INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

ING. BIOQUMICA

LABORATORIO DE MTODOS DE ANLISIS

GRUPO: 4IM1

SECCIN 1

PROFESORA: FRANCISCO FERNNDEZ LPEZ

PRCTICA # 4
ESTUDIO DE ALGUNOS FACTORES QUE AFECTAN EL ESTABLECIMIENTO DE UN MTODO ESPECTROFOTOMTRICO

Alumno: Luna Callejas Benjamn

Fecha de Entrega: 18/Marzo/2014

ESTUDIO DE ALGUNOS FACOTRES QUE AFECTAN EL ESTABLECIMIENTO DE UN MTODO ESPECTROFOTOMTRICO OBJETIVO

Seleccionar tubos comunes de laboratorio para ser usados como cubetas para el espectrofotmetro. Manejar algunos de los parmetros que intervienen en el establecimiento de un mtodo espectrofotomtrico. Establecer las condiciones ptimas de los parmetros probados para la aplicacin del mtodo.

INTRODUCCION De acuerdo con el Skoog, el espectrmetro es un instrumento espectroscpico que utiliza un monocromador o un policromador en combinacin con un transductor para convertir las intensidades de radiacin en seales elctricas. Los espectrofotmetros son espectrmetros que permiten medir la relacin entre la energa radiante de dos rayos, lo cual es necesario para medir la absorbancia. Para considerar a un mtodo espectrofotomtrico como cuantitativo primero debe de cumplir ciertas reglas como: El mtodo seleccionado deber ser especfico para cuantificar un analito de nuestro inters. Que el mtodo est libre de todas las interferencias posibles al momento de hacer la determinacin o en su defecto tratar de controlar lo ms posible estas interferencias. Debe de tener alta precisin y alta exactitud. El mtodo debe tener una alta sensibilidad y adems el lmite de deteccin debe de corresponder a una concentracin baja. Experimentalmente para el establecimiento de un mtodo espectrofotomtrico, despus de optimizar las condiciones qumicas del sistema (pH, temperatura, control de interferentes, concentracin adecuada de reactivos, solvente apropiado, proteccin a la luz para evitar reacciones fotoqumicas, etc.) que garanticen que se tiene la especie de inters en condiciones adecuadas para la medida. RESULTADOS Seleccin de tubos
TUBO No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 %T400(NISO4) 18.6 18.6 18.6 18.5 16.7 18.6 18.6 18.5 18.6 18.7

Tabla 1. Seleccin de tubos comunes para usarlos como celdas.

Como se puede notar los 10 tubos que fueron elegidos para utilizarlos como celdas tuvieron menos variacin en el %T con NiSO4 a 400 nm y cabe aclarar que se seleccionaron en base al dimetro interno del tubo, tamao y forma buscando aquellos que fueran lo ms similares posibles. Explique que son las superficies pticas equivalentes y el dimetro interno equivalente. o Superficie ptica equivalente.- Las superficies pticas equivalentes de un conjunto de cubetas son aquellas que estn libres de imperfecciones, poseen una superficie homognea, paredes de igual grosor, desvan la luz y producen efectos pticos idnticos o similares, por lo que es sumamente importante el material del cual estn construidas. o El dimetro interno equivalente se refiere a que la luz atraviese la misma distancia en todas las celdas, es decir, que el paso de luz sea el mismo en todos los tubos. Curva de calibracin
Las concentraciones del in Fe3+ se calcularon para cada tubo a partir de los escalamientos siguientes: | Entonces ejemplificando para el tubo 2: || |

| = 0.698

pero el volumen total fue de 10 mL por lo que: 0.0698 =0.07

A ajustada por regresin lineal 0.0112 0.0240 0.0401 0.0670 0.1207 0.1744 0.3891 0.6039 0.8187 1.0334 1.2482 1.4629 1.6777

TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

[Fe3+] 0.000 0.070 0.175 0.350 0.700 1.050 2.450 3.850 5.250 6.650 8.050 9.450 10.850

A480 0.000 0.016 0.025 0.051 0.113 0.152 0.419 0.634 0.847 1.075 1.226 1.446 1.655

Tabla 2. Curva de calibracin de Fe3+ por el mtodo del N 4 SCN.

