Tincin de Gram

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Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser te idas con la tincin de Gram!

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas)!

Bacterias Gram positivas de Bacillus ant"racis (bacilos morados) que producen una en#ermedad llamada $arbunco, encontrados en una muestra de l%quido cerebroespinal! Si "ubiera una especia de bacteria Gram negativa apareceria de color rosa! &l resto son leucocitos atacando la in#eccin!

'na tincin Gram en la que observamos un me(clado de Staphylococcus aureus ($oco Gram positivo) ) Escherichia coli (bacilo Gram negativo) *a tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin di#erencial empleado en Bacteriolog%a para la visuali(acin de bacterias, sobre todo en muestras cl%nicas! Debe su nombre al bacterilogo dan+s $"ristian Gram, que desarroll la t+cnica en ,--.! Se utili(a tanto para poder re#erirse a la mor#olog%a celular bacteriana como para poder reali(ar una primera apro/imacin a la di#erenciacin bacteriana, consider0ndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visuali(an de color morado, ) Bacteria Gram negativa a las que se visuali(an de color rosa o ro1o o grosella

ndice
2ocultar3 , 4etodolog%a o ,!, &/plicacin 5 6eor%as 7 Bacterias resistentes a la tincin Gram . 'tilidades 8 9undamentos de di#erenciacin de Gram positivo ) Gram negativo : $ausas que alteran la tincin de Gram ; 9uentes o ;!, Bibliogra#%a

Metodologa[editar]

<ecoger muestras! =acer el e/tendido en espiral! De1ar secar a temperatura ambiente o #i1arlas utili(ando un mec"ero! 9i1ar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (#lameado 7 veces apro/!) >gregar a(ul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) ) esperar , minuto! 6odas las c+lulas gram positivas se ti en de color a(ul?prpura! &n1uagar con agua! >gregar lugol ) esperar entre , minuto! &n1uagar con agua! >gregar alco"ol acetona ) esperar 7@ segundos o 8 segn la concentracin del reactivo (parte cr%tica de la coloracin)! &n1uagar con agua! 6incin de contraste agregando sa#ranina o #ucsina b0sica ) esperar , minuto! &ste tinte de1ar0 de color rosado?ro1i(o las bacterias Gram negativas!

Aara observar al microscopio ptico es conveniente "acerlo a ,@@/ con aceite de inmersin! Explicacin[editar] &l cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las c+lulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a trav+s de la pared bacteriana! &l lugol es un

compuesto #ormado por B5 ()odo) en equilibrio con CB ()oduro de potasio) ) Sl (Siulterio), los cuales est0n presente para solubili(ar el )odo, ) actan de mordiente, "aciendo que el cristal violeta se #i1e con ma)or intensidad a la pared de la c+lula bacteriana! &l B5 entra en las c+lulas ) #orma un comple1o insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta!! *a me(cla de alco"ol?acetona que se agrega, sirve para reali(ar la decoloracin, )a que en la misma es soluble el comple1o B5Dcristal violeta! *os organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s% lo "acen! Aara poner de mani#iesto las c+lulas Gram negativas se utili(a una coloracin de contraste! =abitualmente es un colorante de color ro1o, como la sa#ranina o la #ucsina! Despu+s de la coloracin de contraste las c+lulas Gram negativas son ro1as, mientras que las Gram positivas permanecen violetas! *a sa#ranina puede o no utili(arse, no es crucial para la t+cnica! Sirve para "acer una tincin de contraste que pone de mani#iesto las bacterias Gram negativas! >l t+rmino del protocolo, las Gram positivas se ver0n a(ul?viol0ceas ) las Gram negativas, se ver0n rosas (si no se "i(o la tincin de contraste) o ro1as (si se us, por e1emplo, sa#ranina)! &sta importante coloracin di#erencial #ue descubierta por =ans $"ristian Gram en ,--.! &n este m+todo de tincin, la e/tensin bacteriana se cubre con solucin de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se de1a actuar durante un lapso determinado! Se escurre luego el e/ceso de violeta de metilo ) se a ade luego una solucin de )odo, que se de1a durante el mismo tiempo que la anteriorE despu+s se lava el portaob1etos con alco"ol "asta que +ste no arrastre m0s colorante! Sigue a tal tratamiento una coloracin de contraste, como sa#ranina, #ucsina #enicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o "asta inclusive verde de malaquita! >lgunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despu+s de tratarlos con un decolorante, ) el color no se modi#ica al a adir +steE otros pierden con #acilidad el primer tinte, ) toman el segundo! *os que #i1an el violeta, se cali#ican de grampositivos, ) los que pierden la primera coloracin ) retienen la segunda, de gramnegativos! Bas0ndonos pues, en la reaccin Gram, podemos clasi#icar a los microorganismos en uno de los dos grupos! *os colorantes de p?rosanilina son los que me1ores resultados dan en la coloracin Gram! *os representantes m0s usados de este grupo son violeta de metilo ) violeta cristal o de genciana! &n realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil?p?rosanilina! &l mati( de color de la p?rosanilina se intensi#ica al aumentar el nmero de grupos metilo en la mol+culaE por consiguiente, de los tres grupos, el tono m0s oscuro es la "e/ametil?p?rosanilina (violeta cristal), ) el tinte m0s ligero, la tetrametil?p?rosanilina (violeta de metilo)! *os nombres violeta de metilo 7<, 5<, <, B, 5B, 7B, etc!, se re#ieren al nmero de grupos metilo contenidos! *a letra < indica matices ro1os, ) la letra B, tonos a(ules! &l violeta de cristal contiene seis grupos metilo, ) se considera como el me1or colorante primario para te ir por el m+todo de Gram! *a #acultad de las c+lulas para tomar la coloracin Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a "ongos ) bacterias! >s% vemos que las c+lulas de plantas ) animales superiores no conservan la primera coloracinE los mo"os

