BIO 368 ANALISIS INSTRUMENTAL

Mtodos cromatogrficos I

CROMATOGRAFIA Conjunto de tcnicas utilizadas para la separacin de mezclas de solutos, basada en la diferente solubilidad (afinidad) de los solutos por dos solventes (fases) inmiscibles. e la clasifica seg!n los criterios f"sico#$u"micos responsables de la separacin. e desarroll en Inglaterra en la dcada del %&' para la separacin de sustancias coloreadas (de all" su nombre( cromatograf"a). )l fundamento de todas las formas de cromatograf"a es el *coeficiente de particin+ (Kd ) $ue describe la distribucin de un compuesto en las dos fases inmiscibles(
concentracin en la a!e A

Kd " ###########################

,as dos fases de todo sistema cromatogrfico se denominan( # -ase estacionaria o fase fija( un slido, un gel, un l"$uido. # -ase mvil( un l"$uido o un gas, $ue flu.e sobre o a travs de la fase fija. e escoge las fases de modo $ue los coeficientes de particin de los componentes de la mezcla sean lo ms distintos posible.

TI$OS %E CROMATOGRAFIA e los clasifica de acuerdo al principio f"sico#$u"mico $ue permite la separacin( /0 12CI13( e$uilibrio entre una fase fija slida . una fase mvil l"$uida. ()j( cromatograf"a de adsorcin4 cromatograf"a de interaccin 5idrofbica). 6/27ICI13( e$uilibrio entre una fase fija l"$uida . una fase mvil l"$uida o gaseosa. ()j( cromatograf"a en fase reversa4 cromatograf"a gas#l"$uido4 cromatograf"a de contra#corriente). I37)2C/M8I1 I13IC1( e$uilibrio entre un intercambiador inico fijo . una fase mvil con electrolitos. ()j( cromatograf"a de intercambio inico4 cromatoenfo$ue).

TI$OS %E CROMATOGRAFIA (continuacin) )9C,: I13( e$uilibrio entre un l"$uido atrapado en los poros de una fase fija slida . un fase mvil l"$uida. ()j( cromatograf"a de filtracin molecular). /-I3I0/0( e$uilibrio entre un ligando inmovilizado (fase fija) . un ligando en solucin (fase mvil). ()j( cromatograf"a de afinidad4 cromatograf"a de inmunoafinidad4 cromatograf"a de ligando#colorante). )n la prctica, es com!n $ue dos o ms de estos tipos de e$uilibrio operen en forma simultnea en una determinada cromatograf"a.

)n el ejemplo se agregan ;< mg de una sustancia en = ml de fase mvil . se supone un coeficiente de particin igual a =. /l cabo de un n!mero de e$uilibrios el compuesto se distribu.e en una banda simtrica. >?u ocurre si tenemos adems otro compuesto con coeficiente =''@

$ARAMETROS %E REN%IMIENTO CROMATOGRAFICO

)n cromatograf"a, dos tipos de procesos afectan el comportamiento de los analitos . con ello el Aito de la separacin( =.# Mecanismos f"sico#$u"micos bsicos $ue definen el proceso (p. ej., particin, adsorcin, intercambio inico, etc.). <.# 6rocesos $ue tienden a oponerse a la separacin, p. ej. difusin, $ue producen bandas ms anc5as . *tailing+.

/,B:3/ 0)-I3ICI13) ( # Tie&'o de retencin (tr)( tiempo re$uerido por un analito para emerger de la columna. # *ol+&en de el+cin (*e), volumen de fase mvil re$uerido para eluir el analito. #*elocidad de l+-o (Fc) de la fase mvil (mlCmin). Influenciado por las dimensiones de la columna, la caracter"stica f"sica de las part"culas, . la viscosidad de la fase mvil. *e " tr A Fc

UN CROMATOGRAMA,

e grafica la respuesta del detector en funcin del tiempo de retencin (o volumen de elucin). ,a asimetr"a de un pico puede tener distintas causas( aplicacin de un eAceso de analito, mal empa$ue de la columna, deficiente aplicacin de la muestra, etc.

)l Aito de una cromatograf"a se mide por su capacidad de separar (resolver) completamente un analito de una mezcla. ,a resolucin de dos picos / . 8 (R!) depende de las propiedades de stos( . (trB # trA) R! " ################ /A 0 /B

donde( trA . trB son los tiempos de retencin de A . de B1 . /A . /B el anc5o de la base de los picos respectivos.

Dalores de 2s de =,' corresponde a una separacin del EF G, lo $ue es adecuado para anlisis cuantitativo.

e considera $ue las columnas cromatogrficas consisten de un conjunto de zonas ad.acentes donde 5a. suficiente espacio para $ue los solutos logren un e$uilibrio completo entre las fases fija . mvil. Cada una de estas zonas 5ipotticas se denomina un Hplato tericoH . su altura en la columna es la Haltura del platoH (2). Una col+&na e! &3! e ecti4a &ientra! &3! 'lato! terico! ten5a1 )l n!mero de platos tericos (N) involucrados en la elucin de un analito determinado est dado por( N " 66 (tr7/). o N " 898: (tr7/;).

