MTODOS DE OBTENCIN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

El mtodo ms habitual de obtencin de anticuerpos monoclonales se basa en la activacin de linfocitos B frente al antgeno contra el que se desea obtener los anticuerpos especficos. Las clulas B se suelen obtener del bazo de un ratn que ha sido inmunizado repetidamente con el antgeno para aumentar el nmero de linfocitos B que lo reconocen, as como su afinidad. Estas clulas B se fusionan con clulas de mieloma de ratn que no produce anticuerpos, aun cuando conserva la capacidad de fabricarlos. Una vez conseguida la fusin existen, en teora, tres tipos de clulas: los hbridos de los diversos clones de linfocitos B y una clula de mieloma, clulas B y clulas de mieloma, ambas sin fusionar. De estas se seleccionan los hbridos, que adquieren el carcter inmortal de la clula tumoral. Posteriormente se seleccionan aquellas que tienen la especificidad deseada y se cultivan con el fin de que generen los anticuerpos deseados. Los clones que producen el anticuerpo monoclonal se pueden expandir y crecer en cantidades grandes e ilimitadas, bien como tumores ascticos en animales, en biorreactores de fibras huecas o incluso mediante ingeniera gentica Tcnica de produccin de anticuerpos monoclonales El procedimiento para producir anticuerpos monoclonales demora, habitualmente, cuatro meses. Para ello, se inyecta en ratones el antgeno, aun cuando no est puro. Luego de un perodo de espera que permite un aumento de los linfocitos B especficos, se sacrifica el ratn y se extrae el bazo, rico en linfocitos. Como primera etapa, los linfocitos que se obtengan del bazo, se mezclan con clulas mielomatosas (clulas de un tumor de linfocitos), agregando adems polietilenglicol, un agente que facilita la fusin. Con esto se consigue que algunas clulas mielomatosas se fusionen con linfocitos del bazo, produciendo lo que se llama un hibridoma. Se logra as una clula que combina la capacidad de producir anticuerpos de los linfocitos, con la capacidad de multiplicarse indefinidamente de la clula mielomatosa. No todas las clulas logran fusionarse (hibridizarse), sino que por el contrario, un escaso nmero de ellas (slo una cada 2 x 105 de las clulas del bazo). De all que sea necesario eliminar todas aquellas clulas que no se fusionen (linfocitos y clulas mielomatosas). Los linfocitos que no se han fusionado se eliminan solos, porque luego de unas pocas divisiones, mueren. El problema ms complicado es eliminar las clulas del mieloma, que si continan multiplicndose. Las clulas mielomatosas que se utilizan para la fusin han sido genticamente alteradas, de modo que les falta una enzima vital para la sntesis de DNA: la hipoxantina guanina fosforibosiltrarferasa. Cuando estas clulas

mielomatosas mutadas se hacen crecer en un medie do cultivo especial, ellas tambin mueren. Sin embargo, si se logran fusionar con linfocitos normales, sobreviven, porque los linfocitos le proveen la enzima que a ellas les falta. De este modo, al poco tiempo, en el cultivo slo quedan las clulas fusionadas (hibridomas). Luego debe seleccionarse y purificarse, entre todos las hibridomas, aquel que produce el anticuerpo especfico que se desea. Muchas tcnicas se han utilizado para seleccionar los hibridomas especficos, siendo la ms usada aquella que utiliza un radioinmunoanlisis. Para ello, se fija el antgeno especfico en el fondo de pocillos de plstico. Luego, a cada uno de los pocillos se agrega el lquido del cultivo donde estn creciendo las colonias de hibridomas. En aquellos casos en que las colonias secretan el anticuerpo especfico ste va a reaccionar con el antgeno que se ha fijado al plstico, los dems se eliminan por un simple lavado. En este momento se agrega un reactivo (marcado con un radioistopo) que reacciona solamente con la molcula de anticuerpo monoclonal (generalmente un segundo anticuerpo especfico contra los anticuerpos monoclonales). Despus de un tiempo de incubacin apropiada, nuevamente se lavan los pocillos. Para ubicar el hibridoma que interesa se busca en qu pocillo est la radioactividad (figura 2).

