Primer ciclo de prcticas de Microbiologa Oral

PRIMER CICLO DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA ORAL

DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS. DIAGNSTICO DIRECTO E INDIRECTO. LA IMPORTANCIA DE LA RECOGIDA Y TRANSPORTE ADECUADOS DE LAS MUESTRAS PRINCIPALES TCNICAS DE DIAGNSTICO DIRECTO. DIAGNSTICO DIRECTO BASADO EN EL CULTIVO.

Da 1: Da 2: Da 3: Da 4:

Procesamiento de las muestras. Medios de cultivo. Tipos de Siembra. Observacin macroscpica y microscpica de la siembra Identificacin bioqumica. Antibiograma. Lectura e interpretacin de las pruebas bioqumicas y del antibiograma Nomenclatura Bacteriana. Taxonoma Bacteriana

Los alumnos deben estudiar el contenido del guin antes de la realizacin de las prcticas. Los alumnos tienen la obligacin de acudir a las prcticas el da y a la hora en que hayan sido convocadas. Es obligatorio acudir al laboratorio de prcticas con bata, guin de prcticas y cuaderno de notas.

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DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS. DIAGNSTICO DIRECTO E INDIRECTO. LA IMPORTANCIA DE LA RECOGIDA Y TRANSPORTE ADECUADOS DE LAS MUESTRAS PRINCIPALES TCNICAS DE DIAGNSTICO DIRECTO. El diagnstico de una enfermedad infecciosa comienza con la sospecha clnica. Esta sugerir una serie de posibles agentes etiolgicos basndose en el conocimiento de los Sndromes Infecciosos y su curso. Es por lo tanto un requisito indispensable la existencia de una adecuada comunicacin y cooperacin entre el clnico y el microbilogo. El clnico deber tomar las muestras adecuadas, as como facilitar una orientacin clnica. Para conocer cul es el agente etiolgico implicado en un determinado proceso se pueden seguir dos estrategias: 1. Buscar el agente causal, alguno de sus componentes o productos metablicos en muestras clnicas del paciente: DIAGNSTICO DIRECTO. 2. Poner de manifiesto la Respuesta inmune especfica (humoral o celular) que se desarrolla en el paciente como consecuencia de la infeccin: DIAGNSTICO INDIRECTO (se desarrollan en el 2 ciclo de prcticas). Siempre que sea posible se debe intentar el DIAGNSTICO DIRECTO. Este proceso comienza con la RECOGIDA DE MUESTRA/S por parte del clnico y su TRANSPORTE ADECUADO al laboratorio. El principal motivo por el que no se llega a establecer el diagnstico etiolgico de un proceso infeccioso es haber cometido fallos en el proceso de recogida o transporte de muestras. Normas generales para la recogida de muestras: 1. Siempre que sea posible se obtendrn las muestras "antes de la implantacin de una terapia de antimicrobiana , ya que la presencia de antibitico puede dificultar o imposibilitar el diagnstico. 2. Es axiomtico tomar la muestra del sitio en que con ms probabilidad se encuentre el microorganismo sospechoso, asegurando el mnimo de contaminacin externa. Hay 4 formas de superar la flora normal: a) Piel con alcohol iodado (extraccin de hemocultivos); b) Evitar reas con flora normal (Cepillo telescopado y broncoscopio para obtencin de muestras del tracto respiratorio inferior); c) Uso de medios que inhiban el crecimiento de la flora normal; d) Cultivos cuantitativos (catter, esputos, orina). 3. Estadio de la enfermedad , as la toma de sangre para hemocultivo debe realizarse cuando est subiendo la fiebre, ya que ste es el

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momento en el que hay ms posibilidad de encontrar microorganismos en sangre y en mayor cantidad. A veces se requiere la colaboracin activa del paciente, por lo que hay que darle normas precisas: Ej Orinas y Esputos. La muestra debe tomarse en cantidad suficiente para permitir el anlisis completo y habr que colocar la muestra en recipientes estriles para evitar la ulterior contaminacin. Tambin es muy importante que el exterior del recipiente quede completamente limpio para evitar la posible contaminacin del personal que lo manejar despus. Debe ir acompaada de una orientacin clnica, para realizar el procesamiento adecuado en cada caso. La rapidez en el transporte y entrega de la muestra al laboratorio es fundamental, ya que algunos microorganismos son muy sensibles y puede que mueran o sean enmascarados antes de ser procesada la muestra. La muestra debe estar perfectamente identificada para evitar errores en la manipulacin y emisin de resultados.

