Anda di halaman 1dari 110

MINISTRIO DA SADE

Raiva
BrasliaDF 2008

Manual de Diagnstico Laboratorial da

MINISTRIO DA SADE Secretaria de Vigilncia em Sade Departamento de Vigilncia Epidemiolgica

Raiva
Manual de Diagnstico Laboratorial da
Srie A. Normas e Manuais Tcnicos

Braslia DF 2008

2008 Ministrio da Sade. Todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte e que no seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens desta obra da rea tcnica. A coleo institucional do Ministrio da Sade pode ser acessada, na ntegra, na Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sade: http://www.saude.gov.br/bvs O contedo desta e de outras obras da editora do Ministrio da Sade pode ser acessado na pgina: http://www.saude.gov.br/editora Srie A. Normas e Manuais Tcnicos Tiragem: 1. edio 2008 500 exemplares Elaborao, distribuio e informaes: MINISTRIO DA SADE Secretaria de Vigilncia em Sade Departamento de Vigilncia Epidemiolgica Coordenao-Geral de Laboratrios de Sade Pblica Esplanada dos Ministrios, bloco G, Edifcio Sede, 1. andar CEP: 70058-900 Braslia DF E-mail: svs@saude.gov.br Home page: http://www.saude.gov.br/svs Colaborao: A redao deste manual, que se iniciou com a participao de diversos profissionais da Rede de Laboratrios de Diagnstico de Raiva do Brasil, s foi finalizada com a efetiva participao dos pesquisadores do Laboratrio de Referncia Nacional, Instituto Pasteur. A CGLAB agradece a colaborao de todos. EDITORA MS Documentao e Informao SIA trecho 4, lotes 540/610 CEP: 71200-040, Braslia DF Tels.: (61) 3233 1774/2020; Fax: (61) 3233 9558 E-mail: editora.ms@saude.gov.br Home page: www.saude.gov.br/editora Impresso no Brasil / Printed in Brazil Ficha Catalogrfica Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Departamento de Vigilncia Epidemio lgica. Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva / Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade, Departamento de Vigilncia Epidemiolgica. Braslia: Editora do Ministrio da Sade, 2008. 108 p. : il. (Srie A. Normas e Manuais Tcnicos). ISBN 978-85-334-1454-9 1. Raiva/diagnstico. 2. Tcnicas de diagnstico e procedimentos. 3. Vrus da raiva. I. Ttulo. II. Srie. NLM WC 550 Catalogao na fonte Coordenao-Geral de Documentao e Informao Editora MS OS 2008/0013 Ttulos para indexao: Em ingls: Guide of Laboratorial Diagnosis of Rabies Em espanhol: Manual de Diagnstico en Laboratorio de la Rabia Equipe editorial: Normalizao: Cinthia Kikuchi Reviso: Lilian Alves Assuno e Paulo Henrique de Castro Capa, projeto grfico e diagramao: Marcus Monici

Sumrio
APRESENTaO _ ______________________________________________7 CaPTULO 1 A RaIVa____________________________________________9 1.1 Distribuio geogrfica_ ______________________11 1.2 Principais caractersticas do vrus da raiva_________12 1.3 Patogenia_ _________________________________16 1.4 Imunidade anti-rbica_ _______________________18 1.5 Epidemiologia_______________________________19 1.6 Anticorpos monoclonais como instrumento de vigilncia epidemiolgica_____________________21 1.7 Estudos genticos com o vrus rbico_ ____________24 1.8 Sintomatologia______________________________25 1.8.1 Humanos ______________________________25 1.8.2 Ces_ __________________________________26 1.8.3 Gatos__________________________________27 1.8.4 Bovinos________________________________27 1.8.5 Outros animais domsticos________________28 1.8.6 Animais silvestres________________________28 CaPTULO 2 BIOSSEGURaNa_ ____________________________________29 2.1 Classes de risco biolgico_ _____________________31 2.2 Medidas bsicas de biossegurana_ _____________32 CaPTULO 3 COLHEITa E ENVIO DaS aMOSTRaS PaRa DIaGNSTIcO LabORaTORIaL_ _35 3.1 Colheita do material_ _________________________37 3.2 Necropsia___________________________________38 3.2.1 Materiais para necropsia_ _________________38 3.2.1.1 Equipamentos de proteo individual_________________________38 3.2.1.2 Instrumentais_ _____________________38 3.3 Colheita da amostra_ _________________________39 3.4 Acondicionamento e preparo da amostra para encaminhamento____________________________43 3.5 Sugesto de informaes para a ficha de remessa de amostras para o laboratrio de diagnstico de raiva__________________________44

CaPTULO 4 DIaGNSTIcO LabORaTORIaL_____________________________45 4.1 Tcnica histolgica (colorao de Sellers)__________47 4.1.1 Materiais necessrios_____________________47 4.1.1.1 Equipamentos_____________________47 4.1.1.2 Reagentes_ _______________________47 4.1.1.3 Materiais diversos_ _________________47 4.1.1.4 Corante_ _________________________48 4.1.2 Colorao______________________________49 4.1.3 Leitura_________________________________51 4.2 Tcnica de imunofluorescncia direta_ ___________52 4.2.1 Materiais necessrios_____________________53 4.2.1.1 Equipamentos_____________________53 4.2.1.2 Reativos__________________________53 4.2.1.3 Materiais diversos_ _________________53 4.2.1.4 Procedimentos_ ___________________54 4.2.2 Leitura das lminas_ ______________________55 4.2.3 Preparo do CVS (Challenge Virus Standard)____56 4.2.4 Titulao do CVS (trabalho)_______________56 4.2.5 Preparo do CCN (crebros de camundongos normais)_______________________________57 4.2.6 Titulao do conjugado anti-rbico_ ________57 4.2.7 Avaliao do conjugado_ _________________59 4.3 Prova para isolamento do vrus rbico em camundongos (prova biolgica)_ _______________60 4.3.1 Materiais necessrios_____________________61 4.3.1.1 Equipamentos_____________________61 4.3.1.2 Reativos__________________________61 4.3.1.3 Materiais diversos_ _________________61 4.3.2 Procedimentos__________________________62 4.3.3 Inoculao em camundongos______________62 4.4 Prova para Isolamento do Vrus Rbico em Cultivo Celular____________________________________ 65 4.4.1 Materiais necessrios_____________________65 4.4.1.1 Equipamentos_____________________65 4.4.1.2 Reativos__________________________66 4.4.1.3 Materiais diversos_ _________________66 4.4.2 Procedimentos__________________________67

4.5 Tipificao antignica pela tcnica de imunofluorescncia indireta com anticorpos monoclonais________________________________69 4.5.1 Materiais necessrios_____________________70 4.5.1.1 Equipamentos_____________________70 4.5.1.2 Reativos__________________________70 4.5.1.3 Materiais diversos_ _________________71 4.5.1.4 Procedimentos_ ___________________71 CaPTULO 5 SORONEUTRaLIZaO__________________________________75 5.1 Avaliao sorolgica para raiva__________________79 5.1.1 Colheita do soro_________________________80 5.2 Soroneutralizao em cultura de clulas_ _________80 5.2.1 Materiais necessrios_____________________80 5.2.1.1 Equipamentos_____________________80 5.2.1.2 Materiais diversos_ _________________81 5.2.1.3 Reativos__________________________81 5.2.2 Procedimentos__________________________81 5.2.3 Colorao com conjugado fluorescente______82 5.2.4 Leitura_________________________________82 5.3 Soroneutralizao em camundongos_____________83 5.3.1 Diluio do soro a ser testado e do soro-padro____________________________83 5.3.2 Diluio do vrus desafio_ _________________84 5.3.3 Inoculao e observao dos camundongos__85 5.3.4 Clculos segundo Reed & Mench_ _________85 CaPTULO 6 LOGaRITMOS________________________________________87 6.1 Conceitos bsicos______________________________89 6.2 Operaes com logaritmos______________________89 6.3 Cologaritmo__________________________________91 6.4 Estrutura de logaritmo decimal___________________91 6.5 Obteno de antilogaritmos_____________________92 CaPTULO 7 MTODO DE REED-MENcH (R & M)_______________________93 CaPTULO 8 TaMPES E SOLUES__________________________________97 REFERNcIaS ______________________________________________ 101

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Apresentao
O diagnstico laboratorial da raiva de fundamental importncia para o tratamento profiltico humano ps-exposio, mediante a aplicao de imunobiolgicos especficos, e para a adoo de medidas visando ao controle da doena nas populaes de animais domsticos, evitando a ocorrncia de epizootias com a identificao das reas com circulao viral. A avaliao sorolgica dos anticorpos anti-rbicos com a soroneutralizao permite o acompanhamento da proteo conferida pela vacina em indivduos expostos ao vrus da raiva, acidentalmente ou por razes de trabalho, evitando riscos da ocorrncia de novos casos da enfermidade. Outras contribuies importantes do laboratrio de diagnstico so a anlise antignica dos vrus isolados e o estudo genmico. A anlise antignica tem contribudo para o estudo comparativo das variantes do vrus da raiva, por meio da utilizao de anticorpos monoclonais. Tal caracterizao tem sido muito til para que se entenda a epidemiologia da raiva humana em situaes em que no h evidncias de exposio ao vrus, em regies onde a raiva canina est sob controle, e tambm para integrar a vigilncia epidemiolgica no mbito dos laboratrios de diagnstico, na compreenso dos novos ciclos epidemiolgicos da raiva identificados no pas. A anlise genmica permite que se estabelea a relao evolutiva das variantes e a distribuio espacial e temporal de cada uma delas. A padronizao dos procedimentos nos laboratrios que realizam o diagnstico essencial para garantir a qualidade dos resultados obtidos. Este manual tem o objetivo de promover tal padronizao de procedimentos de rotina da rede de laboratrios, com a atualizao dos profissionais que atuam nas diferentes instituies da referida rea. Ministrio da Sade

Captulo

A raiva

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

A raiva uma antropozoonose transmitida ao homem pela inoculao do vrus da raiva, contido na saliva de animais infectados, principalmente por meio de mordeduras. Trata-se de uma encefalite aguda, que leva as vtimas ao bito em praticamente 100% dos casos, sendo uma das mais antigas doenas conhecidas. Ainda nos dias atuais, a raiva representa um srio problema de sade pblica e produz grandes preju zos econmicos pecuria.

1.1 Distribuio geogrfica


A distribuio da raiva mundial, com cerca de 40.000 a 70.000 mortes ao ano, quase todas em pases em desenvolvimento. Atualmente, as nicas regies cuja populao animal no est infectada com raiva so: Nova Zelndia, Nova Guin, Japo, Hawai, Taiwan, Oceania, Finlndia, Islndia, a parte continental da Noruega, Sucia, Portugal, Grcia e algumas ilhas das Antilhas e do Atlntico. Aps mais de 115 anos do desenvolvimento da vacina anti-rbica, por Louis Pasteur, a raiva persiste em algumas regies sob a forma epidmica. A razo mais importante para que tal fato ocorra a multiplicidade de reservatrios domsticos ou silvestres da raiva. Na sia, na frica e na Amrica Latina, os ces continuam sendo os mais importantes reservatrios, e a raiva humana permanece como um grave problema de sade pblica. Nos pases nos quais foi possvel o controle da raiva nos animais domsticos urbanos, os casos em humanos diminuram; porm, os animais silvestres representam um srio desafio a ser vencido. Em raposas, a raiva tem se mostrado endmica, tanto na Europa como na Amrica do Norte. Outros animais silvestres, como os cangambs, guaxinins e morcegos, na Amrica do Norte, tm assumido enorme importncia, porm os dados de ocorrncia refletem principalmente a ateno que tem sido dada raiva nesses animais, o que no vem acontecendo no restante do mundo. Algum xito vem sendo obtido, atualmente, no controle da raiva silvestre, com a utilizao de vacinas de vrus atenuados ou de vacinas recombinantes. Na Amrica Latina, os morcegos hematfagos, principalmente o Desmodus rotundus, constituem-se nos principais transmissores

11

Secretaria de Vigilncia em Sade

para os animais de interesse econmico, embora os ces tenham sido os principais transmissores da raiva humana at o ano de 2003. Outras espcies de morcegos tambm vm desempenhando importante papel na transmisso da raiva. A partir de 2004, os morcegos hematfagos se tornaram o principal transmissor da raiva na Amrica Latina e, em particular, no Brasil. Quando se consideram os prejuzos econmicos causados pela raiva, devem ser computados, alm das mortes dos animais de interesse econmico, os prejuzos indiretos, como a quebra da produo leiteira e da carne, a depreciao do couro dos animais, pelos freqentes ataques dos morcegos hematfagos, e o dano econmico pelas horas perdidas por homem nos tratamentos anti-rbicos, bem como o prprio custo dos tratamentos.

1.2 Principais caractersticas do vrus da raiva


A raiva uma doena que acomete mamferos, em geral, e causada por um vrus RNA da ordem Mononegavirales, famlia Rhab doviridae, gnero Lyssavirus e espcie Rabies virus (RABV). Na famlia Rhabdoviridae, existe um amplo nmero de espcies de vrus que infectam animais vertebrados (mamferos, peixes e rpteis), invertebrados e plantas, o que demonstra a grande diversidade desses vrus. A famlia Rhabdoviridae possui trs gneros que infectam mamferos: Vesiculovirus: vrus da estomatite vesicular e vrus relacionados. Lyssavirus: vrus da raiva e aparentados ao vrus da raiva. Ephemerovirus: vrus da febre efmera dos bovinos. Alm desses trs gneros, h outros trs: Novirhabdovirus (que infecta peixes) e cytorhabdovirus e nucleorhabdovirus (que infectam plantas e invertebrados). O estudo do vrus da raiva, que at a dcada de 70 era considerado uma unidade antignica, teve grandes avanos a partir da dcada de 80, com a utilizao de anticorpos monoclonais.
12

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

O gnero Lyssavirus possui, atualmente, sete espcies distintas. Quatro delas podem ser relacionadas da seguinte forma: (1) Rabies virus (RABV), o vrus clssico da raiva, que infecta mamferos terrestres, morcegos hematfagos e morcegos no-hematfagos das Amricas e pertence ao gentipo 1; (2) Lagos bat virus (LBV) ou gentipo 2, que o vrus isolado de morcegos frugvoros (Eidolon helvum, Micropterus pusillus e Epomorphorus wahlbergi) da Regio dos Lagos (Nigria); (3) Mokola virus (MOKV) ou gentipo 3, que foi isolado de mussanharos (Crocidura sp) de humanos, tambm da Nigria, e de felinos do Zimbabwe e da Etipia; e (4) Duvenhage virus (DUVV) ou gentipo 4, isolado de morcegos insetvoros (miniopterus schereibersii e nycteris thebaica) e humanos da frica do Sul e Zimbabwe. A partir da dcada de 80, verificou-se que tais vrus (gentipos 2, 3 e 4), denominados vrus relacionados ou aparentados ao vrus da raiva, pareciam estar mais difundidos do que se sups inicialmente. Naquela poca, foram isoladas vrias cepas de vrus do continente europeu com caractersticas similares aos vrus relacionados. Mais estudos realizados posteriormente permitiram a classificao de mais dois gentipos ou duas espcies: o European bat lyssavirus 1 (EBLV1), que agrupou os isolamentos do gnero Eptesicus; e o European bat lyssavirus 2 (EBLV2), que agrupou os isolamentos do gnero Myotis. Esses foram denominados, respectivamente, gentipos 5 e 6. Na dcada de 90, foi isolada na Austrlia, de um morcego frugvoro (Pteropus alecto), uma nova cepa, denominada Australian bat lyssavirus, classificada como gentipo 7. Mais recentemente, em 2003, foram descritas novas variantes isoladas de morcegos insetvoros do Kirguisto, do Tadijkisto e da Rssia, tendo sido apresentada proposta para que eles sejam classificados como novos gentipos do gnero Lyssavirus. Tais vrus so denominados Aravan virus, isolado no Kirguisto, em 2003, a partir de morcego insetvoro (Myotis blythi); Khujand virus, isolado no Tadijkisto, em 2001, tambm de morcego insetvoro; e outras duas
13

