado
cm
3
Volume total de fase aquosa
em contacto com o solo
(calculado)
v
0
cm
3
Concentrao da soluo C
0
g cm
3
Tempo necessrio para atingir
o equilbrio
h
Concentrao da substncia na
fase aquosa, incluindo a cor-
reco decorrente do ensaio
em branco
C
ads
aq
eq
g cm
-3
Temperatura
o
C
Massa adsorvida por unidade
de solo
C
ads
s
eq
g g
-1
Anlise por regresso linear:
valor de KK
F
ads
:
valor de l/n:
coeficiente de regresso r
2
:
Substncia ensaiada:
Solo ensaiado:
o
C, 1 2 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
o
C
Metodologia analtica adoptada: Mtodo
indirecto
Mtodo
paralelo
Mtodo
sequencial
Ensaio de dessoro
Smbolo Unidades Intervalo Intervalo Intervalo Intervalo
Nmero do tubo no ensaio de adsoro
Massa de substncia adsorvida no solo
no estado de equilbrio de adsoro
m
ads
s
eq
g
Volume de fase aquosa removido e
substitudo por soluo de CaCl
2
0,01
M
V
R
cm
3
Volume total de fase
aquosa em contacto com
o solo
PM V
0
cm
3
SM V
T
cm
3
Smbolo Unidades Intervalo Intervalo Intervalo Intervalo
Massa de substncia em estudo excluda
do equilbrio de adsoro devido a
substituio incompleta de volumes
m
A
aq
g
Cintica de dessoro
Massa determinada de substncia des-
sorvida do solo no instante t
i
m
des
m
t
i
g
Volume de soluo reco-
lhida do tubo (i) para
determinao da substn-
cia em estudo
PM V
f
i
cm
3
SM v
a
A
cm
3
Massa de substncia dessorvida do solo
no instante t
i
(calculada)
m
des
aq
t
i
g
Massa de substncia dessorvida do solo
no intervalo t
i
(calculada)
m
des
aq
t
i
g
Percentagem de dessoro
Dessoro no instante t
i
D
ti
%
Dessoro no intervalo t
i
D
ti
%
Coeficiente de dessoro aparente K
des
PM: Mtodo paralelo
SM: Mtodo sequencial
C.19. ESTIMATIVA DO VALOR DO COEFICIENTE DE ADSORO (K
OC
) EM SOLOS E EM LAMAS DE
DEPURAO POR CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (HPLC)
1. MTODO
1.1. INTRODUO
O comportamento absortivo e/ou adsortivo das substncias presentes em solos ou lamas de depurao pode
ser descrito por meio de parmetros determinados experimentalmente, atravs do mtodo de ensaio C 18. O
coeficiente de adsoro um parmetro importante, definido como a razo entre a concentrao da substncia
no solo/lamas e a concentrao da substncia na fase aquosa, em condies de equilbrio de adsoro. O
coeficiente de adsoro normalizado para o teor de carbono orgnico no solo (K
oc
), um indicador til da
capacidade de ligao de um composto qumico matria orgnica presente no solo e nas lamas de depurao,
permitindo que se estabeleam comparaes entre os diferentes compostos qumicos. Este parmetro pode ser
estimado atravs de correlaes com a solubilidade em gua e com o coeficiente de partio n-octanol/gua (1)
(2) (3) (4) (5) (6) (7).
O mtodo experimental descrito no presente ensaio utiliza a tcnica HPLC para estimar o coeficiente de
adsoro K
oc
em solos e em lamas de depurao (8). Os valores estimados so mais fiveis que os obtidos
atravs do mtodo de clculos QSAR (quantitative structure-activity relationships, relaes quantitativas
estrutura/actividade) (9). Por se tratar de um mtodo estimativo, o presente mtodo experimental no pode
substituir completamente as experincias em reactor descontnuo que so utilizadas no mtodo de ensaios C l8.
No entanto, o valor estimado para K
oc
pode ser til na escolha dos parmetros de ensaio adequados para
estudos de adsoro/dessoro de acordo com o mtodo de ensaios C l8, atravs do clculo de K
d
(coeficiente
de distribuio) ou de K
l
(coeficiente de adsoro de Freundlich), segundo a equao 3 (ver ponto 1.2).
1.2. DEFINIES
K
d
: coeficiente de distribuio. Este coeficiente definido como a razo entre as concentraes de equilbrio (C),
de uma substncia de ensaio dissolvida num sistema bifsico constitudo por um componente com
comportamento absortivo e/ou adsortivo (solo ou lamas de depurao) e uma fase aquosa. Esta grandeza
adimensional quando as concentraes em ambas as fases so expressas em peso/peso. No caso da
concentrao da fase aquosa ser expressa em peso/volume, as unidades utilizadas so ml.g
-1
. O valor de K
d
pode
variar com as propriedades do componente com comportamento absortivo e/ou adsortivo, assim como
depender da sua concentrao.
K
d =
C
soil
C
aq
or
C
sludge
C
aq
(1)
em que:
C
solo
= concentrao da substncia de ensaio no solo, no equilbrio (g g
-1
)
C
lamas
= concentrao da substncia de ensaio nas lamas, no equilbrio, (g g
-1
)
C
aq
= concentrao da substncia de ensaio na fase aquosa, no equilbrio (g g
-1
, g ml
-1
).
K
f
: coeficiente de adsoro de Freundlich. Este coeficiente definido como a concentrao da substncia de
ensaio no solo ou nas lamas de depurao (x/m) quando a concentrao de equilbrio na fase aquosa (C
aq
)
igual a um. Esta grandeza expressa em g g
-1
de componente com comportamento absortivo e/ou
adsortivo. O valor de K
f
pode ser afectado pelas propriedades desse componente.
log
x
m
= logK
f

1
n
logC
aq
(2)
em que:
x/m = quantidade da substncia de ensaio x (g) adsorvida numa quantidade m (g) de componente com
comportamento absortivo e/ou adsortivo, no equilbrio
l/n = declive da isotrmica de adsoro de Freundlich
C
aq
= concentrao da substncia de ensaio na fase aquosa, no equilbrio (g ml
-1
)
AtC
aq = 1; logK
f
= log
x
m
K
oc
: coeficiente de distribuio (K
d
) ou coeficiente de adsoro de Freundlich (K
f
) normalizados para o teor de
carbono orgnico (f
oc
), de um componente com comportamento absortivo e/ou adsortivo. Esta grandeza um
indicador adequado do grau de adsoro entre a substncia e o componente com comportamento absortivo e/
/ou adsortivo, principalmente no caso de compostos qumicos no ionizados, permitindo que sejam feitas
comparaes entre diferentes compostos qumicos. Dependendo das unidades de K
d
ou de K
f
, o K
oc
pode ser
adimensional ou expresso em ml g
-1
or g g
-1
de matria orgnica:
Koc =
Kd
foc
adimensional ou mlg
1
_ _
or
Kf
foc
gg
1

