TIPIFICACION HLA

Bioq. Eliana Palomino Lab. De Histocompatibilidad Hospital Privado

Tipificacin HLA:
Estudio mediante el cual se determina cuales de todas las variantes conocidas del locus HLA estn presentes en un individuo determinado.

Muestra:
Extraccin de sangre entera, anticoagulada con EDTA.

Mtodos de tipificacin HLA

Serologa Linfotoxicidad medida por complemento: CDC Biologa molecular PCR SSP (Primers de secuencia especfica) PCR SSOP Reversa (Sondas de oligonucleotidos de secuencia especifica) LUMINEX SBT (Tipificacin basada en la secuencia)

Tipificacin Serolgica:
Principio: poner en contacto linfocitos aislados del sujeto a estudiar con un panel de aloanticuerpos o anticuerpos monoclonales antiHLA capaces de reconocer determinadas especificidades antignicas.

Tipificacin serolgica
Se utiliza una suspensin de linfocitos viables obtenidos a partir de sangre perifrica, utilizando Fycoll-Hypaque (densidad 1.077 g/mL) Separacin de los inmunomagnticas Complemento de conejo Placas Terasaki con sueros caracterizados Placas con Terasaki anticuerpos monoclonales L T y B con perlas

Separacin de los Linfocitos T y B con perlas inmunomagnticas

PERLAS

INCUBAR

SEPARAR

LAVAR

Citotoxicidad dependiente de Complemento CDC

Ventajas y desventajas
Ventajas:
Tcnica fcil ,no se requiere de equipamiento costoso Se realiza en 3 hs Utilizando sueros monoclonales se obtienen resultados aceptables de bajo nivel de resolucin

Desventajas
Se requieren mayores volumenes de sangre Se requieren linfocitos viables Dificultoso encontrar antisueros para los especificidades raras

Mtodos de tipificacin HLA

Serologa
LInfotoxicidad medida por complemento: CDC

Biologa molecular
PCR SSP (Primers de secuencia especfica) PCR SSOP Reversa (Sondas de oligonucleotidos de secuencia especifica) LUMINEX SBT (Tipificacin basada en la secuencia)

Secuencias target
HLA clase I
HVR 2 1 1 1

HLA clase II
HVR HVR*
DQ -DP

2m

Para HLA de clase I, los exones 2 y 3 de los genes de la cadena pesada (1, 2) Para HLA de clase II, el exn 2 de la cadenas alfa y beta
Samaniego M, et al. Clin Transplant.2006;503

SSP-PCR
Paneles de pares de primers de secuencias especficas, cuyas secuencias discriminan las diferentes variantes que puede presentar el locus. Cada reaccin de PCR se realiza en un tubo separado Cada tubo contiene un par de primers especficos y un par de primers como control interno.

Amplificacin por PCR

Electroforsis en gel de agarosa 2% Visualizacin de los productos de amplif y confirmacin del tamao (bp) de las reacciones + La tipif HLA es deducida de acuerdo al pattern de reacciones + y -

HLA-DR SSP-PCR

HLA-A*11 HLA-A*24 HLA-B*39 HLA-B*44 HLA-DR*13 HLA-DR:15

PCR-SSOP
Amplificacin del locus HLA por medio de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) con la subsiguiente hibridacin del producto amplificado por medio de sondas de oligonuclotidos de secuencia especfica.

PCR - SSOP
Amplificacin: Pares de primers que amplifican locus HLA especficos marcados c/ biotina Primers genricos Primers group/allele especficos Hibridizacin: DNA amplificado se desnaturaliza y se hibridiza con las sondas de secuencia complementaria a una temperatura y condiciones estrictas de astringencia Resultados: Se incuba las tiras con conjugado estreptavidina y peroxidasa que se une a la biotina y con el agregado de un sustrato se visualizan las bandas La tipif HLA es deducida a partir del patrn de reacciones positivas y negativas de la sondas

SSOP Reversa
Reporter Strepavidin Biotin
5 3 3 5

Amplified test DNA

Support Platforms
Nylon membranes Nitrocellulose strips Microtiter plates Luminex beads Microchips

Reporter Molecules
Fluorescent labels Enzyme + substrate

Probe

LUMINEX LABType SSO

Fundamento: 100 beads pticamente distinguibles por el luminex unidas a sondas especficas que hibridizaran con el alelo especfico en caso de estar presente.

