UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR

Cincias

Efeito dos andrognios na regulao do tnus da artria umbilical, na hipertenso arterial da gravidez

Ana Filipa Silva Esteves

Dissertao para obteno do Grau de Mestre em

Bioqumica
(2 ciclo de estudos)

Orientador: Prof. Doutora Maria Elisa Cairro Rodrigues Coorientador: Prof. Doutor Jos Ignacio Verde Lusquios

Covilh, outubro de 2013 i

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Dedicatria

minha famlia pelo apoio, fora, incentivo, companheirismo e amizade. Sem eles nada disso seria possvel.

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Agradecimentos
Em primeiro lugar quero deixar aqui o meu sincero e especial agradecimento Professora Doutora Maria Elisa Cairro Rodrigues por me ter confiado este projeto, pela orientao ao longo do mesmo, pelos ensinamentos tericos e prticos que me facultou e pela pacincia e disponibilidade demonstrados ao longo da minha adaptao s novas tcnicas laboratoriais. Agradeo ao Professor Doutor Jos Ignacio Verde Lusquios, pelo apoio e disponibilidade para esclarecer e ensinar, sempre que se revelou necessrio. Um obrigado ao Professor Doutor Cludio Maia pela pacincia, ajuda, dedicao e conhecimentos tericos e prticos transmitidos sobre o PCR em tempo real. O sincero meu agradecimento. Agradeo Ana Martinho pelo tempo disponibilizado a ensinar e discutir os dados obtidos no PCR em tempo real ao longo deste trabalho. A toda a equipa do Centro de Investigao, que se mostraram disponveis para ajudar sempre que foi necessrio, em particular aos colegas de laboratrio, Melissa, Joana e Paulo por todo o apoio tcnico e cientfico. Um agradecimento especial Joana minha colega de laboratrio e acima de tudo amiga. Nada disto seria possvel sem o teu olhar crtico, as nossas conversas, as nossas risadas, contigo cresci como investigadora e pessoa. Foste o meu porto de abrigo quando as coisas no corriam pelo melhor caminho. Obrigada por tudo! s minhas amigas, Armanda Gonalves, Cludia Sousa, Tatiana Saraiva, por me

ouvirem, ajudarem e apoiarem sempre que foi necessrio. Vou ter muitas saudades dos nossos encontros nos corredores do CICS, dos nossos almoos, das nossas conversas e risadas. Um beijinho cheio de saudade. Ao Jos Eduardo pela pessoa maravilhosa que e por todo amor incondicional, carinho e fora que me deu ao longo deste trabalho. s-me tudo! Por fim um agradecimento especial a toda a minha famlia. Aos meus pais e minha irm, pela fora e apoio que me deram, sem eles no seria possvel concretizar esta longa caminhada. Tambm agradeo aos meus avs, tios e primos por me aconselharem e acreditarem em mim. Um beijinho para todos.

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Resumo
Nas ltimas dcadas, vrios investigadores tm sugerido uma associao entre os andrognios e a hipertenso. Os efeitos benficos dos andrognios no sistema vascular esto associados com a sua capacidade para provocar vasorelaxamento vascular. Os efeitos no genmicos dos andrognios nas clulas vasculares do musculo liso parecem ser devidos ativao dos canais de potssio ativados pelo Ca 2+ de elevada condutncia (BKCa) e dos canais de potssio sensveis voltagem (KV) e/ou inibio dos canais de Ca 2+ dependentes da voltagem tipo L (L-VOCC). Contudo os efeitos genmicos dos andrognios, nomeadamente na expresso destes canais inicos, so pouco conhecidos. No entanto em estudos anteriores observou-se que os andrognios podem ser benficos a nvel cardiovascular pois tm efeitos vasodilatadores, e aumentam a expresso dos canais BKCa e dos Kv. A hipertenso um dos problema mais comums na gravidez que complica 5% a 10% das situaes de gravidez. Apesar da morbilidade significativa associada aos bebs nascidos de grvidas com hipertenso, a patognese permanece por esclarecer, o que limita a capacidade de preveni-la e trata-la. O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos genmicos dos andrognios na expresso de diferentes protenas envolvidas na regulao da contrtilidade vascular, nomeadamente da guanilato ciclase solvel (sGC), do recetor do pptido natriurtico-A (NPRA) e da protena cinase G (PKG). Estas protenas parecem estar envolvidas no mecanismo vasodilatador provocado pelos andrognios. Este trabalho tambm teve como objetivo a comparao entre os nveis de expresso destas protenas em artrias umbilicais humanas (HUA) provenientes de grvidas normotensas e de grvidas hipertensas. Para atingir estes objetivos foi utilisada a tcnica de PCR em tempo real em clulas do msculo liso de HUA, as quais foram pr-incubadas durante 24 horas com DHT (1-1000nM). Em clulas musculares de HUA provenientes de grvidas normotensas, os andrognios provocaram uma diminuio da expresso da sGC e da PKG, e um aumento na expresso do NPRA. No entanto, em clulas musculares de HUA provenientes de grvidas hipertensas os andrognios provocam uma diminuio da expresso da sGC, da NPRA e um aumento da expresso da PKG. Em suma, podemos concluir que o DHT modula a expresso das protenas analisadas, as quais esto envolvidas no mecanismo vasodilatador dos andrognios.

Palavras chave
Clulas musculares lisas vasculares, artria umbilical humana, andrognios, hipertenso, efeitos genmicos, protena cinase G, guanilato ciclase soluvel, recetor do pptido natriurtico-A

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Abstract
In recent decades, several researchers have suggested an association between androgens and hypertension. The beneficial effects of androgens in the vascular system are associated with their ability to cause vascular vasorelaxation. The non genomic effects of androgens in vascular smooth muscle appear to be due to activation of large conductance calcium-activated potassium channels (BKCa) and voltage gated potassium channels (KV) and/or the inhibition of L-type Ca2+ channels voltage dependent (L-VOCC). However, the genomic effects of androgens, particularly in the expression of these ion channels, are little known. However, in earlier studies it was observed that androgens may be beneficial to cardiovascular level because they have vasodilatory effects and increase the expression of BKCa channels and Kv . Hypertension is one of the most comums problem in pregnancy that complicates 5 % to 10 % of cases of pregnancy. Despite the significant morbidity associated with babies born to pregnant women with hypertension, the pathogenesis remains unclear, which limits the ability to prevent and treat it. The aim of this study was to analyze the genomic effects of androgens on the expression of different proteins involved in the regulation of vascular contractility, including soluble guanylate cyclase (sGC), the natriuretic peptide receptor-A (NPRA) and protein kinase G (PKG). These proteins appear to be involved in the vasodilator mechanism induced by androgens. This study also aimed to compare the expression levels of these proteins in human umbilical artery (HUA) from normotensive and hypertensive pregnant women. To achieve these goals was used the technique of real time PCR in smooth muscle cells of HUA, which were preincubated for 24 hours with DHT (1-1000nM). HUA muscle cells from normotensive pregnant women, androgens caused a decreased expression of sGC and PKG and an increase in the NPRA eexpression. However, in HUA muscle cells from pregnant hypertensive women androgens cause a decrease in expression of sGC and NPRA and an increased expression of PKG . In sum, we conclude that DHT modulates the expression of the analyzed proteins, which are involved in vasodilator mechanism of androgens.

Keywords
Vascular smooth muscle cells, human umbilical artery, androgens, hypertension, genomic effects, protein kinase C, soluble guanylate cyclase, natriuretic peptide receptor-A

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ndice
Agradecimentos.................................................................................................................v Resumo ............................................................................................................................ vii Abstract ............................................................................................................................ ix Lista de figuras ................................................................................................................ xiv Lista de Tabelas .............................................................................................................. xvi Lista de acrnimos ......................................................................................................... xvii

Captulo I Introduo .................................................................................................... 1 1.1. Cordo Umbilical ................................................................................................... 1 1.1.2. Artria Umbilical Humana ........................................................................... 2 1.2. Msculo Liso ......................................................................................................... 4 1.2.1. Protenas participantes no processo contrtil ............................................ 6 1.3. Canais Inicos ....................................................................................................... 8 1.3.1. Canais de clcio ........................................................................................... 8 1.3.1.1. Canais De Clcio Dependentes de Voltagem ....................................... 9 1.3.1.2. Canais de Clcio Independentes de Voltagem ................................... 11 1.3.2. Canais de potssio ..................................................................................... 13 1.4. Mecanismos envolvidos no tnus vascular ........................................................ 15 1.4.1. Mecanismo contrtil.................................................................................. 16 1.4.2. Mecanismo de relaxao ........................................................................... 17 1.5. Nucletidos Cclicos ............................................................................................ 18 1.5.1. Guanilato Ciclase ....................................................................................... 18 1.5.2. Protena cinase G ....................................................................................... 24 1.6. Andrognios ........................................................................................................ 26 1.6.1. Generalidades ............................................................................................ 26 1.6.2. Mecanismo vasodilatador da testosterona ............................................... 28 1.6.3. Andrognios e as Doenas Cardiovasculares ............................................ 32 1.6.4. Andrognios e a Hipertenso .................................................................... 32 1.7. Patologias da Gravidez ........................................................................................ 33 1.7.1. Hipertenso ............................................................................................... 33
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1.7.2. Pr-eclampsia ............................................................................................ 34 Captulo II Objetivo ..................................................................................................... 35 Captulo III Materiais e Mtodos ................................................................................ 36 2.1. Preparao do tecido .......................................................................................... 36 2.2. Cultura de clulas ................................................................................................ 36 2.3. Tratamento com 5-DHT .................................................................................... 37 2.4. Extrao do RNA total ......................................................................................... 37 2.5. Sntese de DNA complementar ........................................................................... 38 2.6. PCR convencional ................................................................................................ 39 2.7. PCR em tempo real ............................................................................................. 39 2.8. Anlise estatstica................................................................................................ 40 Captulo IV Resultados ................................................................................................ 43 4.1. Anlise da expresso do mRNA da sGC .............................................................. 43 4.2. Anlise da expresso do mRNA do NPRA ........................................................... 46 4.3. Anlise da expresso do mRNA da PKG .............................................................. 49 Captulo V Discusso ................................................................................................... 52 Captulo VI - Concluses e Perspetivas Futuras ............................................................ 56 Captulo VII - Bibliografia ............................................................................................... 57

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Lista de figuras
FIGURA 1 - CORTE TRANSVERSAL DO CORDO UMBILICAL. .......................................................... 2 FIGURA 2 - REPRESENTAO ESQUEMTICA DA ESTRUTURA GERAL DE UMA ARTRIA. ............................... 3 FIGURA 3 REPRESENTAO ESQUEMTICA DE UMA CLULA MUSCULAR LISA ........................................ 4 FIGURA 4 CARATERSTICAS ULTRAESTRURAIS DAS SMC COM FENTIPO CONTRTIL E SINTTICO ................... 5 FIGURA 5 REPRESENTAO ESQUEMTICA DA ORGANIZAO DOS FILAMENTOS FINOS E GROSSOS. ................. 7 FIGURA 6 ESTRUTURA ESQUEMTICA PROPOSTA PARA OS VOCC ................................................. 9 FIGURA 7 - ILUSTRAO ESQUEMTICA DOS EVENTOS CHAVE ENVOLVIDOS NA RESPOSTA DAS CLULAS MUSCULARES LISAS ATIVAO DOS CANAIS DE POTSSIO OU INIBIO ............................................. 13 FIGURA 8 REPRESENTAO ESQUEMTICA DO MECANISMO DE REGULAO DA CONTRAO DO MSCULO LISO .... 17 FIGURA 9 ESTRUTURA DA SGC. ................................................................................ 19 FIGURA 10 - REGULAO DA SGC PELOS SEUS LIGANDOS......................................................... 20 FIGURA 11 - ESTRUTURA DA PGC. ............................................................................... 22 FIGURA 12 - ESTRUTURA DOS RECETORES DOS NP. .............................................................. 23 FIGURA 13 - MODELO HIPOTTICO DA ATIVAO E DESSENSIBILIZAO DOS RECETORES NPR-A E B. ............. 24 FIGURA 14 - PAPEL DO PKGI NA MODULAO DO NVEL DO CLCIO INTRACELULAR NA PROMOO DA RELAXAO DO MSCULO LISO........................................................................................ 25 FIGURA 15 MECANISMO DA FORMAO DA DIHIDROTESTOSTERONA, UM POTENTE METABOLITO DA TES .......... 27 FIGURA 16 EFEITOS NO GENMICOS (ESQUERDA) E EFEITOS GENMICOS (DIREITA) DOS ANDROGNIOS. ........ 28 FIGURA 17 - MECANISMO RPIDO DA TESTOSTERONA NAS HUASMC ............................................. 31 FIGURA 19 - EFEITO DA 5-DHT NA EXPRESSO DO MRNA DA SGC NAS HUASMC DE CORDES PROCEDENTES DE GRVIDAS NORMOTENSAS ............................................................................. 43 FIGURA 20 - EFEITO DA 5-DHT NA EXPRESSO DO MRNA DA SGC NAS HUASMC DE CORDES PROCEDENTES DE GRVIDAS HIPERTENSAS .............................................................................. 44 FIGURA 21 - EFEITO DA 5-DHT NA EXPRESSO DO MRNA DA SGC NAS HUASMC DE CORDES PROCEDENTES DE GRVIDAS NORMOTENSAS VERSUS CORDES PROCEDENTES DE GRVIDAS HIPERTENSAS ................. 45 FIGURA 22 - EFEITO DA 5-DHT NA EXPRESSO DO MRNA DO NPRA NAS HUASMC DE CORDES PROCEDENTES DE GRVIDAS NORMOTENSAS ............................................................................. 46 FIGURA 23 - EFEITO DA 5-DHT NA EXPRESSO DO MRNA DO NPRA NAS HUASMC DE CORDES PROCEDENTES DE GRVIDAS HIPERTENSAS .............................................................................. 47 FIGURA 24 - EFEITO DA 5-DHT NA EXPRESSO DO MRNA DO NPRA NAS HUASMC DE CORDES PROCEDENTES DE GRVIDAS NORMOTENSAS VERSUS CORDES PROVENIENTES DE GRVIDAS HIPERTENSAS ................ 48 FIGURA 25 - EFEITO DA 5-DHT NA EXPRESSO DO MRNA DA PKG NAS HUASMC DE CORDES PROCEDENTES DE GRVIDAS NORMOTENSAS ............................................................................. 49 FIGURA 26 - EFEITO DA 5-DHT NA EXPRESSO DO MRNA DA PKG NAS HUASMC DE CORDES PROCEDENTES DE GRVIDAS HIPERTENSAS .............................................................................. 50 FIGURA 27 - EFEITO DA 5-DHT NA EXPRESSO DO MRNA DA PKG NAS HUASMC DE CORDES PROCEDENTES DE GRVIDAS NORMOTENSAS VERSUS CORDES PROVENIENTES DE GRVIDAS HIPERTENSAS ................ 51

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Lista de Tabelas
TABELA 1 REPRESENTAO ESQUEMTICA DOS VOCC.................................................................................... 10 TABELA 2 - FENTIPOS DE RATOS E SERES HUMANOS COM MUTAES QUE LEVAM INATIVAO DOS GENES QUE CODIFICAM PARA OS RECETORES DOS PPTIDOS NATRIURTICOS ......................................................... 23 TABELA 3 - PRIMERS UTILIZADOS PARA PCR EM TEMPO REAL ............................................................................. 40