La etapa final, es separar los distintos hibridomas resultantes, con el fin de obtener una poblacin proveniente de una sola clula (clon). Para ello, las clulas se diluyen hasta lograr que una clula quede en un micropocillo de cultivo. El anticuerpo producido por esta clula y sus progenitoras (clon), es un anticuerpo monoclanal. De all en adelante estas clulas se pueden guardar congeladas o cultivar y multiplicar por siempre (figura 2). Estos hibridomas pueden inyectarse en la cavidad peritoneal de un ratn donde se multiplican y desarrollan como un cncer secretando al mismo tiempo el anticuerpo deseado. Este mtodo es til para el trabajo de laboratorio, pero no es prctico ni econmico para la produccin comercial del anticuerpo monoclonal. Por esto, se ha buscado otra forma para poder reproducir y multiplicar el hibridoma; el mtodo llamado Encapel, que consiste en capsular los hibridomas, en pequeas esferas (figura 3).

Primero se colocan los hibridomas en una solucin biocompatible de alginatos (sustancia derivada del alga Gracilaria), y luego se encapsulan con una membrana de polmeros de almidn. La porosidad de la membrana de la cpsula permite que los gases y nutrientes fluyan al interior y que los productos de desechos, salgan de ella. Cuando se alcanza la densidad apropiada de anticuerpos en su interior, las cpsulas se rompen y se recolecta la protena (figura 4).

Anticuerpos Monoclonales Humanos

Produccin de anticuerpos monoclonales humanos La produccin de anticuerpos monoclonales humanos ha sido abordada desde dos frentes principales. Uno es a travs de la inmortalizacin de las clulas productoras de anticuerpos, aspecto que detallaremos a continuacin, y el otro mediante el uso de tcnicas de biologa molecular y ADN recombinante, el cual se describe ms adelante, en la seccin que hemos titulado "Anticuerpo de segunda generacin" Inmortalizacin de las clulas productoras de anticuerpos La preparacin de anticuerpos monoclonales humanos mediante la inmortalizacin de las clulas productoras de stos ha tenido que enfrentar dos escollos importantes que vale la pena mencionar antes de detallar las tcnicas por las cuales se ha abordado este objetivo. Uno es la fuente de donde obtener los linfocitos B humanos. En la mayora de los casos, la sangre perifrica ha sido la fuente prcticamente obligada (James y Bell, 1987). Desgraciadamente, en la sangre perifrica la proporcin relativa de linfocitos B es baja si se compara con rganos linfoides como el bazo y los ganglios. Adems, se cree que en la sangre perifrica son pocos los linfocitos B que se encuentran en el estadio adecuado de diferenciacin para rendir hbridos productores de inmunoglobulinas (Schwaber et al., 1984). El otro aspecto es la inmunizacin. A menos que uno cuente con la suerte de tener individuos inmunizados de forma "natural", son pocos los casos en los que deliberadamente se puede inmunizar a un ser humano para luego obtener una muestra de sus linfocitos B inmunes y utilizarlos para la produccin de anticuerpos monoclonales. Resultados obtenidos por Melamed en 1987 realizando estudios para la produccin de anticuerpos monoclonales humanos con especificidad por el grupo sanguneo Rh ilustran la importancia que la inmunizacin tiene para la generacin de un anticuerpo monoclonal. En estos estudios se encontr que el tiempo para la obtencin de los linfocitos desde el momento M ltimo "contacto con el antgeno" resulta crtico para el xito o fracaso (Melamed et al, 1987). La utilizacin de esquemas de inmunizacin in vitro se mantiene como una alternativa promisoria para la resolucin de este problema. Haciendo uso de los avances en el conocimiento de los mecanismos y seales solubles que se ponen en juego durante la aparicin de la respuesta inmune humoral, como por ejemplo la interaccin de linfocitos B con linfocitos T cooperadores activados que expresan el ligando para CD40 (Banchereau et al., 1991) y con clulas dendrticas foliculares, el efecto de ciertas interleucinas como las IL-2, IL-4, IL-5 (Phillips y Klaus, 1992; Morikawa et al., 1993), la IL-6 (Hirano y col., 1987; Tosato et al., 1988), la IL-10 (De Waal et al., 1992; Briere et al., 1993; Burdin et al., 1993) y la forma soluble de CD23 (Thorley-Lawson, 1988), en conjunto con los avances en el desarrollo de nuevos agentes adyuvantes tipo P3C-X (Hoffman et al., 1990) y muramil-dipptido (Carrol et al., 1990) y la caracterizacin de las influencias que ejercen in vitro las poblaciones celulares presentes en la sangre perifrica que, como se mencion, es la fuente principal para la obtencin de los

