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BIOENSAYO DE TOXICIDAD EN ARTEMIA SALINA L.

Medina R. Amisaddai J. Laboratorio de Farmacologa L-202, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Av. Guelatao 66, Col. Ejrcito de Oriente, 09230, Mxico D.F Resumen El bioensayo de toxicidad en la Artemia salina es una herramienta til para el ensayo preliminar de sustancias con actividad biolgica. El estudio se centr en la evaluacin y verificacin de la letalidad de las fracciones EtOH, Pb(C2H3O2), KSCN, HgCl2, K2Cr2O4 y. La valoracin se llev a cabo mediante el bioensayo en Artemia salina, a travs del cual, se evidencia el siguiente proceso: determinar la concentracin letal 50 (CL50) utilizando el medio artificial aproximadamente a una temperatura de 26-28OC y dejar que alcance el equilibrio con el agua de la pecera de incubacin despus de 24 horas, preparar la solucin patrn con una secuencia de 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1,4,1.6, 1.8 y 2 mL por tubo y un volumen total de 2 mL y las mismas concentraciones para los dems reactivos. Comprobada la letalidad de las fracciones de los reactivos se mostr CL50 de 2.018 EtOH, 6.61 Pb(C2H3O2), 0.589 KSCN, 3.63 HgCl2, 0.386 K2Cr2O4 y 0.776 AgNO3 mg/ml respectivamente, siendo la ms potente el reactivo con plomo. Introduccin Bioensayo de toxicidad es una herramienta en la ectoxicologia una rama de la farmacologa que combina las tcnicas ecolgicas y la qumica para determinar los efectos de que una sustancia puede tener en un organismo. Los bioensayos de toxicidad involucra la exposicin de organismos a una serie de diferentes concentraciones de la sustancia y determinando la respuesta del organismo. La respuesta del organismo depende de la especie y el tipo de prueba puede incluir una reduccin del crecimiento o supervivencia. Las especies o estados de vida que son especialmente sensitivos a las sustancias ideales para la prueba de toxicidad, por ejemplo los estados de desarrollo temprano de organismos marinos son ms sensitivos que sus equivalentes adultos. Porque el estrs del medio ambiente afecta el desarrollo larvario y puede tener seria consecuencias potenciales para la poblacin y el ecosistema y esos estados de vida tempranos son importantes para identificar el efecto daino a su medio ambiente. Los bioensayos de toxicidad aguda son pruebas diseadas para medir los efectos de sustancias en especies durante un corto tiempo. Los bioensayos, los cuales tpicamente tardan de 48 a 96 horas, usualmente miden los efectos de sustancias en la supervivencia de la especie. Los resultados pueden ser reportados como CE50 la cual es la concentracin efectiva de una muestra de prueba que causa un efecto especifico. Sin embargo, los ensayos de a) Incubacin de los huevecillos toxicidad crnica son usados para sustancias de bajo nivel en situaciones del alto riesgo. Estas pruebas son de largo tiempo relativo a la vida de la especie utilizada y son diseados para medir el desarrollo larvano o crecimiento y el xito o falla de la reproduccin. Marco Terico Cuando un frmaco es administrado en un organismo sufre diferentes procesos (liberacin, absorcin, distribucin, biotransformacin o metabolismo y excrecin). Durante este experimento se evalu la eliminacin renal de la sulfacetamida sdica en una rata a diferentes tiempos. La eliminacin es el paso de frmacos desde el interior hacia el exterior del organismo, este fenmeno se rige por el proceso de difusin pasiva y activa. Una vez que un frmaco ha cumplido su accin teraputica en el organismo y ha sufrido biotransformacin, es eliminado del cuerpo por medio de la excrecin renal principalmente, aunque existen otras vas como: gastrointestinal, biliar, salival, etc. Los bioensayos de toxicidad aguda son pruebas diseadas para medir los efectos de sustancias en especies durante un corto
4. Colocar una cantidad de agua corriente en la pecera mayor, aproximadamente a una temperatura de 26-28OC y dejar que alcance el equilibrio con el agua de la pecera de incubacin.

