Manual Practicas Microbiologia General 2012

2012
Manual de prcticas de Microbiologa General

Programa de Ingeniera de Alimentos
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Docente Zorangel Amzquita Montes Universidad de Cartagena 15/06/2012
UNIVERSIDAD DE CARTAGENA
MICROBIOLOGA GENERAL
TABLA DE CONTENIDO
PRCTICA No 1. NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA ...... 3 PRCTICA No 2. MANEJO DE ELEMENTOS DE TRABAJO ............................................................................... 8 PRCTICA No 3. DETERMINACIN DE FLORA AMBIENTAL, PARTE I MORFOLOGA BACTERIANA Y TINCIN SIMPLE ......................................................................................................................................................... 13 PRCTICA No 4. DETERMINACIN DE FLORA AMBIENTAL, PARTE II FUNDAMENTO DE LA TINCIN DIFERENCIAL Y SELECTIVA ........................................................................................................................... 19 PRCTICA No 5. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVOS ......................................................................... 26 PRCTICA No 6. SIEMBRAS .......................................................................................................................... 34 PRCTICA No. 7 RECUENTO EN PLACAS DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC) ..................... 37 PRCTICA No 8. INFLUENCIA DE LOS AGENTES FISICOS EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO ..................... 40 PRCTICA No 9. INFLUENCIA DE LOS AGENTES QUIMICOS EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO................ 43 PRCTICA No 10. IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS ............................................................... 46 PRCTICA No 11. IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS. ........................................................... 50 PRCTICA No 12A. IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS ....................................................... 53 PRCTICA No 12B. COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGUA DE CONSUMO HUMANO....................... 62 PRCTICA No 13. OBSERVACION DE PARSITOS ........................................................................................ 75 PRCTICA No 14. OBSERVACION DE HONGOS ............................................................................................ 77
Universidad de Cartagena | PRCTICA No 1. NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
PRCTICA No 1. NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Los laboratorios de microbiologa constituyen ambientes de trabajo especiales, que pueden presentar riesgos de enfermedades infecciosas para las personas que se encuentren en o cerca de ellos. El trabajo diario en el laboratorio es un trabajo de grupo, en donde la actitud de cada uno de los integrantes ante las prcticas, as como el entrenamiento que posean en las tcnicas requeridas para el manejo de material contaminado, determinan su propia seguridad, as como la de sus compaeros y la de la colectividad en general. Es por ello que antes de comenzar con las actividades prcticas, todas las personas involucradas (estudiantes y profesores) tenemos la obligacin de conocer cules son las normas de seguridad a seguir en el laboratorio de manera tal, que el trabajo se realice con un riesgo mnimo de exposicin, tanto para las personas que lo ejecutan como para el medio ambiente. El objetivo de esta lectura, es ofrecerle al estudiante una gua que contribuya a lograr un ambiente de trabajo adecuado y seguro, durante la ejecucin de las actividades prcticas en el Laboratorio de Microbiologa. NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA PRINCIPIOS DE BIOSEGURIDAD Bioseguridad La seguridad biolgica o bioseguridad, es la aplicacin del conocimiento, de las tcnicas y de los equipos necesarios para prevenir la exposicin del personal, del rea de laboratorio y del medio ambiente a agentes potencialmente infecciosos o biopeligrosos. Agentes Biopeligrosos Son todos aquellos agentes biolgicos y materiales que son potencialmente peligrosos para los seres humanos, los animales y las plantas. Entre ellos podemos citar: bacterias, virus, hongos, parsitos, productos recombinantes, alrgenos, priones, etc. Riesgo Microbiolgico El Riesgo Microbiolgico se encuentra presente cada vez que se realiza una actividad prctica en el Laboratorio, donde se requiera la manipulacin de cultivos de microorganismos, los cuales pueden alcanzar concentraciones muy elevadas y pueden llegar a provocar una infeccin si no son manipulados adecuadamente. Para que se produzca un accidente por un agente biolgico deben estar presente bsicamente 4 elementos: un husped susceptible, un agente infeccioso, una concentracin suficiente de ste y una ruta de transmisin adecuada; siendo este ltimo punto el que mejor se puede controlar en el laboratorio.
Vas de Infeccin Los microorganismos pueden ingresar al organismo a travs de: la boca, los pulmones, la piel (intacta o lesionada), la conjuntiva, etc. Las vas de contaminacin ms frecuentes en el laboratorio se dan a travs de: La boca - Comer, beber y fumar en el laboratorio. - Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningn tipo de proteccin. - Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos o utensilios contaminados (lpices, bolgrafos, etc.). La piel - Inoculacin accidental con una aguja hipodrmica u otros instrumentos punzantes de vidrio. - Cortaduras o rasguos. Los ojos - Salpicaduras de materiales infecciosos. - Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos contaminados. Los pulmones - Inhalacin de microorganismos transportados por el aire (aerosoles). - En los Laboratorios de Microbiologa de la Facultad de Farmacia estamos seguros que comprendiendo y teniendo conocimiento de todos estos posibles riesgos, aprendiendo y ejecutando las tcnicas adecuadas, contribuiremos con una parte importante e integral del proceso de educacin, as como tambin a reducir el nmero de accidentes en el laboratorio y en futuras actividades fuera de l. NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin. Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe permanecer completamente cerrada. Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesin prctica. Lavar las manos con agua y jabn antes de realizar las actividades programadas, antes de salir del laboratorio y siempre despus de manejar materiales que se sabe o se sospecha que son contaminantes. Trabajar cerca del mesn, adoptando una buena postura y estando fsicamente cmodo. Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante en las reas de laboratorio.
Evitar llevar en el laboratorio accesorios que podran ser fuente de contaminacin (por ejemplo joyas). Recoger el cabello largo. Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar slo lo indispensable. No comer, beber, fumar, almacenar comida, objetos personales o utensilios, aplicarse cosmticos ni ponerse o quitarse lentes de contacto en ningn rea del laboratorio. Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades indicadas en la prctica. Si usted tiene alguna duda, dirjase al profesor. Mantener el rea de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales, exceptuando aquellos equipos y materiales necesarios para la realizacin del trabajo prctico. Tener cuidado con el alcohol cuando manipule el mechero. Nunca debe dejar ste desatendido. Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios y de manera ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la actividad. Reporte cualquier dao de los mismos al profesor. Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos para tal fin, por ejemplo: las pipetas en los pipeteros, tubos y placas de Petri en las ollas de desecho, etc. No usar ningn reactivo que no est debidamente identificado, verificar las etiquetas de los mismos y estar seguro de cmo emplearlo. No devolver sustancias a sus envases originales. Emplear la propipeta al medir lquidos. Est rigurosamente prohibido pipetear con la boca. De igual manera las pipetas tendrn tapones de algodn para reducir la contaminacin de estos dispositivos de pipeteo. Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el profesor, no llevar a cabo experimentos no autorizados. Reportar inmediatamente cualquier accidente al profesor (derrame de material contaminado, heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como menor. Reducir al mnimo la formacin de aerosoles durante la realizacin de cualquier trabajo prctico. Extremar las precauciones cuando se utilicen agujas y jeringas para evitar la inoculacin accidental y la generacin de aerosoles durante su manipulacin y desecho. Emplear tcnicas aspticas para el manejo de cultivos de microorganismos.
MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA A continuacin mencionaremos los pasos que se deben seguir en caso de que ocurran los siguientes accidentes: Derrame de material biolgico sobre el cuerpo: - Remover la ropa inmediatamente.
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Lavar vigorosamente el rea expuesta con agua y jabn por un minuto. Reportar el incidente al profesor. Buscar atencin mdica si es necesario. La ropa contaminada debe ser colocada en una solucin desinfectante antes de ser lavada. Salpicaduras en los ojos con materiales biopeligrosos: - Lavar inmediatamente el globo ocular e interior de la superficie del prpado con abundante agua durante 15 minutos aproximadamente. Abrir el ojo para asegurar efectivamente el lavado, comenzando por los prpados. - Reportar el incidente al profesor. - Buscar atencin mdica inmediatamente. Cortadas menores y heridas por pinchazo: - Lavar vigorosamente la herida con agua y jabn por varios minutos. - Aplicar un antisptico adecuado - Reportar el incidente al profesor. - Buscar atencin mdica inmediatamente. En el caso de derrames: - Reportar el incidente al profesor. - Colocarse guantes y cubrir con papel absorbente el rea del derrame. - Verter un desinfectante adecuado y dejar actuar por el tiempo necesario. - Retirar el material absorbente junto al material roto y colocarlos en un recipiente para residuos contaminados o bolsa de desechos, la cual debe esterilizarse junto con los guantes utilizados. - Limpiar y desinfectar nuevamente el rea empleando nuevas toallas de papel y desinfectante. - Lavarse las manos con abundante agua y jabn -
El xito de estas normas depende de la sinceridad, la constancia, la participacin activa y cooperativa de cada estudiante, por ello antes de asistir al laboratorio, deben leer el fundamento y las actividades a realizar, para as evitar posibles accidentes, con el conocimiento y las tcnicas de trabajo apropiadas. MATERIALES INDISPENSABLES EN CADA SESIN EN EL LABORATORIO Bata de laboratorio limpia y con botones El protocolo de prcticas y bitcora del laboratorio Un pedazo de tela, cerillos, cinta de enmascarar, tijeras, marcador indeleble (sharpie)
BIBLIOGRAFA Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. CDC/NIH. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service (4 Ed.). Washington; 1999. Mahon, Conni and Manuselis, George. Textbook of Diagnostic Microbiology. Second edition. USA: W.B. Saunders Company; 2000. Organizacin Mundial de la Salud. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Ginebra: OMS; 2005 Universidad de Alicante. Facultad de Ciencias. Manual de Supervivencia en el Laboratorio [monografa en lnea]. Espaa: 1999 [acceso 7 de abril 2008]. Disponible en; http://www.ua.es/centros/ciencias/seguridad/hab_seg_lab_biol.htm
PRCTICA No 2. MANEJO DE ELEMENTOS DE TRABAJO OBJETIVOS Aprender el manejo y uso correcto de los elementos de trabajo utilizados en el laboratorio de Bacteriologa, los cuales son necesarios para realizar un buen desempeo, en el desarrollo de los diferentes anlisis bacteriolgicos. MATERIALES Bao Serolgico Estufa Autoclave Horno Nevera o Cuarto fro Incubadora Mechero Tubos de ensayo Asa bacteriolgica Caja de Petri Pipetas Jarra para anaerobiosis Atmsfera de CO2 (jarra con vela) Microscopio
Bao Serolgico Es una caja metlica con temperatura graduada en ambiente hmedo. Se utiliza cuando se necesita una determinada temperatura en ambiente hmedo. muy utilizada en la preparacin de agar sangre y agar chocolate con el fin de mantener la base en estado lquido antes de agregarle la sangre. Estufa Utilizada en la preparacin de los medios de cultivo para ayudar a la disolucin del agar. Autoclave Equipo de esterilizacin utilizado en bacteriologa con el fin de destruir los microorganismos aun los ms resistentes (esporulados). esto se consigue en un ambiente hmedo, con una temperatura 121c a 15 libras de presin por 15 minutos. Horno Caja metlica de doble pared que contiene una fuente de calor la cual no est en contacto directo con los elementos a esterilizar. tiene un termmetro el cual indica la temperatura deseada, se utiliza para la esterilizacin y secado de material de laboratorio en un ambiente seco, a 180c durante 2 horas.
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Nevera o cuarto frio Utilizado para mantener medios de cultivo, cepas y reactivos a temperaturas bajas entre 5 y 8c y evitando con esto que los reactivos se deterioren que los medios de cultivos se deshidraten y las cepas se contaminen, con las bajas temperaturas se consiguen una disminucin de la actividad metablica de los microorganismos disminuyendo con ellos el peligro de contaminacin bacteriana. Incubadora Caja metlica de doble pared la cual posee dispositivos elctricos para controlar la temperatura (37c), contiene un botn con el cual se regula esta y un termmetro para su lectura. La incubadora la utilizamos para favorecer el crecimiento de los microorganismos. Mecheros Los hay de alcohol y de gas. son utilizados en bacteriologa para crear una pequea rea de esterilizacin cuando se trabaja en condiciones de asepsia. tambin para esterilizar por flameo. Tubos de ensayo Los ms utilizados son de vidrio resistentes al calor (pirex). Se utilizan para almacenar medios de cultivos, tiles en siembras bacteriolgicas y en la preparacin de diluciones. Manejo: tome la tapa con los dedos en flexin entre el dedo meique y la palma de la mano. Si el tubo contiene medio de cultivo, flamear, despus de destapar la boca del tubo para evitar contaminacin con microorganismos del medio ambiente, Introduzca el asa, estril y fra agitarla dentro del tubo, al sacar el asa flamee nuevamente la boca del tubo, antes de taparlo. Asa Bacteriolgica Es un alambre de platino al cromo nquel o al cromo aluminio con un espesor aproximado de 0.5 - 1 mm de dimetro por 5-8 mm de largo, se adapta a un largo porta agujas llamado base o mango. En su extremo libre el alambre puede terminar en 2 formas: Recto en forma de aguja llamado asa en punta. Formando en su extremo un arco cerrado llamado asa de redondela. USO. Para preparar extendidos y siembra de bacterias. Manejo. Se esteriliza por calor directo, en la llama del mechero (flameado). La esterilizacin del asa se consigue Harnendola al rojo vivo hasta la parte terminal y ojal se incluya un tercio del mango. Este procedimiento debe realizarse antes del uso y despus. Caja de Petri Es una caja circular de vidrio (pirex) o de propileno, con paredes perpendiculares de ms o menos un centmetro de alto, la tapa es de la misma forma pero de un dimetro un poco mayor para que encaje en la base. USO. Para almacenar los medios de cultivo. La posicin correcta de colocarla en la incubadora es con la tapa hacia abajo, para impedir la contaminacin del cultivo.
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Pipetas Graduadas Tubos de vidrio graduados en diferente medidas (desde 0.2 bastas 25 ce), para su uso en bacteriologa deben estar estriles, para esto se le coloca un algodn en la boquilla, se envuelven y se llevan al autoclave a 121C a 15 libras de presin por 15 minutos, luego al horno para el secado de material estril. USO: Para realizar siembras y diluciones Necesidades de oxigeno de los microorganismos Los gases que tienen ms importancia para el cultivo de las bacterias son el oxigeno y el dixido de carbono. Con respecto al oxigeno libre las exigencias de las bacterias son muy diferentes, algunas tienen absoluta necesidad de oxigeno, otras solo crecen en su ausencia y existen tipos intermedios que pueden crecer en ambas condiciones. En relacin con su respuesta al oxigeno gaseoso pueden considerarse los siguientes tipos bacterianos: Aerobios obligados: Crecen solo en presencia de oxigeno libre. Anaerobios obligados: Aquellos que crecen solo en ausencia de oxigeno. Anaerobios facultativos: Que crecen en ausencia o presencia de oxigeno. Microaeroflicos: Que crecen en pequeas cantidades de oxigeno libre. Captoflicos: Son aquellos que necesitan de un 5 a 10% de CCX para estimular su crecimiento.
Para cultivar microorganismos Aerobios o facultativos en cajas, tubos o matraces pequeos se hace la incubacin del medio en condiciones atmosfricas normales. El motivo por el cual el oxigeno impide a los microorganismos anaerobios continuar su proceso fermentativo y de crecimiento se debe a la formacin de un radical libre altamente reactivo del O2 que es el sper oxido O2, el cual se forma por accin de las llavo enzimas. Este radical se destruye por accin de la enzima sper oxido dismutasa, enzima que poseen los microorganismos Aerobios y Aerotolerantes pero no la poseen los microorganismos anaerobios. Los microorganismos aerobios y los facultativos que realizan metabolismo respiratorio poseen una cadena completa de transporte de electrones cuyo aceptor final es el oxigeno. Cuando el aceptor final de electrones no es el oxigeno sino los nitratos el microorganismo es facultativo. Los microorganismos anaerobios no poseen cadena de electrones y su respiracin anaerobia tiene como aceptor final de electrones los sulfates y carbonatas. Cultivo de Anaerobios Como se hace necesario la eliminacin del oxigeno para el crecimiento de anaerobios comentaremos algunos mtodos utilizados para expulsar este de los medios de cultivo.
