Gentica y Biologa Molecular en Bioqumica

$egunda %arte D&'( tcnica , e tructura del genoma

Ricardo Fujita, Ph.D. Centro de Gentica y Biologa Molecular In tituto de In!e tigaci"n Facultad de Medicina #$MP

Electroforesis
Separacin de molculas por carga elctrica cidos nucleicos ms o menos uniforme en carga (negativa) cidos nucleicos separados por tamao Matriz: agarosa, poliacrilamida D ! invisi"le necesita teir Grande %eque-o

+
$el agarosa (separacin %& a mas "ases) Gel acrilamida ) e%araci"n de de * +a e,

Polymera e chain reaction )PCR,

. Du%licaci"n e/%onencial in vitro de un egmento de genoma )*001*,000 +%, . 2n 3 24154 ciclo . 6ermociclador( m7quina que cam+ia de tem%eratura cclicamente( denaturaci"n, hi+ridaci"n, nte i )%olimeri8aci"n, . 6aq %olymera e Thermus aquaticcus . Primer( e %eci9icidad )*4150 nucle"tido , . d&6P . Bu99er . Mg::

'lguno u o
. Detecci"n de mutacione . Marcadore gentico . Pre encia o au encia de organi mo in culti!o( !iru , +acteria, microrgani mo

'()

M*uina:+ermociclador 92-95C denaturacin 50-65C hibrid. 72C polimeriz.

'() (continuacin)

1 ciclo 21 2 ciclos 22 3 ciclos 23 30 ciclos 230

'() product of )'$) e,on --

ormal

Mutation

19 bp deletion in family XLRP-236

Fujita et al., 'm. ;. <um Genet )*==>,( ?*(4>*14@0

Secuenciacin: insumo principal

Deoxinucletido 5A

4A Dideoxinucletido

Secuenciacin de Sanger

"

+$!
(Stop)

!$! (.al

0ors1t2e, '3, Maguire, !3, 0u4ita, )3, Moen, (3, S5aroop, !3, and 6ennett, 73 Experim ental Eye Research 89: 9:;#9<& (-<<;)

Choroideremia e on 1!

'() product of )'$) e,on --

Fujita et al., 'm. ;. <um Genet )*==>,( ?*(4>*14@0

$ecuenciacion con 9luore cencia

Ca%ilar, imultaneo

0ig3% Se*uence of M@A( e,on B in a 'A!$ patient of famil13 indicates a dou"le reading (( and $) in nucleotide position -99& of gen M@A(3 ormal se*uence -9B:#-99& (!!() corresponds to codon !sn, 52ereas mutation c2anges codon to !!$, ?1s3 +2is transversion 1ields a M@A( !sn9:&?1s mutation (c2arge)3
6 G ' 6 6 G ' C 6 ' C ' ' & C C C C 6 G G ' C ' '

nt*BB0 )aa B@0,

0u4ita#$uevara, 'erez $rossman, =strada, .argas, )ic2ards > 0u4ita (%&&:) )ecurrent m1ocilin !sn9:&?1s glaucoma causative mutation arises de novo in a 'eruvian famil1 of !merindian descent3 7ournal of $laucoma, -; (-): 8;#;%

Microarray
Gen"mica( Permite anali8ar ciento de mue tra a la !e8 Caria 9orma D&', Dco%y num+er !ariationE, R&', %rotena =4m3 variacin nCmero copias

$lide 0

D!elcro molecularE

<i+ridaci"n D&' marcado 9luore cencia

+cnica 0luorescence in situ 21"ridization 0DSE (localizar genes en regiones cromosmicas)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) en interfase

Ncleo hibridado con sondas fluorescentes con secuencias de crom 21 (rojo) y 5 (verde)

Clula con 2 cromosomas 5 y 3 cromosomas 21

Fluorescence in situ hybridization (FISH) en metafase

Deteccin de delecin de gen esteroide sulfatasa (STS) en cromosoma X Sonda fluorescente para centrmero X (Control) y para secuencias STS. Ictiosis ligada al X, indicador de deleciones otros genes vecinos:

F tructura Genoma <umano )*,

F F F %% pares autosomas G HHIH@ B3% H -&< pares de "ases ("p) 2aploide J %K,&&& genes traducidos, # de B&&,&&& proteLnas3 $enes segmentados MN Splicing alternativo: - gen varias proteLnas segCn te4idoOOO F Solo -3BP traducido a proteinasOOO (vs KP inicial) F (onservacin en secuencias codantes (NN), regulatorias 1 no codantes (J) F .arios segmentos de varios Q"#M" del genoma repetidos en diferentes regiones

