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Anlisis del contenido aminoacdico de los alimentos con fines nutricionales

Indice 1. Introduccin. 2. Mtodos de anlisis de aminocidos en alimentos. 3. Tcnicas de separacin de aminocidos 4. Reactivos de derivati acin. !. "erivati acin pre#columna frente a post#columna $. %i&lio'rafa. 1. Introduccin . Los aminocidos, pptidos y protenas son componentes importantes de los alimentos. Por un lado proporcionan los elementos necesarios para la sntesis proteica. Por otro lado, los aminocidos y pptidos contribuyen directamente al sabor de los alimentos y son precursores de los componentes aromticos y las sustancias coloreadas que se forman mediante las reacciones trmicas y/o enzimticas que ocurren durante la obtencin, preparacin y almacenamiento de los mismos. minocido. Los aminocidos son cidos carbo!licos que contienen un grupo amino. "!isten unos cien en la naturaleza. "n el #idrolizado total de las protenas e!isten $einte aminocidos que tienen, con algunas e!cepciones, la frmula general siguiente% &'()'(**) +), "n el caso ms sencillo, el radical & es un tomo de )idrgeno -cido aminoactico o glicina., en los dems aminocidos & es un resto aliftico, aromtico o #eterocclico, que puede ser portador de otros grupos funcionales. "!isten diez aminocidos, denominados aminocidos esenciales, que el organismo es incapaz de sintetizar y que deben ser aportados por la alimentacin. "l organismo no los puede sintetizar porque carece del mecanismo necesario para elaborar los cetocidos correspondientes/ se #a comprobado que si se le suministran stos y sales de amonio es capaz de elaborarlos. Los aminocidos constituyentes de las protenas son, apro!imadamente, $einte% alanina, arginina, asparagina, cido asprtico, cistena, cido glutmico, glutamina, glicina, #istidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptfano, tirosina y $alina. 0odos ellos son aminocidos e!cepto dos, que son 1iminocidos, la prolina y la #idro!iprolina, que tambin pueden considerarse como aminocidos por su similitud estructural. 2e les llama aminocidos porque el grupo amino est unido al carbono de la cadena que es, por con$enio, el tomo de carbono adyacente al grupo carbo!ilo. Los aminocidos contienen tantos grupos cidos como bsicos, por lo que tienen propiedades cidas y bsicas dbiles y se les llama anfolitos. 2e comportan como anfiprticos porque pueden aceptar o donar electrones. Las molculas de aminocidos transportan una carga negati$a y otra positi$a, lo que da como resultado una carga total nula, esta forma se conoce como 3zwitterion4 del aminocido. La carga total transportada por un aminocido depende del p) de la solucin y de los $alores de la constante de acidez de los grupos ionizables presentes. 2i el p) es muc#o mayor que el $alor de la constante de un grupo, se libera un protn y la molcula tendr una carga negati$a, pero si el p) es menor, tendr carga positi$a. "l #ec#o de que a diferentes $alores de p) el aminocido tenga distintas formas y lle$e distintas cargas netas se utiliza en muc#os mtodos analticos, como en la electroforesis y en la cromatografa de intercambio inico. "l punto iso'inico de una molcula es el p) en el que el n5mero de cargas negati$as debidas a los protones perdidos es igual al n5mero de cargas positi$as debidas a los protones ganados, entonces predomina la forma zwitterinica. "l punto isoelctrico es el p) en el que las molculas no presentan migracin en un campo elctrico y puede determinarse e!perimentalmente por electroforesis/ en los aminocidos es igual que el punto iso'inico. 6n aspecto importante en el anlisis de los aminocidos es el #ec#o de que no se pueden detectar en el $isible'67. "!isten $arios reacti$os que reaccionan con los aminocidos dando compuestos coloreados o fluorescentes y que, por tanto, pueden utilizarse para anlisis cualitati$os o cuantitati$os. "sto es lo que se denomina deri$atizacin de los aminocidos. Los mtodos fluorimtricos tienen muc#as $enta8as respecto a la espectrofotometra para el anlisis de aminocidos.

