Hibridizao in situ Permite a deteco de sequncias de DNA e RNA em preparaes citolgicas e cortes histolgicos.

Usada pela 1 vez no mapeamento fsico de genes. Gall e Pardue (1969): sondas de RNA ribossomal. FISH: As sondas so sequncias de nucleotdeos complementares desenvolvidas a partir de segmentos conhecidos do DNA ou RNA que se deseja identificar. As sondas podem estar associadas a molculas radioativas ou fluorescentes.

Utiliza sondas de DNA marcadas com fluorescncia para detectar anomalias cromossmicas que esto alm do poder de resoluo da citogentica de rotina, como

microdelees e rearranjos cromossmicos complexos.

Pode ser aplicada tanto para clulas em pr-metfase, metfase como em intrfase, o que permite fazer diagnsticos citogenticos mais acurados, tanto para anormalidades

constitucionais, quanto para mudanas cromossmicas adquiridas como no caso de

clulas cancerosas. tambm um instrumento valioso para mapeamento gnico. FISH: Vantagens Pesquisas de aneuploidias podem ser feitas mais rapidamente. No h necessidade de crescimento em culturas das clulas. Tecidos preservados podem ser investigados. Pode ser aplicado para lminas padres de citogentica, mas tambm para tecidos fixados em formol, amostras de sangue e de medula ssea. Tipos de Hibridizao In vitro Suporte slido, em solues. Deve-se usar: Southern blotting - DNA Northern blotting - RNA In situ Tecidos e preparaes citolgicas. Princpios Sensibilidade: depende do acesso da sonda ao material-alvo. Resoluo: depende do dimetro celular e do mtodo usado para marcao e deteco

da sonda.
Especificidade: depende da lavagem e da extenso similar entre a sonda e a sequncia alvo. Segurana: sondas no-radioativas so mais seguras que as radioativas. Etapas da Hibridizao in situ Preparao da Sonda Sondas de DNA dupla cadeia: podem ser sintetizadas por nick translation, random priming ou PCR na presena de nucleotdeos marcados. Sondas de DNA cadeia nica: sintetizadas por PCR. Sondas de oligonucleotdeos: ocorre com a incorporao de nucleotdeos marcados. Sondas de RNA: uso de RNA polimerase purificada que transcreve determinadas sequncias a partir de um stio de iniciao. Geralmente essa sonda clonada usando -se um plasmdeo. Comprimento da sonda: Sondas muito longas podem formar sinais fracos devido a baixa taxa de penetrao. 50 a 150 pb resultam, geralmente, em bons sinais.
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Marcao da sonda:
Marcao radioativa: eficincia da sntese pode ser monitorada; radioistopos so
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facilmente incorporados durante a sntese (H , P e S ). Marcao no radioativa: rapidez na visualizao, alta estabilidade da sonda, segurana, melhor preservao da morfologia do tecido, facilidade de execuo, menor custo e desperdcio. Interao entre biotina-avidina ou com algum anticorpo, sendo que alguns fluorocromos (Fluorescena ou rodamina) podem ser usados para identificar stios de hibridizao. Preparao do material: essa etapa varivel porque depende da natureza do material e do tamanho e tipo de sonda a ser utilizada. Cultura de tecidos: as clulas devem crescer diretamente sobre as lminas ou as clulas devem ser pingadas. Fixao: deve ser suficiente para prevenir a perda do cido nucleico (paraformaldedo 4% e glutaraldedo 4%). Embebio e seccionamento: o pedao de tecido pode ser congelado ou embebido em parafina. Importante para a preservao do tecido. Pr-tratamento: Essa etapa necessria para aumentar a eficincia da hibridizao e/ou diminuio da formao de ligaes no-especficas. Se a sonda for cadeia dupla, ela deve ser desnaturada a 70C em formamida. Hibridizao: para cada caso se tem um protocolo. 5. Lavagem ps-hibridizao: para remoo do excesso de sonda. 6. Deteco da sonda: depende do tipo de marcao incorporada na sonda: RADIOATIVA: Autoradiografia. NO-RADIOATIVA: Direta Indireta Mtodo Direto: ligao com fluorocromo; Mtodo Indireto: molculas sinalizadoras: biotina, digoxigenina: conjugam-se com outra molcula ligada ao fluorocromo (avidina ou anticorpos).