linfocitos B en la mayora de los casos (eliminacin de la poblacin de linfocitos T CD8+) (Borrebaeck, 1988), es probable que pronto se disponga de una manera confiable de inmunizar linfocitos B humanos in vitro. La inmortalizacin de las clulas humanas productoras de anticuerpos se ha hecho bsicamente por tres vas. Una es la transformacin de los linfocitos B humanos con el virus de Epstein-Barr (VEB); otra la fusin de clulas somticas para generar horno o heterohibridomas y una ltima que combina las dos primeras; es decir, transformacin con el VEB seguido de fusin celular. Inmortalizacin por transformacin con el VEB Desde 1968 se conoce que la infeccin de linfocitos B humanos con el VEB induce en ellos un proceso de transformacin que les faculta para crecer por perodos prolongados en cultivo, generndose las, as llamadas lneas linfoblastoides (Pope et al., 1968). El primer reporte de tina lnea linfoblastoide productora de anticuerpos de especificidad conocida fue hecho por Steinitz en 1977, quien obtuvo anticuerpos monoclonales humanos especficos para el hapteno NNP (Steinitz et al., 1977). La tcnica es relativamente sencilla: consiste en aislar la fraccin de clulas mononucleares (CMN) a partir del "buffycoat" de una muestra de sangre, obtenida de un donante en cuyo suero se hayan detectado los anticuerpos deseados. Estas CMN son luego incubadas con una fuente de VEB, lo cual permite que ocurra la infeccin viral con la subsecuente multiplicacin celular y produccin de anticuerpos. Dado que las clulas B infectadas expresan antgenos virales en su superficie (Thorley-Lawson, 1988) y ms del 95% de los seres humanos posee inmunidad contra el VEB (es el agente causal de la mononucleosis infecciosa o enfermedad del beso) (Henle et al, 1968), es necesario eliminar o inactivar los linfocitos T citotxicos especficos presentes en las CMN. Esto se logra comnmente aadiendo a los cultivos fitohemaglutinina o ciclosporina A. Al cabo de unos 7-10 das se examina el sobrenadante de los cultivos en busca de aquellos que contengan los anticuerpos deseados y se procede a aislar o clonar las clulas linfoblastoides productoras de stos. Dicho aislamiento se ha realizado mediante tcnicas de roseteo, "panning" o "FAC-sorting" (Kozbor y Roder, 1983) y es necesario debido a que las clulas linfoblastoides obtenidas constituyen una poblacin heterognea en la cual, por lo general, terminan predominando las clulas B no productoras de las inmunoglobulinas de inters. A pesar de su simplicidad, muchos investigadores han encontrado numerosos inconvenientes al tratar de producir anticuerpos monoclonales mediante la transformacin con VEB. Quizs el ms importante de estos inconvenientes es la manifiesta incapacidad que exhiben las clulas linfoblastoides para clonarse a baja densidad celular (James y Bell, 1987). Como mencionamos, este clonamiento es fundamental para minimizar el riesgo de sobrecrecimiento de las clulas en las que no estamos interesados por encima de las que s, pero adems es importante para garantizar la clonalidad de una preparacin dada de anticuerpos. De manera que, aun teniendo xito en la fase de aislamiento o seleccin, en muchos casos el producto obtenido es oligoclonal, no monoclonal. Adems, la experiencia acumulada indica que

