Anda di halaman 1dari 12

Laporan Praktikum Mikroba dan Potensinya

ISOLASI DAN SELEKSI KAPANG PENGHASIL ASAM SITRAT

oleh

Kelompok 5: Khairul Anam P051090031 Maisya Zahra Albanna G351090201 Yonatan Banoet G351090151 Zuraidah G351090141

MAYOR MIKROBIOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INTITUT PERTANIAN BOGOR 2010


0

PENDAHULUAN

Latar Belakang Asam sitrat adalah asam organik yang secara alami terdapat pada buah-buahan seperti jeruk, nenas dan pear. Asam sitrat pertama kali diekstraksi dan dikristalisasi dari buah jeruk, sehingga asam sitrat hasil ektraksi dari buah-buahan ini dikenal sebagai asam sitrat alami. Wehner (1893) pertama kali melaporkan produksi asam sitrat sebagai hasil sampingan pada fermentasi produksi asam oksalat dengan menggunakan Penicillium glaucum. Tahun 1917, Currie juga melaporkan bahwa Aspergillus niger dapat menghasilkan asam sitrat pada medium pH rendah dengan kadar gula tinggi. Sejak saat itu asam sitrat diproduksi secara komersial dengan menggunakan kapang A. niger. Dewasa ini telah diketahui banyak jenis kapang yang dapat menghasilkan asam sitrat, seperti A. niger, A. awamori, A. fonsecaeus, A. luchuensis, A. wentii, A. saitoi, A. flavus, A. clavatus, A. fumaricus, A. phoenicus, Mucor viriformis, Ustulina vulgaris dll. Selain kapang, beberapa bakteri dan kamir juga dapat memproduksi asam sitrat, diantaranya : Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter dan Candida. Kapang A. niger merupakan mikroorganisme yang dapat tumbuh dan banyak digunakan secara komersial dalam produksi asam sitrat, asam glukonat, dan beberapa enzim seperti pektinase dan amilase (Broekhuijsen et al. 1993; Okada 1985). A. niger mampu mensintesis asam sitrat dalam medium fermentasi ekstraseluler dengan konsentrasi yang cukup tinggi, jika dibiakkan dalam media yang kadar garamnya rendah dan mengandung gula sebagai sumber karbon (Hang et al. 1977; Ji et al. 1992). Asam sitrat (C6H8O7) banyak digunakan dalam industri terutama industri makanan, minuman, dan obat-obatan. Kurang lebih 60% dari total produksi asam sitrat digunakan dalam industri makanan, dan 30% digunakan dalam industri farmasi, sedangkan sisanya digunakan dalam industri pemacu rasa, pengawet, pencegah rusaknya rasa dan aroma, sebagai antioksidan, pengatur pH dan sebagai pemberi kesan rasa dingin. Dalam industri makanan dan kembang gula, asam sitrat digunakan sebgai pemacu rasa, penginversi sukrosa, penghasil warna gelap dan penghelat ion logam. Dalam industri farmasi asam sitrat