ABSORBANCIA a 480nm

CURVA DE CALIBRACIN
1.800 1.600 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 0.000

y = 0.1537x + 0.0112 R = 0.9984

2.000

4.000

6.000

8.000

10.000

12.000

CONCENTRACIN DE CLORURO FRRICO [g/mL] Grfica 1. Curva de calibracin de Fe3+ por el mtodo del N 4 SCN.

a) Sigue esta reaccin la ley de Bouger y Beer? Explique. En base al coeficiente de correlacin de la curva de calibracin de valor 0.9984 cuyo valor es muy prximo a uno, se entiende que la mayora de los puntos que conforman nuestra curva de calibracin siguen una tendencia lineal, que se observa ms claramente de manera grfica para los puntos entre 2 a 8 g/mL, con ello se comprueba que existe una relacin directamente proporcional entre la absorbancia y la concentracin del in frrico, mientras mayor sea la concentracin del in frrico mayor ser la absorbancia, por tanto se observa que nuestra curva de calibracin s cumple con la ley de Bouger y Beer. b) Comente acerca de la sensibilidad del mtodo, el intervalo de concentracin y escala de lectura til del aparato. La pendiente de la recta determina el valor de la sensibilidad del mtodo, en este caso se tiene una pendiente con un valor de 0.1537, es decir, se produce un cambio de absorbancia de 0.1537 por cada incremento de concentracin de analito de una unidad (1 g/mL). Acerca del intervalo de concentracin, como mencion anteriormente se observa ms claramente de manera grfica para los puntos entre 2 a 8 g/mL de in frrico, que corresponde al intervalo donde mejor se obedece la ley de Bouger y Beer; la escala til de absorbancia en base al intervalo de concentracin se encuentra alrededor de 0.4 a 1.0.
4

c) Determina el lmite de deteccin del mtodo.

Pendiente Ordenada al origen Coeficiente de correlacin

0.1537 0.0112 0.9984

y = a + bx y= Entonces a= =0.0112 y b=0.1537 Para calcular el valor de se us la frmula:

A480 (yi) 0.016 0.025 0.051 0.113 0.152 0.419 0.634 0.847 1.075 1.226 1.446 1.655

A ajustada por regresin lineal (i) 0.0240 0.0401 0.0670 0.1207 0.1744 0.3891 0.6039 0.8187 1.0334 1.2482 1.4629 1.6777

(yi-i) -0.008 -0.0151 -0.016 -0.0077 -0.224 0.0299 0.0301 0.0283 0.0416 -0.0222 -0.0169 -0.0227

(yi-i)= -0.0011 y

=0.00000121 = 3.479x
4

Como y=

= 0.0112 + (3)( 3.479x

y=0.01224 ste valor representa la medida de absorbancia que produce la concentracin mnima detectable por lo que al sustituir en y = a + bx se obtiene: 0.01224 =0.0112 + (0.1537)X X=LDD=
4

=0.006766

tambin LDD=

TUBO [Fe3+] 0.00 1 0.07 2 0.175 3 0.35 4 0.7 5 1.05 6 2.45 7 3.85 8 5.25 9 6.65 10 8.05 11 9.45 12 10.85 13

METODO DE RINGBOM Log[Fe3+] A480 %T ABSORTANCIA (100-%T) _____ 0.0000 100.00 0.0000 -1.1549 0.0240 94.6154 5.3846 -0.7570 0.0401 91.1706 8.8294 -0.4559 0.0670 85.7058 14.2942 -0.1549 0.1207 75.7391 24.2609 0.0212 0.1744 66.9314 33.0686 0.3892 0.3891 40.8197 59.1803 0.5855 0.6039 24.8949 75.1051 0.7202 0.8187 15.1827 84.8173 0.8228 1.0334 9.2596 90.7404 0.9058 1.2482 5.6472 94.3528 0.9754 1.4629 3.4441 96.5559 1.0354 1.6777 2.1004 97.8996

Tabla 3. Datos para aplicar el mtodo de Ringbom en la determinacin de Fe3+ por el mtodo del SC .