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Lista de acrnimos
ANP pptido natriurtico auricular (atrial natiuretic peptide) AR recetor de andrognios (androgen receptor) BNP pptido natriurtico do crebro (brain natriuretic peptide) BKCa Canal de potssio ativado por clcio de elevada condutncia (Large conductance calcium-activated potassium channel) CaM Calmodulina (Calmodulin) cGMP Monofosfato cclico de guanosina ou Guanosina monofosfato cclico (Cyclic Guanosine monophosphate) CNP pptido natriurtico do tipo C (C-type natriuretic peptide) CVD Doena Cardiovascular (Cardiovascular disease) DAG Diacilglicerol (Diacylglicerol) DHP Di-hidropiridina GC Guanlilato ciclase (Guanylate cyclase) HVA Canais de alta voltagem (high voltage activated) HUA Artria umbilical humana (Human Umbilical Artery) HUASMC Clulas Musculares Lisas da Artria Umbilical Humana (Human Umbilical Artery Smooth Muscle Cells) HT Hipertenso ( Hypertension) IP3 1,4,5-Trifosfato de Inositol (Inositol-1,4,5-Triphosphate) KATP Canais de potssio sensveis a ATP (ATP Sensitive Potassium Channels) KCa Canais de potssio activados por Ca2+(Calcium-Activated Potassium channels) KIR Canais de potssio rectificadores internos (Inwardly Rectifying PotassiumChannles) KV Canais de K+ Operados por Voltagem (Voltage-Gated Potassium Channels) LVA Canais de baixa voltagem (low voltage activated) L-VOCC Canal de clcio dependente da voltagem do tipo-L (L Type voltage operated calcium channels) MLC20 Cadeias Leves Reguladoras da Miosina (Myosin Regulatory Light Chains) MLCK Protena Cinase da Cadeia Leve da Miosina (Myosin-Light-Chain Kinase) MLCP Protena Fosfatase da Cadeia Leve da Miosina (Myosin-Light-Chain Phosphatase) NCX Permutador Na+/Ca2+ (Na+/Ca2+Exchanger) NO xido Ntrico (Nitric Oxide) NPs Pptidos Natriurticos (Natriuretic Peptides) NPRA recetor do pptido natriurtico-A (natriuretic peptide receptor-A) NPRB recetor do pptido natrurtido-B (natriuretic peptide receptor-B) NPRC recetor do pptido natriurtico-C (natriuretic peptide receptor-C) PE Pr-eclampsia pGC Guanilato Ciclase Membranar (Particulate Guanylyl Cyclase)

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PKC Protena Cinase C (Protein Kinase C) PKG Protena Cinase G (protein Kinase G or Cyclic GMP-dependent Protein Kinase) PLC Fosfolipase C (Phospholipase C) PMCA Ca2+ATPase da Membrana Plasmtica (Plasma Membrane Ca 2+ATPases) ROC Canais Operados por Receptores (Receptor-Operated Channels) ROCK Protena cinase dependente da Rho-A (Rho-activated Kinase) SERCA Bomba de clcio do retculo sarcoplasmtica (Sarco/endoplasmatic reticulum Ca 2+activated ATPase) sGC Guanilato ciclase solvel (Soluble guanylyl cyclase ) SMC clulas musculares lisas (Smooth Muscle Cells) SOC Canal ativado pela depleo sarcoplasmtica de clcio (Store-operated channels) SUA Artria umbilical nica (single umbilical artery) Tes Testosterona T-VOCC Canal de clcio dependente da voltagem tipo-T (T-type voltage operated calcium channels) VOCC Canais de clcio dependentes de voltagem (voltage operated calcium channels)

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Captulo I Introduo
1.1. Cordo Umbilical

Durante a gravidez existe uma estrutura que permite a ligao entre a me e o feto, e responsvel pelo transporte de sangue e nutrientes [1]. O cordo umbilical uma estrutura vital para o crescimento e bem-estar do feto, comea a formar-se simultaneamente com a placenta na primeira semana de gestao e, apesar de provavelmente ser o nico rgo que morre quando a vida comea, uma das partes mais importantes da unio feto-placentria [2]. Tem sido demonstrado que as alteraes na morfologia e na constituio do cordo umbilical podem influenciar o curso da gravidez e o nascimento. Vrios estudos demonstraram que a composio e o metabolismo alterado do cordo umbilical frequentemente encontrado em certas doenas da gravidez como a pr-eclampsia (PE), diabetes, hipertenso (HT) entre outras [1, 2]. Esta uma amostra biolgica ideal para o estudo de patologias, pois de fcil obteno logo aps o nascimento, e pode ser recolhida, sem riscos adicionais para a me ou para o feto [3]. No geral, um cordo umbilical normal tem um comprimento mdio de 50 a 60 cm, e 1 a 2 cm de dimetro, e pesa aproximadamente 40g. Porm, podem existir cordes umbilicais de diferentes tamanhos, podendo ser curtos ou longos, no sendo a sua ocorrncia comum [1, 3]. Os cordes muito curtos podem causar a separao prematura da placenta da parede do tero, enquanto os cordes excessivamente compridos tem tendncia a sofrer prolapso e/ou enrolarem-se em torno do feto e a formarem ns, sendo a sua identificao bastante importante de forma a evitar morte fetal resultante de anxia fetal [4]. O cordo umbilical tem um aspeto esbranquiado e normalmente constitudo por trs vasos sanguneos; duas artrias e uma veia, envolvidas por um tecido conjuntivo mucoso a geleia de Wharton (figura 1) [1]. Contudo, j foram observados cordes umbilicais com apenas uma artria. A presena de apenas uma artria umbilical a anomalia do cordo umbilical menos frequente, estimando-se que afete 0,5 a 2,5% de todas as gestaes, e est associada a uma alterao cromossmica e a malformaes cardacas [5].

Figura 1 - Corte transversal do cordo umbilical. Adaptado de [6].

A geleia de Wharton constitui a maior parte do cordo umbilical humano e age como uma camada protetora. Apresenta um aspeto gelatinoso e composta por algumas clulas estromais mesenquimais e uma matriz extracelular rica em gua, glicosaminoglicanos, proteoglicanos (cido hialurnico e condroitina sulfato) e diferentes tipos de colagnio [7, 8]. Quanto aos vasos umbilicais estes diferem na sua estrutura e na sua funo, em comparao com os vasos principais do corpo. A veia umbilical tem maior dimetro, e a parede mais fina, enquanto que as artrias, so mais estreitas e tem paredes mais espessas. As duas artrias umbilicais enrolam-se em volta da veia de um modo helicoidal e o sangue flui de um modo pulstil do feto para a placenta, atravs destas. O retorno do sangue para o feto feito atravs da veia umbilical [9].

1.1.2. Artria Umbilical Humana

A artria umbilical humana (HUA) est envolvida na circulao feto-placentria e os mecanismos que regulam o estado contrtil desta artria so muito importantes para otimizar a troca de nutrientes e oxignio entre o feto e a placenta [10]. A HUA considerada uma fonte nica, til e de fcil acesso atravs do cordo umbilical [11]. uma artria muscular de calibre mdio, entre 1 e 10mm, onde na parede predominam as fibras musculares [12], e constituda por trs tnicas concntricas, a tnica interna ou ntima, a tnica mdia, e a tnica externa ou adventcia (figura 2) [13].

Figura 2 - Representao esquemtica da estrutura geral de uma artria. Adaptado de [13]

A tnica ntima ou interna constituda por uma nica camada de clulas endoteliais que est em contato direto com a camada muscular. A tnica mdia formada por duas camadas de clulas musculares lisas uma por dentro e outra por fora dos feixes musculares constituindo a; membrana interna elstica e a membrana externa elstica. A membrana interna elstica separa a tnica mdia da ntima, apresenta um aspeto enrugado e as clulas musculares lisas (SMC) esto dispostas linear ou longitudinalmente [12-14]. A membrana externa elstica separa a tnica mdia da tnica externa e est menos definida que a interna. As SMC nesta camada esto dispostas circularmente e as contraes que levam ao incio do fecho das artrias umbilicais tm origem nesta camada [15]. A presena de uma tnica mdia muscular bem desenvolvida permite que estas artrias possam variar no seu calibre segundo as necessidades metablicas da regio irrigada [12-14]. As artrias umbilicais no tm adventcia nem vasa vasorum da mesma forma que observado nas outras artrias. Em vez disso, a rgida geleia de Wharton executa a funo de adventcia. Este scaffold fibroso e poroso contribui para a firmeza do cordo. A espessura e a turgidez da geleia de Wharton variam com a expanso e contrao dos vasos e pode deste modo suportar estruturalmente e prevenir a hiperdistenso dos vasos [6, 9]. Uma vez que os vasos sanguneos umbilicais no so inervados, o controlo do fluxo do sangue umbilical depende inteiramente de substncias vasoativas libertadas localmente ou na circulao. A compreenso dos mecanismos intracelulares que modulam a contrao da HUA pode oferecer um valor teraputico para o tratamento de algumas patologias como a PE [10].

1.2. Msculo Liso

O msculo liso vascular uma estrutura altamente especializada e tem como principais funes a contrao, regulao da presso sangunea, do fluxo sanguneo e do tnus vascular [16, 17]. O msculo liso encontra-se nas paredes de rgos ocos, tais como nos vasos sanguneos, na bexiga, no tero e no trato gastrointestinal e contrai-se lenta e involuntariamente. O msculo liso vascular composto por clulas longas e fusiformes, com um nico ncleo central. Estas SMC esto envolvidas num tecido fino fibroelstico, e fazem parte da poro contrtil de muitos rgos, estando dispostas em camadas na parede do tubo digestivo, tero, vasos sanguneos entre outros. As SMC tm entre 20-50 m de comprimento e 5-10 m de largura (figura 3) [6].

Figura 3 Representao esquemtica de uma clula muscular lisa [18].

Nas SMC o ncleo cilndrico e localiza-se no centro da clula e o citoplasma est ocupado por filamentos de actina, miosina e filamentos intermdios [18-20]. Ao contrrio das clulas do msculo-esqueltico ou do msculo cardaco que so totalmente diferenciadas, as SMC tm uma plasticidade notvel e podem sofrer modificaes profundas e reversveis no seu fentipo, como resposta a alteraes de estmulos locais [20]. Atravs da contrao ou relaxao alteram o dimetro luminal dos vasos sanguneos regulando a presso arterial. Estas clulas tm um papel fundamental na morfognese do vaso sanguneo e apresentam altos ndices de proliferao, migrao e produo de componentes da matriz extracelular, como colagnio, elastina, e proteoglicanos. Deste modo, em resposta leso vascular, as SMC aumentam dramaticamente a sua taxa de proliferao celular, migrao e capacidade sinttica, desempenhando um papel primordial na reparao vascular [11, 20]. importante afirmar que o elevado grau de plasticidade exibido pelas SMC, predispe estas clulas a estmulos ambientais anormais que podem levar a uma mudana fenotpica adversa, isto , aquisio de caratersticas que podem contribuir para o desenvolvimento e/ou progresso de doenas vasculares. Com efeito, h uma forte evidncia de que a mudana fenotpica das SMC, desempenha um papel importante nomeadamente na aterosclerose, no cancro, e na HT [20].

A morfologia um parmetro importante para a definio de fentipos das SMC, contudo a utilizao de protenas marcadoras para este fim tornou-se frequente e indispensvel para uma caraterizao aprofundada destas clulas [11]. As protenas marcadoras das SMC que so normalmente usadas para definir os fentipos so: -actina do msculo liso, cadeia pesada da miosina do msculo liso, SM22-, SM-calponina, h-caldesmona, smoothlina, telokina, meta-vinculina, e a desmina. Muitas destas protenas esto envolvidas na contrao das SMC, ou so um componente estrutural do aparelho contrtil. Quando os nveis de expresso destas protenas marcadoras contrteis diminuem gradualmente, isso geralmente adotado como uma caraterstica do fentipo sinttico [19, 21]. O fentipo contrtil e sinttico das SMC apresentam duas morfologias diferentes (figura 4).

Figura 4 Caratersticas ultraestrurais das SMC com fentipo contrtil e sinttico. Adaptado de [19].

As SMC contrteis so alongadas e fusiformes, enquanto as SMC sintticas so menos alongadas e tm uma morfologia parecida a um paraleleppedo, que referido como epiteliide ou romboide. O fentipo sinttico contm um elevado nmero de organelos envolvidos na sntese de protenas que so substitudas posteriormente por filamentos contrteis nas SMC contrteis. As SMC sintticas e contrteis tm diferentes caratersticas proliferativas e migratrias, sendo as sintticas as que apresentam taxas de crescimento mais

elevadas e maior atividade migratria [19]. Quando ocorre uma leso arterial, as SMC passam do estado contrtil para sinttico. [19, 21]. Um dos maiores problemas da realizao de culturas primrias de SMC vasculares o facto de este tipo de clulas apresentar mltiplos fentipos, desde o contrtil ao sinttico. Contudo Li et al (1999) demonstrou que aps 24 horas em meio sem soro, estas clulas apresentam principalmente o fentipo contrtil [21, 22].

1.2.1. Protenas participantes no processo contrtil

O tecido muscular liso formado por trs tipos de filamentos, os filamentos grossos contendo principalmente miosina, os filamentos finos contendo principalmente actina e os filamentos intermdios que consistem principalmente de vimentina. Pensa-se que os filamentos intermdios desempenham uma funo a nvel estrutural [23]. No entanto, ao contrrio do msculo-esqueltico os filamentos esto dispostos obliquamente dentro das SMC e ancorados membrana citoplasmtica por placas densas e dentro do citoplasma por corpos densos [24, 25]. As protenas participantes no mecanismo contrtil encontram-se agrupadas apenas em filamentos finos e filamentos grossos.

Filamentos finos
Os filamentos finos possuem aproximadamente 6-8 nm de dimetro e so compostos principalmente por actina filamentosa ou fibrosa (F-actina) e mais trs protenas acessrias: a tropomiosina, a caldesmona e a calponina (figura 5) [26]. A actina uma protena scaffold e tem aproximadamente 42kDa. Ela capaz da sua automontagem a partir da sua forma monomrica G-actina numa macro-molcula filamentosa conhecida como a F-actina [27]. Existem quatro isoformas da actina conhecidas no msculo liso, a alfa-actina e a gama-actina que so geralmente referidas como isoformas contrteis, estando a alfa actina predominantemente no msculo liso vascular e a gama actina predominante no msculo liso gastrointestinal. As duas isoformas no-musculares da actina citoplasmticas, ou seja, do citoesqueleto, so as isoformas beta e gama [28]. A alfa-actina e a gama-actina esto associadas miosina e caldesmona e participam na contrao, enquanto que a beta actina est associada com a calponina e tem um papel estrutural importante nas SMC [29]. A tropomiosina uma protena longa e fina, constituda por duas cadeias polipeptdicas enroladas em forma de hlices para formar filamentos que correm ao longo do microfilamento de F actina, e est envolvida na regulao da interao actinamiosina. Esta protena liga-se actina e impede a ligao actina/miosina bloqueando o stio de ligao. A troponina um complexo de 3 subunidades (dispe-se em forma descontnua ao longo do microfilamento) que se une tropomiosina, e permite a unio dos ies clcio actina. A caldesmona uma protena de ligao actina, tropomiosina, miosina e calmodulina que interage com os filamentos de actina. Esto identificadas duas isoformas da caldesmona, a h-caldesmona (150 KDa) e l-caldesmona (89KDa), mas s a isoforma h-

caldesmona expressa nas SMC vasculares diferenciadas. Evidncias sugerem assim, que esta protena est envolvida na contrao do msculo liso, atuando como uma protena reguladora [30]. A calponina uma protena que interage com a F-actina, miosina, protenas de ligao ao Ca2+ e com a tropomiosina. Esta protena inibe a atividade ATPase da miosina, bem como o movimento dos filamentos de actina sobre a miosina, in vitro. A fosforilao da calponina por uma protena cinase liberta a inibio da ATPase do msculo liso [31, 32].