digunakan sebgai pelarut dan pembangkit aroma, sedangkan pada industri kosmetik digunakan sebagai antioksidan (Bizri & Wahem 1994). Asam sitrat merupakan senyawa antara pada siklus kreb (siklus asam trikarboksilat). Lintasan reaksi katabolik yang mendahului pembentukan asam sitrat ini diantaranya adalah lintasan glikolisis dan lintasan Entner-Doudoroff yang menyediakan senyawa antara asam piruvat yang merupakan senyawa kunci dalam metabolisme sel. Sebagian besar (80%) dari glukosa diubah menjadi piruvat melalui lintasan glikolisis. Piruvat akan mengalami dekarboksilasi dan berikatan dengan koenzim-A membentuk asetil-CoA dan selanjutnya masuk kedalam siklus krebs untuk bergabung dengan oksaloasetat membentuk asam sitrat. Piruvat juga bisa langsung masuk ke siklus krebs dengan bantuan enzim piruvat karboksilase yang mengubah piruvat menjadi oksaloasetat. Pada A. niger, fosfoenol piruvat dapat diubah langsung menjadi oksaloasetat (tanpa melalui piruvat) oleh enzim fosfoenol piruvat karboksilase. Reaksi tersebut membutuhkan ATP sebagai sumber energi, Mg2+, atau Mn2+, dan K+, atau NH4+. Judoamidjojo & Darwis (1992) menyatakan bahwa apabila sumber karbon bukan glukosa, misalnya asam asetat, atau senyawa alifatik berantai panjang (C9 C23), maka isositrat liase akan terinduksi sehingga isositrat diubah menjadi glioksilat, selanjutnya glioksilat diubah menjadi malat oleh sintetase. Bila glukosa ditambahkan siklus tersebut akan terhambat. Asam sitrat merupakan metabolik primer, seperti halnya pertumbuhan mikroba secara umum, pertumbuhan mikroba dalam fermentasi dibatasi oleh ketersediaan beberapa unsur kelumit (P, Mn, Zn). Peranan ion logam dalam proses ini belum diketahui secara menyeluruh. Nilai pH optimum sekitar 1,7 2,0. Jika pH lebih tinggi (alkalis) menyebabkan pembentukan asam asam oksalat dan glukonat dalam jumlah banyak. Karenanya pengendalian kondisi proses secara cermat merupakan prasyarat untuk mempertahankan keteraturan metabolik dan mendukung pembentukan asam sitrat yang lebih banyak. Kondisi yang sesuai tersebut memungkinkan stimulasi glikolisis untuk penyediaan aliran karbon yang tidak terbatas ke dalam metabolisme antara. Akumulasi sitrat selanjutnya tergantung pada pemasokan oksaloasetat (Mangunwidjaja & Suryani 1994). Mangunwidjaja & Suryani (1994) juga menjelaskan bahwa kekurangan mangan akan menurunkan aktivitas enzim dalam siklus asam trikarboksilat yang diikuti oleh penurunan anabolisme. Gangguan metabolisme ini menyebabkan perbedaan tingkat ion amonium intraselluler yang dapat membantu menghilangkan penghambatan enzim fosfofruktose oleh sitrat. Mangan juga terlibat dalam biokimia permukaan sel dan morfologi hifa. Kebutuhan
2

oksigen yang tinggi memungkinkan reoksidasi sitoplasma NADH tanpa pembentukan ATP dan melibatkan suatu cabang respirasi alternatif yang berbeda dari rantai respirasi normal. Proses fermentasi asam sitrat dapat dilakukan dengan sistem terendam, fermentasi kultur permukaan. Fermentasi kultur terendam dibagi dua yaitu dilakukan pada fermentor berpengaduk dan pada air lift fermentor. Sedangkan pada fermentasi kultur permukaan dapat menggunakan media cair maupun media padat. Fermentasi sistem terendam lebih sulit dilakukan dibandingkan prosedur permukaan, tetapi dapat dilakukan secara curah, proses curah terumpani, atau sinambung. Fermentasi curah digunakan untuk substrat glukosa, dan curah terumpani lebih layak diterapkan untuk untuk tetes tebu. Biakan sinambung mempunyai produktivitas yang lebih tinggi (Mangunwidjaja & Suryani, 1994). Produksi asam sitrat pada proses fermentasi dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya adalah jenis media, pH media, waktu fermentasi, suhu, aerasi, dan mikroorganisme yang digunakan. Faktor yang paling menentukan adalah media tumbuh (substrat) dan mikroorganisme yang digunakan (Friedrich et al. 1994). Pada umumnya hasil samping pertanian dan perkebunan seperti jerami padi, onggok, bagas, dan kulit kakao masih mengandung lignoselulosa. Limbah ini masih mengandung pati, protein, lemak, dan senyawa kimia lainnya. Dengan teknologi fermentasi, hasil samping ini dapat dimanfaatkan lebih lanjut menjadi produk lain yang berguna seperti pangan, pakan ternak, pelarut organik, asam-asam organik seperti asam sitrat dan lain-lain (Judoamidjojo et al. 1989).

Tujuan Praktikum Praktikum ini bertujuan untuk melatih mahasiswa untuk dapat melakukan isolasi kapang penghasil asam sitrat dari berbagai sumber seperti buah-buahan busuk, dari tanah, serta menyeleksi isolat-isolat potensial untuk digunakan sebagai isolat penghasil asam sitrat.

METODE

Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah sampel buah-buahan busuk (tomat busuk), sampel tanah, medium agar cawan Prescott (Lampiran 1), medium agar cawan Prescott + 0,1% KH2PO4, larutan garam fisiologis steril (9 ml dalam tabung steril), alkohol 95%, agar miring PDA, onggok tapioka, dedak, Tween 80, NaOH 0,1 N, indikator Fenolftalein, air aquades, Asam sitrat anhidrat, larutan Piridin. Alat-alat yang digunakan adalah Lup inokulasi, pisau/skapel, batang penyebar, pipet 1 ml, inkubator, labu erlemenyer 250 ml, labu ukur 50 ml, tabung reaksi, biuret, gelas piala 100 ml, kertas saring Whatman No. 40,Vortex, Spektrofotometer.