(3)
Embora a relao entre K
oc
e K
d
no seja sempre linear, pelo que os valores de K
oc
podem variar de solo para
solo, esta variabilidade significativamente reduzida comparativamente registada para os valores de K
d
ou K
f
,
O coeficiente de adsoro (K
oc
) deduzido a partir do factor de capacidade (k
1
), utilizando uma curva de
calibrao de log k
1
em funo de log K
oc
dos compostos de referncia seleccionados.
k
0
=
t
R
t
0
t
0
(4)
em que:
t
R
= tempo de reteno em HPLC da substncia de ensaio e da substncia de referncia (em minutos)
t
0
= tempo-limite em HPLC (minutos) (ver ponto 1.8.2).
P
OW
: coeficiente de partio octanol-gua. Este coeficiente define-se como a razo entre as concentraes da
substncia dissolvida em n-octanol e em gua. Trata-se de uma grandeza adimensional
Pow=
Coctanol
Caq
= Kow
(5)
Antes da utilizao do mtodo, necessrio conhecer a frmula estrutural, o grau de pureza e a constante de
dissociao (caso seja adequado). Ser til dispor de informaes relativas solubilidade em gua e em
solventes orgnicos, ao coeficiente de partio octanol-gua e s caractersticas de hidrlise.
De forma a correlacionar os valores de reteno, medidos em HPLC, de uma substncia de ensaio com o seu
coeficiente de adsoro, K
oc
, dever ser traada uma curva de calibrao de log K
oc
em funo de log k
1
.
Devero ser utilizados, no mnimo, seis valores de referncia, dos quais pelo menos um dever estar acima e
outro abaixo do valor esperado para a substncia de ensaio. O grau de exactido do mtodo ser melhorado
significativamente se forem utilizadas substncias de referncia estruturalmente relacionadas com a substncia
de ensaio. Caso estes dados no estejam disponveis, cabe ao analista seleccionar as substncias de calibrao
adequadas. Nesse caso, dever ser escolhido um conjunto mais abrangente de substncias, estruturalmente
heterogneas. Nas tabelas 1 e 3 do apndice apresentam-se listas das substncias e valores de K
oc
que podem ser
utilizados para as lamas de depurao e para os solos, respectivamente. A seleco de outras substncias de
calibrao dever ser devidamente justificada.
O HPLC realizado em colunas analticas com enchimento de cianopropilo comercial em fase slida contendo
grupos lipoflicos e grupos polares. E utilizada uma fase estacionria com polaridade moderada baseada numa
matriz de slica.
O S CH
2
CH
2
CH
2
CN
slica espaador apolar grupo polar
O princpio do mtodo de ensaio semelhante ao utilizado no mtodo de ensaio A.8 (coeficiente de partio,
mtodo de HPLC). A substncia de ensaio interage com a fase estacionria ao passar pela coluna juntamente
com a fase mvel, sendo retardada em resultado da partio entre as fases mvel e estacionria. A composio
mista da fase estacionria, que contm grupos polares e grupos apoiares, permite que a interaco dos grupos
polares e apoiares de determinada molcula ocorra de forma semelhante que se verifica com a matria
orgnica em matrizes de solo ou de lamas de depurao, possibilitando o estabelecimento de uma relao entre
o tempo de reteno na coluna e o coeficiente de adsoro matria orgnica.
O pH tem uma influncia significativa no comportamento absortivo e/ou adsortivo, sobretudo no caso de
substncias polares. Em solos agrcolas ou em tanques de estaes de tratamento de guas residuais, o pH varia
normalmente entre 5,5 e 7,5. Relativamente a substncias ionizveis, devero ser efectuados dois ensaios, um
com a forma ionizada e outro com a forma no ionizada em solues tampo adequadas, apenas nos casos em
que pelo menos 10 % do composto de ensaio se encontre dissociado a pH entre 5,5 e 7,5.
Uma vez que, para avaliar os resultados, utiliza-se apenas a relao entre a reteno na coluna de HPLC e o
coeficiente de adsoro, no necessrio utilizar qualquer mtodo quantitativo, determinar o tempo de
reteno. Caso se disponha de um conjunto adequado de substncias de referncia e estejam estabelecidas
condies experimentais-padro, o presente mtodo constitui um modo rpido e eficaz para estimar o valor do
coeficiente de adsoro K
oc
.
O mtodo de HPLC aplicvel a substncias qumicas (marcadas ou no) para as quais exista um sistema de
deteco adequado (por exemplo, espectrofotmetro, detector de radioactividade) e que sejam suficientemente
estveis durante o perodo de ensaio. O mtodo pode ser particularmente til no caso de produtos qumicos
que sejam difceis de estudar com outros sistemas experimentais (ou seja, substncias volteis, substncias que
no so solveis em gua em concentraes que possam ser determinadas analiticamente, substncias que
apresentem uma elevada afinidade para a superfcie dos sistemas de incubao). O mtodo pode ser utilizado
para misturas que apresentam bandas de eluio no resolvidas. Nesse caso, devem ser referidos os limites
superior e inferior dos valores de log K
oc
dos compostos presentes na mistura de ensaio.
As impurezas podem por vezes representar um problema para a interpretao dos resultados de HPLC. No
entanto, a sua influncia pode ser minimizada se a substncia de ensaio puder ser inequivocamente identificada
pelo mtodo analtico e separada das impurezas.
O presente mtodo encontra-se validado para as substncias descritas na tabela 1 do apndice, tendo sido
igualmente aplicado a uma srie de outros compostos qumicos pertencentes s seguintes famlias de
compostos:
aminas aromticas (por exemplo, trifluralina, 4-cloroanilina, 3,5-dinitroanilina, 4-metilanilina,
N-metilanilina, l-naftilamina),
steres de cidos carboxlicos aromticos (por exemplo, ster metlico do cido benzico, ster etlico do
cido 3,5-dinitrobenzico),
hidrocarbonetos aromticos (por exemplo, tolueno, xileno, etilbenzeno, nitrobenzeno),
steres do cido ariloxifenoxipropinico (por exemplo, diclofop-metilo, fenoxaprop-etilo, fenoxaprop-P-
-etilo),
fungicidas benzimidazlicos e imidazlicos (por exemplo, carbendazim, fuberidazol, triazxido),
amidas de cidos carboxlicos (por exemplo, 2-clorobenzamida, N,N-dimetilbenzamida, 3,5-dinitroben-
zamida, N-metilbenzamida, 2-nitrobenzamida, 3-nitrobenzamida),
hidrocarbonetos clorados (por exemplo, endosulfan, DDT, hexaclorobenzeno, quintozeno, 1.2.3-
-triclorobenzeno),
insecticidas organo-fosforados (por exemplo, azinfos-metilo, dissulfoto, fenamifos, isofenfos, pirazofos,
sulprofos, triazofos),
fenis (por exemplo, fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentaclorofenol, 2,4,6-triclorofenol, 1-naftol),
derivados da fenilureia (por exemplo, isoproturo, monolinuro, pencicuro),
corantes (por exemplo, Amarelo Acido 219, Azul Bsico 41, Vermelho Directo 81),
hidrocarbonetos poliaromticos (por exemplo, acenafteno, naftaleno),
herbicidas do tipo 1,3,5-triazina (por exemplo, prometrino, propazina, simazina, terbutrina),
derivados de triazole (por exemplo, tebuconazole, triadimefona, tradimenol, triapentenol).
O presente mtodo no aplicvel a substncias que reajam com o eluente ou com a fase estacionria nem a
substncias que interajam de forma especfica com componentes inorgnicos (por exemplo, formao de
agregados de complexos com minerais argilosos). O presente mtodo pode no ser adequado para a anlise de
surfactantes, compostos inorgnicos ou cidos e bases moderadamente fortes ou fortes. O presente mtodo
permite determinar valores de log K
oc
entre 1,5 e 5,0. Na medio de substncias ionizveis deve utilizar-se
uma fase mvel tamponada, sendo necessrio tomar precaues de modo a evitar a precipitao dos
componentes do tampo ou da substncia de ensaio.
1.6.1. Exactido
De um modo geral, o coeficiente de adsoro de uma substncia de ensaio pode ser estimado com uma
margem de erro de 0,5 unidades de logaritmo, relativamente ao valor determinado em reactor descontnuo
(ver tabela 1 do apndice). Poder obter-se um grau de exactido superior se se utilizarem substncias de
referncia estruturalmente relacionadas com a substncia de ensaio.
Cada determinao deve ser feita pelo menos em duplicado. Os valores de log K
oc
obtidos em cada medio
devem encontrar-se numa gama de 0,25 unidades de logaritmo.
1.6.3. Reprodutibilidade
A experincia obtida at ao momento com a aplicao do presente mtodo suporta a sua validade. Numa
anlise do mtodo de HPLC, realizada com 48 substncias (pesticidas, na sua maior parte) relativamente s
quais existiam valores fiveis de K
oc
em solos, o coeficiente de correlao obtido foi de R = 0,95 (10) (11).
De modo a melhorar e validar o presente mtodo, foi efectuado um ensaio comparativo interlaboratorial no
qual participaram 11 laboratrios (12). Os resultados desse ensaio so apresentados na tabela 2 do apndice.
1.7.1. Estimativa preliminar do coeficiente de adsoro
O coeficiente de partio octanol-gua P
ow
(= K
ow
), assim como, em certa medida, a solubilidade em gua,
podem ser utilizados como indicadores da extenso da adsoro, em particular para substncias no ionizveis,
podendo assim ser utilizados numa primeira aproximao com vista a determinar a gama de variao do valor
do coeficiente de adsoro. Relativamente a vrios grupos de compostos qumicos. Tm sido publicadas uma
srie de correlaes teis relativamente a vrios grupos de compostos qumicos (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
1.7.2. Equipamento
necessrio um cromatgrafo de fase lquida equipado com uma bomba de pulsao livre e um equipamento
de deteco adequado. Recomenda-se a utilizao de uma vlvula de injeco com ciclos de injeco. Devero
ser utilizadas resinas comerciais de cianopropilo quimicamente ligado a uma base de slica (por exemplo,
Hypersil e Zorbax CN). Poder interpor-se uma coluna de proteco do mesmo material entre o sistema de
injeco e a coluna analtica. A eficincia de separao das colunas poder variar substancialmente em funo
do fabricante. Como referncia, relativamente aos factores de capacidade k' devero ser atingidas os seguintes
valores: log k' > 0,0 para log K
oc
= 3,0 e log k' > 0,4 para log K
oc
= 2,0, quando se utiliza uma fase mvel de
metanol/gua nas propores de 55/45 %.
1.7.3. Fases mveis
Foram ensaiadas diversas fases mveis, sendo recomendadas as duas seguintes:
metanol/gua (55/45 % v/v),
metanol/0,01 M tampo citrato pH 6,0 (55/45 % v/v).
Na preparao do solvente de eluio, deve utilizar-se metanol com grau de pureza para HPLC e gua destilada
ou tampo citrato. Os gases da mistura devem ser eliminados antes da sua utilizao. Deve utilizar-se uma
eluio isocrtica. Se o uso de misturas metanol/gua no for apropriado, pode tentar utilizar-se outras
misturas gua/solventes orgnicos como, por exemplo, etanol/gua ou acetonitrilo/gua. Para compostos
ionizveis, recomendada a utilizao da soluo tampo, de modo a estabilizar o pH. Devero tomar-se
precaues para evitar a precipitao de sais e a deteriorao da coluna, que podem ocorrer com algumas
misturas de fase orgnica/tampo.
No devem ser utilizados aditivos, como reagentes de pares inicos, uma vez que estes podem afectar as
propriedades absortivas e/ou adsortivas da fase estacionria, de uma forma que poder ser irreversvel. por
esta razo obrigatrio que os ensaios com aditivos sejam realizados em colunas separadas do mesmo tipo.
1.7.4. Solutos
Tanto as substncias de ensaio como as de referncia devem ser dissolvidas na fase mvel.
1.8. PROCEDIMENTO DO ENSAIO
Deve ser registada a temperatura qual se efectuam as medidas. fortemente recomendada a utilizao de um
compartimento de colunas com controlo de temperatura, de modo a garantir condies de temperatura
constante durante a calibrao, de avaliao prvia e das medies da substncia de ensaio.
1.8.2. Determinao do tempo limite t
o
Podem ser utilizados dois mtodos diferentes na determinao do tempo limite t
o
(ver tambm ponto 1.2).
1.8.2.1. Determinao do tempo limite t
o
atravs de uma srie homloga
Este procedimento provou dar origem a valores de t
o
fiveis e padronizados. Pormenores sobre este mtodo
podem ser encontrados no mtodo de ensaio A.8: coeficiente de partio (n-octanol/gua), mtodo de HPLC.
1.8.2.2. Determinao do tempo limite t
0
atravs de substncias inerte que no so retidas pela coluna
Esta tcnica baseia-se na injeco de solues de formamida, ureia ou nitrato de sdio. As medies devem ser
feitas, peio menos, em duplicado.
1.8.3. Determinao dos tempos de reteno t
R
As substncias de referncia devem ser seleccionadas de acordo com o procedimento descrito no ponto 1.3.
Para determinar os respectivos tempos de reteno, podem ser injectadas misturadas desde que se tenha
confirmado que o tempo de reteno de cada um dos padres no afectado pela presena dos outros padres.
A calibrao deve ser efectuada a intervalos regulares, pelo menos duas vezes por dia, de modo a poder detectar
quaisquer alteraes inesperadas no comportamento da coluna. Para uma boa prtica laboratorial, as injeces
de calibrao devem ser efectuadas antes e depois da injeco da substncia de ensaio, de modo a confirmar se
no houve alteraes nos tempos de reteno. As substncias de ensaio so injectadas separadamente, em
quantidades o mais reduzidas possvel (de modo a evitar a sobrecarga da coluna), e determinados os seus
tempos de reteno.
Para aumentar o grau de confiana das medies, as determinaes devem ser feitas pelo menos em duplicado.
Os valores de log K
oc
obtidos em cada medio devem manter-se numa gama de 0,25 unidades de logaritmo.
1.8.4. Avaliao
Os factores de capacidade k' so calculados a partir do tempo limite t
o
e dos tempos de reteno t
R
das
substncias de referncia seleccionadas, de acordo com a equao 4 (ver ponto 1.2) Os valores de log k' das
substncias de referncia so em seguida representados graficamente em funo dos respectivos valores de log
K
oc
, obtidos nos ensaios em reactor descontnuo fornecidos nas tabelas 1 e 3 do apndice. Atravs deste grfico,
o valor de log k' de uma substncia de ensaio ento utilizado para determinar o seu valor de log K
oc
. Se os
resultados obtidos revelarem que o valor de log K
oc
da substncia de ensaio se encontra fora da curva de
calibrao, o ensaio deve ser repetido com outras substncias de referncia, mais adequadas.
2. DADOS E RELATRIO
O relatrio deve incluir a seguinte informao:
a identidade das substncias de ensaio e de referncia, e o seu grau de pureza e, se relevante, os
respectivos valores de pK
a
,
a descrio do equipamento e das condies de funcionamento, por exmplo, o tipo e a dimenso da
coluna analtica (e da coluna de proteco), os meios de deteco, a fase mvel (composio relativa e
pH), a gama de temperaturas observadas durante o decorrer das medies,
o tempo limite e o mtodo utilizado para a sua determinao,
as quantidades das substncias de ensaio e de referncia introduzidas na coluna,
os tempos de reteno dos compostos de referncia utilizados para a calibrao,
as caractersticas da regresso linear dos pontos experimentais (log k' em funo de log K
oc
) e um grfico
da recta obtida por regresso linear,
os dados sobre o tempo mdio de reteno e o valor estimado para log K
oc
do composto de ensaio,
cromatogramas.
3. REFERNCIAS
(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). Handbook of chemical property estimation
methods, Chap. 4, McGraw-Hill, New York.
(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (K
oc
) for soils by HPLC.
Chemosphere, 17, 1-67.
(3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water
partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem.,
29, p. 1050-1059.
(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds
between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, p. 227-231.
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci.
Health, B19, p. 297-312.
(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic
organic compounds, Science, 106, p. 831-832.
(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural
sediments and soils. Chemosphere, 10, p. 833-846.
(8) W. Krdel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the
determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), p. 121-128.
(9) M. Mueller, W. Krdel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption
coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), p. 2493-2504.
(10) W. Krdel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption
coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), p. 2341-2352.
(11) B. von Oepen, W. Krdel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils:
Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106,
Chemosphere, 22, p. 28 5-304.
(12) W. Krdel, G. Kotthoff, J. Mller (199 5). HPLC-screening method for the determination of the
adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), p. 1373-1384.
Apndice
Tabela 1
Comparao entre os valores de K
oc
para solos e lamas de depurao e os valores calculados pelo mtodo de
HPLC (
1
), (
2
)
Substncia
Nmero
CAS
Log K
OC
lamas de
depurao
Log K
OC
HPLC
A
Log K
OC
solos
Log K
OC
HPLC
A
Atrazina 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39
Linuro 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30
Fentio 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09
Monuro 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27
Fenantreno 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57
ster fenlico do cido
benzico
93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07
Benzamida 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01
4-Nitrobenzamida 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27
Acetanilida 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08
Anilina 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43
2,5-Dicloroanilina 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
(
1
) W. Krdel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), p. 121-128.
(
2
) W. Krdel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges.
Chemosphere. 35(1/2), p. 107-119.
Tabela 2
Resultados de um ensaio comparativo interlaboratorial (11 laboratrios participantes), efectuado com o objectivo
de melhorar e validar o mtodo de HPLC (
1
)
Substncia Nmero CAS
Log K
OC
K
OC
Log K
OC
(OECD 106) (mtodo de HPLC)
Atrazina 1912-24-9 1,81 78 16 1,89
Monuro 150-68-5 1,99 100 + 8 2,00
Triapentenol 77608-88-3 2,37 292 58 2,47
Linuro 330-55-2 2,59 465 62 2,67
Fentio 55-38-9 3,31 2062 648 3,31
(
1
) W. Krdel, G. Kotthoff, J. Mller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a
ring test. Chemosphere, 30(7), p. 1373-1384.
Tabela 3
Substncias de referncia recomendadas para o mtodo de HPLC baseado em dados de adsoro em solos
Substncia de referncia Nmero CAS
Valores mdios
de log K
OC
em
reactor descont-
nuo
Nmero de valo-
res de K
OC
Log desvio-
-padro
Fonte
Acetanilida 103-84-4 1,25 4 0,48 (
a
)
Fenol 108-95-2 1,32 4 0,70 (
a
)
2-Nitrobenzamida 610-15-1 1,45 3 0,90 (
b
)
N,N-dimetilbenzamida 611-74-5 1,52 2 0,45 (
a
)
4-Metilbenzamida 619-55-6 1,78 3 1,76 (
a
)
Benzoato de metilo 93-58-3 1,80 4 1,08 (
a
)
Atrazina 1912-24-9 1,81 3 1,08 (
c
)
Isoproturo 34123-59-6 1,86 5 1,53 (
c
)
3-Nitrobenzamida 645-09-0 1,95 3 1,31 (
b
)
Anilina 62-53-3 2,07 4 1,73 (
a
)
3,5-Dinitrobenzamida 121-81-3 2,31 3 1,27 (
b
)
Carbendazim 10605-21-7 2,35 3 1,37 (
c
)
Triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (
c
)
Triazxido 72459-58-6 2,44 3 1,66 (
c
)
Triazofos 24017-47-8 2,55 3 1,78 (
c
)
Linuro 330-5 5-2 2,59 3 1,97 (
c
)
Naftaleno 91-20-3 2,75 4 2,20 (
a
)
Endosulfan-diol 2157-19-9 3,02 5 2,29 (
c
)
Metiocarbe 2032-65-7 3,10 4 2,39 (
c
)
Amarelo cido 21 9 63405-85-6 3,16 4 2,83 (
a
)
1,2,3-Triclorobenzeno 87-61-6 3,16 4 1,40 (
a
)
Y-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (
a
)
Fentio 55-38-9 3,31 3 2,49 (
c
)
Vermelho Directo 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (
a
)
Pirazofos 1 3457-18-6 3,65 3 2,70 (
c
)
a-Endosulfan 959-98-8 4,09 5 3,74 (
c
)
Diclofop-metilo 51338-27-3 4,20 3 3,77 (
c
)
Fenantreno 85-01-8 4,09 4 3,83 (
a
)
Azul Bsico 41 (mistura) 268 50-47-5
12270-13-2
4,89 4 4,46 (
a
)
DDT 50-29-3 5,63 1 (
b
)
(
a
) W. Krdel, J. Mller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D Report
No 106 01044 (1994).
(
b
) B.V. Oepen, W. Krdel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, p. 285-304.
(
c
) Dados fornecidos por entidades industriais.
C.20. ENSAIO SOBRE A REPRODUO DE DAPHNIA MAGNA
1. MTODO
Este mtodo de ensaio de toxicidade na reproduo baseia-se na publicao OECD TG 211 (1998) (normas de
ensaio da OCDE).
1.1. INTRODUO
O principal objectivo do ensaio consiste em determinar o efeito de produtos qumicos sobre a produo de
descendncia de Daphnia magna.
Animais progenitores: as fmeas Daphnia presentes no incio do ensaio e cuja reproduo o objecto do
estudo.
Descendncia: os juvenis Daphnia produzidos pelos animais progenitores no decorrer do ensaio.
Menor concentrao com efeito observvel (LOEC): a menor concentrao testada em que a substncia
ensaiada produz um efeito observvel estatisticamente significativo sobre a reproduo e mortalidade dos
progenitores (a p < 0,05), comparativamente ao controlo, durante um perodo de exposio definido. No
entanto, todas as concentraes de ensaio superiores LOEC devem ter um efeito nocivo igual ou superior ao
verificado para a LOEC. Quando estas duas condies no puderem ser satisfeitas, dever ser fornecida uma
explicao pormenorizada sobre a forma como se determinou a LOEC (e, consequentemente, a NOEC).
Concentrao sem efeito observvel (NOEC): a mais elevada concentrao ensaiada que, quando
comparada com o controlo, no tem qualquer efeito estatisticamente significativo (p < 0,05), durante um
perodo de exposio definido (corresponde concentrao ensaiada imediatamente abaixo da LOEC).
CE
x
: a concentrao da substncia de ensaio dissolvida em gua que provoca uma reduo de x % na
reproduo da Daphnia magna, durante um perodo de exposio definido.
Taxa intrnseca de crescimento: uma medida do crescimento da populao que integra a produo de
descendncia e a mortalidade especfica da idade (20) (21) (22). O seu valor ser igual a zero nas populaes
estveis, positivo para as populaes em crescimento e negativo para populaes em declnio. Manifestamente,
a ltima situao no sustentvel c, em ltima anlise, conduzir extino.
Limite de deteco: a menor concentrao que pode ser detectada, mas no quantificada.
Limite de determinao: a menor concentrao que pode ser medida de forma quantitativa.
Mortalidade: um animal considerado morto quando permanece imvel, isto , quando no capaz de nadar
ou quando no se observa movimento dos apndices ou do ps-abdmen no intervalo de 15 segundos aps
agitao suave do recipiente de ensaio (se for utilizada outra definio, esta deve ser mencionada juntamente
com a sua referncia).
As fmeas jovens Daphnia (os animais progenitores), com menos de 24 horas de vida no incio do ensaio, so
expostas substncia de ensaio misturada na gua em diversas concentraes. A durao do ensaio de 21
dias. No fim do ensaio, determinado o nmero total de descendentes vivos produzidos por cada animal
progenitor que esteja vivo. Isto significa que so excludos dos clculos os juvenis produzidos por adultos que
morreram durante o ensaio. A produo de descendncia pelos animais progenitores pode expressar-se de
outras formas (por exemplo, pelo nmero de descendentes vivos produzidos por animal e por dia, desde o
primeiro dia em que se observou descendncia), mas estas devem ser descritas juntamente com o nmero total
de juvenis produzidos por progenitor vivo no fim do ensaio. A produo de descendncia pelos animais
expostos substncia de ensaio comparada com a obtida no(s) controlo(s), a fim de determinar a menor
concentrao com efeito observvel (LOEC) e, consequentemente, a concentrao sem efeito observvel
(NOEC). Adicionalmente, e na medida do possvel, os dados so analisados utilizando um modelo de regresso
de modo a estimar a concentrao que causaria uma reduo de x % na produo de descendncia (isto CE
50
,
CE
20
ou CE
10
).
necessrio registar tambm a sobrevivncia dos animais progenitores e o tempo que decorreu at ao
aparecimento dos primeiros juvenis. Podem ainda ser examinados outros efeitos relacionados com a substncia,
em parmetros como o crescimento (o comprimento, por exemplo) e, possivelmente, a taxa intrnseca de
crescimento.
Devero estar disponveis os resultados de um ensaio de toxicidade aguda (ver mtodo C.2, parte I) realizado
com a Daphnia magna. Estes resultados podem ser teis para seleccionar um intervalo apropriado de
concentraes a usar nos ensaios de reproduo. A solubilidade em gua e a presso de vapor da substncia de
ensaio devero ser conhecidas, e dever estar disponvel um mtodo analtico fivel para a quantificao da
substncia nas solues de ensaio, relativamente ao qual esteja descrita a eficincia de recuperao e o limite de
determinao.
A frmula estrutural, o grau de pureza da substncia, a estabilidade luz, a estabilidade nas condies do
ensaio, o pKa, o P
ow
e os resultados do ensaio para a biodegradabilidade fcil constituem informaes relativas
substncia que podem ser teis para o estabelecimento das condies do ensaio (ver mtodo C.4).
Para que um ensaio seja vlido, devero ser satisfeitos os seguintes critrios relativamente ao(s) controlo(s):
a mortalidade dos animais progenitores (fmea Daphnia) no fim do ensaio no deve exceder 20 %;
o nmero mdio da descendncia viva, produzida por animal progenitor sobrevivente no fim do ensaio
deve ser 60.
1.6.1. Equipamento
Os recipientes de ensaio e outros aparelhos que entrem em contacto com as solues de ensaio devem ser,
exclusivamente, de vidro ou outro material quimicamente inerte. Os recipientes de ensaio utilizados sero,
normalmente, copos de vidro.
Adicionalmente, ser necessrio utilizar parte ou a totalidade do seguinte equipamento:
medidor de oxignio (com microelctrodo ou outro equipamento adequado para a medio de oxignio
dissolvido em amostras com volume reduzido),
aparelhos adequados para o controlo da temperatura,
medidor de pH,
equipamento para a determinao da dureza da gua,
equipamento para a determinao da concentrao de carbono orgnico total (COT) da gua ou
equipamento para a determinao da carncia qumica de oxignio (CQO),
aparelho adequado para o controlo do regime de luz e a medio da intensidade da luz.
1.6.2. Organismos de ensaio
A espcie a ser utilizada no ensaio a Daphnia magna Straus. Podem ser utilizadas outras espcies de Daphnia,
desde que obedeam aos critrios de validade (o critrio de validade relativo produo de descendncia nos
controlos deve ser aplicvel espcie de Daphnia). Se forem utilizadas outras espcies de Daphnia, estas devem
ser claramente identificadas e o seu uso justificado.
desejvel que os clones tenham sido identificados, por genotipagem. A investigao j efectuada nesse
domnio (1) demonstrou que a reproduo do clone A (proveniente do 1RCHA, em Frana) (3) obedece de
forma satisfatria ao critrio de validade de uma mdia 60 descendentes por animal progenitor sobrevivente,
quando cultivado nas condies descritas no presente mtodo. No entanto, so aceitveis outros clones, desde
que se demonstre que a cultura de Daphnia satisfaz os critrios de validade para o ensaio.
No incio do ensaio, os animais devem ter menos de 24 horas de vida e no devem fazer parte da primeira
ninhada do progenitor. Devem provir de um lote saudvel [isto , no evidenciar sinais de distrbio, tais como
elevada mortalidade, presena de machos e ovos de repouso (ephippia), atraso na produo da primeira ninhada,
animais descorados, etc.]. O lote de animais deve ser mantido em condies de cultura (luz, temperatura, meio,
alimentao e nmero de animais por unidade de volume) semelhantes s que iro ser utilizadas no ensaio. Se o
meio de cultura da Daphnia a ser utilizado no ensaio for diferente do utilizado para a cultura de rotina da
Daphnia, boa prtica incluir um perodo de aclimatao de cerca de trs semanas antes do ensaio (isto , uma
gerao) para evitar perturbaes nos animais progenitores.
1.6.3. Meio de ensaio
E recomendada a utilizao, neste ensaio, de um meio totalmente definido. Isto permite evitar o uso de aditivos
(por exemplo, algas marinhas, extracto de solo, etc.), que so difceis de caracterizar, e assim melhorar o
processo de padronizao entre laboratrios. Foram considerados adequados para este fim os meios Elendt M4
(4) e M7 (ver apndice 1). So aceitveis, no entanto, outros meios [ver, por exemplo, (5) e (6)] desde que as
caractersticas da cultura de Daphnia satisfaam os critrios de validade para o ensaio.
Se for utilizado um meio que inclui aditivos no definidos, estes devero ser claramente especificados e o
relatrio do ensaio dever incluir informaes sobre a composio, nomeadamente no que diz respeito ao teor
de carbono, j que este poder contribuir para o alimento fornecido. Recomenda-se que o carbono orgnico