se ti en con cierta irregularidadE los gr0nulos de micelios propenden retener el colorante! *a reaccin de Gram no es in#alible ni constanteE puede variar con el tiempo del cultivo ) el p= del medio, ) qui(0 por otras causas!

Teoras[editar]
'n microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana! &l mismo microorganismo, si su#re da o de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo! &sto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del colorante! 'na posible teor%a del mecanismo de tincin es la siguiente: &l colorante b0sico entra al microorganismo, donde #orma con el )odo una laca insoluble en agua! &l alco"ol o la acetona empleados para aclarar, des"idrata las paredes de los microorganismos grampositivos, tratados con mordiente, ) #orma una barrera que la laca no puede atravesar! &n las c+lulas gramnegativas, los l%pidos de la pared (m0s abundantes que en las c+lulas grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del comple1o de cristal violeta con )odo! >lgunos autores ob1etan esta teor%a, pero es indudable la importancia general de la pared celular! Farias son las teor%as emitidas para e/plicar el mecanismo de la tincin de Gram! Stearn (,G57) bas la su)a en una combinacin qu%mica entre el colorante ) las prote%nas de las bacterias, *as prote%nas ) amino0cidos son cuerpos an#teros, esto es, tienen la #acultad de reaccionar con 0cidos ) con bases, gracias a sus grupos amino ) carbo/iloE en soluciones 0cidas, reaccionan con los 0cidos, ) en soluciones alcalinas lo "acen con las bases! De igual manera, comprobaron que la reaccin de tincin de las bacterias obedece en gran parte a su contenido prote%nicoE estos microorganismos se conducen como cuerpos an#teros, al combinarse con colorantes 0cidos en soluciones 0cidas ) con los b0sicos en medio alcalino! *a combinacin con ambos tipos de colorante no se produce en el Hpunto isoel+ctricoI! $omo los microorganismos contienen m0s de una prote%na, ese punto no tiene un valor preciso ) de#inido, sino que constitu)e m0s bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de p=! Segn Stern ) Stearn, los microorganismos grampositivos tienen una escala isoel+ctrica de p= in#erior a la de los microorganismos gramnegativosE ), a base de sus datos e/perimentales, deducen las siguientes conclusiones:

*os microorganismos grampositivos pueden "acerse gramnegativos al aumentar la acide(! *os microorganismos gramnegativos pueden "acerse grampositivos al aumentar la alcalinidad! *os microorganismos de reaccin positiva a los colorantes 0cidos pueden "acerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad! *os microorganismos de reaccin positiva a los colorantes b0sicos pueden "acerse gramnegativos por aumentar la acide(! &n la (ona isoel+ctrica caracter%stica de cada especie es mu) escasa la tendencia a retener cualquier colorante! Aarece estar bien demostrado que las prote%nas de las bacterias no son simples, sino m0s bien una d+bil combinacin de sustancias prote%nicas con otras lipoideas o grasas!