las clulas linfoblastoides tienden con el tiempo a disminuir e incluso a detener la produccin de anticuerpos y a dejar de crecer (Thompson, 1988). Preparacin de hibridomas Otra manera de inmortalizar las clulas productoras de anticuerpos ha sido mediante la fusin de clulas somticas para generar hibridomas humanos (Abrams et al., 1986). Por diversas razones, algunas de ellas no del todo entendidas, la produccin de hibridomas humanos ha resultado bastante ms dificultosa que la obtencin de los homlogos hibridomas de ratn. Entre estas razones se encuentra la no disponibilidad de una pareja (o parejas) de fusin adecuada. La obtencin de lneas mielomatosas humanas equiparables a las existentes en el modelo murino ha resultado difcil. Las clulas de mieloma humano se adaptan pobremente a crecer en cultivo y adems exhiben baja fusogenicidad y eficiencia de clonamiento. As mismo, las pocas lneas que se han generado son productoras, ya sea de cadenas livianas o pesadas (Kozbor y Roder, 1983: James y Bell, 1987; Thompson, 1988; Larrick y Gavilondo, 1989). Estos inconvenientes han provocado la utilizacin de las lneas mielomatosas mridas en la construccin de "heterohibridomas" humano-ratn. Sin embargo, con este sistema se ha presentado el problema de la inestabilidad de los hbridos. Esta inestabilidad radica, fundamentalmente, en la ocurrencia de un fenmeno denominado segregacin (prdida preferencial de los cromosomas de una especie que ocurre cuando se hibridizan clulas somticas de diferentes especies). Desafortunadamente, en el caso de los heterohibridomas humano-ratn los cromosomas que se segregan son los humanos (James y Bell, 1987). Tratando de disminuir este problema se ha optado por preparar hbridos humano-ratn (los llamados "heteromielomas") para usarlos como pareja de fusin, con la esperanza de que al tener un componente humano previo, el nuevo hbrido no segregue tan vigorosamente los cromosomas humanos (Foung et al., 1986; Grunow et al., 1988; Jahn et al., 1990). Transformacin con el VEB + fusin celular. La otra forma cmo se ha abordado el problema de producir anticuerpos de manera continua en el laboratorio es mediante la combinacin de las dos tcnicas antes mencionadas, es decir transformacin con VEB y posterior fusin con mieloma o heteromieloma. Este enfoque ha resultado ms exitoso que cualquiera de las dos tcnicas por separado. En esencia, el esquema bsico de ambas tcnicas es respetado: luego de la transformacin y enriquecimiento de las clulas transformadas productoras del anticuerpo, stas se fusionan con una poblacin de clulas de mieloma o heteromieloma. El producto de fusin es ahora sometido a un proceso de doble seleccin negativa en un medio que contiene una droga para eliminar las clulas mielomatosas (por lo general aminopterina, ya que ordinariamente las clulas de mieloma utilizadas son deficientes en la enzima HGPRT) y una droga para eliminar las clulas linfoblastoides humanas no fusionadas (se emplea Ouabaina, un inhibidor de la ATP-asa Na-K de la membrana celular, para el cual las clulas humanas exhiben una mayor susceptibilidad que las de ratn). Esta variante fue introducida en 1982

(Kozboret al., 1982) y ha sido ampliamente utilizada para la produccin de anticuerpos monoclonales humanos contra distintos antgenos. Mediante el uso de estas tcnicas varios laboratorios en el mundo, incluyendo el nuestro ubicado en el Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas, han producido anticuerpos monoclonales humanos anti-Rh. El inters fundamental en esta rea reside en su posible utilidad como reactivos de clasificacin eritrocitaria y en su potencial uso como sustitutos de la preparacin policlonal anti-Rh que actualmente se utiliza para prevenir la inmunizacin materno-fetal en los casos de incompatibilidad Rh. No obstante, estos anticuerpos tambin han ayudado enormemente a definir los detalles finos de la antigenicidad del antgeno D y a la identificacin y caracterizacin de la(s) molcula(s) en la(s) que reside el factor Rh. Resumen del Proceso de Produccin de un Anticuerpo Monoclonal H Resumen del Proceso de Produccin de un Anticuerpo Monoclonal Humano En la figura 2 se esquematizan los pasos necesarios para el desarrollo de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales humanos.

FIGURA 2. ESQUEMA PARA LA PRODUCCIN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS TOMADO Y MODIFICADO DE KOZBOR Y RODER, 1983.

