Medicin de la cintica enzimtica de la glucosa-oxidasa

Laboratorio de ingeniera de reacciones. Propuesta: Prctica II. (Duracin: dos sesiones)

1. Motivacin del problema

La determinacin de la concentracin de glucosa en fluidos corporales es de gran importancia en el diagnostico clnico de trastornos metablicos. El ms importante de estos es la diabetes mellitus, esta enfermedad se caracteriza por la presencia de altos niveles de glucosa en los fluidos fisiolgicos humanos. Actualmente es la enfermedad metablica ms comn en el mundo con ms de 150 millones de personas afectadas, y con una proyeccin poco favorable; pues es posible que este nmero se duplique en las prximas dos dcadas. Adicionalmente la evaluacin de los niveles de la glucosa tambin es de gran utilidad en el diagnstico de la hipoglicemia (niveles bajos de glucosa en la sangre). Las metodologas utilizadas para este fin, combinan principios fsicos, qumicos y biolgicos, con el objetivo de obtener seales cuantificables, detectables de forma rpida, exacta y reproducible. Esto, sumado a la necesidad de desarrollar estas pruebas con un consumo mnimo de reactivos, en los menores tiempos posibles y favoreciendo la automatizacin de los procesos. Se ha dado inicio a una sinergia entre la bio-sensrica y la microfludica, asociando las ventajas y desventajas de trabajar los procesos a microescala, con la especificidad de las reacciones enzimticas y sus consideraciones cinticas. Desde el punto de vista de la ingeniera de reacciones la medicin de los parmetros (Km y Vmax)1 de una reaccin enzimtica, es el punto de partida para establecer la capacidad de prediccin sobre las concentraciones de los sustratos en el tiempo, permitiendo el desarrollo de sensores basados en este tipo de reacciones bioqumicas. Estos parmetros son esenciales para la definicin precisa de los rangos de medicin y de las funciones necesarias para la cuantificacin primaria de la seal. En el caso especfico en el cual las reacciones ocurren en sistemas a escala micromtrica es necesario adicionar consideraciones de transporte referentes al rgimen de flujo, a las caractersticas del mezclado, y a la transferencia de masa. En esta prctica se pueden integrar diferentes ciencias bsicas de la ingeniera qumica en el contexto actual de una aplicacin prctica y con un potencial de trabajo importante, para evidenciar conceptos de: cintica qumica, reacciones enzimticas, fenmenos de transporte, diseo de reactores y anlisis qumico.

2.

Introduccin

Km: Constante de Michaelis, Vmax: velocidad mxima de la reaccin enzimtica

Los procedimientos para la deteccin de glucosa en el cuerpo se pueden clasificar en tres categoras bsicas: mtodos de oxido-reduccin, mtodos de condensacin, y mtodos enzimticos. Los primeros aprovechan la forma eneidal de la glucosa y su alta reactividad para oxidarla de forma rpida, usualmente en presencia de soluciones cpricas alcalinas que se reducen a la forma cuprosa en presencia de la glucosa como agente reductor. Sin embargo estos procedimientos son poco especficos. Los mtodos de condensacin utilizan la glucosa y compuestos aromticos con grupos funcionales amina y fenol, en solucin acida, cuyos productos son coloreados y permiten deteccin colorimtrica (mtodo de la o-toluidina). Finalmente los mtodos enzimticos, catalizan la oxidacin de la glucosa por el oxgeno, formando cido glucnico y perxido de hidrgeno H2O2, acoplado a una reaccin colorimtrica para su deteccin. La tcnica utilizada en esta prctica para la cuantificacin de la glucosa es la reaccin de Trinder, la cual se describe a continuacin:

O H HO H H OH H OH OH OH Glucosa

HO H

O OH H OH OH OH cido Glucnico

H2O

Glucosa oxidasa O2

HO H H

H2O 2

O H2 N

N N

+
OH

Peroxidasa H2O 2 O N N N

H2O

4 - aminoantipirina O

Quinoneimina (producto coloreado)

En primera instancia la glucosa es oxidada en presencia de glucosa oxidasa formando el acido glucnico y perxido de hidrogeno, esta reaccin es la etapa que controla el proceso y por lo tanto la cintica de inters principal. Tan pronto como el perxido empieza a formarse y por accin de la enzima peroxidasa, se produce la oxidacin de la o-dianisidina la cual genera una fuerte absorcin en el espectro UV-VIS con una banda principal alrededor de 545 nm. Esto permitira seguir el curso de la reaccin por espectroscopia.