Filamentos grossos
Os filamentos grossos tm 15-18 nm de dimetro e so compostos por miosina. A miosina uma protena ATPase que se movimenta ao longo da actina e em presena de ATP, so responsveis pela contrao muscular. A miosina composta por duas cadeias pesadas, um par de cadeias leves alcalinas no fosforilveis de 17kDa (MLC17), e um par de cadeias leves reguladoras de 20kDa (MLC20). O dmero de cadeias pesadas contm na extremidade Nterminal duas cabeas globulares e na extremidade C -terminal uma longa cauda ou basto formado por duas hlices alfa. A cabea da miosina tem uma atividade intrnseca de Mg2ATPase ativado pela actina, em que a miosina transforma a energia qumica armazenada na forma de ATP, em trabalho mecnico associado contrao muscular. Sendo assim a miosina considerada uma protena motora. Na cabea da miosina encontra -se o stio de ligao ao ATP e actina, sendo o local de gerao de fora. O "pescoo", que regula a atividade da "cabea" liga-se calmodulina. E a "cauda" contm stios de ligao que determina se a molcula vai se ligar membrana plasmtica ou a outras caudas para formar um filamento grosso (figura 5) [33].

Figura 5 Representao esquemtica da organizao dos filamentos finos e grossos.

No msculo liso, numerosos miofilamentos esto orientados ao longo do eixo longitudinal da clula. Estes consistem principalmente em filamentos de miosina e actina, que formam unidades contrtil, como j foi referido anteriormente. A fora mecnica gerada nas SMC baseada no deslizamento das extremidades livres dos filamentos de actina sobre os filamentos da miosina adjacentes em direes opostas durante o ciclo das pontes cruzadas. Este ciclo um mecanismo bem estabelecido para o desenvolvimento da tenso em todas as clulas musculares [34].

1.3. Canais Inicos

1.3.1. Canais de clcio
O clcio um mensageiro intracelular que controla uma variada gama de processos celulares, como a transcrio de genes, contrao muscular e proliferao celular. A concentrao de clcio no interior das SMC regulada pela interao de diversos processos de compensao, que podem ser divididos em mecanismos para aumentar ou diminuir a concentrao de Ca2+ [35]. Nos mecanismo para aumentar a [Ca 2+] do meio extracelular para o meio intracelular envolve vrios tipos de canais de Ca 2+ localizados na membrana plasmtica, que podem ser dependentes ou independentes de voltagem [35, 36]. Os canais de clcio dependentes de voltagem (VOCC) incluem os (1) canais dependentes de voltagem do tipo L (L-VOCC) que regulam o processo contrtil sendo a principal via de entrada de Ca 2+ e os (2) canais de clcio dependentes de voltagem do tipo T (T-VOCC) que esto principalmente envolvidos na regulao da proliferao celular [37]. Quanto aos canais de clcio independentes de voltagem incluem os (1) canais operados por recetores (ROC) que so regulados pela interao entre o agonista e o recetor, (2) os canais de clcio operados por depsitos intracelulares (SOC) que so ativados pela libertao do clcio das reservas intracelulares, e os (3) canais de clcio ativados por stress fsico (SAC) que so ativados pelo stress fsico da membrana. Todos estes canais independentes de voltagem esto situados na membrana plasmtica, e esto envolvidos na regulao do tnus vascular [36, 38-40]. Quanto aos mecanismos de remoo do Ca2+ do citoplasma para os depsitos intracelulares realizada atravs da Ca2+ ATPase do reticulo sarco-endoplasmtico (SERCA), e/ou para o meio extracelular, atravs da ATPase do Ca 2+ da membrana plasmtica (PMCA) e do permutador Na+/Ca2+ (NCX) [37].

1.3.1.1. Canais De Clcio Dependentes de Voltagem

Os canais de clcio dependentes de voltagem (VOCC) so necessrios para a excitaocontrao normal do corao, msculo-esqueltico e clulas do msculo liso, incluindo as SMC vasculares e desempenham um papel central na regulao do tnus vascular, atravs do potencial de membrana [41]. A primeira classificao destes canais foi baseada em propriedades bsicas eletrofisiolgicas e farmacolgicas. Foi observado que alguns canais de clcio precisavam apenas de uma pequena despolarizao para serem ativados, enquanto outros necessitariam de uma despolarizao maior para abrirem. De acordo com este critrio os canais de clcio foram divididos em canais de clcio ativados por alta voltagem (HVA) e os ativados por baixa voltagem (LVA). A ativao dos canais HVA ocorre a partir de -20mV enquanto a ativao dos canais LVA ocorre em potenciais de membrana baixos, a partir - 60mV. famlia dos canais HVA pertencem os canais de clcio dependentes de voltagem do tipo-L (L-VOCC), tipo P/Q e canais tipo-R, enquanto a famlia dos canais LVA apenas constituda por canais de clcio dependentes de voltagem do tipo-T (T-VOCC) (tabela 1) [37, 42-44]. Em termos estruturais, os VOCC so protenas complexas compostas por 4 diferentes subunidades, a subunidade principal 1, e as subunidades auxiliares , 2 e a . A subunidade 1 a maior subunidade (190 a 250 kDa) e nela est incorporada o poro condutor, o sensor de voltagem e a zona de ligao de segundos mensageiros, drogas e toxinas. Esta subunidade formada por 4 domnios homlogos (I-IV), com seis segmentos transmembranares (S1-S6) cada um. A existncia de um loop entre os segmentos S5-S6 determina a seletividade dos ies e a sua condutncia. Quanto subunidade , intracelular e transmembranar e est ligada por pontes disulfureto subunidade 2 (figura 6) [37].

Figura 6 Estrutura esquemtica proposta para os VOCC [37]

Aps a descoberta de vrios canais foi necessrio adotar uma nomenclatura de forma a distinguir os canais, deste modo a denominao segue o esquema Ca v x.y., onde x o nmero que designa a subfamlia do canal e y o nmero que designa os membros individuais da subfamlia (tabela 1) [37]. Relativamente expresso foi descrito que os canais L-VOCC e os T-VOCC so expressos nas SMC da artria umbilical [21].
Tabela 1 Representao esquemtica dos VOCC. Adaptado de [37].

Canais de clcio dependentes de voltagem do tipo-L

Os canais de clcio dependentes de voltagem do tipoL (L-VOCC) foram inicialmente identificados por Fatt e Katz et al. (1953) e so os canais mais bem caraterizados [36, 37]. Estes canais so ativados por despolarizaes de membrana mais positivas (a partir dos -20 mV), possuem uma condutncia elevada e a sua inativao mais lenta (300 a 600 ms), e so por isso denominados de longa durao, tipo-L. Aps a despolarizao das SMC vasculares, os L-VOCC abrem-se, e conduzem a um aumento do clcio intracelular, contrao das clulas e vasoconstrio. Quatro isoformas dos L-VOCC foram descobertas e denominam-se de Cav1.1, Cav1.2, Cav1.3 e Cav1.4 e todas elas so caraterizadas por terem uma alta sensibilidade di-hidropiridina (DHP), sendo este um bloqueador especfico. Esta sensibilidade nica DHP distingue-os de outros canais de clcio dependentes de voltagem [39, 43, 45, 46]. Os L-VOCC do msculo liso (Cav1.2) desempenham um papel fundamental na determinao da presso arterial e os bloqueadores destes canais so uma classe importante de medicamentos anti-hipertensivos [43]. Os canais Cav1.4 so encontrados principalmente em neurnios retinais, e os canais Cav1.2 e Cav1.3 so mais amplamente distribudos e ocorrem nos neurnios, clulas sensoriais do ouvido interno, na retina, clulas endcrinas, msculo liso, e no corao. Devido falta de moduladores seletivos destas isoformas,

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impossvel determinar a sua contribuio relativa para as correntes de clcio ou qual a funo nestas clulas por meios farmacolgicos [45].

Canais de clcio dependentes de voltagem do tipo-T

Os canais de clcio dependentes de voltagem do tipo T (T-VOCC) parecem desempenhar um papel primordial em vrias funes fisiolgicas, como na proliferao celular e no ciclo celular das SMC vasculares. Estes canais so ativados por nveis de despolarizao da membrana prximos do potencial de repouso (a partir dos -50 mV), possuem uma baixa condutncia e so caraterizados por uma rpida ativao e inativao. Trs membros compem a famlia dos T-VOCC, e so conhecidos como Cav3.1, Cav3.2 e Cav3.3. Os Cav3.1e Cav3.2 esto presentes no sistema cardiovascular, mas o Cav3.3 tem sido detetado principalmente no crebro [43].

1.3.1.2. Canais de Clcio Independentes de Voltagem

Nas SMC, agonistas como os neurotransmissores ou hormonas podem induzir o aumento da concentrao de clcio intracelular atravs da libertao de clcio intracelular armazenado ou/e do influxo de clcio extracelular. A via de entrada de clcio opera atravs de uma variedade de canais de clcio que envolvem, entre outros, os canais independentes de voltagem que incluem; os ROC, os SOC, e os SAC [38, 47, 48]. Os mecanismos de ativao destes canais ainda assunto de muita discusso. No entanto, durante os ltimos 10 anos, foram realizados estudos que sugeriram que os diferentes tipos de canais podem ser estruturalmente relacionados com a mesma famlia de protenas: as TRP the transient receptor proteins. Alguns tipos de protenas TRP so ubiquosamente expressas nas SMC e as variaes na expresso depende do tipo de tecido e de espcie. Mais recentemente, outras protenas como STIM1 e Orai1 foram apresentadas para participar isoladamente ou em associao com as TRP para a estrutura de SOC e SAC. Estes canais controlam a proliferao e a contrao das SMC [47].

Canais de clcio operados por recetores

O termo de canal operado por recetor (ROC), foi proposto simultaneamente por Bolton (1979) e VanBreemen (1978), de forma a definir um canal membranar que ativado como resultado da ligao de um agonista ao seu recetor, estando este recetor ligado a uma protena G e independente de uma alterao no potencial de membrana. Os ROC esto presentes nas SMC vasculares e so ativados por uma grande variedade de agonistas. Entre os vrios agonistas contrteis inclui-se o ATP, a norepinefrina, acetilcolina, angiotensina-II, a endotelina-1, serotonina e a vasopressina [47, 48].

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Nas SMC, foi demonstrado que os agonistas podem ativar estes canais e provocar a contrao, contudo a participao destes canais durante a vasoconstrio continua em debate uma vez que este efeito pode ser devido ativao indireta dos VOCC e/ou SOC [47, 48].

Canais de clcio operados por depsitos intracelulares

Os canais de clcio operados por depsitos intracelulares (SOC) so canais ativados aps a libertao de clcio dos depsitos intracelulares, contudo a via de sinalizao porque ocorre esta ativao ainda no est bem definida. Vrias evidncias sugerem que esta via pode ser importante na regulao do tnus vascular [38]. A entrada de clcio atravs destes canais foi originalmente proposta por Putney (1986) que usou o termo entra da de clcio capacitativo para descrever o fenmeno de acoplamento entre a concentrao de clcio do retculo endoplasmtico e a ativao dos canais membranares para entrada de clcio em clulas no-excitveis [47]. A depleo das reservas intracelulares de clcio do retculo sarcoplasmtico por diversos mecanismos tem sido relatada como causador da entrada de clcio capacitivo atravs dos SOC, numa ampla gama de clulas, incluindo as SMC vasculares [48]. Tem sido difcil saber um pouco mais sobre os SOC nas SMC, devido ao facto de ser complexo registar especificamente a corrente inica ativada pela depleo das reservas neste tipo de clula. importante referir que a depleo de clcio do retculo por si, e no o clcio libertado das reservas, que ativa os SOCs. Vrias experincias demonstraram que os inibidores de SERCA, sem ativar os recetores da membrana plasmtica, aumenta o influxo de clcio nas SMC e, consequentemente, aumentar a concentrao de clcio intracelular e induz a contrao do msculo liso [47, 48].

Canais ativados pelo aumento do stress fsico

Os canais ativados pelo stress fsico (SAC) foram descritos em 1984 no msculoesqueltico embrionrio de galinha por Guharay e Sachs. Desde a sua caraterizao original, os SACs foram encontrados numa variedade de tecidos e espcies, incluindo no msculo liso dos mamferos. As SMC em virtude da sua posio num ambiente biomecnico complexo so continuamente expostas estimulao mecnica, tais como compresso, stress fsico e distenso [47]. Os SAC na membrana celular tm como funo a converso da fora fsica em sinais biolgicos e resposta celular. Uma caracterstica comum dos SAC que a abertura do canal depende do grau da compresso, stress fsico ou distenso da membrana. Dois mecanimos principais do papel dos SAC foram propostos; (1) induzem a despolarizao da membrana via influxo de caties (principalmente Na+), pela ativao dos VOCC que induz o aumento de clcio citoslico, e (2) o aumento de clcio citoslico devido entrada de clcio atravs de SAC, abre os BKCa ou leva libertao de clcio das reservas [38, 47, 48].

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1.3.2. Canais de potssio

Os canais de potssio so a via dominante da conduo de ies nas SMC.Como tal, a sua atividade contribui de forma importante para a determinao e regulao do potencial de membrana e do tnus vascular [49, 50]. A hiperpolarizao da membrana devida a um efluxo de potssio aquando da abertura dos canais de potssio no msculo liso vascular. Este efeito seguido pelo fecho dos canais de clcio dependentes da voltagem, que conduz a uma reduo da entrada de clcio, e vasodilatao [49]. Em contraste, a inibio da funo de canais de potssio leva despolarizao da membrana e consequente vasoconstrio. At data, quatro tipos distintos de canais de potssio foram identificados no msculo liso vascular: os canais de potssio operados por voltagem (K v), os canais de potssio ativados por clcio (BKCa), canais de potssio retificadores internos (KIR ), dentro dos quais esto includos os canais sensveis ao ATP (KATP).(figura 7) [38, 50-52].

Figura 7 - Ilustrao esquemtica dos eventos chave envolvidos na resposta das clulas musculares lisas ativao dos canais de potssio (esquerda) ou inibio (direita). Adaptado de [52].

Canais de potssio operados por voltagem

Os canais de potssio operados por voltagem (Kv) esto presentes no msculo liso vascular e so ativados pela despolarizao da membrana num potencial de membrana entre os -35 mV e os -55mV, resultando na repolarizao e um retorno ao potencial de membrana. Uma despolarizao em pequena escala nas SMC conduz a um influxo de clcio atravs dos L-VOCC e ativao da maquinaria contrtil. Deste modo podemos afirmar que os Kv tm uma funo importante para limitar a despolarizao da membrana e manter o tnus vascular em repouso [49, 51, 52]. Quanto inativao deste canal resulta de uma despolarizao prolongada [51]. O composto 4-aminopiridina tem sido utilizado como um bloqueador farmacolgico dos K v. A 4-aminopiridina causa a despolarizao arterial e vasoconstrio, sugerindo que a atividade do canal Kv existe em alguns vasos sanguneos sob condies basais. O cAMP e o NO/cGMP podem ativar estes canais em alguns vasos sanguneos, e podem ser inibidos pela protena

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cinase C [38, 51, 52]. Cairro et al. mostraram tambm que a Tes e o ANP estimulam a atividade deste canal atravs do aumento dos nveis intracelulares de cGMP e consequentemente ativao da PKG [53]. Na hipertenso vrios estudos eletrofisiolgicos indicam uma diminuio da expresso funcional dos K v nas SMC, que podem contribuir para a despolarizao e um aumento no tnus vascular nesta doena [38].