*a materia grasa e/tra%da de los microorganismos grampositivos di#iere de la obtenida de los microorganismos gramnegativos, en que la primera contiene una proporcin muc"o ma)or de 0cidos no saturados que muestren gran a#inidad por los agentes o/idantes! 6odos los mordientes (como el )odo) empleados en la coloracin Gram son o/idantesE su e#ecto, en general, consiste en dar a la sustancia o/idada un car0cter m0s 0cido! &sto aumenta la a#inidad de un microorganismo por los colorantes b0sicos! &l cambio de respuesta a la coloracin de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos d+bilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de #ermentar, ) cu)a reaccin se vuelve 0cida en el curso del desarrollo!

Gianni (,G85) comprob que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis ) B! ant"racis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a tres "oras! *uego se desarrollaba la sustancia grampositiva deba1o de la pared celular, para invertir la reaccin! Jtra e/plicacin de la reaccin de Gram puede ser la posible e/istencia de una capa e/terior alrededor de un ncleo gramnegativo! *ibenson ) 4cllro), "an comunicado que si la reaccin grampositiva depende de que se #orme una combinacin comple1a entre los componentes de la coloracin de Gram ) las prote%nas de la pared celular, ser%a de esperar que las bacterias desintegradas por medios #%sicos retuviesen este tinte, )a que ese tratamiento no podr%a cambiar el car0cter qu%mico de los materiales de dic"a pared! Aor el contrario, los g+rmenes grampositivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario ) toman negativamente el Gram! *a pared celular de los microorganismos grampositivos ) gramnegativos es permeable al violeta cristal! Sin embargo, la de los primeros no lo es al comple1o de )odo ) colorante #ormado en el interior de la c+lula! *os resultados e/perimentales obtenidos con una di#usin celular e/enta de prote%nas, ) la escasa solubilidad del comple1o de )odo ) violeta cristal en alco"ol ) acetona, parecen sustentar la opinin de que la reaccin grampositiva consiste esencialmente en la #ormacin, dentro de la c+lula, de una cantidad apreciable de comple1o de )odo ) colorante di#%cil de eliminar con el disolvente! *a pared celular de los microorganismos grampositivos, a di#erencia de la de los gramnegativos, ser%a pr0cticamente impermeable al violeta cristal! *os microorganismos aparecer0n te idos despu+s de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la super#icie e/terna de la pared celular, ) el disolvente eliminar0 sin di#icultad el comple1o #ormado despu+s del tratamiento con )odo! Ki los grupos sul#"idrilo ni las prote%nas b0sicas "an in#luido espec%#icamente en el mecanismo del colorante de Gram! *ibenson ) 4cllro) "an sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del comple1o de )odo ) colorante en alco"ol ) acetona, ) el libre acceso del disolvente al comple1o constituido, son los principales #actores que intervienen en el mecanismo de esa coloracin! *os pasos "a seguir para reali(ar la tincin son los siguientes: ,L 9i1amos la muestra mediante calor!

5L Fioleta cristal (6i e todas las bater%as, gram M ) ?) ,N! 7L 9i1amos con *ugol, ,N! .L Decoloremos con una me(cla alco"ol?cetona (los gram ? se decoloren)! 8L Sa#ranina (colorante de contraste, ti e a los gram ?), ,N! *os tiempos para aplicar cada colorante es orientativo! &n la tincin se observar0n de color a(ul?violeta las gram M ) de color rosa las gram ?!

Bacterias resistentes a la tincin Gram[editar]

*as siguientes bacterias de naturale(a grampositiva, ti en como gramnegativas:

4)cobacterias (est0n encapsuladas)! 4)coplasmas (no tienen pared)! 9ormas * (p+rdida ocasional de la pared)! Arotoplastos ) es#eroplastos (eliminacin total ) parcial de la pared, respectivamente)!

Utilidades[editar]
&n el an0lisis de muestras cl%nicas suele ser un estudio #undamental por cumplir varias #unciones:

Bdenti#icacin preliminar de la bacteria causal de la in#eccin! 'tilidad como control calidad del aislamiento bacteriano! *os mor#otipos bacterianos identi#icados en la tincin de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos reali(ados en los cultivos! Si se observan ma)or nmero de #ormas bacterianas que las aisladas "a) que reconsiderar los medios de cultivos empleados as% como la atms#era de incubacin!

> partir de la tincin de Gram pueden distinguirse varios mor#otipos distintos: *os cocos son de #orma es#+rica! Aueden aparecer aislados despu+s de la divisin celular (Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), #ormar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos)! *os bacilos poseen #orma alargada! &n general suelen agruparse en #orma de cadena (Estreptobacilos) o en empali(ada! 6ambi+n pueden distinguirse los espirales, que se clasi#ican en espirilos si son de #orma r%gida o espiroquetas si son blandas ) onduladas! Si por el contrario, poseen #orma de OcomaO, o curvados, entonces se los designa vibrios!

