Grupo de Biosensores.

Centro Nacional de Microelectrnica (CSIC)

Biosensores: la alianza entre la vida y la microelectrnica

Anlisis directos e inmediatos sobre pequeas muestras son las principales ventajas que ofrecen los biosensores desarrollados por este grupo de investigadores
Las tcnicas de anlisis de laboratorio ms habituales, ya sean de contaminantes qumicos o sustancias biolgicas, son generalmente tediosas e indirectas. Contar con dispositivos de alta sensibilidad, porttiles y de medicin directa supondra un ahorro de tiempo y costes. Hacia este objetivo se dirige el trabajo del grupo de Biosensores del Instituto de Microelectrnica de Madrid, liderado por Laura M. Lechuga. Combinando componentes pticos y microelectrnicos con materiales biolgicos (protenas o ADN), desarrollan tres modelos de biosensores, macro, micro y nano, basados en la tecnologa de silicio. En ellos la vida y la microelectrnica se alan para servir de base a unos dispositivos con mltiples aplicaciones, ya que cambiando la parte biolgica pueden medir desde contaminantes ambientales hasta variaciones genticas o contaminaciones en alimentos.

Laura Lechuga Gmez en uno de los laboratorios del IMM

Patricia Serrano Antoln

Cuando se imagina un biosensor casi todo el mundo piensa en un aparato de medicin de sustancias biolgicas, si embargo los dispositivos que fabrica el grupo del Instituto de Microelectrnica de Madrid (IMM) situado en el Parque Tecnolgico de Madrid (Tres Cantos) no son exactamente eso, aclara la doctora Lechuga. La definicin ms correcta sera un dispositivo compuesto por dos elementos fundamentales: el sensor, en este caso microelectrnico, y el receptor biolgico, por ejemplo una protena o una cadena de ADN. Esos dos componentes, ms otros de funcionamiento y conversin de seal forman el biosensor, que puede medir todo tipo de sustancias, no slo biolgicas. De hecho, los compuestos con los que experimentan este grupo del IMM, perteneciente al Centro Nacional de Microelectrnica del CSIC son principalmente contaminantes orgnicos de aguas de origen agrcola e industrial, como el DDT o los clorofenoles. A travs de la parte biolgica podemos hacer biosensores especficos, totalmente selectivos para medir contaminantes, explica Lechuga Gmez, qumica de formacin. As, la investigacin con los prototipos de escala macro y micro se ha centrado en el control medioambiental, mientras que el nanomtrico se dirige a la aplicacin en genmica. Estos dispositivos siguen un planteamiento tecnolgico similar al biosensor ms clsico y difundido comercialmente, el usado por los diabticos para medir la concentracin de glucosa en sangre. En ste se integra una enzima, que acta como receptor biolgico, situada sobre un electrodo. La enzima permanece en estado seco, hidrofilizada, hasta que entra en contacto con la gota de sangre del paciente, que la regenera y activa dando lugar a una reaccin qumica y en consecuencia a un movimiento de electrones. El electrodo registra esos cambios y los traduce en la informacin que aparecer en la pantalla en tan slo unos 30 segundos. Nuestros biosensores siguen el mismo planteamiento, pero en vez de

Con el componente biolgico adecuado se pueden disear biosensores para todo tipo de sustancias