Canais de potssio ativados por clcio

Os canais de potssio ativados por clcio de grande condutncia (BKCa) (200 ~ 250 pS) so uma caraterstica constante das clulas do msculo liso vascular. Os canais BKCa so ativados por alteraes na concentrao de clcio intracelular, e pela despolarizao da membrana, e acredita-se que contribuem para a manuteno do potencial de membrana em pequenos vasos miognicos [38, 49, 51]. A ativao fisiolgica dos BKCa pode ser um importante mecanismo de tamponamento para neutralizar a despolarizao e constrio do vaso em resposta a alguns vasoconstritores e ao aumento da presso intravascular. Devido grande condutncia dos BKCa, a atividade de um nmero relativamente pequeno destes canais pode exercer uma influncia relativamente grande no potencial de membrana [52]. Vasodilatadores que aumentem os nveis intracelulares de cAMP ou cGMP, monxido de carbono, e epxidos do cido araquidnico podem ativar estes canais. Os BKCa podem ser bloqueados por TEA, iberotoxina e charybdotixin, sendo a iberotoxina a mais seletiva. Na hipertenso arterial a expresso dos canais BKCa aumenta e isto ocorre como resposta a um feedback negativo ao aumento da reatividade vascular observada no tratamento da hipertenso. Assim, os canais BKCa desempenham um papel importante na regulao do tnus vascular, na sade e na doena [38]. Cairro et al. mostraram que a vasodilatao induzida pela Tes ocorre atravs da ativao destes canais [14].

Canais de potssio retificadores internos

Os canais de potssio retificadores internos (KIR) esto presentes numa variedade de clulas, incluindo nas SMC vasculares. Como uma descrio emprica de correntes inicas de membrana, retificao significa mudana de condutncia com voltagem. A maioria, se no todos os canais inicos, apresentam algum grau de retificao. Estes canais caraterizam-se por apresentarem um influxo de ies de potssio a potenciais de membrana mais negativos do que o potencial de equilbrio, e efluxos deste io a potenciais de membrana mais positivos que o potencial de equilbrio. Os canais K IR so ativados pela hiperpolarizao da membrana, ao contrrio dos canais Kv e BKCa, que so ativados pela despolarizao da membrana. Estes canais permitem assim o influxo de ies de potssio, quando no h hiperpolarizao, e a sada deste io, quando o potencial de membrana aumenta. As correntes deste tipo de canais so inibidas por brio nas SMC vasculares de uma forma dependente de voltagem [38, 51, 52, 54, 55]. Foi observado que na hipertenso estes canais tm a sua expresso ou funo diminuda [52].

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Canais de potssio dependentes do ATP

Os canais de potssio dependentes do ATP (KATP) foram descritos pela primeira vez em micitos cardacos, no entanto tambm se encontram presentes nas SMC vasculares [56]. Estes canais fecham quando a concentrao de ATP intracelular aumenta. No entanto os canais KATP so regulados por diversas vias de transduo de sinal independentes das alteraes do ATP. Assim, outras vias de regulao podem ser mais importantes fisiologicamente. Foi demonstrado tanto em estudos in vitro como in vivo que o bloqueio dos KATP leva vasoconstrio e despolarizao da membrana em diversos tipos de msculo liso vascular. Os KATP no msculo liso so conhecidos como sendo inibidos pelas drogas antidiabticas sulfonliureias, como a glibenclamida e tolbutamida [38, 49, 51, 52, 56].

1.4. Mecanismos envolvidos no tnus vascular

O tnus vascular a atividade contrtil das SMC nas paredes das artrias e arterolas, e o principal determinante da resistncia ao fluxo sanguneo. Tem um papel importante na regulao da presso arterial e na distribuio de fluxo sanguneo. A regulao da atividade contrtil das clulas musculares lisas depende de uma interao complexa entre estmulos vasodilatadores e vasoconstritores, de hormonas, neurotransmissores, fatores derivados do endotlio e da presso arterial e todos estes sinais podem induzir contrao ou relaxamento do msculo liso vascular. [16, 38, 57, 58]. Os ies no se encontram uniformemente distribudos no interior e no exterior da clula e esta assimetria, quando associada diferente permeabilidade da membrana plasmtica para cada espcie inica, toma-se responsvel pela criao de um potencial de membrana em repouso (Em). A maioria dos estudos em SMC isoladas sugere que o seu Em varia em mdia entre - 40 a - 60 mV e pensa-se que a interao entre os canais de K + e Ca2+ o principal fator que determina os nveis do par excitao-contrao nas SMC [49, 59]. Assim, a abertura dos canais de K+ ou Cl- resulta no aumento do potencial de membrana com o interior da clula a ficar mais negativo Hiperpolarizao. A hiperpolarizao fecha os canais de clcio dependentes de voltagem e leva vasodilatao. Contrariamente, a abertura dos canais de Na+ ou Ca2+ resulta na diminuio do potencial de membrana com o interior a ficar menos negativo despolarizao, ou seja vasoconstrio [38, 50, 60]. O movimento de ies e o influxo de clcio atravs dos canais inicos da membrana plasmtica, assim como, a libertao de clcio das reservas intracelulares so a maior fonte de ativao da contrao [38].

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1.4.1. Mecanismo contrtil

No organismo, o processo de contrao das SMC regulado principalmente pela receo e ativao das protenas contrteis, miosina e actina. Uma mudana no potencial de membrana, provocada pela atividade dos potenciais de ao ou pela ativao de canais inicos, pode tambm desencadear a contrao [57]. Resumidamente a contrao do msculo liso baseada na fosforilao da cadeia leve da miosina que necessria para o ciclo das pontes cruzadas e gerao de fora [61]. A partir da atividade ATPase da miosina libertada energia que resulta neste ciclo e importante para o mecanismo da contrao. Esta atividade resulta no que conhecido como o tnus do msculo liso e a sua intensidade pode ser variada [16, 57, 61].

Contrao dependente de clcio

O fenmeno de contrao/relaxamento do msculo liso depende do equilbrio que se estabelece entre os mecanismos que controlam as subidas e descidas da concentrao de clcio citoslico. A contrao das SMC regulada pela entrada de clcio atravs de duas vias iniciadas tanto pela despolarizao como por agonistas. A despolarizao da membrana celular ativa os VOCC resultando num influxo de clcio, enquanto que a estimulao por agonistas geralmente ativa a protena G levando formao do IP3 e a libertao de clcio a partir do reticulo sarcoplasmtico [61]. O mecanismo inicia-se do seguinte modo (figura 8): Em resposta a estmulos especficos nas SMC a concentrao de clcio citoslico aumenta, e este liga-se calmodulina (CaM), provocando uma alterao da conformao da CaM, e formando o complexo Ca 2+/CaM. Este complexo ativa a MLCK (cinase da cadeia leve da miosina) para posteriormente fosforilar uma das cadeias leves da miosina, a MLC20, e em conjunto com a actina e a miosina ocorre o ciclo de ponte cruzada, levando contrao da clula do msculo liso [61]. Agonistas como por exemplo a noradrenalina, angiotensina II, endotelina, etc, ligam-se a recetores acoplados protena G heterotrimrica, que vai estimular a atividade da fosfolipase C. Esta enzima produz dois segundos mensageiros: o inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). O IP3 liga-se aos recetores no retculo sarcoplasmtico e causa a libertao de clcio para o citosol. O DAG, juntamente com o clcio, ativa a protena cinase C (PKC), que fosforila as protenas alvo especficas. Em muitos casos, PKC tem uma contrao que promove efeitos, tais como a fosforilao dos canais L-VOCC ou outras protenas que regulam o ciclo das pontes cruzadas [16, 57, 61]. Alm da contrao muscular dependente de Ca2+, existe tambm a contrao independente de Ca2+, existindo assim dois mecanismos que vo desencadear este tipo de contrao.

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Sensibilizao ao clcio
Na ausncia de Ca2+, a contrao do msculo liso inicia-se quando a fosfatase da cadeia leve da miosina (MLCP) se encontra totalmente inibida [62]. O mecanismo de sensibilizao ao clcio iniciado ao mesmo tempo que a fosfolipase C ativada, e envolve a ativao da uma pequena protena a RhoA de ligao GTP. A protena Rho uma pequena protena que pertence superfamlia da Ras GTP-ases monomricas e atua em diversas funes fisiolgicas associadas com a actina-miosina, tal como a motilidade celular e a contrao do msculo liso. A natureza precisa sobre como ocorre a ativao da RhoA pelo recetor acoplado protena G no completamente claro mas envolve um "guanine nucleotide exchange factor o RhoGEF e a migrao da RhoA para a membrana plasmtica. Esta via de sinalizao envolve a Rho cinase (ROCK), que desempenha um papel fundamental na contrao do msculo liso, nomeadamente na regulao da atividade da MLCP. Uma vez ativada a RhoA aumenta a atividade da ROCK, levando inibio da fosfatase da miosina. Isto vai promover um estado fosforilado quando a cadeia leve da miosina no pode ser desfosforilada, permitindo que o estado contrtil se mantenha (figura 8) [57, 63, 64].

Figura 8 Representao esquemtica do mecanismo de regulao da contrao do msculo liso. Adaptado de [57]

1.4.2. Mecanismo de relaxao

O relaxamento do msculo liso vascular pode ocorrer de forma passiva, induzido pela remoo do agente contrtil, ou de forma ativa, induzido pela ativao de uma via dependente de nucletidos cclicos [57, 65]. O processo de relaxamento requer uma diminuio da concentrao de clcio intracelular e o aumento da atividade da MLCP. E os mecanismos envolvidos na remoo de clcio citoslico envolvem o retculo sarcoplasmtico e a membrana plasmtica.

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Quando a concentrao de Ca2+ diminui, o complexo Ca2+-CaM dissociado e a MLCK inativa. A dissociao do complexo tem como resultado a libertao de Ca 2+ que se encontrava ligado CaM. A [Ca2+]c regressa aos valores basais atravs de vrios mecanismos, que envolvem o retculo sarcoplasmtico e a membrana plasmtica: a PMCA, a SERCA, o permutador NCX e protenas citoslicas de ligao ao Ca2+. Sob estas condies, a atividade da MLCP aumenta e esta desfosforila a MLC20 e induz a relaxao das SMC vasculares [62, 65]. Entre os mecanismos envolvidos na regulao fisiolgica do tnus vascular encontramse os nucletidos cclicos. Um aumento a nvel citoslico do cAMP ou cGMP, vai provocar ativao das protenas cinases PKA e PKG, respetivamente, nas clulas do msculo liso vascular sendo este considerado um dos principais mecanismos que medeiam a vasodilatao sob condies fisiolgicas. Estes mecanismos esto mais desenvolvidos no capitulo a seguir.

1.5. Nucletidos Cclicos

Os nucletidos cclicos, cAMP e cGMP so os principais mensageiros ligados vasodilatao no msculo liso vascular. A sntese destes nucletidos catalisada pela adenilato ciclase (AC) e pelo guanilato ciclase (GC), respetivamente. A grande parte dos seus efeitos intracelulares resulta da ativao de protenas cinases especifcas: a protena cinase dependente do cAMP (PKA) e protena kinase dependente do cGMP (PKG). Neste trabalho apenas vamos abordar a GC pois apenas vamos estudar o efeito da Tes sobre a expresso deste nucletido.

1.5.1. Guanilato Ciclase

O cGMP (guanosina-3,5-monofosfato cclico) uma molcula de sinalizao importante gerada por guanilato ciclases, que esto envolvidas em vrios processos fisiolgicos, incluindo a relaxao das clulas musculares lisas, transduo do sinal neuronal, e a agregao plaquetria [66, 67]. Logo a partir das experincias iniciais [68, 69] foi descoberto duas isoformas distintas da enzima guanilato ciclase que sintetizam o cGMP, a guanilato ciclase solvel ou citoslica (sGC) e a guanilato ciclase particular ou membranar (pGC) [70]. A sGC ativada pelo xido ntrico (NO) enquanto que a pGC ativada pelos pptidos natriurticos (NPs) [71].

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Guanilato ciclase solvel

A guanilato ciclase solvel (sGC) uma protena heteromtrica, expressa no citoplasma celular e interfere em vrias funes fisiolgicas importantes, tais como relaxao das clulas musculares lisas, transduo de sinal neuronal e inibio da agregao plaquetria. Esta protena constituda por duas subunidades diferentes, a (1 ou 2) e a (1 ou 2) [72-74] e a expresso de ambas as subunidades requer atividade cataltica [67, 74]. Relativamente estrutura, a sGC possui um domnio de regulao no N-terminal que contm um grupo prosttico heme, com um ncleo de ferro que forma uma ligao com a histidina 105 da subunidade e medeia a sensibilidade para o NO [67, 71]. Para alm disso, possui um domnio de dimerizao, que apenas tem uma funo conhecida, a de ligar as duas subunidades a um domnio cataltico no terminal carboxilo. Esse domnio cataltico altamente conservado e responsvel pela converso do GTP em cGMP (figura 9) [67, 71, 72, 74].

Figura 9 Estrutura da sGC. Adaptado de [67].

As subunidades mais abundantes so a 1 e a 1, que podem ser encontradas em diversos tecidos. Embora as duas subunidades e possuam domnios catalticos, necessrio que sejam expressas simultaneamente para que a enzima tenha atividade. As combinaes de subunidades mais habituais so as 1/1 e a 2/1, ambas presentes no sistema vascular sendo a 1/1 a mais expressa [73, 74]. Diversos estudos revelam dados que suportam a hiptese de que a expresso de 2 pode servir para regular a atividade sGC 1/1. De facto, a expresso de 2 tem sido sugerida para desempenhar um papel na patognese da hipertenso [67, 71, 74, 75]. Foi feito outro estudo onde, Ruetten et al.(1999) mediram a expresso e a atividade enzimtica da sGC em ratos normotensivos e ratos com hipertenso. Curiosamente, eles

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observaram que tanto a expresso da subunidade 1 como a 1 estavam diminudas nos ratos com hipertenso, sugerindo que a falta de sGC pode contribuir para a hipertenso [76]. Quanto regulao da atividade de sGC, a ativao desta ocorre quando o NO se liga ao grupo prosttico heme. Quando o NO se liga, a ligao entre a histidina105 da subunidade 1 e o ferro, formando-se o complexo His-Fe2+-heme. Foi demonstrado que uma mutao na His105 vai resultar na incapacidade do heterodmero se ligar ao grupo heme e consequente falta de sensibilidade ao NO [67, 71, 72, 74]. O NO ao se ligar ao grupo heme e a subquente alterao conformacional desse complexo leva a um aumento da atividade enzimtica em aproximadamente 200 vezes. O posterior aumento na concentrao de cGMP traz mudanas na atividade das molculas efetoras cGMP, como na protena cinase dependente do cGMP (PKG) e fosfodiesterases dependentes de cGMP levando a alteraes na funo celular (figura 10) [75]. O monxido de carbono (CO) tambm ativa a sGC, mas menos eficaz que o NO [67, 68, 77].

Figura 10 - Regulao da sGC pelos seus ligandos. Adaptado de [67].

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Guanilato Ciclase Membranar

Aquando da descoberta da guanilato civlase membranar (pGC), esta no prendeu muita ateno devido ao facto de ainda no se conhecerem os ativadores fisiolgicos desta enzima. Aps alguns anos descobriu-se que os pptidos natriureticos (NPs) ativavam a pGC e estimulavam a produo de cGMP em diversos tecidos e a partir da comeou uma investigao mais profunda desta enzima. Os ligandos da pGC so os NPs: o pptido natriurtico auricular (ANP), pptido natriurtico do crebro (BNP), e o pptido natriurtico do tipo C (CNP) [77]. Os pptidos natriurticos so uma famlia de mediadores peptdicos cardacos e vasculares com papis fundamentais na homeostase cardiovascular, principalmente na regulao do volume e da presso sangunea [78, 79]. O ANP um polipptido de 28 aminocidos produzido na aurcula, um potente vasodilatador e tambm uma hormona diurtica [80, 81]. O BNP est tambm presente na aurcula, mas encontrado a elevados nveis nos ventrculos de coraes em stress. As concentraes plasmticas de ANP so maiores que as do BNP em humanos saudveis. Mas tanto as concentraes do ANP como as do BNP esto elevadas em pacientes com insuficincia cardaca grave, e em alguns casos, os nveis de BNP excedem os nveis de ANP. O CNP encontrado a baixas concentraes no corao, mas est presente a altas concentraes nos condrcitos, onde estimula o crescimento dos ossos [82]. O CNP mais potente que o ANP a provocar o relaxamento no msculo liso, mas menos potente a induzir a diurese e a natriurese [83]. Nos mamferos, so conhecidas sete isoformas da pGC ( da GC-A GC-G) [77], mas apenas trs formas so conhecidas por se ligarem aos NPs, tambm chamados de recetores de NPs (NPRs): GC-A (ou NPR-A), GC-B (ou NPR-B) e recetor de clearance (ou NPR-C). Enquanto os recetores GC-A e GC-B produzem o segundo mensageiro intracelular o cGMP, o NPR-C apenas tem funo de clearance [70, 79, 81]. A topologia bsica das guanilato ciclases membranares consiste num domnio extracelular de ligao ao ligando, uma nica regio transmembranar e um domnio homlogo de cinase intracelular (KHD), um domnio de dimerizao da guanilato ciclase e um domnio cataltico (homodmero) na regio C-terminal (figura 11) [80].

