PRCTICA 1:

EVALUACIN DE LA CONCENTRACIN DE LA ENZIMA SUSTRATO EN LA CINTICA ENZIMTICA

1. RESMEN El cuajo es conocido desde tiempos muy antiguos, pero su componente activo y puro, la quimosina, slo se conoce desde hace unas cuantas dcadas. El cuajo antiguo se obtena del estmago de terneros lactantes. Se sumerga una parte del estmago en salmuera, y tras dejarlo reposar hasta que la renina difundiera a la salmuera, se utilizaba parte de ese lquido en la leche a cuajar. El inconveniente de este mtodo antiguo radica en la dificultad para obtener dosis precisas de cuajo, y en su variabilidad de concentracin a lo largo de su tiempo de uso. El cuajo qumico, la quimosina pura, no tiene este inconveniente, por lo que es ms fcil estandarizar los tiempos de cuajado. En cuanto al cuajo puro, existen cuajos naturales: quimosina extrada cortando del estmago de los terneros, y cuajo sinttico, descubierto hace una dcada y de presentacin en pastillas: es quimosina obtenida a partir de procedimientos de sntesis qumica sin usar el estmago de terneros como materia prima. As averiguaremos la concentracin de quimosina en la coagulacin de la leche. La accin de la quimosina es bien conocida por la industria lctea. Acta directamente en un punto delimitado de la casena con calcio. Al alterar dicha molcula se inicia la formacin de un gel que atrapa la mayora de los componentes slidos de la leche; este gel se contrae poco a poco ayudado por la acidificacin previa de la leche por medio de bacterias acido lcticas, y al contraerse va expulsando suero. Al cortar el gel en cubitos, se logra separar entre un 50 y un 90% del contenido inicial del suero de la leche. La concentracin de enzimas en el cuajo en diferentes tipos de dosis nos daremos cuenta cual es el que se coagula ms rpido o lento.

2. INTRODUCCIN La coagulacin de la leche se define como la desestabilizacin de la solucin coloidal de casena que da lugar a la aglomeracin de las micelas libres y la formacin de un gel que contiene el resto de los componentes de la leche La coagulacin cida o lctica suele ser utilizada para la elaboracin de quesos frescos mientras que la enzimtica es la empleada de forma mayoritaria en quesos madurados. Los coagulantes enzimticos utilizados, conocidos comnmente como cuajos, son proteasas cidas que tienen su pH ptimo de actuacin en la zona cida y presentan un origen variado: animal, vegetal o microbiano. La fuerza del cuajo se expresa como una relacin entre una unidad de peso y/o de volumen del cuajo capaz de coagular un nmero de unidades correspondientes de leche en unas condiciones definidas de temperatura y de tiempo; siendo estas condiciones consideradas en la presente prctica. La enzima hidroliza la parte hidrofilita de la casena capa (que es la que est en la superficie de la micela) atacando los enlaces peptdicos de los aminocidos 105 - 106, se desdobla en dos: para - casena capa y macropeptidos quedando separadas la parte hidrofilita por un lado y la hidrofbica por el otro. Al separarse, la parte hidrofilita se solubiliza, mientras que la hidrofbica al no tener quien la soporte se une y coagula. El cogulo formado por va enzimtica es ms firme que el producido por va acida porque en la va enzimtica no se le quita el calcio coloidal por lo tanto las submicelas siguen unidas y coagulan todas, como un paquete. Para la dicha prctica utilizaremos solucin de cloruro de calcio, solucin de cuajo y muestras de leche fresca.

3. OBJETIVOS Determinar la influencia de la concentracin de quimosina en el tiempo de coagulacin de la leche. Determinar la influencia de la concentracin de leche en el tiempo de coagulacin de la leche. 4. FUNDAMENTO TERICO La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cintica y de la dinmica qumica de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas. Las enzimas, en su mayora, protenas con la capacidad de manipular otras molculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro cataltico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimtico. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una protena en dos polipptidos. En otros casos, se produce la unin simultnea de dos sustratos, como en el caso de la ADN polimerasa, que es capaz de incorporar un nucletido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, tambin suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reaccin. Esta etapa limitante puede consistir en una reaccin qumica o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato. El conocimiento adquirido acerca de la estructura de las enzimas ha sido de gran ayuda en la visualizacin e interpretacin de los datos cinticos. Por ejemplo, la estructura puede sugerir cmo permanecen unidos sustrato y producto durante la catlisis, qu cambios conformacionales ocurren durante la reaccin, o incluso el papel en particular de determinados residuos aminocidos en el mecanismo cataltico.