Secretaria de Vigilncia em Sade

variantes isoladas na Rssia, uma da cidade de Irkutsk, denominada Irkut virus, a partir de um morcego Murina leucogaster, e a outra obtida na regio das montanhas do Cucaso, denominada West caucasian bat virus (WCBV), isolada a partir de um morcego Miniopterus schreibersi. Ressalta-se que, at o presente, o nico Lissavrus no isolado de quirpteros foi o gentipo 3 (Mokola virus) e somente o gentipo 1 foi encontrado no continente americano e no Caribe. Todos os Lyssavirus, vrus rbicos ou aparentados, possuem RNA de fita simples, polaridade negativa, linear, no segmentado, com 11.932 nucleotdeos e PM = 4,6 x 106 daltons. O vrus da raiva pode ser dividido em duas pores: o ribonucleocapsdeo e o envelope. O ribonucleocapsdeo possui o RNA e trs protenas: a nucleoprotena (n), que est associada ao RNA viral; a protena L, que uma RNA polimerase RNA dependente (responsvel pela transcrio e pela replicao do RNA viral), e a protena P (NS ou M1), que uma fosfoprotena. O envelope constitudo de duas protenas: a glicoprotena (G) e a protena matrix (M ou M2). A protena mais importante e mais conhecida a glicoprotena (G), responsvel pela induo de anticorpos neutralizantes, pela estimulao das clulas T e pela adsoro entre vrus e clula. A resposta imune especfica ao vrus da raiva possui dois componentes: a mediada por anticorpos e a mediada por clulas. Alm da glicoprotena (G), a nucleoprotena (N) tem importante papel na resposta imune, visto que, mediante uma interao, age na resposta imune celular. Destaca-se que uma boa relao N/G, na suspenso antignica destinada vacina, o ideal para a obteno de uma boa vacina antirbica. No que diz respeito morfologia, o vrus da raiva apresenta a forma de um projtil, com uma das extremidades plana e a outra arredondada. Seu comprimento mdio de 180nm e o dimetro mdio de 75nm. As espculas do envelope, de glicoprotena, possuem 9nm. Na sua constituio qumica, a partcula viral completa possui de 2 a 3% de cido ribonuclico (RNA), 67% de protenas, 26% de lipdeos e 3% de carboidratos.
14

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

O vrus da raiva sensvel aos solventes de lipdeos (sabo, ter, clorofrmio e acetona), ao etanol a 45-70%, aos preparados iodados e aos compostos de amnio quaternrio. Outras relevantes propriedades so a resistncia dessecao, assim como aos congelamentos e descongelamentos sucessivos, a relativa estabilidade a um pH entre 5-10 e a sensibilidade s temperaturas de pasteurizao e luz ultravioleta. inativado a 60oC, em 35 segundos; a 4oC, se mantm infectivo por dias; a -70oC ou liofilizado (4oC), se mantm durante anos. O vrus da raiva muito sensvel aos agentes fsicos e qumicos, sendo possvel a sua inativao em poucos minutos pela ao de cidos e bases fortes, luz solar, alteraes de PH e temperatura e raios ultravioleta. A adsoro entre vrus e clula feita pela glicoprotena, em uma ligao especfica (receptor celular anti-receptor viral). O vrus penetra nas clulas por um processo de endocitose. Uma vez dentro das clulas, o ribonucleocapsdeo liberado dentro do citoplasma, onde o RNA negativo se replica, dando origem ao RNA mensageiro (ciclo de transcrio primria), que codifica as cinco protenas e os novos genomas, que so encapsidados e, no nvel das membranas celulares, so liberados por brotamento. A glicoprotena, como j foi dito, tem papel importante na penetrao do vrus na clula, tendo tambm importante papel na imunidade humoral e na celular, pela ativao de linfcitos T (helper) e citocinas. A fosfoprotena interage com a nucleoprotena no processo de encapsidao, e a protena matrix muito importante na fase de maturao viral. A polimerase (protena L) RNA dependente tem mltiplas atividades enzimticas: na sntese do RNA, na metilao, na fosforilao, etc. importante tambm fazer distines entre os vrus rbicos clssicos, o vrus de rua e o vrus fixo. A denominao vrus de rua utilizada para cepas isoladas de animais infectados em ciclos de transmisso natural. Tais cepas caracterizam-se por um perodo de incubao varivel, s vezes bastante prolongado, ao contrrio das cepas deno15

Secretaria de Vigilncia em Sade

minadas vrus fixos, que apresentam um perodo de incubao curto, geralmente de quatro a sete dias.

1.3 Patogenia
A patogenia da raiva semelhante em todas as espcies de mamferos. O vrus se replica no local da inoculao, inicialmente nas clulas musculares ou nas clulas do tecido subepitelial, at que atinja concentrao suficiente para alcanar as terminaes nervosas, sendo este perodo de replicao extraneural responsvel pelo perodo de incubao relativamente longo da raiva. Nas junes neuromusculares, o vrus rbico, por meio da glicoprotena, se liga especificamente ao receptor nicotnico da acetilcolina. Aps essa fase, os vrus atingem os nervos perifricos, seguindo um trajeto centrpeto, em direo ao sistema nervoso central (SNC). O vrus segue o fluxo axoplasmtico retrgrado e o transporte clula a clula. Estima-se que o genoma viral tenha um deslocamento de 25 a 50mm por dia, at chegar ao sistema nervoso central. A distribuio do vrus rbico no homognea no SNC e, por tal razo, a poro de eleio para encaminhamento ao laboratrio de diagnstico varia de espcie para espcie. As regies mais habitualmente atingidas so: o hipocampo, o tronco cerebral e as clulas de Purkinje, no cerebelo. Muitas vezes, os sintomas esto associados com a localizao anatmica no crebro. Nos ruminantes suspeitos de raiva, deve ser feita a colheita de todo o encfalo ou, de preferncia, de fragmentos do sistema nervoso (crtex, cerebelo e hipocampo ou corno de Amon) de ambos os hemisfrios. Nos eqdeos, deve-se enviar, tambm, o bulbo e fragmentos das pores inicial, medial e terminal da medula espinhal. Nos ces, a poro de eleio o corno de Amon ou o hipocampo. Ressalta-se que, na coleta de amostras de todas as espcies (domsticas ou silvestres), deve ser encaminhada poro da medula. A partir da intensa replicao no SNC, o vrus da raiva segue em direo centrfuga, disseminando-se atravs do sistema nervoso perifrico e autnomo para diferentes rgos (pulmes, corao, rins, bexiga, tero, testculos, folculo piloso, etc.) e glndulas salivares, sendo eliminado pela saliva. A disseminao possibilita que
16

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

o vrus atinja, tambm, terminaes nervosas sensoriais do tecido cutneo da cabea e do pescoo, onde se pode demonstrar a presena de antgeno viral. Por tal razo, utiliza-se a bipsia de tecido dessa regio como mtodo de diagnstico ante-mortem. O vrus rbico pode localizar-se tambm na retina e no epitlio da crnea. A viremia tem sido documentada em modelos experimentais, sendo fugaz e temporria, mas no h evidncias de que tenha importncia significativa durante o processo de disseminao viral. Em ces e gatos, a saliva pode ter maior concentrao de vrus do que o prprio SNC. Em herbvoros, no entanto, a concentrao de vrus eliminado pela saliva baixa. As leses histopatolgicas so as incluses de Negri, que so patognomnicas para a raiva. A sua ausncia, porm, no invalida o diagnstico da raiva, tendo em vista que nos episdios de evoluo rpida, com perodo de incubao curto e bito precoce, pode no haver tempo suficiente para o aparecimento das incluses. Tal fato tem sido observado, com freqncia, no diagnstico laboratorial da raiva em eqdeos. Outra leso observada deve-se formao de vacolos, que conferem ao sistema nervoso o aspecto espongiforme. A via nasal e particularmente as clulas neuroepiteliais olfativas podem ser uma via alternativa de penetrao viral. Mais recentemente, nos Estados Unidos e na Alemanha, foi verificada a transmisso entre humanos mediante transplantes de rgos slidos. O perodo de incubao da raiva extremamente varivel e depende, fundamentalmente, da concentrao do inculo viral e da distncia entre o local do ferimento e o crebro. De igual forma, est relacionado com a extenso, a gravidade e o tamanho da ferida causada pelo animal agressor. o perodo que vai desde o momento em que o agente penetra no organismo at o aparecimento da sintomatologia clnica. Pode variar, em mdia, de 20 a 90 dias, em humanos e animais. O perodo de transmissibilidade o perodo em que existe a possibilidade de transmisso do agente infeccioso de um organismo a outro. Varia de espcie a espcie, mas, em todos os animais, inclusive nos seres humanos, precede ao aparecimento da sintomatologia
17

Secretaria de Vigilncia em Sade

e perdura durante o quadro clnico, at a morte. Tal perodo foi bastante estudado em ces e gatos, sendo, na grande maioria das vezes, de cerca de dois a quatro dias antes do surgimento dos sintomas no animal, at sua morte, que ocorre geralmente cinco dias aps.

1.4 Imunidade anti-rbica


Ao contrrio de muitos vrus que causam infeco aguda, o vrus da raiva ultrapassa as defesas imunes do hospedeiro, por um longo perodo, devido ao seu extremo neurotropismo, isto , a produo de anticorpos anti-rbicos em indivduos infectados s ocorre tardiamente, com freqncia apenas quando surgem os primeiros sintomas. Ao penetrar nos neurnios, o vrus da raiva torna-se protegido da ao dos anticorpos, das clulas do sistema imune e da ao dos interferons, responsveis pela resposta imune inespecfica. Os interferons so protenas de baixo peso molecular extremamente importantes no incio da infeco, que podem atuar inibindo diretamente a replicao viral (e, assim, a sua disseminao) ou induzindo as reaes das clulas imunes. O vrus da raiva capaz de induzir a produo de interferons antes de sua migrao para o sistema nervoso central. As clulas apresentadoras de antgeno (macrfagos, clulas dendrticas, clulas de Langerhans, etc.), quando entram em contato com o vrus da raiva, fagocitam-no e o processam para apresentao s clulas imunes. Tal apresentao fundamental ativao dos linfcitos T auxiliares, que vo produzir diferentes citocinas. Estas ativam diferentes clulas implicadas na eliminao direta do vrus ou de clulas infectadas e auxiliam a produo de anticorpos pelos linfcitos B. A estimulao dos linfcitos B para a produo de anticorpos, na infeco natural, s se d aps o aparecimento dos sintomas clnicos. A possibilidade de neutralizao da capacidade infecciosa viral s se d, portanto, aps a invaso do sistema nervoso central e, neste momento, a doena j adquiriu uma forma irreversvel. O ttulo de anticorpos neutralizantes permanece baixo at a fase terminal da doena e atinge seu pico prximo morte da vtima.

18

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

O papel principal dos anticorpos o de bloquear o vrus extracelular antes que ele encontre o receptor das clulas musculares, limitando sua propagao no nvel do local de infeco e sua progresso para o sistema nervoso central. A resposta imune celular , talvez, o mecanismo mais importante da resposta imune ao vrus da raiva. Os linfcitos T participam da proteo de diferentes maneiras: (1) estimulando, por intermdio dos linfcitos T auxiliares, as clulas B para que produzam anticorpos; (2) como efetoras de imunidade, na forma de clulas T citotxicas, lisando clulas infectadas; (3) induzindo a sntese de substncias mediadoras da estimulao de diferentes clulas; e (4) como clulas de memria imunolgica.

1.5 Epidemiologia
A raiva uma enfermidade que ocorre de maneira endmica em diversos pases. Suas formas epidemiolgicas obedecem a uma diviso didtica, sendo que as mais conhecidas so a raiva urbana e a raiva rural. A raiva urbana transmitida principalmente de co para co. O vrus mantido primariamente na populao canina; porm, outros animais domsticos urbanos so freqentemente infectados. Os ces, como j foi dito, so os importantes transmissores da raiva para o homem. Esta forma um grave problema de sade pblica, devido ao estreito relacionamento entre as pessoas e seus animais de companhia. A raiva rural mantida no campo pelo morcego hematfago (desmodus rotundus), que o reservatrio do vrus rbico no ambiente rural. Dessa forma, o morcego transmite o vrus para diferentes espcies de animais domsticos, como bovinos, eqinos, caprinos, etc. O nmero de casos de raiva em herbvoros, confirmados laboratorialmente, tem tido, nos ltimos anos, um acrscimo de maneira preocupante em algumas regies, devido principalmente intensa proliferao dos morcegos hematfagos e crescente dificuldade de controle de suas populaes.

19

Secretaria de Vigilncia em Sade

A transmisso do vrus da raiva feita, geralmente, por meio da saliva de um animal infectado para outro, embora outras vias sejam relatadas (membranas mucosas: olhos, nariz, boca), aerossis e transplante de crnea. Em quirpteros, as transmisses transplacentrias e transmamrias tambm j foram relatadas. J foi relatada a transmisso da doena em cavernas com grandes populaes de morcegos, para humanos e animais, por via aergena, bem como em laboratrios de produo e vacina. O ciclo areo da raiva tem, atualmente, uma grande importncia para a manuteno do vrus em uma rea geogrfica. As diferentes espcies de morcegos, hematfagos ou no, so susceptveis ao vrus, com possibilidade de transmiti-lo e de apresentar sintomatologia, que sempre evolui para a morte. O ciclo silvestre representado pela raiva nas espcies de mamferos silvestres terrestres, com nfase nos candeos silvestres. Em nosso meio, a real importncia desse ciclo no , ainda, bem conhecida, razo pela qual se torna indispensvel a implementao de programas de vigilncia epidemiolgica. Os estudos realizados com amostras isoladas nos ltimos anos, no Brasil, permitiram a proposio de um ciclo epidemiolgico da raiva, no qual h uma estreita inter-relao entre os quatro ciclos clssicos.

20

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Figura 1. Ciclos epidemiolgicos da raiva

Fonte: Instituto Pasteur.