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Figura 11 - Estrutura da pGC. Adaptado de [67].

O NPRA o recetor membranar com atividade cataltica GC mais bem caraterizado [70, 80]. Este recetor considerado o recetor biolgico do ANP e do BNP, porque a maioria dos efeitos fisiolgicos destas hormonas so desencadeados pela produo de cGMP. Estudos recentes em humanos, que tinham uma mutao num nico alelo no promotor do gene do NPRA, verificaram que uma perturbao gentica no NPRA aumenta a presso sangunea e causa hipertenso (tabela 2). Nas clulas em cultura, este recetor encontrado nas clulas primrias vasculares do msculo liso e nas clulas mesenliais do rim e expresso a nveis baixos mas significativos no corao [70, 78, 80, 84]. A ordem de preferncia de ativao deste recetor : ANPBNPCNP (figura 12) [84, 85]. A maioria das funes fisiolgicas do NPRA est associada com processos que reduzem o trabalho cardaco [80]. O NPR-B tem uma topologia semelhante ao NPR-A. O mRNA deste recetor foi encontrado no crebro, pulmes, ossos, corao e tecido ovrio. Mas igualmente expresso a nveis relativamente altos nos fibroblastos e nas clulas musculares lisas vasculares [70, 84]. A ordem de preferncia de ativao do NPRB : CNPANPBNP (figura 12) [85]. Vrios estudos em ratos mostraram que quando existe uma mutao no gene do recetor, os ratos fmeas ficam infrteis e alguns com nanismo (tabela 2) [84]. O NPR-C tem uma arquitetura extracelular semelhante aos GC-A e GC-B, mas no contm o domnio KHD nem o domnio cataltico [70, 80]. Este recetor o mais abundante, sendo principalmente expresso nos rins, crebro, pulmes e na parede vascular [70, 78]. A ordem de preferncia de ativao para o NPR-C : ANP>CNP>BNP (figura 12) [84, 85]. Tem como principal funo eliminar os NPs circulao atravs da internalizao e degradao mediada pelo recetor [78].

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Figura 12 - Estrutura dos recetores NP. Adaptado de [84].

Tabela 2 - Fentipos de ratos e seres humanos com mutaes que levam inativao dos genes que codificam para os recetores dos pptidos natriurticos. Adaptado de [84].

Gene NPR-A

NPR-B

NPR-C

Fentipo do ratinho knockout Hipertenso Fibrose ventricular Hipertrofia cardaca Nanismo, convulses, Esterilidade feminina Decrescente adiposidade Gigantismo Hipotenso

Doenas humanas Hipertenso Fibrose ventricular Nanismo

O mecanismo exato de ativao e de dessensibilizao dos recetores NPR-A e B ainda no conhecido. Um modelo hipottico foi proposto, segundo o qual podem apresentar trs estados classificados como basal, ativo, e dessensibilizado (figura 13). No estado basal, os recetores, que estavam no estado dessensibilizado, so fosforilados por tirosina cinases no KHD o que permite a ligao dos NP. No estado ativo, a ligao do NP promove uma mudana conformacional no recetor que permite a associao de duas partes do domnio intracelular, anulando o efeito inibitrio que a KHD exercia sobre a atividade cataltica e ativando a ciclase. No estado dessensibilizado, a exposio prolongada ao NP provoca uma desfosforilao do KHD por uma fosfatase especfica, o que provoca uma reduo da atividade. A sada do ligando e a fosforilao faz voltar o recetor ao estado basal [84].

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Figura 13 - Modelo hipottico da ativao e dessensibilizao dos recetores NPR-A e B. Adaptado de [84].

1.5.2. Protena cinase G

Atravs da produo do cGMP, a sGC e a pGC exercerem muitos efeitos fisiolgicos como mediador da motilidade e do tnus do msculo liso vascular. Para fazer isto, o cGMP atua em efectores diretos tais como a famlia de protenas cinases dependentes do cGMP ou PKG (protena cinase G). A PKG fosforila um nmero importante de alvos biolgicos e est implicada na regulao da relaxao do msculo liso, funo plaquetria, diviso celular e sntese de cidos nucleicos [84]. A PKG uma cinase de serina/treonina e um composta por um domnio N-terminal, um domnio regulatrio e um domnio cataltico. O domnio regulatrio contm dois stios de ligao ao cGMP e quando esto os dois ocupados ocorre uma alterao conformacional e deixa de haver a inibio da PKG no centro cataltico o que permite a fosforilao do resduo de serina/ treonina e uma autofosforilaao no N-terminal, o que vai provocar a sua ativao. Uma vez ativa a PKG pode atuar em muitos substratos, incluindo o recetor de IP3, a phospholamban, e as subunidades da fosfatase da cadeia leve da miosina. Existem duas isoformas desta enzima, a tipo I (PKG1) e a tipo II (PKG2), que derivam de genes diferentes (prkg1 e prkg2) com diferenas a nvel do domnio regulatrio. A isoforma PKG1 (PKG1 e a PKG1) citoslica e a PKG2 membranar e no se encontra expressa nas SMC [78, 84, 86]. O cGMP permite a reduo da concentrao intracelular de clcio atravs da ativao da PKG, pois esta sabe-se que fosforila protenas alvo (tais como, canais inicos, bombas inicas, recetores e enzimas) levando diminuio das concentraes de clcio e portanto ao relaxamento do msculo liso.

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Mltiplos mecanismos tm sido propostos para explicar o papel da PKG na reduo do clcio (figura 15) [87]. 1. Fosforilao da fosfolipase C ativada pela protena G que depois inibe a atividade desta enzima, reduzindo assim a produo de IP3 e a mobilizao de clcio [88]. 2. A sinalizao NO/cGMP/PKG1 promove o aumento da sequestrao e diminuio da libertao de clcio como resultado da fosforilao do IRAG/recetor de IP3 [89]. 3. A fosforilao/ativao dos canais BKCa promove a abertura dos canais, deste modo h uma perda de potssio intracelular, hiperpolarizao da membrana e diminuio do influxo de clcio atravs dos L-VOCC [90]. 4. A fosforilao de phospholamban promove o seu efeito inibitrio na bomba clcio/ATPase e assim causa um aumento da sequestrao de clcio [91]. 5. A fosforilao da fosfatase da cadeia leve da miosina promove a relaxao do msculo liso [87].

Figura 14 - Papel da PKG1 na modulao do nvel do clcio intracelular na promoo da relaxao do msculo liso. Adaptado de [87].

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1.6. Andrognios
1.6.1. Generalidades
Os andrognios do corpo humano incluem a testosterona (Tes), a di-hidrotestosterona (DHT), a androstenediona e a dehidroepiandrosterona (DHEA) e seu sulfato DHEAS. A maior parte da Tes secretada pelos testculos e aproximadamente 5% da Tes presente no soro produzido nos homens sofre uma reduo atravs da 5-reductase, para formar o andrognio mais potente, o DHT. O DHT tem trs vezes mais afinidade com o recetor de andrognios (AR) que a Tes. O DHEA e o DHEAS, so os esteroides adrenais mais abundantes nos humanos, e so percursores da produo intracelular de andrognios e estrognios nos tecidos no reprodutores (figura 15) [92]. A Tes o principal andrognio da circulao sangunea, e responsvel pelo desenvolvimento e manuteno das caratersticas sexuais masculinas [93]. Mais de 95% da Tes em circulao nos homens sintetizada a partir do colesterol proveniente dos steres de colesterol armazenados na matriz intracelular ou nas lipoprotenas de baixa densidade (LDL) [93, 94]. A sntese de Tes nos homens ocorre predominantemente nas clulas de Leydig dos testculos sob estimulao da hormona luteinizante (LH). A LH, por sua vez, est sob o controlo positivo dos nveis da hormona libertadora (GnRH) que libertada pelo hipotlamo episodicamente, controlando a secreo de hormona luteinizante, e a Tes, por sua vez, exerce um feed-back negativo, inibindo a secreo de GnRH [92, 95]. A maior parte da Tes circulante, aproximadamente 98%, est ligada s protenas, dentro das quais, 44% circulam ligadas globulina que se liga a esteroides sexuais (SHBG) e 54% ligam-se albumina e a outras protenas enquanto os restantes 2% a Tes livre [94]. A ligao da Tes albumina e a Tes livre referida como a quantidade biodisponvel, enquanto que a que se liga SHBG serve como uma forma de armazenamento ou transporte [92, 93, 95]. Quanto ao nvel de Tes no soro, nos homens os nveis mais elevados so observados no incio da manh e vo diminuindo at noite. A concentrao da Tes diria no plasma varia entre 3,1 ng/mL e 8,4 ng/mL [93, 96]. A sntese de andrognios e estrognios tambm pode ser feita na placenta desempenhando um papel importante durante a gravidez. Sugere-se que o complexo hormona-recetor pode estar envolvido no mecanismo da programao das condies fisiolgicas, ou patolgicas, normais na vida extra-uterinas. A concentrao de DHEA e de 16alfa-DHEA e dos sulfatos correspondentes maior na HUA do que na veia umbilical humana, indicando que estes andrognios so produzidos principalmente no compartimento fetal. A maioria dos andrognios produzidos pelo feto posteriormente convertida em estrognios na placenta. Contudo, a Tes biossintetizada no testculo do feto, usando a progesterona e a pregnenolona como percursores, sendo a Tes determinante na diferenciao do mesmo [97].

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Figura 15 Mecanismo da formao da di-hidrotestosterona, um potente metabolito da testosterona [98]

A ao dos andrognios iniciada quando estes se ligam ao recetor de andrognios (AR). Este recetor AR distribui-se amplamente pelo sistema cardiovascular, um membro da superfamlia de recetores nucleares e os efeitos dos andrognios so mediados pela ativao do mesmo. A Tes e o DHT ligam-se a este recetor e produzem efeitos fisiolgicos na massa e fora muscular, densidade ssea, funo metablica, humor e cognio (figura 16) [93, 94, 99]. As aes biolgicas dos andrognios via regulao transcricional dos genes alvo pelo AR so referidas como efeitos genmicos. Inicialmente, o andrognio entra na clula e liga-se ao AR, esta ligao provoca a dimerizao do recetor agindo o dmero como fator de transcrio que se liga a sequncias especificas do DNA (androgen Responde Elements) e deste modo regula a expresso de genes-alvo (figura 16) [92-94, 100, 101]. Para alm dos efeitos genmicos dos esteroides, a Tes pode tambm exercer efeitos no genmicos de ao mais rpida, pela ligao da Tes a recetores de esteroides na membrana plasmtica o que leva ao bloqueio dos canais L-VOCC e abertura dos canais BKCa e Kv e tambm a induo rpida das cascatas de transduo de sinal dos segundos mensageiros incluindo a regulao da concentrao de clcio citoslico, a ativao da protena cinase A, da protena cinase C e das MAPKcinases [100-102].

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Figura 16 Efeitos no genmicos (esquerda) e efeitos genmicos (direita) dos andrognios. ARE elementos de resposta aos andrognios (androgen response elements). Adaptado de [103]

1.6.2. Mecanismo vasodilatador da testosterona

Nos ltimos anos, o sistema cardiovascular tem sido um alvo importante para andrognios. A Tes, considerada um esteroide vasoativo, e em estudos in vivo e in vitro em animais e humanos tem sido mostrado que a Tes provoca a relaxao dos vasos [101, 104, 105]. Controversamente, alguns estudos demonstraram tambm que a Tes pode produzir efeitos antirelaxantes, em particular no tratamento a longo prazo com doses elevadas de andrognios. No entanto, a maioria dos estudos disponveis tm mostrado consistentemente um efeito vasodilatador da Tes [106]. importante tambm realar que o efeito vasodilatador no exclusivo da Tes, outros andrognios como o DHT tambm so capazes de induzir a relaxao de vasos, como na aorta torcica de rato e na artria umbilical humana [100, 107], mas ao que parecem so mais sensveis ao vasorelaxamento induzido pela DHT. No entanto, os mecanismos atravs dos quais a Tes e o DHT modulam o tnus vascular so objeto de interesse recente. Esses mecanismos vo ser descritos mais abaixo [106].

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Efeito no endotlio vascular

Diversos estudos estabeleceram claramente que os andrognios induzem um vasorelaxamento com um efeito rpido, no genmico na parede vascular [108]. Alm disso, importante assinalar que vrios estudos tm demonstrado que as altas concentraes farmacolgicas de Tes (10-100 M) induzem a vasodilatao nos vasos sem endotlio, sugerindo um mecanismo independente do endotlio. Em contraste, outros estudos demonstraram que o relaxamento vascular induzido por concentraes fisiolgicas (100 pM10 M) de Tes e inibido significativamente pela remoo do endotlio. Deste modo, estes dados sugerem a presena de um mecanismo dependente do endotlio com concentraes fisiolgicas de Tes (11-36 nmol/l). Esta possibilidade apoiada por estudos in vivo, que demonstraram que a vasodilatao induzida pela Tes em artrias coronrias sistmicas de ces e sunos, dependente de xido ntrico (NO) [108]. O NO um potente vasodilatador que pode sintetizado pela sintetase do xido ntrico (NOS) e libertado pelo endotlio vascular, entre outros tecidos. A sntese de NO aumenta em resposta a concentraes fisiolgicas de Tes pela ativao da via no genmica afirmando que a Tes aumenta a produo do NO e estimula a sua sntese, provocando o aumento da formao de cGMP e induzir a relaxao das clulas do msculo liso vascular. Por outro lado, Yue et al. (1995) examinaram artrias coronrias de coelhos com e sem endotlio. Yue et al. (1995) expuseram as artrias prostaglandina para contrair a tnica mdia. Depois de 7 minutos, as artrias foram lavadas e expostas Tes ou numa soluo de controlo. A percentagem de relaxamento e a concentrao da Tes foi determinada e foi observado um aumento. A significncia estatstica foi observada, e no houve diferena entre os grupos com e sem endotlio. Isto sugere que a Tes tem um efeito relaxante direto no msculo liso e no necessita do endotlio para induzir vasodilatao [101, 108-110]. Deenadayalu et al. (2001) fizeram um estudo parecido usando artrias coronrias de sunos, onde foi usada a prostaglandina como agente contrtil. Comprovaram que a Tes tem um efeito vasodilatador e a remoo do endotlio no influenciou o resultado [111]. Jones et al. (2005) observaram igualmente em artrias e aortas de ratos que no havia diferena na relaxao com Tes em vasos com ou sem endotlio. Em sntese, podemos afirmar que alguns estudos demonstram uma interao entre o efeito da Tes e o endotlio, mas visvel que o efeito vasodilatador da Tes principalmente devido a uma ao direta no msculo liso vascular [112].

Modulao dos canais inicos

Diversos estudos demonstraram que o mecanismo fundamental subjacente ao vasodilatadora da Tes est associado com a modulao dos canais inicos influenciando tanto a abertura dos canais de potssio e/ou a inativao dos canais de clcio [101, 108].