Algunas enzimas modifican su conformacin significativamente durante la reaccin, en cuyo caso, puede ser crucial saber la estructura molecular de la enzima con y sin sustrato unido (se suelen usar anlogos que se unen pero no permiten llevar a cabo la reaccin y mantienen a la enzima permanentemente en la conformacin de sustrato unido). Los mecanismos enzimticos pueden ser divididos en mecanismo de nico sustrato o mecanismo de mltiples sustratos. Los estudios cinticos llevados a cabo en enzimas que solo unen un sustrato, como la triosafosfato isomerasa, pretenden medir la afinidad con la que se une el sustrato y la velocidad con la que lo transforma en producto. Por otro lado, al estudiar una enzima que une varios sustratos, como la dihidrofolato reductasa, la cintica enzimtica puede mostrar tambin el orden en el que se unen los sustratos y el orden en el que los productos son liberados. Sin embargo, no todas las catlisis biolgicas son llevadas a cabo por enzimas proteicas. Existen molculas catalticas basadas en el ARN, como las ribozimas y los ribosomas, esenciales para el splicing alternativo y la traduccin del ARNm, respectivamente. La principal diferencia entre las ribozimas y las enzimas radica en el limitado nmero de reacciones que pueden llevar a cabo las primeras, aunque sus mecanismos de reaccin y sus cinticas pueden ser estudiados y clasificados por los mismos mtodos. La reaccin qumica catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma cantidad de producto que una reaccin no catalizada. Al igual que ocurre en otros tipos de catlisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reaccin entre sustrato y producto.1 Sin embargo, al contrario que las reacciones qumicas, las enzimas se saturan. Esto significa que a mayor cantidad de sustrato, mayor nmero de centros catalticos estarn ocupados, lo que incrementar la eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los sitios posibles estn ocupados. En ese momento se habr alcanzado el punto de saturacin de la enzima y, aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia. Las dos propiedades cinticas ms importantes de una enzima son: el tiempo que tarda en saturarse con un sustrato en particular y la mxima velocidad de reaccin que pueda alcanzar. El conocimiento de estas propiedades hace posible hipottica acerca del comportamiento de una enzima en el ambiente celular y predecir cmo responder frente a un cambio de esas condiciones.

COAGULACIN ENZIMTICA DE LAS CASENAS Las micelas de casena pueden coagular por la accin de enzimas proteolticos, que cortan la cadena de la protena por el enlace entre Phe105-Met106, separando la regin hidroflica del extremo El fragmento mayor de la casena kappa, que va desde el aminocido 1 al 105, conocido como "para-kappa-casena", queda asociado a la micela, mientras que el fragmento menor, el "caseinomacropptido", se libera y queda en solucin. Tras la coagulacin de las micelas, este fragmento permanecer en el lactosuero. Quimosina La quimosina, es un enzima proteoltico que se obtiene tradicionalmente del abomaso (cuarto estmago) de terneros jvenes. Se encuentra, como enzima digestivo, mezclado con pepsina, siendo la proporcin de quimosina, y la calidad del cuajo, mayor cuanto ms joven es el animal. Tambin se encuentra en otras especies animales, como el cerdo. Durante muchos siglos se ha utilizado como en la fabricacin de queso el estmago de los terneros secado al sol y triturado. La quimosina se sintetiza como pre-pro-quimosina, protena que tiene en su cadena 58 aminocidos ms que la quimosina activa, y que no tienen actividad proteoltica. Se secreta al estmago como pro-quimosina, tambin inactiva, tras el corte de 16 aminocidos, y se transforma en el enzima activo por la eliminacin proteoltica de otro fragmento de 42 aminocidos, quedando con un peso molecular de aproximadamente 30.700. El enzima, como todas las proteinasas, puede auto digerirse si se conserva en las condiciones en las que es activo. Puesto que la quimosina se inactiva reversiblemente con concentraciones elevadas de cloruro de sodio, se conserva en esta forma. Al disminuir la concentracin salina al utilizarla, se reactiva. La quimosina tiene tres variantes genticas, la variante A, con un resto de asprtico en la posicin 286, y la B, que tiene en esa misma posicin un resto de glicina y la variante C. La variante A es algo ms activa que la B frente a la casena kappa, posiblemente porque la carga del asprtico favorece su interaccin con ella. En cambio, la variante B es algo ms estable a pH 3,5 o inferior. Junto con la quimosina, en el cuajo aparece pepsina. Este enzima, obtenido de bovinos adultos o de cerdos, tambin puede utilizarse en la coagulacin de la leche.