total (COT) e/ou a carncia qumica de oxignio (CQO) da soluo de reserva do aditivo orgnico sejam
determinados, e feita uma estimativa da contribuio resultante para os valores COT/CQO no meio de ensaio.
Recomenda-se que os nveis de COT no meio (isto , antes da adio das algas) sejam inferiores a 2 mg/l (7).
Quando as substncias de ensaio contm metais, importante reconhecer que as propriedades do meio de
ensaio (por exemplo, a dureza, capacidade quelante) podem ter influncia na toxicidade da substncia de
ensaio. Por esta razo, desejvel utilizar um meio cuja composio seja totalmente conhecida. No entanto,
actualmente, os nicos meios totalmente definidos que se sabe serem adequados para a cultura a longo prazo
da Daphnia magna so os meios Elendt M4 e M7. Ambos os meios contm o agente quelante EDTA. Alguns
estudos (2) demonstram que a toxicidade aparente do cdmio geralmente menor quando o ensaio da
reproduo realizado em meios M4 e M7 do que quando realizado num meio que no contm EDTA. Em
consequncia, os meios M4 e M7 no so recomendados para o ensaio de substncias contendo metais,
devendo igualmente ser evitados outros meios contendo agentes quelantes. Para substncias que contenham
metais, poder ser aconselhvel utilizar um meio alternativo, como, por exemplo, gua dura ASTM
reconstituda (7), que no contm EDTA, com adio de extracto de algas marinhas (8). Esta combinao de
gua dura ASTM reconstituda e extracto de algas marinhas tambm adequada para culturas de longo prazo e
ensaios de Daphnia magna (2), embora ainda exera uma fraca aco quelante devido ao componente orgnico
existente no extracto de algas marinhas adicionado.
A concentrao de oxignio dissolvido no incio e ao longo do ensaio deve ser superior a 3 mg/l. O valor de pH
deve estar situado entre 6 e 9 e no deve variar em nenhum ensaio mais do que 1,5 unidades. Recomenda-se
uma dureza superior a 140 mg/l (como CaCO
3
). Ensaios a este nvel e superiores demonstraram que, nessas
condies, a produo de descendncia cumpre os critrios de validade (9) (10).
De um modo geral, as solues de ensaio com as concentraes escolhidas so preparadas por diluio de uma
soluo de reserva. As solues de reserva devem ser preparadas, de preferncia, por dissoluo da substncia
no meio de ensaio.
Em alguns casos, pode ser necessrio recorrer a solventes orgnicos ou dispersantes de modo a produzir uma
soluo de reserva com uma concentrao adequada, mas devero ser feitos todos os esforos de modo a evitar
a utilizao de tais substncias. A acetona, o etanol, o metanol, a dimetilformamida e o trietilenoglicol
constituem exemplos de solventes adequados. Como exemplos de dispersantes adequados, podem citar-se o
Cremophor RH40, a metilcelulose 0,01 % e o HCO-40. Em qualquer um dos casos, a substncia de ensaio
presente nas solues nunca deve exceder o limite de solubilidade no meio de ensaio.
Utilizam-se solventes com o fim de preparar uma soluo de reserva que permita o doseamento exacto da
substncia no meio de cultura. Na concentrao recomendada para meio de ensaio final (isto 0,1 ml/l), os
solventes acima indicados no so txicos, nem aumentam a solubilidade da substncia em gua.
Os dispersantes podem ser teis para o doseamento e disperso correctos da substncia. Na concentrao
recomendada para o meio de ensaio final (< 0,1 ml/l), os dispersantes acima indicados no so txicos, nem
aumentam a solubilidade da substncia em gua.
1.7. PLANEAMENTO DO ENSAIO
Os tratamentos devem ser distribudos pelos recipientes de ensaio e todos os processos de manuseamento
subsequentes devem ser efectuados de modo aleatrio. O no cumprimento destas recomendaes pode
provocar desvios nos resultados que podero ser erradamente interpretados como um efeito da concentrao.
Em particular, se as unidades experimentais forem manuseadas por ordem de tratamento ou concentrao,
alguns efeitos relacionados com o tempo, como a fadiga do operador ou outro tipo de erro, podero ter efeitos
e repercusses de maior dimenso nas concentraes mais elevadas. Alm disso, se houver indicaes de que os
resultados do ensaio podem ser afectados por uma condio inicial ou ambiental do ensaio, como a localizao
no laboratrio, deve considerar-se a possibilidade de efectuar o ensaio por agrupamento de recipientes.
1.8. PROCEDIMENTO
1.8.1.1. Durao
A durao do ensaio de 21 dias.
1.8.1.2. Carga
Os animais progenitores so mantidos individualmente, um em cada recipiente de ensaio, contendo cada
recipiente 50-100 ml de meio.
Por vezes, podem ser necessrios volumes maiores de modo a possibilitar o cumprimento dos requisitos do
procedimento analtico utilizado para a determinao da concentrao da substncia de ensaio, embora seja
tambm permitida a juno de repeties para anlise qumica. Se forem utilizados volumes superiores a 100
ml, poder ser necessrio aumentar a rao fornecida s Daphnia de modo a assegurar uma disponibilidade
adequada de alimento e o cumprimento dos critrios de validade. Em ensaios por escoamento, podem ser
considerados, por razes tcnicas, planos alternativos (por exemplo, quatro grupos de 10 animais num volume
de ensaio maior), devendo, no entanto, qualquer alterao do plano do ensaio ser indicada no relatrio.
1.8.1.3. Nmero de animais
Para ensaios semi-estticos, devero ser mantidos individualmente, pelo menos, 10 animais em cada
concentrao de ensaio e 10 animais nas sries de controlo.
Para ensaios por escoamento, concluiu-se ser adequado dividir 40 animais por quatro grupos de 10 animais
para cada concentrao de ensaio (1). Pode ser utilizado um nmero menor de organismos de ensaio, sendo
recomendado um mnimo de 20 animais para cada concentrao, repartidos por duas ou mais repeties com
igual nmero de animais (por exemplo, quatro repeties com cinco animais cada). Convm salientar que nos
ensaios em que os animais so mantidos em grupos, no ser possvel expressar a produo de descendncia
em termos de nmero total de descendentes vivos produzidos por animal progenitor vivo no fim do ensaio se
os animais progenitores morrerem. Nestes casos, a produo de descendncia deve ser expressa em termos de
nmero total de descendentes vivos produzidos por progenitor presente no incio do ensaio.
1.8.1.4. Alimentao
Para ensaios semi-estticos, a alimentao deve ser fornecida de preferncia diariamente, no mnimo, trs vezes
por semana (isto , correspondendo s mudanas de meio). Qualquer desvio em relao a essa norma (por
exemplo, para ensaios por escoamento) dever ser indicado no relatrio.
Durante o ensaio, a dieta dos animais progenitores dever consistir, de preferncia, em clulas de algas vivas de
uma ou mais das seguintes espcies: Chlorella sp, Selenastrum capricornutum [agora Pseudokirchneriella subcapitata
(11)] e Scenedesmus subspicatus. A dieta fornecida deve basear-se na quantidade do carbono orgnico (C)
fornecida a cada animal progenitor. Os dados da investigao j realizada nesta rea (12) demonstraram que,
para a Daphnia magna, nveis de rao entre 0,1 e 0,2 mg C/Daphnia/dia so suficientes para atingir o nmero
de descendentes necessrio para satisfazer o critrio de validade do ensaio. A rao pode ser fornecida a uma
taxa constante ao longo de todo o perodo do ensaio ou, se for desejvel, pode ser utilizada uma taxa inferior
no incio, que ser depois aumentada durante o ensaio de modo a compensar o crescimento dos animais
progenitores. Neste caso, a rao dever continuar a manter-se dentro da gama recomendada de 0,1-0,2 mg C/
/Daphma/dia.
Se forem utilizados medies alternativas, tais como o nmero de clulas de algas ou a absorvncia, para
determinar o nvel de rao necessrio (por razes de convenincia, uma vez que as medies do teor de
carbono so muito mais demoradas), cada laboratrio deve produzir o seu prprio nomograma em que
relacione a medida alternativa com o contedo em carbono da cultura de algas (ver apndice 2 para conselhos
sobre a elaborao do nomograma). Os nomogramas devem ser verificados pelo menos anualmente, e com
maior frequncia se tiverem sido alteradas as condies de cultura das algas. Verificou-se que a absorvncia
uma medida alternativa mais adequada para a determinao do teor de carbono do que o nmero de clu-
las (13).
De modo a reduzir o volume do meio de cultura de algas transferido para os recipientes de ensaio, a suspenso
de algas fornecida s Daphnia deve ser concentrada. A concentrao das algas pode ser efectuada por
centrifugao seguida de re-suspenso em gua destilada, gua desionizada ou meio de cultura de Daphnia.
1.8.1.5. Luz
Perodo de exposio luz de 16 horas com uma intensidade que no exceda 15-20 E m
-2
s
-1
.
1.8.1.6. Temperatura
A temperatura do meio de ensaio deve situar-se entre 18 e 22
o
C. No entanto, para qualquer ensaio, a
temperatura no deve, se possvel, variar mais do que 2
o
C dentro destes limites (por exemplo, 18-20, 19-21 ou
20-22
o
C). Poder ser vantajoso utilizar um recipiente de ensaio adicional para a monitorizao da
temperatura.
1.8.1.7. Arejamento
Os recipientes de ensaio no devem ser arejados durante o ensaio.
Normalmente devero ser testadas pelo menos cinco concentraes de ensaio, dispostas numa srie geomtrica
com um factor de separao que no exceda de preferncia 3.2 e dever ser utilizado um nmero de repeties
apropriado para cada concentrao de ensaio (ver ponto 1.8.1.3). Se forem utilizadas menos de cinco
concentraes, dever ser apresentada uma justificao. As substncias no devem ser ensaiadas acima do seu
limite de solubilidade no meio de ensaio.
Na escolha da gama de concentraes, importa ter presente o seguinte:
i) Se o objectivo consistir em determinar a LOEC/NOEC, o valor da menor concentrao de ensaio deve ser
suficientemente baixo de modo a que a fecundidade quela concentrao no seja significativamente
inferior do controlo. Se no for este o caso, o ensaio ter de ser repetido reduzindo a da menor
concentrao ensaiada;
ii) Se o objectivo for a determinao da LOEC/NOEC, o valor da maior concentrao de ensaio deve ser
suficientemente elevado para que a fecundidade quela concentrao seja significativamente inferior do
controlo. Se no for este o caso, o ensaio ter de ser repetido com um aumento da maior concentrao;
iii) Se for estimada a CE
X
para os efeitos sobre a reproduo, aconselhvel utilizar concentraes suficientes
de modo a definir a CE
X
com um nvel de confiana apropriado. Se for estimada a CE
50
para os efeitos
sobre a reproduo, aconselhvel que a maior concentrao de ensaio seja superior a este valor CE
50
. De
outro modo, embora seja ainda possvel estimar o valor CE
50
, o intervalo de confiana para o valor CE
50
ser muito alargado e poder no ser possvel estabelecer satisfatoriamente o nvel de adequao do
modelo ajustado;
iv) A gama de concentraes de ensaio no dever incluir, de preferncia, quaisquer concentraes que
tenham um efeito estatisticamente significativo na sobrevivncia de adultos, pois tal alteraria a natureza
do ensaio, transformando um ensaio de reproduo simples num ensaio combinado de reproduo e
mortalidade, o que exigiria urna anlise estatstica muito mais complexa.
O conhecimento prvio da toxicidade da substncia de ensaio (obtido a partir de um ensaio de toxicidade aguda
e/ou de estudos preliminares para determinao das concentraes, por exemplo) dever ajudar na seleco das
concentraes de ensaio apropriadas.
Quando for utilizado um solvente ou dispersante na preparao de solues de ensaio (ver ponto 1.6.4), a sua
concentrao final nos recipientes de ensaio no dever ser superior a 0,1 ml/l e dever ser a mesma em todos
os recipientes de ensaio.
1.8.3. Controlos
A par das sries de ensaio, deve ser realizada uma srie de ensaios de controlo do meio c, se aplicvel, uma srie
de controlo contendo o solvente ou o dispersante. Quando forem utilizados solventes ou dispersantes, a sua
concentrao deve ser igual utilizada nos recipientes contendo a substncia de ensaio. Deve utilizar-se um
nmero apropriado de repeties (ver ponto 1.8.1.3).
Em geral, num ensaio bem realizado, o coeficiente de variao relativamente ao nmero mdio de descendentes
vivos produzidos por animal progenitor no(s) controlo(s) deve ser < 25 %, o que dever ser descrito nos planos
de ensaio que utilizem animais mantidos individualmente.
1.8.4. Renovao do meio de ensaio
A frequncia da renovao do meio depender da estabilidade da substncia de ensaio, mas deve ser no mnimo
de trs vezes por semana. Se, a partir de ensaios de estabilidade preliminares (ver ponto 1.4) a concentrao da
substncia de ensaio no for estvel (isto , se ela se situar fora da gama de 80-120 % do valor nominal ou
abaixo de 80 % da concentrao inicial medida) durante o perodo mximo de renovao (isto , trs dias), deve
considerar-se uma renovao mais frequente do meio ou efectuar um ensaio por escoamento.
Nos ensaios semi-estticos, quando o meio renovado, dever preparar-se uma segunda srie de recipientes de
ensaio e para onde se transferem os animais progenitores utilizando, por exemplo, uma pipeta de vidro de
dimetro adequado. O volume do meio transferido com a Daphnia deve ser reduzido ao mnimo.
1.8.5. Observaes
Os resultados das observaes realizadas durante o ensaio devem ser registados em folhas de dados (ver
exemplos nos apndices 3 e 4). Se tiverem de ser efectuadas outras medies, poder ser necessrio efectuar
observaes adicionais (ver pontos 1.3 e 1.8.8).
1.8.6. Descendncia
Os descendentes produzidos por cada animal progenitor devem ser retirados e contados, de preferncia
diariamente desde o aparecimento dos primeiros juvenis, para evitar que estes consumam a comida destinada
aos adultos. Embora para atingir o objectivo deste mtodo apenas seja necessrio contar o nmero de
descendentes vivos, a presena de ovos abortados ou descendentes mortos tambm dever ser indicada no
relatrio.
1.8.7. Mortalidade
A mortalidade entre os animais progenitores deve ser registada, de preferncia diariamente ou, no mnimo,
quando se efectua a contagem dos descendentes.
1.8.8. Outros parmetros
Embora este mtodo seja planeado sobretudo para avaliar os efeitos sobre a reproduo, possvel que outros
efeitos possam tambm ser suficientemente quantificados de modo a permitir urna anlise estatstica. As
medies relativas ao crescimento so desejveis, pois fornecem informao sobre possveis efeitos subletais,
que podem ser mais teis que a simples medio relativa reproduo. Recomenda-se a medio do
comprimento dos animais progenitores (isto , o comprimento do corpo excluindo o espinho anal) no fim do
ensaio. O tempo necessrio para a produo da primeira ninhada (e seguintes), o nmero e tamanho das
ninhadas por animal progenitor, o nmero de ovos abortados, a presena de machos ou ovos de repouso
(ephippia) e a taxa intrnseca de crescimento da populao so outros parmetros que podem ser medidos ou
calculados.
Pelo menos uma vez por semana, deve ser medida a concentrao de oxignio, a temperatura, o grau de dureza
e os valores de pH nos meios frescos e velhos, nos controlo(s) e na maior concentrao da substncia de ensaio.
As concentraes da substncia de ensaio so determinadas a intervalos regulares durante o ensaio.
Nos ensaios semi-estticos, em que a concentrao da substncia de ensaio dever manter-se entre 20 % do
valor nominal (isto , dentro da gama dos 80-120 % ver 1.4 e 1.8.4), recomenda-se que, no mnimo, sejam
analisadas a maior e menor concentraes de ensaio quando acabadas de preparar e uma vez durante a
primeira semana do ensaio, na altura da renovao do meio (isto , devem efectuar-se anlises numa amostra da
soluo no momento em que esta acaba de ser preparada e no momento da renovao do meio). A partir de
ento, estas determinaes devem ser repetidas, pelo menos, a intervalos semanais.
Para os ensaios em que no esperado que a concentrao da substncia de ensaio se mantenha dentro de
20 % do valor nominal, necessrio analisar todas as concentraes de ensaio no momento em que as
solues acabam de ser preparadas e na altura da renovao do meio. No entanto, para os ensaios em que a
concentrao inicial medida da substncia de ensaio no se encontra no intervalo de 20 % do valor nominal,
mas em que possvel fornecer provas suficientes de que as concentraes iniciais so reprodutveis e estveis
(isto , mantm-se dentro da gama dos 80 120 % das concentraes iniciais), as determinaes qumicas
para concentraes de ensaio podero ser reduzidas na segunda e terceira semana do ensaio, limitando-se
maior e menor concentrao. Em todos os casos, a determinao das concentraes da substncia de ensaio
antes da renovao do meio s precisa de ser efectuada no recipiente de uma das repeties, para cada
concentrao de ensaio.
Se for efectuado um ensaio por escoamento, adequado aplicar um mtodo de amostragem semelhante ao
descrito para os ensaios semi-estticos (no sendo, neste caso, aplicvel a medio de solues usadas). No
entanto pode ser aconselhvel aumentar o nmero de amostragens durante a primeira semana (efectuando trs
conjuntos de medies, por exemplo) de modo a assegurar que as concentraes de ensaio se mantm estveis.
Nestes tipos de ensaio, a taxa de fluxo do diluente e da substncia de ensaio dever ser verificada diariamente.
Se existirem provas de que, durante o ensaio, a concentrao da substncia de ensaio no excedeu 20 % do
valor da concentrao nominal ou da concentrao inicial medida, os resultados podem basear-se nos valores
nominais ou iniciais medidos. Se o desvio em relao ao valor nominal ou da concentrao inicial medida for
superior a 20 %, os resultados devem ser expressos atravs da mdia ponderada em funo do tempo (ver o
apndice 5).
2. DADOS E RELATRIO
O objectivo deste ensaio consiste em determinar o efeito da substncia de ensaio no nmero total de
descendentes vivos produzidos por animal progenitor vivo no fim do ensaio. Dever calcular-se o nmero total
de descendentes por animal progenitor em cada recipiente de ensaio (isto , em cada repetio). Se, em qualquer
repetio, se observar a presena de animais progenitores mortos durante o ensaio ou se o progenitor for um
macho, a repetio excluda do ensaio. A anlise basear-se- ento num nmero reduzido de repeties.
Para determinar a LOEC e, consequentemente, a NOEC em relao aos efeitos da substncia qumica na
produo de descendncia, necessrio calcular a produo da descendncia mdia nas repeties de cada
concentrao e o desvio-padro residual conjunto, o que poder ser feito atravs de uma anlise de varincia
(ANOVA). A mdia para cada concentrao deve ser ento comparada com a mdia observada no controlo,
utilizando um mtodo de comparaes mltiplas apropriado. Os testes de Dunnett ou Williams (14) (15) (16)
(17) podero ser teis para o efeito. necessrio verificar se se verifica a presuno de homogeneidade da
varincia calculada atravs da ANOVA. Recomenda-se que isso seja realizado graficamente e no por meio de
um teste de significncia formal (18); uma alternativa adequada consiste em realizar um teste de Bartlett. Se esta
presuno no se verificar, deve considerar-se a transformao dos dados de modo a homogeneizar as
varincias antes de realizar a ANOVA, ou a realizao de uma ANOVA ponderada. Deve ser calculada e
registada a dimenso do efeito detectvel atravs da ANOVA (isto , a diferena menos significativa).
Para efectuar uma estimativa da concentrao que causaria uma reduo de 50 % no resultado reprodutivo (isto
, a CE
50
), dever ajustar-se aos dados uma curva adequada (curva logstica, por exemplo), utilizando um
mtodo estatstico como, por exemplo, o mtodo dos mnimos quadrados. A curva pode ser parametrizada de
modo a que a CE
50
e o seu desvio-padro possam ser estimados directamente, o que facilitaria enormemente o
clculo dos limites de confiana da CE
50
. Devero ser utilizados limites de confiana de mais ou menos 95 %, a
no ser que existam boas razes para preferir nveis de confiana diferentes. aconselhvel que o procedimento
de ajuste da curva permita avaliar a significncia dos desvios. Isto poder ser realizado graficamente ou
dividindo a soma residual dos quadrados em desvios de ajuste e componentes de erro puro e realizando um
teste de significncia para os desvios. Uma vez que os tratamentos que resultam em elevada fecundidade so
susceptveis de registar, relativamente ao nmero de juvenis produzidos, uma variao superior que se verifica
nos tratamentos que resultam em baixa fecundidade, dever considerar-se a ponderao dos valores observados
de modo a reflectir as diferentes varincias nos diferentes grupos de tratamento [para informao sobre este
assunto, ver referncia (18)].
Na anlise dos dados do ensaio interlaboratorial final (2), a curva logstica foi ajustada utilizando o modelo
seguinte, embora possam ser adoptados outros modelos adequados:
Y =
c
1
x
x
0
_ _
b
em que:
Y = o nmero total de juvenis por animal progenitor vivo no fim do ensaio (calculado para cada recipiente)
x = o valor da concentrao da substncia
c = o nmero esperado de juvenis quando x = 0
x
0
= o valor CE
5o
na populao
b = o parmetro de declive
Este modelo dever ser adequado num elevado nmero de situaes, embora possivelmente no o seja para
todos os ensaios. Como se prope acima, deve realizar-se um teste para verificar a validade do modelo. Em
alguns casos, poder ser apropriado utilizar um modelo hormesis, no qual os efeitos observados a baixas
concentraes so ampliados (19).
Podero tambm ser estimadas outras concentraes, tais como a CE
10
ou CE
20
, embora neste caso possa ser
prefervel utilizar uma parametrizao do modelo diferente da utilizada para estimar a CE
50
.
dados relativos identificao qumica, incluindo a pureza.
o clone (quer tenha sido ou no geneticamente identificado), o fornecedor ou fonte (se conhecidos) e as
condies de cultura utilizadas. Se for utilizada uma espcie diferente de Daphnia magna, tal dever ser
registado e justificado.
o mtodo de ensaio utilizado (por exemplo, semi-esttico ou por escoamento, o volume, a carga expressa
em nmero de Daphnia por litro),
fotoperodo e intensidade da luz,
plano do ensaio (nmero de repeties, nmero de progenitores por repetio, por exemplo),
informaes pormenorizadas sobre o meio de cultura utilizado,
eventuais adies de material orgnico, incluindo a composio, a fonte, o mtodo de preparao, o
COT/CQO de preparaes de reserva, a estimativa do COT/CQO resultante no meio de ensaio,
informao pormenorizada sobre a alimentao, incluindo as quantidades (em mg C/Daphnia/dia) e a
descrio [o tipo de alimento(s), incluindo para as algas o nome especfico (espcie) e, se conhecida,
a estirpe e as condies de cultura, por exemplo],
mtodo de preparao das solues de reserva e frequncia de renovao do meio (quando utilizados,
devem ser fornecidas as concentraes do solvente ou dispersante).
2.2.4. Resultados:
resultados de quaisquer estudos preliminares sobre a estabilidade da substncia de ensaio,
o valor nominal das concentraes de ensaio e os resultados de todas as anlises para determinar a
concentrao da substncia de ensaio nos recipientes de ensaio (ver exemplo de folha de dados no
apndice 4); a eficincia de recuperao do mtodo e o limite de determinao tambm devero ser
regista dos,
a qualidade da gua nos recipientes de ensaio (isto , o pH, a temperatura e a concentrao de oxignio
dissolvido, assim como o COT e/ou a CQO e a dureza, quando aplicvel) (ver exemplo de folha de dados
no apndice 3),
o registo completo da descendncia viva de cada animal progenitor (ver exemplo nas folhas de dados do
apndice 3),
o nmero de animais progenitores mortos e o dia em que ocorreu a morte (ver exemplo de folha de
dados no apndice 3).
o coeficiente de variao da fecundidade no controlo (baseado no nmero total de descendentes vivos
por animal progenitor vivo no fim do ensaio),
representao grfica do nmero total de descendentes vivos por animal progenitor vivo (para cada
repetio) no fim do ensaio, em funo da concentrao da substncia de ensaio,
a menor concentrao com efeito observvel (LOEC) na reproduo, incluindo uma descrio dos
mtodos estatsticos utilizados, uma indicao da dimenso do efeito que poderia ser detectada e a
concentrao sem efeito observvel (NOEC) na reproduo; quando for apropriado, tambm devero ser
regista dos os valores LOEC/NOEC para a mortalidade dos animais progenitores,
quando for apropriado, o valor CE
X
para a reproduo, os intervalos de confiana, um grfico do modelo
ajustado utilizado para o seu clculo, o declive da curva de dose/resposta e o seu desvio-padro,
outras medies ou efeitos biolgicos observados: descrio de qualquer outro efeito biolgico que tenha
sido observado ou medido (crescimento de animais progenitores, por exemplo), incluindo qualquer
justificao apropriada,
uma explicao para qualquer desvio do mtodo de ensaio.
3. REFERNCIAS
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test,
Sheffield University, UK, 20-21 March 1993.
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 6. Report of
the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.
(3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C, Soares A. M. V. M. and Calow P. (1991). A comparative study of
genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicology and
Environmental Safety, 21, p. 257-265.
(4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in
Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, p. 25-33.
(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater
and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing
Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 47, p. 775-782.
(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and
Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. 20 p.
(8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley M. C. and Calow P. (1989). The long term
maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In:
Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Lkke, H. Tyle & F.
Bro-Rasmussen. Eds.), p. 144-148.
(9) Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity test with
Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, p. 1-8.
(10) Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water quality variables:
salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), p. 185-196.
(11) Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F-1990. Biologice Prace, 36, 209.
(12) Sims I. R., Watson S. and Holmes D. (199 3). Toward a standard Daphnia juvenile production test.
Environmental Toxicology and Chemistry, 12, p. 2053-2058.
(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon
with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, p. 459-466.
(14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a
control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, p. 1096-1121.
(15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, p. 482-491.
(16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are
compared with a zero dose control. Biometrics 27, p. 103-117.
(17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28,
p. 510-531.
(18) Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N.Y.
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of
growth at low doses. Weed Research, 29, p. 93-96.
(20) Wilson E. O. and Bossert, W. H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc.
Publishers.
(21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. McGraw-Hill Series in Population Biology,
New York, p. 532.
(22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L. and Boyce M. S. (1986). Estimating uncertainty in population
growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, p. 1156-1166.
Apndice I
PREPARAO DOS MEIOS TOTALMENTE DEFINIDOS ELENDT M7 E M4
Aclimatao aos meios Elendt M7 e M4
Alguns laboratrios tiveram dificuldades na transferncia directa de Daphnia para os meios M4 (1) e M7. No entanto,
obteve-se algum sucesso com uma aclimatao gradual, isto , transferindo do prprio meio para Elendt a 30 %, a 60 % e,
por fim, a 100 %. Os perodos de aclimatao necessrios podem atingir a durao de um ms.
PREPARAO
Elementos vestigiais
Em primeiro lugar, preparam-se solues de reserva separadas (I) de elementos vestigiais individuais em gua com um grau
de pureza adequado por exemplo, desionizada, destilada ou submetida a osmose inversa. A partir destas solues de
reserva individuais (I), preparada uma segunda soluo de reserva simples (II), que contm todos os elementos vestigiais
(soluo combinada), isto :
Solues de reserva I
(substncia simples)
Quantidade
adicionada
gua
(mg/l)
Concentrao
(em relao ao
meio M4)
x (vezes)
Para preparar a soluo de reserva
combinada II, adicionar a seguinte
quantidade de soluo de reserva I