+ecesidades proteicas. 2e requiere un criterio para fi8ar las necesidades o e!igencias en protenas para el ser #umano. Por ello se establece una 3protena de referencia4 o 3patrn4. (onocida la composicin en aminocidos de las protenas de los distintos alimentos que se consumen y cuales #an demostrado poseer mayor $alor biolgico, a saber% la de la lec#e, la del #ue$o y las de la carne/ y teniendo en cuenta la composicin cuali'cuantitati$a en aminocidos, se #a adoptado dic#a 3protena de referencia4 o 3patrn4. "n la calidad de las protenas influye el contenido en aminocidos esenciales, y es importante la presencia de 3limitantes4. "n efecto, se llama as al aminocido esencial que en una protena dada se encuentra en cantidad relati$a ms ba8a con respecto a la protena patrn porque limita el apro$ec#amiento de esa protena a los fines biolgicos. "s importante determinar el contenido en aminocidos, en con8unto, para estimar el grado de protelisis enzimtica que #a sufrido el producto, as como la proporcin de cada uno de ellos, como componentes de la protena, cuando se desea establecer su $alor biolgico. La determinacin de aminocidos en alimentos permite e!traer algunas conclusiones acerca de su composicin/ por e8emplo, la gelatina usada como espesante se diferencia rpida y sencillamente, de otros #idrocoloides -grasas $egetales, almidn, etc.., en funcin de su composicin aminoacdica. *b8eti$os. "n primer lugar recogemos los distintos mtodos oficiales y estndares para el anlisis de aminocidos en alimentos, encontrados en 9todos *ficiales de nlisis editados por el 9inisterio de gricultura, Pesca y limentacin -:;<=. y en 9et#ods of nalysis of * ( -:;;>., as como algunos mtodos recomendados. Posteriormente, en la discusin, tratamos sobre las distintas tcnicas de separacin -cromatogrficas y electroforesis., del analizador automtico de aminocidos, de los distintos reacti$os deri$atizantes y el tipo de deteccin apropiada para cada uno, y las $enta8as y des$enta8as de la deri$atizacin, tanto antes -precolumna. como despus -postcolumna. de la separacin. 2. Mtodos de anlisis de aminocidos en alimentos. 9todos oficiales. ?eterminacin de prolina en miel. &eaccin de la prolina con nin#idrina en medio cido y posterior determinacin a >:@ nm de la absorbancia del compuesto formado. Preparacin de la muestra% 2uponiendo que la miel ya #a sido separada del panel por escurrimiento a tra$s de un filtro de luz de malla, optaremos por realizar el siguiente paso, la #omogeneizacin. &eblandecer la muestra calentando entre ,>'ABC( agitndola al mismo tiempo. 6na $ez #omogeneizada se calienta a >BC( al baDo 9ara #asta que se consiga la fusin y se de8a enfriar rpidamente. ?eterminacin de #idro!iprolina en carnes. Pre$ia #idrlisis en medio cido de las protenas y o!idacin de la #idro!iprolina. "l deri$ado formado con el p'dimetilaminobenzalde#ido se $alora colorimtricamente a >=B nm.. Preparacin de la muestra% Primero, se quitan las diferentes capas protectoras del producto para poder tomar una muestra representati$a. 2e parten trozos de B,> ' : cm y se cortan dic#os trozos en pequeDos cubos. ?espus se pasan por una trituradora $arias $eces #asta conseguir una mezcla #omognea. 2e guarda en frascos limpios y secos para pre$enir la prdida de #umedad. 2e conser$a en refrigeracin de forma que e$ite su deterioro y cualquier cambio en su composicin. 9todos estndares. ?eterminacin de prolina en miel. ?eterminacin de #idro!iprolina en carnes. ?eterminacin de aminocidos en preparados $itamnicos. ?eterminacin de lisina en suplementos nutricionales. Los grupos amino de las protenas reaccionan con ?+EF dando lugar a los deri$ados lisina'?+EF. Posteriormente se produce una #idrlisis cida y la determinacin en un analizador de aminocidos de la lisina. ?eterminacin de triptfano en alimentos. La muestra es #idrolizada en medio bsico, seguidamente se realiza un a8uste de p). "l triptfano es separado por cromatografa lquida de intercambio inico y determinado por un detector 67 a ,<B nm.

