Anda di halaman 1dari 5

Karakteristik Induksi Fenilanin Amonia Lyase (PAL) Terhadap Gen Amonia Lyase Pisang Yang Terinfeksi Mycosphaerella Fijiensis

PENDAHULUAN Pisang merupakan tanaman yang penting karena dapat dijadikan sebagai makanan pokok maupun dapat di ekspor ke pasar internasional. Pisang rentan rusak oleh berbagai penyakit yang menyebabkan kerugian yang signifikan bagi petani (Robinson dan Sauco 2010). Patogen penyebab penyakit yang sering menyerang pisang yaitu jamur Mycosphaerella fijiensis. Infeksi jamur Mycosphaerella fijiensis dimulai dengan deposisi spora pada daun dari pisang diikuti dengan perkecambahan dalam 2-3 jam pada permukaan daun dengan kondisi diatas permukaan daun yang sesuai. Spora yang berkecambah tumbuh epiphytically selama 2-3 hari sebelum menembus daun melalui stomata dalam respon hydrotropic melalui pembentukan stomatopodia. Di dalam daun, hifa tumbuh melalui lapisan mesofil dan ke dalam jaringan palisade (Meredith 1970, Stover 1980). Dalam beberapa dari genotip tahan, ada akumulasi jelas senyawa fenolik dan adanya sel-sel polifenol menyimpan khusus dalam parenkim (Hoss 2000, Torres et al. 2012). Senyawa fenolik dilepaskan ke ruang antarsel, senyawa tersebut berhubungan dengan hifa jamur dan tampaknya membatasi penyebaran penyakit ke dalam parenkim (Beveraggi et al. 1993). Berbagai penelitian menyebutkan Fenilalanin amonialyase (PAL)

merupakan enzim penting dalam metabolisme fenilpropanoid dan mengkatalisis L-fenilalanin menjadi asam sinamat, yang mengarah ke berbagai kelompok tanaman metabolit sekunder termasuk lignin, kumarin, flavonoid dan

phytoalexins. Banyak studi menunjukkan bahwa PAL memainkan peran penting dalam modulasi ketahanan jaringan tanaman cekaman abiotik (Wang et al., 2007) dan juga dalam pertahanan umum reaksi terhadap infeksi oleh patogen di banyak tanaman yang lebih tinggi (Dixon & Paiva 1995; Mauch-Mani & Slusarenko, 1996; Mur et al, 1996).

BAHAN METODE 1. Bahan tanaman - Tanaman rentan penyakit daun hitam pisang Williams (AAA), Grain Nain (AAA), Yangambi km5 (AAA), Calcutta 4 (AA) - Tanaman yang disimpan di bawah rumah kaca kondisi sampai infeksi pada 29 C dan kelembaban relatif (RH) di atas 95%. 2. M. Fijiensis M. fijiensis diperoleh dari daun pisang dikumpulkan di wilayah Urab (Kolombia) kemudian masing-masing ascospore ditanam di Medium kultur Potato Dextrose Agar (PDA) dan diinkubasi pada 25 1C sampai memperoleh koloni diameter sekitar 1 cm. 3. Persiapan inokulasi Produksi konidia menggunakan suspensi miselia melalui proses scrapping dengan spatula steril dan menambahkan 10 ml air suling steril. Suspensi kemudian disaring dan konsentrasi disesuaikan dengan 1x104 fragmen per mililiter dengan air suling. 1 ml suspensi ditambahkan ke petri media agar diperkaya dengan 0,2 g / L CaCO3. Cawan petri diinkubasi selama 15 hari dalam kegelapan, pada suhu 26 1 C diikuti oleh 15 hari lebih di bawah cahaya putih kontinyu pada intensitas 1500 lux. Selama periode inkubasi cahaya, suhu dijaga pada 26 1C. 4. Inokulasi dengan Mycosphaerella fijiensis Koloni di setiap cawan petri yang lembut dihapus dengan pisau bedah dan kemudian 5 ml air ditambahkan. Suspensi disaring dengan kain ethamine, dan konsentrasi propagul infektif (konidia + miselium fragmen) ditentukan dengan menggunakan chamber Neubauer dan kemudian disesuaikan dengan 106 propagul/ ml dalam air dengan 2 % gelatin. Inokulasi dilakukan pada 48 tanaman berumur 30 hari dan antara 20 sampai 30 cm dengan menyemprotkan 3 daun setiap tanaman pada jarak sekitar 20 cm dengan airbrush disesuaikan dengan 50 psi. Kontrol dari kedua kultivar diinokulasi dengan larutan 2 % gelatin tanpa propagul infektif. Inokulasi tanaman disimpan dalam ruang infeksi dengan suhu konstan 29C, kelembaban relatif dari 95 % dan

