7/22/2011

I Curso de Inverno em Oncologia Molecular

Controle transcricional da Expresso Gnica e sua relao com o Cncer

Michelly C Pereira Adriana P Trape 2011

Nveis de regulao da expresso gnica e sua relao com o cncer

Controle transcricional Controle processamento do RNA Controle transporte e localizao do RNA (ncleo/citoplasma) Controle epigentico Controle por RNAi (siRNA/miRNAs)

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?
QUAL A IMPORTNCIA DA REGULAO DA EXPRESSO GNICA NAS CLULAS?

Desenvolvimento dos organismos multicelulares envolve alteraes na expresso gnica

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DIFERENCIAO CELULAR

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EXPLICA A GRANDE DIVERSIDADE CELULAR - CLULAS COM DIFERENAS MORFOLGICAS E COM DIFERENTES FUNES!

MESMO GENOMA MESMA SEQUNCIA DE DNA

DIFERENTES FATORES DE TRANSCRIO DIFERENTES RNAs DIFERENTES SPLICES

DIFERENTES PROTENAS

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DIFERENTES INTERAES PROTENA-PROTENA

Mapa DIP (Database of Interacting Proteins) da Calmodulina. Fonte: nature.com

DIFERENTES CLULAS FUNES ESPECFICAS

E AS CLULAS TUMORAIS?

As prprias clulas tumorais adquirem perfis de expresso gnica diferenciados

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Estudos de expresso gnica sugerem que em algum

momento do seu ciclo, uma clula humana ir expressar aproximadamente 10.000 a 20.000 dos seus 30.000 genes!

Quando comparamos o perfil de mRNAS das diferentes clulas humanas verificamos que os nveis de genes ativos varia de uma clula para outra.

GENES CONSTITUTIVOS & GENES ESPECFICOS

Algumas protenas so expressas em quase todas as clulas (protenas do DNA, reparo, enzimas do metabolismo, do citoesqueleto) = CONSTITUTIVOS/Housekeeping (10.000 a 20.000/clula)

Outras so especficas, como por exemplo a Hemoglobina, ou so expressas devido a estmulos especficos (aprox 1000 genes/clula)

Os padres de expresso dos mRNAs so caractersticos de cada tipo celular e podem ser utilizados para classificao tumoral.

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Uma clula pode alterar a expresso de seus genes em resposta aos sinais externos

Clulas do fgado expostas ao hormnio glicocorticide sintetiza vrias protenas especficas em altas concentraes: enzimas tirosina aminotransferase = converte tirosina em glicose. Se no h o hormnio, os nveis da enzima volta ao normal Clulas do tecido adiposo na presena do hormnio glicocorticide diminui a expresso da enzima tirosina aminotransferase Outras clulas nem respondem ao hormnio glicocorticide Especializao celular: diferentes tipos celulares respondem de forma diferente ao mesmo sinal extracelular

A expresso gnica pode ser regulada em muitos dos diferentes passos na via DNA RNA - PROTENA

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Nveis de regulao da expresso gnica e sua relao com o cncer

Controle transcricional Controle processamento do RNA Controle transporte e localizao do RNA (ncleo/citoplasma) Controle epigentico Controle por RNAi (siRNA/miRNAs)

1 - CONTROLE TRANSCRICIONAL

Define QUANDO e QUANTO determinado gene transcrito!

nico nvel de controle que garante que a clula no sintetizar produtos desnecessrios, evitando gastos de energia!

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Elementos importantes para o controle da expresso gnica (MAQUINARIA TRANSCRICIONAL)

REGIO PROMOTORA RNA POLIMERASE FATORES DE TRANSCRIO ATIVADORES/REPRESSORES MEDIADORES

OPERADOR

ENHANCERS

EFETORES ALOSTRICOS

ENZIMAS REMODELADORAS DA CROMATINA (histonas acetil transferases, deacetilases, metilases)

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Stios regulatrios das bactrias so localizadas prximas regio do promotor

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MODELO DE REGULAO DA EXPRESSO GNICA: OPERON LAC

OPERON = segmento de DNA que codifica um mRNA multignico e tem uma regio regulatria e do promotor comum; genes que codificam enzimas de uma mesma via metablica; genes na sequncia de atuao na via.