gua
(ml/l)
M 4 M 7
H
3
BO
3
57 190 20 000 1,0 0,25
MnCl
2
* 4 H
2
O 7 210 20 000 1,0 0,25
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25
RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25
SrCl
2
* 6 H
2
O 3 040 20 000 1,0 0,25
NaBr 320 20 000 1,0 0,25
Na
2
MoO
4
* 2 H
2
O 1 260 20 000 1,0 0,25
CuCl
2
* 2 H
2
O 335 20 000 1,0 0,25
ZnCl
2
260 20 000 1,0 1,0
CoCl
2
* 6 H
2
O 200 20 000 1,0 1,0
Kl 65 20 000 1,0 1,0
Na
2
SeO
3
43,8 20 000 1,0 1,0
NH
4
VO
3
11,5 20 000 1,0 1,0
Na
2
EDTA 2 H
2
O 5 000 2 000
FeSO
4
* 7 H
2
O 1 991 2 000
Ambas as solues Na
2
EDTA e FeSO
4
so preparadas individualmente, juntas e imediatamente autoclavadas. Isto d:
21 soluo Fe-EDTA 1 000 20,0 5,0
Meios M4 e M7
Os meios M4 e M7 so preparados utilizando a soluo de reserva II, os macronutrientes e as vitaminas tal como indicado:
Quantidade
adicionada
gua
(mg/l)
Concentrao
(relacio-nada
com o meio M4)
X (vezes)
Quantidade de soluo de reserva
adicionada para preparar o meio
ml/l
M 4 M 7
Soluo de reserva 11 elementos vestigiais
combinados
20 50 50
Solues de reserva de macronutrientes (substncia nica)
CaCl
2
* 2 H
2
O 293 800 1 000 1,0 1,0
MgSO
4
* 7 H
2
O 246 600 2 000 0,5 0,5
KCl 58 000 10 000 0,1 0,1
NaHCO
3
64 800 1 000 1,0 1,0
Na
2
SiO
3
* 9 H
2
O 50 000 5 000 0,2 0,2
NaNO
3
2 740 10 000 0,1 0,1
KH
2
PO
4
1 430 10 000 0,1 0,1
K
2
HPO
4
1 840 10 000 0,1 0,1
Soluo de reserva de vitaminas 10 000 0,1 0,1
A soluo de reserva de vitaminas preparada adicionando as trs vitaminas a 1 l de gua como se mostra em baixo::
Hidrocloreto de tiamina 750 10 000
Cianocobalamina (B
12
) 10 10 000
Biotina 7,5 10 000
A soluo de reserva de vitaminas armazenada e congelada em pequenas alquotas. As vitaminas so adicionadas ao meio imediatamente
antes da utilizao.
Notas: Para evitar a precipitao dos sais quando se prepara o meio completo, adicionar as alquotas de solues de reserva a cerca de 500-
-800 ml de gua desionizada e perfazer at 1 l.
A primeira publicao relativa ao meio M4 tem a seguinte referncia: Elendt, B.P. (1990). Selenium deficiency in crustacea: an ultras-
-tructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
Apndice 2
ANLISE DO CARBONO ORGNICO TOTAL (COT) E PRODUO DE UM NOMOGRAMA PARA O TEOR
COT DAS ALGAS QUE SERVEM DE ALIMENTO
Reconhece-se que o teor de carbono das algas que servem de alimento no ser normalmente medido directamente, mas sim
atravs de correlaes (isto , nomogramas) com medies alternativas, tais como o nmero de clulas de algas ou a
absorvncia).
O COT deve ser medido por oxidao a alta temperatura em vez de utilizar mtodos de UV ou persulfato. (ver: The
Instrumental Determination of Total Organic Carbon. Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49
High Holborn, London WC1V 6HB).
Para a elaborao do nomograma, as algas devem ser separadas do meio de crescimento por centrifugao, seguida de re-
-suspenso em gua destilada. Medir o parmetro de substituio e a concentrao de COT em cada amostra em triplicado.
Devem ser analisados brancos de gua destilada e a concentrao de COT dever ser deduzida a partir da concentrao de
COT presente na amostra de algas.
O nomograma deve ser linear em toda a gama de concentraes de carbono necessria. So indicados a seguir alguns
exemplos.
Nota: Estes exemplos no devero ser aproveitados para efectuar converses; essencial que os laboratrios preparem os
seus prprios nomogramas.
Apndice 3
EXEMPLO DE FOLHAS DE DADOS COM REGISTO DA RENOVAO DOS MEIOS, DADOS DE MONITORIZAO FSICA/QUMICA, ALIMENTAO, REPRODUO DE DAPHNIA E
MORTALIDADE DE ADULTOS
Experincia nmero: Dados iniciais: Clone: Meio: Tipo de alimento Substncia de ensaio: Conc. nominal:
Dia 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Renovao do
meio (assinalar
os dias)
PH (
1
) novo
velho
O
2
mg/l (
1
) novo
velho
Temperatura
(
o
C) (
1
)
novo
velho
Alimentos for-
necidos (assina-
lar os dias)
Nmero de des-
cendentes vivos
Total
Recipiente 1
2
3
4
5
6
7
8
L
1
4
2
/
6
8
8
P
T
J
o
r
n
a
l
O
f
i
c
i
a
l
d
a
U
n
i
o
E
u
r
o
p
e
i
a
3
1
.
5
.
2
0
0
8
Experincia nmero: Dados iniciais: Clone: Meio: Tipo de alimento Substncia de ensaio: Conc. nominal:
Dia 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
9
10
Total
Mortalidade cumulativa
de adultos
(
1
) Indicar o recipiente utilizado na experincia.
3
1
.
5
.
2
0
0
8
P
T
J
o
r
n
a
l
O
f
i
c
i
a
l
d
a
U
n
i
o
E
u
r
o
p
e
i
a
L
1
4
2
/
6
8
9
Apndice 4
EXEMPLO DE FOLHA DE DADOS PARA REGISTO DE RESULTADOS DA ANLISE QUMICA
a) Concentraes medidas
Conc. nominal
Amostra da semana 1 Amostra da semana 2 Amostra da semana 3
Nova Velha Nova Velha Nova Velha
b) Concentraes medidas em percentagem do valor nominal
Conc. nominal
Amostra da semana 1 Amostra da semana 2 Amostra da semana 3
Nova Velha Nova Velha Nova Velha
Apndice 5
CLCULO DA MDIA PONDERADA EM FUNO DO TEMPO
Mdia ponderada em funo do tempo
Considerando que a concentrao da substncia de ensaio pode diminuir durante o perodo entre renovaes do meio,
necessrio determinar um valor de concentrao representativo da gama de concentraes a que os progenitores Daphnia
foram expostos. A determinao desse valor deve basear-se tanto em consideraes biolgicas como estatsticas. Por
exemplo, se se considerar que a reproduo afectada principalmente pela concentrao mxima experimentada, dever
utilizar-se a concentrao mxima, No entanto, se se considerar que o efeito acumulado ou a longo prazo da substncia
txica tem um peso mais importante, ser mais adequado utilizar um valor mdio de concentrao. Neste caso, a
concentrao mdia ponderada em funo do tempo ser um valor apropriado, uma vez que considera a variao da
concentrao instantnea ao longo do tempo.
Figura 1:
Exemplo de mdia ponderada em funo do tempo
A figura 1 mostra um exemplo de um ensaio (simplificado) com a durao de sete dias, em que o meio renovado nos dias
0, 2 e 4.
A linha em ziguezague representa a concentrao ao longo do tempo. Assume-se que a queda do valor de
concentrao segue uma curva exponencial.
Os seis pontos representados no grfico representam as concentraes medidas no incio e fim de cada perodo de
renovao.
A linha mais espessa indica a posio da mdia ponderada em funo do tempo.
A mdia ponderada em funo do tempo calculada de modo a que a rea abaixo desse valor seja igual rea abaixo da
curva de concentrao. O quadro 1 apresenta em pormenor o clculo correspondente ao exemplo da figura 1.
Quadro 1:
Clculo da mdia ponderada em funo do tempo
Nmero da renovao Dias Conc0 Conc 1 Ln(Conc0) Ln(Concl) rea
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544
3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781
Nmero da renovao Dias Conc0 Conc 1 Ln(Conc0) Ln(Concl) rea
Total de dias: 7 rea total 50,091
Mdia pon-
derada em
funo do
tempo
7,156
A coluna Dias corresponde ao nmero de dias no perodo de renovao.
A coluna Conc0 corresponde concentrao medida no incio de cada perodo de renovao.
A coluna Conc1 corresponde concentrao medida no fim de cada perodo de renovao.
A coluna Ln(Conc0) corresponde ao logaritmo natural de Conc0.
A coluna Ln(Conc1) corresponde ao logaritmo natural de Concl.
A coluna rea corresponde rea abaixo da curva exponencial para cada perodo de renovao. calculada atravs da seguinte frmula:
rea =
Conc0 Conc1
Ln Conc0 Ln Conc1
Dias
A mdia ponderada em funo do tempo (MPFT) a rea total dividida pelo Total de dias.
Para o ensaio de reproduo de Daphnia, o quadro dever, obviamente, ser aumentado de modo a abranger 21 dias.
bvio que, quando as observaes se limitam ao princpio e ao fim de cada perodo de renovao, no possvel
confirmar se o decaimento segue, de facto, uma curva exponencial. Uma curva diferente resultar num clculo diferente para
os valores da rea. No entanto, o decaimento seguindo uma curva exponencial constitui um modelo plausvel, que no
de excluir e que, na ausncia de outras informaes, constituir, provavelmente, a curva mais adequada.
No entanto, necessrio tomar algum cuidado no caso de a anlise qumica no permitir detectar a substncia no fim do
perodo de renovao. A no ser que seja possvel estimar a velocidade a que a substncia desapareceu da soluo,
impossvel obter uma rea realista abaixo da curva e, consequentemente, impossvel obter uma mdia ponderada em
funo do tempo que seja razovel.
C.21. MICROoRGANISMOS DO SOLO: ENSAIO DE TRANSFORMAO DE AZOTO
1. MTODO
O presente mtodo de ensaio baseia-se na publicao OCDE TG 216 (1999).
1.1. INTRODUO
O presente mtodo de ensaio descreve um mtodo laboratorial concebido para a investigao dos efeitos, a
longo prazo, resultantes de uma nica exposio a produtos qumicos, na capacidade de transformao do
azoto pelos microorganismos do solo. O ensaio baseia-se, fundamentalmente, nas recomendaes da
Organizao Europeia e Mediterrnica para a Proteco das Plantas (1), embora tenham sido igualmente
consideradas outras linhas de orientao, nomeadamente as fornecidas pelas seguintes organizaes:
Biologische Bundesanstalt da Alemanha (2); Agncia de Proteco do Ambiente dos EUA (3); SETAC (4) e
Organizao Internacional de Normalizao (ISO) (5). As orientaes respeitantes ao nmero e tipo de solos a
utilizar neste ensaio so as acordadas na reunio de trabalho da OCDE sobre Seleco de Solos/Sedimentos que
decorreu em Belgirate, Itlia, em 1995 (6). As recomendaes respeitantes recolha, manuseamento e
armazenamento de amostras de solos baseiam-se nas normas ISO 10381-6 (7) e nas recomendaes da
reunio de Belgirate. A determinao e avaliao das caractersticas de toxicidade de determinadas substncias
de ensaio podero requerer a determinao dos seus efeitos sobre a actividade microbiana dos solos, por
exemplo, quando se pretendem conhecer os potenciais efeitos secundrios de produtos utilizados na proteco
de culturas agrcolas sobre a microflora do solo ou quando se prev a exposio dos microorganismos do solo
a outro tipo de substncias qumicas. O ensaio de transformao de azoto aplica-se na determinao dos efeitos
destes produtos sobre a microflora do solo. No ensaio de produtos qumicos agrcolas (por exemplo, produtos
de proteco de culturas, fertilizantes, qumicos florestais) devero realizar-se os ensaios de transformao de
azoto e de transformao de carbono. Nos ensaios de produtos qumicos no agrcolas, considera-se suficiente
a realizao do ensaio de transformao de azoto, ressalvando-se os casos em que os valores de CE
50
obtidos no
ensaio de transformao de azoto se encontrem dentro dos valores correspondentes aos inibidores de
nitrificao comerciais (por exemplo, nitrapirina), casos em que deve ser efectuado um ensaio de transformao
de carbono no sentido de se obter informao adicional.
Os solos so misturas complexas e heterogneas de elementos vivos e no vivos. Os microorganismos
desempenham um papel importante na decomposio e transformao da matria orgnica em solos frteis
atravs de processos complexos em que diversas espcies contribuem de forma distinta para cada um dos
factores que determinam a fertilidade do solo. Por este motivo, qualquer interferncia a longo prazo nos
processos bioqumicos envolvidos constitui uma potencial interferncia nos ciclos nutricionais, podendo vir a
afectar a fertilidade do solo. A transformao de carbono e de azoto ocorre em todos os solos frteis e, ainda
que as comunidades de microorganismos responsveis por estes processos divirjam de solo para solo, as vias e
processos de transformao so essencialmente os mesmos.
O Mtodo de Ensaio aqui descrito foi desenvolvido com o objectivo de determinar os efeitos adversos a longo
prazo de uma substncia no processo de transformao de azoto em solos aerbios de superfcie. Este mtodo
de ensaio permite ainda estimar os efeitos dos produtos testados sobre a transformao de carbono pela
microflora dos solos. Uma vez que a formao de nitratos ocorre subsequentemente quebra das ligaes
azoto-carbono, a observao de taxas idnticas de produo de nitratos em solos tratados e de referncia indica
que muito elevada a probabilidade de as principais etapas de degradao do carbono se encontrarem intactas
e funcionais. O substrato escolhido para o ensaio (farinha de luzerna) possui uma relao carbono/azoto
adequada (geralmente entre 12/1 e 16/1). Por este motivo, a privao de carbono reduzida durante o ensaio e,
no caso de as comunidades de microorganismos serem afectadas por um produto qumico, ser possvel a sua
recuperao num perodo de 100 dias.
Os ensaios que serviram de base ao presente Mtodo de Ensaio foram inicialmente desenvolvidos para
substncias relativamente s quais possvel estimar a quantidade de substncia que atinge o solo. o caso, por
exemplo, dos produtos utilizados para a proteco de culturas agrcolas, uma vez que conhecida a sua taxa de
aplicao nos campos. No caso de produtos qumicos agrcolas, considera-se suficiente o ensaio de duas doses
relevantes, relativamente taxa de aplicao estimada ou prevista. Os produtos qumicos agrcolas podem ser
testados como ingredientes activos (i.a.) ou como formulaes. A aplicao deste ensaio no se limita, no
entanto, a produtos qumicos agrcolas. Fazendo variar simultaneamente a quantidade de substncia de ensaio
aplicada no solo e o mtodo de avaliao dos dados, o ensaio poder ser igualmente utilizado em situaes em
que no conhecida a quantidade de produto qumico que atinge o solo Deste modo, para produtos qumicos
no agrcolas, devero determinar-se os efeitos de uma srie de concentraes sobre a transformao de azoto e
utilizar-se os dados obtidos nesses ensaios para construir uma curva de dose-resposta, a partir da qual se
calculam os valores de CE
x
, em que x corresponde percentagem de efeito.
1.2. DEFINIES
Transformao de azoto: a degradao total por microorganismos de matria orgnica contendo azoto,
atravs do processo de amonificao e nitrificao, at ao respectivo nitrato inorgnico final.
EC
x
(Concentrao Efectiva): a concentrao da substncia de ensaio no solo que resulta numa
percentagem x de inibio da transformao de azoto em nitrato.
EC
50
(Concentrao Mdia Efectiva): a concentrao da substncia de ensaio no solo que resulta em 50 %
de inibio da transformao de azoto em nitrato.
Nenhuma.
Depois de peneirado, adiciona-se ao solo uma farinha de cereal, aps o que se reserva uma parte que ir ser
utilizada como controlo e se trata o restante com a substncia de ensaio. No ensaio de produtos qumicos
agrcolas recomenda-se o teste de um mnimo de duas concentraes, que devero ser escolhidas tendo em
conta a maior concentrao de substncia que se prev que venha a ser aplicada no campo. Aps 0, 7, 14 e
28 dias de incubao, procede-se extraco de amostras dos solos tratados e de controlo com um solvente
adequado e determinam-se as quantidades de nitratos nos extractos. A taxa de formao de nitratos nas
amostras tratadas comparada com a taxa de formao de nitratos nas amostras de controlo e calcula-se a
percentagem de desvio das amostras tratadas. Todos os ensaios tm uma durao mnima de 28 dias. Se ao 28.
o
dia as diferenas entre as amostras tratadas e as amostras no tratadas forem iguais ou superiores a 25 %,
devero continuar a efectuar-se medies at ao limite de 100 dias. Nos ensaios de produtos qumicos no
agrcolas, adiciona-se uma srie de concentraes da substncia de ensaio a amostras de solo, medindo-se as
quantidades de nitratos formadas nas amostras tratadas e nas amostras de controlo aps 28 dias de incubao.
Os resultados dos ensaios com mltiplas concentraes so analisados atravs de um modelo de regresso, com
base no qual se calculam os valores de CE
X
(isto : CE
50
, CE
25
ou CE
10
). Ver definies.
1.5 VALIDADE DO ENSAIO
As anlises dos resultados dos ensaios com produtos qumicos agrcolas baseiam-se em diferenas
relativamente pequenas (isto , com um valor mdio de 25 %) entre as concentraes de nitrato nas
amostras de solo tratadas e nas amostras de controlo. Por este motivo, e uma vez que grandes variaes entre as
amostras de controlo podem conduzir a resultados falsos, a variao entre repeties das amostras de controlo
deve ser inferior a 15 %.
1.6.1. Equipamento
Os recipientes utilizados durante o ensaio devem ser de materiais quimicamente inertes e ter uma capacidade
adequada ao mtodo usado na incubao dos solos, isto , a granel ou numa srie de amostras de solo
individualizadas (ver seco 1.7.1.2). Devem tomar-se precaues no sentido de minimizar as perdas de gua e
permitir trocas gasosas durante o ensaio (por exemplo, os recipientes de ensaio podem ser cobertos com folhas
de polietileno perfuradas). Para o ensaio de substncias volteis, devem ser usados recipientes selveis e
estanques com dimenses que permitam que aproximadamente um quarto do seu volume seja ocupado pela
amostra de solo.
Utiliza-se, para alm do equipamento corrente de laboratrio, o seguinte equipamento:
mecanismo de agitao: agitador mecnico ou equipamento equivalente,
mecanismo de centrifugao (3 000 g) ou de filtrao (uso de filtro que no contenha nitratos),
instrumento de sensibilidade e reprodutibilidade adequadas para anlise de nitratos.
1.6.2. Seleco e nmero de solos
No presente ensaio utiliza-se um nico solo, cujas caractersticas recomendadas so as seguintes:
teor de areia: no inferior a 50 % e no superior a 75 %,
pH: 5,5 a 7,5,
teor de carbono orgnico: 0,5 a 1,5 %,
a biomassa microbiana deve ser medida (8)(9) e o seu teor de carbono deve corresponder, no mnimo, a
1 % do total de carbono orgnico do solo.
Na maioria dos casos, um solo com estas caractersticas representa a situao menos favorvel, uma vez que
nestas condies a adsoro da substncia qumica de ensaio mnima e a sua disponibilidade para a
microflora mxima. Por este motivo, a realizao de ensaios com outros solos geralmente desnecessria.
Contudo, em determinadas circunstncias, por exemplo, quando se prev que a substncia de ensaio venha a
ser principalmente utilizada em solos especficos, tais como solos florestais acdicos, ou para produtos
qumicos com carga electrosttica, poder ser necessrio utilizar um solo adicional.
1.6.3. Recolha e armazenamento das amostras de solo
1.6.3.1. Recolha
Deve existir, e estar disponvel, informao pormenorizada sobre a histria do local donde foram recolhidas, as
amostras de solo para o ensaio. A informao necessria inclui a localizao exacta, o coberto vegetal, as datas
dos tratamentos com produtos utilizados para a proteco de culturas agrcolas, os tratamentos com
fertilizantes orgnicos e inorgnicos, as aplicaes de materiais biolgicos e as de contaminaes acidentais.
Dever ser escolhido, para a recolha de solo, um local que permita o seu uso a longo prazo. Consideram-se
locais adequados: as pastagens permanentes, os campos com culturas anuais de cereais ( excepo de milho)
ou os campos densamente semeados para produo de adubo natural. No local escolhido para a amostragem
no devem ter sido aplicados produtos de proteco de culturas agrcolas, pelo menos, durante o ltimo ano,
nem nenhum fertilizante orgnico, pelo menos, nos ltimos seis meses. O uso de fertilizantes minerais apenas
poder ser aceite quando em concordncia com as necessidades das culturas agrcolas e, nesse caso, a recolha de
amostras de solo no dever ser efectuada antes de passados trs meses aps a aplicao do fertilizante. Deve
ser evitado o uso de solos tratados com fertilizantes que tenham efeitos biocidas conhecidos (por exemplo,
cianamida de clcio).
Deve ser evitada a recolha de amostras durante, ou imediatamente aps, perodos longos (superiores a 30 dias)
de seca ou de excessos de gua. Em solos lavrados, as amostras devem ser recolhidas a uma profundidade de 0 a
20 cm. Nas pastagens ou outros solos que no so lavrados durante perodos longos (pelo menos, uma poca
de cultivo), a profundidade mxima de amostragem pode ser ligeiramente superior a 20 cm (por exemplo, at
25 cm).
As amostras de solo devem ser transportadas em recipientes adequados, em condies de temperatura que
garantam que as propriedades iniciais do solo no so alteradas de forma significativa.
1.6.3.2. Armazenamento
Sempre que possvel, de preferir a utilizao de amostras de solos recolhidas na altura. Nos casos em que o
armazenamento em laboratrio no possa ser evitado, os solos devem ser armazenados no escuro, a uma
temperatura de 4 2
o
C e por um perodo mximo de trs meses. Durante o armazenamento dos solos, devem
ser asseguradas condies aerbias. Se os solos forem recolhidos em zonas onde permanecem gelados por
perodos iguais ou superiores a trs meses por ano, poder ser considerada a hiptese do seu armazenamento
durante seis meses a uma temperatura entre 18
o
C negativos e 22
o
C negativos. A biomassa microbiana de
solos armazenados medida antes de cada experincia e o teor de carbono na biomassa no dever ser inferior
a 1 % do teor total de carbono orgnico no solo (ver seco 1.6.2).
1.6.4. Manuseamento e preparao do solo para o ensaio
1.6.4.1. Pr-incubao
Se o solo esteve armazenado (ver seco 1.6.3.2), recomenda-se um perodo de pr-incubao de 2 a 28 dias. A
temperatura e a humidade do solo durante a pr-incubao e o ensaio devem ser idnticas s utilizadas durante
o ensaio (ver seces 1.6.4.2 e 1.7.1.3).
1.6.4.2. Caractersticas fsico-qumicas
Os objectos de grandes dimenses (por exemplo, pedras, pedaos de plantas, etc.) so removidos manualmente
do solo e a amostra peneirada hmida, evitando dessecao excessiva, de forma a reduzir as partculas a uma
dimenso mxima de 2 mm. O teor de humidade da amostra de solo deve ser ajustado com gua destilada ou
desionizada para um valor entre 40 % e 60 % da sua capacidade mxima de reteno de gua.
1.6.4.3. Adio de substrato orgnico
Dever ser adicionado ao solo um substrato orgnico adequado por exemplo, farinha de luzerna-erva-relva
(componente principal: Medicago sativa) com uma relao C/N entre 12/1 e 16/1. A relao luzerna-solo
recomendada de 5 g de luzerna por quilograma de solo (peso seco).
1.6.5. Preparao da substncia de ensaio para aplicao no solo
A aplicao da substncia de ensaio no solo envolve, geralmente, a utilizao de um excipiente (matriz de
transporte), que pode ser gua (para substncias hidrossolveis) ou um slido inerte, como, por exemplo, areia
fina de quartzo (tamanho de partculas: 0,1 a 0,5 mm). A utilizao de outros excipientes lquidos (por
exemplo, solventes orgnicos, como acetona, clorofrmio) deve ser evitada devido possibilidade de virem a
afectar a microflora. Nos casos em que se use areia como excipiente, esta pode ser coberta com a substncia de
ensaio em soluo ou suspenso num solvente adequado. Nesses casos, o solvente deve ser removido por
evaporao antes da mistura com o solo. De modo a optimizar a distribuio da substncia de ensaio no solo,
recomenda-se uma relao de 10 g de areia por quilograma de solo (peso seco). As amostras de controlo so
tratadas com uma quantidade equivalente de gua ou de areia de quartzo (sem adio de substncia de ensaio).
Nos ensaios de produtos qumicos volteis importa, tanto quanto possvel, evitar perdas durante o tratamento e
procurar assegurar a homogeneidade da distribuio dos produtos no solo (por exemplo, as substncias de
ensaio devem ser injectadas em diferentes locais do solo).
Nos ensaios de produtos qumicos agrcolas devem ser usadas pelo menos duas concentraes. A concentrao
inferior deve reflectir, no mnimo, a quantidade mxima que se espera que, na prtica, venha a atingir o solo,
enquanto a concentrao mais elevada deve ser um mltiplo da concentrao inferior. As concentraes da
substncia de ensaio adicionada ao solo so calculadas assumindo uma incorporao uniforme at uma
profundidade de 5 cm e uma densidade aparente do solo de 1,5. Para produtos qumicos agrcolas que so
aplicados directamente no solo ou para compostos qumicos cuja quantidade que atinge o solo pode ser
prevista, as concentraes recomendadas so a mxima concentrao prevista no ambiente (predicted
environmental concentration, PEC) e cinco vezes o valor dessa concentrao. Nos casos em que se prev que as
substncias sejam aplicadas diversas vezes no solo durante uma mesma estao, devem ser efectuados ensaios a
concentraes correspondentes multiplicao da PEC pelo nmero mximo de aplicaes previsto. Contudo,
a concentrao mxima de ensaio no deve exceder dez vezes a taxa mxima para uma nica aplicao. Nos
ensaios de produtos qumicos no agrcolas. deve ser usada uma srie geomtrica de, pelo menos, cinco
concentraes. As concentraes usadas devem cobrir a gama necessria para os clculos dos valores de CE
x
.
1.7.1. Condies de Exposio
1.7.1.1. Tratamento e Controlo
Nos ensaios de produtos qumicos agrcolas, o solo dividido em trs pores de igual peso. Duas pores so
misturadas com o excipiente contendo o produto e a terceira misturada apenas com o excipiente (amostra de
controlo). Recomenda-se um mnimo de trs repeties para ambos os solos, tratado e de controlo. Nos ensaios
de produtos qumicos no agrcolas, o solo dividido em seis pores de igual peso. Cinco das amostras so
misturadas com o excipiente contendo o produto e a sexta misturada com o excipiente no activado.
Recomendam-se trs repeties para ambos os solos, tratado e de controlo. Devem ser tomadas precaues de
modo a assegurar uma distribuio homognea da substncia de ensaio nas amostras de solo tratadas. Durante
a mistura deve evitar-se a aglomerao ou compactao do solo.
1.7.1.2. Incubao das amostras de solo
A incubao das amostras de solo pode ser realizada de duas formas: usando cada um dos solos, tratado e de
controlo, como amostras nicas ou dividindo-os numa srie de subamostras individualizadas e de igual peso.
Contudo, no caso de substncias volteis, os ensaios devem ser realizados obrigatoriamente na forma de sries
de subamostras individuais. Quando os solos so incubados como amostras nicas, preparam-se grandes
quantidades de cada solo, tratado e de controlo, e vo-se retirando subamostras para anlise, conforme
necessrio, ao longo do ensaio. A quantidade de solo inicialmente preparada para cada tratamento e para cada
controlo depende do tamanho das subamostras a retirar durante o ensaio, do nmero de repeties a realizar e
do nmero mximo de tempos de amostragem previsto. Os solos incubados como amostras nicas devem ser
misturados vigorosamente antes de cada subamostragem. Quando os solos so incubados como uma srie de
amostras individualizadas, cada solo tratado e de controlo inicialmente dividido no nmero de subamostras
pretendido e estas utilizadas conforme necessrio. Nas experincias em que se prevem mais de dois tempos de
amostragem, devem preparar-se subamostras em nmero suficiente para todas as repeties de todas as
amostragens. Pelo menos, trs repeties do solo de ensaio devem ser incubadas em condies aerbias (ver
seco 1.7.1.1). Os recipientes utilizados durante todos os testes devem possuir um volume livre suficiente para
impedir o desenvolvimento de condies anaerbias. Nos casos em que as substncias de ensaio so volteis, o
ensaio s deve ser realizado com sries de subamostras individualizadas.
1.7.1.3. Condies e durao dos ensaios
O ensaio realizado em cmara escura temperatura de 202
o
C. Durante o ensaio, o teor de humidade das
amostras de solo deve. ser mantido entre 40 % e 60 % da capacidade mxima de reteno de gua do solo (ver
seco 1.6.4.2), com uma variao mxima de 5 %. Sempre que necessrio, pode adicionar-se gua destilada
ou desionizada.
A durao mnima do ensaio de 28 dias. Nos ensaios de produtos qumicos agrcolas, comparam-se as taxas
de formao de nitratos nas amostras tratadas e de controlo. Se estes valores diferirem em mais de 25 % aps o
28.
o
dia, o ensaio continua at que essa diferena atinja um valor igual ou inferior a 25 % ou at ao 100.
dia.
Para compostos qumicos no agrcolas, o ensaio tem a durao de 28 dias. No 28.
o
dia, determinam-se as
quantidades de nitratos nas amostras de solo tratadas e de controlo e calculam-se os valores de CE
x
.
1.7.2. Amostragem e anlise dos solos
1.7.2.1. Calendrio de amostragem dos solos
Nos ensaios de produtos qumicos agrcolas, analisa-se a quantidade de nitratos nas amostras de solo nos dias 0,
7, 14 e 28. Caso seja necessrio prolongar o ensaio, aps o 28.
o
dia devem efectuar-se medies com intervalos
de 14 dias.
Nos ensaios de produtos qumicos no agrcolas, testa-se um mnimo de cinco concentraes de ensaio e a
anlise de nitratos nas amostras de solo efectua-se no incio (dia 0) e no fim do perodo de exposio (28.
o
dia).
Nos casos em que tal se revele necessrio, podem realizar-se medies intermdias por exemplo, ao 7. dia.
Os dados obtidos ao 28. dia so utilizados para determinar o valor de CE
X
para o produto qumico. Se