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Ativao dos canais de potssio

Vrios estudos realizados em animais sugerem que a vasodilatao induzida pela Tes mediada predominantemente via canais de K + em artrias mesentricas de rato [113], artrias coronrias de coelho [109], e na aorta de ratos [114]. Num estudo usando o patch-clamp, Deenadayalu et al. (2001) demonstraram, atravs de experincias em SMC de artrias coronrias de suno, que a vasodilatao provocada pela Tes devido ativao dos canais BKCa [111]. Noutro estudo Seyrek et al. (2011), observou e concluiu que a Tes estimula os canais Kv e BKCa em veias de grande condutncia e os canais K ATP em artria e veias de pequena resistncia [115]. Contrariamente Ding e Stallone (2001) observaram que o efeito da Tes exclusivamente devido ativao dos Kv, no estando envolvidos os canais KATP e os BKCa [114]. O efeito vasodilatador da Tes nas HUA, pr-contradas com serotonina ou histamina ou cloreto de potssio, foi parcialmente mediado pela ativao de ambos os canais de potssio, Kv e BKCa [14]. Estudos realizados pelo nosso grupo em HUASMC foi observado que a atividade dos KATP insignificante, e existe uma maior atividade dos canais BKCa e Kv [53]. As investigaes sobre os efeitos dos andrgenos nos canais inicos tambm so relevantes para a compreenso do seu papel em algumas doenas cardiovasculares, como por exemplo na HT [100]. Neste sentido, Amberg et al. demonstraram que, em ratos hipertensos, verificou-se uma diminuio da expresso dos canais BKCa a nvel vascular. Outros demonstraram que, em artrias de ratos hipertensos h pouca funcionalidade dos canais K V e/ou uma maior atividade dos canais de BK Ca [116]. No entanto Saldanha et al (2012), demonstraram que a longo prazo (durante 24h) os efeitos dos andrognios envolvem mudanas na expresso dos canais BKCa e modificaes no envolvimento dos canais K V nos mecanismos subjacentes vasodilatao induzida pela Tes. Estas observaes sugerem que os andrgenos podem ser benficos na preveno da hipertenso arterial pois, tm efeitos vasodilatadores diretos, e efeitos genmicos que aumentam a expresso dos canais BKCa e dos Kv como mediadores da vasodilatao [100].

Bloqueio dos canais de Clcio

Em relao aos canais de clcio, vrios estudos tm sugerido que a Tes inibe principalmente os elementos dependentes de clcio intervenientes nada contrao vascular, atravs da inibio dos L-VOCC para induzir os efeitos vasodilatadores da Tes [117]. Scragg et al.(2004) demonstraram que a resposta vasodilatadora Tes ocorre seletivamente atravs da inibio dos L-VOCC em clulas embrionrias de rim transfetadas com a subunidade 1-C, que forma o poro dos L-VOCC e em clulas SMC vasculares de A7r5 de rato que expressam estavelmente o canal dos L-VOCC [118]. Atravs de clulas da aorta de rato, Montano et al. (2008) demonstraram, que, a vasodilatao induzida pela 5-DHT pode ser devido ao seu bloqueio seletivo nos L-VOCC atuando como um puro antagonista em concentraes que vo de nM a M. Em contraste, a Tes pode assumir diferentes locais de ao dependendo do intervalo de concentrao utilizada. A Tes pode ser antagonista (baixas concentraes, nM) ou agonista (altas concentraes, M) dos L-VOCC. Com este estudo tambm se pode observar

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que concentraes elevadas da Tes aumentam os nveis de cAMP, podendo assim dever-se ativao da PKA [106]. Em relao artria umbilical humana, Perusquia et al.(2007) sugeriram que a Tes provocava relaxao da HUA pr-contrada com KCl e com 5-HT devido inibio direta dos VOCC e no atravs da ativao de vias de sinalizao intracelulares, e demonstrou tambm que elevados nveis de outros andrognios fetais no plasma, como DHEA, podem induzir um efeito relaxante significativo. Podendo concluir que nveis baixos destes andrognios podem ser a causa de muitas doenas da gravidez como a pr-eclampsia [107]. Saldanha et al. (2012) testaram a longo prazo o efeito do DHT nas HUASMC, e demonstraram que o DHT diminui a expresso dos L-VOCC mais especificamente da subunidade 1 [100].

Envolvimento do cGMP e da PKG no vasorelaxamento induzido pela testosterona

Para explicar alguns dos efeitos rpidos no genmicos da Tes, o envolvimento de algumas vias de sinalizao tm sido propostos. Deenadayalu et al. (2001) sugeriram que a ativao dos canais BKCa pela Tes pode estar associada com o aumento dos nveis intracelulares do cGMP [111]. Os dadores de NO e o ANP so potentes vasodilatadores e atuam atravs do aumento intracelular dos nveis de cGMP, resultando na ativao da PKG. Estudos recentes demonstraram que a produo do cGMP pela guanilato ciclase membranar (GC particulado) regula preferencialmente os alvos localizados na membrana plasmtica, como os canais inicos, provavelmente devido ao localizada dependente da PKG [119]. Cairro et al. (2008) mostraram que na HUA a Tes e o ANP, estimulam a atividade dos canais BKCa e dos Kv devido ao da PKG. Sugerem ainda que a Tes aumenta os nveis de cGMP ativando a pGC diretamente ou indiretamente por um mecanismo ainda desconhecido [14].

Figura 17 - Mecanismo rpido da Testosterona nas clulas musculares lisas da artria umbilical humana [120]

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Assim como mecanismo geral no-genmico, foi estudado que a Tes ativa a guanilato ciclase membranar e consequentemente aumenta o cGMP, que ativa a protena cinase G (PKG) e finalmente estimula os canais Kv e BKCa nas SMC da HUA [14, 53, 100, 101, 121, 122].

1.6.3. Andrognios e as Doenas Cardiovasculares

Globalmente, as doenas cardiovasculares (CVD) so a maior causa de mortalidade. As diferenas entre homens e mulheres na incidncia dos problemas cardiovasculares ainda no foi devidamente explicada [123]. O foco tem sido largamente os estrognios, mas nenhuma evidncia conclusiva provou o seu papel na reduo da incidncia da CVD. Na verdade, os resultados dos principais estudos concluram que aps a menopausa a suplementao de estrognio pode ser associada a um aumento do risco de doenas cardiovasculares, em vez de reduzir esse risco [124]. A suplementao de estrognios em homens apresenta resultados claramente piores. Isto gerou mais interesse em identificar qual o papel dos andrognios na doena cardiovascular [95]. Devido elevada prevalncia de algumas doenas cardiovasculares nos homens, a Tes foi inicialmente considerada como prejudicial para o sistema cardiovascular. Nos ltimos anos, diferentes estudos clnicos reverteram esta ideia. De facto, foi observado que a maior parte dos homens com nveis mais baixos de Tes tendem a ter maior incidncia de doenas cardiovasculares, incluindo HT, dislipidemia e doena da artria coronria [14]. No entanto, a interveno com a suplementao de Tes tem sido clinicamente benfico apenas na melhoria do desempenho de pacientes com insuficincia cardaca. Estes dados, embora promissores so escassos neste momento para a recomendao do uso da suplementao de Tes nesses pacientes. No entanto, reconfortante a evidncia de que a suplementao de Tes pode ser usada com inteno teraputica, sem efeitos adversos significativos, apesar das relatadas complicaes idiossincrticas. Os efeitos colaterais relatados em atletas que abusam dos andrognios e esteroides anabolizantes so observados principalmente em doses suprafisiolgicas. Deste modo podemos afirmar que em determinadas patologias a terapia hormonal de substituio uma forma de prevenir e/ou reduzir a severidade da CVD como a HT que ainda hoje atinge um grande nmero de indivduos [14, 92, 110, 125].

1.6.4. Andrognios e a Hipertenso

Pouco se conhece sobre a influncia dos andrognios na patognese da HT. H relatos de que nveis baixos de Tes circulante ocorrem em homens hipertensos. Alguns estudos sugeriram que a diminuio dos nveis de andrognios est associada HT, enfarte do miocrdio e doena arterial coronria. Uma ressalva importante que os nveis de Tes mais baixos observados nos estudos descritos podem simplesmente refletir o aumento do stresse induzido por recente cirurgia, traumatismo craniano etc [126]. Giorgi et al.(1999) mostraram atravs de experincias placebo que o efeito da Tes na presso sangunea pode ser modelado pelo exerccio fsico [127]. Foi estudado tambm que a Tes aumenta os nveis de

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homocsteina, que induz a destruio endotelial e consequentemente o desenvolvimento de aterosclerose. Assim a Tes pode elevar a presso sangunea e contribuir para a patognese da CVD atravs da alterao da homocsteina, endotelina-1 e catecolaminas [126, 128]. Quanto ao tnus vascular Saldanha et al.(2012) observaram que os andrognios podem ser beneficiais na preveno da HT como j foi referido anteriormente pois, tm efeitos vasodilatadores, e tem efeitos genmicos que aumentam a expresso dos canais BKCa e Kv como mediadores da vasodilatao [100]. Quanto aos efeitos dos andrognios nos rins, foram feitos estudo em animais que afirmam que os efeitos anti-mitogenicos da Tes nas SMC vasculares diminui a habilidade dos rins excretarem sal, e assim predispe para a HT [126, 129].

1.7. Patologias da Gravidez

1.7.1. Hipertenso
A hipertenso uma das doenas mais comuns na gravidez e a maior causa de morbidade e morte maternal e perinatal [130]. A hipertenso complica 5% a 10% das gravidezes e inclui vrias desordens como a pr-eclampsia, hipertenso gestacional e hipertenso crnica. Apesar da morbilidade significativa associada aos bebs de grvidas hipertensas, a patognese permanece por esclarecer, o que limita a capacidade de prevenir e tratar esta desordem [131-133]. Numa gravidez normal, existem algumas alteraes no sistema cardiovascular que ocorrem para se adaptar s exigncias da gravidez. Estas adaptaes so caraterizadas por um aumento do volume de sangue, aumento do dbito cardaco, diminuio da presso sangunea, uma diminuio da resistncia aos agentes vasopressores (frmacos cuja ao caraterstica o aumento da presso arterial atravs da vasoconstrio arterial) tais como a norepinefrina e angiotensina II e uma vasodilatao generalizada [134, 135]. A hipertenso na gravidez est associada a um risco aumentado de casos cardiovasculares na vida adulta do feto [135]. A hipertenso definida como um aumento sustentado da presso sangunea a valores de 140mm Hg sistlica ou 90 mm Hg diastlica [136].

Hipertenso gestacional
A hipertenso gestacional define-se como uma elevao significativa da presso arterial durante a segunda metade da gravidez, aps a 20 semana em grvidas que previamente foram dadas como normotensas. Valores superiores a 140/90mmHg e a ausncia de proteinria tambm so caratersticos. A hipertenso gestacional pode ser uma manifestao precoce da pr-eclmpsia, e se a presso arterial permanece elevada aps o parto, pode levar ao diagnstico de hipertenso crnica [131, 132, 134, 136-138].

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Hipertenso crnica
Hipertenso crnica definida com uma presso arterial maior que 140/90 mm Hg e apresenta-se antes da gravidez ou antes da 20 semana de gravidez no quarto ms de gestao. Tambm pode ser considerada hipertenso crnica, o aumento de presso diagnosticado em qualquer fase da gravidez e que persiste alm de seis semanas aps o parto. Tambm considerada hipertenso crnica quando diagnosticada pela primeira vez durante a gravidez e que no se normaliza no ps-parto. O grande problema neste tipo de hipertenso a grande probabilidade de desenvolver pr-eclmpsia, pois os pacientes com hipertenso crnica tm maiores probabilidades de desenvolver esta outra forma de hipertenso que pode complicar a gestao [131, 138].

1.7.2. Pr-eclampsia
uma desordem especfica da gravidez que ocorre entre 3% a 5% das gravidezes. A pr-eclampsia uma doena multissistmica onde existe um mau funcionamento do sistema vascular [131, 132, 135, 139, 140]. A pr-eclampsia caraterizada por hipertenso e proteinuria ( 300 mg/24 horas), reduo do volume do plasma, aumento da resistncia perifrica e vasoconstrio geral. Normalmente desenvolve-se depois de 20 semanas de gestao e normaliza aps a expulso da placenta. A pr-eclmpsia ainda uma das principais causas de morte e morbilidade materna e perinatal [131, 132, 134-142]. A PE caraterizada por uma resposta vascular anormal placentao que est associada a um aumento da resistncia vascular sistmica, aumento da agregao das plaquetas, ativao do sistema de coagulao, e disfuno das clulas endoteliais. As descobertas clnicas sobre a PE podem-se manifestar tanto como um sndrome materno (hipertenso e proteinria, com ou sem outras anomalias multisisitmicas) ou sndrome fetal (restrio do crescimento fetal, lquido amnitico reduzido, e oxigenao anormal). Alguns autores consideram ainda que a preclampsia pode ser caraterizada por edema [131, 136, 140]. Mas hoje em dia este sintoma no mais usado na definio de pr-eclampsia. Este sintoma muito raro aparecer, e por isso sim um sinal de alerta, em que afeta os membros inferiores, mas tambm nas mos e no rosto da me [138]. As duas complicaes mais graves da pr-eclmpsia so (1) a sndrome HELLP onde caraterstica hemlise, enzimas hepticas elevadas e baixas plaquetas, e (2) a pr-eclampsia eclampsia, caraterizada pelo desenvolvimento de convulses. Ambas as condies so raras, mas esto associadas a um prognstico particularmente pobre [131].

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Captulo II Objetivo
Diversos estudos tm discutido a importncia dos andrognios nas doenas cardiovasculares. Estudos recentes do nosso grupo mostraram que a testosterona apresenta efeitos benficos para o sistema cardiovascular, tendo um efeito vasodilatador nas artrias umbilicais humanas. Esse efeito vasodilatador passa por aumentar a concentrao intracelular do cGMP e consequente ativao da PKG que provoca a ativao dos canais de potssio BKCa e Kv. A terapia de substituio hormonal em determinadas patologias uma forma de prevenir e/ou reduzir a severidade de doenas cardiovasculares como hipertenso que ainda hoje atinge grande nmero de indivduos. As sndromes hipertensivas na gravidez so a principal causa de morbidez e mortalidade materna e fetal no mundo desenvolvido. Torna-se assim importante demonstrar o efeito dos andrognios na expresso de diferentes protenas, envolvidas na regulao da contratilidade vascular de artrias umbilicais humanas provenientes de grvidas normotensas (Amostras normais) e provenientes de grvidas hipertensas (amostras com hipertenso). Diferentes objetivos especficos foram definidos para atingir a correta resoluo do objetivo central: 1. Isolamento e cultura de clulas musculares lisas da artria umbilical humana. 2. Pr-incubao com os andrognios a diferentes concentraes 3. Estudos de expresso da sGC, do NPRA e PKG usando o PCR em tempo real.

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Captulo III Materiais e Mtodos

2.1. Preparao do tecido
Os cordes umbilicais procederam de partos vaginais no trmino da gestao realizados pelo Servio de Obstetrcia e Ginecologia do Centro Hospitalar da Cova da Beira. Todos os procedimentos levados a cabo com o cordo umbilical foram aprovados pela Comisso de tica do Centro Hospitalar da Cova da Beira EPE (Covilh, Portugal) em conformidade com a Declarao de Helsnquia. Os cordes umbilicais provenientes de mes com hipertenso gestacional e preclampsia procederam de partos vaginais e cesarianas realizadas pelo Servio de Obstetrcia e Ginecologia do Hospital Sousa Martins (Guarda). Todos os procedimentos destas amostras foram aprovados pelo Comit de tica do Hospital Sousa Martins (Guarda, Portugal) em conformidade com a Declarao de Helsnquia. Os cordes umbilicais foram recolhidos dentro de intervalos de tempo no superiores a 15 minutos, e aps os partos foram imediatamente colocados numa soluo salina fisiolgica estril, PSS constitudo por (mM); NaCl 110; CaCl2 0,15; KCl 5; MgCl2 2; HEPES 10; NaHCO3 10; KH2PO4 0,5; NaH2PO4 0,5; Glucose 10; EDTA 0,49). A fim de evitar contaminaes e a degradao dos tecidos, uma mistura de antibiticos (penicilina 5 U/ml, anfotericina B 12,5 ng/ml , estreptomicina 5g/ml) e antiproteases (leupeptina 0 ,45 m g/l, benzamidina 26 mg/l e inibidor de tripsina 10 mg/l) foi adicionada ao PSS. As amostras foram sempre mantidas a 4C e utilizadas nas 24h-48h seguintes.