Using This Method and Two Dyes, 100 Individual Beads can be Resolved

LABTipe SSO
1) Amplificacin con primers biotinilados. 2) Desnaturalizacin. 3) Hibridizacin con las beads. 4) Agrego SAPE (Estreptoavidina + ficoeritrina) para amplificar la seal. 5) Lectura en Luminex. 6) La asignacin de la tipificacin de HLA se basa en el patrn de reaccin comparado con patrones asociados a secuencias de genes HLA publicadas

Description of LABType SSO

1. Amplification
Class I 2/3 Class II - 2 10 min primers biotina

2. Denaturation/Neutralization

3. Hybridization

4. Labeling
5 min a 60C washes

Probes are attached to color-coded beads

Probe 1
1

Probe 2
2

Probe 3
3

100

Signal Detection
Biotin

1. Add DNA
Biotin

DR15 Probe

DR16 Probe

2. Hybridize & Wash

3. Label with Stretavidin-PE

SAPE

Positive

Negative

4. Fluorescence Measurement Fluorescence from 1. Reporter 2. Bead

SBT: Tipificacin basada en secuencia

SBT: Tipificacin basada en secuencia

El DNA se amplifica con una mezcla de nucletidos marcados con 4 fluorforos (Didesoxinucletidos)

Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar.

Como "cebador" para iniciar la sntesis, se necesita un corto oligonucletido complementario del extremo de la cadena.

desoxinucletidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP. didesoxinucletidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciacin. Al aadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerizacin en el cebador, pero cesa el incorporarse un didesoxinucletido

electroforesis. Identificados con un detector de fluorescencia automatizado

Los fragmentos resultantes se separan por tamao mediante electroforesis y la sucesin de bandas de cada una de las cuatro reacciones, comparndolas entre s,dan la secuencia del ADN

Resumen
SSP Primers de secuencia especfica PCR/electroforsis en gel de agarosa PCR/hibridacin de sondas con producto de la PCR Media Rpida Media/alta + prolongada

SSOP REVERSA

Sondas de oligonuclotidos especficas a secuencia

LUMINEX

Sondas de oligonuclotidos especficas de secuencia unidas a microesferas

PCR/hibridacin de sondas con producto de la PCR

Media o alta Anlisis mltiples con sensibilidad de Citometra de flujo Anlisis automatizado estudian 96 indiv.con 100 diferentes sondas x locus Rpido,> n de muestras

SBT

Cebadores de sitio especficos a grupo y mezclas de establecimiento de secuencia con un teminador de secuencia marcado

PCR/establecimiento de secuencia del producto de la PCR

Alta Alelos a nivel de secuencia exacta

HLA Alleles and Antigens (IMGT)

Numero de antgenos y alelos nombrados por el comit de nomenclatura HLA desde 1968 hasta junio del 2010.

Assigned April 2010

Assigned April 2010

Las reglas para nombrar los antgenos HLA y alelos son establecidos por un Comit de Nomenclatura de la WHO (World Health Organization) (Marsh SG, et al. Immunol.2005 Humanos; 66:571 )

Assigned April 2010

Cdigos NMDP( National Marrow Donor Program)

Resolucin en HLA Typing

Baja resolucin molecular. Tipificacin se resuelve o se reporta en un nivel de 2 digitos A*02-B*08-DRB1*03 Equivalente a la tipif. serolgica Resolucin molecular intermedia Tipificacin se resuelve o se reporta como un set de posibles alelos A*02DEKM, 24DEKN 51 posibles A*02 allelos y 42 posibles A*24 allelos. Alta resolucin molecular Tipificacin se resuelve o se reporta como un nico alelo A*01:02:01

Ventajas de los ensayos moleculares Mayor precisin y reproducibilidad No hay necesidad de linfocitos viables Opcin para la automatizacin parcial o total