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Normas especiales Dependen del tipo de muestra. LCR: Debe ser enviado inmediatamente al laboratorio, sobre todo si se sospecha una meningitis meningoccica, ya que ste germen tiende a lisarse. Incubacin a 37C hasta su cultivo, igual que la sangre. Orina: Miccin espontnea. Debe recogerse la primera de la maana, despus de un lavado de los genitales para evitar la contaminacin con grmenes que constituyen la flora normal de piel. Debe desecharse la primera porcin de la miccin, as eliminamos los grmenes que podran encontrarse en uretra y que daran lugar a resultados errneos. La orina debe enviarse rpidamente al laboratorio ya que, al ser un excelente medio de cultivo, los microorganismos como por ejemplo E. coli se pueden multiplicar rpidamente y obtenerse un resultado falsamente positivo. Muestras en las que se quiera investigar anaerobios : deben de ser tomadas por aspiracin e inoculadas lo ms rpido posible en un medio de transporte adecuado que garantice las condiciones de anaerobiosis. Debe hacerse llegar al laboratorio para su procesamiento tambin de una forma rpida. Muestras subgingivales o radiculares: debido al escaso tamao anatmico la toma de muestras se realiza con palillos de papel que deben dejarse impregnar e introducirse en un medio de transporte adecuado para anaerobios.

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PRINCIPALES TCNICAS DE DIAGNSTICO DIRECTO 1. OBSERVACIN MICROSCPICA. Examen directo: Examen en fresco: til para hongos y parsitos. Microscopa de campo oscuro: Treponemas. Microscopa electrnica: Virus principalmente. Tinciones: Muy utilizadas, a veces permiten un diagnstico precoz. Las ms frecuentes: Gram: Esputo, orina, hemocultivos, LCR... Ziehl-Neelsen: micobacterias. Tcnicas fluorescentes: Auramina-rodamina (micobacterias), inmunofluorescencia directa o IFD ( Legionella) Giemsa: Parsitos. Otras 2. CULTIVO a. Medios de cultivo artificiales: Se utilizan para el aislamiento e identificacin de la mayora de las bacterias y hongos. Son todos aquellos sustratos slidos, lquidos o semislidos que favorecen y permiten el desarrollo de los microorganismos en el laboratorio. Composicin: 1. Elementos bsicos: Carbono. Normalmente lo proporcionan los azcares. Hidrgeno y oxgeno. Nitrgeno. Lo proporcionan las peptonas y aminocidos 2. Oligoelementos. Son el Na, K, Fe, Mg, Mn, etc. que se administran al medio en forma de sales. ClNa acta regulando la presin osmtica. Extracto de carne. Constituye una de las bases ms importantes del medio de cultivo por su riqueza nutritiva. Extracto de levadura. Es un factor de crecimiento importante para la mayora de los microorganismos. Clasificacin 1. Segn su estado fsico: Medios lquidos: Favorecen el crecimiento de microorganismos pero no pueden utilizarse para el aislamiento de grmenes y la obtencin de

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colonias separadas. Permiten observar el tipo de respiracin; aerobios estrictos, anaerobios estrictos, microaerfilos y anaerobios facultativos. Medios slidos: Llevan en su composicin una sustancia solidificante que es el agar. Es una sustancia polisacardica, obtenida de algas marinas y su propiedad fundamental es la de formar gel. La gelatina tambin es una sustancia solidificante, en este caso de naturaleza proteica, pero tiene el inconveniente de que algunos grmenes actan sobre ella licundola por la accin de enzimas proteolticos producidos por los mismos. Los medios slidos permiten obtener colonias separadas. Medios semislidos: en su composicin llevan agar en menor proporcin que los slidos. 2. Segn el crecimiento bacteriano que permitan: Medios enriquecidos. Son aquellos que contienen una serie de sustancias que favorecen el crecimiento de todos los microorganismos (ejemplo: Columbia). Medios de enriquecimiento. Son aquellos que llevan un sustrato determinado para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (ejemplo: caldo Selenito favorece el crecimiento de Salmonella y Shigella). Medios selectivos. Son aquellos que llevan sustancias inhibitorias que impiden el crecimiento de determinados microorganismos (ejemplo: MacConkey inhibe el crecimiento de Gram positivos). Medios diferenciales. Son aquellos que permiten poner de manifiesto alguna caracterstica de los microorganismos (ejemplo: MacConkey permite conocer si la bacteria fermenta o no fermenta la lactosa) Las condiciones de incubacin van a variar en funcin del microorganismo a aislar: - Atmsfera: aerobia, anaeroerobia (en jarras o cmaras de anaerobiosis), enriquecida con C02 (gonococo, meningococo...) - Temperatura: 35-37C (la mayora de las bacterias), 42 C (sobrecrece C. jejuni), 4 C (se mantiene e incluso crece Listeria monocytogenes).

