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Universidad de Santiago de Chile Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa Laboratorio de Principios de Sistemas Celulares

INFORME DE LABORATORIO MICROBIOLOGA

Autores

: Felipe Carreo L. Francisco Chvez E. Jos Rodrguez V.

Fecha de Entrega

: 170/01/2014

Docente Encargado : Hans Khler Jos Marcos Ayudante : Roco Cozmar

1. Introduccin.

Los microorganismos son seres vivos diminutos que individualmente suelen ser demasiado pequeos para ser observados a simple vista. El grupo incluye las bacterias, los hongos, los protozoos y algas microscpicas. Tambin incluye los virus, entidades no celulares que a veces se consideran en el lmite entre lo vivo y lo inerte. (1) Para el anlisis en el laboratorio se har un cultivo bacteriano. Las bacterias son microorganismos unicelulares relativamente simples. Dado que su material gentico no est encerrado por una membrana nuclear especial, las clulas bacterianas se denominan procariontes. (2) Las clulas bacterianas suelen presentar una de diversas formas. La forma de bastn (bacilos), la forma esfrica (cocos) y la forma de tirabuzn (espirilos) son las ms comunes, pero algunas bacterias presentan formas estrelladas o cuadradas. Las bacterias individuales pueden formar pares, cadenas, racimos u otros agrupamientos; estas formaciones suelen ser caractersticas de un gnero o especie de bacteria particular. (3) Las bacterias utilizadas en el prctico son Escherichia coli y Bacillus subtilis. La Escherichia coli vive en los intestinos de la mayor parte de los mamferos sanos. Es el principal organismo anaerobio facultativo del sistema digestivo. En individuos sanos, es decir, si la bacteria no adquiere elementos genticos que codifican factores virulentos, la bacteria acta como un comensal formando parte de la flora intestinal y ayudando as a la absorcin de nutrientes. (4) La bacillus subtilis es una bacteria Gram positiva, Catalasa-positiva, aerobio1 comnmente encontrada en el suelo. Miembro del Gnero Bacillus, B. subtilis tiene la habilidad para formar una resistente endospora protectora, permitendo al organismo tolerar condiciones ambientalmente extremas. (5) La tincin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en Bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicasSe utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color morado, y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo. (6) Tambin se har una accin de antispticos y desinfectantes las bacterias. Los antispticos son sustancias antimicrobianas que se aplican a un tejido vivo o sobre la piel para reducir la posibilidad de infeccin, sepsis o putrefaccin. Se denomina desinfeccin a un proceso fsico o qumico que mata o inactiva agentes patgenos tales como bacterias, virus y protozoos impidiendo el crecimiento de microorganismos patgenos en fase vegetativa que se encuentren en objetos inertes. En general, deben distinguirse de los antibiticos que destruyen microorganismos en el cuerpo, y de los desinfectantes, que destruyen

microorganismos existentes en objetos no vivos. Algunos antispticos son autnticos germicidas, capaces de destruir microbios (bactericidas), mientras que otros son bacteriostticos y solamente previenen o inhiben su crecimiento. (7)

Objetivos

Objetivos generales Diferenciacin de bacterias mediante el uso de tcnica Gram Determinar el uso de antibiticos y el efecto sobre cultivos de bacterias.

Objetivos especficos Preparar y fijar las muestras bacterianas. Determinar la accin del sensidisco de antibiticos sobre el cultivo bacteriano. Usar tcnica diferencial Gran para clasificar bacterias Gram positivas y negativas.

Materiales y mtodos.

1. Instrumentos: - Asa de nicrn. - Mechero Bunsen. - Placa de Petri. -Portaobjetos. -Disco inhibitorio. - Pipeta plstica.

2. Reactivos: - Escherichia coli. - Bacillus subtilis. - Solucin de cristal violeta. - Solucin de yodo. - Lugol - Alcohol-acetona (3:1)

3. Procedimiento: Procedimiento previo Se desinfectaron las manos y la superficie del mesn usando etanol 70% limpiar. Luego de esto, se ubic y se encendi el mechero bunsen de manera de obtener la llama oxidante. Tincin de Gram Se extrajo una colonia que fue previamente separada como se explic en el punto anterior, y se coloc en un portaobjetos, luego se agreg una gota de agua a este, y se esparci por una pequea superficie. Posteriormente se sec con el calor irradiado por el mechero, acercndolo a este con la ayuda de pinzas. Al portaobjetos con bacterias previamente fijadas se ti con cristal violeta por 2 minutos, luego se lav con agua. Despus de esto se agreg una solucin de yodo, la cual se mantuvo por un minuto hasta que se lav con agua. Luego se decolora con alcohol:acetona (3:1), lavando de forma intermitente hasta que no se desprendi ms colorante. Finalmente se ti con safranina por un minuto y luego se lava con agua. Se sec la muestra con la ayuda de papel absorbente, y despus se le agreg una pequea de gota de agua, y se coloc encima el cubreobjetos, sobre este se aadi el aceite de inmersin, y as se observ la muestra al microscopio ptico modelo Zeiss Axiovert 100. Las bacterias observadas fueron E.coli y B.subtilis. Antispticos y desinfectantes. Se tom una muestra desde un cultivo puro con la micropipeta y se deposit en una placa de petri, se esparci con el rastrillo y posteriormente se ubic en su interior un sensidisco, el cual dependa si

la bacteria era Gram positiva o negativa. La muestra finalmente sellada se mantuvo en una estufa a 37,5 C, por aproximadamente 6 das. Esto se realiz para un cultivo de E.coli y B.subtilis.

