RESUMO PARA P1 DE BIOTECNOLOGIA FARMACUTICA

INTRODUO BIOTECNOLOGIA FARMACUTICA

manipulao de microrganismos, plantas, animais, objetivando a obteno de processos e produtos de interesse

A Biotecnologia pode ser definida tambm atravs desses termos: a)Utilizao de sistemas celulares para obteno de produtos e desenvolvimento de processos. b)A aplicao dos princpios cientficos e de engenharia para o processamento de materiais por agentes biolgicos proporcionando produtos e servios. c)Uso de tcnicas de regenerao in vitro e do DNA recombinante Conceito de biotecnologias apropriadas: -Tecnicamente factveis / -Benefcios mensurveis / -Ambientalmente seguras /-Socioeconomicamente aceitveis Principais tcnicas biotecnolgicas

Qual a contribuio das biotecnologias para o desenvolvimento sustentvel? Econmica: reduo de custos e aumento da eficincia (matria prima e produo industrial)

Ambiental: preveno, remediao e monitoramento da contaminao. Tecnologias limpas/verdes greentech ou cleantech - Termo utilizado para descrever produtos ou servios que melhorem o desempenho operacional, a produtividade ou eficincia, reduzindo custos, insumos, consumo de energia, resduos e poluio. Social: criao de empregos, qualidade de vida, segurana Os processos de biotecnologia ambiental levam em conta 5 elementos bsicos: 1)O composto txico a ser eliminado ou ter sua concentrao reduzida; 2)O meio em que o composto se encontra; 3)As caractersticas do local que o contem; 4)O agente biolgico que conduzir a biodegradao; 5)As condies do processo (parmetros). A aplicao de tecnologias biolgicas aplicadas a soluo de problemas ambientais determinada por 3 fatores: - Custo do tratamento. - Durao do processo. - Nvel ou limite ao qual se desejam diminuir ou chegar. Biossegurana Cincia surgida no sculo passado voltada para o controle e a minimizao dos riscos advindos da prticas de diferentes tecnologias, seja em laboratrio, seja quando aplicadas no meio ambiente Estuda os impactos decorrentes da biotecnologia na sade humana e animal e no meio ambiente .

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

No passado considerada a molcula mais difcil de ser analisada, hoje o DNA passou a ser a mais fcil. Agora possvel isolar uma regio especifica de quase todos os genomas para produzir um numero praticamente ilimitado de copias deles e determinar a sequencia de seus nucleotdeos em poucas horas. Por meio de tcnicas relacionadas, um gene pode ser alterado (engenharia de DNA) e transferido de volta para a linhagem germinativa de um animal ou vegetal, tornando-se uma parte fundamental e hereditria do genoma do organismo. A tecnologia do DNA recombinante compreende uma mistura de tcnicas, algumas recentemente desenvolvidas e algumas adotadas de outras reas como a gentica microbiana. Dentre as tcnicas esto as seguintes tcnicas chaves: -Clivagem de DNA em stios especficos por meio de nucleases de restrio, que facilitaram muito o isolamento e a manipulao de genes individuais. -Ligao de DNA, que torna possvel desenhar e construir molculas de DNA no encontradas na natureza. -Clonagem de DNA pelo uso de vetores de clonagem, ou pela reao em cadeia da polimerase, na qual uma poro de DNA repetidamente copiada para gerar vrios bilhes de molculas idnticas. -Hibridizao de cidos nucleicos, que torna possvel encontrar uma sequencia especifica de DNA ou RNA com grande preciso e sensibilidade, com base em sua habilidade de se ligar seletivamente a uma sequencia complementar de cidos nuclicos. -Determinao rpida da sequencia de nucleotdeos de qualquer DNA (mesmo genomas inteiros), o que torna possvel identificar genes e deduzir a sequencia de aminocidos das protenas que eles codificam.