En la industria quesera es importante y determinante el uso del cuajo, La dosis aplicada garantizar la coagulacin en un mximo de 40 minutos, para estandarizar la produccin quesera. Como la quimosina contenida en los cuajos comerciales hasta en un 75% es la mejor opcin y la ms difundida para la coagulacin enzimtica de la leche, sin desconocer que para ciertos quesos, como el crema y algunos frescos, se emplea la coagulacin acida. El principio activo del cuajo es la quimosina, enzima proteoltica que hidroliza los enlaces peptdicos de las protenas, especialmente la ca-sena. Aparte de pepsina, el cuajo tambin puede estar contaminado con tripsina y peptidasas. El pH de la quimosina pura es 5.4 y su pH ptimo de 3.8, pero el cuajo acta normalmente al pH natural de la leche, 6.6 a 6.8, cuando el pH sube por encima de 9 (leches neutralizadas) la quimosina se inactiva. La accin de la quimosina no est clara, lo ms probable es que el caseinato de calcio al ser atacado por el cuajo se convierta en paracaseinato clcico, y ste al reaccionar con los iones de calcios libres, solubles, se hace insoluble y se precipita en forma de cuajada. La velocidad de coagulacin y la calidad del proceso son afectadas por muchos factores, entre estos tenemos: - La acidez o pH de la leche. - La concentracin de sales solubles de calcio. - La concentracin de casena y fosfato coloidal. - La temperatura de conservacin y tratamiento de la materia pri-ma, o leche. La fuerza del cuajo u otra enzima coagulante se define como la cantidad de leche en mililitros, que cuaja a 35 C en 40 minutos, cuando se le adiciona una un gramo o mililitro de cuajo (la dosis no es baja ni excesiva, es la necesaria).

Se puede calcular de la siguiente forma:

V * 2400 .Ec (1) C *t

Donde F: Fuerza del cuajo C: Cantidad de cuajo (g) V: cantidad de leche (litros) t: tiempo (seg.)

Cuando se conoce la fuerza, se puede calcular la cantidad necesaria a utilizar por medio de la siguiente formula:

C
Donde:

L * 35 * 40 .Ec (2) F *T * M

F: Fuerza del cuajo C: Cantidad de cuajo (g) M: duracin en minutos L: cantidad de leche (litros) T: Temperatura

5. MATERIAL Y REACTIVOS Materia prima: 01 Litro de leche fresca libre de inhibidores Reactivos Agua Cuajo en polvo Cloruro de sodio o sal comn Cloruro de calcio (solucin)

Materiales y Equipos 02 Pipeta de 10 ml. 02 Pipeta de 5 ml. 02 Pipeta de 2 ml. 01 Matraz de 1000cc. 02 Probetas de 100cc. 05 Beaker 250 ml. Balanza de precisin Bao Mara 02 Fiolas de 100 ml.

6. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Preparacin de la solucin de Cloruro de calcio: 1. Disolver 1.6 gr de Cl2Ca en 100 ml de agua destilada Preparacin de la solucin de cuajo: 1. Disolver 0.1 gr de cuajo en 100 ml de agua destilada 2. Adicionar aproximadamente 0.1 gr de sal comn

Preparacin de las muestras de leche: 1. Calentar 1000 ml de leche a 35C en un bao mara. 2. Distribuir 200 ml de leche en 5 beakers 3. Rotularlos en orden creciente del 1 al 5 4. Retirar 50 ml de leche del beaker N2 y agregar 50 ml de agua hervida y atemperada a 35C agitar hasta total homogenizacin de la mezcla. 5. Agregar al beaker N3 6 gramos de leche descremada en polvo y agitar hasta total disolucin 6. Agregar a todos los beakers 10 ml de la solucin de Cl2Ca 7. Agregar al beaker N1, 2 y 3, 2 ml de la solucin de cuajo 8. Agregar al beaker N4 4 ml de la solucin de cuajo 9. Agregar al beaker N5 1 ml de la solucin de cuajo 10. Tomar el tiempo desde la adicin del cuajo hasta que se presente la coagulacin de la leche 11. Hallar la fuerza del cuajo para cada muestra emplee la Ec. 1. 12. Asumiendo una fuerza de cuajo de 1000 Despeje y determine el tiempo exacto de coagulacin para cada muestra emplee la Ec. 1. 7. RESULTADOS a) Determine la influencia de la concentracin de quimosina en el tiempo de coagulacin de la leche. Calcular la fuerza de los dos tipos de cuajo. Calculamos el valor verdadero de la fuerza del cuajo: Cantidad de Leche = 200 ml = 0,2 L Cantidad de cuajo = 0,002g Tiempo = = 2400 s
F V * 2400 C *t

F=

Calculamos las Fuerzas de cuajo: Beaker 2 y 4 Tiempo = 18 min x = 1080 seg. seg seg

Fuerza del Beaker 2 = Fuerza del Beaker 4 = Beaker 1 Tiempo = 25 min x = 1500 seg.

Fuerza del Beaker 1 = Beaker 5

Tiempo = 33 min x

= 1980 seg.

Fuerza del Beaker 5 = Beaker 3 Tiempo = 40 min x = 2400 seg.

Fuerza del Beaker 3 =

b) Determine la influencia de la concentracin de leche en el tiempo de coagulacin de la leche. Tomando el valor verdadero de la fuerza del cuajo hallamos el tiempo, solo para los que trabajamos con leche en condiciones normales: F = 100

t=

Tiempo para el Beaker 1:

t=

= 2400

60 = 40 min

Tiempo para el Beaker 4:

t=

= 1200

60 = 20 min

Tiempo para el Beaker 5:

t=

= 4800

60 = 80 min

8. ANLISIS Y DISCUSIN DE LOS RESULTADOS Al haber usado el mismo cuajo, la fuerza debera ser la misma. Tiene que estar alrededor de 100, la cual se determina con el punto final de la coagulacin. En los Beaker 1, 2, 3 hemos modificado la leche. El beaker 1 es de leche con dosis normal, el beaker 2 es de leche con dosis duplicada de enzimas por lo cual es una leche aguada en este caso su fuerza se duplica porque tiene menos casena que romper llegando a su coagulacin ms rpido, el beaker 3 es una leche con dosis a la mitad quiere decir que es una leche concentrada no llegando a terminar su coagulacin ya que tiene ms sustrato y su fuerza ser menor. Cuando hallamos las fuerzas del cuajo no damos cuenta que en la Fuerza 1 est en un valor adecuado, la Fuerza 2 tiene esta el doble de las dems fuerzas y este resultado es lgico ya que el cuajo tiene menos casena que cortar, en la Fuerza 4 la leche es casi igual a la leche fresca la por lo cual su valor debe ser similar al de la Fuerza 1 y este es el que tiene ms certeza con un error mnimo, en la Fuerza 3 la leche es ms concentrada por lo que tiene menos fuerza para cortar. Para hallar el tiempo de coagulacin solo se realiza las muestras que tengan la leche en condiciones normal, en el Beaker 1 la coagulacin debi presentarse a los 40 minutos, en el Beaker 4 a los 20 minutos y en el Beaker 5 a los 80 minutos.