1.6 Anticorpos monoclonais como instrumento de vigilncia epidemiolgica


Com a finalidade de caracterizar o vrus da raiva, a Organizao Pan-Americana da Sade (Opas) criou um consrcio de instituies com reconhecido conhecimento tcnico-cientfico (Consrcio de Laboratrios de Referncia para a Raiva) com os seguintes objetivos: fortalecer a vigilncia da raiva nas Amricas; otimizar a capacidade de diagnstico; harmonizar os mtodos e unificar os critrios de interpretao dos resultados utilizados nos diferentes laboratrios. Embora os mtodos sorolgicos que utilizam anticorpos policlonais permitam diferenciar o vrus da raiva dos outros Lyssavirus, eles s conseguem estabelecer ligeiras diferenas entre os subtipos do vrus clssico da raiva. Os mtodos de caracterizao antignica e gentica permitem a identificao das variantes responsveis por episdios e por casos individuais tanto de humanos como de animais.
21

Secretaria de Vigilncia em Sade

Os anticorpos monoclonais permitem anlises antignicas comparativas das variantes do vrus da raiva. A reatividade determinada com a utilizao de um painel de anticorpos monoclonais especficos para eptopos da nucleoprotena viral e visualizada pela colorao fluorescente. O painel de anticorpos monoclonais antinucleoprotena tem se mostrado adequado tanto para possibilitar a mxima diferenciao entre os vrus da raiva importantes, do ponto de vista da sade pblica, como para a distribuio e a transmisso entre as diferentes espcies selvagens. A caracterizao das variantes tem sido muito til tambm para que se entenda a epidemiologia da raiva humana, sobretudo nas situaes em que no h evidncias de exposio ao vrus, como, por exemplo, em regies onde a raiva canina esteja controlada. O uso exclusivo de anticorpos monoclonais, no entanto, apresenta certas limitaes. Por exemplo, a diversidade das variantes presentes em morcegos no hematfagos no totalmente explicada com os anticorpos monoclonais existentes. A anlise genmica , evidentemente, mais adequada, pois proporciona informaes mais detalhadas sobre a relao evolutiva dos isolados, as mudanas espaciais e temporais que se podem produzir e a semelhana entre os isolados. Dependendo dos objetivos da anlise e do grau de relao das variantes, prefervel a anlise das seqncias totais ou parciais do gene N, altamente conservado; do gene G, de divergncia intermediria; ou do gene P e da regio intergnica G-L, altamente divergentes. A anlise gentica se realiza mediante a reao de polimerizao em cadeia e a anlise dos produtos da amplificao. A aplicao da tipificao antignica e gentica na vigilncia da raiva na Amrica Latina e no Caribe essencial para melhorar os atuais programas de controle da doena. O conhecimento da fonte de novos focos de raiva canina e a identificao das espcies silvestres que mantm os ciclos silvestres de transmisso da raiva possibilitam uma melhor utilizao dos recursos de sade pblica.

22

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Na atualidade, o CDC (de Atlanta, USA), como Centro Colaborador da Organizao Mundial da Sade para a investigao e a referncia da raiva, que proporciona aos pases da Amrica Latina o painel de oito anticorpos monoclonais anti-N. O uso do mesmo painel tem a vantagem de permitir a comparao dos resultados obtidos por diferentes grupos de pesquisa. No Brasil, o Instituto Pasteur de So Paulo vem utilizando tal tcnica, que tem permitido determinar a distribuio geogrfica das variantes antignicas do vrus da raiva, descrever novas variantes e identificar variantes conhecidas em novos hospedeiros, informaes muito teis para a vigilncia epidemiolgica da raiva no Brasil. Tm sido demonstradas algumas limitaes da anlise antignica com um pequeno nmero de anticorpos monoclonais, visto que pequenos erros na interpretao de uma reao positiva ou negativa com um dos anticorpos monoclonais podem proporcionar um padro antignico diferente, o que poderia conduzir identificao incorreta de um reservatrio ou de um novo padro de reao. Por tal razo, a tipificao antignica, quando fornece resultados inesperados, deve ser complementada com o seqenciamento gentico. No Brasil, foram encontradas quatro variantes: variante 2, prpria dos ces; variante 3, prpria do morcego hematfago Desmodus rotundus; variante 4, prpria do morcego insetvoro Tadarida brasiliensis; e variante 6, prpria do morcego insetvoro Lasiurus cinereus. Foram encontradas tambm diversas outras variantes, que foram denominadas no compatveis com o painel de monoclonais estabelecido para estudos das cepas isoladas nas Amricas, com especial destaque para uma nova variante isolada em sagis do tufo branco (Callithrix jacchus) e em humanos, nos estados do Cear e do Piau, bem como outras isoladas em morcegos insetvoros.

23

Secretaria de Vigilncia em Sade

1.7 Estudos genticos com o vrus rbico


A tipificao gentica de uma determinada amostra de vrus rbico pode ser feita com a determinao da seqncia de um pequeno segmento de seu genoma e a comparao da seqncia com outras derivadas de diversas amostras de vrus rbico, disponveis em bancos de dados internacionais, como, por exemplo, o GenBank. Para tanto, o primeiro passo a ser cumprido amplificar, em uma escala de bilhes de vezes, o segmento de eleio e isol-lo do material gentico pertencente a outros microorganismos presentes na amostra ou mesmo ao prprio hospedeiro do qual se colheu a amostra. A amplificao conseguida por meio de uma reao desenvolvida no incio dos anos 80 e que ficou conhecida como reao em cadeia pela polimerase (PCR), na qual uma enzima que sintetiza cadeias de DNA (DNA-polimerase), a partir de um DNA molde, presente na amostra, faz cpias de um determinado segmento de DNA, cujas localizao e extenso so determinadas por um par de cadeias curtas de DNA sintetizadas artificialmente em laboratrio, par denominado primers, que ir reagir de modo especfico, nica e exclusivamente com o gene ou o agente de interesse. Ciclos de temperaturas permitem que o DNA-polimerase monte cpias do segmento delimitado pelos primers por meio da insero das bases nitrogrenadas A, G, T, C. Ao final da reao, o fragmento de DNA amplificado pode ser observado por eletroforese em gel de agarose, quando aparece como uma banda de precipitao de DNA de um tamanho esperado. Tal resultado , por si s, suficiente para que se determine a presena de vrus rbico, mas no permite que se observe a composio do DNA amplificado em termos de seqncias de nucleotdeos. Assim, para que se atinja esse nvel de disseco, o material amplificado submetido a uma segunda reao bioqumica, a reao de seqenciamento de DNA, mediante a adio de bases A, T, G e C modificadas e marcadas com cores. Uma vez terminada a reao, o equipamento conhecido como seqenciador de DNA capaz de ler as cores e apresent-las, finalmente, sob a forma de uma seqncia de DNA que pode, agora, ser utilizada para a tipificao molecular por meio da construo de uma rvore filogentica, uma representao grfica das relaes existentes entre diversas amostras de vrus rbico.
24

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Uma questo fundamental na tipificao molecular reside na escolha do segmento ou do gene a ser focalizado. No vrus rbico, so encontrados cinco genes, um para cada uma das protenas: N para a nucleoprotena, P para a fosfoprotena, M para a protena de matriz, G para a glicoprotena e L para a RNA-polimerase. Desses genes, a menor variabilidade encontrada no N: por exemplo, sabese que a similaridade dos aminocidos codificados por tal gene de 98 a 99,6% em amostras fixas. Isso torna o gene N o alvo de eleio para a tipificao molecular de uma dada amostra de vrus rbico: o gene N to conservado e estvel que pequenas variaes encontradas em sua seqncia sero compartilhadas por variantes que tm caractersticas em comum, como, por exemplo, o hospedeiro (morcego, co, etc.), o ciclo de transmisso (silvestre, areo, rural ou urbano), a regio de onde provm a amostra ou mesmo a poca em que a amostra foi detectada. A tipificao antignica, por meio da imunofluorescncia indireta, com utilizao de anticorpos monoclonais, uma tcnica especfica, sensvel e extremamente rpida, mas impossvel de ser realizada em amostras com volume muito pequeno, autolisadas ou em decomposio avanada, alm de ter um poder discriminatrio limitado, desvantagens que podem, seguramente, ser contornadas com a tipificao molecular.

1.8 Sintomatologia
A sintomatologia varia conforme o animal infectado. Assim, sero apresentadas consideraes sobre a sintomatologia em humanos, ces, gatos, outros animais domsticos e animais silvestres. 1.8.1 Humanos O perodo de incubao, na maioria dos casos, de 2 a 12 semanas, podendo variar de 10 dias at 4 a 6 anos. Durante o perodo de incubao, o paciente apresenta-se absolutamente assintomtico. A maior ou menor durao do perodo pode depender da dose de vrus injetada pela mordedura, do lugar desta e da gravidade da leso, sendo mais longo o perodo quanto mais distante do sistema nervoso central localizar-se a leso.

25

Secretaria de Vigilncia em Sade

A doena inicia-se com alteraes de comportamento, sensao de angstia, cefalia, pequena elevao de temperatura, mal-estar e alteraes sensoriais imprevistas, com freqncia relacionadas ao local da mordedura. O paciente costuma sentir dor e irritao na regio lesionada. Na fase seguinte, de excitao, surge hiperestesia de uma extrema sensibilidade luz e ao som, dilatao das pupilas e aumento da salivao. Conforme a doena progride, surgem espasmos nos msculos da deglutio e a bebida recusada por contraes musculares. A disfuno de deglutio observa-se na maioria dos doentes, muitos dos quais apresentam contraes espasmdicas laringofarngeas simples viso de um lquido e se abstm de deglutir a sua prpria saliva (hidrofobia). Tambm podem ser observados espasmos dos msculos respiratrios e convulses generalizadas. A fase de excitao pode ser predominante at a morte ou ser substituda por uma fase de paralisia generalizada. Em alguns casos, a fase de excitao muito curta e, em quase todo o curso da doena, predomina a sintomatologia paraltica. Tal fato ocorre, principalmente, quando a espcie transmissora o morcego. A doena dura de dois a seis dias ou mais e quase sempre termina com a morte, que atribuda falncia das funes vegetativas centrais bsicas e, muitas vezes, ocorre em funo da miocardite rbica concomitante. A raiva em animais manifesta-se de duas formas: a raiva furiosa e a raiva paraltica ou muda, de acordo com a sintomatologia nervosa apresentada. 1.8.2 Ces O perodo de incubao , em geral, de 15 dias a 2 meses. Na fase prodrmica, os animais apresentam mudana de comportamento, escondem-se em locais escuros ou mostram uma agitao inusitada. A excitabilidade reflexa fica exaltada e o animal se sobressalta ao menor estmulo. Observa-se a ocorrncia de anorexia, irritao ou prurido na regio de penetrao do vrus e uma ligeira elevao da temperatura. Aps um a trs dias, ficam acentuados os sintomas de excitao. O co se torna agressivo, com tendncia a morder objetos, outros animais, o homem (inclusive o seu proprietrio) e morder a si mesmo, muitas vezes provocando graves ferimentos. A salivao torna-se abundante, uma vez que o animal incapaz de deglutir sua saliva, em virtude da paralisia dos msculos da deglutio. H alte26

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

rao do seu latido, que se torna rouco ou bitonal, devido paralisia parcial das cordas vocais. Os ces infectados pelo vrus rbico tm propenso de abandonar suas casas e percorrer grandes distncias, durante a qual podem atacar outros animais, disseminando, dessa maneira, a raiva. Na fase final da doena, freqente observar convulses generalizadas, que so seguidas de incoordenao motora e paralisia do tronco e dos membros. A forma muda se caracteriza por predomnio de sintomas do tipo paralticos, sendo a fase de excitao extremamente curta ou imperceptvel. A paralisia comea pela musculatura da cabea e do pescoo; o animal apresenta dificuldade de deglutio e suspeita-se de engasgo, quando ento seu proprietrio tenta ajud-lo, expondose infeco. A seguir, vm a paralisia e a morte. 1.8.3 Gatos Na maioria das vezes, a doena do tipo furioso, com sintomatologia semelhante raiva canina. Observao: especial ateno se deve dar a outras sintomatologias que podem ocorrer quando a raiva em ces e gatos for transmitida por morcegos, fato que vem ocorrendo em algumas regies do pas. 1.8.4 Bovinos Na raiva transmitida por morcegos hematfagos (Desmodus rotundus), o perodo de incubao geralmente mais longo, com variao de 30 a 90 dias ou at mais. A sintomatologia predominante da forma paraltica. Os animais infectados se afastam do rebanho, apresentam as pupilas dilatadas e os plos eriados. possvel observar, tambm, lacrimejamento, catarro nasal e movimentos anormais das extremidades posteriores. Os acessos de fria so raros, podendo se observar, no entanto, inquietao, tremores musculares e hipersensibilidade no local da mordedura, de modo que os animais podem at provocar autodilaceraes. Com a evoluo da doena, observam-se contraes tnico-clnicas e incoordenao motora; os animais apresentam dificuldade de deglutio e param de ruminar. Os sinais de paralisia aparecem entre o segundo e terceiro dia aps o
27

Secretaria de Vigilncia em Sade

incio dos sintomas, sendo a durao da doena, geralmente, de dois a cinco dias. 1.8.5 Outros animais domsticos A sintomatologia da raiva em eqdeos, ovinos e caprinos bastante semelhante dos bovinos. Depois de um perodo de excitao com durao e intensidade variveis, apresentam sintomas paralticos, que dificultam a deglutio e provocam incoordenao das extremidades. Muitos animais apresentam alterao de comportamento e realizam a ingesto de objetos estranhos. Em sunos, a enfermidade inicia-se, geralmente, com sintomas de excitabilidade. Os animais se apresentam agressivos, semelhana do que ocorre nos ces. 1.8.6 Animais silvestres A raiva ocorre naturalmente em muitas espcies de candeos e outros mamferos. Com base em estudos epidemiolgicos, considera-se que os lobos, as raposas, os coiotes e os chacais so os mais susceptveis. Os morcegos (hematfagos ou no hematfagos), os mapaches e as mangostas apresentam um grau menor de susceptibilidade. A sintomatologia dos candeos silvestres , na maioria das vezes, do tipo furiosa, semelhante dos ces. Nos morcegos pode ocorrer uma fase de excitabilidade seguida de paralisia, principalmente das asas, o que faz que esses animais deixem de voar. Deve-se suspeitar, portanto, de morcegos (hematfagos ou no) encontrados em locais e horas no habituais e que no sejam capazes de se desviar de obstculos interpostos sua trajetria.