Direto
A sequncia marcada com biotina que detectada pela ligao com a avidina. Depois, utiliza-se uma enzima ou fluorocromo para a visualizao. Fosfatase alcalina ou peroxidase Fluorescena ou Rodamina

Indireto
A sonda marcada com biotina e, utiliza-se um anticorpo anti-biotina. Aps, usa-se um anticorpo secundrio. Policlonal de cabra IgG conjugada a Fluorescena Artefatos da Tcnica
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Background

(sondas

radioativas):

preparao

inadequada

da

emulso

posicionamento da lamnula. Background (sondas no-radioativas): ligaes no especficas. Hibridizao no eficiente: degradao da sequncia-alvo; tamanho e/ou concentrao baixa da sonda; lavagem; tipo de tratamento e fixao.

Pinkel et al.(1986), uniram a tcnica de hibridizao com imunofluorescncia. Tcnica que usa corantes fluorescentes ligados a sonda. APLICAES Aberraes cromossmicas. Mutagnese. Diagnstico de cncer. Pr-natal e pr-implantao.

Trs categorias de sondas: 1. Sondas que hibridizam locus especficos ou sequncias nicas:
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Sequncias nicas de DNA amplificado por PCR ou vetores biolgicos.

Resultam em sinais discretos em cromtides irms de metfases e dois sinais no ncleo interfsico. 2. Sondas que hibridizam estruturas cromossmicas especficas: Sondas pericentromricas especficas ou sequncias repetitivas alfa-satlite, beta-satlite e sondas de satlites clssicos e sondas telomricas. Sinal ntido e brilhante. 3. Sondas que hibridizam sequncias cromossmicas mltiplas: Coquetel de sequncias nicas homlogas a sequncias de DNA abrangendo o

comprimento de uma banda ou cromossomo alvo.

Seu uso em ncleos interfsicos limitado pela ausncia de um sinal distinto.

Sondas Centromricas

Sonda de Sequncia nica

Hibridizao in situ Fluorescente Multialvo

Possibilita a visualizao de vrias sequncias diferentes simultaneamente em cromossomos metafsicos e ncleos interfsicos.

Vrias sondas complementares s diferentes sequncias-alvo numa mesma hibridizao.

Aplicaes: Citogentica do cncer. Determinao sexual.

Hibridizao Genmica Comparativa)

Identificao de anomalias cromossmicas e de sequncias amplificadas e deficientes. Permite a anlise em todo o genoma de uma s vez. Alteraes genticas complexas e aneuploidias em tumores; Translocaes e inverses especficas em certos tipos de leucemia. 1. O DNA genmico de interesse e o DNA normal so cortados pelas mesmas enzimas de restrio e marcados de forma a serem detectados por fluorocromos diferentes. 2. Numa proporo de 1:1, os DNAs so co-hibridizados sobre uma lmina com mtafases de tecido normal.

3. A visualizao dos diferentes sinais permite a comparao entre os DNAs em relao

s metfases normais, fornecendo um nmero comparativo de aumento ou perda de DNA: oncogenes e genes supressores.

CHROMOSSOME PAINTING Ocorre a marcao de um ou mais cromossomos inteiros, utilizando-se vrios tipos de fluorocromos Deteco de alteraes cromossmicas Rearranjos complexos Diagnstico pr-natal Estudos de evoluo comparativa

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL
Em 1996 Schrock et al. usaram a tcnica em cromossomos humanos. Permite a identificao de todos os cromossomos inteiros com diferentes cores. Necessita de uso combinado da espectroscopia de Fourier, analisador de imagens e microscpio ptico. Usa simultaneamente 24 diferentes sondas marcadas com nt conjugados a 5 tipos de fluorocromos: O computador processa uma determinada cor para cada par cromossmico, facilitando a interpretao.
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Aplicaes:
Identificao de alteraes cromossmicas. Rearranjos estruturais. Cromossomos marcadores.