-Monitoramento simultneo do nvel de mRNA produzido por gene na clula, utilizando microarranjos de cidos nucleicos, nos quais dezenas de milhares de reaes de hibridizao ocorrem simultaneamente. Nucleases de Restrio Diferentemente de uma protena, um gene no existe como uma entidade separada nas clulas, mas sim como uma regio pequena de uma molcula de DNA muito maior. Mesmo que o DNA possa ser quebrado aleatoriamente em pequenos fragmentos por fora mecnica, um fragmento contendo um nico gene no genoma de mamferos continuaria sendo apenas um entre centena de milhares de fragmentos de DNA. Como todas as molculas de DNA consistem em uma mistura aproximadamente igual dos quatro nucleotdeos, elas no podem ser prontamente separadas como as protenas podem de acordo com suas cargas e propriedades. A soluo deste problema comeou a surgir com a descoberta das nucleases de restrio. Essas enzimas, que podem ser purificadas a partir de bactrias, cortam a dupla hlice de DNA em stios especficos, definidos pela sequencia de nucleotdeos local, clivando, desse modo uma longa molcula de DNA de fita dupla em fragmentos de tamanhos estritamente definidos. Diferentes nucleases de restrio tm diferentes especificidades sendo relativamente simples encontrar uma enzima que possa criar um fragmento de DNA que inclua um gene em particular. O tamanho do fragmento do DNA pode ento ser utilizado como base para a purificao parcial de um gene de uma mistura. Diferentes espcies de bactrias produzem diferentes nucleases de restrio, que as protegem de viroses, degradando o DNA viral. Cada nuclease bacteriana reconhece uma sequencia especifica de 4 a 8 nucleotdeos. Essas sequencias que tambm ocorrem no genoma da prpria bactria so protegidas por metilacao nos nucleotdeos A ou C, j as sequencias de DNA estranho no so metiladas e assim so clivadas pelas nucleases de restrio. Hoje diversas nucleases obtidas de diferentes espcies de bactrias foram isoladas e so comercializadas. Algumas nucleases de restrio produzem clivagens assimtricas que deixam pequenas caudas de fita simples nas duas extremidades de cada fragmento, esse tipo de extremidade conhecido como extremidade coesiva, uma vez que cada cauda pode formar pares de bases complementares com a cauda de qualquer outra extremidade produzida pela mesma enzima. Essas extremidades permitem que quaisquer dois fragmentos de DNA possam ser unidas desde que os fragmentos tenham sido gerados pela mesma nucleasse de restrio (ou por outra nucleasse que produza as mesmas extremidades coesivas). As molculas de DNA produzidas pela unio de dois ou mais fragmentos de DNA so chamadas de molculas de DNA recombinante.

Eletroforese em Gel O procedimento de eletroforese para DNA mais simples que para protenas, uma vez que cada nucleotdeo em uma molcula de cido nucleico j carrega uma nica carga negativa (no grupo fosfato), no h necessidade de adicionar o detergente SDS carregado negativamente, necessrio para fazer com que as molculas de protenas movam-se uniformemente na direo do eletrodo positivo. O suporte utilizada na eletroforese varia de acordo com os propsitos de separao e os tamanhos dos fragmentos. Uma variao da eletroforese em gel de agarose, chamada de eletroforese em gel de campo pulsado, torna possvel separar at mesmo molculas de DNA muito longas, pois estas na eletroforese comum tendem a falhar, devido a movimentos sinuosos durante a migrao. J na eletroforese em gel de campo pulsado, a direo do campo eltrico se modifica periodicamente, o que fora a molcula a se reorientar antes de continuar a se mover sinuosamente no gel, nesta eletroforese as molculas mais longas se movem mais lentamente do que as mais curtas. As bandas de DNA em gis de agarose ou poliacrilamida so invisveis a menos que o DNA seja marcado ou corado de alguma forma. Um mtodo sensvel para corar DNA exp-lo ao corante brometo de etdeo, que fluoresce sob luz ultravioleta quando est ligado ao DNA. As molculas de DNA podem ser marcadas especificamente in vitro com radioistopos ou com marcadores qumicos que podem ser detectados quimicamente ou por fluorescncia. No primeiro mtodos, uma DNA-polimerase copia o DNA na presena de nucleotdeos que so radioativos, no segundo so utilizados precursores de nucleotdeos especialmente modificados. Dessa maneira as sondas de DNA contendo vrios nucleotdeos marcados podem ser produzidas para reaes de hibridizao de cidos nucleicos. Hibridizao de DNA Quando uma soluo aquosa de DNA aquecida at 100C ou exposta a um pH muito alto (maior que 13), a complementaridade de bases, que normalmente mantm as duas fitas da dupla-helice unidas, rompida, e a dupla-hlice rapidamente se dissocia em duas fitas simples. Esse processo chamado de desnaturao de DNA. Em 1961 descobriu-se que fitas simples complementares de DNA prontamente se reconstituem em duplas-hlices, num processo chamado de hibridizao ou renaturao do DNA, se fossem mantidas por um perodo prolongado a 65C. Podem ocorrer reaes similares de hibridizao entre qualquer fita simples de cidos nucleicos (DNA/DNA, RNA/RNA ou RNA/DNA), desde que tenham sequencias de nucleotdeos complementares. Essas reaes de hibridizao especficas so amplamente utilizadas para detectar e caracterizar sequencia de nucleotdeos especificas tanto nas molculas de RNA quanto de DNA. As molculas de DNA de fita simples utilizadas para detectar sequencias complementares so conhecidas como sondas. As reaes de hibridizao utilizando sondas de DNA so to sensveis e seletivas que podem detectar sequencias complementares presentes a uma concentrao to baixa quanto uma molcula por clula, assim possvel determinar quantas copias de qualquer sequencia de DNA esto presentes em uma determinada amostra de DNA. A mesma tcnica pode ser utilizada para procurar genes relacionados, mas no idnticos. Para encontrar o gene de interesse em um organismo cujo genoma ainda no foi sequenciado, por exemplo, uma poro de um gene conhecido pode ser utilizada como sonda.