28

Captulo

Biossegurana

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

2.1 Classes de risco biolgico


Consideram-se agentes de risco biolgico as bactrias, os fungos, os parasitas e os vrus, entre outros. Tais agentes podem ser distribudos em quatro classes de risco, segundo alguns critrios: patogenicidade do microorganismo infectante; concentrao; volume; virulncia; formao de aerossis; modos de transmisso; disponibilidade de medidas profilticas e de tratamentos eficazes; endemicidade. Para a manipulao dos microorganismos pertencentes a cada uma das quatro classes de risco, devem ser atendidos alguns requisitos de segurana, conforme o nvel de conteno necessrio. O nvel de biossegurana 1 adequado aos laboratrios que efetuam tcnicas bsicas e envolvam agentes bem caracterizados, ou seja, que apresentam escasso risco individual e comunitrio, com pouca probabilidade de provocar enfermidades humanas ou enfermidades de importncia veterinria nos animais. O nvel de biossegurana 2 destinado ao trabalho com microorganismos que apresentam risco individual moderado e risco comunitrio limitado. Nos laboratrios so manipulados agentes patognicos que podem provocar enfermidades humanas ou enfermidades animais, mas que tm poucas probabilidades de acarretar um risco grave para o pessoal de laboratrio, a comunidade, os animais e o meio ambiente. O nvel de biossegurana 3 o que tem risco individual elevado e baixo risco comunitrio. Manipulam-se neste nvel agentes patognicos que podem provocar enfermidades humanas ou animais graves, podendo se propagar de uma pessoa infectada a outra.
31

Secretaria de Vigilncia em Sade

O nvel de biossegurana 4 aplicvel para laboratrios onde so manipulados microorganismos que apresentam elevado risco individual e comunitrio: trata-se de agentes patognicos que podem provocar enfermidades graves nas pessoas, nos animais e ainda podem se propagar facilmente de um indivduo a outro, direta ou indiretamente, sem que haja profilaxia ou tratamento.

2.2 Medidas bsicas de biossegurana


Em consonncia com a classe de risco dos microorganismos manipulados, os laboratrios devem estabelecer um programa de biossegurana que ter por finalidade aperfeioar e disciplinar os trabalhos, objetivando minimizar os riscos mediante a execuo de efetiva preveno de acidentes. De acordo com as Diretrizes Gerais para o Trabalho em Conteno com Material Biolgico do Ministrio da Sade, os Rhabdovirus, incluindo o vrus da raiva (amostras de vrus fixo), esto classificados como classe de risco 2, e os Rhabdovirus vrus da raiva (amostras de rua) esto classificados como classe de risco 3. Algumas prticas tipo padro e especiais so aplicveis aos agentes designados para o nvel de biossegurana 2: Nunca pipetar com a boca; devem ser utilizados dispositivos mecnicos. No comer, beber ou fumar na rea de trabalho do laboratrio. No armazenar alimentos nem bebidas nas reas de trabalho. No aplicar maquiagem, nem usar adereos. Usar os equipamentos de proteo individual, como aventais ou jalecos, protetores faciais, mscaras, culos de proteo, luvas, sapatilhas descartveis, entre outros. Limitar ou restringir o acesso ao laboratrio. Proibir a entrada de crianas na rea de trabalho do laboratrio. No permitir a entrada de animais que no tenham relao com os trabalhos que estejam sendo realizados.

32

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Realizar cuidadosamente todos os procedimentos, a fim de minimizar a criao de borrifos ou aerossis. Descontaminar as superfcies de trabalho com agentes desinfetantes adequados ao final do trabalho e aps qualquer vazamento ou borrifada de material vivel. Lavar as mos aps a manipulao de materiais viveis, aps a remoo das luvas e antes de sair do laboratrio. Colocar, na entrada do laboratrio, o smbolo de risco biolgico. Descontaminar os resduos produzidos antes que sejam descartados. Os materiais que devem ser descontaminados fora do prprio laboratrio devero ser colocados em recipientes prova de vazamentos e hermeticamente fechados, para que sejam transportados. Utilizar cabines de segurana biolgica, mantidas de maneira adequada, sempre que sejam realizados procedimentos com elevado potencial de criao de aerossis ou quando altas concentraes ou grandes volumes do agente infeccioso forem manipulados. Descartar os materiais perfurocortantes (tais como agulhas, lminas, lamnulas, tubos quebrados e outros materiais utilizados) em recipientes de paredes rgidas, devidamente identificados. Assegurar-se de que as sadas de emergncia se encontrem livres de obstculos. Manter extintores para diferentes tipos de fogo, com seu correspondente controle peridico, assim como ter o nmero de telefone dos bombeiros em lugar visvel. Manter a obrigatoriedade da vacinao anti-rbica preventiva para todo o pessoal de laboratrio e controlar periodicamente o ttulo de anticorpos neutralizantes.

33

Captulo

Colheita e envio das amostras para diagnstico laboratorial

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

3.1 Colheita do material


A raiva uma doena que se apresenta de forma varivel nas diferentes espcies de mamferos, razo pela qual todo animal suspeito deve ter o sistema nervoso central coletado e enviado, em condies adequadas, ao laboratrio de diagnstico, para a confirmao de uma suspeita clnica. O laboratrio de diagnstico dever receber amostras em bom estado de conservao, devidamente identificadas e com ficha de remessa de material suficientemente elucidadora. O material para diagnstico laboratorial dever ser encaminhado da seguinte maneira: A) material de animais silvestres: os animais devero ser encaminhados inteiros, de forma a permitir sua perfeita identificao; B) material de ces e gatos: dever ser encaminhado com a cabea inteira ou com o sistema nervoso central coletado; C) material de bovinos, eqdeos e outros: dever ser encaminhado com o sistema nervoso central coletado. importante, em ces e carnvoros silvestres, a realizao do diagnstico diferencial da raiva e da cinomose. Entre bovinos, a necessidade do estabelecimento de um sistema de vigilncia epidemiolgica da encefalopatia espongiforme dos bovinos (EEB) possibilita que as amostras negativas para raiva, em especial o tronco enceflico, sejam encaminhadas para os laboratrios credenciados pelo Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. semelhana do que ocorre com a espcie bovina, um diagnstico negativo para raiva em eqinos que apresentaram sintomas de encefalites, de igual forma, exige o direcionamento dessas amostras para o diagnstico diferencial da encefalomielite eqina tipos leste, oeste e venezuelana e, mais recentemente, para febre do Nilo Ocidental.

37

Secretaria de Vigilncia em Sade

3.2 Necropsia
A sala de necropsia deve ser localizada em rea de circulao restrita e, se possvel, prxima rea de acondicionamento dos resduos slidos de sade. necessrio que as carcaas ou as cabeas dos animais sejam colocadas em sacos apropriados para resduos infectantes e colocadas em cmara fria (-20oC) at o seu recolhimento para a incinerao, quando no for possvel sua descontaminao no local. O necropsista dever ser imunizado e devidamente treinado, para a perfeita coleta do sistema nervoso central ou de seus fragmentos, e dever embalar corretamente o material, para que este chegue ao laboratrio em condies de ser processado e no apresente, durante o transporte, risco s pessoas que o manipulem. 3.2.1 Materiais para necropsia: 3.2.1.1 Equipamentos de proteo individual: toucas/gorros; protetor facial; mscara; culos de proteo; batas cirrgicas; avental longo oleado, de borracha ou material similar; luvas de borracha com punho longo; botas de borracha. 3.2.1.2 Instrumentais: morsa para conteno adequada da cabea do animal; bisturi; faca de dissecao; serra de arco e lminas para substituio; cinzel;
38

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

tesouras cirrgicas de ponta reta e curva; pinas de dissecao (dente de rato); pedra de afiar. Observao: as serras eltricas so desaconselhadas, pois produzem aerossis.

3.3 Colheita da amostra


Para a adequada colheita do material para o diagnstico da raiva, a cabea do animal deve ser fixada e os passos ilustrados a seguir devem ser obedecidos. Figura 2. Fixao da cabea do animal para colheita do SNC

Fonte: Instituto Pasteur

39

Secretaria de Vigilncia em Sade

Figura 3. Corte da linha mediana da caixa craniana: ao longo da linha mdia do crnio, faz-se um corte, dos olhos at a base do crnio, que atravesse a pele e as fscias

Fonte: Instituto Pasteur

Figura 4. Dissecao dos msculos da cabea: rebatem-se os msculos e tecidos at que se exponha a calota craniana

Fonte: Instituto Pasteur

40

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Figura 5. Cortes da caixa craniana: com a serra, fazemse dois cortes, do formen occipital ao osso frontal

Fonte: Instituto Pasteur

Figura 6. Com a serra, fazem-se cortes longitudinais, rebatendo o osso com o cinzel e deixando o encfalo exposto

Fonte: Instituto Pasteur

41

Secretaria de Vigilncia em Sade

Figura 7. Com a pina de dissecao e a tesoura se extrai o encfalo inteiro

Fonte: Instituto Pasteur

Figura 8. Extrao completa do encfalo

Fonte: Instituto Pasteur

42

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

3.4 Acondicionamento e preparo da amostra para encaminhamento


A amostra deve ser encaminhada ao laboratrio em condies de refrigerao, se a previso de envio for de at 24 horas. O material deve ser colocado em um frasco com tampa de rosca, de boca larga e de capacidade maior do que o tamanho da amostra. O recipiente deve ser hermeticamente fechado, de maneira a no haver vazamento de fluidos e contaminao dos manipuladores. O frasco deve ser identificado de maneira clara e visvel e ser colocado em isopor com gelo suficiente para manter a amostra refrigerada durante o transporte. Nos casos em que a previso de envio situar-se entre 24 a 48 horas, a amostra deve ser congelada e embalada da mesma forma j relatada. Em regies onde houver dificuldades para manter as amostras congeladas ou sob refrigerao, estas devem ser colocadas em uma mistura de glicerina a 50%, com salina estril tamponada, observando-se os procedimentos j citados em relao ao vazamento e vedao do frasco. Na embalagem externa, deve constar o nome do laboratrio de destino, com seu endereo completo, bem como o rgo remetente e seu endereo. A amostra deve ser acompanhada de uma ficha de remessa com os dados epidemiolgicos. Observao: para que o resultado laboratorial permita a rpida adoo de aes de controle, as amostras coletadas de animais suspeitos devem ser rapidamente encaminhadas ao laboratrio de diagnstico.

43

Secretaria de Vigilncia em Sade

3.5 Sugesto de informaes para a ficha de remessa de amostras para o laboratrio de diagnstico de raiva
Modelo de ficha de remessa de amostras

Solicitao de exame laboratorial para diagnstico de raiva Remetente:________________________________________________________ Endereo:_________________________________________________________ Cidade:__________________________________Estado:___________________ Telefone: ( )_____________________________Ramal:___________________ Fax: ( )__________________________________________________________ E-mail:____________________________________________________________ Identificao do animal: Data da coleta:____________________________________________________ Espcie: ( ) co ( ) gato ( ) bovino ( ) eqino ( ) outra__________________ Raa:_____________________Sexo:_______ Cor:__________ Idade:_________ ( ) Morcego (espcie)___________________Hora da coleta:________________ Local da coleta:__________________________________( ) Vivo ( ) Morto Procedncia do animal:______________________________________________ Proprietrio ou responsvel:__________________________________________ Endereo: _________________________________________________________ Bairro:__________________________________Telefone: ( )________________ Cidade:_____________________________Estado:________________________ Vacinao anti-rbica: ( ) sim ( ) no n. de doses___________ H pessoas agredidas ou que tiveram contato: ( ) sim ( ) no quantas:____ Sacrificado: ( ) sim ( ) no Sinais anteriores:____________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ __________________________________ Responsvel pela solicitao Observao: por favor, preencha a ficha com letra de forma e coloque a identificao nas amostras. Endereo para o envio da amostra: Alameda Rodrigues, 416 Cerqueira Csar, So Paulo (SP) CEP: 01418-000.

44

Captulo

Diagnstico laboratorial

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Quando a amostra chegar ao laboratrio, esta deve ser registrada de acordo com os critrios do setor de recepo de cada laboratrio.

4.1 Tcnica histolgica (colorao de Sellers)


Consiste na colorao de impresses de diferentes pores do sistema nervoso central com o corante de Sellers e na pesquisa (por meio de microscopia tica comum) da presena de incluses patognomnicas da infeco rbica denominadas corpsculos de Negri, que so concentraes de protenas virais que se localizam no citoplasma da clula infectada. As impresses de fragmentos do tecido nervoso devem ser feitas levemente em uma rea de 3cm2. As mesmas pores utilizadas para a impresso devem ser reservadas para a prova biolgica (em camundongos ou clulas). Tal tcnica, quando realizada por profissional experiente, proporciona uma sensibilidade de at 90%. 4.1.1 Materiais necessrios 4.1.1.1 Equipamentos: microscpio ptico comum. 4.1.1.2 Reagentes: lcool metlico absoluto; azul de metileno; fucsina bsica; leo de imerso. 4.1.1.3 Materiais diversos: lminas de vidro para microscopia; placas de Petri; esptulas de madeira; papis de filtro;

47

Secretaria de Vigilncia em Sade

tesouras e pinas; suportes para colorao. 4.1.1.4 Corante: Soluo-me: Azul de metileno: 10g de azul de metileno + 1.000ml de lcool metlico. Fucsina bsica: 5g de fucsina bsica + 500ml de lcool metlico. Preparo do corante de Sellers: 2 partes da soluo de azul de metileno + 1 parte da soluo de fucsina bsica. Aps a mistura das duas solues, o corante deve ser envasado em frasco mbar com tampa esmerilhada. Deixe-o maturar por 48 horas. Ajustes do corante de Sellers: A) Aps a maturao, convm realizar uma colorao de prova. B) Se a impresso ficar avermelhada, devem ser adicionadas gotas da soluo de azul de metileno. C) Se os corpsculos de Negri aparecerem com uma cor castanha e as clulas com um azul muito intenso, deve-se fazer o ajuste com gotas da soluo de fucsina bsica.

48

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

4.1.2 Colorao Quando a amostra for conservada em glicerina, os decalques produzidos sero insatisfatrios, por causa das dificuldades na aderncia. Para se retirar a glicerina do tecido nervoso, necessria sua lavagem com salina, agitando-se suavemente o preparo com movimentos rotatrios. A lavagem dever ser repetida sucessivas vezes. A) Prepare lminas com impresses de fragmentos de hipocampo, cerebelo, crtex e medula (figura 9). As impresses devem ser extremamente finas e, quando houver necessidade, o excesso pode ser retirado com papel filtro. B) Submerja as lminas no corante de Sellers por aproximadamente cinco segundos (figura 10). C) Lave as lminas, rapidamente, em gua corrente e seque-as temperatura ambiente (figura 11). Figura 9. Preparo de impresses do sistema nervoso central em lminas

Fonte: Instituto Pasteur

49

Secretaria de Vigilncia em Sade

Figura 10. Imerso da lmina no corante de Sellers

Fonte: Instituto Pasteur

Figura 11. Lavagem da lmina em gua corrente

Fonte: Instituto Pasteur

50

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

4.1.3 Leitura Os corpsculos de Negri (figura 12) so encontrados principalmente no corno de Amon (hipocampo), nas clulas de Purkinje do cerebelo e na medula. Eles podem estar presentes, tambm, em um grande nmero de rgos, porm nestas estruturas geralmente apresentam pequeno tamanho. Tais incluses so acidfilas, com granulaes basfilas. O corante de Sellers demonstra os corpsculos de Negri diferenciados com colorao arroxeada e estrutura interna azul-escura no citoplasma celular, que corado em rosa. Quando o tecido cerebral est em decomposio, geralmente a impresso torna-se avermelhada ou azulada; porm, os corpsculos de Negri mantm sua colorao. A utilizao da colorao de Sellers permite a realizao de um diagnstico diferencial entre raiva e cinomose, visto que a infeco pelo vrus da cinomose determina a formao de incluses de Lentz (figura 13), que so intracitoplasmticas ou intranucleares e basfilas e possuem estrutura homognea. Ressalta-se que o vrus que causa a cinomose pertence famlia Paramyxoviridae, gnero Morbillivirus. Figura 12. Incluses de Negri no citoplasma de neurnios infectados pelo vrus da raiva e no meio extracelular

Fonte: Instituto Pasteur 51

Secretaria de Vigilncia em Sade

Figura 13. Incluses de Lentz no neurnio infectado pelo vrus da cinomose

Fonte: Instituto Pasteur

4.2 Tcnica de imunofluorescncia direta


A tcnica de imunofluorescncia direta com utilizao de anticorpos fluorescentes (imunoglobulinas anti-rbicas marcadas com isotiocianato de fluorescena = conjugado anti-rbico) se constitui em um mtodo rpido, sensvel e especfico de diagnosticar a infeco rbica em susceptveis. A prova se baseia no exame microscpico de impresses de fragmentos de tecido nervoso tratados com conjugado especfico e submetidos luz ultravioleta. O antgeno rbico, reagindo com o conjugado e iluminado com luz ultravioleta (comprimento de onda de 260 nanmetros), emite uma luz esverdeada fluorescente. A sensibilidade da imunofluorescncia depende do espcime (espcie animal e grau de autlise) e da experincia do profissional de diagnstico.