Mtodo de Ringbom
120.0000

100.0000 ABSORTANCIA (100-%T)

80.0000

60.0000

40.0000

20.0000

-1.5000

-1.0000

-0.5000

0.0000 0.0000 Log[Fe3+]

0.5000

1.0000

1.5000

Grfica 2. Grfica de Ringbom. La recta roja inclinada representa la recta tangente al punto de inflexin y las flechas verdes determinan el intervalo de concentracin y la escala de A del aparato para el error fotomtrico mnimo.

m=pendiente %EP=

74.0356 3.1100

%EP=

Para conocer los intervalos de concentraciones, de la grfica 2 se observa que: log[Fe3+]=0.7 de donde

log[Fe3+]=0.025 de donde Para conocer los valores de absorbancia, de la grfica 2 se observa que: Cuando Absortancia= 47% esto es 53% de Transmitancia y con ello %T= A=2-log(%T)= 2-log(53)= 0.2757 Cuando Absortancia= 92% esto es 08% de Transmitancia y con ello %T= A=2-log(%T)= 2-log(08)= 1.0969 A partir de la curva de calibracin se determin el intervalo de concentracin que se observ fue de aproximadamente de 2 a 8 g/mL de in frrico comparado con el obtenido por el mtodo de Ringbom cuyo intervalo fue de 1.05 a 5.012 g/mL. Con respecto a las escalas de absorbancia dnde para la curva de calibracin se observa de 0.4 a 1 y a partir del mtodo de Ringbom se nota de 0.2757 a 1.0969. Efecto del tiempo en la estabilidad del color

A 480

Tiempo(min) 0 30 60 90. 120

A480 0.599 0.560 0.520 0.512 0.495

Estabilidad de color respecto al tiempo

0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 60 80 100 120 140

Tiempo de reposo (min) Grfica 3. Estabilidad del color respecto al tiempo.

a) Es estable el color? NO b) Cul es el tiempo ptimo para hacer las lecturas?

El tiempo 0 es decir inmediatamente despus de la adicin del tiocianato ; porque como se observa en la grfica 3 conforme va aumentado el tiempo la absorbancia disminuye y por lo tanto la intensidad del color se ve afectada en una disminucin que altera las lecturas realizadas. Efecto del Cromgeno
TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 [SCN] [Fe3+] [SCN]/ [Fe3+] A480

87.12 232.32 871.2 2904 5808 8712 11616 14520

4.2 4.2 4.2 4.2 4.2 4.2 4.2 4.2

20.7429 55.3143 207.4286 691.4286 1382.8571 2074.2857 2765.7143 3457.1429

0.097 0.214 0.42 0.527 0.628 0.685 0.726 0.746

Tabla 4. Efecto de la concentracin de SCN- en la determinacin de Fe3+

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL CROMGENO

0.9 0.8 0.7 ABSORBANCIA a 480nm 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.0000

500.0000

1000.0000 1500.0000 2000.0000 2500.0000 3000.0000 3500.0000 4000.0000 [SCN-]/ [Fe3+]

Grfica 4. Efecto de la concentracin de cromgeno..

a) Qu concentracin de tiocianato se recomienda? Explique por qu. Las concentraciones de tiocianato ms recomendables son las correspondientes a los tubos 8 y 9 es decir 11616 y 14520 ya que a mayor concentracin de tiocianato mayor es la coloracin lo que permite realizar lecturas ms certeras y con mayor estabilidad de color. Efecto del pH

