Junio 2011 1

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE

ALTA RESOLUCI ALTA RESOLUCI N N
CLAR o HPLC CLAR o HPLC
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Caractersticas:
Elevada sensibilidad.
Elevada aplicabilidad.
Permite realizar anlisis cuantitativos exactos.
Es adecuada para la separacin de especies termolbiles
o no voltiles.
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Tipos de cromatografa segn
el mecanismo de separacin
Slido
Interaccin
bioqumica
Afinidad
Gel
Tamao de
partcula
Exclusin
Lquido Resina
F.
Electrostcticas
Intercambio
inico
Lquido Solubilidad Reparto
Slido
F. de Van der
Waals
Adsorcin
F. mvil F. estacionaria Mecanismo
Cromatografa
de
4
Cromatografa
de
ADSORCIN
Fase estacionaria Fase mvil
Slice o almina
Mezcla de disolvente apolar
(hexano) con otros ms
polares (acetona, cloruro de
metilo)
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Cromatografa
de
REPARTO
Fase normal Fase reversa
Fase estacionaria
polar
Slice o Almina
Fase mvil
apolar
Fase estacionaria
apolar
Slice o Almina
Fase mvil
polar
Con grupos polares
Ciano, diol, amino
Series eluotrpicas
Con grupos apolares
CH
3
, C
8
H
17
, C
18
H
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Disolventes polares
(MeOH, MeCN, THF) y
disoluciones acuosas.
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Cromatografa
De
INTERCAMBIO INICO
Fase estacionaria
Resina de intercambio inico
Fase mvil
Poliestireno
con grupos ionizables
Disoluciones acuosas con
especies inicas + pequeas
cantidades de disolventes
miscibles
Intercambio catinico
(grupos cido)
Intercambio aninico
(grupos amino)
Previo paso al anlisis
cromatogrfico las resinas
precisan de un proceso de
lavado, que se denomina
REGENERACIN.
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Resinas de intercambio inico.
Clasificacin.
cidos orgnicos y
aminocidos
1-9 -C
2
H
4
N(C
2
H
5
)
2
Base dbil
Alcaloides y cidos grasos 1-12 -(CH
3
)
3
N
+
Base fuerte
Aninico
Elementos de transicin y
bases orgnicas
5-14 -COOH cido dbil
Aminocidos y compuestos
inorgnicos
1-14 -SO3H cido fuerte
Catinico
Aplicacin
Rango de
pH
Grupo activo Comportamiento Intercambio
8
Cromatografa
de
EXCLUSIN*
GPC orgnica GPC acuosa
Fase estacionaria Fase mvil Fase estacionaria Fase mvil
Poliestireno/divinilbenceno
PS/DVB
Disolventes orgnicos
de muy distinta polaridad
Polmero de superficie
hidroflica
(slice, vidrio poroso)
con grupos OH
Disolventes polares
(MeOH, MeCN, THF) y
disoluciones acuosas.
*Cromatografa de permeabilidad de gel (GPC) o filtracin en gel.
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Fase estacionaria: Geles
Propiedades:
Qumicamente inerte.
Mecnicamente estable.
Tamao de partcula uniforme.
Estructura de poros reproducible.
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Cromatografa de exclusin.
Mecanismo.
Separacin por tamao.
Sin interaccin fsico-qumica entre analito y fase estacionaria.
Tamao > Valor crtico. Elucin con el disolvente.
Tamao < Valor crtico. Todas las molculas eluyen juntas.
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Cromatografa
de
AFINIDAD
Resinas polimricas
con grupos funcionales bioespecficos
Elevada especificidad y selectividad para el
aislamiento y purificacin de biomolculas.
Mecanismo: antgeno- anticuerpo, enzima-sustrato,
etc.
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Instrumentacin:
Cromatgrafo HPLC
Depsito de disolventes.
Sistema de bombeo.
Sistema de inyeccin.
Columna cromatogrfica.
Horno termostatizado.
Detector.
Registrador de datos.
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Depsito de disolventes
Frascos de vidrio inerte
Tubos de tefln con filtro
Sistema de desgasificacin (N
2
,He)
Disolventes:
Exentos de partculas slidas
FILTRACIN A VACO de la fase mvil
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Disolventes. Caractersticas.
Elevada pureza y estabilidad.
Baja viscosidad.
Buen disolvente de la muestra.
No degradar o disolver la fase estacionaria.
Compatible con el detector empleado.
Buena disponibilidad comercial y precio.
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Modo de trabajo. Elucin
Isocrtica: Composicin de la fase mvil
constante.
En gradiente: Composicin de la fase mvil
variable en funcin del tiempo.
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Tabla de miscibilidad
Catlogo de cromatografa Scharlab
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Tuberas y conexiones
De acero inoxidable, resistente a la
corrosin.
PEEK (PoliEterEterCeterona), resistente
a disolventes, sales de haluro,
tampones fuertes y fases mviles
agresivas.
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Sistema de bombeo
Sistema necesario para conseguir una presin y velocidad
de flujo de la fase mvil regular durante todo el proceso
analtico.
Componentes resistentes a la corrosin por disolventes.
Capaz de generar presiones por encima de 6000 psi.
Flujo libre de pulsaciones.
Caudales reproducibles en el intervalo 0,1 - 10 mL/min.
Fcil de desmontar y reparar.
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Tipos de bombas
De presin constante o neumticas.
De flujo constante:
De jeringa o desplazamiento.
Recprocas: Son las ms empleadas.
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Bombas neumticas
Baratas.
Flujo sin pulsaciones.
Limitada capacidad y presin
de salida.