desejado, os dados obtidos para a amostra de controlo no dia 0 podem ser utilizados para indicar a quantidade
inicial de nitratos no solo.
1.7.2.2. Anlise das amostras de solo
Para cada repetio de cada amostra de solo, tratada e de controlo, determina-se a quantidade de nitratos
formada em cada tempo de amostragem. Os nitratos so removidos do solo por agitao das amostras num
solvente de extraco adequado por exemplo, uma soluo 0,1 M de cloreto de potssio. Recomenda-se uma
razo de 5 ml de soluo de KCl por equivalente de grama de solo (peso seco). Para optimizar a extraco, a
mistura da amostra de solo com a soluo de extraco no deve ocupar mais de metade do volume do
recipiente de extraco. As misturas so agitadas a 150 rpm durante 60 minutos e em seguida centrifugadas ou
filtradas, sendo a fase lquida resultante analisada para deteco de nitratos. Os extractos lquidos livres de
partculas slidas podem ser armazenados antes de analisados, devendo ser mantidos a 205
o
C negativos at
um mximo de seis meses.
2. DADOS
2.1. TRATAMENTO DE RESULTADOS
Nos ensaios efectuados com produtos qumicos agrcolas, regista-se a quantidade de nitratos formada em cada
repetio de cada amostra de solo e os valores mdios do conjunto de repeties devem ser apresentados numa
tabela. As taxas de transformao de azoto devem ser analisadas usando mtodos estatsticos usuais e
adequados (por exemplo, Teste-F, nvel de significncia de 5 %). As quantidades de nitratos formados
expressam-se em mg nitrato/kg solo (peso seco)/dia. A taxa de formao de nitratos em cada tratamento
comparada com a da respectiva amostra de controlo, calculando-se o desvio, em percentagem, da amostra de
teste relativamente ao controlo.
Nos ensaios efectuados com produtos qumicos no agrcolas, determina-se a quantidade de nitratos formados
em cada repetio e traa-se uma curva de dose-resposta para estimar os valores de CE
x
. As quantidades de
nitratos isto , mg nitrato/kg solo (peso seco) obtidas para as amostras tratadas, aps 28 dias so
comparadas com as quantidades obtidas para as amostras de controlo. A partir destes resultados, calcula-se a
percentagem de inibio para cada concentrao de ensaio. As percentagens obtidas so representadas num
grfico em funo da concentrao e, usando procedimentos estatsticos, determinam-se os valores de CE
X
. Os
limites de confiana (p = 0,95) para os valores de CE
x
calculados so igualmente determinados usando
mtodos-padro (10) (11) (12).
No caso de conterem quantidades elevadas de azoto, as substncias de ensaio podem contribuir para as
quantidades de nitratos formadas durante o ensaio. Por este motivo, em ensaios com elevadas concentraes
dessas substncias (por exemplo, compostos qumicos que se prev que venham a ser usados em aplicaes
repetidas), devem ser includas amostras de controlo adequadas (isto , uma mistura de solo com a substncia
de ensaio, sem a farinha vegetal). Os dados dessas amostras de controlo devem ser tidos era conta nos clculos
de CE
x
.
Quando, na avaliao dos resultados dos ensaios com produtos qumicos agrcolas, a diferena entre as taxas de
formao de nitratos entre o tratamento com a menor concentrao (isto , correspondente mxima
concentrao prevista para a situao real) e a respectiva amostra de controlo for igual ou inferior a 25 % em
qualquer amostragem efectuada aps o 28. dia, o produto pode ser considerado como no tendo influncia a
longo prazo na transformao de azoto dos solos. Para ensaios envolvendo produtos qumicos no agrcolas,
os valores CE50, CE
25
ou CE
10
so utilizados como indicadores.
3. RELATRIO
O relatrio do ensaio deve incluir a seguinte informao:
Identificao completa do solo utilizado, incluindo:
referncia geogrfica do local (latitude, longitude),
informao sobre a caracterizao histrica do local (isto , coberto vegetal, tratamentos com produtos
de proteco das culturas agrcolas, tratamentos com fertilizantes, contaminaes acidentais, etc.),
uso do solo (por exemplo, solo agrcola, floresta, etc.),
profundidade de amostragem (cm),
teor de areia/lama/argila ( % peso seco),
pH (em gua),
teor de carbono orgnico ( % peso seco),
teor de azoto ( % peso seco),
concentrao inicial de nitratos (mg nitratos/kg peso seco),
biomassa microbiana, em termos de percentagem de carbono orgnico total,
referncia dos mtodos usados na determinao de cada parmetro,
toda a informao relacionada com a recolha e armazenamento das amostras de solo,
pormenores sobre a pr-incubao do solo, quando existir.
natureza fsica e, quando relevante, propriedades fsico-qumicas,
dados de identificao qumica, sempre que relevantes, incluindo frmula estrutural, pureza (teor do
componente activo, em percentagem, no caso dos produtos de proteco das culturas agrcolas), teor de
azoto.
Substrato:
origem do substrato,
composio (isto , farinha de luzerna, farinha de luzerna-erva-relva),
teor de carbono e azoto ( % peso seco),
dimetro dos peneiras (mm).
Condies de ensaio:
pormenores sobre a adio de substrato orgnico ao solo,
nmero de concentraes do produto qumico de ensaio que foram testadas e, quando adequado,
justificao das concentraes de ensaio escolhidas,
pormenores sobre a aplicao da substncia de ensaio no solo,
teor de humidade do solo no incio e durante o ensaio,
mtodo usado na incubao do solo (isto , como amostra nica ou como sries de subamostras
individualizadas),
nmero de repeties,
tempos de amostragem,
mtodo usado para extraco de nitratos do solo;
Resultados:
procedimento analtico e equipamento usado na anlise de nitratos,
tabelas de resultados, incluindo valores individuais e valores mdios para as medies de nitratos,
variao entre repeties nas amostras tratadas e nas amostras de controlo,
explicao das correces efectuadas nos clculos, quando relevantes,
a variao percentual da taxa de formao de nitratos em cada ponto de amostragem ou, quando
adequado, o valor de CE
50
com um limite de confiana de 95 %, outros valores de CE
x
(isto , CE
25
ou
CE
10
), com os respectivos intervalos de confiana, e a representao grfica da curva de dose-resposta,
tratamento estatstico dos resultados,
toda a informao e observaes teis para a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection
Chemicals. Captulo 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBAGuidelines for the Official Testing of Plant
Protection Products, VI, 1-1 (2.
a
edio, 1990).
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances
Control Act Test Guidelines; Proposed rule. 28 de Setembro de 1987.
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed.
M. R. Lynch, Pub. SETAC-Europa, Bruxelas.
(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in
Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Comit Tcnico ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality
Biological Methods.
(6) OCDE (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Itlia,
18-20 de Janeiro de 1995.
(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil
for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality Determination of soil microbial biomass Part 1: Substrate-
-induced respiration method.
(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality Determination of soil microbial biomass Part 2: Fumigation-
-extraction method.
(10) Litchfield, J. T. e Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour.
Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
(11) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3.
a
edio, Cambridge, Londres e Nova Iorque.
(12) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, Reino Unido.
C.22. MICROORGANISMOS DO SOLO: ENSAIO DE TRANSFORMAO DE CARBONO
1. MTODO
O presente mtodo de ensaio baseia-se na publicao OCDE TG 217 (1999).
1.1. INTRODUO
O presente mtodo de ensaio descreve um mtodo laboratorial concebido para a investigao dos potenciais
efeitos, a longo prazo, resultantes de uma nica exposio a produtos de proteco de culturas agrcolas, e
possivelmente outras substncias qumicas, na capacidade de transformao do carbono pelos micro-
organismos do solo. O ensaio baseia-se, fundamentalmente, nas recomendaes da Organizao Europeia e
Mediterrnica para a Proteco das Plantas (1), embora tenham sido igualmente consideradas outras linhas de
orientao, nomeadamente as fornecidas pelas seguintes organizaes: Biologische Bundesanstalt da Alemanha
(2); Agncia de Proteco do Ambiente dos EUA (3) e SETAC (4). As orientaes respeitantes ao nmero e tipo
de solos a utilizar neste ensaio so as acordadas na reunio de trabalho da OCDE sobre Seleco de Solos/
/Sedimentos que decorreu em Belgirate, Itlia, em 1995 (5). As recomendaes respeitantes recolha,
manuseamento e armazenamento de amostras de solos baseiam-se nas normas ISO 10381-6 (6) e nas
recomendaes da reunio de Belgirate.
A determinao e avaliao das caractersticas de toxicidade de determinadas substncias de ensaio podero
requerer a determinao dos seus efeitos sobre a actividade microbiana dos solos, por exemplo, quando se
pretende conhecer os potenciais efeitos secundrios de produtos utilizados na proteco de culturas agrcolas
sobre a microflora do solo ou quando se prev a exposio dos microorganismos do solo a outro tipo de
substncias qumicas. O ensaio de transformao de carbono aplica-se na determinao dos efeitos destes
produtos sobre a microflora do solo. No ensaio de produtos qumicos agrcolas (por exemplo, produtos de
proteco de culturas, fertilizantes, qumicos florestais) devem realizar-se os ensaios de transformao de
carbono e de transformao de azoto. Nos ensaios de produtos qumicos no agrcolas, considera-se suficiente
a realizao do ensaio de transformao de azoto, ressalvando-se os casos em que os valores de CE
50
obtidos no
ensaio de transformao de azoto se encontrem dentro dos valores correspondentes aos inibidores de
nitrificao comerciais (por exemplo, nitrapirina), casos em que deve ser efectuado um ensaio de transformao
de carbono no sentido de se obter informao adicional.
Os solos so misturas complexas e heterogneas de elementos vivos e no vivos. Os microorganismos
desempenham um papel importante na decomposio e transformao da matria orgnica em solos frteis
atravs de processos complexos em que diversas espcies contribuem de forma distinta para cada um dos
factores que determinam a fertilidade do solo. Por este motivo, qualquer interferncia a longo prazo nos
processos bioqumicos envolvidos constitui uma potencial interferncia nos ciclos nutricionais, podendo vir a
afectar a fertilidade do solo. A transformao de carbono e de azoto ocorre em todos os solos frteis e, ainda
que as comunidades de microorganismos responsveis por estes processos divirjam de solo para solo, as vias e
processos de transformao so essencialmente os mesmos.
O Mtodo de Ensaio aqui descrito foi desenvolvido com o objectivo de determinar os efeitos adversos a longo
prazo de uma substncia, no processo de transformao de carbono em solos aerbios de superfcie. O ensaio
sensvel a alteraes na dimenso e actividade das comunidades microbianas responsveis pela transformao
do carbono, na medida em que sujeita essas comunidades simultaneamente a condies de stress qumico e de
privao de carbono. Utiliza-se um solo arenoso pobre em matria orgnica. O solo tratado com a substncia
de ensaio e incubado em condies tais que permitem um rpido metabolismo microbiano, e sob as quais as
fontes de carbono acessveis no solo se esgotam rapidamente. O processo provoca o empobrecimento de
carbono, causando simultaneamente a morte das clulas microbianas e a induo do estado de letargia ou
esporulao. Se o teste decorrer durante um perodo superior a 28 dias, o somatrio destas reaces pode ser
medido em amostras de controlo (solo no tratado) como uma perda progressiva da biomassa microbiana
metabolicamente activa (7). Se a biomassa de um solo em stress por privao de carbono, nas condies de
ensaio, afectada pela presena de um produto qumico, a recuperao do solo poder no se verificar at ao
mesmo nvel que o solo de controlo. Por este motivo, as perturbaes causadas pela substncia de ensaio, em
qualquer momento do ensaio, mantm-se geralmente at ao final do mesmo.
Os ensaios que serviram de base ao presente Mtodo de Ensaio foram inicialmente desenvolvidos para
substncias relativamente s quais possvel estimar a quantidade de substncia que atinge o solo. o caso, por
exemplo, dos produtos utilizados para a proteco de culturas agrcolas, uma vez que conhecida a sua taxa de
aplicao nos campos. No caso de produtos qumicos agrcolas, considera-se suficiente o ensaio de duas doses
relevantes, relativamente taxa de aplicao estimada ou prevista. Os produtos qumicos agrcolas podem ser
testados como ingredientes activos (i.a.) ou como formulaes. A aplicao deste ensaio no se limita, no
entanto, a produtos qumicos agrcolas. Fazendo variar simultaneamente a quantidade de substncia de ensaio
aplicada no solo e o mtodo de avaliao dos dados, o ensaio poder ser igualmente utilizado em situaes em
que no conhecida a quantidade de produto qumico que atinge o solo. Deste modo, para produtos qumicos
no agrcolas, devero determinar-se os efeitos de uma srie de concentraes sobre a transformao de
carbono e utilizar-se os dados obtidos nesses ensaios para construir uma curva de dose-resposta, a partir da
qual se calculam os valores de CE
x
, em que x corresponde percentagem de efeito.
1.2. DEFINIES
Transformao de carbono: a degradao da matria orgnica por microorganismos at formar um produto
final inorgnico, o dixido de carbono.
EC
x
(Concentrao Efectiva): a concentrao da substncia de ensaio no solo que resulta numa
percentagem x de inibio da transformao de carbono em dixido de carbono.
EC
50
(Concentrao Mdia Efectiva): a concentrao da substncia de ensaio no solo que resulta em 50 %
de inibio da transformao de carbono em dixido de carbono.
Nenhuma.
O solo peneirado tratado com a substncia de ensaio ou deixado por tratar (controlo). No ensaio de produtos
qumicos agrcolas recomenda-se o teste de um mnimo de duas concentraes, que devero ser escolhidas
tendo em conta a maior concentrao de substncia que se prev que venha a ser aplicada no campo. Aps 0,
7, 14 e 28 dias de incubao, amostras do solo tratadas e de controlo so misturadas com glucose e a taxa de
respirao induzida pela glucose medida durante 12 horas consecutivas. As taxas de respirao so expressas
em termos de dixido de carbono libertado (mg dixido de carbono/kg solo seco/h) ou de oxignio consumido
(mg oxignio/kg solo/h). A taxa mdia de respirao nas amostras tratadas comparada com a das respectivas
amostras de controlo e calcula-se a percentagem de desvio das amostras tratadas relativamente s de controlo.
Todos os ensaios tm uma durao mnima de 28 dias. Se ao 28.
o
dia as diferenas entre as amostras tratadas e
as amostras no tratadas forem iguais ou superiores a 25 %, devem continuar a efectuar-se medies, em
intervalos de 14 dias, at ao limite de 100 dias. Nos ensaios de produtos qumicos no agrcolas, adiciona-se
uma srie de concentraes da substncia de ensaio a amostras de solo e medem-se as taxas de respirao
induzida por glucose (isto , a mdia das quantidades de dixido de carbono formado ou de oxignio
consumido) aps 28 dias. Os resultados dos ensaios com mltiplas concentraes so analisados atravs de um
modelo de regresso, com base no qual se calculam os valores de CE
x
(isto : CE
50
, CE
25
ou CE
10
). Ver
definies.
As anlises dos resultados dos ensaios com produtos qumicos agrcolas baseiam-se em diferenas
relativamente pequenas (isto , com um valor mdio de 25 %) entre as quantidades de dixido de carbono
libertado ou de oxignio consumido nas (ou pelas) amostras de solo tratadas e nas (ou pelas) amostras de
controlo. Por este motivo, e uma vez que grandes variaes entre as amostras de controlo podem conduzir a
resultados falsos, a variao entre repeties das amostras de controlo deve ser inferior a 15 %.
1.6.1. Equipamento
Os recipientes utilizados durante o ensaio devem ser de materiais quimicamente inertes e ter uma capacidade
adequada ao mtodo usado na incubao dos solos, isto , a granel ou numa srie de amostras de solo
individualizadas (ver seco 1.7.1.2). Devem tomar-se precaues no sentido de minimizar as perdas de gua e
permitir trocas gasosas durante o ensaio (por exemplo, os recipientes de ensaio podem ser cobertos com folhas
de polietileno perfuradas). Para o ensaio de substncias volteis, devem ser usados recipientes selveis e
estanques com dimenses que permitam que aproximadamente um quarto do seu volume seja ocupado pela
amostra de solo.
Para a determinao da taxa de respirao induzida pela glucose, so necessrios sistemas de incubao e
instrumentos para medir a produo de dixido de carbono ou o consumo de oxignio. Na literatura
encontram-se exemplos destes sistemas e instrumentos (8) (9) (10) (11).
1.6.2. Seleco e nmero de solos
No presente ensaio utiliza-se um nico solo, cujas caractersticas recomendadas so as seguintes:
teor de areia: no inferior a 50 % e no superior a 75 %;
pH: 5,5 a 7,5;
teor de carbono orgnico: 0,5 a 1,5 %;
a biomassa microbiana deve ser medida (12)(13) e o seu teor de carbono deve corresponder, no mnimo,
a 1 % do carbono orgnico total do solo.
Na maioria dos casos, um solo com estas caractersticas representa a situao menos favorvel, uma vez que
nestas condies a adsoro da substncia qumica de ensaio mnima e a sua disponibilidade para a
microflora mxima. Por este motivo, a realizao de ensaios com outros solos geralmente desnecessria.
Contudo, em determinadas circunstncias, por exemplo, quando se prev que a substncia de ensaio venha a
ser principalmente utilizada em solos especficos, tais como solos florestais acdicos, ou para produtos
qumicos com carga electrosttica, poder ser necessrio utilizar um outro tipo de solo.
1.6.3. Recolha e armazenamento das amostras de solo
1.6.3.1. Recolha
Deve existir, e estar disponvel, informao pormenorizada sobre a histria do local donde foram recolhidas as
amostras de solo para o ensaio. A informao necessria inclui a localizao exacta, o coberto vegetal, as datas
dos tratamentos com produtos utilizados para a proteco de culturas agrcolas, dos tratamentos com
fertilizantes orgnicos e inorgnicos, das aplicaes de materiais biolgicos ou de contaminaes acidentais.
Dever ser escolhido, para a recolha de solo, um local que permita o seu uso a longo prazo. Consideram-se
locais adequados: as pastagens permanentes, os campos com culturas anuais de cereais ( excepo de milho)
ou os campos densamente semeados para produo de adubo verde. No local escolhido para a amostragem no
devem ter sido aplicados produtos de proteco de culturas agrcolas, pelo menos, durante o ltimo ano, nem
nenhum fertilizante orgnico, pelo menos, nos ltimos seis meses. O uso de fertilizantes minerais apenas
poder ser aceite quando em concordncia com as necessidades das culturas agrcolas e, nesse caso, a recolha de
amostras de solo no dever ser efectuada antes de passados trs meses aps a aplicao do fertilizante. Deve
ser evitado o uso de solos tratados com fertilizantes que tenham efeitos biocidas conhecidos (por exemplo,
cianamida de clcio).
Deve ser evitada a recolha de amostras durante, ou imediatamente aps, perodos longos (superiores a 30 dias)
de seca ou de explorao de guas. Em solos lavrados, as amostras devem ser recolhidas a uma profundidade de
0 a 20 cm. Nas pastagens ou outros solos que no so lavrados durante perodos longos (pelo menos, uma
poca de cultivo), a profundidade mxima de amostragem pode ser ligeiramente superior a 20 cm (por
exemplo, at 25 cm). As amostras de solo devem ser transportadas em recipientes adequados e em condies
de temperatura que garantam que as propriedades iniciais do solo no so alteradas de forma significativa.
Sempre que possvel, prefervel a utilizao de amostras de solos recolhidas na altura. Nos casos em que o
armazenamento em laboratrio no possa ser evitado, os solos devem ser armazenados no escuro, a uma
temperatura de 42
o
C e por um perodo mximo de trs meses. Durante o armazenamento dos solos, devem
ser asseguradas condies aerbias. Se os solos forem recolhidos em zonas onde permanecem gelados por
perodos iguais ou superiores a trs meses por ano, poder ser considerada a hiptese do seu armazenamento
durante seis meses a uma temperatura de 18
o
C negativos. A biomassa microbiana de solos armazenados
medida antes de cada experincia e o teor de carbono na biomassa no dever ser inferior a 1 % do teor total de
carbono orgnico no solo (ver seco 1.6.2).
1.6.4. Manuseamento e preparao do solo para o ensaio
1.6.4.1. Pr-incubao
Se o solo esteve armazenado (ver seco 1.6.3.2), recomenda-se um perodo de pr-incubao de 2 a 28 dias. A
temperatura e a humidade do solo durante a pr-incubao e o ensaio devem ser idnticas s utilizadas durante
o ensaio (ver seces 1.6.4.2 e 1.7.1.3).
1.6.4.2. Caractersticas fsico-qumicas
Os objectos de grandes dimenses (por exemplo, pedras, pedaos de plantas, etc.) so removidos manualmente
do solo e a amostra peneirada hmida, evitando a dessecao excessiva, de forma a reduzir as partculas a
uma dimenso mxima de 2 mm. O teor de humidade da amostra de solo deve ser ajustado com gua destilada
ou desionizada para um valor entre 40 % e 60 % da sua capacidade mxima de reteno de gua.
1.6.5. Preparao da substncia de ensaio para aplicao no solo
A aplicao da substncia de ensaio no solo envolve, geralmente, a utilizao de um excipiente (matriz de
transporte), que pode ser gua (para substncias hidrossolveis) ou um slido inerte, como, por exemplo, areia
fina de quartzo (tamanho de partculas: 0,1 a 0,5 mm). A utilizao de outros excipientes lquidos (por
exemplo, solventes orgnicos, como acetona, clorofrmio) deve ser evitada devido possibilidade de virem a
afectar a microflora. Nos casos em que se use areia como excipiente, esta pode ser coberta com a substncia de
ensaio em soluo ou suspenso num solvente adequado. Nesses casos, o solvente deve ser removido por
evaporao antes da mistura com o solo. De modo a optimizar a distribuio da substncia de ensaio no solo,
recomenda-se uma relao de 10 g de areia por quilograma de solo (peso seco). As amostras de controlo so
tratadas com uma quantidade equivalente de gua ou de areia de quartzo (sem adio de substncia de ensaio).
Nos ensaios de produtos qumicos volteis importa, tanto quanto possvel, evitar perdas durante o tratamento e
procurar assegurar a homogeneidade da distribuio dos produtos no solo (por exemplo, as substncias de
ensaio devem ser injectadas em diferentes locais do solo).
Nos ensaios de produtos utilizados para proteco de culturas agrcolas, ou outros produtos qumicos cujas
concentraes ambientais possam ser previstas, devem ser usadas, pelo menos, duas concentraes. A
concentrao inferior deve reflectir, no mnimo, a quantidade mxima que se espera que, na prtica, venha a
atingir o solo, enquanto a concentrao mais elevada deve ser um mltiplo da concentrao inferior. As
concentraes da substncia de ensaio adicionada ao solo so calculadas assumindo uma incorporao
uniforme at uma profundidade de 5 cm e uma densidade aparente do solo de 1,5. Para produtos qumicos
agrcolas que so aplicados directamente no solo ou para compostos qumicos cuja quantidade que atinge o
solo pode ser prevista, as concentraes recomendadas so a mxima concentrao prevista no ambiente
(predicted environmental concentration, PEC) e cinco vezes o valor dessa concentrao. Nos casos em que se
prev que as substncias sejam aplicadas diversas vezes no solo durante uma mesma estao, devem ser
efectuados ensaios a concentraes correspondentes multiplicao da PEC pelo nmero mximo de
aplicaes previsto. Contudo, a concentrao mxima de ensaio no deve exceder dez vezes a taxa mxima para
uma nica aplicao.
Nos ensaios de produtos qumicos no agrcolas deve ser usada uma srie geomtrica de, pelo menos, cinco
concentraes. As concentraes usadas devem cobrir a gama necessria para os clculos dos valores de CE
x
.
1.7.1. Condies de Exposio
1.7.1.1. Tratamento e Controlo
Nos ensaios de produtos qumicos agrcolas, o solo dividido em trs pores de igual peso. Duas pores so
misturadas com o excipiente contendo o produto e a terceira misturada apenas com o excipiente (amostra de
controlo). Recomenda-se um mnimo de trs repeties para ambos os solos, tratado e de controlo. Nos ensaios
de produtos qumicos no agrcolas, o solo dividido em seis pores de igual peso. Cinco das amostras so
misturadas com o excipiente contendo o produto e a sexta misturada com o excipiente no activado.
Recomendam-se trs repeties para ambos os solos, tratado e de controlo. Devem ser tomadas precaues de
modo a assegurar uma distribuio homognea da substncia de ensaio nas amostras de solo tratadas. Durante
a mistura deve evitar-se a aglomerao ou compactao do solo.
1.7.1.2. Incubao das amostras de solo
A incubao das amostras de solo pode ser realizada de duas formas: usando cada um dos solos, tratado e de
controlo, como amostras nicas, ou dividindo-os numa srie de subamostras individualizadas e de igual peso.
Contudo, no caso de substncias volteis, os ensaios devem ser realizados obrigatoriamente na forma de sries
de subamostras individuais. Quando os solos so incubados como amostras nicas, preparam-se grandes
quantidades de cada solo, tratado e de controlo, e vo-se retirando subamostras para anlise, conforme
necessrio, ao longo do ensaio. A quantidade de solo inicialmente preparada para cada tratamento e para cada
controlo depende do tamanho das subamostras a retirar durante o ensaio, do nmero de repeties a realizar e
do nmero mximo de tempos de amostragem previsto. Os solos incubados como amostras nicas devem ser
misturados vigorosamente antes de cada subamostragem. Quando os solos so incubados como uma srie de
amostras individualizadas, cada solo tratado e de controlo inicialmente dividido no nmero de subamostras
pretendido e estas utilizadas conforme necessrio. Nas experincias em que se prevem mais de dois tempos de
amostragem, devem preparar-se subamostras em nmero suficiente para todas as repeties de todas as
amostragens. Pelo menos, trs repeties do solo de ensaio devem ser incubadas em condies aerbias (ver
seco 1.7.1.1). Os recipientes utilizados durante todos os testes devem possuir um volume livre suficiente para
impedir o desenvolvimento de condies anaerbias. Nos casos em que as substncias de ensaio so volteis, o
ensaio s deve ser realizado com sries de subamostras individualizadas.
1.7.1.3. Condies e durao dos ensaios
O ensaio realizado em cmara escura temperatura de 20 2
o
C. Durante o ensaio, o teor de humidade das
amostras de solo deve ser mantido entre 40 % e 60 % da capacidade mxima de reteno de gua do solo (ver
seco 1.6.4.2), com uma variao mxima de 5 %. Sempre que necessrio, pode adicionar-se gua destilada
ou desionizada.
A durao mnima do ensaio de 28 dias. Nos ensaios de produtos qumicos agrcolas, comparam-se as
quantidades de dixido de carbono libertado ou de oxignio consumido entre as amostras tratadas e de
controlo. Se estes valores diferirem em mais de 25 % aps o 28.
o
dia, o ensaio continua at que essa diferena
atinja um valor igual ou inferior a 25 % ou at ao 100.
o
dia. Para compostos qumicos no agrcolas, o ensaio
tem a durao de 28 dias. No 28.
o
dia, determinam-se as quantidades de dixido de carbono libertado ou de
oxignio consumido nas amostras de solo tratadas e de controlo e calculam-se os valores de CE
X
.
1.7.2. Amostragem e anlise dos solos
1.7.2.1. Calendrio de amostragem dos solos
Nos ensaios de produtos qumicos agrcolas, analisam-se as taxas de respirao induzida pela glucose atravs
das quantidades de dixido de carbono libertado ou de oxignio consumido nas amostras de solo nos dias 0, 7,
14 e 28. Caso seja necessrio prolongar o ensaio, aps o 28.
o
dia devem efectuar-se medies com intervalos de
14 dias.
Nos ensaios de produtos qumicos no agrcolas, testa-se um mnimo de cinco concentraes de ensaio e a
anlise da taxa de respirao induzida pelo glucose efectua-se no incio do ensaio (dia 0) e no fim do perodo de
exposio (28.
o
dia). Nos casos em que tal se revele necessrio, podem realizar-se medies intermdias por
exemplo ao 7.
o
dia. Os dados obtidos ao 28. dia so utilizados para determinar o valor de CE
x
para o produto
qumico. Se desejado, os dados obtidos para a amostra de controlo no dia 0 podem ser utilizados para indicar
as quantidades iniciais de biomassa microbiana metabolicamente activa no solo (12).
1.7.2.2. Medida das taxas de respirao induzida por glucose