analizar glucosa, analizamos otros compuestos, y en vez de utilizar enzimas, usamos protenas o ADN. Otras aplicaciones de este tipo de tecnologa son las usadas en alimentacin para el anlisis de alimentos susceptibles de contener sustancias nocivas como la bacteria de la salmonella, por ejemplo. Incluso, comenta la investigadora, en Japn se usa uno para analizar si el pescado est fresco o no. Tambin hay muchos grupos de investigacin trabajando en la creacin de biosensores para la deteccin rpida de agentes contaminantes en caso de guerra qumica y bacteriolgica. Y otra rea muy importante de aplicacin es la de los anlisis clnicos para analizar de forma rpida y directa, por ejemplo, infecciones como hepatitis o virus del sida. Y es que el uso de biosensores puede extenderse a muchsimos campos, ya que si se tiene el receptor biolgico adecuado esta tecnologa se puede aplicar a medir prcticamente cualquier sustancia. Ese es el punto clave, segn Lechuga Gmez, que subraya que el trabajo del grupo multidisciplinar (qumicos, fsicos, ambientlogos, bilogos moleculares e ingenieros) que dirige desde 1997 es desarrollar tecnologa y probar que funcione bien. Ante todo somos tecnlogos, las aplicaciones dependen ms de los grupos con los que colaboremos. Control medioambiental En el terreno de la deteccin de contaminantes ambientales, el grupo de Biosensores prueba sus prototipos en varias de las 12 sustancias consideradas prioritarias por la Unin Europea. As, utilizan protenas diseadas especficamente para reaccionar en contacto con contaminantes (una protena diferente para cada uno), principalmente DDT, carbaril y nonilfenol. Son sustancias qumicas de origen agrcola o industrial, persistentes y altamente nocivas para el medio ambiente y la salud humana. Segn Lechuga, los ingerimos constantemente en muchos alimentos. Cuando entran en nuestro organismo, no son interpretados como agentes patgenos sino como hormonas propias, por lo que provocan lo que se ha dado en llamar una disrupcin endocrina. El cuerpo piensa que tiene una elevada concentracin de hormonas ante la cual activa los sistemas de respuesta, y parece ser que esta descompensacin puede tener relacin con el aumento de algunas enfermedades como el cncer de mama o el de prstata, por ejemplo. Por ello, son considerados analitos prioritarios. Lo que sucede con estos compuestos qumicos es que son molculas muy pequeas que adems se hallan en muy bajas concentraciones, casi de partes por billn. Analizar eso en el laboratorio puede llevar horas o das y hay que utilizar tcnicas muy sofisticadas y costosas. Los biosensores basados en la tecnologa del silicio con protenas como receptores son, por el contrario, de medicin directa y alta sensibilidad, aunque de momento tambin costosos. El biosensor tipo macro se compone por una placa de oro de 45 nm de espesor sobre la que se ancla el receptor biolgico. El proceso de anclaje de la protena es uno de los ms problemticos en la fabricacin de este tipo de biosensores, explica la investigadora, porque supone conectar un mundo biolgico con un material inerte. El mtodo consiste a grandes rasgos, en provocar modificaciones qumicas en la superficie del oro que den lugar a un enlace covalente entre los
Biosensor ptico fabricado con tecnologa microelectrnica de silicio y empleado para la medida de parmetros clnicos y contaminacin medioambiental

El anclaje del receptor biolgico sobre la superficie inerte es una de los pasos ms complejos del proceso de fabricacin