tiempo. Los bioensayos, los cuales tpicamente tardan de 48 a 96 horas, usualmente miden los efectos de sustancias en la supervivencia de la especie. Los resultados pueden ser reportados como CE50 la cual es la concentracin efectiva de una muestra de prueba que causa un efecto especifico. Sin embargo, los ensayos de toxicidad crnica son usados para sustancias de bajo nivel en situaciones del alto riesgo. Estas pruebas son de largo tiempo relativo a la vida de la especie utilizada y son diseados para medir el desarrollo larvano o crecimiento y el xito o falla de la reproduccin. Objetivo Determinar la CE 50 y la potencia relativa de HgCl2 y de diferentes sustancias qumicas por el mtodo de bioensayo en artemia salina L, para determinar el grado de toxicidad de los mismos en el sistema de prueba. Hiptesis Mediante un bioensayo de toxicidad en una poblacin de Artemia salina la cual es muy sensible a sustancias citotxicas se podr determinar el efecto dosisrespuesta de HgCl2 y los diferentes reactivos a concentraciones crecientes. Metodologa Procedimiento:

Material biolgico: Huevecillos liofilizados de Artemia salina L. Cristalera y equipo: Pecera de vidrio capacidad 2 L Tubos de ensaye Pipetas de vidrio Jeringas de 1 mL Foco sumergible de 5 W Termmetro para pecera Pecera de 500 mL Matraz Erlenmeyer de 1 L

Vasos de precipitados de 100, 500 mL 5 Pipetas Pasteur con bulbo Balanza Gradillas Aereador con manguera y filtro Reactivos: Disolucin de cloruro de mercurio (II) al 1 % Disolucin de sulfato de plata al 1%. Agua de mar artificial Anticloro (tiosulfato de sodio al 1 %)

1. Se arma el dispositivo de incubacin

2. Se preparan 400 mL de agua de mar artificial, pesando 12.2 g de sal marina y disolver en un volumen final de 400 mL. Adicionar una gota de anticloro y dejar reposar durante 5 minutos.

3. De la solucin anterior se colocan 300 ml en la pecera de incubacin.

5. Conectar los dispositivos de aeracin y luz.

6. Adicionar los huevecillos en la pecera de incubacin con una esptula limpia y seca (aproximadamente 10 g de huevecillos), colocar en la zona obscura de la pecera de 500 mL. Dejar incubar durante 24 h.

1. Las muestras se prepararn de acuerdo: mL de reactivo 0.2mL de aumento por cada tuvo de reactivo y 0.2mL de disminucion al vol. inicial de agua salina.

c) Realizacin del bioensayo

1. Se colocar el volumen de disolucin de prueba en cada tubo de ensaye previamente marcado.

2. Se colocarn 10 nauplios de Artemia salina L. por cada uno de los tubos de ensaye, evitando agregar demasiada agua de mar artificial.

3. Se colocar el volumen de agua de mar artificial necesario para completar a un volumen total de 2 mL.

4. Se observar el movimiento de los organismos por un periodo de 120 minutos.

5. Al trmino del periodo de observacin se contarn los nauplios de Artemia salina L. que sobrevivieron de la siguiente manera: .

a) Los nauplios que presentan movimiento, aunque sea este mnimo, se consideran vivos.

b) Los nauplios que permanecen inmviles, se consideran muertos

Resultados Clculos para la realizacin de la grfica

Dosis mg/Kg 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Efecto AgNO3 0/8 0/10 7/15m 9/10m 8/10j 8/9m 9/9k 9/9l 8/8l 7/8j 9/9k

Efecto de P 0 0 0.46 0.9 0.8 0.89 1 1 1 0.875 1

%E 6.2 5 46 90 80 89 94.4 94.4 93.75 87.5 94.44

log D 0 0.3 0.6 0.78 0.9 1 1.08 1.15 1.2 1.25 2

UP 5.32 5 4.9 6.28 5.84 6.23 6.55 6.55 6.53 6.15 6.63

Dosis mg/Kg 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Efecto K2Cr2O4 0/8 4/11j 1/9k 5/11k 10/12k 3/7u 13/13 9/9j 12/12j 10/10k 8/8h

Efecto P 0 0.36 0.11 0.45 0.83 0.428 1 1 1 1 1

%E 0 36 11 45 83 42.8 100 100 100 100 100

log D 0 0.3 0.6 0.78 0.9 1 1.08 1.15 1.2 1.25 2

UP 5.32 4.64 3.77 4.87 5.95 4.82 6.76 6.63 6.73 6.64 6.53

Dosis mg/Kg 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Efecto HgCl2 0/8 0/8 3/8j 3/8j 3/8j 3/8j 3/8j 5/8h 6/8k 7/8j 8/8j