52

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

4.2.1 Materiais necessrios 4.2.1.1 Equipamentos: microscpio de imunofluorescncia; estufa bacteriolgica; centrfuga refrigerada; geladeira; freezer a -200C; balana; destilador; timer. 4.2.1.2 Reativos: conjugado anti-rbico; CVS (challenge virus standard); crebro de camundongo normal (sadio); acetona PA; glicerina PA; cloreto de sdio (NaCL); fosfato de potssio monobsico (KH2PO4); fosfato de potssio dibsico (K2HPO4); penicilina e estreptomicina ou gentamicina; soro normal de coelho ou de eqino no imunizados contra a raiva. 4.2.1.3 Materiais diversos: pinas pequenas; tesouras pequenas; lminas de vidro com extremidades foscas;
53

Secretaria de Vigilncia em Sade

lamnulas; pipetas diversas; tubos diversos; estantes para tubos; papel de filtro; esptulas de madeira; cmara mida; coplin (suporte para lminas). 4.2.1.4 Procedimentos: Identifique as lminas. Corte fragmentos das diferentes pores do sistema nervoso central (SNC). Toque ligeiramente o fragmento na lmina, fazendo dois espaos de aproximadamente 1,5cm2 cada, com impresses na mesma lmina. Observaes: A) Para ces e gatos, recomenda-se fazer impresses do corno de Amon (hipocampo). Para herbvoros e animais silvestres, utilize fragmentos da medula, do cerebelo e do corno de Amon para as impresses. B) Utilize os fragmentos para o preparo do inculo destinado prova biolgica. Deixe secar a lmina por aproximadamente 15 a 30 minutos. Fixe a lmina, no mnimo durante 30 minutos, em acetona a -20C contida em coplin (este e a acetona devem ser mantidos permanentemente em congelador). Retire a lmina da acetona e deixe-a escorrer e secar.

54

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Aps a secagem, caso no utilize as lminas prprias para IF, faa um crculo em torno das impresses com esmalte, para reter o conjugado. Cubra a impresso mais prxima da identificao com a diluio A (crebro de camundongo normal + conjugado previamente titulado) e a impresso mais distante com a diluio B (CVS + conjugado previamente titulado). Incube as lminas por 30 minutos a 37C em cmara mida. Enxge as lminas com soluo salina tamponada (pH entre 7,2 a 7,5), deixando-as por duas vezes submersas em salina durante dez minutos. Enxge as lminas com gua destilada, para evitar a formao de cristais durante a secagem. Seque as lminas. Adicione uma gota de glicerina tamponada (pH em 8,5). Coloque lamnulas nas duas impresses, A e B. Este mesmo procedimento deve ser feito com as lminas de controle (material positivo e negativo para raiva). O material utilizado para controle positivo deve ser o crebro de camundongos infectados com material de rua ou a prpria amostra original positiva. 4.2.2 Leitura das lminas Nas lminas com a presena do antgeno podero ser observadas estruturas de cor verde-ma dotadas de brilho intenso. Os tamanhos destas incluses podem ser variados: algumas so pequenas (chamadas de areia ou poeira antignica) e outras apresentam o tamanho comparvel ao dos corpsculos de Negri. Observao: no devero ser observadas incluses fluorescentes nas impresses com a diluio B (CVS + conjugado). Tal procedimento importante para determinar a especificidade do teste e evitar o falso-positivo.

55

Secretaria de Vigilncia em Sade

4.2.3 Preparo do CVS (Challenge Virus Standard) Prepare uma diluio que contenha 1.000 DL50/mL do vrussemente. Inocule 0,03mL, via intracerebral, em camundongos de 21 dias com peso de 11 a 14 gramas. Colete o sistema nervoso central dos camundongos quando a maioria deles estiver em fase final de paralisia (de cinco a seis dias). Prepare uma suspenso a 20% com o diluente de vrus. Centrifugue o preparo, em condies de refrigerao, a 2.500g durante dez minutos. Coloque alquotas em frascos apropriados, de acordo com a rotina laboratorial. Mantenha o preparo em condies de congelamento, de preferncia a -70oC. Observao: o ttulo do CVS produzido no dever ser inferior a 105,0 DL50 / 0,03mL, lembrando-se que o ttulo de um 105,0 DL50/0,03mL significa que nesta diluio (1:100.000) temos 1DL50. 4.2.4 Titulao do CVS (trabalho) Todo lote de CVS trabalho produzido dever ser titulado, para que se verifique a viabilidade do produto. Exemplo: A partir da suspenso 1:5 (20%) do lote de CVS trabalho produzido, faa uma diluio 1:2 e depois diluies suces sivas de 1:10. Inocule dez camundongos por diluio (de 11 a 14 gramas ou recm-nascidos) a partir da diluio 10-5,0 a 10-8,0. Observe os animais inoculados por 15 dias, anotando o nmero de animais mortos.

56

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Calcule o ttulo do vrus por meio do mtodo de Reed & Mench. 4.2.5 Preparo do CCN (crebros de camundongos normais) Colete o sistema nervoso central de camundongos sadios. Prepare uma suspenso a 20% com o diluente de vrus. Centrifugue o preparo, em condies de refrigerao, a 2.500g, durante dez minutos. Coloque alquotas em frascos apropriados, de acordo com a rotina laboratorial. Mantenha o preparo em condies de congelamento, de preferncia a -70oC. 4.2.6 Titulao do conjugado anti-rbico Dilua o conjugado, conforme o recomendado pelo laboratrio produtor. Prepare lminas com material positivo com as identificaes das diluies que devem ser testadas. Prepare separadamente diluies duplas do conjugado com CVS e CCN. Deixe o preparo reagir, temperatura ambiente, por aproximadamente 15 minutos. Core as lminas, conforme descrito na tcnica de imunofluorescncia direta. Para melhor avaliao, utilize em cada diluio uma lmina preparada com material negativo, alm das positivas. Quando o ttulo do conjugado anti-rbico, sugerido pelo laboratrio produtor, for maior ou igual a 1:100, sugere-se que seja realizada uma diluio inicial de 1:10 com soluo salina tamponada para iniciar a titulao (tal diluio poder ser aproveitada depois de estabelecido o ttulo ideal).

57

Secretaria de Vigilncia em Sade

Sugestes de diluies para titulao: 1.) Inicie a diluio em 1:2 (conjugado anti-rbico 1:10 e CN/ CVS) e continue com diluies seriadas em 1:2.
1:2 1:2

1:2

Conjugado 1:10 + CN Conjugado 1:10 + CVS Diluies

100l + 100l
1:2

100l + 100l
1:2

100l + 100l
1:2

100l + 100l

100l + 100l 20

100l + 100l 40

100l + 100l 80

100l + 100l 160

2.) Inicie a diluio em 1:3 (conjugado anti-rbico 1:10 e CN/ CVS) e continue com diluies seriadas em 1:2.
1:2 1:2

1:2

Conjugado 1:10 + CN Conjugado 1:10 + CVS Diluies

100l + 200l
1:2

100l + 100l
1:2

100l + 100l
1:2

100l + 100l 100l + 100l 240

100l + 200l 30

100l + 100l 60

100l + 100l 120

3.) Inicie a diluio em 1:5 (conjugado anti-rbico 1:10 e CN/ CVS) e continue com diluies seriadas em 1:2.
1:2 1:2

Conjugado 1:10 + CN Conjugado 1:10 + CVS Diluies

50l + 100l
1:2

100l + 100l
1:2

100l + 100l

50l + 100l 50

100l + 100l 100

100l + 100l 200

58

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

4.2.7 Avaliao do conjugado Observe as lminas microscopia de fluorescncia. Determine a diluio ideal, observando a presena de incluses, sua intensidade de colorao e a inexistncia de colorao inespecfica (no campo com CCN + conjugado) e a total ausncia de incluses (no campo com CVS + conjugado). A diluio determinada ser o ttulo de uso do conjugado. Mantenha o estoque do conjugado anti-rbico acondicionado de acordo com as recomendaes do laboratrio produtor. Figura 14. Lmina com impresso de corno de Amon de animal infectado pelo vrus da raiva corado com conjugado anti-rbico fluorescente

Fonte: Instituto Pasteur

59

Secretaria de Vigilncia em Sade

Figura 15. Lmina com impresso de cerebelo de animal infectado com o vrus da raiva corado com conjugado anti-rbico fluorescente

Fonte: Instituto Pasteur

4.3 Prova para isolamento do vrus rbico em camundongos (prova biolgica)


Os animais de laboratrio tm sido utilizados ao longo dos anos nos estudos de anatomia, fisiologia, imunologia, virologia e outros, procedimento que tem permitido importantes avanos no desenvolvimento da cincia e da tecnologia. A definio mais simplificada de um biotrio a de uma instalao que atenda s exigncias do bemestar e da sade dos animais que sero criados ou mantidos. Tais exigncias, alm do aspecto fsico, se devem aos procedimentos e ao manejo dos animais. Atualmente, os animais utilizados em experimentos ou para fins de diagnstico devem atender a parmetros de qualidade gentica e sanitria, uma vez que podem ser considerados reagentes biolgicos e, como tal, os resultados dos experimentos so afetados em razo da qualidade de cada espcie animal utilizada. Existe em mbito mundial toda uma legislao especfica para o uso de animais em experimentao. Entretanto, o Brasil no possui uma legislao que efetivamente regule a criao e o uso de animais
60

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

para a pesquisa e o ensino em mbito nacional.Apesar disso, na conduta de cada indivduo que trabalha com animais que deve haver a conscientizao de minimizar a utilizao, a dor, o sofrimento e o estresse dos animais. O animal de eleio para o isolamento o camundongo albino suo, por ser um dos mais sensveis ao vrus rbico. O animal utilizado deve ser de boa procedncia e apresentar bom estado sanitrio, com idade e peso adequados. 4.3.1 Materiais necessrios 4.3.1.1 Equipamentos: cabine de segurana biolgica; centrfuga refrigerada com caapas de segurana; geladeira; freezer (-20oC); balana; destilador ou sistema de purificao de gua; timer. 4.3.1.2 Reativos: gua destilada; cloreto de sdio (NaCl); fosfato de potssio monobsico (KH2PO4); fosfato de potssio dibsico (K2HPO4); penicilina e estreptomicina ou gentamicina;  soro normal de coelho ou de eqino, no imunizados contra a raiva, ou soro fetal bovino. 4.3.1.3 Materiais diversos: gral e pistilo; tubos para centrfuga;

61

Secretaria de Vigilncia em Sade

suportes para tubos; tesouras e pinas cirrgicas;  micropipetas e ponteiras para volumes de 200 a 5000uL; gaiolas para manuteno de camundongos; bebedouros para camundongos; rao peletizada, prpria para camundongos; maravalha. 4.3.2 Procedimentos Preparo da suspenso a 20% para inoculao Pese 1 grama dos diferentes fragmentos do SNC, macere-o em gral estril e adicione ao preparo 4mL de diluente de vrus. Centrifugue o preparo de 2.000 a 3.000g durante 15 minutos. Retire o sobrenadante. Mantenha o preparo em refrigerao (de 2 a 8C) para inocullo em camundongos, no mesmo dia, por via intracerebral (IC). 4.3.3 Inoculao em camundongos Realize as inoculaes IC em camundongos lactentes de at 5 dias (0,01mL por animal) ou em camundongos de 21 dias de idade com 11 a 14 gramas de peso (0,03mL por animal). Prepare fichas de identificao e de leitura das amostras que devem ser inoculadas. Inocule de 8 a 10 camundongos por amostra. Realize a leitura dos camundongos inoculados diariamente por 21 dias, no caso de amostras de ces e gatos, e no mnimo 30 dias, no caso de amostras de herbvoros e animais silvestres.

62

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Anote, nas fichas de leitura, a relao dos animais mortos, doentes e sacrificados. Colete todos os animais mortos a partir do quinto dia da inoculao e os submeta prova de IFD. Para a inoculao, devero ser utilizadas, preferencialmente, seringas descartveis de 1mL que permitam a dosagem de 0,03mL e agulhas de calibre 13x4,5, no mximo. Ao final da prova, os animais devero ser sacrificados com a utilizao de equipamentos adequados eutansia de animais ou mediante a inalao de ter etlico ou clorofrmio, observando-se as boas prticas laboratoriais. Observao: 1. As amostras originais recebidas para o diagnstico laboratorial devero ser guardadas em congelador (freezer) at o trmino das provas. 2. Os animais inoculados devem ser mantidos em observao em rea ou local prprio (biotrio de experimentao ou infectrio) separado das demais dependncias do laboratrio. No devem ser mantidos na rea de criao animal. Inicialmente, em 1975, as clulas BHK-21 foram utilizadas em muitos laboratrios na rotina de diagnstico, porm no apresentaram a mesma sensibilidade dos camundongos para a prova de isolamento do vrus da raiva. As clulas de neuroblastoma, identificadas na American Type Culture Collection (ATCC) como CCL 131, so utilizadas, atualmente, em muitos pases para o diagnstico da raiva. Tal linhagem celular sensvel ao vrus de rua, sem nenhum grau de adaptao. A replicao do vrus da raiva nestas clulas revelada pela tcnica de anticorpos fluorescentes. O resultado do teste pode ser obtido a partir de 18 horas de incubao da mistura clulas + vrus (um ciclo de replicao do vrus nas clulas); porm, a leitura realizada, geralmente, aps 48 horas. Este teste to sensvel como a inoculao em camundongos e, uma vez existindo a unidade de cultivo celular no laboratrio, um teste mais econmico do que o realizado em camundongos, pois fornece resultados com maior rapidez.