Cara Kerja Isolasi dari Buah-buahan Busuk dengan Metode Tanam Langsung Sampel buah-buahan yang telah busuk (Tomat) dipotong-potong dengan ukuran 1x1x1 cm3, kemudian diletakkan potongan tersebut pada medium agar cawan Prescott. Diinkubasi pada suhu 300C selama 2-5 hari. Mengamati pertumbuhan kapang dan pembentukan zona asam pada medium. Koloni yang membentuk zona asam dimurnikan pada medium yang sama. Isolat murni disimpan di dalam agar miring PDA. Kemudian menentukan genus kapang berdasarkan mikroskopi morfologi struktur konidianya (menggunakan metode teknik solatif transparan agar struktur konidia tidak rusak). Isolasi dari Buah-buahan Busuk dengan Metode Sebar Sampel buah diblender sebanyak 10 g dan dicampur dengan 90 ml larutan garam fisiologis, diencerkan secara serial (diencerkan 10-3). Pencawanan dengan metode cawan sebar 0,1 ml dari pengenceran 10-1 sampai 10-3 pada medium agar cawan Prescott. Diinkubasi pada suhu 300C selama 2-5 hari. Mengamati pertumbuhan kapang dan pembentukan zona asam pada medium. Koloni yang membentuk zona asam dimurnikan pada medium yang sama. Isolat murni disimpan di dalam agar miring PDA. Kemudian menentukan genus kapang berdasarkan mikroskopi morfologi struktur konidianya (menggunakan metode teknik solatif transparan agar struktur konidia tidak rusak).

Seleksi Isolat berdasarkan Nilai Satuan Asam (Acid Unitage/AU) Medium cawan Prescott yang telah disiapkan ditambahkan 0,1% KH2PO4, kemudian inokulasikan isolat uji di tengah-tengah medium agar cawan tersebut. Inkubasikan pada suhu 300C selama 3 hari (72 jam). Diukur diameter zona asam dan diameter koloni kapangnya. Lalu dihitung nilai AU-nya dengan rumus : Nilai AU = diameter zona asam diameter koloni kapang

Isolat-isolat yang memiliki nilai AU relatif besar untuk percobaan selanjutnya disimpan pada media agar miring PDA. Fermentasi Padat Produksi Asam Sitrat Onggok basah (segar) diperas sampai kadar airnya 65%, disiapkan dedak halus dengan kadar 12%, dan dicampur merata onggok dan dedak dengan perbandingan 5:1. Kemudian ditambahkan air aquadest sehingga kadar air campuran onggok dedak 65%, masukkan 30 g campuran tersebut ke dalam erlemenyer 250 ml kemudian sterilkan. Medium tersebut diinokulasikan dengan 1 ml suspensi konidia (7-8 x 10-5 konidia/ml) dari isolat terpilih secara merata (isolat terpilih tomat). Inkubasikan pada suhu kamar selama 4 hari dengan posisi erlemenyer dimiringkan. Diaduk secara merata hasil fermentasi tersebut. Sebanyak 10 g contoh dimasukkan ke dalam erlemenyer 300 ml. Ditambahkan aquades sehingga total volumenya 200 ml (20 x pengenceran), diaduk dan dipanaskan sampai campuran tersebut mendidih. Lalu disaring dengan kertas saring Whatman No. 4 dan didinginkan pada suhu kamar. Filtrat 10 ml at yang telah ditetesi larutan Phenolphtalein (PP) sebanyak 1-2 tetes, kemudian dititrasi dengan NaOH 0,1 N. Kemudian dihitung total asam sebagai asam sitrat monohidrat dengan rumus :

Total asam sitrat monohidrat = Keterangan : a b c 210 20 3 = bobot bahan (mg) = volume larutan NaOH yang digunakan (ml) = Normalitas larutan NaOH (0,1N) = bobot molekul asam sitrat monohidrat = pengenceran 20 kali

b x c 210 x 20 a x3

= banyaknya ion H+ yang dilepaskan oleh asam sitrat


5

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Isolasi Mikroba dari Tomat Busuk

Dengan metode tanam langsung dan metode sebar, dari buah tomat yang telah busuk berhasil diisolasi sebanyak 5 buah koloni kapang dari kapang-kapang yang membentuk zona bening pada media Presscott, kemudian dimurnikan. Hasil pengamatan secara morfologis, dapat diketahui ciri-ciri dari masing-masing isolat adalah seperti pada tabel 1. Tabel 1. Hasil isolasi sampel yang membentuk zona asam Sampel Tomat Penampakan Koloni 1 Koloni berwarna putih, terdapat hifa 2 Koloni berwarna merah kecokelatan, terdapat hifa 3 Koloni berwarna putih, terdapat hifa 4 Koloni berwarna putih kekuningan 5 Koloni berwarna putih kecokelatan

Isolat yang telah dimurnikan kemudian diseleksi dengan menggunakan media

Presscott untuk diukur diameter zona bening yang dihasilkan.