Alternativamente, as sondas de DNA podem ser utilizadas para as reaes de hibridizao com RNA, em vez de DNA, para saber se uma clula esta expressando um dado gene. Nesse caso uma sonda de DNA, que contem parte da sequencia do gene hibridizada com RNA purificado da clula em questo para determinar se o RNA inclui sequencias nucleotdicas complementares sonda de dNA e, caso isso ocorra, em quais quantidades. Em procedimentos mais elaborados, a sonda de DNA tratada com nucleases especificas depois da hibridizao, para determinar as regies exatas da sonda de DNA que se parearam com as molculas de RNA. Desse modo, pode-se determinar os stios de inicio e de termino da transcrio de RNA, assim como as ligaes precisas das sequencias de ntrons e de xons em um gene.

Atualmente as posies das ligaes de ntrons/xons normalmente so determinadas pelo sequenciamento das sequencias de DNA complementar (DNAc) que representam os mRNAs expressos em uma clula e pela comparao delas com a sequencia de nucleotdeos do genoma. Clonagem de DNA Os genes podem ser clonados usando-se bibliotecas de DNA. Qualquer fragmento de DNA pode ser clonado. O termo clonagem de DNA utilizado em dois sentidos. Em um dos sentidos ele literalmente se refere ao ato de produzir varias copias idnticas de uma molcula de DNA a amplificao de uma determinada sequencia de DNA. Entretanto o termo tambm descreve o isolamento de uma determinada fita de DNA (frequentemente um gene em particular) a partir do resto do DNA da clula, pois esse isolamento muito facilitado fazendo-se varias copias idnticas do DNA de interesse.

A clonagem de DNA no seu sentido mais geral pode se realizada de varias maneiras. A mais simples envolve a insero de um fragmento de DNA particular no DNA genmico purificado de um elemento gentico que se autorreplica geralmente um vrus ou plasmdeo. Um fragmento de DNA contendo um gene humano, por exemplo, pode ser ligado em um tubo de ensaio, a um cromossomo de vrus bacteriano, e a nova molcula de DNA recombinante pode ento ser introduzida em uma clula bacteriana onde o fragmento de DNA inserido ser replicado junto com o DNA do vrus. Partindo apenas de uma dessas molculas de DNA recombinante, que infecta uma nica clula, o mecanismo normal de replicao do vrus pode produzir mais de 10 12 molculas de DNA viral em menos de um dia, amplificando tambm a quantidade do fragmento de DNA humano inserido pelo mesmo fator. Um vrus ou plasmdeo assim utilizado conhecido como vetor de clonagem, e o DNA propagado pela insero nele considerado clonado. Para isolar um gene especfico, inicia-se construindo uma biblioteca de DNA uma coleo abrangente de fragmentos clonados de DNA a partir de uma clula, um tecido ou um organismo. Essa biblioteca inclui no mnimo um fragmento que contenha o gene de interesse. Atualmente, a maioria das clonagens realizada em vetores plasmidiais, estes so pequenas molculas circulares de DNA fita dupla derivadas de plasmdeos maiores, que ocorrem naturalmente em clulas bacterianas. Para serem utilizados como vetores de clonagem, os crculos de DNA plasmidial purificados so primeiro clivados com uma nucleasse de restrio para criar molculas de DNA linear. O DNA genmico a ser utilizado na construo da biblioteca clivado com a mesma nuclease de restrio, e os fragmentos de restrio resultantes (incluindo aqueles contendo o gene a ser clonado) so ento adicionados aos plasmdeos clivados e anelados por meio das suas extremidades coesivas para formar crculos de DNA recombinante. Essas molculas de DNA recombinante, contendo insertos de DNA estranho, so ento covalentemente ligadas enzima DNA-ligase.