4. Resultados. 4.1 Tcnicas de Tincin Gram.

Figura 4.1.2 Tincin Gram para Bacillus subtilis En la figura 4.1.2 se observan muchas estructuras de coloracin marrn y en sectores un color violeta.

Figura 4.1.2 Tincin Gram para Escherichia coli En la figura 4.1.2 se observan sectores con coloracin rosada y otros de una tonalidad ms oscura.

4.2 Accin del sensidisco de antibiticos sobre el cultivo bacteriano.

Figura 4.2.1 Cpsula con csped de Escherichia coli con sensidisco de antibitico En la figura 4.2.1 en esta cpsula se observa el disco de antibiticos que se sembr sobre la cosecha de Escherichia coli, en las proximidades de cada antibitico se observan la formacin de circunferencias.

Figura 4.2.2 Cpsula con csped Bacillus subtilis con sensidisco de antibitico. En la figura 4.2.2 en la cpsula se observa que la formacin de circunferencias alrededor de los dicos blancos.

Discusiones. Tincin gram. La bacteria Bacillus subtilis da como resultado una tincin gram positivo, esto se debe a que su membrana celular es nica y con una gran capa de cidos teitoicos y lipoteitoicos a diferencia de las bacterias gram negativo que tienen una doble membrana celular y una delagada capa de peptidoglican, como es la Escherichia coli. El punto importante que determina si una bacteria es gram postivo es la diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos. La capa de peptidoglican que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglican, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul. (8) (9) Accin del sensidisco de antibiticos sobre el cultivo bacteriano. Para el cultivo de Escherichia coli. los antibiticos presente en este cultivo son Ciprofloxacino, Sulfatrimetoprim, Clindamicina, Eritromicina, Tetraciclina, Penicilina, Gentamicina, Oxacilina, Vancomicina. A) Sulfatrimetoprim es una combinacin de dos inhibidores de la sntesis de acido dihidroflico que causan una actividad sinergstica contra diferentes microorganismos. La combinacin ataca tanto a gram + como gram y la resistencia que la Escherichia coli posee sobre este antibitico es entre un 10-20%. Es un antibitico utilizado para tratamientos normales de esta bacteria debido a su baja resistencia, pero su principal indicacin el para el tratamiento de neumonas. B) Clindamicina es uno de los antimicrobianos mas tiles en la vaginosis bacteriana, tiene un alto porcentaje de eficiencia debido a que actua tanto sobre bacteria anaerbias como aerobias. Su mecanismo de accin consiste en suprimir la sntesis de protenas. Este antibitico esta indicado para el tratamiento de infecciones severas gram negativas excepto para el E.coli, ya que este antibitico no tiene efecto sobre esta bacteria. C) Eritromicina pertenece al grupo de los macrlidos. Es un antibitico alternativo para los susceptibles a la penicilina, pero es un antibitico para enfermedades especificas gastrointestinales, tiene una gran efectividad sobre la E.coli. D) Tetraciclina provocan la inhibicin de la sntesis de protenas, para penetrar la pared celular tiene que hacerlo a travs de poros o por un proceso de transporte. Atacan tanto a gram + como gram-. La principal indicacin para tetraciclina son para infecciones de E.coli , esto se debe a

su mecanismo de reaccin que le permite inhibir fcilmente la pared membrana citoplasmtica de la E.coli y asi inhibir su sntesis proteica. E) Penicilina se utiliza para el tratamiento o prevencin de bacterias infecciosas por lo general gram +. Actuan daando y penetrando las pareces de las clulas atando asi las clulas de las bacterias. El problema del uso de la penicilina sobre la E.coli es que al igual que muchas otras bacterias han desarrollado una resistencia sobre este antibitico. F) Gentamicina es un antibitico aminoglucosido de amplio espectro que actua sobre bacteria gram negativas aerobias. Debido a esta actividad no se receta para E.coli.

G) Oxacilina es un antibitico que proviene de las penicilinas, por lo que se indica para infecciones de bacterias gram positivas en particular para estafilococos, por lo que la E.coli es resistente a este antibitico. H) Vancomicina es un glicopeptido de estructura compleja que es sumamente efectivo contra bacterias gram positivas, no asi con la gram negativas debido al volumen de la molcula que le impide atravesar las membranas, por lo que la E coli resiste este antibitico. I) Ciprofloxacino es un antibitico del grupo de las fluoroquinolas que se utiliza para combatir bacterias infecciosas en el tracto urinario, diarrea, tuberculosis, protatitis etc.. es uno de los principales antibiticos utilizados para la E..coli debido a su capacidad de atacar bacterias anaerobias, pero ltimamente se esta buscando alternativas a este antibitico debido a que la resistencia de la bacteria frente a este antibitico han aumentado desde un 15% hasta un 35% en los ltimos 10 aos.

Conclusiones.

Referencias.

Tortora, Gerard J.; Funke, Berdel R.; Case, Christine L.; 2007, Introduccin a la microbiologa, 9na edicin, Editorial mdica Panamericana (Buenos Aires), pp: 19-48. (1) (2) (3)

Garca Martos, Pedro; Fernndez del Barrio, Mara Teresa; Paredes Salido, Felipe; 2000, Microbiologa clnica prctica, 2da edicin, Servicio de publicaciones U. de Cdiz, pp: 211- 234 y 331-347. (4) (5)

Khler, Hans, Marcos, Jos, ao 2013, Gua de laboratorio Principios de Sistemas Celulares, pp: 26-30. (6) (7) Romero Cabello, Ral, 2007, Microbiologa y parasitologa humana, 3ra edicin, Editorial mdica Panamericana (Chapultepec Morales), pp:83-187 (8) (9)