penyinaran dari 12 jam light/12 h kegelapan. Tiga sampel daun dikumpulkan per titik waktu dan tanaman disimpan sebagai pengendalian infeksi menunjukkan pengembangan nekrosis dalam kultivar rentan dan reaksi hipersensitif di tahan kultivar. Percobaan Inokulasi diulang tiga kali pada 12 bulan. 5. Isolasi RNA dan Sintesis cDNA Total RNA diekstraksi dari daun pisang menggunakan Skala Kecil Isolasi RNA kit sesuai dengan standard. Konsentrasi RNA diukur pada 260 nm, menggunakan Spectrophotometer. RNA diuji untuk kontaminasi DNA genom dengan PCR. Produk PCR dipisahkan dengan elektroforesis. 6. MaPAL Gene Expression Analisis Menggunakan Real-Time PCR Setiap sampel diuji dalam rangkap tiga dan dua sampel biologis dibuat. 7. Molekul Kloning MaPAL Full-Length cDNA Kloning molekuler lengkap MaPAL cDNA dari empat kultivar pisang dilakukan dengan amplifikasi cepat dari ujung cDNA. Kultivar Williams digabungkan dengan gen-gen lain yang diambil sifat unggulnya dengan menyelaraskan dan kemudian dikonfirmasi oleh PCR amplifikasi. 8. Analisis urutan MaPAL Menentukan model nukleotida substitusi (Nei & Kummar, 2000; Posada ,2008) dan analisis filogenetik dari MaPAL dan urutan PAL serta analisis struktur sekunder dari protein MaPAL. HASIL Ekspresi gen PAL dalam keragaman kultivar Banana terjadi perbedaan dalam ekspresi gen PAL antara kultivar Musa sp. yang diamati dan dianalisis. Hasil dari kedua kultivsr setelah inokulasi yaitu ekspresi gen MaPAL dari kultivar Calcutta 4 terinfeksi M. Fijiensis yang muncul 12 jam, 24 jam dan 144 jam setelah infeksi. Sebaliknya MaPAL ekspresi gen dari kultivar rentan Williams tidak menunjukkan induksi terhadap infeksi M. Fijiensis. Peran utama dari PAL adalah untuk deaminate fenilalanin menjadi asam trans- sinamat yang akan cepat berubah menjadi lignin untuk akumulasi penebalan dinding sel dan menghalangi pertumbuhan jamur (Hoss et al , 2000; Khan et al , 2004).

Peran aktif untuk protein MaPAL selama awal pisang yang berinteraksi dengan Mycosphaerella fijiensis. Gen lanjut kinetika fungsional dan protein eksperimen adalah diperlukan untuk sepenuhnya memahami peran yang tepat enzim ini bermain di respon pertahanan pisang terhadap tanaman patogen Mycosphaerella fijiensis. Apapun peran MaPAL dalam respon pertahanan, ekspresi gen ini merupakan indikator yang baik dari timbulnya respon pertahanan dalam pisang terhadap sistem patogen M . fijiensis. Beveraggi, A., Mourichon, X., & Salle, G. (1993). Study of hostparasite interactions in susceptible and resistant bananas inoculated with Cercospora fijiensis, pathogen of black leaf streak disease. In J. Ganry (Eds.), Breeding Banana and Plantain for resistance to disease and pests (pp. 213- 220). Montpellier, France: CIRAD, INIBAP. Dixon, R. A., & Paiva, N. L. (1995). Stress-induced phenylpropanoid metabolism. Plant Cell, 7, 1085-1097. doi:10. 1105/tpc.7.7.1085 Hoss, R., Helbig, J., & Bochow, H. (2000). Function of Host and Fungal Metabolites in Resistance Response of Banana and Plantain in the Black leaf streak Disease Pathosystem (Musa spp. -Mycosphaerella fijiensis). J Phytopathol, 148, 387-394. http://dx.doi.org/10.1046/j.14390434.2000.00530.x Khan, W., Prithiviraj, B., & Smith, D. L. (2004). Chitosan and chitin oligomers increase phenylalanine ammonia-lyase and tyrosine ammonia-lyase activities in soybean leaves. J Plant Physiol., 160, 859-863. http://dx.doi.org/10.1078/0176-1617-00905 Mauch-Mani, B., & Slusarenko, A. (1996). Production of salicylic acid precursors is a major function of phenylalanine ammonialyase in the resistance of Arabidopsis to Peronosporaparasitica. Plant Cell, 8, 203-212. Meredith, D. S. (1970). Banana leaf spot disease (Sigatoka) caused by Mycosphaerella musicola Leach. (Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England). Mur, L. A. J., Naylor, G., Warner, S. A. J., Sugars, J. M., White, R. F., & Draper, J. (1996). Salicylic acid potentiates defence gene expression in leaf tissue exhibiting acquired resistance to pathogen attack. Plant Journal, 9, 559-571. http://dx.doi.org/10.1046/j.1365-313X.1996.09040559.x Robinson, J. C., & Saco, V. (2010). Crop production Science in Horticulture Series, Bananas and Plantains (2nd ed.). Design. La Laguna, Tenerife, Spain: CAB International. Stover, R. H. (1980). Sigatoka leaf spot diseases of banana and plantain. Plant Disease, 64, 750-755. http://dx.doi.org/10.1094/PD-64-750 Torres, J., Calderon, H., Rodriguez-Arango, E., Morales, J., & Arango, R. (2012). Differential induction of pathogenesis-related proteins in banana in response

to Mycosphaerella fijiensis infection. European Journal of Plant Pathology, 133, 887-898. http://dx.doi.org/10.1007/s10658-102-0012-7 Wang, Y., Chen, J. Y., Jiang, Y. M., & Lu, W. J. (2007). Cloning and expression analysis of phenylalanine ammonia-lyase in relation to chilling tolerance in harvested banana fruit. Postharvest Biology and Technology, 44, 34-41. http://dx.doi.org/10.1016/j.postharvbio.2006.11.003