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Se puede expulsar el oxigeno gaseoso de un medio de cultivo liquido hirviendo este por 10 minutos, enfriando rpidamente e inoculando masivamente para adicionar despus una barrera protectora que puede ser vaselina o aceite estril. Nota: El tubo no debe agitarse y la siembra debe hacerse en el fondo del tubo, liste mtodo se denomina PRAS que significa Pre-reduccin aerbic sistem. Aadiendo al medio un compuesto reductor como tioglicolato sdico el cual reduce el contenido del oxigeno. El tioglicolato reacciona con el oxigeno y mantiene las enzimas en forma reducida, se usa en medio liquido y tambin en agar cuando se utilizan placas de Brewer. Jarras de anaerobiosis: Es el mtodo ms utilizado, consta de un sobre generador de hidrogeno y CO2 el cual acta combinando el hidrogeno con el oxigeno contenido en la jarra para formar H2O que se observa en las paredes de esta., tiene tambin un catalizador de grnulos de paladio que puede ser generado colocndolo al homo por dos horas antes de ser nuevamente usado y un indicador de anaerobiosis que nos sirve para controlar la presencia de O2 en la jarra.
Atmosfera de CO2 (jarra con vela) Todas las bacterias requieren la presencia de pequeas cantidades de dixido de carbono para su crecimiento, este normalmente proviene de la atmsfera o de procesos de oxidacin y fermentacin de la propia clula. Otras bacterias (por ej. Brucella abortus, Listeria sp), por el contrario, requieren mayores concentraciones de este compuesto (5 a 10%), que deben ser suministradas creando un ambiente definido en el medio de cultivo (Microaeroflicos). Para crear una atmsfera de CO2 se utiliza una jarra con vela, incubando siempre a 37 C. Algunas bacterias requieren un ambiente hmedo (por ej. Neisserias), el cual se logra colocando dentro de la jarra una gasa hmeda. Para las bacterias que requieren una atmsfera de CO2 con bastante humedad (ej. gnero Haemophilus), puede ser obtenida colocando un vaso de precipitado pequeo con 50 a 80 mL de agua destilada estril dentro de la jarra de incubacin. Microscopio Enfoque del microscopio con objetivo de 10x Seleccionar el objetivo, empezar con aumento de 10X. Colocar la preparacin sobre la platina. Encender la fuente de luz, graduar la iluminacin desplazando el condensador de forma adecuada y regulando el diafragma. Bajar suavemente hasta llegar casi a la preparacin, sin hacer contacto con ella. Colocar los ojos en el ocular accionando el tornillo micromtrico comenzar a subir hasta que aparezca la imagen. Repetir los ltimos dos pasos. Accionar el micromtrico, para asegurar la nitidez de las sucesivas imgenes en la retina.
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Accionando el revlver se puede pasar a la utilizacin de un objetivo de mayor aumento, para conseguir un correcto enfoque, mover ligeramente el micromtrico. Moviendo la platina recorra toda la preparacin para realizar una correcta observacin.
Enfoque con el objetivo de inmersin o 100x. Se deben cumplir los siguientes requisitos: - El condensador debe estar arriba. - El diafragma abierto totalmente. - El extendido coloreado debe llevar una gota de aceite de inmersin. Se debe lograr que el objetivo 100X toque la gota de aceite, con la ayuda del tomillo micromtrico. Luego con el micromtrico se le da nitidez a la imagen. Al concluir la microscopa, se limpia el objetivo con papel arroz, para quitar los residuos de aceite. Se coloca el objetivo de 10X en lnea con el ocular y se baja el condensador
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PRCTICA No 3. DETERMINACIN DE FLORA AMBIENTAL, PARTE I MORFOLOGA BACTERIANA Y TINCIN SIMPLE OBJETIVO Adquirir mediante diferentes procedimientos una apreciacin de la diversidad de microorganismos presentes en el medio ambiente y en el humano. Capacitacin al estudiante en la elaboracin de extendidos o Frotis a partir de un cultivo de microorganismos obtenidos de medios lquidos y slidos. Identificacin de diferentes tcnicas de tincin de microorganismos Al finalizar la prctica, el estudiante estar en capacidad de hacer preparaciones para realizar exmenes por microscopa ptica, utilizando la tcnica de montaje hmedo y una tcnica de tincin simple reconociendo la morfologa de los microorganismos que se estudiaran en la prctica.
INTRODUCCION Hay dos grandes problemas que dificultan la observacin Morfologa Colonial de Bacterias El crecimiento bacteriano en una superficie slida presenta caractersticas de cultivo llamadas: morfologa colonial. Una colonia se define como una masa visible de microorganismos, todos originados de una slo clula madre, de manera que una colonia constituye clones de bacterias, todas genticamente similares. Los siguientes adjetivos pueden usarse para describir la morfologa colonial o caractersticas de cultivo: 1) Tamao: medido en milmetros; menos de 1mm = puntiforme 2) Forma: Circula, Irregular, Filamentosa, Rhizoide y Ondulada 3) Margen: (la forma del contorno de la colonia): Entero, Ondulada, Lobada, Irregular, Concntrica, Arrugado, Circular irradiado, Filamentoso (filiforme), Ciliado. 4) Propiedades pticas: Opaca, Translcida y Transparente y Brillante (mucoide). 5) Elevacin: Elevada, Convexa, Plana, Gotiforme (forma de gota), Umbonada, Crateriforme. 6) Textura: Suave, Granular, Tenaz, Mucoide. 7) Pigmento: Hialino a colores blanquecinos, y de amarillos a rojos
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Forma Puntiforme Elevacin Circular Filamentosa Rizoide Irregular Spindle
Plana
Raised
Convexa
Pulvinate
Umbilicada
Margen Entero Ondulada Lobulada Erosionada Filamentosa Rizada
En el laboratorio de Microbiologa, el elemento ms frecuentemente usado es el microscopio. Para el estudio de los microorganismos existen dos formas de realizar las preparaciones microscpicas. La primera es la suspensin de los organismos en un medio lquido (montaje hmedo), la segunda, utilizando pelculas o frotis secos de la muestra, fijados y teidos. a. Tcnica de Montaje Hmedo: Permite observar las clulas y organismos en general, con vida y sus movimientos, estructuras, etc. Pueden montarse con soluciones buffer, solucin salina isotnica, caldos de cultivos, etc. Para ello se coloca una gota de fluido que contiene el organismo sobre la lmina portaobjeto y se cubre con la laminilla cubre objetos y esta preparacin se observa al microscopio. b. Preparaciones fijas y coloreadas. Las tcnicas de tincin utilizan pelculas o frotis secos de la muestra, los cuales son sometidos a un proceso de teido, empleando compuestos orgnicos coloreados. Las coloraciones se usan para diferenciar morfolgicamente algunos tipos de microorganismos para estudiar estructuras celulares. Hay por tanto coloraciones simples, diferenciales y estructurales. En la coloracin simple se usan colorantes bsicos, cidos y diluidos obtenindose un solo tono en la preparacin. En la coloracin diferencial se aprovecha el hecho que los microorganismos difieren tanto fsica como qumicamente, reaccionando de distinta manera ante los colorantes. De este modo, las tcnicas diferenciales permiten distinguir los diferentes tipos de bacterias. La tincin de Gram es la tcnica de coloracin diferencial ms utilizada en Microbiologa. TINCIN SIMPLE La Tincin Simple es la tincin en que se utiliza un solo colorante, como colorantes utilizaremos el azul de metileno o la safranina, ambos de naturaleza bsica. Al realizar esta tincin, podemos observar, formas, distribucin y tamao relativo de las clulas. En su estado natural los microorganismos unicelulares como las bacterias se presentan al microscopio como esferas o bastoncillos incoloros, Transparentes, difciles de observar, por ello para observarlas con nitidez y estudiarlas se deben teir con colorantes de anilina.
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Preparacin de extendidos a partir de medios lquidos mtodo Seleccione un portaobjeto libre de ralladuras y de grasa. Mezcle la suspensin bacteriana contenida en el tubo de ensayo, esterilice el asa, enfrela e introdzcala en el tubo que contiene cultivo bacteriano. Tome una gota de la suspensin con el asa en aro, colquela en la lmina portaobjetos, extindala usando para ello el asa y tratando de obtener un extendido homogneo, deje secar a temperatura ambiente.
Preparacin de extendidos a partir de medios slidos mtodo. En el medio slido las bacterias no se encuentran en suspensin (dispersas) como lo estn en medio lquido, por el contrario se encuentran agrupadas en la superficie de los medios slidos, contenidos en la caja de petri, formando colonias. Coloque una gota de solucin salina sobre el portaobjetos con el asa estril fra. Tome una pequea porcin de la colonia, realice una emulsin homognea con la gota de solucin salina y los microorganismos contenidos de la porcin de la colonia. Extienda la emulsin en el centro del portaobjetos de manera uniforme, homogneo y delgado. Deje secar a temperatura ambiente, proceda a fijarlo. Nunca se debe secar el extendido con ayuda del mechero.
Mtodos de fijacin. Fsico: Se hace a travs de calor, calentando el extendido suavemente sobre la llama del mechero, realizando dicha operacin por el lado opuesto al que se encuentra el extendido. Esta operacin se debe repetir 2 o 3 veces poniendo como testigo la palma de la mano, para que el calor no sobre pase la temperatura tolerable por el dorso de la mano. Deje enfriar antes de someterlo al proceso de coloracin. Qumico: El proceso de fijacin qumico consiste en baar el extendido con fon no I, eta coloracin. formol, etanol o metanol, se deja secar y luego se realiza el proceso de coloracin.
MATERIALES Material de Bioseguridad y trabajo (Guantes, Batas, Tapa bocas) Jabn Toallas para manos Fsforos Cinta para enmascarar Lpiz de cera
Laminas porta objeto Material de trabajo para la prctica Cultivos de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas: Streptococcus spp, Escherichia coli, Bacillus spp Medio de cultivo: agar plate count (PC) o agar Sabouraud (S) Mechero Asas redonda y recta Escobillones Agua estril Cubetas de tincin o similar. Aceite de inmersin Microscopio Estufa de bao Mara Azul de metileno o Cristal violeta
Staphylococcus
aureus,
PROCEDIMIENTO Marcar correctamente las cajas: Fecha, nombre o grupo, determinacin o prctica Determinacin de la flora ambiental Escoger el sitio Marcar el material Destapar los medios de cultivo PDA o S y dejarlo expuesto al medio ambiente por un tiempo de 20 minutos. Incubar la caja con el medio a temperatura ambiente de 3 - 5 das
Tincin Simple La tcnica es la siguiente: 1. 2. 3. 4. Hacer el frotis, secarlo y fijarlo. Cubrir con colorante la preparacin y dejarlo actuar durante un minuto. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante. Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo de inmersin (100x) empleando el aceite apropiado. 5. Esta tcnica permite observar la morfologa y tamao de las bacterias, as como los tipos de agrupaciones que forman. Tinta china 1. Hacer una suspensin de microorganismos y agregar una gota de tinta china o nigrosina (en un porta objeto). 2. Emulsionar y cubrir con una laminilla 3. Observar al microscopio con objetivo de 40X
4. MORFOLOGA BACTERIANA Puede resumirse en las siguientes formas: Esfricas (cocos) Diplococos (parejas) Estreptococos (cadena) Estafilococos (racimos) Ttradas (grupos de cuatro) Sarcinas (paquete o acmulos cbicos) Bacilos nicos Diplobacilos (parejas) Estreptobacilos (cadenas) Bacilos en forma de letras o de paquetes Los extremos de los bacilos pueden ser: Redondos, Cuadrados, Afilados
Cultivo:
Aumento total:
Forma: cocos, bacilos, etc. Agrupamiento de clulas: solos, en pareja, cadenas, etc...
Cultivo:
Aumento total:
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Cultivo:
Aumento total:
INFORME Realice un informe anotando de manera resumida lo obtenido y observado en el laboratorio Dibuje lo observado BIBLIOGRAFIA Aquiahuatl RMA, Prez CM. Manual de prcticas del Laboratorio de Microbiologa General. 1 ed. Mxico D.F: Universidad Autnoma Metropolitana; 2004. Hernndez J, Meja G. Manual de Prcticas de Bacteriologa I. Cartagena: Universidad de San Buenaventura; 2004. Madigan, M., Martinko, J. and Parker, J. 2001. Brock biology of microorganisms 8a edition. Prentice Hall, New Jersey.
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PRCTICA No 4. DETERMINACIN DE FLORA AMBIENTAL, PARTE II FUNDAMENTO DE LA TINCIN DIFERENCIAL Y SELECTIVA OBJETIVO Aprender las tcnicas de coloracin mediante las cuales se clasifican la mayora de las bacterias, dependiendo de la composicin qumica de la pared celular y a su vez conocer su valor e importancia en el diagnostico presuntivo de los diferentes procesos infecciosos. Clasificacin de bacterias en microorganismos Gram positivo (violeta) y Gram negativo (rosado) de acuerdo a la tincin de Gram. Identificacin de estructuras importantes como endosporas y capsulas en tinciones selectivas
INTRODUCCION Tincin diferencial La tincin diferencial requiere ms de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir entre varios tipos de clulas bacterianas. Una tincin diferencial tpicamente consiste de tres pasos principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teir a todas las clulas en la tincin; enseguida un paso de decoloracin, el cual remueve el colorante solo de ciertos tipos de clulas y finalmente un colorante de contraste, el cual tie las clulas recin decoloradas pero no tiene efecto sobre las clulas que an retienen el colorante primario. Coloracin de Gram La tincin propuesta por el mdico dans Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales ms utilizadas en bacteriologa, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. La reaccin de la tincin de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes celulares de estas bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas de peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen molculas de cido teicoico. El cido teicoico reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tincin. Un complejo de las molculas cristal violeta-yodo-cido teicoico es muy difcil de remover. Como la pared celular de las clulas Gram positivas retiene estos compuestos, es ms difcil decolorar una clula Gram positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve el cristal violeta de la clula Gram negativa, pero no de la Gram positiva. Esta mezcla de alcohol tambin disuelve mucho de la capa exterior de lipopolisacrido de la pared celular de la pared Gram negativa, lo cual acelera la remocin del colorante primario cristal violeta de estas clulas. Cuando otro colorante, usualmente safranina, se aade, las clulas Gram positivas siguen de color azul-violeta mientras que las Gram negativas absorben el color rojizo de la safranina. Al final del procedimiento de tincin, las clulas Gram positivas sern del color del cristal violeta, o colorante primario, y las clulas Gram negativas sern del color de la safranina que es el colorante de contraste.