Hasil Seleksi Isolat berdasarkan Nilai Satuan Asam (Acid Unitage/AU)

Isolat pada medium Presscott yang digunakan sebagai media seleksi, diinkubasi pada suhu 30oC selama 72 jam. Setelah 72 jam, dari 5 isolat, diperoleh 4 yang dapat menimbulkan zona bening, seperti yang terlihat seperti pada gambar 1. Dilakukan pengukuran terhadap diameter zona bening yang dihasilkan juga diameter dari koloni kapang tersebut. Dengan perhitungan maka diperoleh nilai Acid Unitage (AU) seperti pada tabel 2.

Tabel 2. Nilai satuan asam (AU) dari isolat-isolat hasil seleksi pada media Presscott
Kode Isolat Diameter Koloni (cm) 1,2 2,1 2,7 2,3 Zona asam (cm) 2,5 5 4,5 3,7
6

Nilai AU

A B C D

2,08 2,38 1,66 1,6

Gambar 1. Isolat yang menunjukkan pembentukan zona asam sitrat, (a). Isolat A, (b). Isolat B, (c). Isolat C, (d). Isolat D

Dari hasil seleksi diperoleh bahwa isolat B memiliki nilai AU paling tinggi, yaitu 2,38, sehingga akan digunakan sebagai starter dalam produksi asam sitrat secara fermentasi.

Fermentasi Padat Produksi Asam Sitrat

Isolat yang memiliki nilai AU tertinggi diinokulasikan ke dalam campuran onggok dan dedak yang kemudian diinkubasi selama 1 minggu pada suhu 30C. Kapang yang tumbuh di dalam erlemenyer yang berisi onggok tersebut, miseliumnya berwarna putih seperti yang terlihat pada gambar 2. Kapang hanya tumbuh pada permukaan , akan tetapi tidak sampai masuk ke dasar dari media onggok tersebut. 10 gram dari media fermentasi ditimbang dan dilarutkan ke dalam 200 ml aquadest pada wadah Erlenmeyer yang kemudian dididihkan lalu disaring. Sebanyak 10 ml filtrat diambil dari media yang telah didinginkan dan disaring untuk dilakukan pengukuran secara kuantitatif kadar asam sitrat dengan menggunakan prinsip titrimetri, asidimetri dengan menggunakan NaOH 0,1 N yaitu larutan basa sebagai titran. Dari hasil pengukuran diperoleh volume NaOH yang digunakan sebanyak 5 tetes atau sebesar 0,2 ml ketika terjadi perubahan
7

warna dari indikator PP dari tidak berwarna menjadi merah muda. Dengan menggunakan rumus yang terdapat pada metode kerja, maka diperoleh hasil bahwa dalam larutan tersebut mengandung asam sitrat sebesar 0.28% dimana artinya, dalam 100 g bahan atau substrat terdapat 0.28 g asam sitrat.

Gambar 2. Hifa yang tumbuh pada medium campuran onggok dan dedak

Pengamatan Mikroskopis

Dalam pengamatan mikroskopis cendawan yang berasal dari buah tomat busuk, visualisasi bentuk hifa. Diketahui bahwa hifa yang dimiliki olehisolat B tidak sama dengan yang dimiliki oleh hifa A. niger, seperti terlihat pada gambar 3.

Gambar 3. Hasil pengamatan dengan menggunakan mikroskop terhadap isolat B pada perbesaran 1000 x