63

Secretaria de Vigilncia em Sade

Figura 16. Camundongo inoculado com amostra positiva para raiva apresentando aerofobia

Fonte: Instituto Pasteur

Figura 17. Camundongo inoculado com amostra positiva para a raiva apresentando paralisia

Fonte: Instituto Pasteur

64

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

4.4  Prova para Isolamento do Vrus Rbico em Cultivo Celular


Utilizado no diagnstico laboratorial da raiva como um segundo teste para confirmao dos resultados obtidos pela tcnica de imunofluorescncia direta, em casos de suspeita de raiva em animais, a tcnica de isolamento e identificao viral com utilizao de clulas de neuroblastoma de camundongo (N2A) e anticorpos fluorescentes (imunoglobulinas anti-rbicas marcadas com isotiocianato de fluorescena = conjugado anti-rbico) um mtodo mais rpido, simples e de custo menos elevado de isolamento do vrus da raiva. A tcnica se baseia na inoculao de suspenses de sistema nervoso central (SNC) em placas utilizando clulas, seguida pelo exame microscpico da clula tratada com conjugado especfico e submetida luz ultravioleta. O antgeno rbico, reagindo com o conjugado e iluminado com luz ultra (comprimento de onda de 260 nanmetros), emite uma luz esverdeada fluorescente. A sensibilidade da tcnica depende do uso de clula com boa morfologia, da experincia do profissional na realizao da tcnica e, principalmente, da leitura das placas. 4.4.1 Materiais necessrios 4.4.1.1 Equipamentos: cabine de segurana biolgica classe A, II tipo; incubadora de CO2 a 37C; microscpio de fluorescncia invertido; microscpio tico invertido; pipetador automtico para pipetas de vidro; bomba de vcuo; banho maria para 56C; geladeira; freezer a -20C;

65

Secretaria de Vigilncia em Sade

agitador magntico; sistema de purificao de gua (Milli-Q); balana analtica. 4.4.1.2 Reativos: gua destilada; tripsina a 0,2% e versene a 0,02% (ATV); aminocidos no essenciais; antibitico (sulfato de gentamicina); dimethiyl sulfoxide (DMSO); conjugado anti-rbico; acetona a 80%; glicerina tamponada; reagente para preparo da soluo salina tamponada; dihidrogenofosfato de sdio (NaH2PO4.H2O);  di-sdio hidrognio fosfato dodecahidrato (Na2HPO4.12H20); cloreto de sdio (NaCl). 4.4.1.3 Materiais diversos: garrafas de plstico; microplacas de 96 wells; micropipetadores multicanais (8) de 20-200l; pipetas de vidro ponteiras; tubos de 1,5mL para alicotar aminocidos e gentamicina;  tubos cnicos de plstico de 50mL para alicotar soro fetal bovino e ATV; becker.

66

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

4.4.2 Procedimentos Preparo das suspenses do SNC Prepare uma suspenso de tecido cerebral a 20% - 0,6g de tecido + 2,4mL de diluente (1ml de gentamicina e 20ml de soro fetal bovino, completando o preparo com quantidade suficiente para 1000ml de soluo fisiolgica a 0,85%). Deixe o antibitico agir por 1 hora. Centrifugue o preparo por 30 minutos em 3000rpm (1400g) a 4C. Separe o sobrenadante como suspenso para a inoculao em clula. Preparo da suspenso celular Clulas N2A mantidas no laboratrio so resuspensas em 10mL de meio (5x105 clulas/mL) contendo 10% de soro fetal bovino, 30L de antibitico (gentamicina) acrescido de 30L de aminocido. Preparo da placa Em cada 3 orifcios da placa, inocule 1 suspenso de amostra de quirptero, adicionando 40L por orifcio (para a suspenso ficar na concentrao de 4%). Juntamente com as amostras de rotina, tambm sero aplicados na placa um controle positivo (amostra fixa CVS) e controles negativos (somente clula e outro com crebro normal de camundongo CN). Em seguida, adicione 160L de meio de cultura contendo 30L de antibitico [3X] e 30L de aminocido para cada 10ml de meio preparado. Deve-se homogeneizar o material adicionado na placa. Em cada orifcio da placa, adicione 100L da suspenso celular (com meio preparado igual etapa citada), na qual a clula mantida com repiques sucessivos no laboratrio. Incube a placa a 37C em cmara mida com CO2 a 5% por 96 horas.
67

Secretaria de Vigilncia em Sade

Aps esse tempo, remova o material da placa utilizando uma bomba de suco. Fixe as clulas em acetona gelada a 80% (200uL por orifcio) e incube o preparo por 15 minutos em banho de gelo (a acetona deve ser mantida permanentemente em congelador). Despreze a acetona. Seque os orifcios da placa. Acrescente 40L do conjugado anti-rbico (previamente titulado) por orifcio e incube o preparo a 37C por 60 minutos. Despreze o conjugado. Enxge a placa por submerso, 3 vezes, em soluo salina tamponada pH 7,4. Enxge a placa por submerso, 3 vezes, em gua destilada. Seque a placa. Adicione 50L de glicerina tamponada (pH 8,5) em cada orifcio. Leitura das placas Examine as placas em microscpio invertido de luz ultravioleta. Nos orifcios com presena de antgeno podero ser observadas estruturas de cor verde-ma, dotadas de brilho intenso. O tamanho das incluses pode ser variado: algumas so pequenas, chamadas de areia ou poeira antignica, e outras apresentam o tamanho comparvel ao dos corpsculos de Negri. Observaes No devero ser observadas incluses fluorescentes nos orifcios contendo os controles negativos (CN e somente clula); este procedimento importante para determinar a especificidade do teste e evitar o falso positivo. No controle positivo (CVS), devero

68

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

ser observadas incluses fluorescentes, sendo este procedimento importante para determinar tambm a especificidade do teste e evitar falso negativo. Todo o procedimento de repique celular e inoculao das suspenses em clula deve ser realizado dentro de cabine de segurana biolgica classe A II, exclusiva para cada um desses procedimentos. Todos os materiais utilizados devem ser estreis. 4.5 Tipificao antignica pela tcnica de imunofluorescncia indireta com anticorpos monoclonais Os centros colaboradores da OMS, da Opas e de instituies privadas disponibilizam, para a tipificao antignica, vrios painis de anticorpos monoclonais. Cada um dos painis tem poder de resoluo diferente e, em funo disso, h a necessidade de adoo de um nico painel para uma regio. O Centro Pan-Americano de Zoonoses (Cepanzo)/Opas e o Centers of Disease Control and Prevention (CDC), em Atlanta (EUA), realizaram estudos com amostras virais isoladas nos diferentes pases das Amricas durante o perodo de 1987 a 1992. Com tais dados, os referidos rgos selecionaram um painel reduzido, composto de oito anticorpos monoclonais, que permite detectar as cepas mais comuns de raiva da Amrica Latina. Todos os anticorpos monoclonais foram preparados pela imunizao de camundongos com amostras vacinais ERA/SAD e devem ser titulados com esses vrus ou com vrus CVS. Para os laboratrios de diagnstico encaminhado 1mL da diluio 1:10 de cada um dos oito anticorpos monoclonais, sendo que o ttulo de trabalho dos anticorpos , aproximadamente, 1:1000. Cada um deles deve ser diludo a 1:100 em emem, com 10% de soro fetal bovino, 25mm de tampo hepes e 1mm de azida sdica. Essas diluies so estveis por um ano a 4oC. A partir dessa soluo estoque, devem ser testadas diluies seriadas de cada um dos anticorpos monoclonais (por exemplo: 1:500; 1:1000; 1:1500) para determinar, de acordo com cada laboratrio, a diluio de trabalho. Esta diluio ideal de trabalho ser estabelecida
69

Secretaria de Vigilncia em Sade

como a diluio na qual a intensidade de brilho seja de 3+ a 4+ para cada anticorpo monoclonal. As lminas preparadas para o estudo das amostras devem ser providenciadas a partir do cultivo de clulas de neuroblastoma murino ou de decalques a partir de crebros de camundongos infectados com a amostra em teste. Decalques em lminas de amostras originais de SNC podero ser utilizados desde que apresentem distribuio de antgeno rbico em 75% a 100% dos campos pesquisados por meio da IFD. Ressaltase que alguns anticorpos monoclonais podem produzir resultados variveis em decalques preparados com amostras originais de SNC. 4.5.1 Materiais necessrios 4.5.1.1 Equipamentos: microscpio de imunofluorescncia; estufa bacteriolgica; geladeira; freezer (a -200C); timer. 4.5.1.2 Reativos: painel de oito anticorpos monoclonais (Mcl); conjugado anti-camundongo; acetona PA; glicerina PA; cloreto de sdio (NaCL); fosfato de potssio monobsico (KH2PO4); fosfato de potssio dibsico (K2HPO4); meio de cultura (MEM).
70

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

4.5.1.3 Materiais diversos: pinas pequenas; tesouras pequenas; lminas de vidro marcadas com extremidades foscas; lamnulas; pipetas diversas; estantes para tubos; papel de filtro; cmara mida; coplin (suporte para lminas). 4.5.1.4 Procedimentos: Prepare quatro lminas com dois campos de leitura ou oito lminas com um s campo. Mantenha-as temperatura ambiente por 30 minutos. Fixe as lminas em acetona PA a -20oC por quatro horas ou durante toda a noite (recomenda-se a utilizao de lminas j demarcadas para IF). Retire-as da acetona e deixe-as secar por 15 minutos. 1. etapa Coloque 15l da diluio de trabalho de cada um dos oito anticorpos monoclonais em cada decalque. Identifique as lminas com o nmero de cada anticorpo monoclonal (1, 4, 9, 10, 12, 15, 18 e 19). Incube as lminas a 37oC, por 30 minutos, em cmara mida. Retire-as da estufa e lave cada lmina utilizando pisseta com PBS 0,01M, pH 7,6. Esta fase deve ser realizada com o m71

Secretaria de Vigilncia em Sade

ximo cuidado, para que no haja transferncia de um anticorpo monoclonal de um decalque para outro, quando se utilizar dois ou mais por lmina. Lave cada decalque duas vezes. Deixe as lminas submersas em PBS (0,01M, pH 7,6) por dez minutos. Seque-as para a prxima etapa. 2. etapa Coloque em cada decalque cerca de 25 a 30l de conjugado anti-camundongo diludo de acordo com ttulo j estabelecido pelo laboratrio. Incube os decalques a 37oC por 30 minutos. Retire e lave os decalques conforme o procedimento anterior. Retire as lminas do PBS e passe-as em gua destilada. Seque e monte as lminas com glicerina tamponada (pH 8,5) e lamnulas. Realize sua leitura em microscpio de IF, estabelendo os padres de acordo com o quadro apresentado a seguir (MATTOS, C.; MATTOS, C., 1998).

72

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Padres de reao das diferentes variantes antignicas com os anticorpos monoclonais


Anticorpos monoclonais CVS/ERA SAD/ Past Perro/mangosta Perro Vampiro Tadarida brasiliensis Vampiro Lasiurus cinereus Zorro de Arizona Zorrillo centro/sur? Tadarida Br. mex. Baja SC zorrillo Vampiro C1 + + + v + + + C4 + + + + + + + + + + + + C9 C10 C12 C15 C18 C19 AgV + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + v + + + + + + + + + v + + + + Lab. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Fonte: Mattos, C.; Mattos, C. (1998).

73

Captulo

Soroneutralizao

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

A neutralizao viral definida como a perda da capacidade infectante da partcula viral pela reao com um anticorpo especfico. O soro de animais que se recuperam de uma infeco viral geralmente contm imunoglobulinas, que so capazes de diminuir ou inibir a capacidade infecciosa do agente causal. Esses anticorpos neutralizantes so altamente especficos e responsveis pelo efeito protetor do soro imune e esto dirigidos contra determinantes antignicos da superfcie do vrus, que intervm no processo de adsoro clula. Pode-se concluir que a soroneutralizao a tcnica mais sensvel e especfica para a caracterizao viral por mtodos sorolgicos. O princpio bsico consiste em misturar diluies apropriadas de soro e vrus, incub-los sob determinadas condies e inocular a mistura em um sistema sensvel (ovos embrionados, animais de laboratrio ou cultivos celulares). O vrus no neutralizado pode produzir um efeito como morte, leso especfica (pocks) em ovos embrionados, efeito citoptico, etc. As condies de incubao como o tempo, a temperatura, o pH, a presena de complemento podem interferir no processo de neutralizao. O teste de neutralizao freqentemente usado para: identificao de cepas isoladas mediante a utilizao de antisoros especficos fornecidos por rgos de referncia; diagnstico de infeces virais mediante a demonstrao do aumento de ttulo de anticorpos especficos na evoluo de uma doena (sorologia pareada); determinao do nvel de proteo individual ou populacional. H dois mtodos para se realizar uma prova de soroneutralizao.

Mtodo : vrus constante/soro diludo:


Este mtodo apresenta a vantagem de requerer pequena quantidade de soro. bastante til para demonstrar diferentes nveis de anticorpos neutralizantes em soros coletados na fase aguda da doena e durante o perodo de convalescena.
77

Secretaria de Vigilncia em Sade

Para a padronizao deste teste, necessrio determinar o ttulo infeccioso do antgeno viral no sistema no qual se realizar o teste. O ttulo ser determinado pela utilizao da frmula de Reed & Mench. DP = % infectado > 50% 50% x % infectado > 50% % infectado < 50% Onde: DP FD = = distncia proporcional; fator de diluio. FD

Aps a determinao do ttulo infeccioso, dever ser calculada a diluio que possui o nmero fixo de DL50 ou DICT50. Geralmente so utilizados testes que usam 100 DL50 ou 100 DICT50. Neste mtodo, portanto, adiciona-se uma quantidade fixa de vrus (medida por titulaes anteriores) a diluies variveis de um soro-problema e inoculam-se sistemas sensveis. A mais alta diluio do soro que protege o sistema sensvel da infeco denominada ttulo soroneutralizante.

Mtodo : soro constante/vrus diludo:


Diferentes concentraes (diluies) de vrus so misturadas a uma concentrao fixa de soro que, aps a incubao, so inoculadas em sistemas sensveis. O ndice de soroneutralizao (IN) a diferena entre o ttulo do vrus na presena de soro-controle negativo e o ttulo do vrus na presena do soro-problema. O teste de soroneutralizao pode ser utilizado, tambm, para identificao de cepas isoladas, desde que sejam realizadas provas com anti-soros de referncia. O vrus em estudo, usado na diluio que contm 100 DICT50, deve ser misturado a quatro unidades neutralizantes dos soros de referncia. Estas misturas, por sua vez, devem ser inoculadas (aps a incubao) em um sistema adequado. A sobrevivncia deste sistema implica a proteo e, conseqentemente, a identidade com o respectivo soro de referncia. A atividade neutralizante de um soro
78

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

tambm pode ser determinada pelo teste de reduo de placas, com certos vrus que produzem um rpido efeito citoptico. importante lembrar que qualquer teste de neutralizao s poder ser considerado se todos os controles de prova forem executados. Assim, por exemplo, no teste de soroneutralizao em clulas, que o mais utilizado, dever haver soro positivo e soro negativo, controle de clulas e controle de diluio de vrus.