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Una segunda explicacin aceptable de por qu las bacterias reaccionan en forma diferente frente al Gram es: Las bacteria Gram positivas tienen menor porcin de lpido, mientras que las Gram negativas tienen un alto porcentaje de lpidos (por lo tanto, la pared de las Gram negativas es ms delgada). Mientras que en las Gram negativas el tratamiento con alcohol extrae lpidos con lo cual aumenta la porosidad de la pared celular arrastrando consigo al complejo cristal violeta-yodo y por ello se decoloran captando fcilmente el colorante de contraste. Por su bajo contenido en lpidos, la pared celular de las Gram positivas se deshidratan durante el tratamiento con alcohol disminuyendo la porosidad y por tanto el complejo cristal violeta-yodo no se logra extraer. Otra explicacin es la siguiente: En las Gram positivas el complejo cristal violeta yodo se retiene despus del tratamiento con alcohol debido probablemente a una disminucin de los enlaces del peptidoglucano de su pared. Mientras que las Gram negativas contienen en su pared menor cantidad de peptidoglucano con ligaduras cruzadas ms extensas y por ello al ser sometidas al proceso de decoloracin arrastran al complejo CV-1 tomando fcilmente el colorante de contraste. Las bacteria Gram negativas son ms estables en su reaccin al Gram que las Gram positivas, estas bacterias cuando provienen de cultivos viejos, pierden su capacidad de retener el complejo CV-1 comportndose como Gram negativas, Estos defectos tambin pueden deberse a variaciones en la tcnica. La Tincin De Gram es la tincin diferencial ms utilizada en Bacteriologa y requiere cuatro soluciones: Primer colorante. Es un colorante bsico que en contacto con las clulas cargadas negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El ms utilizado es el cristal violeta. Solucin mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las clulas. Los mordientes empleados suelen ser sales metlicas, cidos o bases, como, por ejemplo, una solucin diluida de yodo. Agente decolorante. Es un disolvente orgnico, por ejemplo, alcohol-acetona (1:1). Colorante de contraste. Es un colorante bsico de distinto color que el primer colorante, como, por ejemplo, la safranina. Los dos grupos bacterianos a los que anteriormente nos referamos difieren en el color con el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram positivas se teirn de azul por el cristal violeta y no perdern esta coloracin durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perdern la coloracin inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teirn de rosa debido a la safranina. La diferencia est determinada por la composicin de su envoltura celular. Las bacterias Gram positivas poseen una malla de Peptidoglicano en su parte ms externa, mientras que las bacterias Gram negativas, recubriendo una fina capa de Peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la clula.
Coloracin para acido alcohol resistente Las coloraciones para cido alcohol resistente son: Ziel Nelsen o Kinyou.
La coloracin de Ziel Nelsen o cido resistente es una coloracin diferencial, ya que distingue los bacilos cido alcohol resistente de los dems. Bs uno de los mtodos ms usados para descubrir bacilos tuberculosos del esputo de pacientes con dicha enfermedad. En esta coloracin se somete el extendido a calentamiento ya que los bacilos cido alcohol resistente tienen una pared celular crea, esta debe reblandecerse para que el colorante penetre rpidamente y no pueda ser arrastrado durante el tratamiento con alcohol cido. Observacin de las tinciones de bacterias al microscopio. Las bacterias Gram-positivas presentarn una coloracin violeta mientras que las Gramnegativas la presentarn roja o rosa. La identificacin de las bacterias Gram-positivas puede ser problemtica, solamente cuando las bacterias Gram-positivas se encuentran en crecimiento exponencial (cultivos jvenes) la reaccin es clara; en fase estacionaria (cultivos viejos) las bacterias Gram-positivas pueden parecer Gram-negativas. Tinciones selectivas Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composicin qumica, de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ej.; tincin de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden utilizarse uno o ms colorantes MATERIALES Material de Bioseguridad y trabajo Guantes Batas Jabn Toallas para manos Tapa bocas Fsforos Cinta para enmascarar Lpiz de cera Laminas porta objeto Cultivos de bacterias Gram-positivas: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae Cultivos de bacterias Gram-negativas: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas Spp Cultivo de bacterias esporuladas: Bacillus subtilis Muestra de esputo (paciente con gripa) Mechero
Material de trabajo para la prctica
Asas redonda y recta Escobillones Solucin salina Cubetas de tincin o similar. Colorantes para tincin de Gram: Cristal violeta, Lugol, Alcohol-Acetona (1:1) y Safranina, Azul de metileno Colorantes para tincin de Ziehl Neelsen: Fucsina acida, Alcohol acido y Azul de metileno Verde de malaquita Lminas porta objeto Microscopio Aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO Marcar correctamente las placas / portaobjeto: cepa Tincin De Gram El mtodo de tincin es el siguiente: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Se prepara el frotis, se seca y se fija. Se cubre con cristal violeta durante un minuto. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante. Se cubre con lugol un minuto (El lugol acta como mordiente aumentando la afinidad del colorante por la bacteria) Lavar con agua el exceso de lugol. Se gotea alcohol-acetona de forma continua hasta que la preparacin deje de perder color y se lava enseguida con agua abundante. Se cubre la preparacin con un colorante de contraste, como la safranina, durante un minuto. Se lava con agua y se seca al aire, observndose a continuacin con el objetivo de inmersin. Nota: El orden en que se agregan los colorantes debe respetarse de lo contrario se pierde la diferenciacin de las bacterias.
Tincin de Ziehl Neelsen / Coloracin para acido alcohol resistente 1. Prepare un extendido a partir de una muestra de esputo, tomando para ello un escobilln hacindolo rotor suavemente sobre el porta objeto. Dejar secar. 2. Cubrir el extendido con fucsina por 5 minutos. Calentar la lmina suavemente de manera que emitan vapores, sin secar el colorante. No permita la ebullicin. 3. Lave con agua corriente 4. Aplicar alcohol cido durante 2 minutos. 5. Lavar con agua corriente
6. Cubrir la lmina con azul de metileno por 3 minutos 7. Lavar y dejar secar. Observar al microscopio con aceite de inmersin. Nota: Los bacilos cido alcohol resistente se descubren fcilmente, aparecen de color rosado, debido a su cido resistencia, retienen el colorante primario despus del tratamiento con alcohol cido. Los bacilos no cido alcohol resistente toman el colorante de contraste al igual que las otras estructuras que aparecen en la preparacin. Tincin diferencial 1. Cubrir la extensin con papel de filtro (dificulta la precipitacin del colorante sobre las bacterias). 2. Depositar la preparacin sobre una platina de Koch. Aadir verde de malaquita. Esperar un minuto 3. Seguir la tincin con calor: en emisin de vapores durante 5-10 minutos. Dejar enfriar. 4. Lavar con agua abundante. Secar. 5. Teir con safranina (dos minutos). Lavar con agua. Secar. Observar con objetivo de inmersin Nota: observe las esporas teidas de verde y clulas vegetativas teidas de rosa. Observar la forma, tamao relativo y posicin de la espora en la clula vegetativa
Cultivo:
Aumento total:
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Cultivo:
Aumento total:
Cultivo:
Aumento total:
PREGUNTAS Qu es un frotis y para que se utiliza? Qu es una tincin? Qu estructura permite la coloracin de las bacterias? Cules gneros no pueden ser coloreados por la tincin de Gram? Cul es la razn de ello? Qu reaccin de Gram darn los cultivos de levaduras? Estos resultados tendrn la misma importancia que para las bacterias? Por qu? 6. Qu es un mordiente? Mencione ejemplos 7. De ejemplo de 3 bacterias Gram positivas y 3 bacterias Gram negativas
1. 2. 3. 4. 5.
INFORME Realice un informe anotando de manera resumida lo obtenido y observado en el laboratorio Dibuje lo observado BIBLIOGRAFIA Aquiahuatl RMA, Prez CM. Manual de prcticas del Laboratorio de Microbiologa General. 1 ed. Mxico D.F: Universidad Autnoma Metropolitana; 2004. Hernndez J, Meja G. Manual de Prcticas de Bacteriologa I. Cartagena: Universidad de San Buenaventura; 2004.
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PRCTICA No 5. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVOS OBJETIVOS Aprender la preparacin de los medios de cultivos y conocer su composicin, qumica consistencia y utilidad como potenciadores del crecimiento bacteriano.
INTRODUCCION Entre los requisitos para el trabajo con microorganismos estn los cultivos y la tcnica asptica. Dado la ubicuidad de los microorganismos y la existencia de endosporas termoresistentes se han desarrollado varios procesos de esterilizacin, es decir eliminacin o destruccin de todo organismo vivo. As todo objeto esterilizado est libre de organismos viables capaces de reproducirse, la destruccin de endosporas termoresistentes se realiza a temperaturas mayores de 100C, aplicada mediante vapor a alta presin, no alcanzables con el agua lquida. La esterilizacin con vapor a presiones superiores a la atmosfrica se logra en las autoclaves. Usualmente se utiliza para esterilizar medios de cultivo y soluciones a 121oC, 15 lb (1,2 atm) de presin por 15 20 minutos. Temperaturas mayores pueden ocasionar destruccin de los componentes de los medios de cultivo. Soluciones con antibiticos o vitaminas usualmente se esterilizan por filtracin en membranas. Algunos medios requieren la esterilizacin por separado de fuentes de carbono, para evitar caramelizacion del medio y reacciones que inhiban el crecimiento de los microorganismos. Medio de Cultivo Un medio de cultivo es un ambiente propicio en nutrientes necesarios para aquellos microorganismos que son transferidos desde un producto al medio (siembra) o desde un medio de cultivo a otro medio de cultivo (repique) con ayuda de pipetas, escobillones o asa estril crezcan y se multipliquen. Los medios pueden contener sustancias naturales o sintticas, lquidas, semislidas o slidas destinadas al mismo fin, favorecer el crecimiento y multiplicacin bacteriana. Entre los medios de cultivos naturales estn: Las leches descremadas, lquido pleural y asctico, extracto de carne, etc. Los medios sintticos o qumicamente definidos deben llenar las siguientes exigencias: Fuente de energa: Por oxidacin de compuestos qumicos o usar energa radiante. Fuentes de Carbono: Como carbohidratos (Azucares y otros hidratos de Carbonos). Fuentes de Nitrgeno: Como protenas y sus productos de degradacin. Sustancias qumicas: En pequeas concentraciones tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, hierro, zinc y manganeso. Vitaminas. Lquidos: No contienen agar, el medio lquido tpico es el caldo nutritivo. Slidos: Contienen agar en una proporcin de 1.5 a 2.5 gr. %, le da la consistencia slida. Ejemplo: agar sangre, agar EMB,
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Los medios de cultivo segn su consistencia se dividen en:
Semislidos: Contienen de 0.5 a 1.0 gr. % de agar, lo que le da la consistencia pastosa o trmula. Ejemplo: Medio de SIM, agar movilidad. Medios Simples: Son aquellos medios destinados a favorecer el crecimiento de microorganismos poco exigentes. Medios Complejos: Son medios simples a los que se le agregan sustancias destinadas a poner de manifiesto algunas propiedades de los microorganismos. Estos medios se dividen en: - Enriquecidos: Son medios simples a los que enriquecemos con ciertos productos (sangre, suero bovino, liquido asctico, etc.) que permiten el aporte de factores de crecimiento, en bacterias exigentes. Son distintos para cada tipo de bacterias. Ejemplo: agar sangre, agar chocolate. - Diferenciales: Son aquellos en los que no slo crecen determinadas bacterias, sino que, adems, stas, al actuar sobre algunos de los componentes especficos del medio, demuestran algunas de sus propiedades. Por ejemplo, si al medio se le adiciona un carbohidrato y un indicador y la bacteria es capaz de fermentar dicho carbohidrato, se producir una acidificacin, con el consiguiente cambio de pH. Dentro de ellos, existen dos tipos: nicos, aquellos en los que slo se va a poder demostrar una determinada caracterstica del microorganismo, tal como la utilizacin de un sustrato o la posesin de una enzima. Ejemplo de estos medios es el citrato de Simmons, medio de urea. Combinados, aquellos en los que se detectan varias caractersticas de una forma simultnea. Ejemplo: kligler, TS1, LIA, SIM. - Medios Selectivos: Se obtiene adicionando al medio simple compuestos qumicos, que son nocivos para las bacterias cuyo crecimiento no interesa. Ejemplo: agar SS, Bismuto sulfito. Medios de Transporte: Medios utilizados para asegurar la viabilidad de las bacterias desde el momento en que se toma la muestra, hasta su posterior siembra en el laboratorio o para su envo de un laboratorio a otro. Ejemplo: medio de Stuart, Clary Blar. Extracto de Carne: Contiene sustancias de tejido animal soluble en agua, tales como: Hidratos de carbono, compuestos orgnicos nitrogenados, vitaminas y sales. Peptonas: Compuestos nitrogenados orgnicos. Agar: Hidratos de carbonos obtenidos de algunas algas marinas con poder gelifcante y sin valor nutritivo. Extractos de Levaduras: Es fuente de vitamina E.
Segn sus componentes los medios se dividen en simples y complejos.
Componentes mnimos de los medios de cultivos
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Propiedades de los medios de cultivos Fertilidad: (Elementos necesarios que estimulan el crecimiento bacteriano) Transparencia. Humedad. Esterilidad. PH ptimo (6.5 a 7.5) Conservacin inadecuada. Medios de cultivos vencidos. Determinacin incorrecta del peso. Medicin incorrecta del agua. Uso de material de vidrio contaminado con detergentes o productos qumicos. Mezcla incompleta de ingredientes. Sobrecalentamiento en cualquier momento durante la preparacin, esterilizacin, fusin repetida de medios slidos. Determinacin incorrecta del pH. Almacenamiento: Dentro de lo posible los medios de cultivo deshidratados debern conservarse en lugares secos protegidos de la luz, a una temperatura entre 15 y 30C y siempre bien cerrado. Bajo condiciones ptimas de almacenamiento los medios de cultivo deshidratados conservan sus cualidades durante 5 aos como mnimo a partir de su fabricacin. S tras el periodo de almacenamiento ms Prolongado se presenta una alteracin del pH puede reajustarse su valor. Preparacin: para la preparacin se utiliza agua limpia recin destilada cuya reaccin sea lo ms posible cercana al pH neutro, los recipientes utilizados para la preparacin deben estar escrupulosamente limpios, deben ser lo suficientemente grandes para que el medio que se prepara pueda ser agitado con facilidad. No es recomendable preparar ms de 1 a 2 litros por recipiente, el medio de cultivo deshidratado se aade aproximadamente la mitad de la cantidad necesaria de agua y se agita para conseguir una suspensin homognea, despus se incorpora la cantidad de agua restante. Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento por esto no debe calentarse ms de lo estrictamente necesario. Algunos medios de cultivo muestran una turbidez inevitable, para estos hay que procurar una turbidez homognea. Ajuste de pH: Cuando se utiliza agua neutra para la preparacin de los medios muestran el valor de pH indicado para cada uno de ellos. Si se procede a hacer la correccin, aadir al medio de cultivo la cantidad calculada de una solucin de cido clorhdrico 1N o de hidrxido de sodio 1N segn el caso.
Fuentes de error en la preparacin de medios de Cultivos
Condiciones para el almacenamiento y preparacin de medios de cultivo
Esterilizacin: Se lleva a cabo en autoclave a 121C a 15 libras de presin durante 15 minutos, la esterilidad se consigue cuando se ha desalojado el aire del autoclave y esto se logra manteniendo abierta la vlvula de purga durante el comienzo de la fase de calentamiento del autoclave. Vertido en placa: Para evitar la condensacin de agua en la tapa de la caja de petri debe verificarse la temperatura del medio debe estar entre 45- 55C, para ser servido, las burbujas de aire en la superficie de la placa deben abanicarse brevemente con el mechero. Tubos de agar inclinado: Cuando el medio de cultivo esterilizado esta todava lquido dentro del tubo se colocan en posicin inclinada y se dejan solidificar de esta manera. Conservacin de medios de cultivo: Los medios de cultivo ya preparados tienen un periodo de conservacin limitado, a 4 -5C, cuando se va a prolongar su conservacin se recomienda almacenarlos a unos 12 o 15C. Los medios de cultivo no deben guardarse a temperaturas por debajo de 0C por que se altera la estructura del gel, deben protegerse de la luz, de la deshidratacin, para ello se coloca cinta adhesiva en el borde lateral. La perdida de agua puede provocar precipitados o hacer que se cristalicen ciertas sustancias del medio de cultivo, as como originar grietas en la superficie del agar.