Pembahasan

Onggok merupakan media yang umum digunakan untuk produksi asam sitrat. penambahan dedak dimaksudkan sebagai tambahan sumber protein dari substrat. Akan tetapi kecilnya hasil yang diperoleh dalam pembuatan asam sitrat ini dapat dipengaruhi oleh banyak hal, seperti kondisi dari substrat. Onggok merupakan limbah dalam pembuatan tepung tapioka, oleh karena itu di dalam onggok masih terdapat sedikit kandungan karbohidrat. Oleh kapang hasil isolasi, sisa-sisa amilum yang terdapat pada onggok digunakan untuk memproduksi asam sitrat, akan tetapi perlu diingat bahwa karbohidrat yang diperoleh juga digunakan dalam metabolisme primer dalam pembentukan sel dari kapang tersebut. Oleh sebab itu, asam sitrat yang diperoleh cukup sedikit yaitu 0,28 g tiap 100 g substrat. Selain itu, ada kemungkinan pH media dan suhu yang tidak sesuai untuk pertumbuhan kapang penghasil asam sitrat berpengaruh sehingga tidak dapat memproduksi asam sitrat dengan maksimal (Mangunwidjaja & Suryani, 1994). Isolat kapangnya sendiri bukan merupakan isolat terbaik yang diperoleh karena meski secara visual memberikan diameter zona bening yang luas pada media Presscott akan tetapi hal tersebut masih bersifat kualitatif. Masih perlu dilakukan banyak isolasi dan rekayasa untuk memperoleh kapang yang benar-benar potensial untuk menghasilkan asam sitrat (Friedrich et al, 1994). Pada fermentasi kali ini pun dilakukan fermentasi secara permukaan pada media padat. Kendala yang ditemui pada fermentasi kali ini adalah tidak meratanya pertumbuhan kapang pada substrat pada sehingga banyak substrat yang tidak ditumbuhi oleh hifa kapang. Oleh karena itu, amilum yang terdapat dalam substrat tersebut belum sempat diubah menjadi asam sitrat.

SIMPULAN

1. Dari hasil praktikum diperoleh 5 isolat kapang yang berasal dari tomat busuk dimana isolat B memberikan nilai AU terbesar yaitu 2,38. 2. Dari hasil fermentasi, diperoleh bahwa isolat B hanya dapat memproduksi 0,28% asam sitrat yaitu 0,28 gram tiap 100 gram substrat.

DAFTAR PUSTAKA

Bizri NJ dan Wahem AL. 1994. Citric Acid and Antimicrobials Affect Microbiological Stability and Quality of Tomato Juice. J. of Food Science 59 (1) : 130-134 Broekhuijsen MP, Mattern IE, Contreras, R dan Kinghorn JR. 1993. Secretion of Heterologons Protein by Aspergillus niger. J.Biotech. 31 : 135-145 Currie. 1917 dalam Rusmana I. 2005. Petunjuk Praktikum Bioteknologi Mikrobia. FMIPA IPB. Bogor Friedrich J, Cimerman A, dan Steiner W. 1994. Concomitant Biosynthesis of Aspergillus niger Pectolytic Enzymes and Citric Acid on Sucrosa. J. Enzym and Microbial Technology 16 : 703710 Hang YD, Splittstoessitr DF, Woodams REE, dan Sherman RM. 1977. Citric Acid Fermentation of Brewery Waste. J. of Food Science. 42 (2) : 383-388 Ji LN, Zhao XR, dan Yang HY. 1992. Effects of Trace Elements on Citric Acid Fermentation by Aspergillus niger and Treatment of cane Molasses as Raw Material. J. Industriall Microbiology 22(2) : 16-21 Judoamidjojo M, Sa'id EG, dan Hartoto L. 1989. Biokonversi. PAU-BIOTEK. IPB. Bogor Judoamidjojo M ,Darwis AA dan Sa'id EG. 1992. Teknologi Fermentasi. CV.Rajawali pers. Jakarta Mangunwidjaja D, Suryani A, 1994. Teknologi Bioproses. Penebar Swadaya. Jakarta Okada, G. 1985. Purification and Properties of a Cellulase from Aspergillus niger. J. Biochem. 49 (5) : 1257-1265. Wehner. 1893 dalam Rusmana I. 2005. Petunjuk Praktikum Bioteknologi Mikrobia. FMIPA IPB. Bogor

10

LAMPIRAN

Lampiran 1. Komposisi medium Prescott


Komponen Sukrosa NH4NO3 K2HPO4. 3H2O KH2PO4 MgSO4. 7H2O Jingga metal atau brom cresol green Agar Aquades Berat / Volume 140 g 2,23 g 1g 1g 0,23 g 0,0016 g 17 g 1000 ml

Medium ini disterilisasi pada suhu 121 0C selama 15 menit, kemudian pH diatur sampai 5-5,5 dengan menambahkan 5 ml asam tartarat 10%. Medium akan berwarna jingga bila menggunakan indikator jingga metal (methyl orange/MO) atau biru bila menggunakan brom cresol green (BCG). Asam yang dihasilkan akan mengubah warna medium menjadi merah (MO) atau kuning (BCG).

11