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b. Cultivo en lneas celulares contnuas: Se utilizan para patgenos intracelulares obligados, sobre todo para los virus. La presencia del virus se pone de manifiesto por la aparicin de un efecto citoptico, por tinciones (IF), por sondas o PCR o poniendo de manifiesto las hemaglutininas vrales en la superficie de las clulas infectadas (hemadsorcin). c. Huevos embrionados: Ya no se utilizan con fines diagnsticos. d. Inoculacin animales de experimentacin: Cada vez menos usado. Tiene utilidad sobre todo en estudio de patogenia. 3. IDENTIFICACIN Y ANTIBIOGRAMA: Una vez obtenido el cultivo del microorganismo, se proceder a la identificacin del gnero y especie valorando las caractersticas de crecimiento, requerimientos nutricionales, propiedades bioqumicas, sensibilidad a inhibidores. As mismo, es importante el estudio in vitro de sensibilidad a diferentes antimicrobianos (antibiograma; ver ms adelante en este guin), pues para la mayora de las bacterias es imposible predecir su patrn de sensibilidad debido a la posibilidad de que hayan adquirido algn mecanismo de resistencia. Hoy en da existen gran variedad de mtodos automatizados que realizan la identificacin de bacterias y hongos en pocas horas. En ocasiones se utiliza la identificacin serolgica, utilizando anticuerpos especficos para determinar la especie o el serotipo. Asimismo en la actualidad se pueden utilizar sondas de ADN y/o PCR para la identificacin. 4. DETECCIN DE ANTGENOS EN MUESTRAS CLNICAS. La IFD (comentada en la observacin microscpica) permite la deteccin de antgenos de la superficie de los microorganismos directamente sobre muestras clnicas (ejemplos: deteccin de Legionella o de virus respiratoro sincitial en muestras respiratorias). La deteccin de antgenos microbianos libres en las muestras clnicas se utiliza sobre todo para bacterias encapsuladas (neumococos, meningococos, Haemophilus influenzae), hongos (Criptococcus neoformans) o virus (Ag de superficie del virus de la hepatitis B, o Ag p24 del VIH). Son tcnicas de aglutinacin con anticuerpos unidos a partculas de ltex, EIA,, aplicadas a muestras de LCR, suero, lquido articular, orina, etc (depende del microorganismo y del cuadro clnico), que dan los resultados en el plazo mximo de 1 a 2 horas, sin necesidad de que los microorganismos sean

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viables para poder detectarlos (requisito indispensable en el cultivo). En el caso de las bacterias, a pesar de ser tcnicas atractivas, su baja sensibilidad hace que un resultado negativo no descarte el diagnstico, con lo que se deber esperar al resultado del cultivo. Adems con estas tcnicas no se puede conocer el patrn de sensibilidad antimicrobiana, lo que es fundamental para la eleccin del tratamiento ptimo en cada caso. 5. TCNICAS MOLECULARES NUCLEICOS O DE ANLISIS DE LOS CIDOS

Actualmente estn adquiriendo cada vez mayor importancia las tcnicas que ponen de manifiesto los cidos nucleicos de los microorganismos patgenos. Son tcnicas que ofrecen una gran sensibilidad y especificidad, adems de su rapidez en la deteccin. Entre ellas destacamos: PCR (usadas tanto para deteccin como para identificacin) y Sondas de ADN (usadas sobre todo para identificacin). Se explicarn en el 2 ciclo de prcticas.