0onde / es la anc5ura de la base de cada pico, /; la anc5ura del pico medida a la mitad de su altura . tr el tiempo de retencin. )l n!mero N puede, dentro de ciertos l"mites, ser aumentado alargando la columna, pero tambin aumentan el tiempo de retencin . el anc5o

)fecto del n!mero de platos tericos en la distribucin de un soluto. Mientras ma.or sea 3, (. menor I) ms angosto ser el pico del analito.

$ROCESOS <UE TIEN%EN A AUMENTAR LA ANC2URA %EL $ICO %E ELUCION %E UN ANALITO #7iempo re$uerido para aplicar la muestra a la columna. # 0ifusin longitudinal. )l analito tiende a difundir de zonas de alta concentracin a a$uellas de baja concentracin. # Caminos m!ltiples. )l empa$ue de la columna es aleatorio . esto genera muc5os caminos entre las part"culas para el analito . la fase mvil. #7iempo re$uerido para el e$uilibrio entre las dos fases. Mientras ms pe$ueJas las part"culas de la fase estacionaria, ms rpido es el e$uilibrio . menor la tendencia a la difusin.

)l Aito de un sistema cromatogrfico determinado se eval!a por su capacidad de resolucin . depende de los siguientes parmetros( # electividad. Capacidad del sistema de discriminar entre compuestos relacionados estructuralmente. e refleja en los valores de Kd. 0epende de la naturaleza $u"mica de las fases fijas . mvil. /lta selectividad muestra la cromatograf"a de afinidad. # )ficiencia. )s una medida de los efectos de difusin $ue producen picos ms anc5os . $ue se sobreponen. Importante el empa$ue de la columna. # Capacidad. )s un "ndice de la cantidad de material $ue puede ser resuelto sin sobreposicin de picos. ,a cromatograf"a de intercambio inico . el cromatoenfo$ue son de alta capacidad.

CLASIFICACION %E LA CROMATOGRAFIA LI<UI%A %E ACUER%O A LA $RESION GENERA%A %ENTRO %E LA COLUMNA

Cromatograf"a de baja presin( presiones menores a L bar (',L M6a, L,= /tm). Cromatograf"a de presin media( genera presiones entre M . L' bar. (-6,C N<' # L' bar) Cromatograf"a de alta presin( presiones sobre L' bar. 0enominada tambin I6,C.

2$LC (;i5; 'er or&ance li=+id c;ro&ato5ra';>), Cro&ato5ra ?a l?=+ida de alto rendi&iento ,a capacidad de resolucin de una columna cromatogrfica aumenta con el n!mero de platos tericos . stos con el largo de la columna (dentro de ciertos l"mites, por la tendencia al ensanc5amiento de los picos). )l n!mero de platos tericos est asociado al rea de las part"culas de la fase fija (mientras ms pe$ueJas, mejor la resolucin pues se reduce el tiempo de e$uilibrio entre fase fija . mvil). /l ac5icarse las part"culas, aumenta la resistencia al flujo, . esto obliga a aplicar altas presiones.

Isocrtico( igual composicin

0iferencias entre una elucin isocrtica . una elucin por gradiente en una cromatograf"a I6,C de una mezcla de =M aminocidos. )l sistema de bombas en una elucin por gradiente es ms complejo pues re$uiere mezclar solventes, pero se obtiene una mejor resolucin.

COM$ONENTES %E UN E<UI$O %E 2$LC Col+&na!, se las fabrica de acero inoAidable para $ue resistan presiones de 5asta LL M6a (LL' bar). ,argo 5asta L' cm4 dimetro( = a & mm. Matrice! ( a!e! e!tacionaria!)( part"culas esfricas de tamaJo uniforme para minimizar difusin. 7res tipos( Microporo (L#=' Om dimetro)4 microporos $ue se ramifican en toda la part"cula. 6elicular (porosa superficial)4 part"culas porosas $ue cubren un slido inerte (bolitas de vidrio de N&' Om de dimetro). -ases unidas (bonded p5ases). ,a fase estacionaria est $u"micamente ligada a un soporte inerte como s"lice. Fa!e &4il, solventes de alta pureza, $ue deben ser desgasificados. Bo&@a!, deben operar 5asta LL M6a, sin generar pulsos

COM$ONENTES %E UN E<UI$O %E 2$LC (Continuacin) %etectore!, deben ser mu. sensibles (poca muestra) . estables.

Lon5it+d de onda 4aria@le. on espectrofotmetros de luz ultravioleta . visible con celdas de flujo continuo. Arre5lo de diodo!. 6ermiten detectar el espectro completo. Fl+ore!cente!. /lta sensibilidad. 6ocos analitos fluorescentes. Indice de re raccin. ensibilidad limitada pero responden a cual$uier analito. E!'ectr&etro de &a!a!. 0eteccin . determinacin simultnea de la estructura del analito. Electro=+?&ico!. Mu. sensibles. :tiles en la deteccin de analitos $ue pueden ser oAidados o reducidos. 0os electrodos, uno de referencia . el otro *de trabajo+, al $ue se aplica un potencial constante. /l fluir un analito, ste se reduce u oAida, pasando una corriente entre ambos electrodos, la $ue es registrada.

A, detector de arre5lo de diodo!1

B, detector +ltra4ioleta1