Fundamentos de di erenciacin de Gram positivo ! Gram negativo[editar]

*os #undamentos de la t+cnica se basan en las di#erencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas ) Gram negativas *a pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, adem0s de dos clases de 0cidos teicoicos: >nclado en la cara interna de la pared celular ) unido a la membrana plasm0tica, se encuentra el 0cido lipoteicoico, ) m0s en la super#icie, el 0cido teicoico que est0 anclado solamente en el peptidoglicano (tambi+n conocido como mure%na) Aor el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, ) se encuentra unida a una segunda membrana plasm0tica e/terior (de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprote%nas! 6iene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana e/terior por lipoprote%nas! *a membrana e/terior est0 "ec"a de prote%na, #os#ol%pido ) lipopolisac0rido! Aor lo tanto, ambos tipos de bacterias se ti en di#erencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared! *a clave es el peptidoglicano, )a que es el material que con#iere su rigide( a la pared celular bacteriana, ) las Gram positivas lo poseen en muc"a ma)or proporcin que las Gram negativas! *a di#erencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana e/terna de las Gram negativas es soluble en solventes org0nicos, como por e1emplo la me(cla de alco"olDacetona! *a capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el comple1o de cristal violetaD)odo que se #orm previamente, ) por lo tanto este comple1o se escapa, perdi+ndose la coloracin a(ul?viol0cea! Aero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular m0s resistente ) con ma)or proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente org0nico, sino que este acta des"idratando los poros cerr0ndolos, lo que impide que pueda escaparse el comple1o cristal violetaD)odo, ) manteniendo la coloracin a(ul?viol0cea!

"ausas #ue alteran la tincin de Gram[editar]

B: &dad de la bacteria! BB: &rrores del operador! BBB: 'so de antibiticos

> pesar de la gran utilidad del la tincin de Gram, este m+todo debe ser valorado con precaucin, )a que la reaccin puede variar segn la edad de las c+lulas (cultivos vie1os de bacterias grampositivas pueden perder capas de peptidoglicanos ) te irse como gram negativos) ) la t+cnica empleada (>l decolorar por un tiempo mu) prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se ti an como gram negativas),&s por esta situacin que 1unto a la muestra deben te irse controles con bacterias gram positivas (e1! S. aureus) ) gram negativas (e1! E. coli)!

PRCTICAS DE MICROBIOLOGA OBJETIVOS: ,! Iniciacin en las tcnicas del estudio de mic oo !anismos" culti#o$ tincin % mo &olo!'a( Mate ial necesa io" Culti#o de )acte ias$ le#adu as$ #ino a! iado( Anti)iticos( C istal #ioleta *+ ! de c istal #ioleta en +,, cc de a!ua destilada-( Lu!ol *+ ! de iodo en . ! de iodu o /ot0sico en +,, cc de a!ua destilada-( 1ucsina )0sica *+ ! de &ucsina )0sica en +,, cc de a!ua destilada-( Aceite de inme sin( Mic osco/io Po tao)2etos$ asas de culti#o$ mec3e o$ c0/sulas de Pet i$ tu)os de ensa%o( Pa/el secante(

+(4 I5TROD6CCI75 El tama8o de la ma%o 'a de las clulas )acte ianas es tal 9ue esultan di&'ciles de #e con el mic osco/io /tico( La / inci/al di&icultad es la &alta de cont aste ent e la clula % el medio 9ue la odea( El modo m0s sim/le de aumenta el cont aste es la utili:acin de colo antes( Si se desea sim/lemente aumenta el cont aste de las clulas /a a la mic osco/'a$ son su&icientes los / ocedimientos 9ue usan un solo colo ante llamados de tincin sim/le( Sin em)a !o$ a menudo se utili:an mtodos 9ue no ti8en de i!ual modo todas las clulas$ es el / oceso denominado tincin di&e encial( 6no mu% usado en mic o)iolo!'a es la tincin G am( Bas0ndose en su eaccin a la tincin G am$ las )acte 'as /ueden di#idi se en dos ! u/os" ! am/ositi#as %