Efecto de P 0 0 0.375 0.375 0.375 0.375 0.375 0.625 0.75 0.875 1

%E 0 0 37.5 37.5 37.5 37.5 37.5 62.5 75 87.5 100

log D 0 0.3 0.6 0.78 0.9 1 1.08 1.15 1.2 1.25 2

UP 5.32 5.32 4.68 4.68 4.68 4.68 4.68 5.32 5.67 6.15 6.53

SUSTANCIA EtOH Pb(C2H3O2) KSCN HgCl2 K2Cr2O4 AgNO3

DE50 2.018 6.61 0.589 3.63 0.386 0.776

Pr 0.556 1.821 0.162 1 0.106 0.214

Dosis mg/Kg 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Efecto KSCN 0/10 0/9 2/10k 3/11j 2/10h 3/10l 5/11j 10/10l 9/9l 10/10l 10/10l

Efecto de P 0 0 0.2 0.272 0.2 0.3 0.454 1 1 1 1

%E 0 0 20 27.2 20 30 45.4 100 100 100 100

log D 0 0.3 0.6 0.78 0.9 1 1.08 1.15 1.2 1.25 2

UP 5 5.55 4.16 4.39 4.16 4.48 4.88 6.64 6.59 6.64 6.64
Anlisis de resultados.

Dosis mg/Kg 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Efecto EtOH 0/10 0/10 0/10 0/10 1/10l 10/10l 10/10l 10/10l 10/10l 10/10l 10/10l

Efecto de P 0 0 0 0 0.1 1 1 1 1 1 1

%E 0 0 0 0 10 100 100 100 100 100 100

log D 0 0.3 0.6 0.78 0.9 1 1.08 1.15 1.2 1.25 2

UP 5 5 5 5 3.72 6.64 6.64 6.64 6.64 6.64 6.64

En esta prctica se pudo observar que sustancia era la que mataba a la mayora de las artemias y la toxicidad que produca viendo el nmero de muertes que provoca. Se observ que para la solucin de K2Cr2O4 no mato a la mayora de las artemias por que no es tan toxico a comparacin del Pb(C2H3O2 ya que este al tener Plomo que al entrar en contacto con el organismo acta mediante diversos mecanismos:a)- disminuye la produccin de glbulos rojos y su vida media al alterar su membrana y provocar su ruptura.y b)- disminuye la sntesis del grupo HEM en los eritroblastos de mdula sea, al inhibir tres enzimas de la ruta biosinttica de este grupo. Dichas enzimas se denominan: aminolevulnico dehidratasa, Coproporfiringeno oxidasa y Ferroquelatasa . Conclusiones El bioensayo de toxicidad en artemia salina resulto muy importante para determinar y entender, la toxicidad que sufre un organismo en un medio. Esta prctica ayudo mucho a entender el efecto toxico que tienen algunos frmacos y no provocar algn dao que perjudique alguna persona. En este caso solo se analiz la potencia relativa de las fracciones EtOH, Pb(C2H3O2), KSCN, HgCl2, K2Cr2O4 para ver que tan toxico es en un medio de artemias. Siendo este el que contuvo plomo. Referencias
Farmacologa humana, Katzung B. 3ra Edicin, Editorial McGraw Hill. EUA. 1998. Aiache, J.M.; Devissaguet, J. Ph. Biofarmacia. Edit. El Manual Moderno.Mxico. 1983.

Dosis mg/Kg 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Efecto Pb(C2H3O2) 0/10 1/7l 3/9l 3/10l 1/8l 6/9l 9/11l 9/10l 5/9l 10/11l 0/11

Efecto de P 0 0.143 0.333 0.3 0.125 0.666 0.818 0.9 0.555 0.9 0

%E 0 14.3 33.3 30 12.5 66.6 81.8 90 55.5 90 0

log D 0 0.3 0.6 0.78 0.9 1 1.08 1.15 1.2 1.25 2

UP 5 3.93 4.57 4.48 3.85 5.43 5.91 6.28 5.14 6.28 4.88