Anda di halaman 1dari 9

PERCOBAAN 1B KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) UNTUK ANALISIS OBAT

I.

Tujuan 1. Untuk memahami dan trampil melakukan teknik KLT dalam uji skrining obat. 2. Untuk mengetahui pengembang yang sesuai dengan senyawa yang dianalisis. 3. Untuk mengetahui komponen komponen yang terdapat dalam obat. 4. Untuk mengidentifikasi senyawa dan memisahkan senyawa pada sampel obat. 5. Untuk menentukan nilai Rf senyawa standar dan sampel obat.

II.

Dasar Teori Terdapat banyak cara untuk memisahkan senyawa dalam suatu campuran, salah satu diantaranya yang paling sering dan mudah digunakan yaitu kromatografi. Proses kromatografi melibatkan 2 fase yaitu fase gerak dan fase diam. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan sedangkan fase diam dapat berupa bentuk padatan atau berupa lapisan cairan encer yang diserap oleh sebuah padatan. Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan 2 fase yaitu fase gerak dan fase diam serta mengkuantifikasi macam-macam komponen dalam suatu campuran yang kompleks, baik komponen organik mauapun anorganik. Kromatografi dapat diklasifikasikan berdasarkan mekanisme pemisahannya misalnya kromatografi adsorpsi, afinitas, dan penukar ion. Kromatografi juga dapat diklasifikasikan berdasarkan alat yang digunakan seperti Kromatografi Kertas (KK), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dan Kromatografi Gas (GC). Dalam kromatografi juga dikenal istilah kromatografi jenis planar dan kolom. Kromatografi planar menggunakan fase diam berupa lempeng tipis yang umumnya terbuat dari kaca, lempeng alumunium dan sebagainya. Yang termasuk kromatografi planar yaitu kromatografi kertas (KK) dan kromatografi lapis tipis (KLT). Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu metode yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen dari sutau senyawa, berdasarkan perbedaan adsorpsi atau partisi fase diam (adsorben) dengan pelarut pengembang (fase gerak). Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikiann juga peralatan yang digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan hampir semua laboratorium melaksanakan metode ini. Kromatografi lapis tipis (KLT) fase diamnya berupa lapisan

seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat alumunium, atau pelat plastik. Fase diam pada KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 m. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam, semakin baik kinerja KLT dalam hal efisien dan resolusinya. Penjerap yang paling sering digunakan adalah silica dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama adalah pada KLT yaitu adsorpsi dan partisi. Fase gerak dapat ditentukan dengan uji pustaka atau dengan dicoba-coba karena pengerjaan KLT ini cukup cepat dan mudah. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran ini dapat diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi dengan optimal. Dalam pembuatan dan pemilihan fase gerak yang harus diperhatikan yaitu kemurnian dari eluen itu sendiri karena KLT merupakan teknik yang sensitif, daya elusi dari pelarut itu juga harus diatur sedemikian rupa agar harga Rf berkisar antara 0,2-0,8 yang menandakan pemisahan yang baik, polaritas dari pelarut juga harus diperhatikan agar pemisahan terjadi dengan sempurna. Ada dua faktor yang mempengaruhi gerak komponen (pada eluen yang digunakan) yaitu keseimbangan yang terbentuk pada bidang antar muka diantara butiran-butiran fasa diam dan fasa cair yang bergerak dan kelarutan relatif zat terlarut pada fasa geraknya. Kompetisi antara molekul-molekul zat terlarut dan pelarut untuk teradsorpsi menimbulkan suatu proses di mana molekul-molekul zat terlarut dan molekul-molekul pelarut secara kontinu mengadakan kontak dengan permukaan adsorben, tertahan beberapa saat di permukaan dan kemudian masuk kembali pada fasa gerak. Pada saat teradsorpsi, zat terlarut dipaksa untuk berpindah oleh aliran maju fasa gerak, akibatnya hanya molekul-molekul dengan dengan afinitas yang lebih besar terhadap adsorben yang akan tertahan secara selektif. Analisa kualitatif terhadap analit dapat dilakukan menggunakan metode KLT dengan cara melihat kesamaan nilai Rf dari komponen analit terhadap senyawa pembanding (standar). Sedangkan penentuan kadar analit secara kuantitatif dapat ditentukan dengan larutan standar/baku yang dipakai dalam spektrofotometri UV-Visibel melalui metode kurva kalibrasi atau adisi standar. KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, atau preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan system penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf dapat

didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0. Adapun keuntungan dari penggunaan kromatografi lapis tipis ini dapat ditentukan sebagai berikut: Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

Pengembangan (elusi) memberikan hasil spot/noda. Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan dengan cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas. Berikut adalah cara-cara kimiawi dan fisika untuk mendeteksi bercak: Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi secara kimia dengan solute yang mengandung gugus fungsional tertentu sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang-kadang dipanaskan terlebih dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan intensitas warna bercak. Metode deteksi bercak secara kimia dapat dilakukan dengan menyemprot, mencelupkan atau melewatkan kromatogram melalui larutan pereaksi/larutan penampak bercak. Pereaksi umum yang digunakan, antara lain: Asam sulfat pekat, uap Iodium atau dengan asam-asam lainnya, seperti asam perklorat 2%, asam ortofosfat 50% yang member noda berfluoresensi, asam fosfomolibdat 10% yang member noda berwarna. Selain itu dapat digunakan campuran asam sulfat dengan oksidator kuat Iserisulfat, kalium permanganat, kalium bikromat, dan asam nitrat yang memberi usai dipanaskan. Ada juga pereaksi deteksi bercak kimiawi seperti halida logam (antimon triklorida, antimon pentaklorida, seng klorida, dan besi (III) klorida dalam pelarut organik yang memberikan noda berfluoresen

Mengamati lempeng dibawah lampu ultraviolet yang dipasang panjang gelombang emisi 254 atau 365 nm untuk menampakkan solut sebagai bercak yang gelap atau bercak yang berfluorosensi terang pada dasar yang berfluorosensi seragam. Lempeng yag diperdagangkan dapat dibeli dalam bentuk lempeng yang sudah diberi dengan senyawa fluorosen yang tidak larut yang dimasukkan ke dalam fase diam untuk memberikan dasar fluorosensi atau dapat pula dengan menyemprot lempeng dengan reagen fluorosensi setelah dilakukan pengembangan. Cara ini merupakan salah satu cara deteksi spot/noda dengan cara fisika yang umum dilakukan.

III.

Materi dan Metode 3.1 Materi (Alat dan Bahan) Alat alat: 1. Plat KLT 2. Bejana kromatografi 3. Gelas ukur 4. Pipet mikro 5. Lampu UV 6. Gelas beker Bahan bahan: 1. Sampel obat 2. Senyawa standar 3. Toluena 4. Ammonia 5. Aseton

3.2 Prosedur Kerja 1. Senyawa standar dan sampel dilarutkan dalam pelarut yang sesuai (diberitahukan oleh pengawas) dengan konsentrasi 1-5%. Pelarut dipilih diusahakan yang mudah menguap dan non-polar. 2. Bejana kromatografi disiapkan dan dipilih sistem pengembang (tunggal atau campuran) yang tersedia dan dibuat sesuai dengan kebutuhan

