Anda di halaman 1dari 9

1. Purifikasi Hasil PCR 4.1.

Tujuan Purifikasi hasil PCR adalah teknik yang bertujuan untuk memperoleh DNA hasil PCR (DNA amplikon) yang murni. 4.2.Prinsip Purifikasi hasil PCR merupakan suatu metode yang dilakukan untuk membersihkan DNA dari PCR master mix, seperti sisa-sisa buffer, dNTPmix, primer, nuklease, dan enzim DNA-Taq polymerase. Pada makalah ini, kami akan membahas tentang metode purifikasi hasil PCR menggunakan Geneaid Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit. 4.3.Teori Dasar Secara umum, purifikasi hasil PCR dapat dilakukan secara kualitatif ataupun kuantitatif. Pemeriksaan purifikasi secara kualitatif dengan elektroforesis agaros gel mini atau secara kuantitatif dengan spektrofotometer nanodrop. Purifikasi ini penting terkait masalah reproduksibilitas karena dalam pemeriksaan atau diagnosis DNA atau RNA yang digunakan harus dimurnikan terlebih dahulu. Setelah dilakukan PCR, purifikasi amplikon DNA dapat dilakukan dengan metode atau kit berikut yaitu Geneaid Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit. Purifikasi ini dimaksudkan guna memperoleh DNA yang murni dengan sisa primer, primer dimer, nukleotida (sisa dNTPs), enzim polymerase, dan garam-garam dengan menggunakan membran dan sentrifugasi. Pengerjaan purifikasi DNA hasil PCR ini harus hati-hati dengan adanya nuklease, yaitu enzim yang dapat mendegradasi DNA/RNA. 4.4.Alat dan Bahan Alat: 1) Tabung mikro 1,5 ml (Tabung eppendorf) 2) Vortex 3) Inkubator 4) Kolom DF 5) Tabung penampung 6) Sentrifugator Bahan: 1) Genom DNA 2) Loading buffer (Kristal violet) 3) Gel agaros 1 % 4) Buffer DF 5) Wash buffer

7) Freezer 8) Filter kolom 9) Spektrofotometri Nanodrop

6) Etanol 7) Aquabidest

4.5.Prosedur Kerja Purifikasi menggunakan Geneaid Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit mula-mula DNA hasil amplifikasi PCR sebanyak 20 l diambil dan dicampur dengan 5 l loading buffer (kristal violet) untuk dilakukan elektroforesis di gel agaros 1%. Pita DNA yang diinginkan diiris pada gel tersebut dan dipindahkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml yang baru dan steril. Ke dalam irisan gel tersebut ditambahkan 300 l dapar DF lalu divortex dan diinkubasi pada 55-60oC selama 10-15 menit hingga larut. Campuran didiamkan pada suhu kamar. Kemudian campuran tersebut dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom DF yang terpasang pada tabung penampung. Lalu disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 30 detik. Cairan yang tertampung dibuang dan kolom DF ditempatkan kembali pada penampung. Pada tabung tersebut ditambahkan 600 l wash buffer yang telah ditambah etanol dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan yang sama selama 30 detik. Cairan yang terkumpul dibuang kembali dan kolom DF dikemablikan pada tabung penampung, sentrifugasi kembali hingga membran kolom mengering. Kolom DF yang telah kering dipindahkan ke tabung baru dan steril 1,5 ml dan ditambahkan dengan 25 l aquabidest pada bagian tengah kolom DF. Hal ini untuk mencegah terjadinya pengendapan pada dinding kolom. Aquabidest dibiarkan hingga terserap lalu disentrifugasi kembali selama 1 menit untuk memperoleh DNA murni. DNA yang telah diperoleh disimpan pada suhu -20oC. Setelah dilakukan PCR, DNA yang murni yang diperoleh tersebut dapat diamati purifikasinya secara visual secara kualitatif dengan elektroforesis agaros gel mini atau secara kuantitatif dengan spektrofotometer nanodrop. Secara kualitatif dapat dibandingkan antara hasil elektroforesis DNA amplikon murni dengan penanda ukuran molekul. Sedangkan untuk memperoleh data purifikasi secara kuantitatif dapat digunakan nanodrop.