Caudal depende de la
viscosidad y contrapresin de
la columna.
Ruidosa.
Difcil reparacin.
No permite trabajar en modo
gradiente.
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Bombas de jeringa
Flujos independientes de
viscosidad y sobrepresin.
Flujos libres de pulsaciones.
Volumen de la cmara
pequeo (aprox. 250 mL)
Cambio de disolvente
complicado.
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Bombas recprocas
Las ms empleadas.
Volumen interno muy
pequeo (35-400 L)
Altas presiones de salida.
Caudales constantes e
independientes de la
viscosidad.
Permiten trabajo en
gradiente.
Flujos con pulsaciones.
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Sistema de inyeccin
Vlvulas de inyeccin con bucles de muestra de
volumen pequeo y constante (5-500 L)
Posicin de carga Posicin de inyeccin
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Columna cromatogrfica
Elemento clave del sistema. Donde se produce la separacin.
Tubo de acero inoxidable, de dimetro interno uniforme y relleno variable.
Su capacidad de separacin vendr marcada por:
Propiedades qumicas: estabilidad qumica y sensibilidad (tiempo de retencin).
Fase estacionaria: tipo de superficie, tamao de poro y tamao de partcula
(5 m estndar)
Propiedades fsicas: eficiencia y velocidad.
Dimensiones: Longitud: 10-30 cm. y dimetro interno: 4-10 mm.
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Sistemas de proteccin
Para eliminar partculas en suspensin.
Para saturar la fase mvil de fase estacionaria.
Pueden ser de dos tipos:
Pre-filtros en lnea:
Para el disolvente.
Para la columna.
Pre-columnas:
De cartucho.
De columna.
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Tipos de rellenos
Pelicular: Bolas de vidrio o polmero, no porosas y esfricas.
Recubiertas de una capa delgada de slice, almina o resinas
de intercambio inico.
De partcula porosa: Micropartculas porosas de slice, almina
o resinas de intercambio inico, con dimetros entre.
Superficie especfica.
300-600 7-14 Superficie especfica (m
2
/g)
Alta Baja Capacidad de carga
1-3 m Espesor (m)
3-10 30-40 Dimetro (m)
Partculas porosas Pelicular
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Hornos termostatizados
Lo ms habitual es trabajar a Temperatura
ambiente.
Aplicaciones especiales, se trabaja a
temperatura constante y controlada. Los
hornos alcanzan hasta 150C.
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Detectores. Caractersticas.
Sensibilidad adecuada.
Respuesta lineal a varios rdenes de magnitud.
Universal o de respuesta selectiva.
Buena estabilidad y reproducibilidad.
Tiempo de respuesta corto e independiente del caudal.
Volumen interno mnimo.
Bajo coste, fiable y de sencillo manejo.
No destructivos de la muestra.
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Detectores. Clasificacin.
En funcin de que respondan a una propiedad fsica de
La fase mvil:
ndice de refraccin
Conductividad
Del soluto:
Absorbancia UV-Visible
Fluorescencia
Electroqumicos
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Detector
de ndice de refraccin
Elucin isocrtica.
Responden a casi todos los
solutos pero con baja
sensibilidad.
Anlisis termostatizado.
Muy sensible a la variacin
de temperatura.
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Detector
de conductividad
Son detectores basados en una
respuesta diferencial y no
absoluta.
Empleados fundamentalmente
en cromatografa de
intercambio inico.
Baja sensibilidad.
Sensibles a impurezas de la
fase mvil.
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Detector
de absorbancia UV-Visible
El ms utilizado.
Vlido para determinar
sustancias que absorben
radiacin UV-Visible.
Lmparas de Deuterio,
Xenon o Wolframio.
desde 190-900 nm.
Camino ptico de la celda del
detector suele ser de 0.5 cm.
La capacidad de 8 L.
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Detector
de Fila de Diodos (PDA)
Permite registrar simultneamente la absorbancia en todo el
rango de longitudes de onda UV/VIS.
La luz policromtica atraviesa la muestra, llega a la red de
difraccin y se divide en las diversas A que la componen. Cada A
incide en un diodo diferente.
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Detector
de fluorescencia
Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes.
Se seleccionar la Aexc y la Aem.
Son de alta sensibilidad.
No se ven interferidos por los disolventes al no tener stos naturaleza
fluorescente.
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Detectores
electroqumicos
Formados por 3 electrodos:
De referencia: Ag/AgCl o calomelanos
Auxiliar: Platino o carbn vtreo
De trabajo:
Para reduccin: Mercurio
Para oxidacin: Carbn en sus distintas formas.
Mtodos electroanalticos:
Amperometra
Voltamperometra
Coulombimetra
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Registrador de datos
La representacin grfica de los datos obtenidos en funcin del
tiempo, es el cromatograma.
Anlisis cualitativo: Identificacin mediante el tiempo de
retencin.
Anlisis cuantitativo: El rea o la altura de pico son
proporcionales a la concentracin.
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Aplicaciones
Medioambiente: Pesticidas, herbicidas, fungicidas, HAPs,
anilinas, fenoles, dioxinas, etc.
Anlisis de alimentos: Composicionales (vitaminas,
azcares, antioxidantes, alcoholes), colorantes,
edulcorantes, residuos (pesticidas, herbicidas, HAPs,
antibiticos), aditivos (BHA, BHT, srbico, benzoico),
toxinas (aflatoxinas, ocratoxinas), histamina. Alcaloides.
Anlisis farmaceticos: principios activos (analgsicos,
antidepresivos, aminocidos, vitaminas, nucletidos,
protenas, antibiticos), impurezas, drogas, hormonas,
esteroides.