! amne!ati#as( Esta tincin tiene ! an im/o tancia en ta;onom'a )acte iana %a 9ue indica di&e encias &undamentales de la /a ed celula de las distintas )acte ias( Mient as 9ue las )acte ias ! amne!ati#as son constantes en su eaccin$ los mic oo !anismos ! am/ositi#os /ueden / esenta es/uestas #a ia)les en cie tas condiciones *son ! aml0)iles-( Po e2em/lo$ los culti#os #ie2os de al!unas )acte ias ! am/ositi#as /ie den la / o/iedad de etene el c istal #ioleta$ % en consecuencia$ se ti8en /o la sa& anina a/a eciendo como ! amne!ati#as( An0lo!o e&ecto se / oduce en ocasiones /o cam)io en el medio del o !anismo$ o /o li!e as modi&icaciones en la e2ecucin de la tcnica( Po este moti#o$ es / eciso atene se$ en la / 0ctica$ al / ocedimiento esta)lecido( Pa a e;/lica el mecanismo de la tincin de ! am se 3an / o/uesto #a ias 3i/tesis &undadas en la natu ale:a 9u'mica de las /a edes celula es de los mic oo !anismos( A9u' /uedes #e las di&e encias est uctu ales % 9u'micas de los dos ti/os de /a ed )acte iana" Pa ed G am <

ca/a densa % uni&o me de .,, a =,, A0cidos teicoicos /olisac0 idos / ote'nas */ocas #eces!lico//tido *>,? del /eso seco-

Pa ed G am 4
ca/a inte na del!ada de ., a @, A cu)ie ta /o ca/as e;te nas de densidad meno li/o/olisac0 idos li/o/ ote'nas / ote'nas

!lico//tido *+,? del /eso seco-

El mecanismo de la tincin G am es la ese8ado en el si!uiente es9uema"

P oductos 9ue se utili:an

Reaccin % colo acin de las )acte ias GRAM < Clulas colo #ioleta GRAM 4 Clulas colo #ioleta Se &o ma el com/le2o CA4I( Las clulas continBan te8idas de colo #ioleta( Eliminacin /o e;t accin de ! asas de las /a edes celula es( Aumenta la /o osidad( El com/le2o CA4I se se/a a de la clula(

+- C istal #ioleta .- Lu!ol solucin iodada @- Alco3ol

Se &o ma el com/le2o CA4I( Las clulas continBan te8idas de colo #ioleta( Se des3id atan las /a edes celula es( Se cont aen los /o os( Disminu%e la /e mea)ilidad( El com/le2o CA4I no sale de las clulas 9ue continBan te8idas de colo #ioleta( C- Sa& anina Clulas no decolo adasD 9uedan te8idas de colo #ioleta(

Clulas decolo adasD se ti8en de colo osado(

.( TI5CI75 DE GRAM .(+ Mtodo .(+(+ E;tensin" En un /o ta )ien lim/io *con alco3ol$ /a/el de &ilt o % &lameado- se coloca una !ota de a!ua destilada a la 9ue( con el asa de siem) a$ / e#iamente este ili:ada a la llama$ se lle#a una /e9ue8a cantidad de sus/ensin de )acte ias o$ en su caso$ de una colonia( Con el asa se e;tiende la !ota % las )acte ias so) e el /o ta % se &i2a la e;tensin /o el calo $ calentando sua#emente a la llama del mec3e o 3asta 9ue se se9ue(

.(+(. Colo acin" a- + minuto en c istal #ioleta de EucFe (colorante inicial) )- se la#a con a!ua destilada c- + minuto en lu!ol (mordiente) d- se decolo a con alco3ol de G>H (decolorante) e- se la#a con a!ua destilada &- + minuto en &ucsina )0sica (colorante de contraste) !- se la#a con a!ua co iente 3- se seca suavemente % sin frotar con /a/el de &ilt o 6na #e: 9ue la / e/a acin est0 totalmente seca$ /one una !ota mu% /e9ue8a de aceite de ced o % o)se #a al mic osco/io con el o)2eti#o de inme sin(

.(.( Observacin De)e utili:a se el o)2eti#o de inme sin( Se coloca una !ota de aceite de ced o so) e la / e/a acin( Se en&oca$ / e&e entemente$ con el mic omt ico( Despu s de utili!ar el ob"etivo de inmersin debe limpiarse con #ilol

O)se #aciones eali:adas" antalas en tu cuade no IJu &o ma tienen las )acte ias o)se #adasK ILas )acte ias a/a ecen aisladas o a! u/adasK En caso de 9ue a/a e:can a! u/adas indica el ti/o de asociacin( Indica ti/o de G am(