Na prxima etapa da preparao de uma biblioteca, os crculos de DNA recombinante so introduzidos em clulas bacterianas que foram preparadas para ser transitoriamente permeveis ao DNA. Essas clulas bacterianas so transfectadas com os plasmdeos. A medida que essas clulas crescem e se dividem, duplicando em nmeros a cada 30 minutos, os plasmdeos recombinantes tambm replicam para produzir um numero enorme de copias de crculos de DNA contendo o DNA estranho .

Vrios plasmdeos bacterianos carregam genes para resistncia a antibiticos, um propriedade que pode ser explorada para selecionar aquelas clulas que foram transfectadas com sucesso; se a bactria crescida na presena do antibitico, apenas as clulas contendo plasmdeos sobrevivero. Cada clula bacteriana original que foi inicialmente transfectadas contm, em geral um inserto de DNA estranho diferente; esse inserto herdado por todas as prognies de clulas daquela bactria que, juntas, formam uma pequena colnia em uma placa de cultura. Os fragmentos de DNA maiores so mais difceis de manipular e clonar. Ento, os pesquisadores comearam a utilizar cromossomos artificiais de leveduras (YAC, yeast artificial chromosomes), que podem acomodar pedaos muito grandes de DNA. Diferentemente de plasmdeos bacterianos menores, o plasmdeo F e seu derivado, o cromossomo artificial de bactria (BAC, bacterial artificial choromosome) est presente em apenas uma ou duas copias por clulas de E coli. O fato de que os BACs so mantidos em nmeros muito baixos nas clulas bacterianas pode contribuir para sua habilidade de manter estveis grandes sequencias de DNA clonadas: com apenas alguns BACs presentes, menos provvel que os fragmentos de DNA clonados se misturem pela recombinao com sequencias presentes em outras copias do plasmdeo. Por sua estabilidade, habilidade de aceitar grandes insertos de DNA e por serem facilmente manipulados, os BACs so agora os vetores preferidos para construir bibliotecas de DNA de organismos complexos incluindo aqueles representando o genoma humano e o de camundongo. Limitaes Dos Plasmdeos Como Vetores De Clonagem: Tamanho: limita o tamanho do fragmento de DNA a ser clonado; Stios de restrio: baixo nmero de stios de restries limitando o uso de diferentes enzimas de restrio para produo de insertos; Poucos marcadores genticos para seleo: ex: R a antibiticos, metabolismos especficos, etc. Bibliotecas de DNA Clivar todo o genoma de uma clula com uma nucleasse de restrio especfica e clonar cada fragmento como descrito produz um grande numero de fragmentos de DNA. Os fragmentos so distribudos entre milhes de colnias diferentes de clulas bacterianas transfectadas. Quando trabalhamos com BACs em vez de plasmdeos tpicos, podem ser inseridos fragmentos maiores, e assim menos clulas bacterianas transfectadas so necessrias para cobrir o genoma. Em ambos os casos, cada uma das colnias composta de um clone de clulas derivadas de uma nica clula ancestral e dessa maneira guarda varias copias de uma sequencia em particular do genoma fragmentado.

Tal plasmdeo contem um clone de DNA genmico, e a coleo inteira de plasmdeos chamada de biblioteca de DNA genmico. Contudo como o DNA genmico cortado em vrios fragmentos aleatoriamente, somente alguns fragmentos contem genes, vrios dos clones de DNA genmico obtidos

de uma clula eucaritica superior contem apenas DNA no-codificante, que a maior parte do DNA em tais genomas. Uma estratgia alternativa comear o processo de clonagem selecionando-se apenas aquelas sequencias de DNA que so transcritas em mRNA e, assim, presumvel que correspondam a genes que codificam para protenas. Isso feito extraindo-se o mRNA de clulas e ento fazendo-se uma copia de DNA de cada molcula de mRNA presente cDNA (DNA complementar). Essa reao de copia catalisada pela transcriptase reversa de retrovrus, que sintetiza uma cadeia de DNA complementar a partir de um molde de RNA. As molculas de cDNA de fita simples sintetizadas pela transcriptase reversa so convertidas em molculas de cDNA fita dupla pela DNA-polimerase, sendo inserida em um vetor plasmidial ou vetor viral e clonadas.