Efecto del pH
Tubo No pH A480 --0 1 0 0.869 2 1 0.953 3 2 0.960 4 8 0.024 5 9 0.023 6
1.2 1 0.8 A 480 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 0 2 4 pH 6 8 10

Grfica 5. Efecto del pH.

a) De qu manera influye el pH en el sistema colorido? Como la reaccin se lleva a cabo ms favorablemente en un medio cido, el aumento en el pH interfiere en la formacin del cromforo y disminuye la intensidad de ste en la formacin de color. A pH cidos se ve favorecida la estructura del tiocianato para que sta pueda reaccionar con mayor facilidad con el in fierro, mientras que a un pH bsico las estructura del tiocianato cambia y esto lo hace ms difcil de que reaccione con el fierro y se lleve a cabo la reaccin colorida. b) Cul es el pH recomendado para que se efecte la reaccin Fe3+ - SCN-? El pH ptimo para que se lleve a cabo la reaccin es un pH cido, en el caso de la prctica lo podemos observar en los tubos 3 y 4 con pH de 1 y 2 pero es importante mencionar que el pH ptimo experimental fue de 2.

Efecto de Aniones

Anin A inicial A Final 0.935 0.580 Fluoruro 0.924 0.237 Oxalato 0.924 0.919 Tartrato 0.928 0.903 Fosfato

Efecto de algunos aniones en la reaccion Fe 3+ -SCN1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 fluoruro oxalato tartrato fosfato

A 480

A 480 inicial A 480 final

a) Cul es el efecto de los diferentes aniones sobre la reaccin entre el in frrico y el tiocianato? Todos los aniones utilizados en la prctica interfieren en la formacin del cromforo, los que ms interfieren son el oxalato y el fluoruro, tartrato y fosfato. Actan como sustituyentes para el Fe, compitiendo con el ion SCN- para reaccionar con el metal. En el caso del oxalato y el fluoruro se ve que estos dos reaccionan con el Fe por tener mayor electronegatividad que el SCN-, evitando asi la formacin de color. b) A qu se debe este efecto? Los iones fluoruro y oxalato son ms electronegativos que el tiocianato, lo que provoca que entren como sustituyentes desplacen al tiocianato, provocando la decoloracin. Parmetros ptimos en todos los experimentos
Parmetro pH Tiempo Concentracin de SCNLmites de concentracin con %Ep mnimo Aniones que interfieren(en orden creciente) Lmite de deteccin del mtodo (LDD) Valor ptimo 2 0s 14520 g/ml De 1.05-5.019 g/ml y 3.11% Oxalato, fluoruro, fosfato, tartrato. 0.006766 g/ml

DISCUSION DE RESULTADOS De acuerdo al valor calculado para el LDD podemos decir que el mtodo es muy sensible, ya que el LDD o lmite de deteccin mnimo es la concentracin mnima detectable en el espectrofotmetro. No es de sorprender que el intervalo de concentracin recomendable sea el que comprende el pico ms alto de la grfica por que a mayor concentracin habr ms color en el cromgeno y favorecer la lectura.