En cintica enzimtica usualmente la velocidad de reaccin de la enzima depende de la concentracin de sustrato que se encuentra presente en el medio, hasta una concentracin mxima en la cual la enzima se satura y la velocidad de la reaccin permanece constante, este parmetro se conoce como velocidad mxima de la reaccin (V max). Inicialmente tiene lugar una reaccin qumica bimolecular entre la enzima (E) y el sustrato (S), formndose el complejo enzima-sustrato (ES). Aunque el mecanismo enzimtico para una reaccin unimolecular puede ser bastante complejo, existe una etapa enzimtica limitante que permite que el mecanismo sea simplificado como una etapa cintica nica cuya constante es k2, siguiendo la siguiente expresin: 10,11 (1) El termino k2 hace referencia al mximo nmero de reacciones enzimticas catalizadas por segundo, y CES a la concentracin del complejo (ES). La expresin es vlida para concentraciones de sustrato menores a la concentracin de saturacin, pues en esta etapa la enzima permanece en un equilibrio constante entre la forma libre (E) y el complejo enzima-sustrato (ES). Sin embargo, para concentraciones elevadas de sustrato, la enzima se satura y solo queda la forma unida al sustrato (ES). Bajo estas condiciones, la velocidad de la reaccin se expresa como: 12 (2) La expresin (2) deja de ser sensible a pequeos cambios en la concentracin de (S). En este caso, la concentracin total de enzima (CEtot) es aproximadamente igual a la concentracin del complejo (ES), ya que la concentracin de enzima libre es prcticamente cero, la reaccin global del proceso se define en (3). 10-12

E+ S

K1 K-1

ES

K2

EP
(3)

A partir de la expresin (3) es posible plantear una ecuacin diferencial para expresar el cambio en la concentracin del complejo enzima sustrato en el tiempo, en la expresin (4) la concentracin CES es prcticamente constante y por esta razn se puede hacer casi igual a cero: 10-12 (4). La ecuacin (4) puede resolverse de la forma siguiente: (5) En esta expresin el trmino Km se define como:

(6)

Remplazando en la ecuacin (1), podemos obtener la velocidad de reaccin en trminos de Km:

(7) La ecuacin (7) se conoce como cintica de tipo Michaelis-Menten y ser el modelo que debe ajustarse a la cintica enzimtica de la oxidacin de glucosa en presencia de la enzima glucosa oxidasa. Dado que el seguimiento de la reaccin se debe desarrollar por espectroscopia UV-VIS, es necesario expresar las concentraciones de sustrato en trminos de la absorbancia, con este fin se puede utilizar la ley de Beer-Lambert, expresada de modo dinmico para la variacin de la concentracin de la quinoenimina: (8) Donde A(t) es la absorbancia en el tiempo, Ablanco es la absorbancia del blanco2 utilizado, es el coeficiente de extincin de sustancia analizada, L es elpath lenghtde la celda que de forma estndar se define como: 1 cm, pues es la longitud comn de las celdas utilizadas y V i es la velocidad inicial de reaccin. Combinando las ecuaciones (7) y (8) se obtiene la siguiente expresin:

(9) Donde Cg es la concentracin de glucosa y DF es el factor de dilucin. 3. Metodologa 3.1 Cintica de la reaccin enzimtica (Sesin 1) Debe medirse la cintica de la reaccin enzimtica, este procedimiento consta de los siguientes pasos: Preparar una solucin base concentrada de glucosa en agua desionizada, la cual debe diluirse acorde con las concentraciones presentadas en la tabla 1. El volumen total de cada muestra debe ser de 1,5 mL y estas se realizaran en las cubetas del espectrofotmetro.

Blanco: son todas las sustancias que se encuentran en la solucin menos aquella que produce la seal (cambio de color) a la longitud de onda del anlisis.

Tabla 1. Concentraciones para las soluciones de glucosa a preparar

Muestra Concentracin (mg/dm3) 1 50 2 100 3 200 4 300 5 400 6 500

Preparar en un tubo eppendorf una solucin de 0.5 ml. de reactivo de Trinder en 1.5 ml. de agua deionizada. Se prepara el blanco el cual es una solucin de agua deionizada y acido benzoico al 0.5% v/v y se mide la absorbancia 545 nm. Para las soluciones preparadas (muestras 1 a 6) se mide la absorbancia en el tiempo cero a 545 nm., en una celda de plstico (usando 1.5 mL de la solucin), sin extraer la celda del espectrofotmetro se agrega 0.5 ml. de la solucin (4:12 v/v) de reactivo de Trinder y se mide la absorbancia a 545 nm. cada 30 segundos durante 30 minutos o hasta que se estabilice el valor de la absorbancia.