BAB 2 Isolasi Plasmid dan Kloning DNA

1. Isolasi Plasmid 1.1. Tujuan Pada pembahasan kali ini isolasi/ekstraksi DNA plasmid bertujuan untuk memperoleh DNA plasmid dengan kualitas kemurnian yang baik menggunakan metode modifikasi Alkalin Lisis dan netralisasi. 1.2. Prinsip Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosomal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja perlu dilakukan pemurnian dari debris mebran sel, organel sel, dan pengotor lainnya. Tahapan yang digunakan untuk isolasi plasmid menggunakan PrepEase MiniSpin Plasmid Kit ada 9 tahap, yaitu penyiapan kultur LB, Pemanenan sel bakteri, Sel lisis dan netralisasi, Pemurnian hasil lisis, Penempelan plasmid ke kolom, Penyiapan plasmid kolom, Pencucian kolom, Pengeringan kolom, dan Elusi. 1.3. Teori Dasar Plasmid adalah molekul DNA ekstrakromosomal yang ukurannya bervariasi antara 1 kb hingga lebih dari 200 kb. Pada umumnya plasmid berbentuk doublestranded, covalend closed, sirkular yang dapat diisolasi dari sel bakteri dalam bentuk superheliks. Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid, dalam rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Selain itu plasmid juga banyak digunakan untuk perbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisa mengekspresikan gen tertentu. Alasan utama penggunaan plasmid ini adalah karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker sehingga dapat diketahui apakah gen insert masuk atau tidak, memiliki copy number yang besar, dan mudah dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu. 1.4. Alat dan Bahan Alat: 1) Sentrifuge mikro Bahan: 1) Bakteri yang berisi plasmid

2) Tabung mikro 1.5 mL 3) Pipet mikro 1 mL, 200 L beserta tip-nya 4) Beberapa beaker glass 5) Rak tabung mikro 6) Tabung reaksi steril 7) Vortex mixer 8) PrepEase Columns 9) PrepEase Collecting Tubes MiniSpin Plasmid

2) Medium LB yang mengandung antibiotic yang sesuai 3) A1 buffer 4) A2 buffer 5) A3 buffer 6) A4 buffer 7) AW buffer 8) AE buffer 9) Etanol

1.5. Prosedur Penyiapan kultur LB dilakukan dengan cara diambil stok bakteri yang berisi plasmid, diinokulasi ke dalam medium LB (5-10 ml) yang mengandung antibiotik yang sesuai. Inkubasi semalaman sambil digoyang-goyangkan (12-16 jam). Selanjutnya pemanenan sel bakteri dilakukan dengan cara memanen sebanyak 1-5 ml kultur LB lalu dimasukkan ke dalam tabung microcentrifuge 1,5 ml, lalu lakukan sentrifugasi pada 1.000 rpm selama 30 detik , dan hati-hati membuang supernatan. Ulangi seperlunya untuk mendapatkan pelet dari volume kultur yang diinginkan. Langkah-langkah ini dilakukan pada suhu kamar, kecuali dinyatakan lain. Tahap selanjutnya adalah sel lisis dan netralisasi, pertama-tama resuspensikan pelet sel bakteri dalam 250 l A1 buffer, lalu vortex kuat. Selanjutnya suspensinya di lisis dengan menambahkan 250 l A2 buffer, dicampur secara lembut dengan cara membalik-balikan tabung perlahan (6-8 kali). Inkubasi hasil lisis yang dihasilkan selama 2-3 menit pada suhu kamar (max. 5 menit). Jangan divortex, karena hal ini akan membuat kontaminasi kromosom DNA dari puing-puing selular ke dalam suspensi. Selanjutnya netralisasi hasil lisis dengan menambahkan 300 l A3 buffer, dicampur secara lembut dengan cara membalik-balikan tabung perlahan (6-8 kali) atau sampai keputihan.

Tahap berikutnya adalah pemurnian hasil lisis, memperjelas hasil lisis dengan sentrifugasi pada 1.000 rpm selama 15 menit. Selanjutnya pelekatan plasmid ke kolom dilakukan dengan cara tempatkan kolom PrepEase MiniSpin dalam 2 ml tabung penampung, tambahkan hasil lisis ke tabung. Lalu lakukan sentrifugasi pada 1.000 rpm selama 1 menit. Buang cairan. Selanjutnya pilihan pencucian menggunakan AW buffer dilakukan untuk menghapus semua nuklease, dan khususnya untuk strain inang yang mengandung nuclease tingkat tinggi. Tempatkan kolom PrepEase MiniSpin ke 2 ml tabung pengumpul. Tambahkan 500 l AW buffer, lalu lakukan sentrifugasi pada 1.000 rpm selama 1 menit. Buang cairan Selanjutnya pencucian kolom dilakukan dengan menempatkan kolom PrepEase MiniSpin ke dalam 2 ml tabung pengumpul. Tambahkan 600 l A4 Buffer (lengkap dengan etanol). Lalu lakukan sentrifugasi pada 1.000 rpm selama 1 menit. Buang cairan. Selanjutnya untuk mengeringkan kolom, sekali lagi tempatkan Kolom PrepEase MiniSpin kembali ke 2 ml tabung pengumpul. Lakukan sentrifugasi pada 1000 rpm selama 2 menit. Residual etanol wash buffer yang mungkin menghambat reaksi enzimatik, dihilangkan dengan langkah ini. Tahap yang terakhir adalah elusi yang dilakukan dengan menempatkan kolom PrepEase MiniSpin ke tabung microcentrifuge 1,5 ml. Lalu tambahkan 50 ml AE Buffer. Inkubasi 1 menit. Lalu lakukan sentrifugasi pada 1000 rpm selama 1 menit. Supernatan berisi plasmid yang telah dielusi.