MATERIALES Agar papa dextrosa (PDA). Cilindro de vidrio o madera de aproximadamente 1.5 cm de dimetro. Estufa o plancha con agitador magntico Balanza Agua destilada Medios deshidratados: Agar nutritivo (AN), Agar Sabouraud (S), caldo nutritivo Cajas de petri estriles Tubos de ensayo 10 x 170 mm (o similar) o tubos para cultivos Erlenmeyer Probetas Pipetas Beaker Filas Papel kraft o de reciclar Vidrios de reloj Esptula Autoclave Estufa Guantes de cuero Gasa
Cinta indicadora Cinta de enmascarar Medios de cultivo: lquidos, semislidos, inclinado y slidos. Cepas de diferentes microorganismos Mecheros Asas Lpiz de cera
PROCEDIMIENTO Pasos en la preparacin de medios de cultivos slidos Los medios de cultivo se pueden preparar a partir de sus componentes o de medios deshidratados. Los volmenes a preparar se calcular para cajas y tubos bacteriolgicos estndar, as:
Tubo inclinado Volmenes a calcular Tubo con caldo Caja de petri
Pesar (regla de 3) Medir PH del agua Hidratar Calentar Esterilizar
1. Preparar 170 ml de AN, a partir de medio deshidratado. 2. Pese en la balanza la cantidad requerida segn la frmula (ver envase del medio e instrucciones). 3. Coloque el polvo deshidratado en el interior del erlenmeyer. 4. Vierta el agua. Mezcle hasta homogenizar. Hierva el medio. 5. Vierta 5 ml en cada uno de los tubos (10 tubos), ponga el tapn o tapa y colquelos verticalmente en una canastilla. Estos servirn para preparar los tubos con medio inclinado a en cuna, despus de la esterilizacin en la autoclave. 6. Tape el resto del medio del erlenmeyer y coloque este en la olla interior de la autoclave. Un segundo grupo preparara caldo nutritivo (50 ml)
1. Repita los pasos anteriores 1 5, con los componentes apropiados. Nota: No hervir el caldo 2. Sirva 10 tubos de ensayo (5 ml cada uno) tpelos y colquelos en la canastilla o en un recipiente plstico (esterilizable). 3. Ponga el tapn de gasa y algodn al resto del medio del erlenmeyer. 4. Coloque el material as preparado en la autoclave. Para ambos medios 1. Esterilice por 15 minutos a 121C. 2. Una vez esterilizados los medios saque los recipientes y deje enfriar hasta unos 45 50C (el calor del recipiente debe ser tolerable al tacto). 3. Sirva el AN restante en las cajas de Petri, para ello, se abren estas cerca del mechero a unos 10 cm de distancia y se vierte el medio (que queden con un espesor menor de 2 mm). 4. Los tubos con el medio fundido se inclinara sobre la barra de vidrio procurando que quede en un fondo de 1 cm y que la superficie inclinada o extendido no quede cerca del tapn. Esterilizacin por calor hmedo (vapor) y alta presin en la autoclave. 1. Reconozca inicialmente las partes de la autoclave. 2. Verifique el nivel del agua de la cmara de vapor. Este debe estar siempre por encima de la resistencia, y de 12 cm por debajo de la parrilla. Coloque el recipiente de aluminio en la cmara de esterilizacin y en el interior de esta el disco difusor de vapor (disco con perforaciones). 3. Introduzca el material a esterilizar. Nota: El lquido en recipientes debe ser menor de 1/3 de su capacidad. 4. Coloque la tapa introduciendo la manguera del manmetro en el interior del canal de la olla interior y ajuste est en posicin orientada (ver flecha y ranuras grabadas exteriormente). La vlvula de salida del vapor debe quedar abierta (palanquilla en posicin vertical). 5. Encienda la autoclave y posicione la temperatura en alto. Proceda a purgar la cmara de esterilizacin evacuando el aire. Para esto permita que se caliente el agua y salga una corriente continua de vapor unos 2 minutos. As se arrastra el aire y la cmara queda saturada con vapor puro. 6. Cierre la vlvula del vapor (palanquilla en posicin horizontal). 7. Espere que llegue el manmetro a presin y temperatura de esterilizacin (121C y 15 libras/pulg2 o 1 atm/cm2). 8. Regule el termostato. Gire la perilla hasta que se apague el bombillo del termostato. 9. Esterilice por unos 15 minutos. En general el tiempo requerido para la esterilizacin depende de los volmenes de los lquidos y el tipo de materiales (1-3 litros/30 min).
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10. Terminado el tiempo de esterilizacin apague el equipo y espere a que baje la presin a cero. 11. Destape la autoclave (en algunos casos se requiere palanca). Retire el material (use guantes aislantes de calor) y en condiciones aspticas cerca del mechero, dispense el medio fundido (45-50C) en las cajas de Petri. Coloque los tubos en posicin inclinada. PREGUNTAS 1. 2. 3. 4. Qu es un medio de cultivo y para que se utiliza? Que es el agar y cul es su procedencia? Que es un medio cultivo natural y sinttico? Escriba el nombre y formula de sustancias que son utilizadas en los medios de cultivo como fuentes de; carbono, nitrgeno, fosforo y azufre 5. Qu factores fsicos y qumicos pueden afectar la estabilidad de los medios de cultivo? 6. Esquematice un autoclave e indique sus partes 7. Cul es el mecanismo por el cual el vapor saturado a presin mata los microorganismos? 8. Cuales son los mtodos ms corrientes utilizados para esterilizar? 9. Ciertos organismos poseen la estructura biolgica ms termoresistentes, para supervivencia. Cual es y en que microorganismos se encuentra? 10. Que significa termorresistencia en microbiologa? 11. Usualmente, como se esterilizan las cajas de Petri y las pipetas? 12. Cmo se verificara que un medio de cultivo procesado en la autoclave quedo realmente esterilizado? 13. Por qu un caldo no se hierve despus de ser preparado? 14. Explique cules son las diferencias entre esterilizacin, desinfeccin y asepsia.
BIBLIOGRAFA Aquiahuatl RMA, Prez CM. Manual de prcticas del Laboratorio de Microbiologa General. 1 ed. Mxico D.F: Universidad Autnoma Metropolitana; 2004. Arenas, r: 2000. Micologa mdica ilustrada. Mc Graw-Hill, Mexico French, E. and Henert, t: 1982. Mtodos de investigacin fitopatolgica, Instituto Iberoamericano de Cooperacin para la Agricultura (IICA) San Jos Helms, R., Helms, C., Kosinski, R. and Cummings, J. 1998 ALL AMERICAN STEREOAUTOCLAVE 25X. Instructions and supplies. Biology in the laboratory, 3th edition, W,H. Freeman and company Madigan, M., Martinko, J. and Parker, J. 2001. Brock biology of microorganisms 8a edition. Prentice Hall, New Jersey. Microbiology Manual 2002 Darmstadt, Merck pp. 187, 207
INFORME Realice un informe anotando de manera resumida lo obtenido y observado en el laboratorio
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PRCTICA No 6. SIEMBRAS OBJETIVOS Aprender la preparacin de los medios de cultivos y conocer su composicin, qumica consistencia y utilidad como potenciadores del crecimiento bacteriano. Aprender a inocular medios de cultivo lquido, semislidos y slidos y conocer las diferentes manifestaciones de crecimiento bacteriano, necesarios para hacer el correcto aislamiento de un microorganismo implicado en un proceso infeccioso.
INTRODUCCION En la naturaleza, los microorganismos viven casi siempre en comunidades microbianas. No obstante, antes de poder determinar la mayor parte de las caractersticas de un microorganismo en particular, este debe ser aislado en un cultivo puro o axnico. El procedimiento general consiste en usar un medio de cultivo y condiciones de crecimiento que estimulen el crecimiento del organismo que se desea y que reduzcan o afecten el crecimiento de otros organismos. Una vez el organismo deseado ha aumentado en cantidad con respecto a otros, se purifica de modo que el cultivo contenga solamente organismos del tipo deseado Tipos de siembra Inoculacin por estras en placas de agar: La inoculacin de diferentes estras en una placa de agar, se usa fundamentalmente para aislar cultivos puros de muestras que contienen flora mixta. Inoculacin en tubos con agar inclinado: El agar inclinado es un tubo de ensayo comn que contiene agar, el cual durante el proceso de enfriamiento se coloc en posicin inclinada. Se usa para aislar microorganismos aerobios y anaerobios y para la observacin de algunas caractersticas de cultivo, como la produccin de pigmentos y reacciones bioqumicas de los microorganismos. Inoculacin en medios lquidos: Los medios lquidos se utilizan para obtener un crecimiento rpido y masivo de las bacterias. Este crecimiento se puede presentar en alguna de las siguientes formas: - Enturbiamiento - con opacidad ms o menos densa. - Formacin de pelcula - velo o nata en la superficie del cultivo. - Sedimento - Depsito de bacterias en el fondo del tubo. - Cambio de color del medio - debido a pigmentos bacterianos solubles en agua. - Formacin de flculos - dan aspecto de migas de pan suspendidas en medio lquido. Inoculacin en Medios Semislidos: Este tipo de inoculacin se usa fundamentalmente para observacin de la movilidad de algunas bacterias. Inoculacin en masas: Este tipo de inoculacin se utiliza para poder hacer un recuento total de las colonias que se desarrollen en el agar. La inoculacin se realiza cuando el agar est fundido (45C) de modo que las bacterias no slo se desarrollan en la superficie sino en todo el medio.
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MATERIALES Placas (cajas de Petri) con colonias de microorganismos: S. aureus, E. coli, K. pneumoniae, Streptococcus Cajas de agar nutritivo (AN). Tubos con medio inclinado de AN. Asas bacteriolgicas. Papel absorbente. Guantes. Gradillas. Incubadora. Cmara de flujo laminar (opcional). Colorante de Gram: cristal violeta, solucin de yodo, alcohol acetona, safranina. Aceite de inmersin. Lpiz de cera PROCEDIMIENTO 1. Desinfecte la superficie con papel absorbente y alcohol. Use guantes. 2. Encienda el mechero y disponga el material requerido. 3. Marque externamente en la placa, la colonia seleccionada para el aislamiento o purificacin. (Describa la morfologa de la colonia). 4. Marque la placa de AN en el exterior de la caja de la base y hacia el borde, as: Iniciales del medio. Fecha. No de referencia de la muestra (o cdigo). 5. Siembre el medio por la tcnica de estriado y agotamiento de la muestra:
Trace una T en el exterior y base de la caja para dividirla en tres sectores (a, b, c) y siembre de la siguiente manera: 5. Divisin de la caja en sectores. En los crculos se esteriliza el asa o se hunde en el medio y se contina con la siembra en estras y agotamiento de la muestra. Nota: No debe hablar cuando est realizando una siembra ni exponer los medios al aire fuera del rea asptica, unos 12 cm alrededor del mechero. TENGA CUIDADO CON EL MECHERO.
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6. Esterilice el asa por flameo en la llama y en la base del mango. Espere 15-20 segundos a que se enfre (puede tambin enfriar punzando el medio de cultivo). 7. Tome la caja con una mano y cerca del mechero, brala en forma de bisagra, y con la otra toque con el asa la colonia a sembrar. 8. Tome la placa de agar nutritivo y siembre en el sector a. 9. Deslice el asa con el anillo paralelo a la superficie del medio. Estre masivamente teniendo cuidado de no arar el medio. 10. Cierre la tapa. 11. Sumerja el asa en el frasco con el desinfectante o solucin germicida (esta NO DEBE SER INFLAMABLE). 12. Esterilice el asa en la llama y a partir de la ultima estra del sector a estre nuevamente, pero sin sobre poner lneas, sobre la superficie b. 13. Sumerja nuevamente el asa en el desinfectante. 14. Con el asa previamente flameada, arrastre de la ltima estra del sector anterior y siembre finalmente en serpentina en el sector c. 15. Sumerja el asa brevemente (medio minuto) y flamela antes de colocarla en la mesa. 16. Con la muestra restante realice un extendido y aplique coloracin de Gram. 17. Observe al microscopio la morfologa bacteriana. Incubacin 18. Coloque la caja sembrada en la incubadora en posicin invertida a 37C durante 24-48 h. Evaluacin Una vez crecidas las colonias, en condiciones aspticas, tome con el asa una de ellas y verifique si estn en cultivo puro. Realice un frotis y coloracin de Gram. Compare los resultados con los de la muestra original. Si se logro obtener un cultivo puro, siembre este, en un tubo inclinado de AN. PREGUNTAS 1. Usted tiene un cultivo lquido mixto y desea obtener cultivo puro. Como procedera? 2. Que es una colonia bacteriana? 3. A que se le denomina cepa en microbiologa? 4. Que es un cepa pura? Investigue instituciones que se encarguen de venderlas. 5. Morfolgicamente, que tipos de colonias bacterianas existen? 6. Que informacin proporcionan el desarrollo de bacterias en medios lquidos y semislidos? INFORME Realice un informe anotando de manera resumida lo obtenido y observado en el laboratorio
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PRCTICA No. 7 RECUENTO EN PLACAS DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC) OBJETIVOS Conozca los diferentes mtodos de recuentos de microorganismos Adquiera destreza en la interpretacin de los resultados Aplique adecuadamente estas tcnicas en el anlisis de diferentes muestras.
INTRODUCCION El tamao de las poblaciones de bacterias puede estimarse al medir alguna actividad biolgica de la poblacin o al transferir los microorganismos en medios apropiados que les permita crecer en colonias visibles. Usualmente se requiere preparar suspensiones de las muestras y diluirlas. En el caso de muestras con pocos microorganismos, por ejemplo agua de la llave relativamente limpia, hay que concentrarlas mediante filtracin en membrana. Para la enumeracin de microorganismos de muestras se utilizan placas de conteo en medios de amplio espectro ya sea mediante la dispersin uniforme de la alcuota sobre el medio solido (siembra en superficie) o su incorporacin en el medio de cultivo (siembra a profundidad por vertido). Para conteos generales de bacterias y hongos (tradicionalmente denominada microflora), estn los medios de cultivo: agar extracto de malta (Malt Extract Agar-MEA) y agar placa de conteo (Plate Count Agar-PCA) Los microorganismos presentes en cualquier superficie o producto pueden ser determinado a travs de su inoculacin en medios de cultivos, para apreciar su desarrollo como unidades formadoras de colonias las cuales pueden ser cuantificadas por medio de un recuenta colonias en un contador de clulas o visualmente aplicando las respectivas reglas de recuento para presentar un informe de resultado en UFC/g o mL MATERIALES Placas de medio: cajas de petri con Agar Plate count (PCA) Gradillas con tubos de ensayo con 9mL de solucin salina peptonada esterilizada (SSP) al 0.1% para las diluciones Varillas de vidrio en L o esptulas de Drigalsky Baln con agar nutritivo fundido Frasco con desinfectante Cajas de petri estriles Pipetas de 1, 2 5mL esterilizadas Vortex Micropipetas de 100 y 1000 l o Pipetas estriles de un mililitro Muestra solida ( suelo, alimento) o liquida (agua de pozo) Gradilla, mechero, asas, tubos de ensayos, Balanza, esptula, pipetas o micropipetas, cajas de petri estril, cuenta grmenes Muestra a analizar. PROCEDIMIENTO 1. Tome 10 g de la muestra solida o 10 mL de la liquida
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2. Transfiera los 10 g de la muestra (o 10 mL) al erlenmeyer con 90 mL de diluyente. Agite por 5 segundos en el vortex o rote 20 veces el tubo entre las manos 3. A cada estudiante se le entregara 4 tubos de ensayo conteniendo cada uno 9 mililitro de SSP los cuales se marcaran con los nmeros del 1 al 4. 4. Despus de homogenizar la muestra, tome un mL, con una pipeta estril y adalo al tubo numero 1. Esta es la dilucin 10 1 o 1/10 5. Con otra pipeta estril mezcle y tome un mL del tubo numero 1 y adalo al tubo numero 2 esta es la dilucin de 10 2 o 1/100 6. Con otra pipeta estril mezcle la suspensin del tubo numero 2 y aada un mL de esta numero 3 esta es la dilucin 10 3 o 1/1000 7. Con otra pipeta estril mezcle la suspensin del tubo numero 3 y aada un mL al tubo numero 4 esta la dilucin 10 4 o 1/10000 8. Con otra pipeta estril mezcle la suspensin del numero 3 y tome un mL y pselo a caja de petri estril 9. Con otra pipeta estril mezcle la suspensin del tubo numero 4 y pselo a una caja de petri estril 10. Despus de agregar el inoculo a la caja de petri. Aada el agar plate count estril fundido y enfriado a 45C a cada una de las cajas mezclado, con movimientos suaves en la direccin de la aguja del reloj y luego en sentido contrario (3 movimientos en cada direccin) esto asegura una mezcla adecuada y proporciona buenas separaciones de las colonias. 11. Deje enfriar el agar hasta que solidifique e incbelo a 37C por 24 horas. 12. Cuente las colonias y de los resultados Conteo y Clculo 1. 2. selecciones las cajas que tiene entre 30 y 300 colonias. Coloque la caja de petri el cuenta colonias. Empiece a contar las colonias desde la parte superior de la caja, utilizando las cuadriculas para separarlas y evitar contar la colonia 2 veces Calcule el nmero de microorganismo por mL de muestra. Multiplicado el nmero de colonia por el factor de dilucin (RTG ~ numero de colonia x factor de dilucin), por ejemplo si cont 250 colonia en la dilucin 1:10000 se reporta as 250 x 10000 = 2500000 m.o/mL
3.