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Da 1. Diagnstico directo basado en el cultivo I: Procesamiento de las muestras. Muestras que se van a procesar: ORINA FROTIS NASAL Medios que se van a usar: COLUMBIA: Est compuesto de extracto de carne, extracto de levadura, peptonas, glucosa, NaCl y sangre (sta favorece el crecimiento de microorganismos patgenos para el hombre). MACCONKEY: En su composicin hay sales biliares y violeta de genciana (inhibidores del crecimiento de los microorganismos Gram positivos), por lo que es un medio selectivo, pero tambin es un medio diferencial (permite conocer si las bacterias que crecen son capaces de fermentar o no la lactosa por el tipo de colonia que presenten, los fermentadores de lactosa dan colonias de color rosa y los no fermentadores dan colonias no coloreadas). TIOGLICOLATO: Medio semislido compuesto de Cistina (aminocido azufrado que acta con funcin reductora) tioglicolato, agar y resazurina que se colorea de rosa en presencia de oxgeno. Este medio sirve para conocer si los microorganismos son aerobios estrictos, anaerobios estrictos, microaerfilos o anaerobios facultativos. Inoculacin o Siembra: ORINA: Se inocularn los medios de cultivo rotulados con nmero impar. * Tioglicolato: Recoger una gota con el asa previamente esterilizada en la llama del mechero, e introducir en el tubo hasta el fondo y sacarlo. Flamear la boca del tubo antes y despus de introducir el asa.
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Columbia: Depositar una gota de orina recogida con el asa sobre el centro de la superficie del medio. Realizar una siembra en tapiz que permitir valorar la concentracin de bacterias que existe en la orina. MacConkey: Depositar una gota de orina recogida con el asa sobre un extremo de la superficie del medio. Hacer estras muy juntas sobre la superficie, hasta haber cubierto

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aproximadamente un tercio de la superficie. Volver a esterilizar el asa y tocando las ltimas estras comenzar a hacer estras en otra direccin y ms separadas entre s, con objeto de obtener colonias aisladas. Este tipo de siembra se denomina siembra por agotamiento o en aislamiento. FROTIS NASAL: se inocularn los medios rotulados con nmero par. * Tioglicolato: Una vez tomada la muestra con la torunda, introducirla en el tubo hasta el fondo y sacarla. Flamear la boca del tubo antes y despus de introducir la torunda.
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Columbia: En el borde de la placa, hacer la inoculacin con la torunda, haciendo estras muy juntas hasta cubrir aproximadamente un tercio de su superficie. A partir de este punto y con el asa previamente esterilizada y enfriada continuar la siembra, tocando las ltimas estras y realizando estras en otra direccin ms separadas (siembra por agotamiento).

TODOS LOS MEDIOS DE CULTIVO SERN INCUBADOS EN LA ESTUFA A 35C DURANTE 24 HORAS.

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DIA 2. Observacin macroscpica y microscpica de la siembra. Observacin macroscpica. Medios slidos: Especificar tipos de colonias, color, brillo, hemlisis, bordes, dimetro... En el caso del medio de Columbia sembrado en recuento correspondiente a la muestra de orina hacer una estimacin de la concentracin de bacterias en la muestra suponiendo que hubisemos inoculado 10 l. Tioglicolato: Especificar formas de crecimiento y tipos de respiracin. Observacin microscpica: Tinciones. Tincin de Gram. Esta tincin nos sirve para clasificar a los microorganismos en dos grandes grupos, Gram positivos y Gram negativos. A la vez podemos observar la forma de las bacterias: cocos, bacilos, etc. y cmo se agrupan: parejas, cadenas, etc. Fundamento: La tincin permite dividir las bacterias en dos grandes grupos, Gram positivas y Gram negativas. Se cree que la diferencia de espesor, la concentracin de cargas y la composicin qumica de la pared celular, son las responsables de la coloracin final con la que permanecen las bacterias teidas por este mtodo. Las bacterias Gram positivas permiten que un colorante bsico (violeta de genciana) se una a las estructuras de la pared, la membrana y el citoplasma; esta unin se refuerza con la adicin de lugol. La accin decolorante del alcohol, se ve impedida por las caractersticas de la pared celular antes mencionadas de forma que la bacteria permanece teida con el colorante inicial; la adicin de un segundo colorante (safranina) no modifica dicha coloracin y la bacteria se observar con una tonalidad azul-violeta. En las bacterias Gram negativas, el alcohol arrastra al colorante inicial (por la distinta naturaleza de la pared celular) de manera que la adicin de safranina tie finalmente la bacteria de color rojo. Tcnica. Suspensin Extensin Fijacin. Para que las protenas queden fijadas al porta pasaremos el porta tres veces por la llama del mechero (fijacin con calor). Dejar enfriar antes de teir. Cubrir el porta con Violeta de genciana y dejar actuar 1 min.