?eterminacin de aminocidos sulfurados en alimentos -metionina y cistena.. "n primer lugar las protenas son o!idadas con cido perfrmico para conseguir cido cisteico y metionina sulfonada, luego se realiza una #idrlisis cida con )(l. &ealizamos una cromatografa de intercambio inico aplicndole un detector que sea capaz de medir a >@B nm. 9todos recomendados. nlisis de aminocidos por )PL( seguido del mtodo del fenilisotiocianato. -Lab. "nzymology and P#ysical (#emistry of Proteins.. continuacin, incluimos un protocolo tpico del anlisis de aminocidos en #arinas% ' ?e8ar a reflu8o la muestra con )(l =+ durante ,G #oras. "$aporar a sequedad en e$aporador rotatorio. ' Dadir agua y e$aporar a sequedad. ' &ealizar el e!amen cromatogrfico de una solucin problema al :BH de la muestra tratada en solucin ' acuosa de isopropanol a :BH. ' "l sistema sol$ente% n'butanol/)ac/) ,* en proporcin :,%A%>. ' 2oporte papel I#atman nC:. ' Longitud del papel >B cm. ' 9todo cromatogrfico descendente. ' ?uracin% :, #oras. ' 2olucin re$eladora% solucin acetnica de nin#idrina al B.,>H. ' (ondiciones de re$elado% ,B min a :B>C(. ' (omparacin frente a muestras puras de clor#idratos de aminocidos. 3. Tcnicas de separacin de aminocidos. menudo es necesario identificar y cuantificar los aminocidos indi$iduales de una mezcla, tanto en estudios metablicos como en las in$estigaciones de la estructura de las protenas. "l uso de la cromatografa en capa fina o de la electroforesis son adecuados para a$eriguar el n5mero y la cantidad relati$a de los diferentes aminocidos presentes en una muestra -anlisis cualitati$o., aunque para los anlisis cuantitati$os es necesaria la cromatografa de gases o un analizador de aminocidos. (romatografa en capa fina. 6na importante aplicacin de la cromatografa en capa fina es la de ser$ir como gua para el desarrollo de las condiciones ptimas para realizar separaciones por cromatografa de lquidos en columna. Proporciona una idea rpida de los aminocido mayoritarios e!istentes en la muestra. Las $enta8as de este procedimiento son la rapidez y el ba8o coste de los ensayos e!perimentales. ?e #ec#o, algunos cromatografistas son de la opinin de que los ensayos en capa fina deberan preceder siempre al uso de la columna "n la cromatografa de papel se pueden aplicar grandes $ol5menes de muestra, lo que permite la elucin posterior de un aminocido en particular para su posterior purificacin y anlisis, factor que tiene gran importancia en la identificacin de un constituyente desconocido de la muestra. ntes de la realizar la cromatografa, es necesario eliminar las sustancias que interfieren, tales como protenas, carbo#idratos y sales, lo que puede #acerse con una resina de intercambio inico. Los aminocidos retenidos pueden eluirse a continuacin aDadiendo a la columna un pequeDo $olumen de amoniaco y la$ando despus con agua destilada. La separacin de los aminocidos se basa en que stos se reparten de modo diferencial entre la fase m$il y la fase estacionaria. Jeneralmente se realizan por el procedimiento ascendente% introduciendo el borde inferior de la placa cromatogrfica en el eluyente que ser succionado por accin de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie del la placa. La identificacin de un aminocido se realiza comparando los $alores de & f -factor de retraso% cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen y la distancia recorrida por el sol$ente desde el origen., con otros tomados como referencia, debindose utilizar al menos tres sistemas de disol$entes distintos para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad. La naturaleza de los aminocidos es un factor importante a la #ora de elegir un disol$ente, ya que los diferentes sol$entes pueden permitir una me8or resolucin de los componentes cidos, bsicos o neutros. "n general, aumentando la proporcin de agua en el disol$ente se incrementan todos los $alores de &f e introduciendo pequeDas cantidades de amoniaco aumentan los $alores del factor de retraso de los aminocidos bsicos. lgunos disol$entes contienen compuestos noci$os, por e8emplo el