Nota: Los resultados sedan en nmeros de m.o por mL. S se toma 0.1mL de la muestra se debe multiplicar por 10 el nmero final de mo obtenido. PREGUNTAS Realizar las lecturas en cada uno de los medios de cultivos sembrados. Investigar cuales son los limites microbiologa aceptables para el tipo de alimento que
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analiz Segn el dato arrojado en los exmenes y aplicando el mtodo de muestre de dos clases verifique si su muestra es aceptada o rechazada Investigue que tcnicas existen para el conteo total de microorganismos, cual es su fundamento? Que tcnicas existen para el conteo de microorganismos vivos y en se basan? Para que se utilizan estas tcnicas en la industria o en la clnica? Investiga que mtodos comerciales existen para el conteo de bacterias, hongos y levaduras cul es su fundamento?
BIBLIOGRAFA FREEMAN, B: A: Microbiologa de Burrows. Ed. Panamericana, 22 Edicin 1986 MAC FADDIN J: Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica 1 edicin. Buenos Aires. Ed. Panamericana 1989 GILMA J LUNA. Manual operativo de anlisis microbiolgico para alimentos
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PRCTICA No 8. INFLUENCIA DE LOS AGENTES FISICOS EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO OBJETIVO Evaluar el efecto que presentan las diferentes condiciones fisicoqumicas sobre los microorganismo entre estas: temperatura, potencial de hidrogeniones, tensin de oxigeno que puedan favorecer o no el desarrollo de las diferentes especies microbianas. INTRODUCCION Debido a su pequeo tamao y a su estilo de vida individual, las clulas procarioticas sufren los cambios ambientales de un modo mucho ms directo e inmediato que las clulas de los organismos pluricelulares. A lo largo de miles de millones de anos, las bacterias han venido estando sometidas a diversas presiones ambientales, y han respondido evolutivamente creando numerosos mecanismos de adaptacin. Actualmente, las nicas formas de vida existentes en determinados ambientes extremos son exclusivamente procarioticas. Desafiando a nuestras ideas preconcebidas de lo que es la vida "normal", encontramos extraordinarios seres vivos unicelulares viviendo a pH muy cidos o muy alcalinos, medrando en salmueras y salinas, o reproducindose a temperaturas de ms de 100C y a grandes presiones. No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. As, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser neutras o beneficiosas para otra. Los principales tipos de factores a considerar se pueden desglosar de la siguiente manera: Agentes fsicos: temperatura, desecacin, radiaciones, ondas sonoras, presin hidrosttica y presin osmtica. Agentes qumicos: desinfectantes y antispticos, quimioterapicos de sntesis, y antibiticos. MATERIALES Cepas en caldo nutritivo (CN): Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa Medios de cultivos: - Agar nutritivo - Medios lquidos caldo nutritivo (pH: 3, 7, 11) Gradillas y elementos de trabajo asptico con microorganismos. Baos de agua a temperatura de ebullicin y 60C. Incubadora a 37C y nevera. Asas bacteriolgicas Pipeta de 10ml Aceite mineral o vaselina
PROCEDIMIENTO
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Influencia de la temperatura: Tome 3 cajas de petri con agar nutritivo, mrquelos (nombre del grupo, nmero, microorganismo, temperatura, fecha) y siembre o inocule la cepa bacteriana suministrada por el laboratorio. Incubar a las diferentes temperaturas (4, 25 y 37C) por 24 horas Tome 3 tubos de ensayo con caldo nutritivo con los diferentes pH (3, 7 11), mrquelos (nombre del grupo, nmero, microorganismo, temperatura, fecha) y siembre o inocule la cepa bacteriana suministrada por el laboratorio. Incubar a las 37C por 24 horas Tome 3 tubos de ensayo con caldo nutritivo, sembrar el microorganismo suministrada por el laboratorio. Agregar 2 mL de aceite mineral (permite las condiciones anaerbicas) Incubar a 37C por 24 horas
Influencia del pH:
Influencia de la tensin de oxgeno:
RESULTADOS Realice las lecturas respectivas del crecimiento bacteriano, evaluando la turbidez o no de los tubos, estime el crecimiento as: (-): Sin crecimiento. (+): Crecimiento escaso. (++): Crecimiento regular. (+++): Crecimiento abundante.
Temperatura
4C (
25C (
37C (
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pH
3( Tensin de oxigeno
7(
10 (
con aceite (
sin aceite (
PREGUNTAS - Realizar la lectura en forma correcta en cada uno de los tubos con los medios inoculados y confrontar con la teora - En los alimentos enlatados qu tipo de microorganismos pueden desarrollarse y por qu? - El limn y la naranja son frutas que pueden ser alteradas principalmente porque tipo de flora y por qu? - Define los siguientes trminos: psicrofilo, mesofilo, termfilo, halfilo, xerfilo y osmofilo - Que efecto tiene el pH sobre el crecimiento de los microorganismos? - Mencione otros agentes fsicos que pueden tener algn efecto en el crecimiento bacteriano BIBLIOGRAFA FREEMAN, B: A: Microbiologa de Burrows. Ed. Panamericano, 22 Edicin 1980 MARTNEZ MARA MERCEDES. Microbiologa Editorial UNAD
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PRCTICA No 9. INFLUENCIA DE LOS AGENTES QUIMICOS EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO OBJETIVOS 1. Comprender los resultados y explicar las diferencias en los resultados obtenidos al utilizar calor como medio para destruir las bacterias. 2. Realizar y explicar un diseo que compare la eficiencia de varios desinfectantes. INTRODUCCION La realizacin de la prctica en el campo medico o de los alimentos es fundamental conocer los principios bsicos de la esterilizacin y la desinfeccin. La seleccin de un determinado agente depende de la situacin especfica y si es necesario destruir a todos los microorganismos o solo algunas especies. La destruccin completa de todos los microorganismos presentes sobre cualquier material o dentro de l es indispensable en la preparacin de los medios de cultivo materiales de vidrio utilizados en el laboratorio y en la preparacin y envasado de alimentos. MATERIALES Bacterias o cepas conocida (bacillus) Caja de agar nutritivo con bacterias en estudio. 12 tubos de caldo BHI o Nutritivo 12 cajas de agar nutritivo o plate count 1 tubo con 1 mL de hipoclorito (Clorox) 1 tubo con un mL de etanol 70% 1 tubo con 1 mL de fenol (creolina) Pipetas de 1 mL Pipeteadores Gradillas Mechero Estufa Termometro Bao de maria.
PROCEDIMIENTO Efecto De La Temperatura: - Tomar una asada de bacillus spp y adicionarla en tres tubos con caldo nutritivo, y marcarlos como a, b y c, hacer lo mismo con la bacteria de la caja desconocida o en seguimiento. TRATAMIENTO TERMICO A B C Agua hirviendo Agua a 60 grados C No se somete a TTo TIEMPO DE TRATAMIENTO 30 minutos 1 Hora
Incube los tubos a 35 grados por 24 horas, haga la lectura por la aparicin de turbidez.
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Accin De Los Desinfectante: Tomar la caja de agar nutritivo con la bacteria desconocida, aislada por usted tome una asada e introduzcala en caldo nutritivo hasta obtener turbidez, luego marque tres tubos y adicione en cada uno de ellos 2 tipos de desinfectantes distinto asi: Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Hipoclorito Etanol Fenol 1 mL 1 mL 1 mL
De la suspensin bacteriana adicione, 0,5 mL a cada tubo con el respectivo desifectante. Una vez realizado el tratamiento siembre una asada de cada tubo en una caja de petri con agar nutritivo fraccionada en 3 y debidamente rotulada.
Blanco
5 min
Blanco
5 min
Blanco
5 min
Hipoclorito
Etanol
Fenol
Realice siembra en cada caja especificamente en cada cuadrante segn el tiempo estipulado de contacto de la bacteria con el respectivo agente quimico. Incube las cajas a 35 grados por 24 horas. Observe y registre los resutados para el respectivo informe. Clculo de la eficiencia germicida del desinfectante: La accin del producto desinfectante se expres como eficiencia germicida porcentual (% E), calculado de acuerdo a la siguiente frmula: Eficiencia (%) = (No - Nt ) / No x 100 donde No = nmero de microorganismos iniciales Nt = nmero de microorganismos sobrevivientes a tiempo t Como criterio de eficacia se utiliz lo estipulado por el test de Chambers, el cual considera como buen desinfectante un producto que, a la concentracin recomendada, cause un 99,999% de muerte a una cantidad entre 7,5 x 107 y 1,3 x 108 clulas / ml en 30 seg (9). PREGUNTAS 1. Cual temperatura permiti eliminar por completo el microorganismo estudiado o al menos se observ menos turbidez? En caso que no haya podido eliminarse por completo, qu otro mtodo fsico recomienda utilizar? Cul de los microorganismos utilizados resistira ms la accin de la luz Ultravioleta y por
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2.
qu? 3. 4. Cul de los desinfectantes utilizados elimin mejor al microorganismo utilizado y porqu? Cul fue el comportamiento observado para su bacteria en seguimiento? Haga un cuadro.
BIBLIOGRAFA - AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS ASSOCIAT1ON, WATER POLLUTION CONTROL FEDERATION, (APHA- AWWA- WPCFJ. Mtodos Normalizados para el anlisis de aguas potables y residuales. 19g_Edcn. Madrid; Daz de Santo S. A, 1995 - BERGEY'S Manual of Systematic Bacteriology. Wllklns and Wiikins. 1986. v.l. - BROCK, Thomas D y MADIGAN, Michael T. Microbiologa, a Edicin. Mxico: Prentice HHI Hispanoamericana. 1993. - DAZ -BAEZ, Mara Consuelo. Manual de Laboratorio de Microbiologa para ingenieros. Santa Fe de Bogot: Universidad Nacional de Colombia. 1994 - DAZ, Ramn: GAMAO, Carlos y LPEZ - GOi, Ignacio. Manual Prctico de Microbiologa. Barcelona: Masson, 5..A. 1995 - GUIA DE PRCTICAS DE LABORATORIOS DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Manual 1. Universidad de Cartagena. 1988 - HERNNDEZ, Edwin y TORANZQS, Gary. Protocolos para aislar Collfagos del agua. Puerto Rico: Laboratorio de Microbiologa Ambiental. Departamento de Biologa. 1993 KQNEMAN Elmer y RBERTS Helena. Micologa Prctica "de Laboratorio. Buenos Aires: Panamericana. 1.987 - LENNETE, E H; BALQWS, A HAUSLER, Wy SODOMY, H J. Manual de Microbiologa Clnica. 4a edicin, Buenos Aires: Panamericana, 1991 - MAC FADDIN J. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica, la edicin. Buenos aires: Panamericana. 1989
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PRCTICA No 10. IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados, llamados pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significa de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. MATERIALES Cultivo de bacterias de 24-48 horas Agua oxigenada Portaobjetos Pipeta Pasteur Tubos con vaselina estril Gradillas Asas bacteriolgicas Incubadora Coloracin de Gram: cristal violeta, lugol, alcohol acetona, fucsina Solucin salina estril Medios: agar Baird Parker y Manitol
PROCEDIMIENTO Prueba de la catalasa La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin del perxido de hidrogeno en agua y oxigeno. Se encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerbico y anaerbicos facultativos, excluyendo los estreptococos. Tcnica: En un portaobjetos se depositan una o dos gotas de agua oxigenada de 30 volmenes y se pone en contacto con ella una colonia de los microorganismos estudiar con ayuda del asa de siembra. Interpretacin La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con desprendimiento de burbujas. Esta prueba se emplea para diferenciar los gneros Micrococcus y Staphylococcus (catalasa positivo) del genero Streptococcus (catalasa negativo).
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En el caso de cocos Gram positivos, catalasa negativo, se trata del gnero Streptococcus u otros relacionados y estudiaremos la hemolisis agar sangre: - hemolisis (hemolisis incompleta, color verdoso) - hemolisis (hemolisis completa, incoloro)
En el caso de cocos Gram positivo catalasa positiva, se comprueba la utilizacin de la glucosa Utilizacin de Glucosa Es una prueba til para distinguir aquellos microorganismos que son incapaces de utilizar la glucosa anaerbicamente de aquellos que lo pueden hacer. Se utilizan dos tubos de medio de cultivo, que se hierven brevemente antes de utilizarlos para eliminar el oxigeno disuelto. Una vez atemperados, se inoculan con ayuda de una pipeta Pasteur, llegando al fondo y ascendiendo hacia la superficie. Dejar solidificar ambos tubos y recubrir uno de ellos con vaselina estril. Incubar a 37 C durante 48 horas. Interpretacin Las bacterias fermentadoras producen acido a partir de la glucosa independientemente de la presencia de oxigeno. Por tanto, los dos tubos viran a amarillo (+/+). En este caso se tratara de un microorganismo del genero Staphylococcus. Las bacterias oxidativas (metabolismo respiratorio) solo utilizan la glucosa en el tubo descubierto; dado que el medio es capaz de detectar la acidificacin producida por el CO2 disuelto solo virara a amarillo el tubo sin cubrir de vaselina (+/-). En este caso, se tratara de Micrococcus. Si no vira ninguno (-/-) la bacteria no utiliza la glucosa como fuente de carbono. Para la posterior identificacin de especies del gnero Staphylococcus recurriramos a otras pruebas bioqumicas, como son DNAasa y coagulasa. Prueba de coagulasa en tubo La coagulasa libre es un profermento que en presencia de protrombina y/o un factor del plasma sanguneo forma un complejo con actividad proteolticas que transforma el fibringeno en fibrina y produce la coagulacin del plasma sanguneo. Est relacionado con la virulencia. Tcnica realice una suspensin de varias colonias de un cultivo puro de 18-24 horas de incubacin en caldo nutritivo e incubar 18-24horas a 37C transcurrido el tiempo de incubacin, adicione en un tubo seco 0,1mL de la suspensin anterior agregue 0,2mL de plasma fresco e incubar a 37C observe a partir de las 4 horas siguientes la formacin del coagulo nota: generalmente el Staphylococcus aureus puede coagular el plasma en un tiempo de 4 horas, en ocasiones puede demorar de 8 a 16 horas. Si el tiempo de incubacin se prolonga por ms de 24 horas debe tenerse en cuenta que la produccin de estafiloquinasas por
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algunas cepas de Staphylococcus aureus puede lisa el coagulo formado, dando resultados falsos negativos. PREGUNTAS 1. Qu es una enzima? 2. Cmo actan las enzimas? Que factores afectan su actividad? 3. En que se fundamenta y como se realizan las siguientes pruebas: CAMP, coagulasa, catalasa, bilis esculina, resistencia a la novobiocina y optoquina 4. Diga el fundamento y composicin de los siguientes medios a) Agar manitol b) Agar Baird Parker BIBLIOGRAFIA Aquiahuatl RMA, Prez CM. Manual de prcticas del Laboratorio de Microbiologa General. 1 ed. Mxico D.F: Universidad Autnoma Metropolitana; 2004. Bentez L, Lpez L. Fundamentos terico-prcticos en el aislamiento e identificacin bacteriana. Cartagena: Universidad de San Buenaventura; 2002.