A partir de estos datos es posible ajustar una cintica de tipo Michaelis-Menten para la reaccin enzimtica estudiada (utilizando por ejemplo la ecuacin de Lineweaver-Burke, o el diagrama de Eadie-Hofstee). Adems segn la absorbancia en el punto final de la reaccin es posible desarrollar una curva para cuantificar la concentracin de acido glucnico, gracias a la reaccin colorimtrica acoplada al proceso la cual ocurre en un tiempo muy corto con respecto a la primera reaccin. 3.2 Medicin de la conversin en presencia de un inhibidor(sesin 2) En esta sesin se repetir el procedimiento de la sesin 1 pero agregando un inhibidor de la enzima peroxidasa. El inhibidor que se va a utilizar es la azida de sodio (NaN). Cada grupo utilizara dos concentraciones diferentes de enzima. 4. Resultados Segn los parmetros medidos en la seccin 3.1 y la cintica calculada, se deben realizar los siguientes procedimientos. Determine el impacto ambiental generado por este tipo de anlisis qumicos (cuantificacin glucosa) y que controles se pueden generar para mitigarlo. Discuta los riegos a los que estaran sometidos los trabajadores responsables de este tipo de anlisis en las diferentes industrias. Calcular la conversin de glucosa a cido glucnico para un reactor tipo batch utilizando las mismas concentraciones que las muestras 1 a 6 estudiadas. (se recomienda utilizar MatLab) Calcular la conversin de glucosa a cido glucnico para el reactor tipo batch, utilizando un modelo para especies diluidas en una plataforma CFD como COMSOL, utilizando las mismas concentraciones que las muestras 1 a 6 estudiadas. Comparar los resultados que arroja cada modelo realizado. A partir de los clculos realizados en los dos numerales anteriores es posible definir las condiciones ptimas para la conversin de glucosa.

Realizar las grficas para los diagramas de: Lineweaver-Burk y de Eadie-Hofstee, y presentar en una tabla los parmetros cinticos calculados por cada mtodo, comentado el modelo que mejor se ajusta a los datos experimentales, para lo cual se puede realizar una grafica comparando los tres mtodos. En la misma grafica se debe presentar para cada una de las concentraciones de glucosa utilizadas (muestras 1 a 6), la absorbancia contra el tiempo. Graficar la velocidad de la reaccin en funcin de la concentracin de glucosa (muestras 1 a 6). Utilizando las simulaciones realizadas se debe graficar la conversin de glucosa, contra la concentracin de glucosa inicial, seleccionar el punto optimo de operacin como el mximo en la superficie de respuesta, y comparar los resultados del modelo de especies diluidas de COMSOL, con el modelo para un batch. Presentar en una tabla los resultados obtenidos experimentalmentes y compararlos con los simulados. Se deben realizar todos los procedimientos mencionados anteriormente para el caso en que hay un inhibidor presente. Se debe entonces hacer una comparacin entre los dos experimentos planteados para observar el efecto del inhibidor en la cintica de la reaccin y el punto ptimo de esta.

5. Discusin de resultados En la discusin de resultados se debe describir en el contexto de la ingeniera qumica el impacto de los resultados obtenidos, haciendo nfasis en las limitaciones3 de los modelos utilizados para simular el reactor, las ventajas y desventajas de utilizar simuladores para la deteccin y cuantificacin de glucosa, adems realizar una serie de recomendaciones que se considere sean trascendentales para la implementacin de estos sistemas en casos reales de deteccin de sustancias. 6. Bibliografia [1] URL: http://www.who.int/inf-fs/en/fact138.html World Health Organization Diabetes Fact Sheet (Number 138). [2] E. Verpoorte, Electrophoresis 23 (2002) 677. [3] R. Kurita, K. Hayashi, X. Fan, K. Yamamoto, T. Kato, O. Niwa, Sens. Actuators B 6370 (2002) 1. [4] J. Wang, Electrophoresis 23 (2002) 713. [5] E. Dempsey, D. Diamond, M.R. Smyth, G. Urban, G. Jobst, I. Moser, E. Verpoorte, A. Manz, H.M. Widmer, K. Rabenstein, R. Freaney, Anal. Chim. Acta 346 (1997) 341. [6] T. Laurell, J. Drott, Biosens. Bioelectron. 10 (1995) 289. [7] J. Wang, M.P. Chatrathi, A. Ibanez, Analyst 126 (2001) 1203.
3

Surgidas de las suposiciones iniciales que deben realizarse para plantear el modelo.

[8] Y. Lv, Z. Zhang, F. Chen, Talanta 59 (2003) 571. [9] M.G. Pollack, A.D. Shendorov, R.B. Fair, Lab on a Chip 2 (2002) 96. [10] S-K. Cho, H. Moon, C-J. Kim, Microelectromech. Syst. 12 (2003) 32. [11] P.Y. Paik, V.K. Pamula, M.G. Pollack, R.B. Fair, Lab on a Chip (2003) 28. [12] P.Y. Paik, V.K. Pamula, R.B. Fair, Lab on a Chip 3 (2003) 253. [13] V. Srinivasan, V.K. Pamula, M.G. Pollack, R.B. Fair, Technical Digest IEEE MEMS, 2003, p. 327. [14] P. Trinder, Ann. Clin. Biochem. 6 (1969) 24.