9. CONCLUSIONES La acidez de la leche favorece la accin del cuajo al liberar iones calcio de los compuestos solubles coloidales, a ms acidez mejor coa-gulacin y cuajada ms firme. La concentracin de casena hallada normalmente en la leche y la presencia de fosfato de calcio coloidal es fundamental para la forma-cin de una buena cuajada, el fosfato sensibiliza las partculas de casena facilitando la precipitacin por iones clcicos. Leches ricas en casena, como se coment antes, cuajan mejor y ms fcilmente. Altas cantidades de agua o de grasa en la leche alteran negativamente el proceso de coagulacin.

10. CUESTIONARIO a) Cmo es el mecanismo de accin de la quimosina?

b) Qu es la pepsina? La pepsina es una enzima digestiva que es liberada por las clulas principales del estmago y cuya funcin es degradar las protenas de los alimentos en pptidos (proteasa). El precursor de la pepsina es el pepsingeno, una proforma cuya estructura primaria tiene 44 aminocidos adicionales. Este pepsingeno se activa por el cido hidroclorhdrico (HCl), que es liberado por las clulas parietales de la mucosa gstrica. Cuando se ingiere alimento, la hormona gastrina y el nervio vago disparan la liberacin de pepsingeno y de HCl en la mucosa gstrica. El HCl crea un ambiente cido que permite al pepsingeno desplegarse y romperse a s mismo de una forma autocataltica, generando pepsina (la forma activa). La pepsina rompe los 44 aminocidos del pepsingeno para crear ms pepsina. Los pptidos pueden ser digeridos de nuevo por otras proteasas (en el duodeno) y eventualmente absorbidos por el organismo. La pepsina se almacena como pepsingeno, as que slo ser liberada cuando sea necesario, para no digerir las propias protenas de la mucosa gstrica. Sus funciones mejoran en entornos cidos de pH entre 1.8 y 4.4, y especialmente a pH 3.

c) Qu es la renina? La renina es una protena (enzima) segregada por clulas renales especiales cuando usted tiene disminucin en los niveles de sal (sodio) o volemia baja. La renina incrementa la cantidad de angiotensingeno en la sangre, lo cual finalmente aumenta la presin arterial. sta incrementa la secrecin de aldosterona, una hormona que ayuda a controlar el equilibrio hdrico y de sales del cuerpo. La renina, tambin llamada angiotensinogenasa, es una protena (enzima) segregada por las clulas yuxtaglomerulares del rin. Suele secretarse en casos de hipotensin arterial y de baja volemia. La renina tambin juega un papel en la secrecin de aldosterona, una hormona que ayuda a controlar el equilibrio hdrico y de sales del cuerpo. La renina activa el sistema renina angiotensina aldosterona al catalizar la hidrlisis de la molcula de angiotensingeno (producida por el hgado) produciendo angiotensina I. La rotura se produce en un aminocido leucina especfico

d) Qu tipo de actividad tiene las dos enzimas anteriores y cul es su papel en la produccin de quesos?

11. BIBLIOGRAFA
http://es.wikipedia.org/wiki/Cuajo http://es.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica http://www.buenastareas.com/ensayos/Fuerza-Cel-Cuajo/965455.html http://datateca.unad.edu.co/contenidos/201509/Manejo%20y%20Procesamiento%20 de%20Lacteos%20II/coagulacin.html http://www.muydelgada.com/wiki/Pepsina/

12. ANEXOS

UNIVERSIDAD CATOLICA DE SANTA MARA FACULTAD DE CIENCIAS E INGENIERIAS BIOLGICAS Y QUMICAS PROGRAMA PROFESIONAL DE INGENIERIA DE INDUSTRIA ALIMENTARIA

BIOQUMICA DE ALIMENTOS II
PRCTICA N1:

EVALUACIN DE LA CONCENTRACIN DE LA ENZIMA SUSTRATO EN LA CINTICA ENZIMTICA INTEGRANTES: KATHERINE ALFREZ VICENTE CAROLINA ESCUDERO PONCE DOCENTE: ING. DANISSA C. PAREDES MUOZ

AREQUIPA-PER