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PRCTICA No 11. IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS. DETERMINACION DE CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES EN AGUA OBJETIVO Determinar la presencia de Clostridios sulfito reductores en agua por el mtodo de recuento en tubo. INTRODUCCION Se consideran Clostridios sulfito reductores aquellas bacterias de morfologa bacilar, Gram positivas, anaerobias estrictas, capaces de formar esporas y con actividad sulfito reductora. La determinacin de stos se basa en el recuento del nmero de colonias de esporas con capacidad sulfito-reductora, desarrolladas en un medio especfico, incubadas en condiciones anaerbicas durante un tiempo y a una temperatura determinada. MATERIAL 1 Muestra de agua (100 mL), ya sea de consumo clorada, "natural limpia" "residual", por cada equipo. 4 Tubos de 18 x 159 mm estriles. Bao de agua con temperatura constante a 50 C. Bao de agua con temperatura constante a 80 C 4 Tubos de 20 x 200 mm conteniendo cada uno 15 mL de agar sulfitopolimixinasulfadiazina (SPS) aun fundido, mantenindolos en un bao de agua a 50 C con el objeto de que permanezcan a esa temperatura y al mismo tiempo para eliminar el aire. 3 Pipetas de 10 mL estriles. Gradillas para tubos de 18 x 150 mm y de 20 x 200 mm. Mechero Bunsen. Cerillos encendedor. Parafina vaselina estril.
PROCEDIMIENTO 1. Agitar vigorosamente la muestra para homogeneizar. 2. A partir de la muestra previamente homogeneizada tomar alcuotas de 10 mL con una pipeta estril y depositarlas en cada uno de los tubos estriles. 3. Una vez que estos tubos contienen los 10 mL de agua, mantenerlos en un bao de agua a 80 C durante 5 minutos a efecto de que se destruyan las formas vegetativas y permanezcan solamente las formas esporuladas. 4. Tomar los tubos con SPS agar a 50 C y proceder a su inoculacin profunda, de la siguiente manera:
- Con una pipeta estril tomar 5 mL de dicha agua e introducirla hasta el fondo del tubo que contiene el agar. - Con mucho cuidado se va depositando el agua a lo largo de todo el tubo desplazando la pipeta al exterior procurando que el total de la muestra quede en el agar y no se airee. - Rpidamente pasar el tubo a la llave del agua para enfriarlo. - Despus aadir una capa de vaselina parafina estril de unos 3 mm de espesor para conseguir condiciones de anaerobiosis. - Este procedimiento se repite con los 3 tubos restantes. - Es aconsejable rotular cada tubo convenientemente. NOTA: Si se sospecha que el agua est muy contaminada, se puede inocular 5 mL de muestra en un tubo y 5 mL de las diluciones 10-1, 10-2.......... 5. Una vez inoculados todos los tubos, incubar a 37C (1C) durante 24 h (2 h). 6. Transcurrido el perodo de incubacin, contar las colonias de color negro que aparezcan en la totalidad de los cuatro tubos inoculados. INTERPRETACION Y PRESENTACION DE RESULTADOS: Efectuado el recuento en los tubos correspondientes, el resultado obtenido se calcular de la siguiente manera: - Si se han sembrado 20 mL de muestra, el resultado es directo. - En caso de haber realizado diluciones, se aplica la siguiente frmula: Nmero de esporas de clostridios sulfito-reductores/20 mL = (Nmero de colonias/volumen real de la muestra inoculada en mL) x 20. LOS RESULTADOS SE EXPRESARAN ASI: Nmero de esporas de clostridios sulfito-reductores: ____/20 mL. EJEMPLOS: a) Los resultados obtenidos en la determinacin, en agua, de esporas de clostridios sulfitoreductores son los que se especifican a continuacin: Volumen de muestra Tubo inoculada (mL) 5 1 5 2 5 3 5 4 Nmero total de colonias: 5 + 3 + 2 + 4 = 14 Volumen total de muestra inoculada = 20 mL. Nmero de colonias 5 3 2 4
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El resultado es directo y por tanto se expresar: Nmero de esporas de clostridios sulfito-reductores: 14/20 mL. b) En el anlisis de una muestra de agua fue necesario efectuar diluciones para la determinacin de esporas de clostridios sulfito-reductores, obteniendo los siguientes resultados: Volumen de muestra inoculada(mL) 5 0.5 0.05 0.005 Tubo 1 2 3 4 Nmero colonias Incontables 13 7 0 de
Los tubos en los cuales se ha realizado el recuento de colonias son los nmeros 2 y 3, por tanto: Nmero total de colonias: 13 + 7 = 20 Suma de los volmenes de muestra inoculados: 0.5 + 0.05 = 0.55 Se aplica la frmula general: (20 colonias/0.55 mL) x 20 = 727 El resultado se expresar: Nmero de esporas de Clostridios sulfito-reductores: 727/20 mL. CUESTIONARIO 1. Por qu las colonias de clostridios sulfito reductores son de color negro en el agar SPS? 2. A qu se debe la posible presencia de Clostridios sulfito reductores en agua? 3. En qu otro medio se pueden encontrar difundidos los Clostridios? 4. A qu se atribuye la patogenicidad de los Clostridios? 5. Mencionar 5 especies de Clostridios.
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PRCTICA No 12A. IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS OBJETIVOS El estudiante al terminar su laboratorio estar en capacidad de identificar la va metablica seguida por los microorganismos, conocer los sustratos y productos finales sintetizados por ellos, mediante el uso de los reactivos correspondientes, reconocer la accin enzimtica microbiana y de esta manera utilizarlos para realizar una identificacin veraz y oportuna de un microorganismo en una muestra biolgica. Hacer que el estudiante comprenda que la actividad bioqumica de las bacterias es la base indispensable para una correcta diferenciacin de las especies. lograr que el estudiante aprenda a realizar las pruebas bioqumicas ms adecuadas para la identificacin de las bacterias. Familiar al estudiante con el manejo de las tablas utilizadas para la lectura de las diferentes reacciones.
INTRODUCCION Medio de O. F.- Hugh - Leifson Los productos finales de la oxidacin no pueden ser detectados fcilmente en los medios utilizados para los procesos de Fermentacin por que su producto final son cidos dbiles que deben ser estudiados en medios especiales preparados para este fin. El medio utilizado es el medio de HUGH-LEIFSON (medio O.F.), cuya caracterstica principal es poseer un alto contenido del carbohidrato en estudio y una baja concentracin de peptona. Esta concentracin de peptona es menor que lo que contienen los medios Convencionales para que se reduzca la produccin de aminas alcalinas, que puedan neutralizar los cidos dbiles que van a formarse como resultado del metabolismo oxidativa del Carbohidrato. Este medio posee un indicador que es el azul de bromotimol que es verde a PH neutro, azul a PH alcalino y amarillo a PH cido. Carbohidrato: Glucosa Medio de TSI El agar TSl (Hierro tres azucares) es medio utilizado para la identificacin de microorganismos entricos. El medio de Kligler contiene dos azucares (Glucosa y lactosa). Adems de tiosulfato de Sodio y Sulfato Ferroso que sirve para detectar la presencia del gas H2S. La diferencia entre el Kligler y el TSl es que el TSI tiene adems 10 gr. De sacarosa. Son medios enriquecidos con extracto de levadura, de carne y de peptona de manera que puede crecer cualquier especie bacteriana (a excepcin de los anaerobios obligados). El medio se reparte en tubos que se enfran inclinados para obtener un bisel en pico de
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flauta y un fondo, de manera que haga una porcin expuesta al oxigeno (bisel) y otra protegida del aire que es relativamente anaerobia (El fondo). Para el estudio de estos medios se utilizan colonias individuales. La lactosa est presente en una concentracin de 10 a 1 en relacin con la glucosa. El medio tiene un indicador de PH que es el rojo de fenol, el cual a PH cido es amarillo y a PH alcalino es de color rojo. Como el H2S (Sulfato de Hidrogeno), es incoloro debe utilizar un indicador para que pueda ser detectado, este indicador es el Sulfato Ferroso. Formacin del H2S El Tiosulfato de Sodio presente en el medio dona los tomos de azufre para la formacin del H2S. Los tomos de Hidrogeno se obtienen de la degradacin de la Glucosa. Para visualizar el ILS las sales de Hierro utilizadas se precipitan formando un compuesto negro insoluble de Sulfato Ferroso, se necesita un medio cido para que se produzca el H2S. En estos medios tambin se puede leer la produccin de gas por parte de las bacterias el cual se visualiza por ruptura del agar y produccin de vaco. Se debe tener cuidado de no introducir el asa hasta el fondo para no romper las condiciones anaerobias de este. Medio de MR-VP Las reacciones del Rojo de metilo y Voges Proskauer son reacciones que se utilizan para determinar vas alternas, que puede utilizar la bacteria para el metabolismo de la Glucosa a Piruvato. Estas vas son la acida mixta y la butil englicolica. El medio utilizado es el medio MRVP. Estas pruebas se usan para diferenciar Microorganismos de la familia enterobacteriacea. Va acida Mixta (MR) Los microorganismos que utilizan esta va mantienen un PH menor de 4.4 a pesar del Buffer que contiene el medio, por que producen cidos fuertes. Se comportan como roja de metilo positivo (MR+). El indicador de la reaccin es el rojo de Metilo que a PH 4.4 es rojo y a PH de 6.0 es amarillo. De rojo de Metilo se le debe adicionar 5 gotas y leer inmediatamente. Va butilenglicolica (VP) Aqu se detecta la formacin de Acetilmetil Carbinol como subproducto de la va butilenglicolica en presencia de oxigeno atmosfrico y de KOH 40%. Los microorganismos que siguen esta va metabolizan la Glucosa para producir Acetoina que en presencia del oxigeno atmosfrico y KOH al 40% se transforma en diacetilo. El alfa naftol acta como catalizador.
Tcnica: Se le adiciona al tubo 0.6 mL de alfa naftol al 5% y 0.2 mL de KOH al 40%, agita el tubo para oxigenar el medio y se deja reposar de 10 a 15 minutos. La presencia de un anillo de color rojo se considera positiva, no debe leerse despus de 1 hora. Medio De LIA (Lisina Hierro Agar) En este medio se pueden leer las siguientes reacciones: Descarboxilacin de la Lisina, desaminacin de la Lisina (Proteus), produccin de H2S, produccin de Gas y fermentacin de Glucosa. Sirve para detectar la presencia de dos enzima: Lisina descorboxilasa y Lisina desaminasa. Descarboxilacin de la lisina Esta ocurre en el fondo del tubo donde hay condiciones anaerobias, alcaliniza el medio y da un color violeta. La reaccin que se lleva a cabo es la siguiente: La Lisina por accin de la Lisina descarboxilasa, se convierte en cadaverina + CO2 (Productos alcalinos). Para que ocurra la Descarboxilacin debe haber acidificacin del medio (debe haber ocurrido fermentacin de glucosa). Si esta presenta la enzima Lisina descarboxilasa el medio vuelve al color violeta original. Si la enzima no existe el medio quedar de color amarillo en el fondo indicando que solo ocurri fermentacin de Glucosa. Desaminacin de la lisina Aqu se produce el cido Alfacetocarbonico que al combinarse con las salas de hierro presentes en el medio y el oxigeno forman un color violeta rojizo. El medio se debe sembrar doblemente (hacer doble puncin), por que la reaccin es lenta. Indicador prpura Bromo Cresol PH cido - Amarillo Neutro Morado / Rojo Medio de SIM El medio de SIM (sulfuro, Indol, movilidad), se pueden visualizar las siguientes reacciones: Produccin de Indol, H2S, y Movilidad. El Indol es un compuesto que resulta de la degradacin metablica del aminocido Triptfano por accin de la enzima Triptofanosa produce Acido pirvico, amoniaco e Indol como producto final. La prueba se evidencia por medio del reactivo de Kovacs. Se considera positiva cuando se forma un anillo de color rojo lo cual nos indica que el Indol ha reaccionado con el grupo aldehdo del reactivo de Kovacs (5 gotas). La prueba se lee inmediatamente. Se considera negativo la ausencia del anillo de color rojo.
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Medio De Urea Se til para ver la produccin de ureasa por los microorganismos. La enzima produce hidrlisis de la urea con formacin de CO2 y amoniaco, virando el color inicial del indicador (rojo de fenol), por alcalinizacin del medio de amarillo a rosado claro o rosado intenso segn sea el grado de hidrlisis que se presente. El medio base de urea se obtiene comercialmente y se prepara de acuerdo a las instrucciones del medio de cultivo, se esteriliza en autoclave a 121C, 15 libras de presin por 15 minutos y se deja enfriar hasta que alcance una temperatura de 50C para agregar una solucin estril de urea al 4% PH final 6.8, mezclar muy bien, evitando la formacin de espuma, dispensar en tubos de rosca estriles y dejar solidificar en posicin inclinada debe inocular en superficie por estras con colonias aisladas del microorganismo desconocido. Observar al cabo de 24 horas de incubacin a 37C, el viraje del indicador rojo de fenol presente en el medio al hidrolizarse la urea. Medio De Citrato Algunos microorganismos pueden obtener su energa por vas distintas de la degradacin de carbohidratos; es el caso de aquellas bacterias que obtienen su energa a partir del citrato sdico que es un metabolito del ciclo de los cidos tricarboxilicos. Los medios para observar la utilizacin del citrato deben estar desprovistos de protenas y carbohidratos. Cuando un microorganismo utiliza el citrato como nica fuente de carbono se producen sustancias alcalinas que hacen virar el indicador del medio (azul de bromotimol), hasta un color azul. El medio incluye el citrato sdico como fuente de carbono y fosfato de amonio como fuente de nitrgeno. Las bacterias que utilizan el citrato tambin son capaces de extraer el nitrgeno de la sal de amonio y producen amoniaco (NH3), que luego se convierte en hidrxido de amonio (NH4OH). Procedimiento El medio inclinado se inocula con asa en punta la cual lleva el microorganismo en estudio que debe ser sembrado por una sola picadura y en el bisel del medio. Se incuba entre 35 37 C por 24 a 48 horas. Al finalizar la incubacin el desarrollo de un color azul indica una prueba positiva con la formacin de productos alcalinos lo que hace virar el indicador (azul de bromotimol), tambin se considera positiva la prueba si hay crecimiento en la lnea de siembra aunque no haya viraje del indicador; pues para que el crecimiento de un microorganismo sea visible debe estar en fase logartmica, lo cual solo es factible si el microorganismo ha utilizado el carbono y el nitrgeno del medio. Este resultado puede ser confirmado incubando el tubo por 24 horas en el que aparecer el color azul.
