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IMMUNOHISTOCHEMICAL EXPRESSION OF HEAT SHOCK PROTEINS IN THE MOUSE PERIODONTAL TISSUES DUE TO ORTHODONTIC MECHANICAL STRESS EXPRESIN INMUNOHISTOQUMICA

DE LAS PROTENAS DE CHOQUE TRMICO EN LOS TEJIDOS PERIODONTALES DE RATN DEBIDO AL ESTRS MECNICO DE ORTODONCIA Abstracto/Resumen Se estudi la histopatologa de ligamento periodontal del ratn sometido a estrs mecnico. Se examinaron las expresiones inmunohistoqumicos de HSP27 y pHSP27. Animales de experimentacin usando los molares superiores de ratn ddY por el mtodo de Waldo se utilizaron en el estudio. Un separador fue insertado para inducir estrs mecnico. al cabo de 10 minutos, 20 minutos, 1 hora, 3 horas, 9 horas y 24 horas, fueron extrados los tejidos regionales, se fijaron en paraformaldehdo al 4% y tampn fosfato 0,05 M solucin de fijacin. Cortes de parafina se hicieron para inmunohistoqumica empleando HSP27 y pHSP27. En el grupo control, los fibroblastos del ligamento periodontal expresaron bajo HSP27 y pHSP27. Sin embargo, en el grupo experimental, los fibroblastos del ligamento periodontal expresaron HSP27 10 minutos despus de la aplicacin de la carga mecnica en el lado de tensin. La expresin ms fuerte se detect 9 horas despus de la induccin de carga mecnica. pHSP27 se expres tambin de una manera dependiente del tiempo, aunque ms dbil que la HSP27. Los resultados sugieren que la HSP27 y pHSP27 fueron expresadas para el mantenimiento de la homeostasis de ligamento periodontal mediante la activacin de los fibroblastos del ligamento periodontal en el lado de tensin. Tambin sugiere que estas protenas actan como chaperones moleculares para la activacin de osteoblastos y el mantenimiento de la homeostasis. Palabras clave: protenas de choque trmico, HSP27, las clulas del ligamento periodontal, estrs mecnico, el movimiento dental ortodncico. INTRODUCCIN Los resultados del tratamiento de ortodoncia al estrs mecnico induce la reorganizacin del ligamento periodontal (PDL) y haces de colgeno. Como consecuencia, los tejidos periodontales de soporte, el movimiento

del diente llamados lado de presin reacciona con la aparicin de los osteoclastos responsables de la resorcin sea. En el lado opuesto, generalmente conocido como el lado de tensin, la activacin de los osteoblastos aade fijacin al hueso a la vez una reorganizacin se produce en los tejidos periodontales. Estas acciones podran provocar al movimiento dentario. El estrs mecnico transferido al PDL provoca reaccin tisular provocando el movimiento del diente. Esta reaccin del PDL es para el mantenimiento de la homeostasis. En los ltimos aos, la respuesta histolgica y la diferenciacin celular, as como la produccin de factores de transcripcin que regulan diversas fenmenos morfogentico se hizo ms ampliamente estudiados. Se ha vuelto claro que el mantenimiento de la homeostasis puede provocar a la remodelacin de tejido periodontal y la expresin de molculas activas en respuesta a diversos estrs mecnico y la inflamacin. Tradicionalmente, grandes protenas expresadas en diversos tejidos y rganos debido a la carga mecnica y la estimulacin de estrs citotxico que se expresa transitoriamente se conocen como protenas de choque trmico (HSP). HSPs no slo son inducidas por choque trmico, sino tambin por diversos cambios patolgicos tales como la isquemia, infecciones e inflamaciones; radiacin, el estrs fsico como la luz, enzima; iones de metales pesados como el arsnico, el etanol, los radicales libres, derivados de aminocidos, diversos productos qumicos inducidos por el estrs. HSPs se cree que participan en la regulacin de la funcin celular y la defensa, as como contra el dao a la clula. Sin embargo, su papel dinmico en PDL y movimiento dentario, as como en la respuesta de clulas reguladora contra estmulos de dao experimental no ha sido investigado. Shigehara, estudi las expresiones de diversos mRNAs en la pulpa dental despus de someter al estrs mecnico durante el movimiento ortodncico sino la expresin de HSP no fue mencionado. En nuestro conocimiento y en la bsqueda de las literaturas, la expresin HPS en los tejidos periodontales es muy limitada. Maeda report que las clulas humanas similares a fibroblastos PDL-derivadas cultivadas cuando se somete a compresin continua expres Hsp60, 70 y 90. Tambin, Okazaki report el una mayor expresin de HSP47, 60 y 70 mediante en una carga cclica vitro de fuerza de estiramiento en los fibroblastos humanos PDL. adems, araujo mencion que en el experimento de la cultura, microarray revel que slo el aumento de HSP70 en fibroblastos humanos PDL fueron expuestos a esfuerzos mecnicos. HSP se clasifica en dos tipos