F tructura Genoma <umano)2,

. !aria+ilidad( G $ecuencia re%etida )HB0I del total,, mucha %olim"r9ica . Fjm. 'lu )cicatri8 de tran %o one ,, J%n )cicatri8 de retro!iru ,, atlite . G Caria+ilidad ca i todo lo gene y regione K4 millone de mutacione %untuale %olim"r9ica )$&P ,. G Mile de marcadore gentico )%o t1it, en toda la regione cromo "mica )9acilita e tudio de ma%eo de gene en 9amilia y en %o+lacione , G 'lguno gene inacti!o o au ente en indi!iduo normale ( CCR4, 'D< G Ltro gene multi%licado ( CMP2D? G Identidad ==.=I NH 0.*I !aria+ilidad

Repetici"n de Secuencias
El DNA se encuentra en diferentes grados de repetici"n. Secuencia Onica: exones de genes Onicos, ejm. gen de distrofina, insulina edianamente repetida: ! Algunas copias"decenas: familia de genes : origen comOn # conser$aci"n de secuencias (poca $ariaci"n), ejm. %lo&inas de sangre (,,,,), actinas, col7genos, '()*+,, ! 'ientos de copias: rRNA, -istonas (necesidad de muc-as copias en poco tiempo) Altamente repetidas " No genes ! iles de copias: .el"mero, 'entr"meros ! 'ientos de miles: S/NE, 0/NE, microsatlites.

)ejm( di tro9ina,in ulina, )ejm( glo+ina ,col7geno ,

)long inter %er ed nuclear element , ) hort inter %er ed nuclear element ,

6andem

$FC#F&CI' $'6PQI6F
Conce%to +ioqumico, centr9uga gradiente den idad D&' total e%arado %or %e o

Secuencias altamente repetiti$as en tandem

Secuencias unidades repetidas en tandem DNA satlite: centr"meros, rico en repeticiones (A'AA'.)miles de $eces .el"meros repeticiones (..A%%%)n, polimeri1ados por .E02 ERASA inisatlites: secuencias de 3 " 4,, &p, repetidas 4 a 5, $eces # en tandem icrosatlites: secuencias de 4 a + &p, repetidas de 4 a 4, $eces # en tandem

DNA repetiti$o agrupados en tandem m6s comunes en los cromosomas

Telmeros Heterocromatina constitutiva Centrmeros -satlites

MD DS!+R?D+=S MD()AS!+R?D+=S

(entrmeros, +elmeros, 2eterocromatina constitutiva (sitio restringido) Microsatlites 1 minisatlites (en todas las dems regiones cromosmicas)

D&' atlite y %olimor9i mo

7 repeticiones $aria&les entre indi$iduos. Satlites, mini # microsatlites. 8a# algunos genes con secuencias repetidas con expansiones, enf neurol"gicas (8untington, 9 :r7gil, Ataxia de :riedreic-, Steinert, etc). ;ariaciones indi$iduales en los nOmeros de unidades del tandem (marcadores polim"rficos) Repeticiones microsatelite (.%)n alrededor de 5,,,,,, sitios esparcidos en genoma. Alelos paternos # maternos para identidad gentica (paternidad) # mapeo de genes

=s*uema de un microsatlite

?a regin flan*ueante es idntica en todos los 2umanos, el nCmero de unidades del tandem es varia"le 1 2eredado

2B 24 2?

2> 2@ 2= 50 5* 52 55

5B 54 5? 5> 5@ 5= B0 B* B2 11 12 19

R*2

Marcadores microsatlites Q12, Q11 y P14 (GATA)n

(entro de $entica SSM' en el $enome Data"ase

2B 24

2? 2>

2@ 2= 50 5* 52 55

5B 54 5? 5> 5@ 5= B0 B* B2 14 21 2

22

R**

2B 24 2?