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Al realizar la seleccin de tubos para ser usados como cubetas se toman como criterios el que la superficie de los mismos sea homognea y de igual grosor, para que de esta manera se produzca una dispersin de la luz anloga en todos los tubos, esto se logr al fijar un valor de transmitancia arbitrario (%T=95) de tal forma que la lectura del aparato no fuera mayor a 2%T. Tambin se tom en cuenta el que los tubos tengan un dimetro interno equivalente para mantener el paso de luz constante en todas las mediciones. Una vez seleccionadas las cubetas, se procedi a estudiar algunos factores que afectan el diseo de un mtodo espectrofotomtrico, entre los cuales se tienen los siguientes: * Estabilidad del color en funcin del tiempo: la formacin de color se llevo a cabo de manera rpida experimentando un desvanecimiento al incrementarse el tiempo de reposo, probablemente debido a la descomposicin por la luz y/o por el calor, por lo cual no es estable el color. Lo ideal sera que la reaccin de formacin de color sea rpida para que los resultados analticos puedan obtenerse con rapidez, y que las especies coloreadas sean estables con el tiempo de forma que no sea necesario realizar el anlisis en un tiempo prefijado. * Efecto de la concentracin del cromgeno: se encontr que la concentracin de tiocianato ptima para esta reaccin debe ser de 14500 g/mL, ya que a esta concentracin la reaccin es prct icamente completa al haber cantidades estequiomtricas de los reactivos, provocando que la adicin de ms cromgeno de cmo resultado pequeos incrementos de la absorbancia. Si por el contrario, la reaccin no es completa, la adicin de cantidades crecientes de cromgeno, desplazar el equilibrio hacia la formacin de ms especie coloreada, provocando un aumento en la absorbancia. * Efecto del pH: el pH ptimo para que se lleve acabo la reaccin es de cero, al ir aumentando dicho parmetro, se incrementa la cantidad de OH en el medio y al ser esta especie ms electronegativa que el tiocianato se favorece otra reaccin a la que se pretende estudiar. Cuando el control de pH es muy crtico se deben utilizar soluciones reguladoras, o bien, ajustar el pH al valor deseado con ayuda de un potencimetro. * Efecto de algunos aniones: con frecuencia, las sustancias interferentes son muy similares en sus propiedades qumicas en base al analito de inters y por tanto reaccionan de modo muy semejante con el cromgeno. En este caso la diferencia de electronegatividades de algunos aniones produce reacciones indeseables que modifican la formacin del color; tal es el caso del fluoruro y de oxalato, que al ser ms electronegativos que el tiocianato, reaccionan con el Fe3+ originando otra sustancia con coloracin diferente. En el caso del fosfato se produce una disminucin pequea en la absorbancia, ya que la mayor parte del fierro reacciona con el tiocianato y no con el fosfato, esto nos indica que no hay una gran diferencia en electronegatividades entre estos dos aniones. El tartrato no modifica la absorbancia de la muestra, por lo que este anin no representa una interferencia para el desarrollo de color. Para algunas reacciones el control de la temperatura es necesario, ya que se utilizan disolventes orgnicos que son muy voltiles; en otros casos, se puede favorecer la formacin del producto coloreado o la decoloracin del mismo. Para nuestro caso la reaccin no es afectada por la temperatura en ninguna de las formas antes mencionadas. En lo que respecta ala curva de calibracin, al realizar la regresin lineal se obtiene un coeficiente de correlacin que se aproxima a uno, lo cual nos indica que nuestros datos presentan una tendencia lineal y que entre ellos existe una proporcionalidad, con lo cual se cumple con la ley de Bouger y Beer en el intervalo de concentraciones de 0.070-10.811 g/mL, y por consecuente, se puede llevar a cabo esta determinacin espectrofotomtrica. Para calcular el limite de deteccin del mtodo, se calcul le desviacin estndar del blanco y al sustituirlo en la ecuacin (3) se encontr que este es de 0.406 g/mL. Para calcular el %Ep, por el mtodo de Ringbom, se determin la pendiente de la parte recta de la grfica en base a dos puntos pertenecientes a este intervalo, obteniendo que el %Ep es de 3.06 para este