3. Sistem pengembang dituang ke dalam bejana kromatografi, ditutup rapat dan dibiarkan sampai jenuh. Dinding bejana dilapisi kertas saring yang dibasahi dengan pelarut pengembang. 4. Plat KLT disiapkan, titik penotolan ditandai dengan pensil 1 cm dari tepi bawah plat dan batas atas dibuat 1 cm dari tepi atas plat. 5. Standar dan sampel ditotolkan dengan pipet mikro atau jarum suntik kira-kira 15L. Diameter penotolan sekecil mungkin (<5mm) an jarak antar penotolan kirakira 1 cm. Setiap penotolan diberikan nomor. 6. Plat diletakkan di dalam bejana pada posisi vertical. Titik awal penotolan standar/sampel harus tetap berada diatas permukaan fase gerak. Bejana ditutup dan disimpan pada suhu kamar. 7. Jika fase gerak telah sampai pada batas atas, plat dikeluarkan dan dikeringkan di udara. 8. Bercak atau noda dideteksi dengan lampu UV 254 nm atau 366 nm atau dengan penyemprotan reagen penampak noda. 9. Nilai Rf dari standar dan sampel dihitung dengan rumus:

3.3 Skema Kerja

IV.

Hasil dan Pembahasan Identifikasi bahan kimia obat pada praktikum kali ini menggunakan metode kromatografi lapis tipis. Dipilih metode ini karena pelaksanaan KLT relatif lebih mudah, peralatannya lebih sederhana, banyak digunakan untuk tujuan analisis dan KLT lebih fleksibel dalam pemilihan fase gerak. Selain itu KLT juga memiliki post chromatography yang beraneka ragam yang dapat menungkatkan sensitifitas dan selektifitas deteksi. Pada uji KLT, fase diam yang digunakan adalah plat KLT yang bersilika gel dengan kemampuan berfluoresensi dibawah lampu UV 254 nm atau yang dikenal dengan silika gel GF254. Fase gerak yang digunakan merupakan sistem pelarut dengan kombinasi dari 3 jenis pelarut yang berbeda, yaitu toluena, ammonia dan aseton. Adapun perbandingan yang digunakan untuk ketiga jenis pelarut tersebut secara berturut-turut adalah 45 : 45 : 10. dengan jarak pengembangan (jarak eluen) sebesar 5,7 cm. Pemilihan fase gerak ini pada dasarnya ditujukan untuk dapat mengelusi bahan kimia obat secara sempurna, yang berarti terjadi pemisahan yang signifikan sehingga kita dapat membandingkan secara jelas antara sampel dan standar untuk dapat menentukan bahwa sampel tersebut mengandung senyawa standar. Eluen (fase gerak) dijenuhkan terlebih dahulu sebelum plat kromatografi dimasukkan. Proses penjenuhan ini bertujuan untuk mencegah penguapan pelarut, karena pada umumnya pelarut yang digunakan pada metode kromatografi adalah pelarut yang mudah menguap. Untuk mengetahui apakah eluen sudah jenuh apa belum maka dapat digunakan kertas saring untuk memeriksanya yaitu dengan membasahi kertas saring dengan uap eluen. Senyawa standar dan sampel dilarutkan dengan pelarut yang kepolarannya rendah seperti aseton, aseton bersifat semipolar. Hal ini ditujukan agar spot dapat mengalami pergerakan dari titik awal spotting, mengingat bahwa fase diam yang digunakan bersifat polar, maka lebih baik jika digunakan sampel dan standar yang sebelumnya telah dilarutkan dengan pelarut yang kurang polar agar tidak terlalu lama tertahan di fase diamnya dan pemisahan bisa berlangsung lebih efisien. Selain itu digunakan aseton agar spot yang ditotolkan dengan pipet mikro dapat cepat mengering dan siap untuk dielusi. Cara menotolkan sampel pada plat KLT adalah larutan sampel tersebut ditotolkankan pada plat dengan menggunakan pipet mikro atau syringe. Pada plat mikro kira-kira 8-10 mm dari dasar, sedangkan untuk plat makro kira-kira 1,5-2,0 cm dari dasar. Untuk memperoleh hasil yang baik, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 mikroliter.

