INSTITUTO TECNOLGICO DE LA PAZ B.C.S.

Determinacin de protenas por el mtodo de Lowri Practica n5 Laboratorio de Bioqumica

Othoniel Sebastin Salazar Mrquez Ana Lourdes Mayoral Cuesta

Resumen. Para determinar la concentracin proteica de una muestra de acuerdo a este mtodo, se elabora primero una curva patrn o de calibracin con un estaar de protena pura, a distintas concentraciones y con las lecturas de absorbancia correspondientes. Despus se lee la absorbancia de la muestra y con la curva de calibracin se obtiene la concentracin proteica correspondiente a esa lectura de absorbancia. As pues es necesaria una solucin estndar de protena pura. La protena mas empleada es la Albumina de suero bovino cristalina. La solucin estndar se prepara a una concentracin de 1 mg/ml = 1 g/ L. La cantidad de protenas se evaluaba midiendo la cantidad total de nitrgeno proteico, y teniendo en cuenta que este elemento representa aproximadamente el 16% del peso de una protena.

Introduccin. El mtodo de Lowry, es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. A la muestra se aade un reactivo que forma un complejo coloreado con las protenas, siendo la intensidad de color de la disolucin resultante proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de Lambert-Beer. Este mtodo consta de dos etapas; Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena, exponindose los residuos

de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con tartrato. La reduccin, bsico, del Ciocalteau por de los residuos tambin en medio reactivo de Folinlos grupos fenlicos de tirosina presentes

en la mayora de las protenas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Objetivo. Identificar algunos de los mtodos que se utilizan en los laboratorios para medir cuantitativamente la concentracin proteica.

Metodologa. Soluciones stock para el mtodo de Lowri. Solucin A Na2CO3 al 3% en NaOH 0.2N Solucin B CuSO4 al 2% en agua destilada Solucin C Tartrato de sodio y potasio al 4% en agua destila da Solucin D 48 ml de solucin A+1ml de solucin B + 1ml C (solucin de trabajo). Curva estndar. 1. Preparar una solucin stock de albumina srica bovina a una concentracin de 1 mg/ml (como se muestra en la tabla 1). 2. Realizar disoluciones de acuerdo a la tabla 2. A 200 L de cada dilucin se le adiciona 1 ml de la solucin de trabajo (D) y se mezcla. 3. Despus de 10 min de incubacin a temp. Ambiente se agrega 100L del reactivo Folin-Ciocalteau. Se mezcla y se incuba a T.A. y en oscuridad durante 30 min. 4. Leer muestra a una longitud de onda de 750nm. 5. La concentracin de protena se grafica contra la absorbancia correspondiente para obtener una curva patrn que se utilizara como referencia para calcular la concentracin de protena en la muestra problema.

Rombos de seguridad de las sustancias.

Na2CO3 (carbonato de sodio) Peligro a la salud = 2; Peligro de Inflamabilidad = 0; Peligro de Reactividad = 0.

0 2 0

CuSO4 (sulfato de cobre)

Inflamabilidad 0. Materiales que no se queman. Salud 2. Materiales bajo cuya exposicin intensa o continua puede sufrirse incapacidad temporal o posibles daos permanentes a menos que se d tratamiento mdico rpido. Inestabilidad / Reactividad 0. Materiales que por s son normalmente estables an en condiciones de incendio y que no reaccionan con el agua. Resultados. Tabla1. Preparacin de la solucin stock para la cuantificacin de protenas.
# TUBO SOLUCIN ESTNDAR ( L) AGUA DESTILADA (L) CONCENTRACIN (g/mL)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0 20 40 60 80 100 150 200 250 500

1000 980 960 940 920 900 850 800 750 500

0 20 40 60 80 100 250 200 250 500

Estndar: Stock 1 mg/mL = g/ L

Tabla 2. Tcnica de Lowri (10-500 g)

# TUBO

CONCENTRACIN (g/mL)

ESTNDAR ( L)

Solucin D ( L)

Rx folin ( L)

Abs 750 nm

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0 20 40 60 80 100 150 200 250 500

200 200 200 200 200 200 200 200 200 200

1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Bco. 0.079 0.129 0.131 0.139 0.145 0.221 0.326 0.386 0.457

Muestra problema: 0.051

Clculos. Calcular: Ordenada al origen, pendiente. Intercepto: -0.04946667 Pendiente: 0.04559394 Y=mx+b Y=( -0.04946667)(0.051)+( 0.04559394)
Y=0.4307113983 abs 0 0.079 0.129 0.131 0.139 0.145 0.221 0.326 0.386 0.457 Y m b 0.04559394 0.04559394 0.04559394 0.04559394 0.04559394 0.04559394 0.04559394 0.04559394 0.04559394 0.04559394 0.04559394 0.04946667 0.04168607 0.04946667 0.03921274 0.04946667 0.03911381 0.04946667 0.03871807 0.04946667 0.03842127 0.04946667 0.03466181 0.04946667 0.02946781 0.04946667 0.02649981 0.04946667 0.02298767 0.04946667

0.05 0.045 0.04 0.035 0.03 0.025 0.02 0.015 0.01 0.005 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Series1 Linear (Series1)

MUESTRA NUESTRA CONCENTRACION DE PROTEINAS CONTRA LA ABSORBANCIA TRANSMITIDA. Discusin. Este procedimiento involucra la formacin de un complejo cobre - protena en solucin alcalina. Este complejo reduce al reactivo fosfomolibdico- fosfotungstato lo que produce una intensa coloracin azul. Este mtodo tiene la ventaja de ser extremadamente sensible, capaz de detectar cantidades del orden de 10 microgramos de protena; su inconveniente principal es que al evaluar, como veremos, los fenoles presentes en la protena (esencialmente residuos de tiroxina), la intensidad del color resultante vara entre las distintas protenas. La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenlicos de los residuos de tirosina presentes en la mayora de las protenas, actuando el cobre como catalizador.

Conclusin. Con el mtodo de lowri observamos que muchas propiedades fueron cambiando a su aspecto natural, cumplindose el objetivo pudimos sacar la concentracin de protenas.

Bibliografa.
http://www.cosmos.com.mx/f/tec/d34x.htm http://portales.puj.edu.co/doc-quimica/FDS-LabQca-DianaHermith/Na2CO3.pdf