Anticuerpos monoclonales de segunda generacin En esta seccin se tratar lo relativo a dos modalidades de produccin de anticuerpos monoclonales que tienen una perspectiva tremenda en el campo de la teraputica y el diagnstico in vivo. Son stas la produccin de anticuerpos biespecficos y de anticuerpos recombinantes. Anticuerpos biespecficos Es bien sabido que una molcula de inmunoglobulina reconoce dos determinantes antignicos iguales, gracias a la existencia en su estructura de dos puntos de combinacin idnticos. Pero sera muy til disponer de inmunoglobulinas en las cuales cada sitio de unin (o punto de combinacin) reaccione con un determinante antignico diferente, permitindoles as interactuar simultneamente con dos antgenos distintos. Son estas molculas las que han sido llamadas anticuerpos biespecficos. Su preparacin se ha logrado mediante la fusin de, ya sea un hibridoma especfico para uno de los antgenos con linfocitos de un animal inmunizado contra el otro antgeno (generndose clulas hbridas llamadas triomas), o de dos hibridomas cada uno con especificidad por un antgeno distinto (dando lugar a los llamados cuadromas). Tanto los triomas como los cuadromas expresan los genes de las inmunoglobulinas provenientes de ambas clulas progenitoras y en ambos ocurre la combinacin aleatoria de los productos proticos de estos genes. Por lo tanto, estas clulas producen anticuerpos monoespecficos para cada antgeno pero adems producen molculas de anticuerpos especficas para ambos antgenos (Gavilondo, 1990), A ttulo de ejemplo, en 1993 Kaneko y col. publicaron en la revista "Blood" la generacin de un anticuerpo biespecfico de uso potencial en el tratamiento en humanos de la leucemia mieloide aguda. Este anticuerpo es especfico para la molcula CD3 presente en los linfocitos T humanos y para la molcula CD13, la cual se expresa abundantemente en las clulas leucmicas. In vitro, este monoclonal hbrido fue capaz de estimular la lsis de clulas leucmicas provenientes de pacientes con leucemia mieloide aguda, por parte de clulas mononucleares de sangre perifrica autlogas, estimuladas con interleucina 2 o interleucina 7. Los autores proponen a este monoclonal como una herramienta para la eliminacin de clulas CD13+ en trasplantes de mdula sea autloga en pacientes con este tipo de leucemia (Kaneko et al., 1993). Anticuerpos recombinantes Las tecnologas de ADN recombinante se han revelado como una herramienta tremendamente poderosa y promisoria para la preparacin, modificacin y mejoramiento de los anticuerpos monoclonales, tanto de origen mrido como humano. Esto ha sido posible gracias al conocimiento detallado que se tiene en la actualidad sobre la estructura y organizacin de los genes que codifican a las molculas de inmunoglobulina (Max, 1993). La combinacin de este conocimiento y estas tecnologas ha permitido hacer verdadera ingeniera molecular para preparar molculas de inmunoglobulina en las que las regiones que determinan la especificidad por el antgeno provienen de genes de ratn y el resto de la molcula es codificado por genes humanos. Virtualmente todo el trabajo de ingeniera molecular, cuyos detalles escapan de los alcances de esta revisin, se realiza a nivel del ADN. El producto de este

trabajo son genes hbridos o, ms apropiadamente, recombinantes que ahora pueden ser insertados en vectores adecuados los cuales permiten su expresin (transcripcin a ARN mensajero y traduccin a protena) en bacterias o en clulas eucariotas como ciertos hongos unicelulares o lneas celulares de mamferos. Han surgido as los llamados anticuerpos "quimricos" y "humanizados" como una alternativa tecnolgica en los intentos de evitar o disminuir la respuesta inmune humana antiinmunoglobulina de ratn, que se genera cuando inyectamos un anticuerpo murino, pero sin perder la especificidad que ste nos brinda (Winter y Milstein, 1991 ). A ttulo de ejemplo se puede mencionar el trabajo de Hale y col., publicado en 1988 por a revista "Lancet" donde se seala la utilizacin de ese tipo de reactivos humanizados en el tratamiento de pacientes con linfomas, obtenindose mejores resultados que con el uso de los monoclonales murinos (Hale et al., 1988). Estas tecnologas tambin han permitido la preparacin de genes que codifican molculas hbridas en las que el fragmento Fc del anticuerpo ha sido sustituido por una enzima, una toxina o una droga. Estos genes recombinantes pueden tambin ser expresados apropiadamente, obtenindose molculas con la capacidad de reconocer especficamente a un antgeno (mediante el fragmento de inmunoglobulina) y con una propiedad funcional nueva, distinta de la del anticuerpo "natural", conferida por la actividad enzimtica, de toxina o de droga que le ha sido artificialmente incorporada. Un ejemplo interesante y con una enorme potencialidad prctica lo constituye un gen recombinante preparado por Schnee en 1987, en el cual se combinaron los segmentos gnicos que codifican la cadena beta del activador tisular del plasmingeno y la regin de combinacin de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal con especificidad por la fibrina. Al ser expresado este gen, se obtuvo una protena recombinante capaz de reconocer especficamente cogulos de fibrina y participar en su disolucin (Schnee et al., 1987). As mismo, una serie de inmunotoxinas (as se llaman las protenas recombinantes anticuerpo-toxina) han sido preparadas y estn siendo evaluadas para su uso como agentes profilcticos en la enfermedad injerto contra husped que aparece con frecuencia luego de un transplante de mdula sea (Antin et al, 1990), en la eliminacin de clulas leucmicas u en el tratamiento de linfomas (Amlot et al., 1993; Grossbard y Nadler, 1994).