2. Pemotongan/Digesti DNA Plasmid dengan Enzim Restriksi 2.1. Tujuan Pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi bertujuan untuk

memperoleh fragmen DNA plasmid yang terpotong menjadi linier agar siap untuk disisipi dengan fragmen DNA sisipan. 2.2. Prinsip Pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi bertujuan untuk

memperoleh fragmen DNA plasmid yang terpotong menjadi linier. Fragmen-

fragmen DNA ini siap disisipi oleh fragmen DNA yang akan disisipkan, dan digunakan untuk merekonstruksi DNA plasmid untuk disisipkan ke dalam DNA target. Teknik digesti ini banyak dipakai untuk mengklon DNA asing ke vektor, maupun pada verifikasi Plasmid DNA rekombinan. 2.3. Teori Dasar Pemotongan DNA dilakukan menggunakan enzim nuklease. Nuklease merupakan enzim yang memotong molekul DNA dengan memutuskan ikatan fosfodiester antara nukleotida satu dengan nukleotida berikutnya. Jenis nuklease ada dua yaitu eksonuklease dan endonuklease. Endonuklease merupakan nuklease yang memotong bagian internal DNA tepat pada ikatan fosfodiester. Hasil pemotongan molekul DNA oleh enzim restriksi endonuklease tepat pada urutan tertentu dan menghasilkan sekuens yang double-stranded, dengan demikian sekuens yang akan dipotong dapat diprediksi urutan basa nitrogennya. Dalam pemotongan DNA plasmid ini digunakan dua enzim restriksi endonuklease, yaitu EcoRI dan BamHI. Enzim EcoRI diperoleh dari bakteri E.coli, sedangkan enzim BamHI diperoleh dari enzim Bacillus sp. Enzim EcoRI memotong molekul DNA pada urutan heksanukleotida 5-GAATTC-3 (5 overhang). Sedangkan enzim BamHI memotong molekul DNA pada urutan heksanukleotida 5GGATCC-3 (5 overhang). 2.4. Alat dan Bahan Alat: 1) Pipet mikro 0-20 l 2) Pipet mikro 20-200 l 3) Tabung mikro 1,5 mL 4) Rak tabung mikro 5) Bak es dan es yang telah Bahan: 1) pUC19 sebelumnya) 2) Enzim endonuklease restriksi (yang diisolasi

(ER): BamHI, EcoRI 3) Buffer masing-masing ER 4) dH2O steril (atau 1xTE pH8) 5) Standar ukuan molekul DNA

dihancurkan untuk menjaga suhu enzim restriksi agar enzim tidak terpengaruh dengan suhu ruangan yang tinggi 6) Inkubator

7) Dry bath 8) Termometer 9) Elektroforesis 2.5. Prosedur Proses dimulai dengan pencampuran pUC19 dengan enzim RE EcoRI dan BamHI pada tabung mikro yang berbeda dan diisikan dengan buffer bagi masingmasing enzim dan pemberian aquadest. DNA (l) pUC19 (2) pUC19 (2) pUC19 (2) 10xbuffer (l) 2 2 2 EnzimRestriksi/ 5 unit (l) 0 BamHI EcoRI dH2O Steril (l) 16 15 15 Total Volume (l) 20 20 20

Masing-masing tabung mikro diinkubasikan dalam alat inkubator dengan suhu 37C selama minimal 2 jam. Dipilih suhu 37 C karena enzim restriksi yang digunakan (BamHI dan EcoRI) stabil dalam suhu ini. Namun, bila digunakan enzim restriksi lain perlu diingat bahwa tidak semua enzim restriksi bekerja optimal pada suhu 37C (contohnya: enzim restriksi yang diambil dari bakteri termofilik memiliki suhu optimal 50-65 C, sedangkan enzim restriksi lainnya seperti SmaI hanya memiliki waktu paruh hidup yang singkat dalam 37 C, sehingga harus digunakan dalam suhu 25 C). Setelah 2 jam, tabung ditambahkan loading buffer, lalu siapkan dry bath, masukkan air pada lubang-lubang dry bath lalu letakkan termometer di tengahnya tunggu hingga bersuhu 65oC, lalu masukkan tabung mikronya selama 5 menit.

Gambar. Dry Bath Setalah itu dimasukkan ke dalam sumur-sumur elektroforesis dengan urutan sebagai berikut mulai dari yang paling kiri: Standar ukuran molekul (DNA ladder) pUC19 BamH1 pUC19 EcoR1 pUC19 utuh

Selanjutnya dibandingkan dengan standar ukuran molekul dan DNA yang tidak di digesti.