Fonte: nature.com

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REGULAO DA EXPRESSO GNICA NOS EUCARIONTES

Nvel de regulao mais complexo + tipos de protenas regulatrias (complexos proticos)

+ tipos de interaes com as regies regulatrias do DNA regies mais distantes do promotor).

DIFERENAS ENTRE REGULAO DA EXPRESSO GNICA

Procariontes
Estrutura do genoma
Simples, geralmente circular s vezes acompanhado de plasmdios Relativamente pequeno

Eucariontes
Em cromossomos; nucleossomo limita acessibilidade ao DNA

Tamanho do genoma Localizao da transcrio gnica e traduo Disposio gnica

Relativamente grande

acoplada; no h barreira Transcrio nuclear e do envoltrio nuclear traduo citoplasmtica Operons (genes de funo Cada gene tem seu prprio similar agrupados juntos) promotor e elementos enhancer

Estado da transcrio basal Estrutura do DNA

On (ativa)

Off (inativa)

DNA supercoiled com Cromatina altamente vrias proteinas associadas condensada (associado com histonas em nucleossomos.

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Regio regulatria tpica de um gene eucarionte

Especficas para cada clula Comuns a todos os genes

Fonte: Molecular Biology of the Cell. 4th edition

SEQUNCIAS REGULATRIAS : prximas ao promotor (200pb) distantes ao promotor nas regies dos ntrons downstream aos genes

REGIO PROMOTORA

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Como ocorre ao distncia distantes e o promotor?

entre sequncias mais

DNA age como uma ALA = grande complexo de regulao

Fonte: nature.com

Roeder R., 2004

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Combinao de vrias protenas regulatrias, permite grande flexibilidade no controle da expresso gnica. Mesmo gene pode ser transcrito de diferentes formas, dependendo da combinao, presena ou ausncia das vrias protenas regulatrias.

Protenas Regulatrias
Domnios funcionais:

Domnio de ligao ao DNA (motivos especficos) Domnio de interao com protenas do aparato transcricional (RNA pol ou protenas que interagem com RNApol) Domnio de cooperao com protenas que se ligam prximos s sequncias regulatrias do DNA Domnio que influencia condensao da cromatina (direta ou indiretamente) Domnio sensor das condies fisiolgicas da clula.

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Interaes DNA-Protena (domnios dos FATORES DE TRANSCRIO)

c-fos/c-jun c-myc

nature.com

Cncer & Regulao da transcrio gnica

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REGULAO DA EXPRESSO GNICA PELOS FATORES MITOGNICOS

E2

ER GP

GF

iNOS

Ca++

PI3K AKT Apotose

ER S118 P ER ERE ER P TF

ER TF

ER ERE

ER

Transcrio do gene alvo Sntese protica Proliferao celular

GGTCANNNTGACC (Adaptado de NAGAI e BRENTANI, 2008)

Superexpresso do oncogene c-myc Linfoma de Burkitts t(8;14)

c-myc fica sob controle de um forte enhancer das imunoglobulinas

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Nveis de regulao da expresso gnica e sua relao com o cncer

Controle transcricional Controle processamento do RNA Controle transporte e localizao do RNA (ncleo/citoplasma) Controle epigentico Controle por RNAi (siRNA/miRNAs)

2. Controle do Processamento (Splicing) do mRNA

S possvel devido a existncia do ncleo (separao fsica entre transcrio e traduo). Quando existe diferentes possibilidades de splicing em vrias posies do transcrito, um NICO GENE pode produzir vrias protenas diferentes (protenas com diferentes domnios funcionais = distintas isoformas

FGFR2/PGFR2
Fonte: Molecular Biology of the Cell. 4th edition

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O splicing alternativo pode ser escolhido para regular a transcrio de protenas funcionais das no-funcionais.