Cada clone obtido dessa maneira chamado de clone de cDNA, e a coleo inteira de clones derivados de uma preparao de mRNA constitui uma biblioteca de cDNA. Existem algumas diferenas importantes entre os clones de DNA genmico e de cDNA. Os clones genmicos representam uma amostra aleatria de todas as sequencias de DNA em um organismo e, com raras excees, sero os mesmos, independente do tipo de clula utilizada para prepara-los. Em contraste os clones de cDNA contm apenas aquelas regies do genoma que foram transcritas em mRNA. Como as clulas de diferentes tecidos produzem conjuntos distintos de molculas de mRNA, uma biblioteca distinta de cDNA obtida para cada tipo de clula utilizado para preparar a biblioteca. Vantagens dos Clones de cDNA Uma das vantagens do uso desses clones a que algumas clulas especializadas podem produzir grandes quantidades de algumas protenas A vantagem mais importante dos clones de cDNA que eles contem sequencias codificantes no-interrompidas isto permite a deduo da sequencia de aminocidos de uma protenas a partir da sequencia de DNA ou mesmo a produo de protenas em grandes quantidades.

Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) Agora que tantas sequencias genmicas esto disponveis, os genes podem ser clonados sem a necessidade de primeiro construir bibliotecas de DNA, a tcnica de PCR possibilita essa clonagem rpida. Comeando com um genoma inteiro, a PCR permite que o DNA de uma regio selecionada seja amplificado vrios bilhes de vezes, purificando efetivamente esse DNA do restante do genoma. Para comear um par de ligonucleotideos de DNA (Iniciadores ou primers) escolhidos para se ligar a sequencia de nucleotdeos deseja do gene, sintetizado por mtodos qumicos. Esses iniciadores so ento utilizados para iniciar a sntese de DNA nas fitas simples geradas pelo aquecimento do DNA do genoma inteiro. O DNA novo sintetizado produzido em uma reao catalisada in vitro por uma DNApolimerase (TAQ polimerase) purificada, e os iniciadores permanecem nas extremidades 5 dos fragmentos finais de DNA que so produzidos. A eficcia da PCR revelada apenas depois de repetidos ciclos de sintese de DNA, cada ciclo duplica a quantidade de DNA sintetizada no ciclo anterior. Com cada ciclo da sntese de DNA, os fragmentos novos gerados servem como molde na sua vez, e dentro de poucos ciclos o produto predominante uma espcie nica de fragmentos de DNA, cujo o comprimento corresponde a distancia entre os dois iniciadores originais.

A PCR portanto torna possvel a clonagem molecular livre de clulas de um fragmento de DNA em poucas horas em comparao com os vrios dias necessrios para os procedimentos normais de clonagem. O mtodo de PCR extremamente sensvel, pode detectar uma nica molcula de DNA em uma amostra. Os traos de RNA podem ser analisados da mesma maneira, sendo transcritos prirmeiro em DNA pela transcriptase reversa. A PCR ainda muito usada para diagnostico de doenas genticas, detecacao de baixos nveis de infeco viral e medicina forense. Resumo das Clonagem e Amplificao por PCR

Produo de Protenas Especficas Grandes quantidades de uma protena desejada so produzidas em clulas vivas utilizando vetores de expresso que em geral so plasmdeos projetados para produzir grandes quantidades de um mRNA estvel que pode ser traduzido eficientemente em protena em bactria, levedura, inseto ou clula de mamfero transfectadas. Para prevenir que a grande quantidade da protena estranha interfira com o crescimento da clula transfectadas o vetor de expresso muitas vezes projetado para retardar a sntese do mRNA estranho e da protena at um pouco antes das clulas serem coletadas e rompidas. Como a protena desejada produzida a partir de um vetor de expresso dentro de uma clula, ela deve ser purificada das protenas da clula hospedeira por cromatografia, aps a lise das clulas. Existem vrios vetores de expresso projetados para adicionar um marcador molecular (como um grupo de resduos de histidina ou pequena protena marcadora) protena expressa para permitir uma purificao fcil por cromatografia de afinidade. Uma variedade de vetores de expresso esta disponvel, cada um modificado por engenharia gentica para funcionar em um tipo de clula na qual a protena devera ser produzida, dessa maneira as clulas podem ser induzidas a produzir vastas quantidades de protenas uteis na medicina como hormnios, citocinas e antgenos virais para vacinas.