2.2. Cultura de clulas

A dissecao do cordo umbilical e cultura celular do mesmo foi obtida usando os procedimentos descritos por Martin et al e por Cairro et al (Cairro et al., 2010; Martin de Llano et al., 2007). A dissecao das artrias do cordo umbilical foi realizada numa cmara de fluxo laminar, sob condies de esterilidade e sobre gelo. Primeiramente o cordo foi lavado com PSS e antibitico para evitar a contaminao. Posteriormente o cordo colocado numa placa de Petri com 35 mL de PSS e 350 l de antibitico e as artrias isoladas por remoo da geleia de Wharton envolvente. Aps o isolamento da HUA, a artria foi seccionada longitudinalmente e os segmentos desta artria foram cortados em retngulos, e posteriormente removida a camada endotelial da tnica ntima (endotlio) com uma leve passagem de um cotonete estril. As artrias sem endotlio foram transferidas para uma nova caixa de petri com 3 ml de PSS e 30 l de antibitico. As camadas de msculo liso vascular foram extradas, usando para o efeito uma pina e um bisturi cirrgico estreis. Posteriormente, recorreu-se lavagem das camadas utilizando 3 ml de PSS sem antibitico, e o mesmo procedimento foi realizado quatro vezes seguidas. As camadas de msculo liso foram

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posteriormente colocadas em frascos de cultura previamente revestidas com colagnio (5 g/cm) e colocadas na incubadora a 37C numa atmosfera de ar de 95% e 5% de CO 2. Aps 1015 min foram adicionados 3 ml de meio de cultura e voltou-se a colocar na incubadora. Depois de 24h neste ambiente, foi adicionado 2ml de meio HUASMC contendo Dulbeccos modified Eagles medium F12 (DMEM-F12) (Sigma-Aldrish), 5% de soro fetal bovino (FBS), fator de crescimento epidrmico (EGF, 100 ng/ml), fator de crescimento de fibroblastos (FGF, 1 g/ml), heparina (2 mg/ml), e insu lina (5 g/ml). O meio de cultura foi mudado a cada 2 dias e as culturas confluentes foram obtidas entre 15-30 dias. Subculturas destas clulas foram obtidas at sexta passagem.

2.3. Tratamento com 5-DHT

As placas de 6 poos com clulas musculares lisas em plena confluncia, foram submetidas ao tratamento com 5-DHT. Inicialmente, aps se verificar plena confluncia em cada poceto, foi colocado meio sem soro. Aps 24h foi colocado o 5-DHT em diferentes concentraes (1nM, 10nM, 100nM, 1000nM) e em poos diferentes. O DHT (Sigma-Aldrich Qumica (Sintra, Portugal)), foi inicialmente dissolvido em etanol para criar uma soluo stock, onde posteriormente foi diludo para as concentraes desejadas usando meio sem soro. Nos pocetos de controlo, foi utilizado o solvente que utilizado na preparao de 5 DHT, sendo este 0,1% de etanol.

2.4. Extrao do RNA total

A extrao do RNA Total (RNAt) foi efetuada utilizando o TRIzol Reagent (Ambion) de acordo com as recomendaes do fabricante. Assim, para extrair o RNAt das clulas musculares lisas adicionou-se 200 L de reagente TRIzol em cada poo (1ml TRIzol/100mg de tecido), que consiste numa soluo monofsica de fenol e guanidina isotiocianato e permite a lise celular, libertando para a soluo o RNA sem que a sua integridade seja comprometida. Aps a adio do Trizol em cada poo (placa de 6) fez-se uma raspagem com um cell scrapper na superfcie da placa para soltar as clulas. Juntou-se o contedo de dois poos em cada eppendorf de 1,5 mL para uma maior quantidade de RNA. Aps incubao durante 5 minutos temperatura ambiente, adicionou-se 80 L de clorofrmio (200 L de clorofrmio/ 1 mL de TRIzol) (VWR) e homogeneizou-se a amostra por inverso. Esta foi posteriormente incubada durante 2-3 minutos temperatura ambiente e posteriormente foi centrifugada a 4 C durante 15 minutos a 12000g, com a finalidade de se obter uma fase aquosa que contm o RNA. Aps a centrifugao, a soluo separou-se em trs fases: no fundo de cada eppendorf obtivemos a fase orgnica (rosa) que contm as protenas e resduos de fenol e clorofrmio, a interfase (branca) onde est presente o DNA e por fim a fase aquosa (transparente), onde est contido o RNA. Esta fase aquosa foi transferida para um novo eppendorf de 1,5 mL, ao qual se adicionou 200 L de isopropanol (500 L de iso propanol/1mL de TRIzol) (VWR). Aps agitao mecnica, para melhor precipitao de RNA, incubou-se 10 minutos temperatura ambiente

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e centrifugou-se posteriormente a 4C a 12000g durante 10 minutos. Aps a centrifugao rejeitou-se o sobrenadante, e o RNA sob forma de um precipitado branco (pellet), lavou-se cerca de duas vezes, onde a cada lavagem se adicionou 400 L de etanol a 75% em gua DEPC a -20C. Agitou-se no vrtex e centrifugou-se a 4C durante 5 minutos a 7500g. Aps a centrifugao fez-se um quick spin e retirou-se o excesso de etanol. Depois de ser incubado temperatura ambiente, durante cerca de 5 minutos, hidratou-se o pellet, em 20L de gua tratada com dietilpirocarbonato (gua DEPC) e arma zenaramse a 80C para uso posterior. De forma a quantificar o RNAt efetuaram-se leituras espetrofotomtricas a 260 e 280nm, utilizando o nanoespetrofotmetro (Nanophotometer
TM

, Implen, Germany).

Este aparelho fornece diretamente a concentrao de RNAt (g/L) e o rcio entre a A260/A280, que determina a qualidade do RNAt com base na absorvncia a 260 nm, comprimento de onda ao qual os cidos nucleicos tm pico de absoro, e a 280 nm, comprimento de onda ao qual as protenas tm pico de absoro. Para determinar uma boa qualidade e pureza de RNAt, o rcio em causa dever estar no intervalo de 1,8 a 2,1. Os rcios inferiores a 1,8 indicam contaminao com protenas ou com fenol e os rcios superiores a 2,1 indicam contaminao com DNA. Para assegurar a pureza do RNAt, reduzindo ao mximo a atividade das ribonucleases (RNases) em todos os passos da extrao foi usado material estril, e todas as solues foram preparadas com gua DEPC e todo o procedimento anterior foi realizado em gelo devido sensibilidade do RNA.

2.5. Sntese de DNA complementar

O cDNA o DNA sintetizado a partir da transcrio reversa do mRNA, por ao da enzima transcriptase reversa, obtendo assim uma cpia exata do gene sem intres. A reao requer o uso de primers, iniciadores de sntese cuja sequncia vai condicionar a especificidade do fragmento amplificado, nucletidos para a sintese DNA (dNTPs), tampo e M-MuLV, todos presentes no kit NZY M-MuLV Reverse Transcriptase (NzyTech, Portugal), seguindo o protocolo do fabricante. Preparamse as misturas com volumes de reagentes para n+1 reaes. Assim, para cada reao de sntese de cDNA de volume final 20 L adicionou -se o volume adequado para 1g de RNA, 2,5 L de Random hexamer mix (0.5 g /L) (NZYset, Portugal), 1 L de dNTPs (10 mM) (NZYset, NzyTech, Portugal) e perfez-se o volume com 17 L com gua estril livre de nucleases. Esta mistura foi incubada a 65C durante 5 minutos, e de seguida arrefecida em gelo. Posteriormente, adicionou-se outra mistura com os seguintes reagente s: 2 L de 10x reaction buffer (nzytech, Portugal), e 1 L de M-MuLV. Seguiu-se uma segunda incubao a 25C durante 10 minutos novamente a 37C durante 60 minutos. Por fim, as amostras foram incubadas a 70C durante 15 minutos e guardou-se o cDNA a 20C.

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2.6. PCR convencional

A expresso dos genes, nomeadamente da sGC, NPRA, e PKG foi analisada atravs da tcnica de PCR convencional (RT-PCR). A mix foi realizada com n+1 reaes e para um volume final de 25 L. Por cada reao adicionou-se 2,5 L de 10x buffer (NZY Taq DNA polymerase, Nzytech, Portugal), 1,5 L de MgCl2 (50 mM) (nzytech, Portugal), 0,625 L de dNTPs (10 mM), 0,1 L de Taq DNA polimerase (5U/l) (NZY Taq DNA polymerase, Nzytech, Portugal), 1,2 L de primer Fw e de primer Rv e 16,875 l de gua estril at um volume total de 24 L. A cada reao foi-lhe adicionado 1 L de cDNA, exceo do negati vo, ao qual se adicionou gua. A amplificao dos genes ocorreu num termociclador TProfessional Basic Gradient (Biometra). Inicialmente as amostras foram colocadas a 95C durante 5 minutos, de seguida estas foram expostas a 30 ciclos onde estiveram a 95C durante 30 segundos para a molcula de DNA desnaturar, depois temperatura tima de emparelhamento de cada primer durante 30 segundos para cada primer se poder ligar molcula de DNA e a 72C durante 30 segundos, onde ocorre a fase de amplificao, e por fim as amostras foram colocadas a 72C durante 5 minutos. Os produtos amplificados foram visualizados por eletroforese em gel de agarose 1% (GRiSP, Portugal) na presena de Green safe (NzyTech, Portugal) e utilizando o marcador NZY DNA Ladder V (nzytech, Portugal).

2.7. PCR em tempo real

A quantificao da expresso dos genes NPR1 , PRKG1, GUCY13, foi efetuada por PCR em tempo real, utilizando o kit Maxima SYBRGreen/Fluorescein qPCR Master Mix (Thermo Scientific), nos dois grupos em estudo (HUASMC provenientes de grvidas normotensas vs HUASMC provenientes de grvidas hipertensas). O gene endgeno usado foi a -actina para normalizar os nveis de expresso (tabela 3). A eficincia do Real Time PCR (iCycler iQTM5, Biorad, Hercules) foi determinada para todos os primers usando diluies de amostras de cDNA (1:1, 1:5, 1:25). As reaes de amplificao dos genes foram preparadas para um volume final de 20 L, para tal adicionou -se 10 l de SYBR green Fluorescein qPCR Master Mix (Thermo Scientific), 1,2 l de Primer Fw e de Primer Rv, 1 l de cDNA e por fim perfez-se com gua estril (Thermo Scientific). As amostras foram expostas s seguintes condies de amplificao: 95C durante 5 minutos, 40 ciclos de 95C durante 10 segundos, temperatura de annealing durante 30 segundos, e 72C durante 10 segundos. A formao de dmeros de primers e a pureza do produto amplificado foram avaliadas atravs da anlise das curvas melting do PCR em tempo real. As diferenas entre experincias foram calculadas usando o modelo matemtico de Pfaffl usando a frmula: 2-Ct [143].

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Tabela 3 - Primers utilizados para PCR em tempo real Nome do primer -actina PKG GC NPRA Gene ACTB PRKG1 GUCY1a3 NPR1 Sequncia do primer Fw 5-CATCCTCACCCTGAAGTACCC-3 Rv 5-GCCTGGATAGCAACGTACATG-3 Fw 5-GGCTGTCAGAGAAGGAGGAAG-3 Rv 5-GGAAGGACCTGTACGTCTGC-3 Fw 5-GATAGCACTGATGGCCCTGAA-3 Rv 5-GTAGTCCAATTCGCATCTTGATAGG-3 Fw 5-GCAAAGGCCGAGTTATCTACATC-3 Rv 5-AACGTAGTCCTCCCCACACAA-3 Fragmento (bp) 314 150 89 98 Temperatura (C) 60 60 60 60 N gene bank NM_001101 NM_001098512.2 NM_ 00130687 NM_000906.3

2.8. Anlise estatstica

Os dados foram expressos como mdias erro padro da mdia das experincias, para cada condio experimental analisada. A anlise estatstica dos dados foi realizada usando o programa estatstico SigmaStat Statistical Analysis System verso 3.5 (Systat Software, London. UK). A significncia estatstica entre as diferentes concentraes e o controlo foi analisada usando a one-way ANOVA seguida do teste Dunnets post hoc. A significncia estatstica entre os dois tipos de amostra foi analisada usando o Stundents t -test. As diferenas entre os grupos foi considerada significativa quando (P <0,05).

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Captulo IV Resultados
A primeira fase deste trabalho foi analisar a expresso de vrias protenas que participam na regulao da contratilidade vascular. Foram anlisados os nveis de expresso do mRNA da sGC, do NPRA e da PKG de HUASMC de cordes umbilicais provenientes de grvidas normotensas e hipertensas. Estas experincias foram realizadas atravs da tcnica de PCR em tempo real. As clulas testadas foram tratadas com diferentes concentraes de 5-DHT (1-1000nM) e as clulas que no foram tratadas com DHT serviram de controlo. A actina foi utilizada como gene de referncia interno para normalizar os nveis de expresso do mRNA dos genes.

4.1. Anlise da expresso do mRNA da sGC

Figura 18 - Efeito da 5-DHT na expresso do mRNA da sGC nas HUASMC de cordes procedentes de grvidas normotensas determinado por PCR em tempo real. As barras representam as mdias da expresso, e as linhas o erro padro. Para a normalizao dos nveis de expresso de mRNA usou-se a actina como gene de referncia interno. * P <0,05 Control versus pr-incubao com DHT (one-way ANOVA com Dunnetts post hoc test).

Relativamente ao nvel de expresso da sGC de HUASMC provenientes de grvidas normotensas, podemos observar que a 5-DHT provocou uma diminuio da expresso nas concentraes de 10 nM e 100 nM (P<0,05).

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Figura 19 - Efeito da 5-DHT na expresso do mRNA da sGC nas HUASMC de cordes procedentes de grvidas hipertensas determinado por PCR em tempo real. As barras representam as mdias da expresso, e as linhas o erro padro. Para a normalizao dos nveis de expresso de mRNA usou-se a actina como gene de referncia interno. * P <0,05 Control versus pr-incubao com DHT (one-way ANOVA com Dunnetts post hoc test).

Em relao expresso da sGC em amostras com hipertenso, podemos observar que a as diferentes concentraes de 5-DHT provocam uma diminuio da expresso de sGC, relativamente ao controlo (0nM).

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Figura 20 - Efeito da 5-DHT na expresso do mRNA da sGC nas HUASMC de cordes procedentes de grvidas normotensas versus cordes procedentes de grvidas hipertensas determinado por PCR em tempo real. As barras representam as mdias da expresso, e as linhas o erro padro. Para a normalizao dos nveis de expresso de mRNA usou-se a -actina como gene de referncia interno. * P <0,05 Amostras provenientes de grvidas normotensas versus amostras provenientes grvidas hipertensas com DHT (students t-test)

Ao compararmos os nveis de expresso entre as HUASMC de cordes umbilicais de situaes de gravidez normais versus cordes de situaes de gravidez com hipertenso observamos que h uma diminuio generalizada da expresso, sendo mais significativa medida que as concentraes de 5-DHT aumentam. Esta diminuio maior em clulas procedentes de situaes de hipertenso, sendo que em presena de 5-DHT a sGC mais expressa em clulas procedentes de grvidas normotensas (figura 21).