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Lavar con agua. Lugol. Acta de mordiente formando un complejo con el violeta de genciana que hace que se fije al colorante. 30 seg. Lavar con agua. Decolorar con alcohol. 10-15 seg. Lavar con agua para impedir que el alcohol siga ejerciendo su accin. Safranina. Colorante de contraste. 1 min. Lavar con agua. Secar. Observar al microscopio con objetivo de inmersin.

Tincin de Ziehl-Neelsen Esta tincin se utiliza para diagnstico de BAAR (Bacilos cido alcohol resistentes) como Mycobacterium tuberculosis. Fundamento: Estos microorganismos poseen en su membrana cidos miclicos de cadena larga, lo que determina que sean muy difciles de teir, pero una vez teidos es muy difcil decolorarlos, de forma que resisten a la accin decolorante de la mezcla de cido clorhdrico y etanol. Tcnica Suspensin Extensin Fijacin Fuchina bsica. Calentar hasta la emisin de vapores durante 6 minutos (3 veces) con lo cual se favorece la penetracin del colorante a travs de la cubierta crea de estos microorganismos. Dejar enfriar Decolorar con etanol- cido clorhdrico Lavar con agua Azul de metileno 1 minuto (colorante de contraste) Lavar con agua Secar. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin Los BAAR se observan de color rojo sobre un fondo azul. Esta tincin no la realizaremos en prcticas pero podremos observar extensiones con BAAR al final de la prctica.

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DIA 3. Identificacin bioqumica. Antibiograma. La identificacin bioqumica debe hacerse partiendo de un cultivo puro o colonias perfectamente aisladas. Tras observar la morfologa de las colonias, el tipo de crecimiento en medio lquido, la morfologa bacteriana y la tincin de Gram, se procede a la identificacin empleando diversas pruebas bioqumicas. Pruebas para cocos Gram positivos (frotis nasal): Catalasa Coagulasa Pruebas para bacilos Gram negativos (orina): TSI Ureasa Prueba de catalasa: Los microorganismos que tienen la enzima catalasa descomponen el agua oxigenada en agua y oxgeno. Al depositar sobre una colonia bacteriana (de un medio sin sangre) una gota de agua oxigenada se observarn burbujas (de oxgeno) si la bacteria produce catalasa. Prueba de coagulasa: La coagulasa es una enzima que tiene la facultad de coagular las protenas sricas del plasma. Se utiliza para la identificacin de estafilococos. Composicin del medio: Infusin cerebro-corazn, TSA, manitol, prpura de bromocresol y suero humano. Forma de siembra: Tomar una colonia y hacer una estra radial en la placa. Lectura: Los microorganismos que son coagulasa y manitol positivos dan un cerco amarillo con precipitado. Los que fermentan el manitol pero son coagulasa negativos dan un halo amarillo pero no precipitado. Los que no fermentan manitol y son coagulasa negativos, no producen ni halo ni precipitado.

TSI (Triple Sugar Iron): Composicin: tres azcares [Glucosa (al 0.1%), Lactosa (al 1%) y Sacarosa (al 1%)], sulfato ferroso, tiosulfato sdico y rojo fenol como indicador (pH cido color amarillo; pH bsico color rojo).