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Algunas veces pueden aparecer colonias pequeas de color amarillo que son el resultado de degradacin de impurezas del medio, pero esta reaccin es de acidificacin y no se considera como positiva. Caldo nitrato Los organismos que reducen los nitratos tienen la capacidad de obtener oxigeno de los nitratos convirtindolos en nitritos y algunos pueden llevar la reaccin hasta obtener nitrgeno libre u otros productos por la reduccin. Procedimiento Inocular al medio con una asada del microorganismo e incubar 24-48 horas a 35-37C. Finalizada la incubacin aadir al medio 1mL de alfa naftilamina y 1mL de cido sulfanilico.
Interpretacin El desarrollo de un color rojo 30 segundos despus de aadir los reactivos revela la presencia de nitritos y significa una reaccin positiva para la reduccin de nitratos. La ausencia de color despus de agregar los reactivos puede indicar que la reaccin es negativa para la reduccin de los nitratos, o que la reaccin produjo compuestos diferentes de los nitritos tales como amoniaco, nitrgeno molecular, xido ntrico u xido nitroso, para detectar si la reaccin fue llevada hasta estos compuestos debe aadirse una pequea cantidad de polvo de zinc a todas aquellas reacciones incoloras. Al agregar el polvo de zinc, si aparece un color rojo esto indica que los iones del compuesto metlico redujeron los nitratos a nitritos de manera que la reaccin se considera negativa, si por el contrario el tubo no se colorea esto indica la presencia de compuestos diferentes a los nitritos pero que fueron obtenidos por la reduccin del substrato inicial que eran los nitratos y la reaccin se considera positiva. Los microorganismos llevan a cabo un conjunto de reacciones qumicas llamadas metabolismo las cuales pueden ser catablicas o energticas y anablicas o biosintticas reacciones que requieren para cumplir con sus funciones fisiolgicas de crecimiento y desarrollo en cualquier ambiente que se encuentren, estas reacciones permiten la caracterizacin especfica de cada especie para lo cual se le deben otorgar unos sustratos ideales para percibir la utilizacin de sus fermentos o enzimas para percibir la transformacin qumica cumplida por el microorganismo. MATERIALES Cepas Gram negativas: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas sp. Coloracin de Gram Portaobjetos Aceite de inmersin
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Microscopio Asas Solucin salina estril Agar TSI (triple azcar hierro) o kliger (dos azcar hierro) Agar citrato de Simmons Agar SIM Caldo RMVP Agar LIA Caldo o agar Urea Caldo nitrato Agar nutritivo Reactivo de kovacs Perxido de hidrogeno
Medios de Cultivo:
PROCEDIMIENTO La siembra para realizar las pruebas bioqumicas se realizan de la siguiente manera 1. Esterilic el asa de inoculacin 2. Toque una colonia de la muestra a analizar 3. Inocule el TS o kliger. Introduciendo e! asa hasta el fondo, luego squela y haga una estra en zig zag en la superficie del bisel 4. Sin tomar ms muestra y sin flamear la aguja. Inocule el agar citrato de Simmons 5. Introduzca la punta del asa hasta la mitad del contenido del medio SIM 6. Finalmente inocule los caldos de cultivo urea, MRVP, nitrato. RESULTADOS Compare y contraste los resultados con la tabla de identificacin bioqumica. Compare la identificacin bioqumica tericamente para que defina si los resultados esperados se obtuvieron Enumere posible causas de error y como corregirlo
PREGUNTAS 1. Investiga el fundamento de las siguientes pruebas bioqumicas: citrato de Simmons, catalasa, Kligler, fermentacin de carbohidratos, reduccin de nitratos, SIM, MIO, Hugh y Leifson, RMVP, hidrolisis de almidn, hidrolisis de la casena, Agar Baird Parker 2. Busca una tabla que contenga los resultados de las pruebas bioqumicas utilizadas para la identificacin de enterobacterias y esquematiza la identificacin de la cepa que fue suministrada en el laboratorio.
3. Investiga que rutas del metabolismo se utilizan para el catabolismo de las fuentes de carbono y nitrgeno. 4. Investiga que pruebas bioqumicas comerciales existen para la identificacin de microorganismos. 5. Cul es el fundamento de las pruebas que investigaste? BIBLIOGRAFA Hernndez J, Meja G. Manual de Prcticas de Bacteriologa I. Cartagena: Universidad de San Buenaventura; 2004. Aquiahuatl RMA, Prez CM. Manual de prcticas del Laboratorio de Microbiologa General. 1 ed. Mxico D.F: Universidad Autnoma Metropolitana; 2004. Winn WC, Allen SD, Janda WM, Koneman EW, Procop GW, Schrenckenberger PC, et al. Diagnstico microbiolgico. Texto y Atlas en color. 6a ed. Buenos Aires: Mdica Panamericana; 2008.
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TABLA AUXILIAR PARA IDENTIFICACION GLUC LACT Escherichia coli Shigella Edwardsiella Salmonella Citrobacter Klebsiella Enterobacter Hafnia Pantoea Serratia Proteus Morganella Providencia Yersinia Pseudomonas V: variable + + + + + + + + + + + + + + + + V + + V SAC V V V + + + GAS H2S RM VP INDOL CITRATO UREA + + + + + + + V + V + V + + V + + + + + + V V V + + + + + + + + V + V + V + V V V V + + V + + + + V + V + + V + V V + + V + MOT + + + + + + + + + + + + LDC + + + + V + + -
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PRCTICA No 12B. COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGUA DE CONSUMO HUMANO OBJETIVO Investigar la presencia de bacterias del grupo Coliforme en agua de consumo humano mediante la tcnica del Nmero Ms Probable (NMP), usando tubos de fermentacin mltiple. INTRODUCCION La potabilidad del agua es de gran importancia en cuanto a Salud Pblica, ya que sta puede servir como vehculo de microorganismos patgenos, es decir, productores de enfermedades llamadas comnmente "de origen hdrico" tales como Salmonelosis (Tifoidea y Paratifoidea), Shigelosis, Clera, Hepatitis, etc. Estos microorganismos son todos de origen entrico. Se sabe que los microorganismos patgenos que llegan a los depsitos de agua, proceden de las descargas intestinales de hombres y animales. Adems, ciertas especies de bacterias, particularmente Escherichia coli, y varios microorganismos similares, denominados coliformes, Estreptococos fecales (como Streptococcus faecalis) y Clostridium perfringens, son habitantes normales del intestino grueso de hombres y animales y en consecuencia siempre estn en las materias fecales. As pues, la presencia de cualquiera de estas especies en el agua es evidencia de contaminacin fecal y el camino est abierto a los patgenos ya que se encuentran en las materias fecales. La evaluacin rutinaria del agua en busca de microorganismos patgenos, como Salmonella spp. y Shigella spp. puede ser difcil de realizar ya que el nmero de estas bacterias es relativamente escaso, por lo que se tiene que recurrir a pruebas bacteriolgicas del agua potable que demuestren la presencia de microorganismos indicadores que siempre estn presentes en materia fecal, fcil de demostrar y que sirva de gua para conocer el grado de contaminacin fecal. Surge as el concepto de "Indicador de contaminacin fecal", el cual ser utilizado para la valoracin de la potabilidad bacteriolgica de las aguas. De acuerdo con lo anterior, se ha adoptado con carcter general, el "Grupo Coliforme" como indicador ms digno de confianza. La OMS incluye dentro del grupo coliforme todos los bacilos aerobios y anaerobios facultativos Gram negativos, no esporulados, que producen cido y gas al fermentar la lactosa, a 35 37 C. Las especies clsicas de este grupo son Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. El microorganismo indicador ms comnmente utilizado es Escherichia coli, considerando la OMS preferible emplear la expresin "Coliforme fecal" que comprende un nmero ligeramente mayor de variedades, todas ellas de claro origen fecal e indicadores de contaminacin fecal reciente.
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Para los efectos del anlisis sanitario del agua, se define el Coliforme fecal como un bacilo aerobio o anaerobio facultativo, Gram negativo, no esporulado, que fermenta la lactosa con produccin de cido y gas a 44 C (0.5 C) en menos de 24 horas. El mtodo se basa en la inoculacin de alcuotas de la muestra sin diluir que pueden ser volmenes de 50, 10 y 1 mL, de 10, 1 y 0.1 mL, o diluida en caso necesario, en una serie de tubos por triplicado o quintuplicado con un medio que contiene lactosa (caldo lactosado o caldo lauril triptosa). La valoracin del contenido microbiano de una muestra de agua por el mtodo del NMP supone la utilizacin de tablas numricas que tienen en cuenta los volmenes de agua y las cantidades de tubos sembrados en una ms series. Realmente consiste en tratar estadsticamente el nmero de tubos de cada serie sembrada que resulten positivos despus de su incubacin. En cuanto a la investigacin de patgenos en agua, no existe un mtodo nico que permita aislar e identificar todos estos microorganismos. En general, los mtodos con los que se obtienen mejores resultados comprenden una fase de concentracin, seguida de tcnicas de enriquecimiento y aislamiento especficas para cada microorganismo. El procedimiento para la recoleccin de las muestras de agua para el anlisis bacteriolgico, depende del tipo de agua que se desee muestrear. Este se har de acuerdo a la normatividad mexicana vigente. Las muestras para el anlisis bacteriolgico, se deben tomar en frascos muestreadores que se hayan lavado con extremo cuidado y esterilizado. En su interior aadir, previo a la esterilizacin, 0.1 mL de solucin de Na2S2O3 (tiosulfato de sodio) al 10%, por cada 120 mL de muestra con el propsito de neutralizar la accin del cloro que pudiera contener la muestra, cubriendo adems el tapn del frasco hasta el cuello con papel aluminio. El anlisis bacteriolgico de la muestra debe practicarse inmediatamente despus de su recoleccin. Es por ello que se recomienda que de no efectuarse as el anlisis, se inicie dentro de las dos horas prximas a la recoleccin de la muestra y en ningn caso, este lapso debe de exceder de 24 horas para agua potable y de 6 horas para otros tipos de agua para que sea vlido el resultado del anlisis. Durante el perodo que transcurre del muestreo al anlisis, se debe conservar la muestra a 4 C, con objeto de inhibir la actividad bacteriana para no obtener resultados falsos o dudosos.
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MATERIAL Y SUBSTANCIAS Muestras de agua potable de diferente origen (Grifo, purificada y embotellada, tinaco, cisterna u otro), de un volumen mnimo de 100 mL. 5 Tubos de 20 x 180 mm con campana Durham en su interior, conteniendo 20mL de caldo lactosado lauril triptosa estril de doble concentracin. 10 Tubos de 18 x 150 mm campana Durham en su interior, conteniendo 10 mL de caldo lactosado estril de simple concentracin. 1 Pipeta de 10 mL graduada en dcimas, estril. 2 Pipetas de 1 mL graduadas en dcimas, estriles. 10 Tubos de 18 x 150 mm con campana Durham en su interior, conteniendo 10mL de caldo Lactosa bilis verde brillante (LBVB) estril de concentracin sencilla. 10 Tubos de 18 x 150 mm con campana Durham en su interior, conteniendo 10mL de caldo E.C. (Escherichia coli) estril de concentracin sencilla. Mechero Bunsen. Cerillos encendedor. Asa bacteriolgica. Gradillas para tubos de 18 x 150 y de 20 x 200. Agitador de tubos Vortex. Incubadora a 35 C. Bao Incubador para C. Fecales a temperatura constante de 44 C (0.5 C).
TECNICAS Descripcin de la metodologa de anlisis: La tcnica del NMP comprende siempre una prueba presuntiva y otra confirmativa. Esto es as porque una positividad en un tubo de la prueba presuntiva no indica necesariamente la presencia del grupo bacteriano a determinar (Coliformes Totales, Coliformes Fecales o Estreptococos Fecales), sino tan solo es una presuncin, que habr de confirmarse posteriormente. Sin embargo, una negatividad en la prueba presuntiva permite dictaminar la ausencia de dicho grupo bacteriano en el agua examinada. La denominada prueba presuntiva consiste en una metodologa de tipo general para cualquier grupo de bacterias, mientras que la prueba confirmativa es especfica. PRUEBA PRESUNTIVA: Todas las operaciones debern efectuarse en absolutas condiciones de asepsia. 1. Preparar tres series sucesivas de 5 tubos con caldo lactosado, una de doble concentracin y las otras dos de concentracin sencilla. 2. Etiquetar las series con 10, 1 y 0.1 mL.
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3. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces antes de tomar el volumen que se va a inocular, a efecto de homogeneizar. 4. Antes y despus de realizar las inoculaciones, la boca del frasco de la muestra deber ser flameada con objeto de evitar contaminacin. 5. Inocular con una pipeta de 10 mL este volumen de muestra en la serie de tubos con caldo de doble concentracin, con otra pipeta de 1 mL para 1 mL de muestra en la segunda serie de tubos con concentracin sencilla. Igualmente con la misma pipeta podr inocularse la tercera serie de tubos con 0.1 mL de muestra. 6. Normalmente, siempre que no se sospecha que el agua contenga elevada carga bacteriana, solo se inoculan estas tres primeras series de tubos. En caso contrario, ser necesario inocular otras series y por lo tanto, realizar diluciones de la muestra original. 7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 C durante 24-48 horas. 8. Despus de 24 horas de incubacin efectuar una primera lectura para observar si hay tubos positivos, es decir, con produccin de cido, si el medio contiene un indicador de pH, turbidez y produccin de gas en la campana Durham. Al hacer esta verificacin es importante asegurarse que la produccin de gas sea resultado de la fermentacin de la lactosa en cuyo caso se observar turbidez en el medio de cultivo y no confundir con burbujas de aire. Para evitar este tipo de confusiones es recomendable revisar las campanas Durham antes de proceder a la inoculacin y desechar aquellos que contengan burbujas de aire de alguna manera eliminar stas y as poder utilizarlos. 9. De los tubos que en esta primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las pruebas confirmatorias para coliformes totales y coliformes fecales. 10. En caso de no apreciarse alguno o todos los cambios mencionados en el resto de los tubos, continuarn en incubacin 24 horas ms. 11. Despus de 48 horas (2h) a partir de la inoculacin, se hace la lectura final. 12. Si pasadas estas 48 h tampoco se aprecia turbidez ni produccin de gas, los tubos se toman como negativos. INTERPRETACION: Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando la AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada. Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarn convenientemente y se proceder a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA para Coliformes Totales y Fecales.
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PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES: 1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitndolos previamente para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB). (Fig. 17.2) 2. Incubar durante 48 3 h a 35 0.5 C. 3. Despus de la incubacin observar la presencia de turbidez y de gas. INTERPRETACION: Si se observa turbidez y produccin de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el nmero de tubos positivos para posteriormente hacer el clculo del NMP. Si en ninguno de los tubos se observa produccin de gas, aun cuando se observe turbidez: Se consideran negativos, establecindose el Cdigo 0,0,0 para efecto del clculo del NMP.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES FECALES: 1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitndolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo E.C. (Escherichia coli). 2. Incubar durante 24 horas a 44 C (0.5 C), observar presencia de turbidez y gas. INTERPRETACION: Si se observa turbidez y produccin de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el nmero de tubos positivos para posteriormente hacer el clculo del NMP. Si no se observa produccin de gas, aun cuando se observe turbidez: Se reporta la AUSENCIA DE COLIFORMES FECALES.