5.1 Avaliao sorolgica para raiva


A determinao dos anticorpos neutralizantes (AcN) deve ser realizada em amostras de soros coletados dez dias aps a ltima dose de vacina (ou a qualquer momento) de indivduos previamente imunizados e expostos ao risco de contrair a raiva. Todos os indivduos pertencentes aos grupos de risco que freqentemente esto em contato com o vrus rbico devem ser avaliados a cada seis meses. De igual forma, uma dose de reforo vacinal deve ser administrada sempre que o ttulo de anticorpos estiver abaixo de 0,5UI/mL. A Organizao Mundial da Sade considera que um ttulo igual ou superior a 0,5UI/mL representa um estado imunitrio suficiente para proteger indivduos expostos ao risco de contaminao pelo vrus rbico. Ressalta-se, no entanto, que os anticorpos no so elementos exclusivos de proteo (resposta imune humoral), visto que agem simultaneamente na presena da imunidade celular. Um ttulo elevado de anticorpos significa proteo, porm um ttulo baixo no significa que o indivduo esteja necessariamente desprotegido, tendo em vista a atuao da imunidade celular. O primeiro teste para titulao de anticorpos foi desenvolvido por Webster & Dawson, em 1935, sendo realizado em camundongos e considerado um bom parmetro para avaliao de imunidade antirbica. Face necessidade de um grande nmero de animais, ao alto custo e demora na obteno dos resultados (15 dias), vrios outros mtodos foram desenvolvidos, tais como: a reao de imunofluorescncia indireta (Rifi) e contraimunoeletroforese (Ciep), bem como o teste rpido de inibio de focos fluorescentes (RFFIT). Por meio de testes comparativos, verificou-se que o RFFIT possui uma boa correlao com a prova de soroneutralizao em ca79

Secretaria de Vigilncia em Sade

mundongos, possuindo a vantagem de ser mais rpido e apresentar maior reprodutibilidade. Mais recentemente, o Instituto Pasteur de So Paulo desenvolveu um teste simplificado de inibio de focos fluorescentes (SFIMT), que vem sendo utilizado rotineiramente na avaliao de anticorpos de humanos vacinados contra a raiva. 5.1.1 Colheita do soro Deve-se coletar uma amostra de sangue de, no mnimo, 5mL. Preferencialmente, deve-se enviar o soro j separado (no mnimo 2mL), sendo que ele deve permanecer em condies de refrigerao at o seu encaminhamento ao laboratrio, em frasco hermeticamente fechado. O sangue total pode ser encaminhado temperatura ambiente, tambm em frasco hermeticamente fechado, o mais rapidamente possvel (no mximo em 24 horas), evitando-se a hemlise, que apresenta toxicidade para as clulas. Os frascos contendo soro ou sangue devem ser perfeitamente identificados com o nome completo do paciente.

5.2 Soroneutralizao em cultura de clulas


O mtodo descrito a seguir o teste simplificado de inibio de focos fluorescentes (SFIMT), utilizado no Instituto Pasteur. 5.2.1 Materiais necessrios 5.2.1.1 Equipamentos: microscpio ptico invertido; microscpio de imunofluorescncia invertido; centrfuga; estufa de CO2; cabine de segurana biolgica;

80

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

continer de nitrognio lquido; banho-maria a 56C. 5.2.1.2 Materiais diversos: frascos para cultura celular (corning ou similar); microplacas para cultura celular de 96 orifcios (corning ou similar); pipetas multicanal. 5.2.1.3 Reativos: vrus PV; conjugado anti-rbico; clulas BHK 21 clone 13; soro hiperimune padro; meio essencial mnimo de Eagle (MEM); soluo de tripsina a 0,05% de EDTA; acetona a 80% em H2O destilada; tampo de carbonato/bicarbonato (0,05M, pH 8,5); salina fosfato tamponada (pH 7,3); glicerina tamponada (pH 8,5); soro fetal bovino. 5.2.2 Procedimentos Inative o soro a 56C , em banho-maria, durante 30 minutos. Faa duas sries de quatro diluies (razo 2) do soro hiperimune padro (por exemplo: 200UI/mL) com diluies iniciais de 1:2000 e 1:3000, respectivamente, em volumes de 100L.

81

Secretaria de Vigilncia em Sade

Faa seis diluies dos soros que devem ser testados (razo 2), a partir da diluio de 1:5, em volumes de 100L. Adicione 50L de vrus em diluio pr-determinada suficiente para infectar, no mnimo, 80% das clulas. Incube o preparo a 37C, durante uma hora, em atmosfera contendo 5% de CO2. Adicione 50L de suspenso de clulas BHK-21 (10.000 clulas/poo). Faa uma diluio de vrus (razo 2) de 1:1 a 1:8 a partir da diluio utilizada na placa. Incube as placas a 37C, com 5% de CO2, durante 24 horas. 5.2.3 Colorao com conjugado fluorescente Retire o meio de cultura da placa por aspirao cuidadosa com bomba de vcuo ou seringa. Adicione 300L de acetona gelada (80% em H2O) em cada orifcio da placa e fixe as clulas durante 15 minutos em banho de gelo. Despreze a acetona (por inverso da placa) e a seque em estufa (37C). Adicione ao preparo 40L de conjugado anti-rbico em diluio tima estabelecida previamente (em PBS). Incube o preparo por 1 hora, a 37C, em cmara mida. Lave as placas (trs vezes) por imerso em PBS durante cinco minutos e, em seguida, trs vezes em gua destilada, por imerso. Aps a secagem das placas, adicione ao preparo 40L de glicerina tamponada (pH 8,5). 5.2.4 Leitura As placas so lidas em microscpio de fluorescncia sem charriot (com objetiva de 10x) ou diretamente em microscpio de fluorescncia invertido.

82

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Os resultados correspondem diluio onde ocorrer decrscimo de 50% de infeco. Com treinamento adequado, leituras intermedirias podem ser feitas com bastante segurana. Por meio de uma regra de trs, comparam-se os resultados obtidos com o soro-padro e o soro-teste, para verificao do resultado do soro, expresso em unidades internacionais (UI/mL). Exemplo: Um soro que tenha ttulo por diluio de 1:40, em uma prova na qual o soro-padro ofereceu resultado 1:16.000, tem ttulo de 0,50 UI/mL, calculado da seguinte maneira: 16.000 __________________ 200UI/mL 40 __________________ X X = 0,50 UI/mL

5.3 Soroneutralizao em camundongos


Como j foi dito, o teste de soroneutralizao em camundongos uma tcnica altamente sensvel e especfica para dosagem de anticorpos rbicos neutralizantes. Como toda prova biolgica apresenta os inconvenientes prprios desta tcnica, os camundongos devem estar dentro das especificaes de peso, idade e condies sanitrias. Alm disso, seu principal fator limitante o tempo necessrio obteno do resultado (15 dias). O vrus CVS deve ser conservado em freezer (-70oC), em nitrognio lquido ou liofilizado, para evitar variaes no ttulo e nas DL50 utilizadas. Embora a tcnica de soroneutralizao seja padronizada para 32 DL50, aceitvel uma variao de 20 a 70 DL50. 5.3.1 Diluio do soro a ser testado e do soro-padro Inative o soro a 56C durante 30 minutos. Faa uma diluio seriada do soro na base 5, iniciando com 1:2,5 at 1:312,5.

83

Secretaria de Vigilncia em Sade

Exemplo: Distribua o diluente em tubos de 12 x 75mm, colocando 150L no primeiro tubo e 200L nos demais. Coloque 100L do soro no primeiro tubo, homogeneize o preparo e transfira 50L para o segundo tubo e assim sucessivamente, desprezando 50L do ltimo tubo. Dilua o soro-padro, seriadamente, na base 2, iniciando com a diluio 1:1.000 at 1:32.000, deixando um volume final, em cada tubo, igual ao da diluio dos soros. 5.3.2 Diluio do vrus desafio Dilua o CVS (base), de ttulo conhecido, iniciando com a diluio 10-1,7 (1:50). As diluies 10-1,7 e 10-2,7 sero desprezadas e as diluies 103,7 at 10-7,7 sero usadas como controle, objetivando conferir se as DL50 obtidas correspondem s DL50 teoricamente esperadas a partir da titulao prvia. Prepare uma diluio do vrus que contenha 64 DL50 tericas em 0,03mL, como exemplificado. Supondo-se que o vrus utilizado tenha um ttulo de 107,1/0,03 mL, deve-se proceder ao seguinte clculo para se obter uma diluio com 64 DL50 (10-5,3), porque o log de 64 aproximadamente 1,8. Exemplo: 107,1 101,8 = 105,3 = 1:200.000. Portanto, a diluio do vrus 105,3 possui 64 DL50, sendo esta diluio igual 1:200.000. Observao: a quantidade a ser utilizada deve ser suficiente para acrescentar 200L (0,2mL) em todos os tubos do soro a ser testado e no soro-padro. Dessa forma, as DL50 sero diludas metade (32 DL50) e as diluies do soro sero dobradas (1:5; 1:25; 1:125 e 1:625). Incube o preparo em banho-maria a 37oC durante 90 minutos. Deixe-o por dez minutos em banho de gelo e o inocule imediatamente.

84

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

5.3.3 Inoculao e observao dos camundongos Inocule oito camundongos por diluio (0,03mL/IC). Inicie o procedimento com o vrus desafio pela maior diluio. Em seguida, inocule o soro-padro e os soros que devem ser testados, iniciando o procedimento pela menor diluio. Observe diariamente os camundongos, fazendo anotaes em fichas. 5.3.4 Clculos segundo Reed & Mench Clculo do vrus Supondo que os resultados da observao dos camundongos tenham sido os seguintes: Mac (mortos acumulados) Vac (vivos acumulados) 0 0 1 3 11
x 1

10-3,7 10-4,7 10-5,7 10-6,7 10-7,7 Frmula:

8 8 7 6 0

0 0 1 2 8

29 21 13 6 0

Ttulo do vrus = log de diluio _____% de mortalidade > 50% 50%__________ > 50% de % de mortalidade > 50% % de sobrevivncia < 50% mortalidade

x log do fator de diluio

Ttulo do
Vrus = log 10-6,7 66,6 50

66,6 0

Ttulo do vrus = 6,7 0,25 = -6,95

Mortalidade (%) 100 100 92,8 66,6 0


85

Diluio do vrus

Animais mortos

Animais vivos

Secretaria de Vigilncia em Sade

Ttulo do vrus = 106,95 DL50/0,03 mL Subtraia, do ttulo terico utilizado, o ttulo do vrus obtido: 10-6,95 10-5,3 = 10-1,65, cujo antilog representa as doses letais utilizadas (45 DL50). Clculo do soro em teste e padro (exemplo): Sobreviventes (%) 100 100 44,4 Mac (mortos acumulados) 0 0 5 Vac (vivos acumulados) 20 12 4 x 0,7 Diluio do soro Animais mortos 0 0 5 Animais vivos 8 8 3

1:5 1:25 1:125 Frmula:

Ttulo do soro = Log de diluio _____% de sobrevivncia > 50% 50%__________ x log do fator > 50% de % de sobrevivncia > 50% % de sobrevivncia < 50% de diluio sobrevivncia

Ttulo do soro = log (1:25) Ttulo do soro = 1,4 0,89 x 0,7. Ttulo do soro = 0,77,

100 50 10 44,4

cujo antilogaritmo representa a diluio que protege 50% dos camundongos = 1:59 frente a 45 DL50. Interpretao do resultado: Segundo a OMS, sero considerados protegidos os indivduos com ttulos > ou = 1:25.

86

Captulo

Logaritmos

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

6.1 Conceitos bsicos


D-se o nome de logaritmo de um nmero positivo N, em uma base B, ao expoente X, que se deve elevar sobre B para se obter N. Se N = Bx Ento, o logaritmo, base B, de N, X. X = logBN Onde: B = base; N = nmero; X = logaritmo. X = logBN = N = antilogBX Observao: os nmeros negativos e o zero no possuem logaritmo. Exemplos: Log39 = 2 ou 9 = 32. Log10 1000 = 3 ou 103 = 1000. Entre todos os possveis sistemas de logaritmos existem alguns utilizados. Estes so: A) Os logaritmos decimais, comuns ou de Briggs: so os de base 10 e so simbolizados por log, entendendo-se que a base 10. B) Os logaritmos naturais ou niperianos: nestes, a base um nmero irracional (e = 2,712828). So simbolizados por ln.

6.2 Operaes com logaritmos


A) logaritmo de um produto O logaritmo de um produto igual soma dos logaritmos dos fatores. Se (A x B), ento: log (A x B) = log A + log B;
89

Secretaria de Vigilncia em Sade

Log (10) (100) = log 10 + log 100; Log 1000 = 1 + 2; Log 1000 = 3. B) Logaritmo de um quociente O logaritmo de um quociente igual diferena entre o logaritmo do numerador e o logaritmo do denominador. Log A/B = log A log B; Log 100/10 = log 100 log 10; Log 10 = 2 1; Log 10 = 1. C) Logaritmo de uma potncia O logaritmo de uma potncia igual ao expoente multiplicado pelo logaritmo da base da potncia. Se A = Bx , ento: Log A = log Bx = X log B. Dado que 100 = 102; Log 100 = 2 log 10; Log 100 = 2 x 1; Log 100 = 2. D) Logaritmo de uma raiz O logaritmo de uma raiz igual ao logaritmo da quantidade sub-radical dividido pelo ndice. Se A = 10 =
2 x

b,

ento: log A = log B/X;

100;

Log 10 = log 100/2;

90

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Log 10 = 2/2; Log 10 = 1.

6.3 Cologaritmo
Cologb N = log 1/N = logB N = 0 - logB N = 0 - logB N = - logB N. Exemplo: colog10 10.000 = log10 1/10.000 = -4.

6.4 Estrutura de logaritmo decimal


Log N = um inteiro + (frao decimal < 1); Log N = caracterstica + mantissa; Log N = C + (m) e 0 < (m) < 1. A parte inteira de um logaritmo chama-se caracterstica e deve ser calculada pelo operador. A parte decimal de um logaritmo chama-se mantissa e se l na tbua de logaritmos; portanto, a tbua s proporciona mantissas, que so nmeros positivos e menores do que um. As seguintes regras devem ser seguidas para que se obtenha a caracterstica: A) Se o nmero N > 1, a caracterstica tem uma unidade a menos que os algarismos de N. B) Se 0 < N < 1 , a caracterstica igual ao nmero de zeros esquerda que tenha N. 0,01 = -2 0,001 = -3

91

Secretaria de Vigilncia em Sade

Caractersticas de alguns nmeros: N 2962,35 26386,35 35,20 2,24 0,0092 0,01 caracterstica 3 4 1 0 -3 -1

Visto que a mantissa de um logaritmo sempre positiva, quando a caracterstica for negativa, o sinal negativo deve ser escrito sobre o valor da caracterstica, indicando que s ela negativa.

6.5 Obteno de antilogaritmos


O antilogaritmo (antilog) de um logaritmo o nmero (N), a que corresponde este ltimo. O seu clculo deve sempre seguir as regras estabelecidas pelas operaes com logaritmos.