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Forma de siembra: Tomar una colonia aislada con un asa, pinchar el medio alcanzando la parte inferior del mismo; sacar el asa e inocular la superficie de la lengeta. Lectura: Los microorganismos que fermentan la glucosa amarillean el medio slo en la base, ya que la produccin de cido es limitada, al ser la concentracin de glucosa en el medio muy baja. Los que adems fermentan los otros azcares lo amarillean tanto en la base como en el pico. Los no fermentadores hacen que el medio se vuelva ms rojo. Tambin se puede observar la produccin de gas que se manifiesta por la formacin de burbujas en el medio y la produccin de SH 2 a partir del tiosulfato a sulfhdrico y luego sulfuro ferroso que es de color negro.

Prueba de la ureasa: La ureasa es una enzima que desdobla la urea produciendo amonaco. Esta sustancia de naturaleza bsica eleva el pH del medio haciendo virar el color del indicador de pH. Composicin: medio base, agar, urea y rojo fenol. Forma de siembra: Extender la colonia sobre la lengeta del medio. Lectura: Rosa ureasa positivo. Amarillo ureasa negativo.

Antibiograma. El antibiograma es el mtodo usual para determinar la sensibilidad in vitro de un microorganismo frente a los antimicrobianos. El estudio de la sensibilidad antimicrobiana de las bacterias es necesario porque el espectro de actividad de los antimicrobianos es limitado y las bacterias tienen capacidad para desarrollar resistencia. Para ello es necesario conocer los conceptos concentracin mnima inhibitoria (CMI) , que es la menor concentracin de antimicrobiano capaz de impedir el crecimiento de un microorganismo en unas condiciones normalizadas, y concentracin mnima bactericida (CMB) que es la menor concentracin de antimicrobiano capaz de destruir el 99,9% de una muestra inoculada en unas condiciones normalizadas. El estudio de la CMI es el que se realiza de forma habitual en los laboratorios de microbiologa. Para llevarlo a cabo se utilizan procedimientos de referencia y cepas control que proporcionan a estos mtodos unos resultados

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reproducibles, comparables y que permiten clasificar los microorganismos en diferentes categoras: a) sensible: Cuando la CMI de un antibitico para una bacteria se puede conseguir in vivo con dosis teraputicas y la experiencia ha demostrado su eficacia b) resistente: Cuando el microorganismo no es inhibido por las concentraciones que normalmente se pueden obtener in vivo. c) intermedio: Cuando las bacterias se inhiben a concentraciones que no se alcanzan con dosis teraputicas, pero que pueden alcanzarse con dosis ms altas sin que sean txicas o cuando el antibitico se encuentra a altas concentraciones en el lugar de la infeccin, generalmente en las vas de eliminacin. El medio de cultivo en el que se realizan la mayora de los antibiogramas (excepto para bacterias exigentes) es el medio Muller-Hinton (extracto de carne, aminocidos y almidn. Este medio se puede usar en estado lquido o slido. Mtodos 1.- Difusin en agar, que se puede realizar: a) disco-placa. Con este sistema se puede probar la eficacia de varios antimicrobianos al mismo tiempo realizando una siembra de una suspensin bacteriana, con un inculo normalizado sobre la superficie de un medio slido, colocando sobre la misma discos de papel impregnados de una cantidad conocida de antibitico. Por el agua del medio los antimicrobianos difunden y se crea un gradiente de concentraciones decrecientes a medida que nos alejamos del disco. Tras un periodo de incubacin se obtiene, alrededor del disco, una zona de inhibicin del crecimiento bacteriano. La valoracin del halo se hace por patrones obtenidos de forma que se hayan correlacionado la CMI, el dimetro del halo de inhibicin y la carga del antibitico del disco. Los resultados se expresan en trminos de categora clnica (S, I, R). Es un mtodo sencillo y til para determinar la sensibilidad de microorganismos de crecimiento rpido, no se debe usar en bacterias de crecimiento lento y anaerobios. Es el mtodo que vamos a utilizar en las prcticas. b) test epsilon (E test). Es un mtodo que utiliza tiras de plstico que contienen un gradiente de antibitico para la determinacin cuantitativa de la sensibilidad o resistencia de los microorganismos. El fundamento es el mismo que el del mtodo disco-placa. Es una tcnica sencilla que puede ser utilizada en la mayora de los microorganismos (aerobios, anaerobios y levaduras).