CALCULOS. De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para Coliformes Totales y Fecales: Establecer los cdigos correspondientes para calcular por referencia en la tabla estadstica correspondiente (Tablas 12.1 12.4), el NMP de Coliformes Totales y Fecales en 100 mL de agua. En caso de no encontrar en las tablas la combinacin de tubos adecuada, emplear para los clculos la siguiente ecuacin:
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ELABORACION Y PRESENTACION DE RESULTADOS. Los resultados se elaboran de la siguiente manera: Si nicamente se inoculan tres series de cinco tubos cada una con 10, 1 y 0.1 mL de muestra, la lectura de los resultados nos permite tener dos cdigos de valores uno para coliformes totales y otro para coliformes fecales los cuales ledos en la tabla del NMP nos dar el valor de bacterias correspondientes en 100 mL de muestra, de manera directa. Si se han realizado diluciones, se ha de obtener una serie final con valor cero. A continuacin se establece el triplete de valores correspondiente a las tres series anteriores a la del valor cero que podr ser leda en la tabla del NMP. Para efectos de expresar el valor obtenido basndose en 100 mL de muestra habr de dividirse el resultado de la tabla por el volumen real de muestra inoculada en cada tubo de la serie central de cada triplete escogido. Se tendr un triplete de valores para cada tipo de determinacin.
En general se tiene:
Los resultados obtenidos se expresarn de la siguiente manera: NMP DE COLIFORMES TOTALES: __________ / 100 mL NMP DE COLIFORMES FECALES: __________ / 100 mL EJEMPLOS: 1. La lectura de los resultados obtenidos en el anlisis del agua de un grifo es la siguiente:
Con estos datos consultando la tabla del NMP correspondiente tenemos: Para coliformes totales los resultados obtenidos finalmente en la prueba confirmativa son: 4,2,1 que en la tabla nos indica un valor de 26 es decir el resultado ser: NMP DE COLIFORMES TOTALES: 26/100 mL.
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Para coliformes fecales el triplete de valores obtenido es: 2,1,0 y consultando la tabla del NMP se tiene el valor de 7. El resultado se expresar: NMP DE COLIFORMES FECALES: 7/100 mL 2. La lectura de los resultados obtenidos en el anlisis de un agua de la que fue necesario hacer diluciones, es la siguiente:
Para coliformes totales se establece el cdigo del triplete: 3,1,1 y consultando la tabla del NMP se observa un valor de 14, por lo tanto se tiene: 14 / 0.01 = 14 x 100 = 1400. NMP DE COLIFORMES TOTALES: 1400/100 mL Para coliformes fecales con el mismo razonamiento se establece el cdigo: 2,1,0 que en las tablas del NMP correspondientes se observa un valor de 7, por lo tanto se tiene: 7 / 0.01 = 7 x 100 = 700 El resultado se expresar: NMP DE COLIFORMES FECALES: 700/100 mL
CONFIABILIDAD El procedimiento de fermentacin en tubos mltiples es el mtodo ms usado por su facilidad y economa. El resultado de esta prueba se expresa por el nmero ms probable (NMP), pero debe entenderse que este mtodo no es exacto ya que slo nos da la probable densidad de bacterias coliformes totales o fecales de una muestra determinada. La confiabilidad est dada por los niveles superiores o inferiores del lmite de confianza al 95% establecidos en las tablas para cada NMP/100 mL, no obstante, es una indicacin importante para evaluar la calidad sanitaria del agua. CUESTIONARIO 1. Mostrar los clculos realizados para obtener el NMP de Coliformes Totales y Fecales en el agua analizada. 2. Cules son las caractersticas que debe reunir un Microorganismo Indicador? 3. Por qu el nmero de Coliformes Totales es siempre mayor que el de Coliformes Fecales?
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4. De acuerdo a la normatividad colombiana vigente Cules son los lmites permisibles en cuanto a Coliformes Totales y Coliformes Fecales en el agua para consumo humano? Dar los nmeros de las Normas Oficiales Colombianas correspondientes. 5. Por qu aun cuando los microorganismos patgenos se encuentran en poca concentracin en un agua stos pueden causar enfermedad?
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TABLA 12.1: Indice del NMP y lmite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan: 5 tubos con porciones de 10 cm3 en cada uno, 5 con porciones de 1 cm3 y 5 con porciones de 0.1 cm3.
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TABLA 12.2: Indice del lmite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan: 1 tubo con porciones de 50 cm3, 5 tubos con porciones de 10 cm3 y 5 tubos con porciones de 10 cm3.
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TABLA 12.3 Indice del NMP y lmite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan: 5 tubos con porciones de 50 cm3, 5 tubos con porciones de 10 cm3 y 5 tubos con porciones de 1 cm3.
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TABLA 12.4: Indice del NMP y lmite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan: 3 tubos con porciones de 10 cm3, 3 con porciones de 1 cm3 y 3 con porciones de 0.1cm3.
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PRCTICA No 13. OBSERVACION DE PARSITOS OBJETIVOS 1. Explicar los procedimientos de obtencin y manejo de materia fecal para realizar estudios microscpicos. 2. Describir los procedimientos de laboratorio frecuentemente usados en el diagnstico de parasitosis intestinales. 3. Describir el examen coproparasitoscpico directo en fresco. INTRODUCCION El diagnstico de las parasitosis intestinales depende del hallazgo de huevos, larvas o adultos de helmintos y quistes o trofozotos de protozoos en heces, por lo tanto, la recoleccin y el manejo adecuado de las muestras fecales son indispensables para la identificacin correcta de los parsitos en el laboratorio. Son factores que interfieren con el examen de las heces, la ingestin de medicamentos previa a su recoleccin y las muestras viejas o conservadas de manera inadecuada. La cantidad de materia fecal suficiente para un examen rutinario, es una muestra del tamao de una nuez o de dos o tres cucharadas soperas. La materia fecal se deposita en un recipiente de boca ancha con tapa hermtica y limpia; no debe contaminarse con agua, orina o cualquier otro material extrao; no debe obtenerse de la taza del bao ni del suelo. En lactantes, la muestra se obtiene mediante la cucharilla rectal, si el examen requerido es el microscpico en fresco. Las muestras, deben ser etiquetadas con el nombre del paciente, nmero de muestra, fecha y hora de coleccin. Generalmente, se recomienda examinar tres muestras, en das sucesivos, durante un periodo de siete a diez das. Dependiendo de la consistencia de la materia fecal, se elige el procedimiento para la bsqueda de trofozotos, quistes, ooquistes, huevos o larvas. Si las heces son blandas, diarreicas y lquidas, deben examinarse dentro de las dos primeras horas de haber sido recolectadas; si esto no es posible, se adiciona una solucin conservadora, por ejemplo: alcohol de polivinilo (PVA), merthiolate-iodo-formol (MIF) o Schaudin. Las heces formadas pueden ser examinadas durante el mismo da de su coleccin; si no es posible, pueden ser refrigeradas durante 24-48 h o conservadas en solucin de formaldehido 10%. La proporcin en que se usan las soluciones conservadoras, es de una parte de materia fecal y tres de la solucin; las heces pueden mantenerse as durante semanas o meses. Otras muestras tiles en la bsqueda de parsitos intestinales son el contenido duodenal, raspado perianal, aspirado rectal o material obtenido por rectosigmoidoscopia. Existe una diversidad de exmenes tiles en el diagnstico de parasitosis intestinales, la seleccin del examen adecuado, depender de la consistencia de la materia fecal o de los
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sntomas del paciente. Los exmenes frecuentemente utilizados son el directo en fresco y los de concentracin, que se basan en los principios fsicos de flotacin o sedimentacin. El examen en fresco es el ms sencillo y se recomienda para la bsqueda de trofozotos de protozoos, en muestras pastosas, diarreicas o lquidas. Los exmenes de concentracin se recomiendan para la demostracin de quistes, ooquistes, huevos o larvas. MATERIALES Para realizar el examen coproparasitoscpico en fresco: Frascos gotero con lugol. Frascos gotero con solucin de NaCl a 0.85%. Aplicadores de madera. Portaobjetos de 26 x 76 mm. Cubreobjetos de 22 x 22 mm. Microscopio. Diapositivas Muestra: traer muestra fecal de perros
PROCEDIMIENTO Coproparasitoscpico microscpico en fresco: 1. Colocar una gota de solucin NaCl al 0.85%, en un portaobjetos. 2. Con un aplicador obtener aproximadamente 2 mg de la materia fecal y mezclarla en la gota de solucin salina. 3. Hacer una suspensin uniforme y retirar los detritos macroscpicos. 4. Colocar un cubreobjetos y hacer la observacin microscpica inmediatamente con los objetivos 10X y 40X. 5. En otro portaobjetos colocar una gota de lugol y continuar como con la gota de solucin salina.
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PRCTICA No 14. OBSERVACION DE HONGOS OBJETIVOS Que el estudiante adquiera: Destreza en la identificacin de las estructuras de los hongos Desarrolla habilidad en el cultivo e identificacin de los hongos contaminantes del suelo, agua y aire Conocer e identificar algunos aspectos de la morfologa microscpica de los hongos filamentosos mediante la tcnica de microcultivo y el examen directo de los mismos.
FUNDAMENTO TERICOS Los hongos son microorganismo eucariotes sin clorofila, de mayor tamao y complejidad que las bacterias. Segn su morfologa los hongos se pueden dividir en dos grupos: mohos (hongos filamentosos) y levaduras que se encuentran difundidos en la naturaleza como saprofitos, parsitos y simbiticos, hetertrofos. Las levaduras son unicelulares y generalmente presentan reproduccin asexual por gemacin. Morfolgicamente, los hongos pueden presentarse como clulas ovaladas, alargadas, redondas o micelial y otros filamentosos o arborescentes; microscpicamente poseen un desarrollo aterciopelado, algodonoso y muy colorido dependiendo de la especie fngica que se trate. Los mohos presentan una estructura vegetativa denominada micelio, el cual est formado por una serie de tubos rgidos ramificados que reciben el nombre de hifas, dentro de los cuales se encuentra el citoplasma multinucleado. De esta forma a partir de una espora en germinacin se desarrolla una hifa, esta se ramifica y forma un micelio. Las hifas pueden ser de dos tipos: vegetativas que penetran el substrato con el fin de absorber nutrientes e hifas areas que son las portadoras de las estructuras reproductoras. La clasificacin de los hongos se hace segn las caractersticas de las hifas, la formacin de esporas asexuales, las estructuras que contienen stas y la capacidad de producir esporas sexuales. MATERIALES Por equipo Glicerina 8 Cajas petri de vidrio Agar Sabouraud 5 varillas de vidrio dobladas en forma de U Azul de lactofenol Portaobjetos Agua Cubreobjetos
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Gasa Bistur Algodn 1 pinzas de diseccin Papel de estraza 3 Pipetas de 10 ml estriles 1 Matraz erlenmeyer de 250ml 1 Microscopio ptico 1 Microscopio de diseccin 2 mecheros Fisher Cuenta colonias
Por grupo 1 Parrilla 1 vaso de precipitados de 1000 ml 2 Agitadores magnticos 1 probeta de 100 ml 1 Matraz erlenmeyer de 500 ml Balanza analtica Material que deben traer los alumnos: muestras (por ejemplo tortillas y/o pan enmohecido, frutas u hortalizas) Levaduras (Saccharomyces cerevisiae) Mohos (Penicillum, Aspergillus)
PROCEDIMIENTO Observacin de levaduras 1. Toma una asada de levadura suspendida en solucin salina. Colquela en un portaobjeto cbrala con una laminilla y obsrvela con 10 y 40 X realice el esquema 2. En un portaobjeto, coloque una gota de lugol tome una asada de la suspensin de levadura y haga una emulsin con el asa: Coloque un cubreobjeto y observa el microscopio con 10 y 40X. 3. Trate de identificar las siguientes estructura pared celular, ncleo, vacuolas etc. realice el esquema de lo observado. Observacin de Mohos:
1. Examine las colonias de los hongos presentes en las cajas con agar Sabouraud.
Describa consistencia color y forma. 2. Prepara una placa tomando con un asa estril una muestra de cultivo depostela en un portaobjeto el cual previamente se le a adicionado una gota de azul de lactofenol: Luego pngale una laminilla y presione con la yema de los dedos o con el borrador del lpiz. Observe al microscopio con objetivo de 10 y 40X haga esquema del tipo de hifa y
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rgano de reproduccin. Identifique el gnero de Moho. Tcnicas de cultivo Microcultivo 1. Preparacin de reactivos y medio de cultivo: Solucin glicerinada al 5 % (5 ml de glicerina en 100 ml de agua) Agar Sabouraud: Preparar medio siguiendo las indicaciones del reactivo. 2. Preparar 6 cajas petri (por equipo) de la siguiente forma: Colocar una varilla de vidrio en forma de U dentro de la caja encima de esta un portaobjetos y 2 cubreobjetos, cerrar la caja. Colocar las cajas petri preparadas de acuerdo al punto anterior en un cilindro para esterilizar cajas petri. Nota: esterilizar pipetas, medio de cultivo, agua glicerinada, bistur y pinzas envueltas en papel de estraza y los cilindros con cajas petri y pipetas en el autoclave 3. En condiciones aspticas vaciar el agar a 2 cajas petri (por equipo) calcular aproximadamente 25 ml por caja. Preparacin del microcultivo 1. Bajo condiciones estriles y con ayuda de un bistur cortar cuadros pequeos de agar aproximadamente de 1 cm X 1 cm. 2. Utilizando las pinzas de diseccin colocar en cada una de las cajas petri un cuadro de agar sobre el portaobjetos. 3. Con el asa estril inocular por picadura en cada uno de los 4 lados del cuadro de agar hongos (muestra y aquellos proporcionados por el profesor). Colocar con la ayuda de las pinzas de diseccin estriles el cubreobjetos encima del agar. 4. Adicionar agua glicerinada estril a cada una de las cajas petri hasta cubrir dos terceras partes de la varilla de vidrio. Tapar las cajas. 5. Incubar las cajas a 30C durante una semana. Verificar que las cajas conserven un nivel adecuado de agua glicerinada. Observacin de los hongos 1. Observar con el microscopio de diseccin los hongos desarrollados despus de 7 das de incubacin. 2. En un portaobjetos colocar una gota de lugol y cubrirla con el cubreobjetos que proviene del microcultivo, observar al microscopio ptico. 3. Observar al microscopio el portaobjetos del microcultivo, retirar el cuadro de agar, agregar una gota de solucin de lactofenol y cubrir con un cubreobjetos limpio.
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RESULTADOS Reportar en esquemas las observaciones hechas a los microcultivos y comparar con lo encontrado en la literatura. Estas descripciones se realizarn con TODOS LOS HONGOS tanto de las muestras como las cepas proporcionadas por el profesor. Adems presentar descripcin de morfologa de colonias. CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. Explica cules son las caractersticas distintivas de los hongos? Cules son los principales criterios de clasificacin? Cmo estn divididos? Cules son las principales diferencias ente hongos y levaduras? Explica en qu consisten las reproducciones asexuales y sexuales en: a. Oomicetos b. Basidiomicetos c. Ascomicetos d. Zigomicetos e. Deuteromicetos JAMES M. JAI Microbiologa Moderna de los alimentos. Editorial Acribia. 3 edicin, aragoza - Espaa 1994 W, C. FRAZIER. Microbiologa de los Alimentos. Editorial Acribia A edicin, 1993
BIBLIOGRAFA
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Manual de prcticas de Microbiologa General

Docente Zorangel Amzquita Montes Universidad de Cartagena 15/06/2012

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Forma Puntiforme Elevacin Circular Filamentosa Rizoide Irregular Spindle

Margen Entero Ondulada Lobulada Erosionada Filamentosa Rizada

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Segn sus componentes los medios se dividen en simples y complejos.

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