TEMA 11.

- CINTICA ENZIMTICA
Introduccin: Cintica enzimtica.
Ecuacin de Michaelis-Menten. Ecuacin de Lineweaver-Burk.

Reacciones con mltiples substratos. Inhibicin enzimtica: - Reversible

Competitiva. No competitiva. Acompetitiva. - Irreversible. Ejemplos de inhibidores irreversibles

Introduccin. Cintica enzimtica

La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.
Perfil cintico de un enzima micaeliana Perfil cintico de un enzima alostrico

Modelo Cintico de Michaelis-Menten

Las reacciones catalizadas enzimticamente ocurren en dos etapas: Primera etapa, se forma el complejo enzima-sustrato. Segunda etapa, el complejo enzima-sustrato se transforma en el producto, liberando el enzima.

V1 = k1 [E] [S] V2 = k2 [ES] V3 = k3 [ES] En equilibrio la V de formacin de ES es igual a la velocidad de descomposicin. V1 = V2 + V3

k1[S] [E] = (k2 + k3 )[ES] [E] = [ET] - [ES]

donde la expresin (k2+ k3)/k1 se ha sustitudo por KM, o constante de Michaelis-Menten

Modelo Cintico de Michaelis-Menten

La velocidad de reaccin = la velocidad de formacin del producto: v = v3 = k3 [ES] =

La velocidad mxima (Vmax) se obtiene cuando el enzima est saturada por el S. Vmax = k3 [ET] Si introducimos el parmetro Vmax en la ecuacin general de la velocidad obtenemos la expresin ms conocida de la ecuacin de Michaelis-Menten:

Modelo Cintico de Michaelis-Menten

La representacin grfica de la ecuacin de Michaelis-Menten (v frente a [S]) es una hiprbola

es la concentracin de sustrato para la cual la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. En efecto, si KM = [S], la ecuacin de Michaelis-Menten se reduce a: v = Vmax/2. El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad.

KM

Representacin de Lineweaver-Burk
Para determinar grficamente los valores de KM y Vmax es ms sencillo utilizar la representacin doble recproca (1/v frente a 1/[S]), ya que es una lnea recta. Esta representacin doble recproca recibe el nombre de representacin de Lineweaver-Burk

v =

Vmax [S] Km + [S]

1 v
1 Vmax -1 Km

KM/Vmax

1 = v

[ ]
Vmax

Km

1 + 1 Vmax [S]

y= m. x + b
pendiente es KM/Vmax abscisa en el origen es -1/KM ordenada en el origen es 1/Vmax

1 [S]

A partir de los datos experimentales se puede calcular grficamente, los valores de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

Reacciones con mltiples substratos

a) Reaccin enzimtica con formacin de un complejo ternario (ES1S2)
a.1. Unin aleatoria de los S

a.2. Unin ordenada de los S

b) Reaccin enzimtica en la que no se forma de un complejo ternario

Mecanismo ping pong

Inhibicin Enzimtica
Inhibidor: Efector que se une al enzima y hace disminuir su actividad,
mediante interacciones con el centro activo u otros centros especficos.
Se excluyen todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a travs de desnaturalizacin de la molcula enzimtica.

Dos tipos de inhibidores: * Inhibidores reversibles: establece un equilibrio con la enzima libre,
con el complejo enzima-substrato, o con ambos.

- COMPETITIVOS: El inhibidor se fija al centro activo de

la enzima libre, impidiendo la fijacin del sustrato. - NO COMPETITIVOS: El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el sustrato. No impide la fijacin del sustrato a la enzima, pero s la accin cataltica. - ACOMPETITIVOS: El inhibidor se fija nicamente al complejo enzima-sustrato una vez formado, impidiendo la accin cataltica

* Inhibidores irreversibles: modifican qumicamente a la enzima mediante

uniones covalentes.

Inhibicin Enzimtica

Inhibicin reversible

Inhibicin competitiva

S E I EI
Se define una constante de equilibrio de disociacin del inhibidor

ES

E + P
[E] [I] [EI]

Ki =

Caractersticas:
-Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente excluyentes. - A muy altas concentraciones de sustrato desaparece la inhibicin. - Por lo general, el inhibidor competitivo es un anlogo estructural del sustrato. - El inhibidor es tan especfico como el sustrato.

Inhibicin Enzimtica

Inhibicin reversible Vmax [S]

Inhibicin competitiva

v= Representacin directa Km Inhibicin competitiva

[ ]
Ki

1+[I] + [S]

100

Sin Inhibidor
80

60

40

Km= Km (1+[I]/Ki)
Con Inhibidor

20

0 0 20 40 60 80 100 120

120

Inhibicin Enzimtica

Inhibicin competitiva - Representacin recproca doble

1/v

0.07

0.06

0.05

0.04

0.03

1/Vmax

-1/Km

0.02

0.01

1/s
0.00 -0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

-1/(Km(1 + i/Ki))