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2. Dilucin. Son los mtodos cuantitativos de referencia para determinar la sensibilidad y resistencia de las bacterias. Consiste en determinar el crecimiento de una bacteria en presencia de concentraciones crecientes de un antibitico. Se pueden realizar en medio slido o lquido; este ltimo en forma de macrodilucin en tubo o microdilucin en placas de plstico con mltiples pocillos. En los medios lquidos, cuando las bacterias se multiplican aparece turbidez, pero cuando el antibitico inhibe el crecimiento el medio no se vuelve turbio; la dilucin del antibitico correspondiente al primer tubo o pocillo en que no existe crecimiento es la CMI. A partir de los tubos o pocillos donde no hay crecimiento se puede determinar la CMB, resembrando el contenido de estos sobre un medio de cultivo y observando si existe o no desarrollo de colonias. Mtodos mecanizados y automatizados La introduccin de estos sistemas ha relegado a los mtodos anteriores de ser usados de forma rutinaria en el laboratorio de microbiologa. La mayora emplean sistemas de microdilucin y la lectura se hace determinado el crecimiento bacteriano por espectrofotometra y nefelometra. La lectura se realiza de forma automtica o semiautomtica y puede ofrecer la informacin en forma de CMI o definir si la bacteria es sensible, resistente o intermedia. En todos estos sistemas la interpretacin de los resultados la realiza un ordenador que llevan incorporado. La determinacin de la sensibilidad de bacterias como micobacterias, treponemas, clamidias, micoplasmas y rickettsias, por tratarse de microorganismos con unas caractersticas muy especiales, requiere de tcnicas complejas. Tcnica de difusin con discos a realizar en prcticas: Se prepara una suspensin bacteriana con una turbidez equivalente al 0,5 de McFarland en solucin salina. Se introduce una torunda en dicha suspensin y con la torunda se hace una siembra en tapiz en la superficie del medio. Sobre ella se colocan los discos de antibiticos, que llevan una carga determinada. Se incuba a 37 C durante 18-24 horas. Haremos un antibiograma al bacilo Gram negativo y otro al coco Gram positivo. Lectura e interpretacin del antibiograma: Con una regla milimetrada se miden los dimetros de los halos de inhibicin que aparezcan alrededor de los discos de antimicrobianos. Los resultados se comparan con unas tablas en las que se correlacionan dimetros de halo con categoras clnicas (S, I, R).

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DIA 4. Lectura e interpretacin de las pruebas de identificacin bioqumica y Antibiograma. NOMENCLATURA BACTERIANA. TAXONOMIA BACTERIANA NOMENCLATURA BACTERIANA. Consiste en la asignacin de nombres a los grupos taxonmicos. A cada especie se le asigna un primer nombre que se refiere al gnero. Suele ser una palabra latina o latinizada basada en la morfologa del microorganismo, el nombre del descubridor u otro carcter diferencial. Se escribe con maysculas. El segundo trmino es el de la especie y suele ser un adjetivo descriptivo del mismo, que se refiere al color, produccin de enfermedad, descubridor... Se escribe con minsculas. Tanto el gnero como la especie se escriben en cursiva o subrayado. Ej. Bacillus anthracis. Bacillus: Bacilo Anthracis: ntrax (carbunco) TAXONOMIA BACTERIANA DIFICULTAD DE SU ESTUDIO. En principio se utiliz una clasificacin filogentica, pero se abandon por la dificultad de establecer relaciones evolutivas. Por otro lado existe una gran movilidad gentica: mutaciones, transferencia de material gentico. Se han utilizado distintos enfoques: 1. Enfoque clsico: Se valoran caractersticas estructurales y morfolgicas (forma celular, movilidad, flagelos, esporas...) Estas son ms estables e independientes del medio externo que las caractersticas fisiolgicas y bioqumicas por lo que tienen ms peso a la hora de clasificar los microorganismos. 2. Enfoque Adamsoniano: Es una taxonoma numrica en la que todas las caractersticas tienen la misma importancia. Requiere el uso de ordenadores. 3. Enfoque gentico o molecular: Las caractersticas fenotpicas son expresin de un gran nmero de genes, que son el ADN. Estudiando este, se pueden clasificar los microorganismos ms correctamente. Se estudian tambin diversas propiedades: a. Composicin de bases del ADN: ndice G + C b. Porcentaje de hibridacin de los cidos nucleicos de dos o ms microorganismos. c. Secuenciacin.

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