tomos de su superficie y una parte especfica de la protena. No puede anclarse de cualquier manera, la protena debe conservar su estructura y conformacin, siendo necesario que queden libres las zonas de la misma que desempean la funcin receptora. Para ello, conectan a la placa de oro unas microcubetas con distintas disoluciones que hacen pasar sobre el sensor en un determinado orden, pH y concentracin provocando las reacciones que darn como resultado el anclaje de la protena a la superficie aurfera. Todos los pasos se monitorizan para comprobar que se estn produciendo las reacciones qumicas buscadas, y una vez que se comprueba que la protena est bien anclada, se conecta a un sistema de flujo automatizado que mantiene a la protena constantemente en contacto con un buffer salino. Mantener la parte viva, que no se degrade y que permanezca estable es otra de las mayores dificultades, comenta Lechuga. La protena (y tambin el ADN) ha de estar en disolucin constante, en su medio natural, es decir en un buffer con un ph y una temperatura adecuados. Y es por esto, por lo que estos dispositivos sirven para la medicin de contaminantes en aguas, porque las muestras a analizar han de ser lquidas para poder inyectarlas en el flujo. La placa de oro, de con la protena anclada y el sistema de flujo constante, se excita mediante un lser un efecto ptico que se llama resonancia de plasmn superficial. Cuando la luz incide sobre la placa de oro produce un movimiento de electrones, que se ve alterado por las reacciones bioqumicas o biomoleculares en la superficie de la misma, provocando un cambio en la luz reflejada que sern registradas por un fotodetector. La seal del fotodetector es procesada electrnicamente y conectada a su vez a un ordenador con un software, elaborado por el propio equipo, que traduce los cambios en los niveles de concentracin del contaminante. As se consigue la ventaja de tener una medicin y un anlisis directo a partir de muestras muy pequeas. El buen funcionamiento de este biosensor suscit hace unos meses la creacin de una spin-off, Sensia S.L., que comercializa el biosensor de resonancia de plasmn superficial para aplicacin general. Es decir, se vende la tecnologa base sin protena ni ADN, as segn lo que quiera medir el usuario habr de usar el receptor biolgico especfico. Nosotros le explicaremos como usarlo y le proporcionaremos consejo sobre el protocolo de inmovilizacin ms adecuado . Diseo propio El biosensor de escala micro funciona con un mecanismo similar pero sustituye el oro por una oblea de silicio, sobre la que se disean los microcircuitos pticos. El equipo del IMM ha diseado un interfermetro (un circuito) compuesto por varias capas de xidos de silicio y nitruros. El interfermetro es el dispositivo por el que transcurrirn los fotones que viajarn desde el emisor de la luz al fotodetector, pasando por el receptor biolgico, que tambin est situado en una disolucin constante. La luz entra por una nica va que en un determinado punto del interfermetro se divide en dos ramas, sobre una de las cuales se ha anclado la protena. Las dos ramas vuelven a unirse y con ello la luz, que no ser igual a la que ha entrado porque en uno de los caminos por los que se ha bifurcado ha sufrido modificaciones debido al contacto con la protena. Del anlisis de esa interferencia se extrae la seal y se averigua la concentracin que exista en la muestra.

A pesar de que los interfermetros se usan mucho en telecomunicaciones su diseo era incompatible con la aplicacin en biosensores, por lo que este equipo ha tenido que redefinirlo entero. Es un diseo completamente nuevo, que requiere mucho tiempo porque hay que hacer modelizaciones de muchos parmetros. Adems, tambin han tenido que abordar ellos mismos la parte de la modificacin qumica para el anclaje de protenas porque nadie lo haca y la del sistema de flujo. Ahora, bromea la investigadora, somos unos expertos. Las partes del proceso que no realiza el grupo de Lechuga son el diseo de las protenas especficas para cada contaminante, que lo llevan a cabo dos grupos de investigacin en inmunoqumica (uno en Valencia y otro en Barcelona), y el desarrollo de la electrnica para la adquisicin y procesado de la seal, que hacen en colaboracin con un grupo de ingeniera de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Tenemos muchas colaboraciones porque si no es imposible hacerlo todo. Los biosensores micro portan placas de silicio con 30 interfermetros, ya que cada uno mide slo 4 nanmetros de altura y es imposible manejarlos en el laboratorio de uno a uno. A cada interfermetro se le conecta una fibra ptica de entrada de luz y de salida. sta ltima se enlaza a un fotodetector que transmite la informacin a la electrnica y de ah al software. El siguiente paso de su investigacin con este prototipo, ms sensible que el de plasmn superficial, es conseguir hacerlo de forma ms integrada, es decir reunir todos los componentes en un chip porttil, al estilo del biosensor de glucosa pero de tamao ms reducido. Adems, persiguen tambin convertirlo en un multibiosensor, en el que cada interfermetro est conectado a una cubeta independiente, con lo que se podran introducir 30 protenas diferentes, especficas para distintos contaminantes. Sera un biochip completo con el que se podran analizar 30 sustancias al mismo tiempo. Anlisis gentico Desde hace dos aos, el grupo ha empezado a investigar con otro tipo de receptores biolgicos, las cadenas de ADN. En esta lnea, gracias a la colaboracin con el Departamento de Inmunologa y Oncologa del Centro Nacional de Biotecnologa del CSIC, en un proyecto europeo sobre el gen BRCA1 (indicativo de la propensin al cncer de mama), han creado un prototipo de biosensor nanomtrico muy sensible para muestras muy pequeas, a diferencia de las tcnicas empleadas en la actualidad para el anlisis gentico. Es el ms sofisticado y sensible de los tres modelos que fabricamos, segn Lechuga, que explica que lo que emplean en este biosensor como sensor sobre el que anclar el ADN es una pieza similar a la palanca de lectura del microscopio de fuerzas atmicas (cantilever). Es una estructura de 200 micras de largo, 20 micras de ancho y como 300 nanmetros de espesor sobre la que fijan una cadena simple de ADN (oligonucletido) mediante un proceso de reacciones qumicas que sigue un planteamiento semejante al de los otros prototipos. La deteccin se produce cuando se hace pasar a travs de la palanca con la cadena de ADN la muestra de ADN de un paciente que se quiera analizar. La cadena de ADN dividida se unir a su complementaria provocando que el cantilever se doble