92

Captulo

Mtodo de Reed-Mench (R & M)

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Princpio bsico: o mtodo de R & M admite que qualquer indivduo que tenha reagido a uma dose de determinado estmulo reagir a doses mais elevadas e que qualquer indivduo que no tenha reagido a determinada dose no reagir s doses mais baixas. Com base neste princpio, procura-se determinar um valor da dose (X), tal que seja igual tanto para a soma acumulada dos indivduos que reagiram quanto para a soma acumulada dos indivduos que no reagiram. DP = % acima de 50% 50% % acima de 50% % abaixo de 50% x log FD

DP = distncia proporcional; FD = fator de diluio. Ttulo: recproca da diluio do vrus que afeta 50% das unidades-teste; equivale ao nmero de unidades infecciosas/unidades de volume. Dose: diluio do vrus/unidade de volume. Exemplo: Dict50 = 10-6/0,1mL. Dados teis: Log2 0,30 Log3 0,40 Log4 0,60 Log5 0,70 Log6 0,80 log7 0,85 log8 0,90 log9 0,95 log10 1

95

Captulo

Tampes e solues

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Todos os reagentes e as solues devero ser preparados em recepientes adequados, estreis, utilizando-se gua destilada ou deionizada. Os sais devem ser muito bem dissolvidos para se obter uma soluo homognea. Dever sempre ser conferido o pH, mediante a utilizao de pHmetros ou papel indicador. Soluo salina a 0,85%: A) cloreto de sdio
______________________________ _______________

8,5g 1000mL

B) gua destilada ou deionizada

Soluo salina tamponada com fosfato de sdio A) Na2HPO4. 12H2O _______________________________ 2,65g B) NaH2PO4. H2O __________________________________ 0,36g C) NaCl ______________________________________________ 8,17g D) gua destilada
_______________________________

1.000mL

Soluo salina tamponada com fosfato de potssio: A) K2HPO4. __________________________________________ 1,45g B) KH2PO4 __________________________________________ 0,22g C) NaCl ______________________________________________ 8,50g D) gua destilada
_______________________________

1.000mL

Soluo tampo de carbonato/bicarbonato (pH 9,5): A) soluo de carbonato de sdio a 0,5M _______________ 10mL B) soluo de bicarbonato de sdio a 0,5M _____________ 13mL Soluo de carbonato de sdio a 0,5M: Na2CO3 anidro _______________ 5,3g gua destilada ________________ 100mL

99

Secretaria de Vigilncia em Sade

Soluo de bicarbonato de sdio a 0,5M: Na2HCO3 _____________________ 4,2g gua destilada _______________ 100mL Glicerina tamponada: A) glicerina PA ________________ 9mL B) tampo de carbonato/bicarbonato de sdio a 0,5M______________ 1mL Acetona a 80%: A) acetona PA _________________ 80mL B) gua destilada _____________ 20ml Diluente de vrus: A) soro normal de coelho ou de eqino ____________________ 2mL B) sulfato de gentamicina _ (4mg por 100mL) C) soluo salina ______________ 97mL ou D) soro normal de coelho ou de eqino _______________________ 2mL E) penicilina ______________ 50.000UI F) estreptomicina ___________ 200mg G) soluo salina _____________ 97mL

100

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

Referncias
ACHA, P. N. B.; SZYFRES, B. Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y los animales. 2nd ed. Washington: Organizacin Panamericana de la Salud, 1986. p. 502-26. (Publicacin Cientfica; 503). ARAI, Y. T. et al. New Lyssavirus genotype from the lesser mouseeared bat (Myotis blythi), Kyrghystan. Emerg. Infect. Dis.,[S.l.], v. 9, n. 3, p. 333-7, 2003. ATANASIU, P. et al. Rabies neutralizing antibodies response to diferent schedules of serum and vaccine inoculations in non-exposed persons. Bull. Wld. Health Org., [S.l.], v. 14, p. 593-611, 1956. BAER, G. M. et al. Rabia: epidemiologia, diagnstico, vacinacin y tratamento en el hombre. Mxico: Ed. La Prensa Mdica Mexicana, 1982. (Ediciones Cientficas). BOURHY, H. Diversit du genre lyssavirus: consequences diagnostiques, epidemiologiques et vaccinales. 1992. Docteur These de lUniversit Paris VI (Especialite Microbiologie, option virologie)Universite Pierre et Marie Curie (Paris VI), 1992. BRASIL. Ministrio da Sade. Programa Nacional de Profilaxia da Raiva. Casos de raiva humana noticados e o percentual de casos transmitidos segundo a espcie animal. Braslia, 2004. BRASIL. Ministrio da Sade. Secretaria de Cincia, Tecnologia e Insumos Estratgicos. Diretrizes Gerais para o Trabalho em Conteno com Material Biolgico. Braslia: Ministrio da Sade, 2004. 60 p. Disponvel em: <http://dtr2001.saude.gov.br/editora/ produtos/livros/pdf/04_0408_M.pdf>.

101

Secretaria de Vigilncia em Sade

CENTERS FOR DISEASES CONTROL AND PREVENTION; NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 3rd ed. Washington, D.C.: U.S. Government Printing Office, 1993. 151p. CONSTANTINE, D. G. Rabies transmission by nonbite route. Publ. Health Rep., [S.l.], v. 77, p. 287-89, 1962. DEAN, D. J.; ABELSETH, M. K.; ATANASIU, P. The fluorescent antibody test. In: MESLIN, F. X.; KAPLAN, M. M.; KOPROWSKI, H. Laboratory techniques in rabies. 4th ed. Geneva: World Health Organization, 1996. p. 88-95. DIAZ, A. M. et al. Antigenic analysis of rabies-virus isolates from Latin America and the Caribbean. J. Vet. Med., [S.l.], v. 41, p. 153-60, 1994. FAVORETTO, S. R. et al. Simplified fluorescent inhibition microtest for the titration of rabies neutralizing antibodies. Rev. Inst. Med. Trop. So Paulo, So Paulo, v. 35, n. 2, p. 171-5, 1993. GOLDWASSER, R. A.; KISSLING, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., [S.l.], v. 98, p. 219-23, 1958. INSTITUT OF LABORATORY ANIMAL RESOURCES. Manual sobre cuidados e usos de animais de laboratrio. Goinia: Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, 2003.162 p. JACKSON, A. C. Pathogenesis. In: JACKSON, A. C.; WUNNER, W. H. (Ed.). Rabies. San Diego: Academic Press, 2002. p. 246-274. KAPLAN, C.; TURNER, G. S.; WARREL, D. A. Rabies vaccines and immunity to rabies, 8-20. In: RAbIES: the facts. 2nd ed. Oxford: Oxford University Press, 1986. 126p.

102

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

KAPLAN, M. M.; KOPROWSKI, H. Laboratory techniques in rabies. 3rd ed. Genebra: WHO, 1973. p. 41-55. KISSLING, R. E. The fluorescent antibody test in rabies. In: BAER, G. M. The natural history of rabies. New York: Academic Press, 1975. p. 401-416. KOPROWSKI, H. The mouse inoculation test. In: MESLIN, F. X.; KAPLAN, M. M.; KOPROWSKI, H. (Ed.). Laboratory techniques in rabies. 4th ed. Geneva: World Health Organization, 1996. p. 80-87. KUZMIN, I. V.; BOTVINKIN, A. D.; KHABILOV, T. K. The lyssaviruswas isolated from a whiskered bat in northern Tajikistan. Plecotus, [S.l.], v. 4, p. 75-81, 2001. KUZMIN, I. V. et al. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetics relationships according to N, P and G genes sequences. Virus Research, [S.l.], v. 97, n. 2, p. 65-79, 2003. LARGHI, O. P. Prueba de anticuerpos uorescentes para rabia. Buenos Aires: Centro Panamericano de Zoonosis, 1975. (Nota Tcnica; 8). LEPINE, P.; ATANASIU, P. Histopathological diagnosis. In: MESLIN, F. X.; KAPLAN, M. M.; KOPROWSKI, H. Laboratory techniques in rabies. 4th ed. Geneva: World Health Organization, 1996. p. 66-79. LORENZ, R. J.; BOGEL, K. Mtodos de calculo. In: KAPLAN, M. M.; KOPROWSKI, H. (Ed.). La rabia: tcnicas de laboratorio. Geneva: WHO, 1976. p. 348-51. Apendice 1 Metodo de Reed & Muench. MATTOS, C. A.; MATTOS, C. C.; RUPPRECHT, C. E. Rhabdoviruses. In: KNIPE, D. M.; HOWLEY, P. M. Fields virology. 4th ed. Philadelphia: Lippincott Willians e Wilkins, 2001. p. 1245-1278.

103

Secretaria de Vigilncia em Sade

MATTOS, C.; MATTOS, C. Uso de anticuerpos monoclonales para la tipificacin antignica de aislamentos de virus rbico. In: ORGANIZACIN PANAMERICANA DE LA SALUD. Consorcio de la OPS de laboratorios de referencia en rabia de las Amricas. Washington, DC: OPS, 1998. p. 2-11. (HCP/HCV/R2/015/98). MESLIN, F. X.; KAPLAN, M. M.; KOPROWSKI, H. Laboratory techniques in rabies. 4th ed. Genebra, Sua: WHO, 1996. 476p. ODA, L. M.; VILA, S. M.(Org.). Biossegurana em laboratrios de sade pblica. 2. ed. Braslia: Fundao Oswaldo Cruz/Ministrio da Sade, 1998. ORGANIZAO MUNDIAL DE LA SALUD (OMS). Prueba de neutralizao para determinao de anticuerpos contra la rabia. Buenos Aires, [19--?]. (Reporte tcnico). ORGANIZACION PANAMERICANA DE LA SALUD (OPAS). Los anticuerpos monoclonales en la caracterizacin y vigilancia de los virus de la rabia en America Latina y el Caribe. Rev. Panam. Salud Publica, [S.l.], v. 8, n. 3, p. 214-17, 2000. RUPPRECHT, C. H.; HANLON, C. A.; HEMACHUDHA, T. Rabies re-examined. Lancet Inf. Dis., [S.l.], v. 2, p. 327-43, 2002. SCHNEIDER, L. G. Antigenic variants of rabies virus. Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis., [S.l.], v. 5, p. 101-107, 1982. SEVENTH REPORT OF THE INTERNATIONAL COMMITTEE ON TAXONOMY OF VIRUSES. Family Rhabdoviridae. In: VAN REGENMORTEL, M. H. V.; FAUQUET, C. M.; BISHOP, D. H. L. (Eds.). Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. San Diego: Academic Press, 2000. p 563-83.

104

Manual de Diagnstico Laboratorial da Raiva

SMITH, J. Molecular epidemiology. In: JACKSON, A. C.; WUNNER, W. H. Rabies. San Diego: Academic Press, 2002. p. 79111. ______. Monoclonal antibody studies rabies in insectivorous bats of the United States. Rev. Infect. Dis., [S.l.], v. 10, p. 5637-43, 1988. SMITH, J. S.; YAGER, P. A.; BAER, G. M. A rapid reproducible test for determining rabies neutralizing antibody. Bull. Wld. Health Org., [S.l.], v. 48, p. 535-41, 1973. SOKOL, F. et al. Biochemical and biophysical studies on the nucleocapsid and on the RNA of rabies virus. Virology, [S.l.], v. 38, p. 651-65, 1969. TECPAR. Manual de Tcnica de Laboratrio e Normas de Controle da Raiva. [S.l. : s.n.], 1987. TIERKEL, E. S.; ATANASIU, P. Rapid microscopic examination for Negri bodies and preparation of specimens for biological tests. In: MESLIN, F. X.; KAPLAN, M. M.; KOPROWSKI, H. Laboratory techniques in rabies. 4th ed. Geneva: WHO, 1996. p. 55-65. TORDO, N. Characteristics and molecular biology of the rabies virus. In: MESLIN, F. X.; KAPLAN, M. M.; KOPROWSKI, H. Laboratory techniques in rabies. 4th ed. Geneva: WHO, 1996. p. 28-51. TORDO, N.; BOURHY, H.; SACRAMENTO, D. Les rhabdovirus: classification, structure, mcanismes gnraux, pidmiologie molculaire. In: HATTENBERBER, A. M.; BLANCOU, J.; DE KINKELIN, P. Journe Rhabdovirus CNEVA-INRA. Ann. Rech. Vt., [S.l.], v. 21, p. 310-14, 1990. TRIMARCHI, C. V.; SMITH, J. S. Diagnostic evalution. In: JACKSON, A. C.; WUNNER, W. Rabies. San Diego: Academic Press, 2002. p. 308-49.
105

Secretaria de Vigilncia em Sade

WEBSTER, L. T.; DAWSON, J. R. Early diagnosis of rabies by mouse inoculation. Measurement of humoral immunity to rabies by mouse protection test. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., [S.l.], v. 32, p. 570-73, 1935. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Who Expert Committee on Rabies, eighth report. Geneva: WHO, 1992. p. 21. (WHO Technical Report Series). ______. La Rabia Tcnica de Laboratrio. 3rd ed. Genebra, 1976. WIKTOR, T. J.; CLARK, H. F. Aplication of the plaque assay technic to the study of rabies virus neutralizing antibody interactions. Ann. Microbiol. (Pasteur Inst.), [S.l.], v. 124A, p. 283-87, 1973. WIKTOR, T. J. et al. Antigenic properties of rabies virus components. J. Immunol., [S.l.], v. 110, p. 269-76, 1973. WIKTOR, T. J.; FLAMAND, A.; KOPROWSKI, H. Use of monoclonal antibodies in diagnosis of rabies virus infection and differentiation of rabies and rabies-related viruses. J. Virol. Methods, [S.l.], v. 1, p. 33-46, 1980. WIKTOR, T. J.; KOPROWSKI, H. Monoclonal antibodies against rabies virus produced by somatic cell hydridization: detection of antigen variants. Proc. Natl. Acad. Sci., [S.l.], v. 75, p. 3938-42, 1978. WUNNER, W. H. Rabies virus. In: JACKSON, A. C.; WUNNER, W. Rabies. San Diego: Academic Press, 2002. p. 23-77.

106

A coleo institucional do Ministrio da Sade pode ser acessada na Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sade: http://www.saude.gov.br/bvs O contedo desta e de outras obras da Editora do Ministrio da Sade pode ser acessado na pgina: http://www.saude.gov.br/editora

EDITORA MS Coordenao-Geral de Documentao e Informao/SAA/SE MINISTRIO DA SADE (Normalizao, reviso, editorao, impresso e acabamento) SIA, trecho 4, lotes 540/610 CEP: 71200-040 Telefone: (61) 3233-2020 Fax: (61) 3233-9558 E-mail: editora.ms@saude.gov.br Home page: http://www.saude.gov.br/editora Braslia DF, janeiro de 2008 OS 0013/2008

ISBN 978-85-334-1454-9

9 788533

41454 9

Disque Sade 0800 61 1997 Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sade www.saude.gov.br/bvs Secretaria de Vigilncia em Sade www.saude.gov.br/svs

Secretaria de Vigilncia em Sade