Para cada repetio de cada amostra de solo, tratada e de controlo, determina-se a taxa de respirao induzida
por glucose em cada tempo de amostragem. As amostras de solo so misturadas com uma quantidade de
glucose suficiente para provocar uma resposta mxima de respirao imediata. A quantidade de glucose
necessria para provocar a resposta mxima de respirao de um dado solo pode ser determinada atravs de um
teste preliminar usando uma srie de concentraes de glucose (14). Contudo, para solos arenosos com 0,5 a
1,5 % de carbono orgnico, 2 000 a 4 000 mg de glucose por kg de solo (peso seco) so, em geral, suficientes.
A glucose pode ser pulverizada com areia limpa de quartzo [10 g areia/kg de solo (peso seco)] e misturada com
o solo de forma homognea.
As amostras de solo adicionadas de glucose so incubadas num aparelho adequado para a determinao de
taxas de respirao, em regime contnuo, de hora a hora ou de duas em duas horas (ver seco 1.6.1) a 202
o
C.
O dixido de carbono libertado, ou o oxignio consumido, medido durante 12 horas consecutivas e as
medies devem iniciar-se logo que possvel, isto , 1 ou 2 horas aps o suplemento de glucose. A partir dos
dados obtidos, determinam-se as quantidades totais de dixido de carbono libertado, ou de oxignio
consumido, durante as 12 horas, assim como as taxas mdias de respirao.
2. DADOS
2.1. TRATAMENTO DE RESULTADOS
Nos ensaios efectuados com produtos qumicos agrcolas, regista-se a quantidade de dixido de carbono
libertado, ou de oxignio consumido, em cada repetio de cada amostra de solo e os valores mdios do
conjunto de repeties devem ser apresentados numa tabela. Os resultados devem ser avaliados usando
mtodos estatsticos usuais e adequados (por exemplo, Teste-F, nvel de significncia de 5 %). As taxas de
respirao induzida pela glucose expressam-se em mg dixido de carbono/kg solo (peso seco)/h ou mg
oxignio/kg solo (peso seco)/h. A taxa mdia de formao de dixido de carbono, ou a taxa mdia de consumo
de oxignio, em cada tratamento comparada com a da amostra de controlo, calculando-se o desvio, em
percentagem, da amostra de teste relativamente ao controlo.
Nos ensaios efectuados com produtos qumicos no agrcolas, determinam-se as quantidades de dixido de
carbono libertado, ou de oxignio consumido, em cada repetio e traa-se uma curva de dose-resposta para
estimar os valores de CE
X
. As taxas de respirao induzida pela glucose [isto , mg dixido de carbono/kg solo
(peso seco)/h ou mg oxignio/kg solo (peso seco)/h] obtidas para as amostras tratadas aps 28 dias so
comparadas com as obtidas para as amostras de controlo. A partir destes resultados, calculam-se os valores
percentuais de inibio para cada concentrao de ensaio. As percentagens obtidas so representadas num
grfico em funo da concentrao e, usando procedimentos estatsticos, determinam-se os valores de CE
x
. Os
limites de confiana (p = 0,95) para os valores de CE
x
calculados so igualmente determinados usando
mtodos-padro (15) (16) (17).
Quando, na avaliao dos resultados dos ensaios com produtos qumicos agrcolas, a diferena entre as taxas de
respirao entre o tratamento com a menor concentrao (isto , correspondente mxima concentrao
prevista para a situao real) e a respectiva amostra de controlo for igual ou inferior a 25 % em qualquer
amostragem efectuada aps o 28.
o
dia, o produto pode ser considerado como no tendo influncia a longo
prazo na transformao de carbono dos solos. Para ensaios envolvendo produtos qumicos no agrcolas, os
valores CE
50
, CE
25
ou CE
10
so utilizados como indicadores.
3. RELATRIO
RELATRIO DO ENSAIO
O relatrio do ensaio deve incluir a seguinte informao:
Identificao completa do solo utilizado, incluindo:
referncia geogrfica do local (latitude, longitude),
informao sobre a caracterizao histrica do local (isto , coberto vegetal, tratamentos com
produtos de proteco das culturas agrcolas, tratamentos com fertilizantes, contaminaes
acidentais, etc.),
uso do solo (por exemplo, solo agrcola, floresta, etc.),
profundidade de amostragem (cm),
teor de areia/lama/argila ( % peso seco),
pH (em gua),
teor de carbono orgnico ( % peso seco),
teor de azoto ( % peso seco),
biomassa microbiana inicial, em termos de percentagem de carbono orgnico total,
referncia dos mtodos usados na determinao de cada parmetro,
toda a informao relacionada com a recolha e armazenamento das amostras de solo,
pormenores sobre a pr-incubao do solo, quando exista.
natureza fsica e, quando relevante, propriedades fsico-qumicas,
dados de identificao qumica, sempre que relevantes, incluindo frmula estrutural, pureza (teor
do componente activo, em percentagem, no caso dos produtos de proteco de culturas agrcolas),
teor de azoto.
Condies de ensaio:
pormenores sobre a correco do solo com substrato orgnico,
nmero de concentraes do produto qumico de ensaio que foram testadas e, quando adequado,
justificao das concentraes de ensaio escolhidas,
pormenores sobre a aplicao da substncia de ensaio no solo,
teor de humidade do solo no incio e durante o ensaio,
mtodo usado na incubao do solo (isto , como amostra nica ou como sries de subamostras
individualizadas),
nmero de repeties,
tempos de amostragem;
Resultados:
mtodo e equipamento usado para a medio das taxas de respirao,
tabelas de resultados, incluindo valores individuais e valores mdios para as quantidades de dixido
de carbono ou oxignio,
variao entre repeties nas amostras tratadas e nas amostras de controlo,
explicao das correces efectuadas nos clculos, quando relevantes,
a variao percentual da taxa de respirao induzida pela glucose em cada ponto de amostragem
ou, quando adequado, o valor de CE
50
com um limite de confiana de 95 %, ou outros valores de
CE
x
(isto , CE
25
ou CE
10
), com os respectivos intervalos de confiana, e a representao grfica da
curva de dose-resposta,
tratamento estatstico dos resultados, quando apropriado,
toda a informao e observaes teis para a interpretao dos resultados.
4. REFERNCIAS
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection
Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBAGuidelines for the Official Testing of Plant
Protection Products, VI, 1-1 (2.
a
edio, 1990).
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicty Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances
Control Act Test Guidelines; Proposed rule. 28 de Setembro de 1987.
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed.
M. R. Lynch, Pub. SETAC-Europa, Bruxelas.
(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Itlia,
(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil
for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
(7) Anderson, J. P. E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments, in Pesticide Effects on
Soil Microflora. Eds. L. Somerville and M. P. Greaves, Captulo 3: 45-60.
(8) Anderson, J. P. E. (1982). Soil Respiration, in Methods of Soil Analysis Part 2: Chemical and
Microbiological Properties. Agronomy Monograph N
o
9. Eds. A. L. Page, R. H. Miller and D. R. Keeney.
41:831- 871.
(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1.
Aerobic Conditions.
(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of
organic chemicals in soil under aerobic conditions.
(11) Heinemeye, O., Insam, H., Kaiser, E. A, e Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration
measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.
(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality Determination of soil microbial biomass Part 1: Substrate-
-induced respiration method.
(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality Determination of soil microbial biomass Part 2: Fumigation-
extraction method.
(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einflu von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden
Gegenber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of
Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an
Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120.
(15) Litchfield, J. T. e Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour.
Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
(16) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3.
a
edio, Cambridge, Londres e Nova Iorque.
(17) Finney D. J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, Reino Unido.
C.23. TRANSFORMAES AERBIAS E ANAERBIAS NO SOLO
1. MTODO
O presente mtodo baseia-se na publicao OECD TG 307 (2002).
1.1. INTRODUO
O presente Mtodo de Ensaio baseia-se nas orientaes existentes (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). O mtodo
descrito no presente Mtodo de Ensaio foi concebido para avaliar as transformaes aerbias e anaerbias de
produtos qumicos no solo. As experincias a realizar tm como objectivo a determinao (i) da taxa de
transformao da substncia de ensaio e (ii) da natureza e taxas de formao e degradao de produtos de
transformao a que as plantas e organismos do solo possam ser expostos. Os estudos descritos neste Mtodo
de Ensaio so requeridos quer para produtos qumicos directamente aplicados no solo quer para substncias
que o possam vir a atingir. Os resultados dos presentes estudos laboratoriais podero igualmente vir a ser
utilizados para o desenvolvimento de protocolos de amostragem e anlise em reas de estudo relacionadas.
Para a avaliao das vias de transformao, geralmente suficiente a realizao de estudos aerbios e
anaerbios com um nico tipo de solo (8) (10) (11). Pelo contrrio, a determinao das taxas de transformao
dever basear-se em anlises efectuadas em, pelo menos, mais trs solos diferentes (8) (10).
O nmero e tipos de solos que devem ser utilizados no presente ensaio foram acordados numa reunio de
trabalho da OCDE sobre seleco de solos e sedimentos, que decorreu em Belgirate, Itlia, em 1995 (10). Os
tipos de solos a ensaiar devem ser representativos das condies ambientais onde a substncia de ensaio vir a
ser utilizada ou libertada no ambiente. Por exemplo, os produtos qumicos que podem vir a ser libertados em
climas subtropicais a tropicais devem ser ensaiados com Ferrasoles ou Nitosoles (sistema FAO). Da referida
reunio saram igualmente recomendaes relativas recolha, manipulao e armazenamento das amostras de
solos, tendo como base a Orientao ISO (15). No presente mtodo considera-se igualmente a utilizao de
solos de arrozais paddy.
1.2. DEFINIES
Substncia de ensaio: Qualquer substncia, quer se trate do composto inicial ou de produtos de
transformao relevantes.
Produtos de transformao: Todas as substncias resultantes de reaces de transformao biticas ou
abiticas da substncia de ensaio, incluindo CO
2
e produtos presentes nos resduos ligados.
Resduos ligados: Os resduos ligados representam compostos presentes no solo, planta ou animal, que, aps
extraco, persistam na matriz, quer na forma da substncia inicial quer como um dos seus metabolitos/
/produtos de transformao. O mtodo de extraco no poder alterar substancialmente nem os prprios
compostos nem a estrutura da matriz. A natureza da ligao poder ser parcialmente determinada utilizando
mtodos extractivos que alterem a matriz e atravs de tcnicas analticas sofisticadas. Tm sido identificadas
deste modo, por exemplo, ligaes do tipo covalente, inico e de absoro/adsoro, assim como encapsulao.
De um modo geral, a formao de resduos ligados reduz significativamente a bioacessibilidade e a
biodisponibilidade das substncias (12) [adaptado de IUPAC 1984 (13)].
Transformao aerbia: Reaces que ocorrem na presena de oxignio molecular (14).
Transformao anaerbia: Reaces que ocorrem na ausncia de oxignio molecular (14).
Solo: Mistura de componentes abiticos (constituintes qumicos minerais e orgnicos, em que os ltimos
incluem compostos com elevado contedo de carbono e azoto e de peso molecular elevado) e biticos
(pequenos organismos vivos, maioritariamente microorganismos). O solo pode ser manuseado em dois estados
distintos:
(a) no perturbado, tal como se desenvolveu ao longo do tempo, em camadas caractersticas de vrios tipos
de solos;
(b) perturbado, tal como normalmente encontrado em campos arveis ou como se apresenta quando a
recolha de amostras para utilizao no presente mtodo de ensaio feita por escavao (14).
Mineralizao: Degradao completa de um composto orgnico em CO
2
e H
2
O, em condies aerbias, ou
em CH
4
, CO
2
e H
2
O em condies anaerbias. No contexto do presente mtodo de ensaio, quando se utiliza
um composto marcado com
14
C, o termo mineralizao refere-se sua degradao extensa, envolvendo a
oxidao de um tomo de carbono marcado e a libertao da quantidade correspondente de
14
CO
2
(14).
Semivida: t
0,5
, o tempo necessrio para a transformao de 50 % da substncia de ensaio, nos casos em que a
transformao pode ser descrita por uma cintica de primeira ordem. A semivida da substncia independente
da sua concentrao.
DT
50
(Tempo de Desaparecimento 50): Tempo necessrio para reduzir a concentrao da substncia de
ensaio em 50 %; nos casos em que a transformao no segue uma cintica de primeira ordem, o valor de DT
50
diferente de t
0,5
(semivida).
DT
75
ensaio em 75 %.
DT
90
ensaio em 90 %.
A caracterizao e/ou identificao dos produtos de transformao atravs de mtodos espectroscpicos e
cromatogrficos dever envolver a utilizao de substncias de referncia.
O mtodo aplicvel a todas as substncias qumicas (no marcadas ou marcadas radioactivamente) para as
quais se encontre disponvel um mtodo analtico suficientemente sensvel e preciso. aplicvel a compostos
ligeiramente volteis, no volteis, solveis ou insolveis em gua. O ensaio no deve ser aplicado a compostos
qumicos muito volteis a partir do solo (por exemplo, fumigantes, solventes orgnicos) j que estes, nas
condies experimentais descritas, no podem ser mantidos no solo.
Enquanto para a medio da taxa de transformao podero ser utilizadas substncias de ensaio marcadas ou
no marcadas, para o estudo da via de transformao e para o estabelecimento do balano de massa
necessria a utilizao de compostos marcados. A marcao recomendada com
14
C, embora a utilizao de
outros istopos, tais como
13
C,
15
N,
3
H e
32
P, possa igualmente revelar-se til. A marcao deve ser feita, tanto
quanto possvel, na(s) zona(s) mais estvel(eis) da molcula (
1
). A pureza da substncia de ensaio deve ser de,
pelo menos, 95 %.
Antes de efectuar um ensaio sobre transformao aerbia ou anaerbia no solo, deve estar disponvel a seguinte
informao sobre a substncia de ensaio:
(a) solubilidade em gua (Mtodo A.6)
(b) solubilidade em solventes orgnicos;
(c) presso de vapor (Mtodo A.4) e constante da lei de Henry;
(d) coeficiente de partio n-octanol/gua (Mtodo A.8);
(e) estabilidade qumica no escuro (hidrlise) (Mtodo C.7);
(f) pK
a
se a molcula puder sofrer protonao ou desprotonao [Norma de Ensaio 112 da OCDE] (16).
Podero ser teis outras informaes como, por exemplo, a existncia de dados relativos toxicidade da
substncia de ensaio para os microorganismos do solo [Mtodos de Ensaio C.21 e C.22] (16).
Devero estar disponveis mtodos analticos (incluindo mtodos de extraco e erradicao) que permitam a
quantificao e identificao tanto da substncia de ensaio como dos seus produtos de transformao.
(
1
) Por exemplo, se a estrutura da substncia de ensaio inclui um anel, este dever ser marcado; no caso de a substncia de ensaio possuir
dois ou mais anis, poder ser necessrio efectuar estudos independentes de modo a avaliar o destino de cada um dos anis marcados e
obter informao adequada sobre a formao dos produtos de transformao.
1.6. PRINCIPIO DO MTODO DE ENSAIO
As amostras de solo so tratadas com a substncia de ensaio e incubadas no escuro em bales biomtricos ou
em sistemas de fluxo em condies laboratoriais controladas (com temperatura e humidade do solo
constantes). A intervalos de tempo adequados, extraem-se amostras de solo que so analisadas relativamente
substncia inicial e aos seus produtos de transformao. Os produtos volteis so igualmente recolhidos para
anlise utilizando dispositivos de absoro adequados. A utilizao de material marcado com
I4
C permite a
determinao das vrias taxas de mineralizao da substncia de ensaio atravs da recolha do
I4
CO
2
libertado e
o estabelecimento de um balano de massa que inclui a formao de resduos ligados ao solo.
1.7.1. Recuperao
A extraco e anlise de amostras de solo, pelo menos em duplicado imediatamente aps a adio da
substncia de ensaio, fornece uma primeira indicao relativa repetitividade do mtodo analtico e
uniformidade do procedimento de aplicao da substncia de ensaio. Os valores de recuperao em fases mais
adiantadas das experincias so obtidos atravs dos respectivos balanos de massa. Os valores de recuperao
devem variar entre 90 % e 110 % no caso de produtos qumicos marcados (8) e entre 70 % e 110 % no caso de
produtos qumicos no marcados (3).
1.7.2. Repetitividade e sensibilidade do mtodo analtico
A repetitividade do mtodo analtico (com excepo da eficincia de extraco inicial) na quantificao da
substncia de ensaio e dos produtos de transformao pode ser verificada pela anlise em duplicado do mesmo
extracto de solo, aps incubao durante o tempo suficiente para que ocorra a formao de produtos de
transformao.
O limite de deteco (LD) do mtodo analtico, tanto para a substncia de ensaio como para os produtos de
transformao, deve corresponder, no mnimo, ao menor dos seguintes valores: 0,01 mg kg
-1
de solo (como
substncia de ensaio) ou 1 % da dose aplicada. Deve ser igualmente especificado o limite de quantificao (LQ).
1.7.3. Preciso dos dados de transformao
A anlise de regresso das concentraes da substncia de ensaio em funo do tempo fornece informao
apropriada sobre a fiabilidade da curva de transformao e permite o clculo dos limites de confiana para as
semividas (no caso de cintica de pseudoprimeira ordem) ou os valores de DT
50
e, se adequado, os valores de
DT
75
e de DT
90
.
1.8.1. Equipamento e reagentes qumicos
Os sistemas de incubao consistem em sistemas estticos fechados ou em sistemas de fluxo adequados (7)(17),
dos quais se representam exemplos nas figuras 1 (aparelho adequado para a incubao de solos em sistema de
fluxo) e 2 (balo biomtrico). Ambos os tipos de sistemas de incubao apresentam vantagens e limitaes (7)
(17).
Para alm do material corrente de laboratrio, necessrio o seguinte:
Instrumentos analticos, tais como equipamento de GLC, HPLC, TLC, incluindo os sistemas de deteco
apropriados para a anlise de substncias marcadas radioactivamente ou no marcadas ou o mtodo de
diluio inversa de istopos;
Instrumentos para fins de identificao (por exemplo, MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR, etc.);
Contador de cintilaes;
Cmara de combusto oxidante para combusto do material radioactivo;
Centrfuga;
Aparelhos de extraco (por exemplo, tubos de centrfuga para extraco a frio e aparelho de Soxhlet para
extraco contnua em refluxo);
Instrumentao para concentrao de solues e extractos (por exemplo, evaporador rotativo);
Banho de gua;
Dispositivo para mistura mecnica (por exemplo, mquina de amassar, misturador rotativo).
Os reagentes qumicos a utilizar incluem, por exemplo:
NaOH, qualidade analtica, 2 mol . dm
-3
, ou outra base adequada (por exemplo, KOH, etanolamina);
H
2
SO
4
, qualidade analtica, 0,05 mol . dm
-3
;
Etilenoglicol, qualidade analtica;
Materiais slidos de adsoro, tais como cal de soda e pastilhas de poliuretano;
Solventes orgnicos, qualidade analtica, tais como acetona, metanol, etc.;
Lquido de cintilao.
1.8.2. Aplicao da substncia de ensaio
Com vista sua adio e distribuio no solo, a substncia de ensaio pode ser dissolvida em gua (desionizada
ou destilada) ou, quando necessrio, em quantidades mnimas de acetona ou de outros solventes orgnicos (6)
em que a substncia de ensaio seja suficientemente solvel e estvel. Neste caso, a quantidade do solvente
seleccionado no dever ter uma influncia significativa na actividade microbiana do solo (ver seces 1.5 e
1.9.2-1.9.3). Dever igualmente evitar-se a utilizao de solventes que inibam a actividade microbiana, tais
como clorofrmio, diclorometano e outros solventes halogenados.
A substncia de ensaio pode tambm ser adicionada na forma slida, por exemplo, misturada com areia de
quartzo (6) ou com uma pequena subamostra do solo a ensaiar que tenha sido previamente seca ao ar e
esterilizada. Neste caso, se a substncia de ensaio foi adicionada utilizando um solvente, dever-se- permitir a
evaporao deste antes da adio da subamostra contendo a substncia de ensaio amostra original, no estril,
de solo.
No caso de produtos qumicos de ocorrncia comum, cuja via principal de entrada no solo atravs de lamas
de esgotos ou actividades agrcolas, a substncia de ensaio dever ser adicionada s lamas que so em seguida
introduzidas na amostra de solo (ver seces 1.9.2 e 1.9.3).
Embora a utilizao sistemtica de produtos formulados no seja recomendada, em algumas situaes, como
por exemplo, no caso de substncias de ensaio pouco solveis, a utilizao deste tipo de produtos pode
constituir uma alternativa apropriada.
1.8.3. Solos
1.8.3.1. Seleco de solos
Para a determinao da via de transformao, poder utilizar-se um solo representativo. Nestes casos,
recomenda-se a escolha de um solo areno-limoso, franco-limoso, limoso ou limo-arenoso [de acordo com a
classificao da FAO e da USDA (18)] com um pH entre 5,5- 8,0, um contedo de carbono orgnico entre
0,5- 2,5 % e uma biomassa microbiana de, pelo menos, 1 % do carbono orgnico total (10).
Para estudos de taxas de transformao, devem utilizar-se pelo menos mais trs solos, que devero ser
representativos de uma gama de solos relevante e cujo teor em carbono orgnico, pH, argila e biomassa
microbiana dever variar (10).
Todos os solos devero ser caracterizados, pelo menos, em relao sua textura ( % de areia, % de silte, % de
argila) [de acordo com a classificao da FAO e da USDA (18)], pH, capacidade de troca catinica, carbono
orgnico, densidade aparente, caractersticas de reteno de gua (
1
) e biomassa microbiana (apenas no caso de
estudos aerbios); no entanto, a disponibilidade de outras informaes relativas s propriedades do solo poder
ser til para a interpretao dos resultados. Com vista determinao das caractersticas 4o solo, podem ser
utilizados os mtodos recomendados nas referncias (19)(20)(21)(22)(23). A biomassa microbiana dever ser
determinada pelo mtodo da respirao induzida pelo substrato (SIR) (25)(26) ou por mtodos alternati-
vos (20).
(
1
) As caractersticas de reteno de gua de um solo podem ser medidas como capacidade de campo, capacidade de reteno de gua ou
tenso de suco de gua (pF). Consultar o apndice 1 para mais pormenores. No relatrio dever referir-se se as caractersticas de
reteno de gua e densidade aparente dos solos foram determinadas em amostras de campo no perturbadas ou em amostras
perturbadas (processadas).
1.8.3.2. Recolha, manuseamento e armazenamento de solos
Deve estar disponvel informao pormenorizada sobre a histria do local de recolha do solo a ensaiar, que
inclua: a localizao exacta, o coberto vegetal, o eventual tratamento com produtos qumicos, fertilizantes
orgnicos e inorgnicos, a adio de matria biolgica ou outras contaminaes. No caso de terem sido
tratados com a substncia de ensaio ou seus anlogos estruturais nos quatro anos imediatamente anteriores, os
solos no devem ser utilizados para estudos de transformao (10) (15),
A amostra de solo dever ter sido recolhida recentemente (do horizonte A ou at 20 cm da camada superior) e
o seu contedo de gua dever ser tal que facilite a crivagem. Para outros solos que no os provenientes de
arrozais paddy, deve evitar-se a amostragem durante ou imediatamente aps longos perodos (> 30 dias) de seca,
gelo ou inundao (14). Na medida do possvel, as amostras devem ser transportadas de modo a minimizar
alteraes no contedo de gua do solo e devem ser mantidas no escuro, em condies de boa ventilao. Para
este fim, geralmente adequada a utilizao de sacos de polietileno fechados frouxamente.
Aps a recolha, o solo dever ser processado to depressa quanto possvel. Aps a remoo da vegetao, fauna
macroscpica e pedras, o solo passado atravs de um peneiro de 2 mm, que remove as pequenas pedras e
restos da fauna e plantas. Antes da crivagem, devem evitar-se a secagem e o esmagamento extensivos do
solo (15).
Nos casos em que a recolha das amostras difcil durante o Inverno (solo congelado ou coberto de camadas de
neve), a amostragem poder ser feita a partir de um lote de solo armazenado numa estufa e coberto por
vegetao (por exemplo, erva ou misturas de erva e trevo). Embora haja uma acentuada preferncia por estudos
efectuados com solos recolhidos na altura, nos casos em que o solo recolhido e processado tenha de ser
armazenado antes do incio do estudo, as condies de armazenamento devem ser adequadas e de curta
durao (4 2
o
C durante trs meses, no mximo) de modo a manter a actividade microbiana (
1
). Nas
referncias (8) (10) (15) (26) (27) podem encontrar-se instrues pormenorizadas sobre a recolha, o
manuseamento e o armazenamento de solos para utilizao em experincias de biotransformao.
Antes da utilizao do solo processado para o presente ensaio, este deve ser pr-incubado de modo a permitir a
germinao e remoo das sementes e o restabelecimento do equilbrio do metabolismo microbiano aps a
passagem de condies de amostragem ou armazenamento para condies de incubao. De modo a
aproximar as condies de temperatura e humidade daquelas que sero utilizadas no ensaio, a pr-incubao
durante um perodo de 2 a 28 dias) geralmente adequada (15). No total, os perodos de armazenamento e
pr-incubao no devem exceder trs meses.
1.9.1.1. Temperatura de ensaio
Ao longo de todo o perodo do ensaio, os solos devem ser incubados no escuro e a uma temperatura constante
e representativa das condies climticas onde ocorrer o uso ou libertao da substncia. Relativamente a
todas as substncias de ensaio que possam vir a atingir o solo em climas temperados, a temperatura
recomendada de 20 2
o
C. A temperatura deve ser monitorizada.
No caso de produtos qumicos aplicados ou libertados em climas mais frios (por exemplo, em pases do Norte,
durante o Outono ou o Inverno), devem ser incubadas amostras de solo adicionais a uma temperatura inferior
(por exemplo, 10 2
o
C).
1.9.1.2. Teor de humidade
No caso de ensaios de transformao em condies aerbias, o teor de humidade do solo (
2
) deve ser ajustado e
mantido a um valor de pF entre 2,0 e 2,5 (3). O teor de humidade do solo expresso em massa de gua por
massa de solo seco e deve ser controlado regularmente (por exemplo, de 2 em 2 semanas) por pesagem dos
bales de incubao, devendo as perdas de gua ser compensadas por adio de gua (de preferncia, gua da
torneira esterilizada por filtrao). Durante a adio de gua devem tomar-se precaues com vista a evitar ou
minimizar perdas da substncia de ensaio e/ou dos produtos de transformao por volatilizao e/ou
fotodegradao (caso ocorra).
No caso de ensaios de transformao em condies anaerbias ou de solos paddy, o solo saturado com gua
por inundao.
(
1
) Resultados de investigaes recentes indicam que solos provenientes de zonas temperadas podem igualmente ser armazenados a 20
o
C
durante perodos superiores a trs meses (28) (29) sem se registarem perdas significativas de actividade microbiana.
(
2
) O solo no deve estar nem demasiado molhado nem demasiado seco de modo a manter uma ventilao e alimentao adequadas da
microflora. Os teores de humidade recomendados para um crescimento microbiano ptimo variam entre 40 % e 60 % da capacidade de
reteno de gua (WHC) e entre 0,1 e 0,33 bar (6). Este ltimo intervalo equivalente a uma gama de pF entre 2,0 e 2,5. No apndice 2
apresentam-se os teores de humidade tpicos para vrios tipos de solos.
1.9.1.3. Condies de incubao aerbia
No caso de sistemas de fluxo, as condies aerbias sero mantidas atravs de ciclos de lavagem ou por
ventilao contnua com ar humidificado. No caso de bales biomtricos, a permuta de a r mantida por
difuso.
1.9.1.4. Condies aerbias estreis
Com vista obteno de informaes relativas relevncia da transformao abitica de uma substncia de
ensaio, as amostras de solo podem ser esterilizadas (para informaes sobre mtodos de esterilizao, consultar
as referncias 16 e 29), tratadas com a substncia de ensaio estril (por exemplo, por adio da soluo atravs
de um filtro estril) e arejadas com ar humidificado estril, tal como descrito na seco 1.9.1.3. No caso de