fenol, lo que restringe su uso rutinario. La composicin qumica del disol$ente puede tambin limitar el rango de reacti$os de localizacin que pueden aplicarse satisfactoriamente. Por e8emplo, el cido sulfanlico no puede utilizarse con disol$entes fenlicos. "l poder de resolucin de la cromatografa de capa fina puede aumentarse empleando tcnicas bidimensionales, o sea, utilizando dos disol$entes distintos. 2e aplica una cantidad de muestra mayor que la utilizada generalmente para la separacin cromatogrfica de una dimensin -apro!imadamente el triple. en una esquina del papel o placa y se #ace correr en una dimensin. "ntonces el cromatograma se seca completamente al aire, se gira un ngulo de ;BC y se desarrolla con el segundo sol$ente. 0ras un nue$o secado, se sumerge en el reacti$o de localizacin elegido. "n la cromatografa de dos dimensiones, la composicin de los dos disol$entes es la que determina el orden en que debe utilizarse. Las separaciones bidimensionales permiten la resolucin de un gran n5mero de aminocidos presentes en una muestra, ya que los que tienen una mo$ilidad similar en la primera dimensin se separan en la segunda. Ksto es muy 5til en la deteccin de los componentes que estn en muy ba8a concentracin y pueden quedar enmascarados por otros compuestos que tengan una concentracin alta cuando se utiliza la cromatografa en una dimensin. "lectroforesis. La electroforesis es un proceso en el cual las especies cargadas -iones o partculas coloidales. se separan en funcin de su distinta $elocidad de migracin en un campo elctrico. ?esde los aDos cincuenta, las separaciones electroforticas fueron la piedra angular de gran parte de la in$estigacin de qumicos y bilogos moleculares relacionada con la separacin y anlisis de protenas, polinucletidos y otros biopolmeros. "stas separaciones #an sido -y contin5an siendo. muy eficientes y de una e!tensa aplicacin, pero por desgracia, son unas tcnicas muy lentas y laboriosas que tienen tendencia a ser poco reproducibles. mediados de los oc#enta, esta situacin cambi espectacularmente con la aparicin de aparatos comerciales para realizar electroforesis analticas a microescala en columnas capilares -electroforesis capilar.. "l #ec#o de que los distintos aminocidos transporten diferentes cargas netas a un p) particular, permite separarlos de una mezcla mediante la electroforesis de alto o ba8o $olta8e. Los medios utilizados ms frecuentes como soporte son el papel o las placas de capa fina -celulosa o gel de slice., pudindose utilizar para $isualizar las manc#as, los reacti$os de localizacin que describiremos ms adelante. Las separaciones se pueden realizar ms fcilmente con alto que con ba8o $olta8e, siendo una de las principales $enta8as de la primera, el que las sales y otras sustancias presentes en la muestra afectan en menor e!tensin la calidad del electroforetograma. pesar de que se pueden conseguir separaciones electroforticas con tmpones a distintos p), en la prctica los $alores de p) escogidos estn entre , y >LA. p) , todos los aminocidos tienen carga positi$a y los de tipo bsico que tienen la mayor carga positi$a migran ms rpidamente #acia el ctodo, mientras, que a p) > los aminocidos se dirigen #acia ambos electrodos, dependiendo de la carga transportada. Las separaciones a p) >LA se utilizan para determinar la naturaleza cida o bsica de un aminocido desconocido. (romatografa de gases. 2e #an #ec#o muc#os ensayos para apro$ec#ar la $elocidad y sensibilidad que ofrece la cromatografa de gases, pero aunque se #an realizado considerables progresos en el desarrollo de tales mtodos, a5n no se utiliza de forma rutinaria para el anlisis de aminocidos en muestras biolgicas. La razn de sto radica en el #ec#o de que los aminocidos, aunque similares, son compuestos qumicamente #eterogneos y adems no son suficientemente $oltiles a menos que se con$iertan en alg5n deri$ado apropiado. parecen dificultades no slo a la #ora de elegir el mtodo de obtencin de tales deri$ados, sino tambin en la seleccin de una fase estacionaria que sea capaz de resol$er los deri$ados de todos los elementos de un grupo tan di$erso de compuestos. lo #ora de elegir el detector aparecen tambin problemas similares. nalizador automtico de aminocidos ' )PL(. "!isten dos tcnicas para la determinacin de aminocidos a tra$s de cromatografa lquida% cromatografa de reparto en fase re$ersa y cromatografa de intercambio inico. La cromatografa de lquidos de alta resolucin es la tcnica de separacin ms ampliamente utilizada. Las razones ms importantes son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitati$as e!actas, su idoneidad para la separacin de especies no $oltiles o termolbiles y, sobre

todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la industria, en muc#os campos de la ciencia y para la sociedad en general. lgunos e8emplos de estos materiales incluyen los aminocidos, protenas, cidos nucleicos y otros. (romatografa de reparto en fase re$ersa. La cromatografa en fase re$ersa consiste en un disol$ente fundamentalmente polar como fase m$il y una cadena #idrocarbonada ligada como fase estacionaria. lgunas de las $enta8as ms sustanciales de esta alternati$a son su gran reproducibilidad, tiempos de retencin cortos, $elocidad de muestreo alta, sistema cromatogrfico simple y amplio campo de aplicacin. Por todo ello, las aplicaciones son cada $ez ms numerosas. La selecti$idad se basa en las interacciones especficas entre el soluto y la fase m$il, ya sea de tipo polar, de formacin de puentes de #idrgeno o mediante equilibrios secundarios pro$ocados al $ariar la composicin de la fase m$il -cido'base, formacin de comple8os o pares inicos, adicin de comple8os metal'ligando o reacti$os quirales para separar los ismeros pticos, etc... (romatografa de intercambio inico. La cromatografa inica est relacionada con los mtodos modernos y eficaces para la determinacin de iones que se basan en el uso de resinas de intercambio inico. "!isten mtodos automatizados para la separacin y deteccin de aminocidos y otras especies inicas en mezclas comple8as. "l desarrollo de la )PL( moderna empez a finales de los aDos sesenta, pero su aplicacin a la separacin por intercambio inico se retraso debido a la ine!istencia de un mtodo general y sensible para la deteccin de especies como los cationes alcalinos y alcalinotrreos, y aniones como los #aluros, acetato y nitrato. "sta situacin se remedi en :;@> al desarrollarse por tcnicos de ?ow (#emical (ompany la tcnica de supresin del efluente, la cual #ace posible la deteccin conductimtrica de los iones eludos. "l analizador de aminocidos, con el que se lle$a a cabo la cuantizacin de los aminocidos se basa en esta tcnica. nalizador automtico de aminocidos. La separacin de aminocidos fue el primer proceso cromatogrfico automatizado con deri$atizacin post'columna. La separacin fue lle$ada a cabo por 9oore, 2pacMman y 2tein -:;><., mediante un intercambio inico, seguido de su cuantizacin de cada componente eluido de la columna por reaccin con nin#idrina y posterior deteccin en el $isible. "ste mtodo se #a realizado durante ms de treinta aDos, en cualquier laboratorio de protenas. "l equipo usado actualmente se basa en el original pero introduciendo algunas modificaciones para conseguir un me8or grado de eficacia. (onsiste en bombear tampones de p) o de fuerza inica $ariables, a tra$s de una columna termostatizada. "ntre las no$edades est la fabricacin de resinas de alta calidad, desarrollo del )PL(, sistemas de automatizacin sofisticados y un aumento en la sensibilidad de los mtodos de deteccin. La separacin tiene lugar en una columna de resina de poliestireno sulfonado. Nnicialmente el p) de la fase m$il es ba8o, por lo que los aminocidos cargados positi$amente se $ern atraidos por los grupos sulfurosos - 2*A' .. (onforme se $a aumentando el p) del tmpon los aminocidos se eluyen diferencialmente al disminuir su carga positi$a y ser menos atraidos por el anin. p) A.> los aminocidos con un grupo cido e!tra, de su cadena tendrn muy poca afinidad por la resina y sern los primeros en salir de la columna, mientras que los que tengan un grupo e!tra ionizable capaz de transportar una carga positi$a -e.g. lisina, #istidina. sern retenidos fuertemente por la resina y se eluirn slo cuando el p) #aya aumentado sustancialmente y se #aya reducido su carga neta positi$a. dems del p) tambin #ay que considerar la concentracin del tampn eluyente, pues influye en la elucin de tal modo que cuando la concentracin de ion aumenta en mismo, los aminocidos se eluyen ms rpidamente. Las interacciones no inicas entre los aminocidos y la resina tambin influyen en la secuencia de elucin, permitiendo que algunos aminocidos que tienen un comportamiento similar se eluyan de forma separada. La resolucin cuantitati$a de mezclas de aminocidos se consigue $ariando la composicin del tmpon, bien incrementando del p) y manteniendo constante la concentracin, o $ice$ersa, o incluso $ariando ambos. )ay otros factores menos significati$os en la calidad de la separacin como son la temperatura, la $elocidad de flu8o del tampn o el tipo de catin utilizado. spectos prcticos del analizador% (olumna% en los analizadores tipo se usan dos columnas, una para separar los aminocidos cidos y neutros y otra para los bsicos. Las de $idrio o acero ino!idable dan picos estrec#os y altos, me8orando la separacin de aminocido similares.