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mtodo. Por otra parte en la grfica de Ringbom de aprecia que los lmites de concentracin con %Ep mnimo es de 1.046-5.231 g/mL, ya que en este intervalo de concentracin representa la parte recta de esa gfica. determinando los parmetros necesarios para evitar errores en la determinacin cuantitativa de Fe3+, lo que nos sirve como base para poder plantear las variables de cualquier determinacin. Hicimos diferentes curvas con nuestros resultados experimentales que nos muestras las medidas de pH, tiempo, concentracin del cromgeno, interferencias mas ptimas para trabajar el mtodo, estandarizndolas para siempre hacer la determinacin bajo estos parmetros. Tambin aprendimos a seleccionar celdas para poder realizar un mtodo espectrofotomtrico, escogiendo las que tuvieran dimetro interno equivalente y pared equivalente y que no estuvieran rayadas. Como se puede observar en la figura 1 existe una tendencia lineal en la curva tipo, as que podemos decir que la curva cumple la ley de Bouger y Beer, lo que podemos comprobar observando la ecuacin obtenida a partir del grfico, en particular el valor de R2 o sea del coeficiente de correlacin el cual es muy cercano a uno. En la figura 2 podemos observar la curva obtenida para el mtodo de Ringbom con la que podremos determinar el intervalo ptimo de concentraciones y en la figura 3 se realiz la linealizacin de la curva asinttica de la figura 2 para marcar el intervalo ptimo de concentraciones y obtener la ecuacin de la recta para el clculo del error fotomtrico que fue de 3.56% lo que nos indica que se realiz u trabajo aceptable ya que el porcentaje del error fotomtrico de be de ser menor o igual al 5% por que ese es el error que manejan los espectrofotmetros que se encuentran para uso en el laboratorio. De acuerdo a lo observado en la figura 4 en donde se grafica la estabilidad del color respecto al tiempo, podemos decir que el tiempo ptimo de la formacin del cromforo es i nmediatamente despus de la adicin del tiocianato por que en la grfica vemos que conforme pasa ms tiempo la absorbancia es menor lo que quiere decir que el color de la reaccin disminuye con el tiempo. En la figura 5 del efecto de la concentracin del tiocianato en la determinacin de fierro frrico podemos inferir que a mayor concentracin de tiocianato se formara un color ms intenso lo que nos podr permitir obtener mayor absorbancia en las lecturas que se realicen y mayor ser el tiempo que dure el complejo colorido esto se puede ver tambin en las absorbancias obtenidas para los tubos 8 y9 de la tabla 5. El efecto del pH sobre la reaccin lo podemos observar en la figura 6 en donde est graficado el pH contra la absorbancia, de donde se obtiene que la reaccin se lleva a cabo ms favorablemente a pH cido ya que mientras ms cido es el medio la absorbancia aumenta y al contrario, esto lo podemos inferir tambin al observar la absorbancia obtenida para el tubo 4 en la tabla 6. En la figura 7 se ilustra el efecto de algunos aniones en la reaccin de la formacin del cromforo y de ah tenemos que el oxalato es el que ms interfiere en la reaccin seguido por el fluoruro, el fosfato y el tartrato, los primeros interfieren de una forma muy notable en la reaccin ya que son potentes reductores por lo que alcalinizan el medio de reaccin, y como esta reaccin requiere de pH cido para que se leve a cabo ptimamente, se obtienen valores de absorbancia muy bajos al adicionar oxalato y fluoruro, comparndolos con los valores iniciales para cada caso. CONCLUSIONES Las a) b) condiciones ptimas para la determinacin de pH= de SCN-= Fe3+ con 14500 NH4SCN son: 0 g/mL
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Concentracin

c) Leer Absorbancia al tiempo cero. * El Fluoruro y el oxalato son aniones que interfieren significativamente en la formacin del color, al igual que el fosfato. El tartrato no es un interferente para la formacin de color en esta reaccin. * El lmite de deteccin de este mtodo es de 0.406 g/mL. * El %Ep de este mtodo es del 3.06%. * La grfica de Ringbom permite determinar los lmites de concentracin donde se presenta el mnimo error fotomtrico. Las cubetas seleccionadas no afectaron la determinacin de Fe * Los parmetros adecuados para trabajar el mtodo son pH:2, una concentracin de 8700g/ml, leyendo al tiempo 0. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

[1] Skoog D. A., West D. M., Holler F.G. Fundamentos de Qumica Analtica Octava edicin Editorial CENGAGE Learning, Mxico 2005, pgs 781 [2] Ayres. G.H.. Anlisis Qumico Cuantitativo. 2 edicin. Editorial Harla. Mxico 1970 Pgs. 475-488.

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