solos paddy, tanto o solo como a gua devem ser esterilizados e a incubao deve ser efectuada tal como
descrito na seco 1.9.1.6.
1.9.1.5. Condies de incubao anaerbia
De modo a estabelecer e manter condies anaerbias, o solo tratado com a substncia de ensaio inicialmente
incubado em condies aerbias durante 30 dias, uma semivida ou DT
50
(escolher a opo mais curta), aps o
que coberto de gua (camada de gua de 1-3 cm) e o sistema de incubao lavado com um gs inerte (por
exemplo, azoto ou rgon) (
1
). O sistema de ensaio deve permitir a realizao de medies de pH, concentrao
de oxignio e potencial redox, e incluir dispositivos de reteno de produtos volteis. O sistema de bales
biomtricos deve ser fechado de modo a evitar a entrada de ar por difuso.
1.9.1.6. Condies de incubao paddy
De modo a estudar a transformao em solos de arrozais paddy, o solo coberto com uma camada de gua de
1-5 cm e a substncia de ensaio aplicada na fase aquosa (9). A profundidade mnima do solo recomendada
de 5 cm. O sistema ventilado com ar, tal como descrito para as condies aerbias. Os valores de pH,
concentrao de oxignio e potencial redox da camada aquosa devem ser monitorizados e includos no
relatrio. O incio dos estudos de transformao deve ser precedido de um perodo de pr-incubao de, pelo
menos, duas semanas (ver seco 1.8.3.2).
1.9.1.7. Durao do ensaio
Os estudos de taxa e via de transformao no devem normalmente exceder 120 dias (
2
) (3) (6) (8), pois aps
este perodo de esperar uma diminuio da actividade microbiana do solo num sistema laboratorial artificial e
isolado dos sistemas naturais de reposio de nutrientes. Sempre que seja necessrio caracterizar o
desaparecimento da substncia de ensaio e a formao e desaparecimento dos principais produtos de
transformao, os estudos podero ser prolongados (por exemplo, 6 ou 12 meses) (8). O prolongamento do
ensaio dever ser justificado no relatrio de ensaio e acompanhado de medies de biomassa realizadas durante
e no final desses perodos.
1.9.2. Princpio do ensaio
Em cada balo de incubao (ver figuras 1 e 2 do apndice 3) coloca-se cerca de 50g a 200 g de solo (peso
seco), que tratado com a substncia de ensaio utilizando um dos mtodos descritos na seco 1.8.2. Caso se
utilizem solventes orgnicos para a aplicao da substncia de ensaio, estes devem ser removidos do solo por
evaporao. 0 solo dever ser muito bem mexido, utilizando uma esptula e/ou por agitao do balo. Se o
ensaio for conduzido em condies de arrozal paddy, o solo e a gua devem ser muito bem misturados aps a
aplicao da substncia de ensaio. De modo a verificar a uniformidade da distribuio da substncia de ensaio,
esta dever ser analisada em pequenas alquotas (por exemplo, 1 g) dos solos tratados. Em alternativa, poder
ser utilizado um outro mtodo, que se descrever mais frente.
A taxa de tratamento dever corresponder maior taxa de aplicao de um produto de proteco de culturas
que recomendada nas instrues de utilizao e a uma incorporao uniforme at uma profundidade
adequada no campo (por exemplo, camada superficial de 10 cm de solo (
3
). Por exemplo, para produtos
qumicos aplicados na folhagem ou no solo sem incorporao, a profundidade apropriada para o clculo de
quantidade de produto qumico a adicionar a cada balo de 2,5 cm. No caso de produtos qumicos
incorporados no solo, a profundidade apropriada a profundidade de incorporao especificada nas instrues
de utilizao. No caso de produtos qumicos de ocorrncia comum, a taxa de aplicao deve ser estimada com
base na via de entrada mais relevante. Por exemplo, quando as lamas de esgotos constituem a principal via de
(
1
) As condies aerbias so as que predominam em solos superficiais e mesmo em solos subsuperficiais, tal como foi demonstrado num
projecto de investigao financiado pela UE [K. Takagi et al. (1992). Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site,
seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Intemat. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270-277,
17-21 August 1992, Sigtuna, Sweden]. A ocorrncia de condies anaerbias ocasional, verificando-se apenas durante a inundao dos
solos aps precipitao intensa ou quando so estabelecidas condies paddy (em arrozais).
(
2
) Os estudos aerbios podero ser terminados muito antes de decorridos 120 dias, desde que se tenha manifestamente atingido o final da
mineralizao e da via de transformao. A concluso do teste poder ocorrer aps 120 dias ou quando pelo menos 90 % da substncia
de ensaio tiver sido transformada, mas apenas se se tiver formado, no mnimo, 5 % de CO
2
.
(
3
) O clculo da concentrao inicial com base na rea utiliza a seguinte equao:
C
solo
mg=kg
solo
_
=
A kg=ha 10
6
mg=kg
l m 10
4
m
2
=ha d kg
solo
=m
3
_
C
solo
= Concentrao inicial no solo [mgkg
-1
]
A = Taxa de aplicao [kg ha
-1
]; 1 = espessura da camada de solo no campo [m]; d = densidade aparente do solo seco [kg m
-3
].
Em geral, uma taxa de aplicao de 1 kg ha
-1
resulta numa concentrao no solo de aproximadamente 1 mg kg
-1
, numa camada de
10 cm (assumindo uma densidade aparente de 1 g cm
-3
).
entrada no solo, o produto qumico deve ser adicionado s lamas a uma concentrao que reflecte a sua
concentrao esperada e a quantidade de lamas adicionadas ao solo deve reflectir a sua carga habitual em solos
agrcolas. Se esta concentrao no for suficientemente elevada para que se possam identificar os principais
produtos de transformao, poder ser til a incubao de amostras de solo independentes contendo taxas mais
elevadas, embora devam ser evitadas taxas excessivas que possam influenciar as funes microbianas do solo
(ver seces 1.5 e 1.8.2).
Alternativamente, poder tratar-se uma maior quantidade de solo (ou seja, 1 kg a 2 kg) com a substncia de
ensaio; depois de ser cuidadosamente misturado numa mquina misturadora apropriada, o solo tratado ser
ento dividido em pequenas pores de 50 g a 200 g e transferido para os bales de incubao (por exemplo,
utilizando divisores de amostras). Tambm neste caso devero ser analisados pequenas alquotas do lote de solo
tratado (por exemplo, 1 g), de modo a determinar a uniformidade da distribuio da substncia de ensaio. Este
procedimento apresenta a vantagem de permitir uma distribuio mais uniforme da substncia de ensaio no
solo, pelo que ser prefervel a sua utilizao.
Devero ser igualmente incubadas, nas mesmas condies (aerbias), que as amostras tratadas com a substncia
de ensaio, amostras de solo no tratadas; estas amostras sero utilizadas para medies de biomassa durante e
no final dos estudos.
Nos casos em que a substncia de ensaio aplicada no solo dissolvida em solvente(s) orgnico(s), devero ser
incubadas, nas mesmas condies (aerbias) que as amostras tratadas com a substncia de ensaio, amostras de
solo tratadas com a mesma quantidade de solvente(s) (sem adio da substncia em ensaio). Estas amostras so
utilizadas para medies de biomassa no incio, durante e no final dos estudos de modo a verificar os efeitos do
(s) solvente(s) na biomassa microbiana.
Os bales contendo o solo tratado podem ser ligados ao sistema de fluxo descrito na Figura 1 ou tapados com
a coluna de absoro ilustrada na figura 2 (ver apndice 3).
1.9.3 Amostragem e medio
A intervalos de tempo apropriados, removem-se dois bales de incubao, extraem-se as respectivas amostras
de solo com solventes apropriados de polaridade diferente e analisa-se a substncia de ensaio e/ou os produtos
de transformao. Um estudo bem planeado dever incluir um nmero de bales suficiente para que possam
ser utilizados dois bales em cada ponto de amostragem. A intervalos de tempo variados durante a incubao
de cada amostra de solo (intervalos de 7 dias durante o primeiro ms e de 17 dias nos meses subsequentes), e
no final do perodo de incubao, as solues de absoro ou os materiais slidos de absoro devero ser
removidos e analisados relativamente presena de produtos, volteis. Para alm de uma amostra de solo
recolhida imediatamente aps a aplicao da substncia de ensaio (amostra do dia 0), devero ser includos,
pelo menos, 5 pontos de amostragem. Os intervalos de tempo devero ser escolhidos de modo a possibilitar o
estabelecimento do padro de desaparecimento da substncia de ensaio e dos padres de formao e
desaparecimento dos produtos de transformao (por exemplo, 0, 1, 3, 7 dias; 2, 3 semanas; 1, 2, 3 meses,
etc.).
No caso de se utilizar uma substncia de ensaio marcada com
14
C, a radioactividade no extractvel ser
quantificada por combusto e ser calculado um balano de massa para cada intervalo de amostragem.
No caso de incubao anaerbia ou paddy, as fases de solo e gua podem ser analisadas conjuntamente para a
substncia de ensaio e produtos de transformao ou ser separadas por filtrao ou centrifugao antes da
extraco e anlise.
1.9.4. Ensaios opcionais
A fim de estimar a influncia da temperatura e humidade do solo nas taxas de transformao de uma
substncia de ensaio e/ou dos seus produtos de transformao no solo, poder ser til realizar estudos em
condies aerbias, no estreis, noutras condies de temperatura e humidade.
Pode tentar-se uma caracterizao mais aprofundada da radioactividade no extractvel utilizando, por
exemplo, extraco com fluidos supercrticos.
2. DADOS
As quantidades de substncia de ensaio, produtos de transformao, substncias volteis (apenas em
percentagem) e produtos no extractveis, devem ser indicadas na forma de percentagem da concentrao
aplicada inicialmente e, quando apropriado, em mg-kg
-1
de solo (com base em peso de solo seco), para cada
intervalo de amostragem. Para cada um destes intervalos dever ainda apresentar-se um balano de massa, em
percentagem da concentrao aplicada inicialmente. A representao grfica das concentraes da substncia
de ensaio em funo do tempo permitir estimar a sua semivida de transformao, ou DT
50
. Os produtos d
transformao principais devem ser identificados e os valores das suas concentraes devem tambm ser
representados graficamente em funo do tempo a fim de evidenciar as suas taxas de formao e
desaparecimento. Considera-se um produto de transformao principal qualquer produto cuja concentrao
seja 10 % da dose aplicada em qualquer altura ao longo do estudo.
Os produtos volteis retidos fornecem alguma indicao sobre a capacidade de volatilizao, a partir do solo, de
uma substncia de ensaio e dos seus produtos de transformao.
Devem ser determinados valores mais precisos para as semividas ou DT
50
e se apropriado, para DT
75
e DT
90
,
atravs da aplicao de modelos cinticos apropriados. Os valores de semivida e de DT50 devem ser
apresentados conjuntamente com a descrio do modelo utilizado, da ordem da cintica da reaco e do
coeficiente de determinao (r
2
). prefervel assumir uma cintica de primeira ordem, excepto se r
2
< 0,7.
Quando apropriado, os clculos devem ser igualmente aplicados aos produtos de transformao principais. As
referncias 31 a 35 descrevem exemplos de modelos apropriados.
No caso de estudos de taxas conduzidos a vrias temperaturas, as taxas de transformao devem ser descritas
em funo da temperatura, dentro da gama de temperaturas utilizada experimentalmente, atravs duma relao
de Arrhenius do tipo:
k = Ae
B=T
or lnk = 1nA
B
T
,
em que ln A e B correspondem, respectivamente, aos parmetros de regresso ordenada na origem e declive da
melhor correlao linear obtida entre ln k e 1/T, k representa a constante de velocidade temperatura T e T
representa a temperatura em kelvin. Deve ter-se em ateno que a relao de Arrhenius vlida para um
intervalo limitado de temperatura, no caso de a transformao ser influenciada pela aco microbiana.
Apesar de os estudos serem efectuados num sistema laboratorial artificial, os resultados permitiro obter uma
estimativa da taxa de transformao da substncia de ensaio, assim como da taxa de formao e
desaparecimento dos produtos de transformao em condies de campo (36) (37).
O estudo da via de transformao de uma substncia de ensaio fornece informao sobre o modo como a
substncia aplicada estruturalmente modificada no solo por reaces qumicas e microbianas.
3. RELATRIO
RELATRIO DO ENSAIO
nome vulgar, nome qumico, nmero CAS, frmula estrutural (com indicao da(s) posio(s) de
marcao no caso da utilizao de material marcado radioactivamente) e propriedades fsico-qumicas
relevantes (ver seco 1.5),
pureza (impurezas) da substncia de ensaio,
pureza radioqumica do produto qumico marcado e actividade especfica (quando apropriado).
Substncias de referncia:
nome qumico e estrutura das substncias de referncia utilizadas para a caracterizao e/ou identificao
dos produtos de transformao.
Solos utilizados no ensaio:
caractersticas do local de recolha,
data e procedimento utilizado para a recolha de amostras do solo,
propriedades dos solos, tais como, pH, teor de carbono orgnico, textura ( % de areia, % de silte, % de
argila), capacidade de troca catinica, densidade aparente, caractersticas de reteno de gua e biomassa
microbiana,
durao e condies de armazenamento do solo (caso tenha sido armazenado).
Condies do ensaio:
datas em que os estudos foram efectuados,
quantidade de substncia de ensaio aplicada,
solventes utilizados e mtodo de aplicao da substncia de ensaio,
peso do solo inicialmente tratado e retirado para anlise em cada intervalo de tempo,
descrio do sistema de incubao utilizado,
taxas de fluxo de ar (apenas para sistemas de fluxo),
temperatura do sistema experimental,
teor de humidade do solo durante a incubao,
biomassa microbiana no incio, durante e no final dos estudos aerbios,
pH, concentrao de oxignio e potencial redox no incio, durante e no final dos estudos anaerbios e
paddy,
mtodo(s) de extraco,
mtodos de quantificao e identificao da substncia de ensaio e principais produtos de transformao
no solo e materiais de absoro,
nmero de repeties (duplicados) e nmero de controlos.
Resultados:
resultado da determinao da actividade microbiana,
repetitividade e sensibilidade dos mtodos analticos utilizados,
taxas de recuperao (na seco 1.7.1 indicam-se os valores percentuais que devero verificar-se para um
estudo vlido),
tabelas de resultados expressos como percentagens da dose inicial aplicada e, quando apropriado, como
mg-kg
-1
de solo (com base no peso seco),
balano de massa durante e no final dos estudos,
caracterizao da radioactividade no extractvel (ligada) ou de resduos presentes no solo,
quantificao do CO
2
e outros compostos volteis libertados,
grficos representativos da concentrao de substncia de ensaio no solo e, quando apropriado, dos
produtos de transformao principais, em funo do tempo,
valores de semivida ou DT
50
, DT
75
e DT
90
para a substncia de ensaio e, quando apropriado, para os
produtos de transformao principais, incluindo os limites de confiana,
estimativa da taxa de degradao abitica em condies estreis,
uma avaliao da cintica de transformao da substncia de ensaio e, quando apropriado, dos produtos
de transformao principais,
vias de transformao propostas, quando apropriado,
discusso e interpretao dos resultados,
dados experimentais (ou seja, exemplos de cromatogramas, exemplos de clculos de taxas de
transformao e mtodos utilizados para identificar os produtos de transformao).
4. REFERNCIAS
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(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides
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(3) Directiva 95/36/CE de 14 de Julho de 1995 que altera a Directiva 91/414/CEE relativa colocao dos
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Apndice 1
TENSO DE GUA, CAPACIDADE DE CAMPO (FC) E CAPACIDADE DE RETENO DE GUA (WHC) (
1
) 1)
Altura da Coluna de gua
[cm]
pF (
a
) bar (
b
) Observaes
10
7
7 10
4
Solo seco
1,6 . 10
4
4,2 16 Ponto de emurchecimento
10
4
4 10
10
3
. 3 1
6 . 10
2
2,8 0,6
3,3 . 10
2
2,5 0,33 (
c
)
10
2
2 0,1 Gama de
Capacidade de campo (
d
)
60 1,8 0,06
33 1,5 0,033
10 1 0,01 WHC (aproximao)
1 0 0,001 Solo saturado de gua
(
a
) pF = log da altura da coluna de gua, em centmetros.
(
b
) l bar=10
5
Pa.
(
c
) Corresponde a um teor de gua aproximado de 10 % na areia, 35 % no limo e 45 % na argila.
(
d
) A capacidade de campo no constante, variando com o tipo de solo, com valores de pF entre 1,5 e 2,5.
A tenso de gua medida em centmetros da coluna de gua ou em bar. Devido extensa gama de valores para a tenso de
suco, esta simplesmente expressa como o valor de pF que equivalente ao logaritmo da altura da coluna de gua, em
centmetros.
A capacidade de campo definida como a quantidade de gua que pode ser armazenada, contra a gravidade, por um solo
natural, 2 dias aps um extenso perodo de precipitao ou aps irrigao suficiente. determinado no solo no perturbado,
in situ, no campo. Esta medio no , portanto, aplicvel a amostras de solo processadas laboratorialmente. Os valores de
FC determinados em solos processados podem apresentar amplas varincias sistemticas.
A capacidade de reteno de gua (WHC) determinada laboratorialmente em solos no perturbados ou em solos processados,
atravs da saturao de uma coluna de solo com gua por transporte capilar. particularmente til para solos processados e
pode atingir valores at 30 % superiores capacidade de campo (1). Para alm disso, mais fcil a sua determinao
experimental do que a determinao de valores fiveis de FC.
Notas
(
1
) Mckenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen
Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt am Main.
Apndice 2
TEORES DE HUMIDADE DO SOLO (g de gua por 100 g de solo seco) DE VRIOS TIPOS DE SOLOS
PROVENIENTES DE DIFERENTES PASES
Teor de humidade do solo a
Tipo de solo Pas
WHC (
1
) pF = 1,8 pF = 2,5
Arenoso Alemanha 28,7 8,8 3,9
Limo-arenoso Alemanha 50,4 17,9 12,1
Limo-arenoso Sua 44,0 35,3 9,2
Franco-limoso Sua 72,8 56,6 28,4
Argilo-limoso Brasil 69,7 38,4 27,3
Argilo-limoso Japo 74,4 57,8 31,4
Areno-limoso Japo 82,4 59,2 36,0
Franco-limoso EUA 47,2 33,2 18,8
Areno-limoso EUA 40,4 25,2 13,3
(
1
) Capacidade de Reteno de Agua
Apndice 3
Figura 1:
Exemplo de um sistema de fluxo para o estudo da transformao de produtos qumicos no solo (
1
) (
2
)
Figura 2
Exemplo de um balo biomtrico para o estudo da transformao de produtos qumicos no solo (
3
)
(
1
) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-
-157.
(
2
) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson,
T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.
(
3
) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z.
PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
C.24. TRANSFORMAES AERBIAS E ANAERBIAS EM SISTEMAS DE SEDIMENTOS AQUTICOS
1. MTODO
O presente mtodo baseia-se na publicao OECD TG 308 (2002).
1.1. INTRODUO
Os produtos qumicos podem penetrar em guas superficiais ou profundas por diversas vias, tais como
aplicao directa, arrastamento, escoamento superficial, drenagem, eliminao de resduos, efluentes
industriais, domsticos ou agrcolas e deposio atmosfrica. O presente Mtodo de Ensaio descreve um
mtodo laboratorial para avaliar as transformaes aerbias e anaerbias de produtos qumicos orgnicos em
sistemas de sedimentos aquticos e baseia-se em normas de ensaio anteriormente definidas (1) (2) (3) (4) (5) (6).
O nmero e tipo de sedimentos que devem ser utilizados no presente ensaio foi acordado numa reunio de
trabalho da OCDE sobre seleco de solos e sedimentos, que decorreu em Belgirate, Itlia, em 1995 (7). Foram
ainda feitas recomendaes relativas recolha, manipulao e armazenamento das amostra de sedimentos,
tendo como base a Orientao ISO (8). Os estudos aqui descritos so necessrios para os compostos qumicos
utilizados na gua ou que so susceptveis de vir a atingir o ambiente aqutico pelas vias supracitadas.
As condies nos sistemas de sedimentos aquticos naturais so frequentemente aerbias na fase aqutica
superior. Enquanto a camada superficial de sedimentos pode ser aerbia ou anaerbia, a camada mais profunda
usualmente anaerbia. De modo a abranger as diferentes condies, o presente documento descreve tanto
ensaios aerbios como anaerbios. O ensaio aerbio simula uma coluna de gua aerbia no topo de uma
camada aerbia de sedimentos que sustentada por um gradiente anaerbio. O ensaio anaerbio simula um
sistema gua-sedimento completamente anaerbio. Em algumas circunstncias poder ser necessrio utilizar
condies significativamente diferentes das descritas nas presentes recomendaes, por exemplo, utilizando
ncleos intactos de sedimento ou sedimentos que possam ter sido expostos substncia de ensaio; nestes casos,
devero ser utilizados outros mtodos disponveis (9).
1.2. DEFINIES
Devem ser sempre utilizadas unidades do Sistema Internacional (SI).
Substncia de ensaio: Qualquer substncia, quer seja o composto inicial ou um produto de transformao
relevante.
Produtos de transformao: Todas as substncias resultantes de reaces de transformao biticas ou
abiticas da substncia de ensaio, incluindo CO
2
e resduos ligados.
Resduos ligados: resduos ligados representam compostos presentes no solo, planta ou animal, que, aps
extraco, persistem na matriz quer na forma da substncia inicial quer como um dos seus metabolito(s). O
mtodo de extraco no poder alterar substancialmente nem os prprios compostos nem a estrutura da
matriz. A natureza da ligao poder ser parcialmente determinada utilizando mtodos extractivos que alterem
a matriz e atravs de tcnicas analticas sofisticadas. Tm sido identificadas deste modo, por exemplo, ligaes
do tipo covalente, inico e de absoro/adsoro, assim como encapsulao. De um modo geral, a formao de
resduos ligados reduz significativamente a bioacessibilidade e a biodisponibilidade das substncias (10)
[adaptado de IUPAC 1984 (11)].
Transformao aerbia (oxidante): Reaces que ocorrem na presena de oxignio molecular (12).
Transformao anaerbia (redutora): Reaces que ocorrem na ausncia de oxignio molecular (12).
guas naturais: So guas superficiais provenientes de charcos, rios, cursos de gua, etc.
Sedimento: uma mistura de constituintes qumicos minerais e orgnicos, em que os ltimos incluem
compostos com elevado contedo de carbono e azoto e de peso molecular elevado. depositado por guas
naturais, com as quais forma uma interface.
Mineralizao: Degradao completa de um composto orgnico em CO
2
e H
2
O, em condies aerbias, ou
em CH
4
, CO
2
e H
2
O, em condies anaerbias. No contexto do presente mtodo de ensaio, quando se utiliza
um composto marcado radioactivamente, o termo mineralizao refere-se sua degradao extensa,
envolvendo a oxidao ou reduo de um tomo de carbono marcado e a libertao da quantidade
correspondente de
14
CO
2
ou
14
CH
4
, respectivamente.
Semivida: t
0,5
, o tempo necessrio para a transformao de 50 % da substncia de ensaio, nos casos em que a
transformao pode ser descrita por uma cintica de primeira ordem. A semivida da substncia independente
da sua concentrao inicial.
DT
50
(Tempo de Desaparecimento 50): Tempo necessrio para reduzir a concentrao inicial da substncia
de ensaio em 50 %.
DT
75
de ensaio em 75 %.
DT
90
de ensaio em 90 %.
A identificao e quantificao dos produtos de transformao atravs de mtodos espectroscpicos e
cromatogrficos devero envolver a utilizao de substncias de referncia.
Embora possam ser utilizadas para a medio da taxa de transformao substncias de ensaio marcadas
isotopicamente ou no marcadas, de preferir a utilizao de material marcado. Para o estudo da via de
transformao e para o estabelecimento do balano de massa, obrigatria a utilizao de compostos
marcados. A marcao recomendada com
14
C, embora a utilizao de outros istopos, tais como
13
C,
15
N,
3
H
e
32
P, possa igualmente revelar-se til. A marcao deve ser feita, tanto quanto possvel, na(s) zona(s) mais
estvel(eis) da molcula (
1
). A pureza qumica e/ou radioqumica da substncia de ensaio deve ser de, pelo
menos, 95 %.
Antes de se efectuar um ensaio, deve estar disponvel a seguinte informao sobre a substncia de ensaio:
(a) solubilidade em gua (Mtodo A.6);
(b) solubilidade em solventes orgnicos;
(c) presso de vapor (Mtodo A.4) e constante da Lei de Henry;
(d) coeficiente de partio n-octanol/gua (Mtodo A.8);
(e) coeficiente de adsoro (K
d
, K
f
ou K
oc
, quando apropriado) (Mtodo C.18);
(f) hidrlise (Mtodo C.7);
(g) constante de dissociao (pK
a
) [Norma de Ensaio OCDE 112] (13);
(h) estrutura qumica da substncia de ensaio e, quando aplicvel, posio da(s) marcao(es) isotpica(s).
Nota: A temperatura a que se efectuaram estas medies dever ser indicada no relatrio.
Outras informaes podero ser teis, como, por exemplo, a existncia de dados relativos toxicidade da
substncia de ensaio para os microorganismos, dados sobre a biodegradabilidade fcil e/ou inerente e dados
sobre as transformaes aerbias e anaerbias no solo.
Devero estar disponveis mtodos analticos (incluindo mtodos de extraco e erradicao) que permitam a
identificao e quantificao da substncia de ensaio e dos seus produtos de transformao em gua e em
sedimentos (ver seco 1.7.2).
(
1
) Por exemplo, se a estrutura da substncia de ensaio inclui um anel, este dever ser marcado; no caso de a substncia de ensaio possuir
dois ou mais anis, poder ser necessrio efectuar estudos independentes de modo a avaliar o destino de cada um dos anis marcados e
obter informao adequada sobre a formao dos produtos de transformao.
O mtodo descrito no presente ensaio utiliza um sistema aerbio e um sistema anaerbio de sedimento
aqutico (ver apndice 1) que permite:
(i) a medio da taxa de transformao da substncia de ensaio num sistema gua-sedimento;
(ii) a medio da taxa de transformao da substncia de ensaio no sedimento;
(iii) a medio da taxa de mineralizao da substncia de ensaio e/ou dos seus produtos de transformao
(caso se utilize a substncia de ensaio marcada com C);
(iv) a identificao e quantificao dos produtos de transformao nas fases aquosa e de sedimento, incluindo
balano de massa (caso se utilize a substncia de ensaio marcada);
(v) a medio da distribuio da substncia de ensaio e dos seus produtos de transformao entre as duas
fases durante um perodo de incubao no escuro (a fim de evitar, por exemplo, o desenvolvimento
explosivo de algas), a temperatura constante. Nos casos em que os dados o permitam, determinam-se
valores para as semividas, DT
50
, DT
75
e DT
90
, no devendo estes valores ser extrapolados para muito alm
do perodo experimental (ver seco 1.2).
Tanto para os estudos aerbios como para os estudos anaerbios, so necessrios pelo menos dois sedimentos
e as respectivas guas associadas (7). No entanto, podero existir situaes em que devero ser utilizados mais
do que dois sedimentos aquticos, como, por exemplo, no caso de um produto qumico que possa estar
presente em ambientes de gua doce e/ou martimos.
O mtodo geralmente aplicvel a todas as substncias qumicas (no marcadas ou marcadas radioactivamente)
para as quais se encontre disponvel um mtodo analtico suficientemente sensvel e preciso. aplicvel a
compostos ligeiramente volteis, no volteis, solveis ou pouco solveis em gua. O ensaio no deve ser
aplicado a compostos qumicos muito volteis a partir da gua (por exemplo, fumigantes, solventes orgnicos)
j que estes, nas condies experimentais descritas, no podem ser mantidos na gua e/ou sedimento.
O mtodo tem sido aplicado ao estudo das transformaes sofridas por produtos qumicos em guas doces e
sedimentos embora, em princpio, possa ser igualmente aplicado a sistemas de esturios e martimos. No , no
entanto, adequado para simular as condies de guas correntes (por exemplo, rios) ou de alto mar.
1.7.1. Recuperao
A extraco e anlise de amostras de gua e de sedimento, pelo menos em duplicado, imediatamente aps a
adio da substncia de ensaio, fornece uma primeira indicao relativa repetitividade do mtodo analtico e
uniformidade do procedimento de aplicao da substncia de ensaio. Os valores de recuperao em fases mais
adiantadas das experincias so obtidos atravs dos respectivos balanos de massa (caso se utilize material
marcado). Os valores de recuperao devem variar entre 90 % e 110 % no caso de produtos qumicos marcados
(6) e entre 70 % e 110 % no caso de produtos qumicos no marcados.
1.7.2. Repetitividade e sensibilidade do mtodo analtico
A repetitividade do mtodo analtico (com excepo da eficincia de extraco inicial) na quantificao da
substncia de ensaio e dos produtos de transformao pode ser verificada pela anlise, em duplicado, do
mesmo extracto das amostras de gua ou de sedimento, aps incubao durante um perodo de tempo
suficiente para que ocorra a formao de produtos de transformao.
O limite de deteco (LD) do mtodo analtico, tanto para a substncia de ensaio como para os produtos de