2olucin tampn% suele ser citrato sdico o de litio, al que se le aDade un detergente, un antio!idante y un conser$ante. ctualmente se utilizan dos disoluciones tampn, una cida y otra bsica. 2e mezclan en proporciones $ariables para conseguir un aumento de p). ?e esta forma se me8ora la separacin disminuyendo el tiempo de anlisis y se eliminan las fluctuaciones bruscas de la linea base debidas a cambios repentinos en el tampn, como sucedia con anteriores tcnicas. 0emperatura% puede ser constante para e$itar cambios en el p) y en la ionizacin de los aminocidos, o bien puede utilizarse un programa de temperaturas que implica un cambio de sta en di$ersos momentos del proceso. Elu8o de la columna% se requiere un flu8o de tampn constante para permitir la reproducibilidad. 2e consigue por uso de bombas de presin o de desplazamiento constante. ?eteccin% es necesaria una segunda bomba para el reacti$o deri$atizante -generalmente nin#idrina. que se #a de mezclar con el eluyente de la columna. (uando la reaccin #a tenido lugar, la corriente se controla en una clula de flu8o de un colormetro o un fluormetro. 2e mide la absorbancia continuamente a >@B y GGB nm. para detectar los amino e iminocidos respecti$amente. "l anlisis aminoacdico es un buen e8emplo del #ec#o de que raramente #ay un 5nico sistema de separacin para problemas analticos, sino que de la eleccin del sistema apropiado depende el problema analtico. Por e8emplo, de la matriz en la cual los aminocidos $an a ser determinados, de la sensibilidad deseada y en la $elocidad requerida para el anlisis. Los actuales mtodos de deteccin para aminocidos dependen de la reaccin del grupo amino primario del aminocido para formar un deri$ado coloreado o fluorescente, esta deri$atizacin tiene lugar tanto antes como despus de que la separacin de los aminocidos #aya sido efectuada. La menor $ariedad de tipos de aminocidos en comparacin con las estructuras de los pptidos #ace que los modos de )PL( disponibles para el in$estigador sean la cromatografa de intercambio catinico -("(., y la cromatografa de fase re$ersa -&P(.. La cromatografa en fase re$ersa es ms apropiada para la separacin de deri$ados aminoacdicos que para aminocidos libres. La eleccin de )PL( est limitada por la eleccin del agente de deri$atizacin y/o la decisin de usar tanto pre' como post'columna de deri$atizacin, de #ec#o, algunos de los ms interesantes descubrimientos lle$ados a cabo en la separacin de aminocidos por )PL( reside en el desarrollo y optimizacin de nue$os agentes de deri$atizacin. &eacciones muy rpidas como la deri$atizacin con fluorescamina y ortoftalde#ido -*P . estn siendo empleadas en aumento con el clsico mtodo de la nin#idrina. 4. Reactivos de derivati acin. "l problema de la deri$atizacin de aminocidos est concentrado en la deteccin selecti$a y sensible de los mismos. Las cantidades de muestra disponibles son muy pequeDas, ya sean protenas cuya estructura $aya a ser determinada o muestras de in$estigaciones en el campo de la ciencia alimenticia, de modo que la reaccin de deri$atizacin debera permitir la deteccin en el rango del pmol. La deri$atizacin puede ser lle$ada a cabo antes de la separacin. ?ebera ocurrir cuantitati$amente para producir productos sencillos para cada aminocido, el reacti$o no debera interferir. "s probable que la deri$atizacin genere productos que son ms parecidos el uno al otro, de cualquier modo, la alta selecti$idad de separacin de los sistemas cromatogrficos implica que raramente #aya problemas. La deri$atizacin precolumna puede ser lle$ada a cabo automticamente inmediatamente antes de la separacin. La deri$atizacin tras la separacin requiere, en general, una comple8idad instrumental mayor. Los instrumentos comerciales a menudo necesitan ser optimizados para alcanzar sensibilidad de deteccin ms alta. +in#idrina. La nin#idrina -#idrato de triceto#idrindeno. reacciona con los aminocidos en medio cido -p) entre A y G. y en caliente produciendo amoniaco, di!ido de carbono y un comple8o de color p5rpura azulado. 