dependiendo del peso molecular. La comparacin entre las HSPs HSP70 y otra de bajo peso molecular no han sido claramente dilucidado. En este estudio, la expresin inmunohistoqumica de HSP especficamente HSP27 y HSP27 fosfolirado (p-HSP27) se examinaron simultneamente despus de someter los tejidos periodontales al estrs mecnico por el movimiento de ortodoncia. Cambios histopatolgicos de PDL en los lados de presin y la tensin se estudiaron el uso de animales experimentales de ratn. MATERIAL Y MTODOS 1) animales de experimentacin Un total de 30,8 semanas de edad, los ratones macho ddY de peso 35 5 g (30-40g) fueron adquiridos de Japn. Los animales fueron alojados en contenedores de metal forrados con una en una habitacin con aire acondicionado (24 1 c). Los animales fueron alimentados libremente con agua y dieta slida durante la cra. 2) mtodos experimentales El mtodo experimental fue basado en nuestros informes previos. El mtodo Waldo de la induccin de carga de estrs mecnico en los tejidos periodontales de ratn fue seguido. Antes de la induccin de carga mecnica, la anestesia por inhalacin fue utilizado con isoflurano (isoflurano: Dainippon Sumitomo Pharma co, Osaka, Japn.) Y la mezcla de gas-aire (concentracin de 4,0% de la pre-anestesia). Con el fin de lograr una anestesia duradera y estable, sistema de anestesia ajustable tasa de constante flujo de gases (agricultor biomtrico ltd., De laboratorio, de Osaka, Japn) para pequeos animales de laboratorio fue usado. Bajo anestesia general, el ratn fue encerrado en una posicin sentada donde el tronco se mantuvo en la parte superior del banco experimento. Anestesia por inhalacin isoflurano se ajust a la nariz para el mantenimiento de la anestesia general (1,0% de concentracin) durante el experimento. Para mantener la boca abierta, el maxilar superior se fij con un hilo atado en el incisivo superior por encima de la mesa y el caucho fue utilizando para fijar la mandbula. Mientras que la boca abierta, el separador fue insertado a la molar superior para inducir estrs mecnico persistente por el mtodo de Waldo (fig. 1, 2). El separador fue utilizado con 2 x 2 mm lmina presa fuerte vigente goma (Ivory, Premium Dique de

goma de ltex puro:. Heraeus Kulzer GmbH & Co KG, Hanau, Alemania). El maxilar superior tiene 3 molares; primer molar (M1), segundos molares (M2) y tercer molar (M3) de un lado mesial. Adems, M1 y M2 tienen 3 races y M3 tiene de 2 a 3 races. Separador fue inserta entre M1 y M2 de los molares superiores adecuadas para asegurar las estrs mecnico debido a la presin durante un perodo de tiempo. Animales de experimentacin fueron divididos en 6 grupos, 10 minutos, 20 minutos, 1 hora, 3 horas, 9 horas, 24 horas con 5 animales por grupo. La Tabla 1 muestra el nmero de las muestras en cada subgrupo. Despus de cada tiempo experimental, los animales anestesiados fueron asesinados por inhalacin de ter, y los tejidos correspondientes fueron retirados como secuencia. Los tejidos periodontales de la regin molar superior izquierdo (lado sin tratar) se utilizaron como controles. En este experimento, la raz bucal distal del primer molar maxilar fue la parte de observacin. El presente experimento se realiz de acuerdo a la Gua para los experimentos con animales de la Universidad Dental de Matsumoto. PREPARACIN DE TEJIDOS El molar maxilar con los tejidos periodontales fueron retirados rpidamente y se fijaron en paraformaldehdo al 4% con tampn de fosfato 0,05 M durante 24 horas y descalcificada en solucin al 10% de EDTA durante 3 semanas. Despus de incrustar en parafina, se realizaron cortes seriados de 5 micras para estudios histopatolgicos e inmunohistoqumicos. la figura 3 muestra los cortes histopatolgicos de M1, M2 y M3. INMUNOHISTOQUMICA Slides fueron sometidos a desparafinacin y luego sometidos a un tratamiento previo durante 30 minutos en incubadora a 60 c. La inmunohistoqumica se realiz con Dako Envision + Kit-K4006 (Dako, Glostrup, Dinamarca). Los anticuerpos primarios utilizados fueron HSP27 anticuerpo monoclonal de ratn (HSP27 (SPM252): sc-65567, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, Estados Unidos, con una concentracin de 1:5000) y el ratn p-HSP27 anticuerpo policlonal de conejo (p-HSP27 (Ser 15): sc-101699, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, Estados Unidos, con una concentracin de 1:5000). Los especmenes fueron de contraste con hematoxilina. para los controles negativos, las muestras se tieron sin anticuerpos primarios.