Gera diferentes verses da protena em diferentes tipos celulares de acordo com as necessidades da clula (Tropomiosina forma especializada dependendo do tipo de clula).

H um delicado balano de competio entre stios de splicing;

Regulao diferencial do Splicing

Fonte: Molecular Biology of the Cell. 4th edition

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DEFEITOS DA MAQUINARIA DE SPLICING & CNCER

Venables J, 2004

Outra forma de regular a transcrio pela mudana c-terminal do mRNA ( alterao do stio de clivagem do mRNA e incio da poliadenilao).

Exemplo: anticorpos dos Linfcitos B = ligados a membrana (cauda de poli-A mais longa) ou secretados (cauda de poli-A mais curta).

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Fonte: Molecular Biology of the Cell. 4th edition

Nveis de regulao da expresso gnica e sua relao com o cncer

Controle transcricional Controle processamento do RNA Controle transporte e localizao do RNA (ncleo/citoplasma) Controle epigentico Controle por RNAi (siRNA/miRNAs)

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3. Controle do transporte e localizao dos mRNAS

Destino do mRNA definido por sequncias curtas (short sequences) 3UTR (elementos cis-regulatrios). Ribonucleoprotenas (mRNA + fatores de ao trans: protenas e RNAs no-codificadores)

Cheneval et al., 2010

Localizao do mRNA um importante mecanismo:

Estabelecer compartimentos e estruturas funcionalmente distintos polarizao

Migrao celular direcionada

Destino celular no desenvolvimento embrionrio (Ex: actina).

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Mecanismos para localizao dos mRNAs

Fonte: Molecular Biology of the Cell. 4th edition

A localizao especfica dos mRNAs necessita de sequncias-sinais tipicamente localizadas na regio 3UTR.

Besse & Ephrussi, 2008.

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Aberrante estabilizao do mRNA!

Definio

Epigentica

Mecanismos de regulao da expresso gnica independentes de alteraes na sequncia do DNA

(Sharma et al; Carcinogenesis, 2010)

Diversidade celular em tecidos normais

(Feinberg AP; Nature, 2007)

Potencialmente reversveis

Alvos teraputicos

(Yoo et al; Nat Rev Drug Discov, 2006)

Categorias
Metilao do DNA Modificaes de histonas (covalente e no-covalente) RNAs no-codificantes

Processos
Estrutura da cromatina Degradao do RNAm Bloqueio de sntese protica

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Estrutura da cromatina
Heterocromatina
(inativa)

Eucromatina
(ativa)

Acesso da maquinaria transcricional ao DNA Manuteno do padro durante a replicao do DNA

(http://nature.com)

(Feinberg AP; Nature, 2007)

Hiptese CDGE
Common disease genetic and epigenetic hypothesis
(Bjornsson et al, Trends Genet, 2004)

Estrutura da Cromatina

Sequncia do DNA

Ambiente

(Feinberg AP; Nature, 2007)

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Estrutura da cromatina
Nucleossomos ~ 146 pb de DNA dispostos em torno de um octmero de histonas
(Luger et al; Nature, 1997)

Modificaes da cromatina Metilao do DNA Metilao e acetilao de histonas

(Fullgrabe et al; Oncogene, 2011)

Estrutura da cromatina
Metilao do DNA
DNA Metil-transferases (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)

(Gibney & Nolan, Heredity, 2010)

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Alteraes em histonas
Covalentes
Metilao de histonas
HMT histona metil-transferases HDM histona demetilases

Acetilao de histonas
HATs histona acetil-transferases HDACs histona desacetilases

(Luczak & Jagodzinski; Folia Histochem Cytobiol, 2006)