transformao, deve corresponder, no mnimo, ao menor dos seguintes valores: 0,01 mg-kg
-1
de gua ou
sedimento (como substncia de ensaio) ou 1 % da dose inicialmente aplicada ao sistema de ensaio. Deve ser
igualmente especificado o limite de quantificao (LQ).
1.7.3. Preciso dos dados de transformao
A anlise de regresso das concentraes da substncia de ensaio em funo do tempo fornece informao
apropriada sobre a preciso da curva de transformao e permite o clculo dos limites de confiana para as
semividas (no caso de cintica de pseudo primeira ordem) ou os valores de DT
50
e, se adequado, os valores de
DT
75
e de DT
90
.
1.8.1. Sistema de ensaio e aparelhagem
O estudo deve ser efectuado em recipientes de vidro (por exemplo, frascos, tubos de centrfuga), excepto se
existir informao preliminar (tal como coeficientes de partio n-octanol/gua, dados de absoro/adsoro,
etc.) indicativa de que a substncia de ensaio pode aderir ao vidro, caso em que se deve considerar a utilizao
de um material alternativo (como Teflon). Quando se sabe que a substncia de ensaio adere ao vidro, o
problema pode ser contornado atravs da utilizao de um ou mais dos seguintes mtodos:
determinar a massa da substncia de ensaio e dos produtos de transformao que se encontram
absorvidos/adsorvidos ao vidro,
efectuar uma lavagem de todo o material de vidro com solvente no final do ensaio,
utilizar produtos formulados (ver igualmente seco 1.9.2),
utilizar uma maior quantidade de co-solvente para a adio da substncia de ensaio ao sistema. Caso se
utilize um co-solvente, este no dever provocar solvlise da substncia de ensaio.
Nos apndices 2 e 3 apresentam-se exemplos de montagens experimentais tpicas de ensaio, ou seja, sistemas
de fluxo e biomtricos, respectivamente (14). Na referncia 15 so descritos sistemas de incubao alternativos.
A concepo das montagens experimentais deve permitir a troca de ar ou azoto e a reteno de produtos
volteis. As dimenses da montagem experimental devem estar de acordo com os requisitos do ensaio (ver
seco 1.9.1). A ventilao pode ser obtida quer por ligeiro borbulhar, quer por passagem de ar ou azoto sobre
a superfcie da gua. No ltimo caso, aconselhvel agitar ligeiramente a gua, a partir do topo, por forma a
garantir uma melhor distribuio do oxignio e azoto. No deve ser utilizado ar sem CO
2
, pois tal pode
provocar um aumento do pH da gua. Em qualquer dos casos, a perturbao do sedimento indesejvel e deve
ser, tanto quanto possvel, evitada. Os produtos qumicos ligeiramente volteis devem ser ensaiados num
sistema biomtrico com ligeira agitao da superfcie da gua. Podem igualmente ser utilizados recipientes
fechados com um espao livre contendo ar atmosfrico ou azoto e pequenos recipientes internos para a
reteno de produtos volteis (16). Durante o ensaio aerbio, o gs presente na zona superior livre deve ser
mudado regularmente de modo a compensar o consumo de oxignio pela biomassa.
Para a recolha de produtos de transformao volteis, podem ser utilizados dispositivos de reteno adequados,
embora no se restringindo a uma soluo de hidrxido de potssio ou de hidrxido de sdio a 1 mol.dm
-3
para a reteno de dixido de carbono (
1
) e etilenoglicol, ou etanolamina ou uma soluo de parafina a 2 % em
xileno para compostos orgnicos. Os produtos volteis formados em condies anaerbias, tais como o
metano, podem ser removidos, por exemplo, atravs de peneiros moleculares. Estes compostos volteis podem
ser sujeitos a combusto, a CO
2
, por exemplo, por passagem do gs atravs de um tubo de quartzo cheio com
CuO a uma temperatura de 900
o
C e recuperando o CO
2
formado num absorvente alcalino (17).
necessria aparelhagem laboratorial adequada anlise qumica da substncia de ensaio e dos produtos de
transformao (por exemplo, cromatografia gs-lquido (GLC), cromatografia lquida de alta resoluo (HPLC),
cromatografia de camada fina (TLC), espectroscopia de massa (MS), cromatografia gasosa acoplada a
espectroscopia de massa (GC-MS), cromatografia lquida acoplada a espectroscopia de massa (LC-MS),
ressonncia magntica nuclear (NMR), etc.), incluindo sistemas de deteco para produtos marcados
radioactivamente, ou no marcados. No caso de se utilizar material marcado radioactivamente, sero ainda
necessrios um contador de cintilaes e uma mufla de combusto oxidante (para a combusto de amostras de
sedimento antes da anlise de radioactividade).
Outro equipamento corrente de laboratrio necessrio inclui o material apropriado para determinaes fsico-
-qumicas e biolgicas (ver tabela 1, seco 1.8.2.2), material de vidro, produtos qumicos e reagentes.
1.8.2. Seleco e nmero de sedimentos aquticos
Os locais de amostragem devem ser seleccionados de acordo com os objectivos do ensaio para cada situao.
Na sua seleco, deve ter-se em conta o historial de possveis descargas de origem agrcola, industrial ou
domstica que tenham atingido a gua no local de captao ou a montante. No devem ser utilizados
sedimentos que tenham sido contaminados com a substncia de ensaio ou seus anlogos estruturais nos
ltimos 4 anos.
(
1
) Uma vez que estas solues alcalinas de absoro absorvem tambm o dixido de carbono proveniente do ar de ventilao e da
respirao em experincias aerbias, devem ser trocadas a intervalos regulares, de modo a evitar a sua saturao e consequente perda de
capacidade de absoro.
1.8.2.1. Seleco de sedimento
Para os estudos aerbios (7), utilizam-se normalmente dois sedimentos que devem diferir em relao ao teor de
carbono orgnico e textura. Um dos sedimentos deve apresentar um elevado teor de carbono orgnico
(2,5- 7,5 %) e uma textura fina, enquanto o outro deve apresentar um baixo teor de carbono orgnico
(0,5- 2,5 %) e uma textura grossa. A diferena mnima entre os teores de carbono orgnico dever ser de 2 %.
Define-se textura fina como um contedo em [argila + silte] (
1
) > 50 % e textura grossa como um contedo
em [argila + silte] < 50 %. A diferena entre os contedos em [argila + silte] nos dois sedimentos deve ser de,
pelo menos, 20 %. Nos casos em que o produto qumico possa atingir guas marinhas, pelo menos um dos
sistemas gua-sedimento deve ser de origem marinha.
Para o estudo em condies estritamente anaerbias, devem ser recolhidas amostras de dois sedimentos
(incluindo as respectivas guas) a partir de zonas anaerbias de massas de gua superficiais (7). Tanto a fase
sedimentar como a aquosa devem ser cuidadosamente manuseadas e transportadas na ausncia de oxignio.
Para a seleco dos sedimentos a incluir no ensaio podem ser importantes outros parmetros, que devem ser
considerados caso a caso. Por exemplo, a gama de pH dos sedimentos ser importante para a anlise de
produtos qumicos cuja transformao e/ou absoro/adsoro possa depender do pH. A dependncia da
absoro/adsoro relativamente aos valores de pH pode ser indicada pelo pK
a
da substncia de ensaio.
1.8.2.2. Caracterizao das amostras gua-sedimento
Os parmetros mais relevantes que devero ser medidos tanto para a gua como para o sedimento e includos
no relatrio (fazendo referncia ao mtodo utilizado), assim como a fase do ensaio em que devem ser
determinados, encontram-se resumidos na tabela abaixo. As referncias (18) (19) (20) (21) descrevem os
mtodos para determinao desses parmetros.
Em casos especficos, poder ser necessrio medir, e incluir no relatrio, outros parmetros [por exemplo, para
gua doce: partculas, alcalinidade, dureza, condutividade, NO
3
/PO
4
(razo e valores individuais); para
sedimentos: capacidade de troca catinica, capacidade de reteno de gua, carbonato, azoto e fsforo totais;
para sistemas martimos: salinidade]. Para a avaliao das condies redox, especialmente no que diz respeito
transformao anaerbia, poder ainda ser til a anlise dos sedimentos e da gua relativamente presena de
nitrato, sulfato, ferro biodisponvel e outros aceitadores electrnicos possveis.
Medio de parmetros para a caracterizao das amostras gua-sedimento (7) (22) (23)
Parmetro
Fase do procedimento de ensaio
Amos-
tragem
de
campo
Manuse-
amento
poste-
rior
Incio
da
aclima-
tao
Incio
do
ensaio
Durante
o ensaio
Final do
ensaio
gua
Origem X
Temperatura X
PH X X X X X
TOC X X X
Concentrao de O
2
(*) X X X X X
Potencial redox (*) X X X X
(
1
) [Argila + silte] a fraco mineral do sedimento com dimenso de partcula < 50 m.
Parmetro
Fase do procedimento de ensaio
Amos-
tragem
de
campo
Manuse-
amento
poste-
rior
Incio
da
aclima-
tao
Incio
do
ensaio
Durante
o ensaio
Final do
ensaio
Sedimento
Origem X
Profundidade da camada X
PH X X X X X
Distribuio do tamanho das partculas X
TOC X X X X
Biomassa microbiana (**) X X X
Potencial redox (*) Obser-
vao
(cor/
/cheiro)
X X X X
(*) Investigaes recentes revelaram que as medies das concentraes de oxignio e de potenciais redox na gua no
possuem valor mecanstico nem preditivo relativamente ao crescimento e desenvolvimento de populaes microbianas em
guas superficiais (24)(25). A determinao da carncia bioqumica de oxignio (BOD, durante a amostragem de campo,
no incio e no final do ensaio) e das concentraes dos micro/macronutrientes Ca, Mg e Mn (no incio e no final do
ensaio), para o caso da gua, e a medio do N e P totais no caso de sedimentos (durante a amostragem de campo e no
final do ensaio) podem constituir instrumentos mais teis para a interpretao e avaliao das taxas e vias de
biotransformao aerbia.
(**) Mtodos utilizados: Para estudos aerbios, o mtodo da taxa de respirao microbiana (26); mtodo de fumigao (27) ou
contagem de colnias (por exemplo, bactrias, actinomicetes, fungos e colnias totais). Para estudos anaerbios, taxa de
metanognese.
1.8.3. Recolha, manuseamento e armazenamento
1.8.3.1. Recolha
Para a amostragem de sedimento, deve ser utilizada a verso preliminar da Orientao ISO para a amostragem
de sedimentos (8). As amostras de sedimento recolhidas devem incluir toda a camada superior (5 cm a 10 cm)
do sedimento. A gua associada deve ser recolhida da mesma zona ou local e ao mesmo tempo que o
sedimento. Para o estudo anaerbio, o sedimento e a gua associada devem ser recolhidos e transportados na
ausncia de oxignio (28) (ver seco 1.8.2.1). Encontram-se descritos na literatura alguns dispositivos de
amostragem (8) (23).
1.8.3.2. Manuseamento
A separao do sedimento da gua feita por filtrao e o sedimento hmido crivado com um peneiro de
2 mm, utilizando um excesso de gua recolhida no mesmo local que posteriormente rejeitada. Em seguida,
misturam-se quantidades conhecidas de sedimento e gua, na razo desejada (ver seco 1.9.1), em bales de
incubao e preparam-se para o perodo de aclimatao (ver seco 1.8.4). Para o estudo anaerbio, todos os
passos devem ser realizados na ausncia de oxignio (29) (30) (31) (32) (33).
A utilizao de amostras de sedimento e gua recentemente recolhidas vivamente recomendada. No entanto,
caso o seu armazenamento seja necessrio, o sedimento e a gua devem ser crivados, tal como descrito
anteriormente, e armazenados conjuntamente, com o sedimento coberto de gua (camada de gua de 6 cm a
10 cm), no escuro, a 4 2
o
C (
1
) por um perodo mximo de 4 semanas (7) (8) (23). As amostras que se
destinam a estudos aerbios devem ser armazenadas em condies de boa ventilao (por exemplo, em
recipientes abertos), enquanto as amostras destinadas a estudos anaerbios devem ser armazenadas na ausncia
de oxignio. Durante o transporte e o armazenamento no poder verificar-se o congelamento do sedimento e
da gua ou a secagem do sedimento.
1.8.4. Preparao das amostras de sedimento/gua para o ensaio
Cada amostra de sedimento/gua dever ser sujeita a um perodo de aclimatao, antes da adio da substncia
de ensaio. Para tal, cada amostra colocada no recipiente de incubao que ser utilizado no ensaio principal,
exactamente nas mesmas condies de incubao do ensaio (ver seco 1.9.1). O perodo de aclimatao
decorrer durante o tempo necessrio para atingir uma estabilidade razovel do sistema, reflectido pelos
valores de pH, concentrao de oxignio na gua, potencial redox do sedimento e da gua e separao
macroscpica das fases. O perodo de aclimatao dever ser, geralmente, de uma a duas semanas, no devendo
(
1
) Estudos recentes demonstraram que o armazenamento a 4
o
C pode conduzir a uma diminuio do teor de carbono orgnico do
sedimento que, por sua vez, poder resultar numa diminuio da actividade microbiana (34).
exceder quatro semanas. Os resultados das determinaes efectuadas durante este perodo devem ser includos
no relatrio.
O ensaio deve ser efectuado num aparelho de incubao (ver seco 1.8.1), com uma razo volume de gua/
/sedimento entre 3:1 e 4:1 e uma espessura da camada de sedimento de 2,5 cm ( 0,5 cm).
2
Recomenda-se ter
um mnimo de 50 g de sedimento (peso seco) por recipiente de incubao.
O ensaio deve ser efectuado no escuro, a uma temperatura constante compreendida entre 10 e
30
o
C. Considera-se adequada uma temperatura de (20 2)
o
C. Nos casos em que tal for apropriado,
dependendo da informao pretendida com o ensaio, poder considerar-se a utilizao de uma temperatura
mais baixa (por exemplo, 10
o
C). A temperatura de incubao dever ser sempre monitorizada e indicada no
relatrio.
1.9.2. Tratamento e aplicao da substncia de ensaio
O ensaio realizado com uma nica concentrao do produto qumico (
1
). No caso de produtos qumicos de
proteco de colheitas aplicados directamente em massas de gua, a dosagem mxima indicada no rtulo deve
ser considerada como a taxa mxima de aplicao calculada com base na rea superficial de gua do recipiente
de ensaio. Em todos os restantes casos, a concentrao a utilizar dever basear-se em previses de emisses
ambientais. Devem adoptar-se precaues que garantam a aplicao de uma concentrao adequada da
substncia de ensaio, de modo a permitir a caracterizao da via de transformao e da formao e
desaparecimento dos produtos de transformao. Nos casos em que, no incio do estudo, as concentraes da
substncia de ensaio se encontram prximas dos limites de deteco e/ou nos casos em que os principais
produtos de transformao no podem ser facilmente detectados quando a sua concentrao de 10 % da taxa
de aplicao da substncia de ensaio, poder ser necessria a aplicao de doses mais elevadas (por exemplo, 10
vezes superiores). No entanto, caso se utilizem no ensaio concentraes superiores, estas no devero ter efeitos
adversos significativos na actividade microbiana do sistema gua-sedimento. A fim de obter uma concentrao
constante da substncia de ensaio em recipientes de diferentes dimenses, poder considerar-se apropriado
ajustar a quantidade da substncia de ensaio ao volume em ensaio; neste caso, os clculos devero basear-se na
relao entre a profundidade da coluna de gua no recipiente e a profundidade da gua no campo (que se
assume como sendo de 100 cm, apesar de poderem ser utilizados outros valores). Ver um exemplo de clculo
no apndice 4.
Idealmente, a substncia de ensaio deve ser adicionada fase aquosa do sistema de ensaio na forma de soluo
aquosa. No entanto, quando tal for inevitvel, podero utilizar-se pequenas quantidades de solventes miscveis
em gua (tais como acetona, etanol) para a aplicao e distribuio da substncia de ensaio, desde que a sua
concentrao no exceda 1 % v/v nem provoque efeitos adversos na actividade microbiana do sistema de
ensaio. Durante a preparao da soluo aquosa da substncia de ensaio devem tomar-se as precaues
necessrias e de modo a assegurar a sua completa homogeneidade poder ser necessrio utilizar colunas e pr-
-mistura. Aps a adio da soluo aquosa ao sistema de ensaio, a fase aquosa dever ser suavemente misturada,
evitando, tanto quanto possvel, perturbar o sedimento.
Embora a utilizao rotineira de produtos formulados no seja recomendada, j que os ingredientes da
formulao podem afectar a distribuio da substncia de ensaio e/ou dos produtos de transformao entre as
fases aquosa e sedimentar, no caso de substncias de ensaio pouco solveis em gua, a sua utilizao poder
constituir uma alternativa apropriada.
O nmero de recipientes de incubao depende do nmero de pontos de amostragem (ver seco 1.9.3),
devendo ser includos sistemas de ensaio suficientes para permitir a utilizao de dois sistemas em cada ponto
de amostragem. Nos casos em que se utilizem unidades de controlo para cada sistema de sedimento aqutico,
estas no devero ser tratadas com a substncia de ensaio. As unidades de controlo podero ser utilizadas para
a determinao da biomassa microbiana do sedimento e do carbono orgnico total da gua e do sedimento no
final do estudo. Duas das unidades de controlo (ou seja, uma unidade de controlo de cada sedimento aqutico)
podero ser utilizadas para monitorizar os parmetros requeridos, relativamente ao sedimento e gua,
(
1
) O ensaio com uma segunda concentrao poder ser til no caso de produtos qumicos que atingem guas superficiais por diferentes vias
de entrada, resultando em concentraes significativamente diferentes; nestes casos, necessrio garantir que a concentrao mais baixa
pode ser analisada com preciso suficiente.
durante o perodo de aclimatao (ver tabela na seco 1.8.2.2). No caso de a aplicao da substncia de ensaio
envolver a utilizao de um solvente, devero ser includas duas unidades de controlo adicionais para a medio
dos potenciais efeitos adversos do solvente na actividade microbiana do sistema de ensaio.
1.9.3.
Normalmente, a durao da experincia no deve exceder 100 dias (6), e deve prosseguir at que se encontrem
estabelecidas as vias de degradao e os perfis de distribuio gua/sedimento ou at que 90 % da substncia de
ensaio se tenha dissipado por transformao e/ou volatilizao. Devero ser includos, pelo menos, seis pontos
de amostragem (incluindo a amostragem no tempo zero). A durao e o regime de amostragem apropriados
para o ensaio podero ser estabelecidos atravs da realizao de um estudo preliminar opcional (ver
seco 1.9.4) ou, no caso de existirem, a partir de dados disponveis sobre a substncia de ensaio provenientes
de estudos anteriores. No caso de substncias de ensaio hidrfobas, poder ser necessria a incluso de pontos
de amostragem adicionais durante o perodo inicial do estudo, de modo a permitir a determinao da taxa de
distribuio entre as fases aquosa e sedimentar.
No tempo correspondente a cada ponto de amostragem, obtm-se, para anlise, recipientes de incubao em
duplicado. O sedimento e a fase aquosa sobrenadante so analisados separadamente (
1
). A gua superficial deve
ser removida cuidadosamente, tendo o cuidado de causar a mnima perturbao possvel na fase sedimentar. A
extraco e caracterizao da substncia de ensaio e dos seus produtos de transformao devem ser feitas
recorrendo a procedimentos analticos apropriados. O material que possa ter ficado adsorvido, quer no
recipiente de incubao quer nos tubos de ligao aos dispositivos de reteno de substncias volteis, deve ser
removido.
1.9.4. Ensaio preliminar opcional
Nos casos em que a durao e o regime de amostragem no possam ser estimados a partir de outros estudos
relevantes sobre a substncia de ensaio, pode ser considerado apropriado recorrer a um ensaio preliminar,
opcional, que dever ser efectuado utilizando as mesmas condies experimentais propostas para o estudo
definitivo. Caso seja efectuado o ensaio preliminar, as condies experimentais mais relevantes e os resultados
devem ser includos, de uma forma resumida, no relatrio.
1.9.5. Medies e anlise
A concentrao da substncia de ensaio e dos seus produtos de transformao na gua e no sedimento, em
cada ponto de amostragem, deve ser medida e includa no relatrio (expressa em concentrao e em
percentagem de substncia aplicada). De uma forma geral, e a menos que seja apresentada uma justificao
razovel para o contrrio, devem ser identificados todos os produtos de transformao que sejam detectados
em quantidade 10 % da radioactividade aplicada no sistema gua-sedimento total, em qualquer ponto de
amostragem. Os produtos de transformao cujas concentraes aumentarem continuamente durante o ensaio
tambm devem ser identificados, mesmo nos casos em que a sua concentrao no exceda os limites
apresentados acima, j que este comportamento poder ser indicativo de persistncia. Esta rea deve ser
considerada caso a caso e o procedimento adoptado deve ser justificado no relatrio.
Os resultados obtidos a partir dos sistemas de reteno de gases/compostos volteis (CO
2
e outros compostos
qumicos, ou seja, compostos orgnicos volteis) devem ser includos no relatrio para cada um dos tempos de
amostragem. As taxas de mineralizao devero igualmente ser includas no relatrio, assim como os dados
sobre os resduos no extractveis (ligados) para cada ponto de amostragem.
2. DADOS
Para cada ponto de amostragem, dever ser calculado o balano de massa total ou a recuperao da
radioactividade adicionada (ver seco 1.7.1). Os resultados devem ser expressos, no relatrio, como
percentagem da radioactividade adicionada. A distribuio da radioactividade entre a gua e o sedimento deve
ser apresentada no relatrio, para cada tempo de amostragem, na forma de concentraes e de percentagens.
Devem calcular-se os valores de semivida, DT
50
e, se apropriado, DT
75
e DT
90
da substncia de ensaio, e
respectivos limites de confiana (ver seco 1.7.3). A informao relativa taxa de dissipao da substncia de
ensaio em gua e no sedimento poder ser obtida atravs da utilizao de mtodos de avaliao adequados, que
podem ir desde a aplicao de um modelo de cintica de pseudoprimeira ordem a tcnicas empricas de ajuste
de curvas, que aplicam solues grficas ou numricas, e avaliaes mais complexas que utilizem, por exemplo,
modelos de compartimento nico ou compartimentos mltiplos. Para informao mais pormenorizada poder
consultar-se a literatura relevante (35) (36) (37).
Todos os mtodos disponveis apresentam vantagens e desvantagens e grande variabilidade em termos de
complexidade. Se, por um lado, o pressuposto de uma cintica de primeira ordem pode ser uma simplificao
excessiva dos processos de degradao e de distribuio, a sua aplicao, quando possvel, fornece um termo
(constante de velocidade ou semivida) que facilmente compreendido e bastante til em modelao por
simulao e no clculo de concentraes ambientais previstas. A aplicao de mtodos empricos ou de
modelos de transformao linear pode resultar num melhor ajuste da curva aos dados experimentais e,
(
1
) Nos casos em que os produtos de transformao anaerbia possam ser fcil e rapidamente reoxidados, as condies anaerbias devem ser
mantidas durante a amostragem e a anlise.
portanto, permitir uma melhor estimativa dos valores de semivida, DT
50
e, quando apropriado, DT
75
e DT
90
.
No entanto, a utilizao das constantes assim derivadas limitada. Por seu lado, a aplicao de modelos de
compartimentos permite o clculo de vrias constantes teis na avaliao de risco, que caracterizam a taxa de
degradao nos diferentes compartimentos, bem como a distribuio do produto qumico. Estes modelos
devem igualmente ser utilizados para estimar as constantes de velocidade para a formao e degradao dos
produtos de transformao principais. Em qualquer dos casos, a seleco do mtodo adoptado deve ser
justificada no relatrio e o experimentador deve demonstrar graficamente e/ou estatisticamente a adequao do
ajuste.
3. RELATRIO
O relatrio deve incluir a seguinte informao:
nome vulgar, nome qumico, nmero CAS, frmula estrutural (com indicao da posio de
marcao no caso da utilizao de material marcado radioactivamente) e propriedades fsico-
-qumicas relevantes,
pureza (impurezas) da substncia de ensaio,
pureza radioqumica do produto qumico marcado e actividade molar (quando apropriado).
Substncia de referncia:
nome qumico e estrutura das substncias de referncia utilizadas para a caracterizao e/ou
identificao dos produtos de transformao.
Sedimentos e guas utilizados no ensaio:
localizao e descrio do local de recolha das amostras de sedimento aqutico, incluindo, se
possvel, o historial de contaminao,
toda a informao relacionada com a recolha, armazenamento (caso tenha sido efectuado) e
aclimatao dos sistemas gua-sedimento,
caractersticas das amostras de gua -sedimento, tal como apresentadas na tabela da seco 1.8.2.2.
Condies do ensaio:
sistema de ensaio utilizado (por exemplo, sistema de fluxo, sistema biomtrico, modo de
ventilao, mtodo de agitao, volume de gua, massa de sedimento, espessura da camada de gua
e da camada de sedimento, dimenso dos recipientes de ensaio, etc.),
aplicao da substncia de ensaio ao sistema de ensaio: concentrao de ensaio utilizada, nmero
de repeties (duplicados) e controlos e modo de aplicao da substncia de ensaio (por exemplo,
utilizao de solvente, caso necessrio), etc.,
tempos de amostragem,
mtodos de extraco e respectivas eficincias, assim como mtodos analticos e limites de
deteco,
mtodos para caracterizao/identificao dos produtos de transformao,
deviations from the test protocol or test conditions during the study.
Results:
raw data figures of representative analyses (all raw data have to be stored in the GLP-archive);
repeatability and sensitivity of the analytical methods used;
rates of recovery ( % values for a valid study are given in section 1.7.1);
tables of results expressed as % of the applied dose and in mg kg
-1
in water, sediment and total
system ( % only) for the test substance and, if appropriate, for transformation products and non-
-extractable radioactivity;
mass balance during and at the end of the studies;
a graphical representation of the transformation in the water and sediment fractions and in total
system (including mineralisation);
mineralisation rates;
half-life, DT
50
and, if appropriate, DT
75
and DT
90
values for the test substance and, where
appropriate, for major transformation products including confidence limits in water, sediment and
in total system;
an assessment of the transformation kinetics of the test substance and, where appropriate, the
major transformation products;
a proposed pathway of transformation, where appropriate;
discussion of results.
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Annex 1
GUIDANCE ON THE AEROBIC AND THE ANAEROBIC TEST SYSTEMS
Aerobic test system
The aerobic test system described in this test method consists of an aerobic water layer (typical oxygen concentrations range
from 7 to 10 mg l
-1
) and a sediment layer, aerobic at the surface and anaerobic below the surface (typical average redox
potentials (E
h
) in the anaerobic zone of the sediment range from 80 to 190 mV). Moistened air is passed over the surface
of the water in each incubation unit to maintain sufficient oxigen in the head space.
Anaerobic test system
For the anaerobic test system, the test procedure is essentially the same as that outlined for the aerobic system with the
exception that moistened nitrogen is passed above the surface of the water in each incubation unit to maintain a head space
of nitrogen. The sediment and water are regarded as anaerobic once the redox potential (E
h
) is lower than 100 mV.
In the anaerobic test, assessment of mineralisation includes measurement of evolved carbon dioxide and methane.
Annex 2
EXAMPLE OF A GAS FLOW-THROUGH APPARATUS
Annex 3
EXAMPLE OF A BIOMETER APPARATUS
Annex 4
EXAMPLE CALCULATION FOR APPLICATION DOSE TO TEST VESSELS
Cylinder internal diameter: = 8 cm
Water column depth not including sediment: = 12 cm
Surface area: 3,142 x 4
2
= 50,3 cm
2
Application rate: 500 g test substance/ha corresponds to 5 g/cm
2
Total g: 5 x 50,3 = 251,5 g
Adjust quantity in relation to a depth of 100 cm:
12 x 251,5 100 = 30,18 g
Volume of water column: 50,3 x 12 = 603 ml
Concentration in water: 30,18 603 = 0,050 g/ml or 50 g/l

REGULAMENTO (CE) N.O 440 - 2008 DA COMISSÃO

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I

(Actos aprovados ao abrigo dos Tratados CE/Euratom cuja publicao obrigatria)

1.4.2. Mtodo est-

seco transversal da coluna

seco transversal da coluna

ou colchicina); as clulas so colhidas, coradas e analisadas microscopicamente para

ou colchicina, geralmente durante 1-3 horas antes da

). Seguidamente, so feitas preparaes de

ou colchicina). As amostras sero colhidas a intervalos regulares,

). Seguidamente so feitas preparaes de

ou colchicina). As amostras sero colhidas a intervalos regulares a

= massa de substncia que permanece adsorvida no solo nos intervalos t

= massa de substncia em estudo dessorvida nos intervalos t

= massa de substncia determinada numa alquota v

Ensaio de adsoro: amostras

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