RESUlTADOS El examen histopatolgico El grupo de control Cuando la raz bucal distal del primer molar superior se examin horizontalmente, la toma de hueso alveolar estaba en forma ovalada con un dimetro a lo largo de 550 micras y un dimetro corto de 450 micras, aunque exista una pequea variacin de tamao entre las muestras. La raz del diente fue localizado casi en el centro del alveolo dentario. El lado mesial tiene una ligera desviacin en el espacio del PDL es de aproximadamente 50 micras. El PDL distal entre en el hueso alveolar y la raz bucal distal del primer molar maxilar izquierdo estaban relativamente organizarse en orden (fig. 4, CH, CT). Fibroblastos fusiformes con ncleos ovales pueden ser vistos a lo largo de las fibras PDL. Sin embargo, algunos sitios tambin mostraron fibroblastos PDL posicionados en una direccin ligeramente diferente. Entremezclados con los haces de colgeno estn llenos de capilares pocos hemates. La superficie de la raz del cemento acelular est misteriosamente teido con hematoxilina. El hueso alveolar contiene pocos osteoblastos aplanados con ncleo oval. En contraste, en el PDL mesial de la raz distal bucal, se observaron los fibroblastos PDL en una orientacin diagonal (fig. 4, cP). De PDL fibroblastos fusiformes con los ncleos ovalados estaban relativamente uniforme. Las superficies de hueso alveolar, cemento y el fueron los mismos que el segmento distal. Grupo Experimental De PDL en los cambios secundarios de tensin en la raz bucal distal del primer molar superior estaban marcadamente diferentes en el grupo experimental. El lado cerca del separador (De PDL distal de la raz bucal distal del primer molar superior derecho) es el lado de tensin; el lado opuesto (De PDL mesial de la raz bucal distal del primer molar superior) es el lado de presin. En el grupo de 10 minutos, el diente se movi ligeramente al mesial. Sin embargo, los cambios en la anchura del PDL no estaban claros. El ncleo de fibroblastos PDL en el lado de tensin era alargada. Su citoplasma y el ncleo fueron ligeramente alargado.

En el grupo de 20 minutos, la diferencia entre la tensin y el lado de presin se hizo evidente (fig. 4, 20m-H). El PDL en la tensin fue dispuesta en una direccin radial. Los fibroblastos de PDL han sido fuertemente estirado, en forma de huso y el ncleo es aplanado o elptica. Asimismo, los capilares congestionados se ven en el PDL (fig. 4, 20m-T). En el grupo de 1 hora, la raz traslad ms a la direccin mesial (fig. 4, 1hH). La anchura de PDL cre una mayor traccin y las fibras haba sido estirada considerablemente. El ncleo fue teido intensamente con hematoxilina y lleg a ser picntico. Se observ los haces de colgeno destruidos en entre lagunas. Ncleo desapareci en haces de colgeno destruidas. Las clulas que se han estirado tienen una apariencia ondulada. Tambin fueron observados algunos fibroblastos PDL con ncleo redondo. Capilares congestionados entre los haces de colgeno aumentados. Los osteoblastos que recubren la superficie del hueso alveolar son de forma oval (fig. 4, 1h-T). En el grupo de 3 horas, la raz continu para mover mesial y la anchura del espacio PDL se increment (fig. 4, 3h-H). La extensin esperado de PDL caus espacios entre las fibras. El citoplasma de los fibroblastos en forma de huso mostr ncleos ovales. El nmero de fibroblastos disminuy comparado con el grupo de 1 hora. En particular, se observ reduccin de la condensacin de cromatina en clulas aplanadas. capilares congestionados son vistos. Osteoblastos de forma oval son observados que recubre la superficie del hueso alveolar (fig. 4, 3h-T). En el grupo de 9 horas, la raz dej de moverse en la direccin mesial y la anchura de la PDL no aumentar an ms y se mantuvo similar a la anchura observado en el grupo de 3 horas. El espacio entre los haces de colgeno se redujo. PDL fibro explosiones son breves, eje en forma con ncleo oval. Por otro lado, los capilares congestionados an se puede observar. En el grupo de 24 horas, las clulas del PDL estn en forma de huso con ncleo oval grueso. Los osteoblastos que recubren la superficie del hueso alveolar son ovalados o cortos en forma cbica. Pueden ser observados vasos dilatados y hemorragias dispersas . (fig. 4, H-24h, 24h-T). En el grupo de 20 minutos, el trastorno en la morfologa celular de los fibroblastos deL PDL se hizo ms clara en el lado de presin. la forma del ncleo de los fibroblastos del PDL se convirti an ms en irregular,