Jika volume sample yang akan ditotolkan lebih besar dari 2-10 mikroliter maka penotolan harus dilakukan dengan cara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan. Pengembangan dilakukan dengan teknik pengembangan menaik. Teknik ini merupakan teknik yang paling umum dilakukan untuk metode KLT. Setelah pengembangan selesai, dimana pelarut dibiarkan bergerak membawa spot sampel dan standar hingga pelarut mencapai pada batas atasnya. Selanjutnya plat KLT diangkat dari bejana kromatografi dan dikeringkan di udara. Setelah dikeringkan, spot yang dihasilkan tidak berwarna sehingga diperlukan pendeteksian noda dengan menggunakan lampu UV. Pengecekan spot dilakukan dibawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm, lalu noda dilingkari dengan menggunakan pensil (agar diketahui jarak spot dan dapat dihitung nilai Rf-nya). Dari hasil pengamatan jarak pergerakan komponen senyawa sampel sama dengan senyawa standar yaitu sebesar 3,5 cm, jadi dapat ditentukan nilai Rf senyawa ampel dan senyawa standar adalah sebagai berikut:

Dari hasil nilai Rf diatas menyatakan bahwa sampel memiliki nilai Rf yang sama dengan standar, hal ini berarti sampel memiliki komponen senyawa yang sama dengan komponen senyawa yang dimiliki oleh senyawa standar. Harga Harga Rf dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu: pelarut, bahan pengembang, suhu, kejenuhan chamber, kelembaban ruangan, dan konsentrasi. Beberapa keuntungan kromatografi lapis tipis adalah sebagai berikut :

Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.

Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.

Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

Kekurangan KLT adalah adanya fase gerak yang kemurnianya tinggi karena KLT sangat sensitif dan pada penentuan penjenuhan eluen dalam chamber biasanya kurang valid.

V.

Kesimpulan dan Saran 5.1 Kesimpulan 1. Fase diam yang digunakan dalam percobaan kromatografi lapis tipis untuk analisis obat adalah silika gel GF254 dan fase gerak yang digunakan adalah campuran pelarut toluena, ammonia dan aseton. 2. Proses penjenuhan pada eluen (fase gerak) ini bertujuan untuk mencegah penguapan pelarut, karena pada umumnya pelarut yang digunakan pada metode kromatografi adalah pelarut yang mudah menguap. 3. Jarak pergerakan komponen senyawa sampel sama dengan senyawa standar yaitu sebesar 3,5 cm. 4. Nilai Rf yang didapat pada komponen senyawa standar dan sampel sama yaitu: 0,614. 5. Karena nilai Rf senyawa standar dan sampel sama maka sampel memiliki komponen senyawa yang sama dengan komponen senyawa yang dimiliki oleh senyawa standar.

5.2 Saran Adapun saran untuk kedepannya pada percobaan kromatografi lapis tipis untuk analisis obat adalah sampel dan standar yang digunakan harus lebih dari satu agar bisa membandingkan senyawa sampel dengan senyawa standar dan mendapatkan data yang lebih banyak. Sampel dan standar harus diberi label, agar bisa mengidentifikasi dan menjelaskan secara lengkap pada percobaan ini.

DAFTAR PUSTAKA

Agoes, G. 2007. Teknologi Bahan Alam. Bandung: ITB Press. Gandjar, Ibnu Tholib dan Abdul Rohman, 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: UGM. Gholib, Ibnu. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Jundullah. 2007. Kromatografi Lapis Tipis. http://www.chem-is-try.org, diakses pada tanggal 19 Mei 2012. Lusia Oktora Ruma Kumala Sari. 2006. Pemanfaatan Obat Tradisional dengan Penimbangan Manfaat dan Keamanannya. Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. III, No.1, April 2006, 01 07. Marzuki, Asnah. 2013. Kimia Analisis Farmasi. Makassar: Dua Satu Press. Moch, Adnan. 1987. Teknik kromatografi untuk analisis bahan makanan. Yogyakarta: ANDI. Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung: ITB.