Sequenciamento de DNA Mtodos que permitem que uma sequencia de nucleotdeos de qualquer fragmento de DNA seja determinada de forma simples e rpida tornaram possvel determinar as sequencias de DNA de dezenas de milhares de genes e de vrios genomas completos. O volume de informao da sequencia de DNA agora to grande que computadores potentes devem ser utilizados para armazen-lo e analisa-lo. Agora com o sequenciamento de DNA possvel determinar indiretamente as sequencias de aminocidos da maioria das protenas.

EXPRESSO GNICA EM PROCARIOTOS

Manipulao da Expresso Gnica em Procariotas: Gene: Promotor; Operador; Cdon indicador AUG; Stop Cdon; Regies terminadoras de traduo. Transcrio do DNA em RNAm Traduo do RNAm em PTN.

 Alto Rendimento Estveis. Fcil de purificar. Caractersticas importantes dos promotores: So fortes, aqueles que apresentam alta afinidade para a RNA polimerase; So reguladores, aqueles que tem capacidade de controle da expresso genica por mecanismos que podem ser controlado. Promotor Fago : Regulado por temperatura. Promotor Fago T7: Regulado pela presena de T7 RNA polimerase. Este gene inserido no cromossomo de E.coli sob o controle de promotor LAC IPTG que ativa o promotor LAC. Produo em Larga Escala: Para isso necessrio mudanas na temperatura e custo com energia; indutores qumicos como IPTCG de alto custo; desenvolvimento de um novo sistema. Como obter altos nveis de expresso de PTN heterlogas? : PTNS heterlogas ; ocorrem em baixas concentraes e pode ser devido a degradao por enzimas proteolticas da cl. Bacteriana; Construo de PTN de fuso (protege contra protelise, direciona a compartimentos celulares desejados, facilita a purificao); Na maioria dos casos a poro da PTN de fuso deve ser retirada. Fatores relacionados a traduo: Nos organismos procariotas vrias PTNS apresentam nveis de expresso diferenciados; A traduo eficiente e estabilidade da PTN recm sintetizadas podem afetar o rendimento; A base molecular desta caracterstica deve-se em parte ao sinal de iniciao da traduo (sitio de ligao do RNAm ao RNAr); Distancia precisa no cdon de iniciao (AUG); RNAm deve apresentar cdons comuns aos RNAt do vetor; Sinais de terminao forte. Vetores de Expresso pkk233-2: R ampicilina(seleo); Promotor tac; Stio de ligao ao ribossomo lac Z; Terminadores de traduo T1 e T3 do fago ; ATG8 nucleotdeos downstream do ribossomo. Incompatibilidade Celular: Gene clonado usa cdons raros como AGG, AGA, AUA, CUA, CGA. Isto pode ser solucionado atravs da mudana da clula de expresso, da modificao do gene e da modificao da clula para super-expressar RNAt. Aumento da estabilidade da PTN: Meia vida de PTN (poucos minutos at horas); Depende do numero de pontes de dissulfeto e aminocidos na poro N terminal; Regio interna PEST diminui a estabilidade (Regies ricas em Prolina, cido Glutmico, Serina, Treonina). Arranjo da PTN: Vria PTN que so expressas em Ecoli, so acumuladas na forma de corpsculos de incluso biologicamente inativos, insolveis e intracelulares;

Alto custo de purificao e arranjo incorreto; Alternativa para isso (PTN de fuso que mantem a PTN solvel). Integrao do DNA exgeno ao cromossomo bacteriano: Identifica um sitio de integrao (Regio do DNA bacteriano que pode ser modificado sem o prejuzo bactria) -> isolamento ou clonagem do sitio de integrao -> ligar o inserto ao stio de integrao-> Transferncia desta estrutura para a bactria atravs de um vetor suicida -> selecionar e perpetuar as clulas bacterianas que apresentam o cromossomo modificado. Aumento da secreo de PTN: O direcionamento de PTN para o espao periplasmatico facilita e diminui o custo de purificao; Aumenta a estabilidade; Adio de peptdeo sinal ligado a poro N-terminal da PTN. Sobrecarga Metablica: Numero alto de plasmdeos; insuficincia de O2 no meio; Superproduo de PTN; Jam dos stios de exportao de PTN; PTN produzidas podem interferir no metabolismo das cls.