2> 2@ 2= 50 5* 52

55 5B 54 5? 5> 5@

5= B0 B* B2

P*B

Murga#Tamalloa (3, $uevara#0u4ita M3?, =strada#(uzcano !3 and 0u4ita, )3 (%&&<)3 Genetics and Molecular Biology B%: ;%&#;%%3 doi: -&3-K<&IS-9-K#9;K;% &&<&&K&&&&<B

Segregacin de alelos de microsatlites en una familia

Ssado para identidad gentica (patermidad) 1 mapeo de genes

Segregacin de un marcador polimrfico microsatlite

Cada persona recibe un alelo de cada progenitor

Microsatlites en el "razo largo del crom3 ;

Uno de los primeros pasos del Proyecto Genoma Humano: Generar marcadores microsatlites en todas las regiones cromosmicas: post-its moleculares

Marcadores (romosoma (romosoma % (romosoma B3333 3333(romosoma %% -%% BB -%% BB

-%%/ BB -%%/ BB

-%% BB -%%/ BB

(2e*uear segregacin de una enfermedad (2umanos) o un caracter (otros organismos) -%% BB

-%%/ BB

-%%/ BB

-%% BB

-%% BB

-%%/ BB

Mapeo $entico (?igacin)

' ociar 9igura en tragamoneda )jacS%ot,

H==I %rdida

T *I ganancia

Ensayo de localizacin de un gen (fallida N <<P de veces)

! 6

Microsatelite del cromosoma ! 1 una enfermedad autosmica dominante del 63 Microsatelite *ue A cosegrega con una enfermedad autosomica dominante3 %da le1 de Mendel3

Localizacin exitosa de un gen por cosegregacin con microsatlite

%#B

-#9

%#9

-#%

-#B

B#9

-#%

%#9

Microsatlite del cromosoma ! cosegregando con una enfermedad autosmica dominante del cromosoma !3 $en ligado a marcador de cromosoma B, puede tardar aos

Sso de marcador (/) de cromosoma %cen#*-B para mapeo de genes: en familia con glaucoma '$!! ((2inc2a) $?(-6
$:K $:8

$:;

$;;

$::

$;:

$;&

$:%

$8;

$;<

$8:

/ / / / / /

/ /

M3?3 $uevara, )3 'erez $3, )3 0u4ita3 !m3 73 Eum $enet Act3 %&&% !;K8

Expansin en el gen de la Corea de Huntington

n B0 5? )C'G,
n

?>

Figura 2 !iagrama del gen "! (#T1$) que tiene ?> e/one y e t7 u+icado en el +ra8o corto del cromo oma B )B%*?,. $u %rotena %roducto )huntingtina, e rica en glutamina #na mutaci"n en el e/"n * cau a la en9ermedad de <untington, la regi"n rica en el trinucle"tido )C'G, %ro!oca la en9ermedad iem%re que %a a de B0 re%eticione . Fujita, 2000. Revista Diagnstico B< (8): B--B#%&3

!nlisis del gen de corea de Euntington (cromosoma 9) =,pansin de tandem ((!$)n 'oli ($lu) en e,n Sm"ral afectados (N 9&) Sm"ral normal (J 9&)

'

/ 'M 'aciente - alelo N 9& 1 otro J 9& M ormal (todos J 9&) / / / / / / / /

urtado, Tam"rano, $uevara, 0u4ita &&B) Eorizonte Mdico .ol B: 9B#9;3

Secuencias altamente repetiti$as esparcidas

. D'icatricesE (<) de retro$irus # transposones No est7n repetidos en tandem, unidades esparcidas S/NE (s-ort interspersed nuclear elements): ! Secuencia recuerda transpos"n ! 'onsenso = secuencia de >,, &p o menos ! 7s conocida familia Alu = +,,,,,, copias 0/NE (long interspersed nuclear elements): ! Secuencia recuerda retro$irus ! consenso algunos cientos de &p de= 3"? @& ! 7s conocida familia Apn

2rigen del )olimorfismo /BD de la En1ima 'on$ertidora de Angiotensina (ECA/ACE) Insercin 289 pb (Alu)
Alelo I (479 pb) Alelo D (190 pb)

Eomocigoto DD elevado =(! circulante (E+!U, cardiovascularesU) :ig. 5&. An6lisis del )olimorfismo /BD en 5C indi$iduos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Origen electroforesis 4%9 &' 19( &'

!! ## #!
Lizaraso, Medina, Salazar, Armas, Diestfano, Hurtado y Fujita (2003) Diagnstico 42:7-16.

Familia de gene

Gene originado %or du%licaci"n y mutaci"n( hi tona , glo+ina , CMPB40, queratina , PJ' , etc. BO queda de nue!o gene de ecuencia %arecida