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4.2. Anlise da expresso do mRNA do NPRA

Figura 21 - Efeito da 5-DHT na expresso do mRNA do NPRA nas HUASMC de cordes procedentes de grvidas normotensas determinado por PCR em tempo real. As barras representam as mdias da expresso, e as linhas o erro padro. Para a normalizao dos nveis de expresso de mRNA usou-se a actina como gene de referncia interno. * P <0,05 Control versus pr-incubao com DHT (one-way ANOVA com Dunnetts post hoc test).

Relativamente aos nveis de expresso do NPRA, nas HUASMC de cordes procedentes de grvidas normotensas observa-se que a 5-DHT 1nM provoca um aumento significativo da expresso deste gene, contudo nas restantes concentraes analisadas tambm existe um aumento da expresso, embora este no estatisticamente significativo (p>0.05).

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Figura 22 - Efeito da 5-DHT na expresso do mRNA do NPRA nas HUASMC de cordes procedentes de grvidas hipertensas determinado por PCR em tempo real. As barras representam as mdias da expresso, e as linhas o erro padro. Para a normalizao dos nveis de expresso de mRNA usou-se a actina como gene de referncia interno. * P <0,05 Control versus pr-incubao com DHT (one-way ANOVA com Dunnetts post hoc test).

Ao contrrio do grfico anterior (fig.22), nas HUASMC de cordes de mes com hipertenso existe uma diminuio da expresso do NPRA, sendo significativa quando a concentrao de DHT usada foi de 10 nM. No entanto nas restantes concentraes analisadas h tambm uma diminuio da expresso deste gene, mas esta no estatisticamente significativa.

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Figura 23 - Efeito da 5-DHT na expresso do mRNA do NPRA nas HUASMC de cordes procedentes de grvidas normotensas versus cordes provenientes de grvidas hipertensas determinado por PCR em tempo real. As barras representam as mdias da expresso, e as linhas o erro padro. Para a normalizao dos nveis de expresso de mRNA usou-se a -actina como gene de referncia interno. * P <0,05 Amostras provenientes de grvidas normotensas versus amostras provenientes grvidas hipertensas com DHT (students t-test)

Em relao s diferenas entre os dois tipos de amostras, HUASMC provenientes de cordes normais versus cordes com hipertenso, podemos observar que o NPRA mais expresso em amostras normais, sendo que nas HUASMC provenientes de cordes com hipertenso h uma diminuio generalizada da expresso deste gene.

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4.3. Anlise da expresso do mRNA da PKG

Figura 24 - Efeito da 5-DHT na expresso do mRNA da PKG nas HUASMC de cordes procedentes de grvidas normotensas determinado por PCR em tempo real. As barras representam as mdias da expresso, e as linhas o erro padro. Para a normalizao dos nveis de expresso de mRNA usou-se a actina como gene de referncia interno. * P <0,05 Control versus pr-incubao com DHT (one-way ANOVA com Dunnetts post hoc test).

Em relao expresso da PKG, podemos observar que existe um decrscimo significativo da expresso deste gene aps pr-incubao com 10 nM de DHT, sendo que as outras concentraes de DHT utilizadas no provocaram um efeito significativo na expresso de PKG em relao ao controlo em ausncia de DHT.

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Figura 25 - Efeito da 5-DHT na expresso do mRNA da PKG nas HUASMC de cordes procedentes de grvidas hipertensas determinado por PCR em tempo real. As barras representam as mdias da expresso, e as linhas o erro padro. Para a normalizao dos nveis de expresso de mRNA usou-se a actina como gene de referncia interno. * P <0,05 Control versus pr-incubao com DHT (one-way ANOVA com Dunnetts post hoc test).

Relativamente expresso do mRNA da PKG em amostras provenientes de mes hipertensas, observa-se um efeito contrrio ao observado na figura anterior (fig 25), ocorrendo um aumento significativo da expresso a 1nM de DHT. Nas restantes concentraes de DHT analisadas parece no existir qualquer diferena em relao ao controlo.

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Figura 26 - Efeito da 5-DHT na expresso do mRNA da PKG nas HUASMC de cordes procedentes de grvidas normotensas versus cordes provenientes de grvidas hipertensas determinado por PCR em tempo real. As barras representam as mdias da expresso, e as linhas o erro padro. Para a normalizao dos nveis de expresso de mRNA usou-se a -actina como gene de referncia interno. * P <0,05 Amostras provenientes de grvidas normotensas versus amostras provenientes grvidas hipertensas com DHT (students t-test)

Quanto s diferenas entre os dois tipos de amostras, possvel observar que aps preincubao com DHT, a PKG mais expressa em amostras provenientes de mes hipertensas embora o nico efeito significativo foi observado quando se utilizou uma concentrao de 1 nM de DHT.

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Captulo V Discusso
O cordo umbilical uma amostra que frequentemente descartada e pode ser utilizada como fonte de SMC humanas. Alm disso, a utilizao destas amostras para a pesquisa no perigoso nem para a me nem para a sade do recm-nascido [21]. As clulas do msculo liso da artria umbilical humana desempenham um papel importante no controlo do fluxo sanguneo feto placentrio e a utilizao destas clulas essencial para o estudo de vrios processos de sinalizao envolvidos neste controlo [21]. Para iniciar a realizao deste trabalho, foi importante obter clulas musculares lisas que, neste caso, proveem tanto de cordes umbilicais de grvidas normotensas como de cordes umbilicais de grvidas hipertensas. O primeiro passo deste trabalho foi o desenvolvimento de culturas de HUASMC puras, isto , sem contaminaes de clulas endoteliais e/ou de fibroblastos, atravs da remoo mecnica do endotlio e da camada adventcia. Aps serem colocadas durante 24h em meio sem soro, foi necessrio colocar o frmaco para posteriormente ser analisado o efeito do mesmo nas HUASMC em PCR em tempo real. Para tal foram colocadas diferentes concentraes, entre 1nM a 1000nM, consideradas como concentraes fisiolgicas [108]. A razo pela qual foi escolhido o DHT em detrimento da Tes, foi porque a Tes pode ser convertida em estradiol pela aromatase, ao contrrio do que acontece com o DHT que no sofre esta converso. Se tivssemos usado a Tes, uma vez que a aromatase est presente no msculo liso vascular, no poderamos distinguir se o efeito era devido Tes ou ao estradiol [144]. Assim, o uso do DHT foi essencial, pois permitiu obter efeitos exclusivos dos andrognios nas clulas, dado que este no convertido em estradiol. Os efeitos genmicos da DHT envolvem a sua ligao ao recetor de andrognios, que vai levar a formao de um complexo que est envolvido na regulao da transcrio de genes e consequente produo de protenas [101]. Estudos anteriores realizados pelo nosso grupo, mostraram que o mecanismo vasodilatador da testosterona, efeito rpido e no genmico, passa pelo aumento do cGMP, que induz a ativao da PKG e que ativa os canais de potssio [53]. Com o intuito de ver se a induo a longo prazo com a testosterona altera a expresso de alguns genes Saldanha et al. (2012) observaram em conjunto e separadamente, os efeitos a longo e a curto prazo dos andrognios. Os resultados indicaram que a longo prazo os andrognios modificam a expresso das protenas envolvidas na regulao da contratilidade vascular como os canais L-VOCC e de os canais de potssio. A incubao com DHT durante 24h (efeito a longo-prazo) diminuiu a expresso da subunidade alfa1C dos L-VOCC e aumentou a expresso da subunidade beta-1 dos canais BKCa nas HUA. Os efeitos a longo prazo modificaram a rpida relaxao induzida pela testosterona na presena de nidepdipina, um inibidor dos L-VOCC, uma vez que h um equilbrio entre os efeitos a longo prazo e os efeito a curto prazo. Do mesmo modo, os efeitos

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a longo prazo no modificaram o grau de vasodilatao induzido pela aplicao da Tes. Neste sentido os efeitos vasodilatadores rpidos da Tes que dependente da atividade dos canais BKca e KV nas artrias de controlo, tornou-se dependente somente dos canais Kv em artrias tratadas com DHT. Deste modo, concluram que os genes do mecanismo a longo prazo alteravam os genes do mecanismo a curto prazo da testosterona [100]. Do mesmo modo, fomos observar se os andrognios provocavam a longo prazo diferenas a nvel da expresso da sGC, NPRA e PKG em HUASMC de grvidas normotensas e grvidas com HT.

5.1. Expresso da sGC

Inicialmente foi analisado o nvel de expresso da sGC em HUASMC de cordes provenientes de grvidas sem patologia. A incubao com DHT diminuiu a expresso da sGC (a 10nM e 100 nM), em comparao com as clulas no tratadas. Indicando assim que os andrognios diminuem a expresso da sGC em HUASMC normais. Estes resultados esto de acordo com os obtidos anteriormente por Liu et al. (2013), que observaram em tecidos benignos da prstata de ratos, que a expresso do sGC foi significativamente inibida quando tratada com testosterona (3mg/Kg/dia) [145]. No entanto dados obtidos em clulas cancergenas provenientes da prstata de ratinhos contrariam esta hiptese. Cai et al. (2006) mostraram que nessas clulas os andrognios estimulam a expresso da sGC [147]. Assim, os resultados obtidos por este autor so opostos aos descritos no presente trabalho em clulas nusculares lisas de HUA. Quanto expresso da sGC em HUASMC de cordes provenientes de grvidas com HT, observamos que houve uma diminuio significativa independente da concentrao de DHT usada. No entanto, Oka et al. (2007) ao tratarem com DHEA as artrias de ratinhos com hipertenso pulmonar, observaram que ocorria uma sobreregulao da atividade da sGC [148], sendo estes dados contrrios aos obtidos no presente trabalho. Esta discrepncia talvez seja devido espcie em anlise, ratinhos num caso e humanos no outro. Quando comparamos os efeitos dos andrognios a longo prazo entre os dois tipos de amostras em anlise, observamos que no h diferenas significativas em ausncia de DHT (0 nM de DHT). Diversos autores analisaram a expresso da sGC na HT. Dumitrasco et al. (2006) observaram que em ratinhos com hipertenso pulmonar h um aumento da expresso da sGC, comparando com ratinhos normotensos, podendo ser este um alvo teraputico para a cura desta doena [149]. O mesmo aconteceu com Schermuly et al. (2008) em que nas SMC de ratinhos com hipertenso pulmonar, observaram igualmente uma sobreregulao da sGC [150]. Pelo contrrio, Ruetten et al. (1999) concluiu que os nveis de mRNA da sGC e a expresso da protena na aorta de ratinhos com hipertenso sofrem uma grande reduo em comparao com os ratinhos sem patologia [76]. Neste sentido os dados obtidos neste trabalho esto discordantes com os apresentados por estes autores pois em HUASMC no foram observadas diferenas entre o controlo de grvidas normotensas versus grvidas hipertensas.

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No entanto quando as HUASMC dos dois tipos de amostra so pr-encubadas com DHT, observado uma expresso menor da sGC em amostras com HT. Em suma, os efeitos a longo prazo dos andrognios alteram a expresso da sGC. Nas SMC provenientes de mes normotensas h uma pequena diminuio da expresso da sGC quando tratada com DHT, em comparao com o controlo. No entanto nas amostras com HT, o DHT provoca uma diminuio da expresso maior que nas HUASMC normais. Podemos concluir que o DHT em clulas com HT diminui significativamente a expresso da sGC.

5.2. Expresso do NPRA

Em relao expresso do NPRA, os nossos resultados indicam que existe um aumento da expresso do NPRA em amostras normais tratadas com DHT, sendo apenas significativa na concentrao de 1nM de DHT. Relativamente s amostras com HT, o DHT provoca uma diminuio da expresso do NPRA . Quando comparamos os efeitos dos andrognios a longo prazo entre os dois tipos de amostras em anlise, observamos que em ausncia de DHT no foram observadas diferenas significativas. Em presena de diferentes concentraes de DHT, observa-se um aumento da expresso do NPRA em amostras normais e uma diminuio da expresso nas amostras procedentes de grvidas com HT. Contudo diversos estudos usando amostras procedentes de animais hipertensos afirmaram que a pouca expresso do NPRA leva hipertenso [151-153]. Oliver et al. (1998) para observar se as diferenas na expresso do NPRA afetavam a presso sangunea, criaram ratinhos com diferentes cpias do gene NPR1. Os resultados mostraram que quando h baixa expresso do gene NPR1, existe um aumento da presso sangunea [154]. Kapasi et al. (1996) examinaram a expresso do NPRA em ratinhos normotensos e em ratinhos hipertensos e concluram que os normotensos tinham uma expresso maior do NPRA [155]. Neste sentido ambos os estudos mostraram que em amostras procedentes de hipertensos existe uma diminuio da expresso do NPRA. Em suma, a expresso do NPRA significativa a todas as concentraes de DHT e maior em clulas normais, ao contrrio do que acontece com clulas com HT, onde a sua expresso bastante reduzida.

5.3. Expresso da PKG

O nosso grupo de investigao observou que na vasodilatao a curto prazo induzida pela testosterona participa a PKG. No entanto apenas foi observado o mecanismo a curto prazo e em HUASMC provenientes de grvidas normotensas [53]. Nas clulas normais pr-incubadas com DHT observou-se um decrscimo da expresso da PKG. Andric et al. (2010) atravs de clulas Leydig de ratos normais e ratos com

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hipogonadotrofia observaram o efeito da testosterona nestas clulas. Atravs de PCR em tempo real observaram que a expresso de PRKG1 estava diminuda em ratos normais [156]. Do mesmo modo Muller et al. (2011) observaram que em ratinhos sem as clulas de leydig, que os nveis de expresso da PKG aumentam [157]. Concluindo assim que em amostras normais sem patologia a incubao com andrognios diminui a expresso da PKG estando de acordo com os nossos resultados. Relativamente ao efeito do DHT na expresso da PKG em amostras procedentes de mes hipertensas, observamos que h um aumento da expresso em comparao com o controlo em ausncia de DHT. Quando comparamos os efeitos dos andrognios a longo prazo entre os dois tipos de amostras em anlise, observamos que apenas na concentrao de 1nM de DHT se observa, um aumento da expresso do PKG em amostras procedentes de mes com HT. Em suma, o DHT diminui a expresso da PKG em amostras normais, e aumenta a sua expresso em amostras com HT. No entanto esse efeito apenas significativo a 1 nM de DHT.

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Captulo VI - Concluses e Perspetivas Futuras

Com a realizao deste trabalho foi possvel demonstram que o DHT modula a expresso da sGC, do NPRA e da PKG nas clulas do msculo liso vascular humano, o que contribuiu para um conhecimento mais profundo do efeito dos andrognios a nvel fisiolgico, assim como o seu possvel envolvimento em doenas cardiovasculares, nomeadamente na hipertenso gestacional. Deste modo, foi demonstrado que: Os efeitos a longo prazo do DHT vo alterar a expresso de protenas contrteis que participam no mecanismo rpido dos andrognios Os andrognios em amostras com HT provocam uma diminuio da expresso da sGC, da NPRA e um aumento da expresso da PKG. Nas amostras normais os andrognios provocam uma diminuio da expresso da sGC e da PKG, e um aumento na expresso do NPRA. A concretizao deste trabalho pode permitir o desenvolvimento de teraputicas mais especficas no tratamento e preveno da hipertenso gestacional. Contudo, ainda necessrio realizar um maior nmero de amostras para conseguir obter significncia estatstica em alguns dos dados obtidos. Ainda existe um longo caminho a percorrer, uma vez que ainda falta determinar vrios passos envolvidos no mecanismo destas patologias. Para experincias futuras seria importante fazer um estudo de outras protenas contrteis envolvidas no mecanismo de ao dos andrognios e tambm analisar a concentrao de testosterona no cordo, para averiguar se existe um aumento ou no dos andrognios.

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Captulo VII - Bibliografia

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