central nuclear se convirti Parcialmente picntico. Los osteoblastos tienen escaso citoplasma, ncleos ovales; algunos fueron aplanadas pero el nmero de clulas fue menor comparado con el grupo de 10 minutos (fig. 4, 20m-P). En el grupo de 1 hora, el espacio del PDL es ms estrecho; fibroblastos del PDL estn dispuestos en capas alrededor de la raz. Por otra parte, las clulas del PDL mostraron varios cambios degenerativos. El citoplasma de los fibroblastos del PDL se convirti en eosinoflico, ncleo es plano, cariopicnosis (nucleo con agua) se hizo evidente. Por otra parte, los osteoblastos que recubren la superficie del hueso fueron reducidos en nmero; el citoplasma y el ncleo se convirtieron en aplanado por la presin y la distincin entre los fibroblastos circundantes se hicieron difciles (fig. 4, 1h-P). En el grupo de 3 horas, el espacio del PDL se convirti en an ms estrecho, cambios degenerativos fueron ms severas que distinguir de las clulas PDL era difcil. Fibroblastos de PDL aumentado su tincin eosinoflico; tena menos ncleos por unidad de superficie. Los osteoblastos recubren superficies seas eran tambin menos (fig. 4, 3h-P). En el grupo de 9 horas, la tincin eosinoflico de el PDL se increment an ms, el nmero de fibroblastos PDL se redujo. Ms an, algunos espacios oscuros Parcialmente en los haces de fibras mostraron la tincin hematoxilina causada por cariolisis. En el grupo de 24 horas, el PDL se convirti fuertemente eosinoflico. Fuerte condensacin de la cromatina nuclear o picnosis se ha observado en fibroblastos PDL, cariorrexis es muy evidente (fig. 4, 24h-P).

ESTUDIO INMUNOHISTOQUMICO El grupo de control El PDL del maxilar la raz distal vestibular izquierda del 1er molar del ratn expresa dbilmente protena HSP27. La expresin se detect

principalmente en el citoplasma de los fibroblastos del PDL (fig. 5, CH). La expresin de pHSP27 era mucho ms dbil (fig. 5, c-pH). Grupo experimental En el grupo de 10 minutos, la expresin de HSP localizado en los fibroblastos del PDL en el lado de tensin fue ligeramente fuerte en comparacin con el grupo de control. Por otro lado, el lado de presin era casi negativo. Sin embargo, pHSP27 fue negativo en ambos lados de presin y tensin. En el grupo de 20 minutos, la expresin citoplsmica de HSP27 en los fibroblastos del PDL tanto en la tensin y los lados de presin era ms fuerte que el grupo de 10 minutos (Fig. 5, 20m-H). No hubo cambios en el p-HSP27 observado cuando se compar con el grupo de 10 minutos (fig. 5, 20m-pH). En el grupo de 1 hora, los fibroblastos del PDL expresaron HSP27 ligeramente ms fuerte en comparacin con el grupo de 20 minutos. No se detect expresin en el lado de presin (fig. 5, 1h-H). pHSP27 fue negativo en ambos lados de presin y de tensin (fig. 5, 1h-pH). En el grupo de 3 horas, los fibroblastos del PDL y cementoblastos en el lado de tensin expres enrgicamente HSP27. La expresin aument en comparacin con el grupo de 1 hora (fig. 5, 3h-H). en este punto, la expresin de p-HSP27 no mostr ninguna diferencia en la fuerza (fig. 5, 3h-pH). En el grupo de 9 horas, HSP27 se expres fuertemente en el citoplasma de fibroblastos y cementoblastos del PDL, as como en los osteoblastos. La expresin en el lado de tensin era ms fuerte en comparacin con el grupo de 3 horas (fig. 5, 9h-H). En este perodo, p-HSP27 comenz a ser fuerte en el lado de presin (fig. 5,9 h-pH). En el grupo de 24 horas, la HSP27 se expresa fuertemente en el lado de tensin por la totalidad de los fibroblastos PDL y cementoblastos, as como por los osteoblastos. La expresin tambin era ms fuerte en comparacin con el grupo de 9 horas. Por otro lado, se perdi la expresin de HSP en el lado de presin (fig. 5, 24h-H). Adems, se detect la expresin ms fuerte de p-HSP27 en el lado de tensin durante todo el experimento en este grupo. En el lado de presin, no se detectaron pHSP27 as como expresiones HSP27 (fig. 5, 24hph).

La Tabla 2 resume los resultados de la inmunohistoqumica.