como un trampoln en una piscina, pero en este caso la curvatura no se produce por el peso, que es nfimo, sino por un fenmeno de tensin superficial. Hay algo diferente en la superficie de arriba de la palanca con respecto a la parte de abajo. La luz que se ha proyectado sobre esa palanca sufrir modificaciones en su reflexin dependiendo del grado del doblamiento, y es eso lo que se mide. Segn cuanto cambie sabemos qu concentracin de molculas de ADN tenemos. Como en los anteriores biosensores, este se conecta a la parte de adquisicin de la seal y sta al ordenador con el software que interpreta la seal. De esta manera, si la muestra del paciente presenta alguna alteracin gentica, la cadena simple de ADN usada como receptor se une ms o menos, y eso har que la palanca se doble ms o menos. El cantilever tiene sensibilidad suficiente como para percibir este fenmeno que sucede a escala nanomtrica y curvarse tambin pocos nanomtros. La investigadora remarca que con este tipo de biosensor no se necesita un marcador, es tan sensible que lo registra directamente, y el no usar marcador significa adems que las mediciones son en tiempo real, en el momento en que suceden las reacciones de reconocimiento lo ests viendo en pantalla. Las tcnicas de anlisis gentico usadas hoy en da, como los biochips de ADN, necesitan siempre de la introduccin de un marcador, ya sea fluorescente, radioactivo o de otro tipo, que una vez que ha entrado en contacto con la muestra hay que analizar. Sin embargo, con esta tecnologa, directamente se observa la interaccin de ADN que est situado sobre un dispositivo capaz de leer esa interaccin. La prxima etapa de la investigacin es optimizar el biosensor para convertirlo en un biochip de anlisis directo de ADN de alta sensibilidad, en el que se integraran del orden de 20 cantilevers, cada uno con una secuencia de ADN distinta. Este tipo de tecnologa, as como la del biosensor micro, es completamente innovadora, no hay nada hecho, subraya Laura Lechuga; la tcnica de los biosensores de plasmn superficial es muy estndar, pero los otros dos desarrollos son exclusivamente nuestros y segn las comparativas que realizan con otras tcnicas de laboratorio funcionan muy bien.

FICHA TCNICA Grupo de Biosensores Centro: Instituto de Microelectrnica de Madrid. Centro Nacional de Microelectrnica. CSIC Coordinador: Laura Mara Lechuga Gmez Direccin: C/ Isaac Newton, 8. Parque Tecnolgico de Madrid 28760 Tres Cantos. Madrid Telfono: 91 806 07 00 Fax: 91 806 07 01 Email: laura@imm.cnm.csic.es Pgina web del grupo: http://www.imm.cnm.csic.es/biosensores/home.html Lneas de investigacin: Diseo y modelizacin terica de las estructuras biosensoras, tecnologa de fabricacin, inmovilizacin a escala nanomtrica de biomolculas y su caracterizacin por AFM, montaje experimental de medida, electrnica de control, sistema de adquisicin y tratamiento de datos; Diseo y fabricacin de sistemas de flujo, macro y micromecanizados; Desarrollo de sistemas de modulacin de seal ptica, integracin de componentes; Microsensor ptico integrado basado en Interfermetros Mach-Zehnder con tecnologa de Silicio; Desarrollo de un sensor de Resonancia de Plasmn Superficial de Doble Canal; Biosensorun nanosensor basado en micropalancas de Silicio como base para desarrollar micro/nano biochip de ADN.