Alteraes em histonas
Efeitos sobre a expresso gnica
Silenciamento Ativao

+ Metilao do DNA:
Silenciamento

(Hake et al; British Journal of Cancer, 2004)

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Estrutura da cromatina
Modificaes no-covalentes
Remodelagem da cromatina (Complexos SWI/SNF) Variantes de histonas

(Wilson & Roberts, Nat Rev, 2011)

Remoo de histonas

(Hake et al; British Journal of Cancer, 2004)

Metilao do DNA e Cncer

Genes supressores tumorais (TSGs)

Ilhas CpG ~ 60% promotores

(Brower V; Nature, 2011)

Oncogenes (Imprinting Genmico)

Tumor de Wilms

(Fainberg AP; Nature, 2007)

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Metilao do DNA e Cncer

Mobilidade de retrotransposons

Oncogene

(Carnell & Goodman; Toxicol Sci, 2003)

Modificao de histonas e Cncer

Expresso alterada de enzimas modificadoras de histonas
Principais alteraes descritas

(Fullgrabe et al; Oncogene, 2011)

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Modificao de histonas e Cncer

MLL: Leucemia EZH2: Mama, prstata, clon

LSD1: Cncer de mama

(Chi et al; Nat Rev, 2010)

Estrutura da cromatina e terapia

Reativao de genes supressores tumorais
1. 5-Aza-CR (azacitidina) e 5-Aza-CdR (decitabine)
(Yoo et al; Nat Rev Drug Discov, 2006)

Sequestradores de DNA metil-transferases

(Egger et al; Carcinogenesis, 2010)

FDA

sndromes mielodisplsicas
(Plimack et al; Leuk Lymphoma, 2007)

2. SAHA
(Carew et al; Cancer Lett, 2008)

Inibidor de HDAC Linfoma de clulas T

(Sharma et al; Carcinogenesis, 2010)

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Epigentica
Definio
Mecanismos de regulao independentes de alteraes na sequncia do DNA. Potencialmente reversveis Alvos teraputicos

Categorias
Metilao do DNA Modificaes de histonas (covalente e no-covalente) RNAs no-codificantes

Processos
Estrutura da cromatina Degradao do RNAm Bloqueio de sntese protica

RNAs no-codificantes
RNAs no traduzidos em protenas Small ncRNAs (18 a 200 nt) Traduo e sntese protica (tRNAs, rRNAs, snoRNAs) Splicing Alternativo (snRNAs) Inibio da Expresso Gnica (miRNAs) Long ncRNAs (200 nt a > 100 kb) Inibio da Expresso Gnica (RNAs intrnicos, antisenso)

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RNAs no-codificantes
mRNAs e ncRNAs Small RNAs

RNA de interferncia RNA de interferncia

Mattick & Makunin; Human Mol Genetics, 2005)

RNA de interferncia
Silenciamento transcricional e ps-transcricional

HOTAIR Cncer de mama Long ncRNAs

Pr-mRNAs Long ncRNAs

shRNAs

(Gibb et al; Mol Cancer, 2011) siRNAs

(Castanotto & Rossi; Nat Rev, 2009)

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Terapia - mRNA
siRNAs x shRNAs
Eficcia Capacidade de modificao na estrutura qumica Maquinaria endgena de miRNAs

shRNAs bi-funcionais Degradao do RNAm E bloqueio da traduo

(Rao et al; Advanced Drug Delivery Reviews, 2009)

Terapia - microRNAs
1 miRNA Diversos mRNA Supressores tumorais e Oncogenes

(Galasso et al; Gen Med, 2010)

Oligonucleotdeos anti-miRNA (AMOS) - Oncogenes Inibidores competitivos miRNA sponge Reposio dos miRNAs por RNAi Supressores de tumor

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RNA de interferncia Perspectivas

Os resultados obtidos por RNAi so promissores. A otimizao de entrega do shRNA e a minimizao dos efeitos indesejveis sero estabelecidos pelos ensaios clnicos atualmente em andamento.

Objetivos

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