Inhibicin Enzimtica

Ejemplo de inhibicin competitiva

COOCH2 CH2 COOSuccinato

FAD

FADH2

COOCH CH COOFumarato

SDH Succinato deshidrogenasa

COOInhibidores competitivos

COOC O CH2 COO-

CH2 COOMalonato

Oxalacetato

Inhibicin Enzimtica

Inhibicin reversible

Inhibicin no competitiva

S E I S EI
Caractersticas:
- El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre (E) y al complejo enzima-sustrato (ES) - Ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos

ES I ESI

E + P

Inhibicin Enzimtica

Inhibicin reversible

Inhibicin no competitiva

Vmax < Vmax Vmax = Vmax /(1+[I]/Ki)

V =

Vmax . [S] Km . (1+[I]/Ki) + [S] . (1+[I]/Ki)

Vmax= Vmax/(1+[I]/Ki)

Inhibicin Enzimtica

Inhibicin reversible

Inhibicin acompetitiva o mixta

- El I slo se une al complejo ES y en

un sitio distinto al que se fija el S en el centro activo

- Baja la Km y Vmax, pero el cociente Km/Vmax no se altera. -Ocurre en reacciones multisustratos

El lugar de unin del I se crea tras la unin del S al E

Inhibicin Enzimtica

Inhibicin reversible

Inhibicin acompetitiva o mixta

Inhibicin acompetitiva

Inhibicin Enzimtica

Inhibicin Irreversible
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo qumico de la enzima, modificndola covalentemente

E + I

- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente txicos. - Una clase especial de inhibidores irreversibles son los Inhibidores suicidas:
Son poco reactivos hasta que se unen al centro activo del enzima, donde se transforman en un compuesto muy reactivo, inactivando irreversiblemente al enzima.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles:

1. Reactivos de grupos -SH 2. Organofosforados 3. Ligandos de metales 4. Metales pesados

Inhibicin Enzimtica

Ejemplos de inhibidores irreversibles Compuestos organofosforados

Ser CH CH2

OH
Ser CH CH2

H3C

CH3 CH

O P O CH H3C CH3

H3C

Diisopropil fluorofosfato (DFP)

CH3 CH P O

CH H3C CH3

Malation

- Actan sobre enzimas sernicas (serin proteasas, acetil colinesterasa...), unindose covalentemente a travs del grupo fosfato. Ejemplos: DFP, Insecticidas (Paration, Malation) Gases de guerra (Sarn), gas mostaza.

Inhibicin Enzimtica

Ejemplos de inhibidores irreversibles

In cianuro, CN-: Se fija con gran afinidad a la sexta posicin de
coordinacin del Fe hemnico del complejo citocromo oxidasa.

Penicilinas. Inhiben enzimas sernicas que participan

en la formacin de la pared bacteriana.

Inhibicin Enzimtica

Inhibidor suicida

(Inhibidores activados enzimticamente)

- Se trata de molculas que se unen al centro activo de manera especfica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos - Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molcula en una especie qumica muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivndola - Tienen por tanto la especificidad del inhibidor competitivo y la potencia de los inhibidores irreversibles

Modo de accin de los inhibidores suicidas

E + I
1.

EI

EI*

E + I*

El inhibidor se fija a la enzima igual que el sustrato o un inhibidor competitivo convencional.

2. La accin cataltica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I*. 3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivndola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

Inhibicin Enzimtica

Ejemplo de inhibidores suicidas

Sistema de la -lactamasa bacteriana

La utilizacin masiva de antibiticos -lactmicos (penicilinas,derivados semisintticos y cefalosporinas) ha conducido a la aparicin de resistencias a los mismos. Los microorganismos resistentes a estos antibiticos lo son por producir una enzima, la -lactamasa, que inactiva a los antibiticos -lactmicos.

Penicilina (activa)
R CO NH N O S CH3 CH3 COO-

Con frecuencia los preparados de penicilinas se formulan aadiendo un inhibidor suicida de la -lactamasa, el cido clavulnico
O C N O COOH CH2OH
O

-Lactamasa

C OHN

O C

CH2OH H

COO-

-Lactamasa
R CO NH O C HN OS CH3 CH3 COO-

c.clavulnico

Esta molcula reacciona con la serina activa de la -lactamasa, produciendo su inactivacin

O C CH CH2 Ser O HN

O C

CH2OH H

c.peniciloico (inactivo)

COO-

Inhibicin Enzimtica

Resumen de los parmetros cinticos de las reacciones enzimticas: efecto de los distintos tipos de inhibicin.
Tipo de inhibicin Ecuacin de velocidad Km Vmx

Sin inhibidor

V =

Vmx . [S] Km + [S]

Km

Vmx

Inhibicin competitiva

V =

Vmx . [S] Km . (1+[I]/Ki) + [S]

Km (1+[I]/Ki)

Vmx

Inhibicin no competitiva

Vmx . [S] V = Km.(1+[I]/Ki)+[S].(1+[I]/Ki) Km Vmx/(1+[I]/Ki)

Inhibicin acompetitiva o mixta

V =

Vmx . [S] Km +[S].(1+[I]/Ki)

Km/(1+[I]/Ki)

Vmx/(1+[I]/Ki)