0odos los aminocidos primarios forman el mismo comple8o tras su reaccin con nin#idrina, #aciendo este agente inapropiado para la precolumna de deri$atizacin. La mayora de columnas de )PL( de intercambio catinico utilizadas para el anlisis de aminocidos con postcolumna basada en la nin#idrina toda$a emplean resinas de sulfonato de poliestireno/di$inilbenceno. Los primeros sistemas automticos para el anlisis de aminocidos descritos en :;>< basados en la separacin de aminocidos por cromatografa de intercambio catinico y posterior reaccin con nin#idrina, permanecen #oy da como la metodologa ms fiable para el anlisis de aminocidos en pptidos y protenas. nalizadores comerciales basados en esa metodologa estn disponibles en

compaDas como FecMman y P#armacia. altas temperaturas - :BBC(., todos los aminocidos primarios reaccionan con dos molculas de nin#idrina para formar un cromforo -p5rpura de &ut#ermann. con m!ima absorcin a >@B nm. "n la cuantificacin de los aminocidos indi$iduales puede utilizarse el coeficiente de absorcin molar del compuesto coloreado, aunque su $alor $ara de un aminocido a otro y debe determinarse para las condiciones particulares del anlisis. 2in embargo, se debe escoger un $alor de referencia para utilizarlo en la cuantificacin de los aminocidos totales de una mezcla. La reaccin coloreada de la nin#idrina se utiliza en traba8os analticos, as como en la $isualizacin de las bandas de los aminocidos despus de su separacin por electroforesis o por cromatografa. "l reacti$o que se utiliza en estas circunstancias se prepara generalmente disuelto en etanol/ cuando se aDade ,,G'=colidina, las diferencias de color entre cada manc#a ayudan a la identificacin de los distintos aminocidos. *Etalde#ido -*P .. "l *P fue originalmente introducido como un reacti$o alternati$o a la nin#idrina en la postcolumna de deri$atizacin y suministr un significante incremento en la sensibilidad. Los aminocidos reaccionan con el *P en presencia de un reductor fuerte, en condiciones alcalinas -p) ;'::., dando un compuesto fluorescente. La separacin en fase re$ersa seguida de deteccin fluorescente constituye un mtodo de deteccin rpido, sensible y selecti$o para todos los aminocidos con grupos amino primario. Los pptidos son menos reacti$os que los ' aminocidos y las aminas secundarias no reaccionan. unque el *P fue originalmente aplicado solamente para postcolumnas de deri$atizacin a#ora est ampliamente usado como un agente para precolumnas. 9ientras que la separacin de aminocidos siguiente a una precolumna de deri$atizacin est lle$ada a cabo por cromatografa de fase re$ersa, ambas, cromatografa de fase re$ersa y cromatografa de intercambio catinico pueden ser utilizadas cuando el *P es el agente de deri$atizacin en la postcolumna. 6na des$enta8a del *P reside en la relati$a inestabilidad de sus deri$ados, quizs aDadida a los problemas de cuantizacin, aunque sto no es de gran dificultad en la tcnica de deri$atizacin en postcolumna. 2in embargo, en precolumna y desde el punto ms ba8o de p) @L, #asta un p) tpico de reaccin de ;L>, los productos deben ser inmediatamente aplicados a un sistema cromatogrfico. Fa8ando estos dos p) se amortigua la reaccin y sir$e para estabilizar ligeramente los productos de reaccin. La mayor des$enta8a del *P es que no reacciona con aminas secundarias -prolina e #idro!iprolina. aunque sto puede ser sol$entado con su o!idacin por cloramina'0 o #ipoclorito. 6na estratgica combinacin del uso de *P con E9*( -;'fluorenilmetil cloroformato. #a sido recientemente introducida para solucionar esta deficiencia. "l mtodo con *P se utiliza especficamente con precolumna de deri$atizacin para el anlisis de aminocidos porque es ms sensible y tarda menos tiempo que otros mtodos )PL(. Eluorescamina. La fluorescamina fue tambin introducida como una posible alternati$a a la nin#idrina en postcolumnas de deri$atizacin. 0odas las aminas primarias reaccionan con la fluorescamina en medio bsico -p) ;' ::. dando un producto fluorescente con un incremento en sensibilidad de deteccin mayor que la nin#idrina, aunque la fluorescamina por si misma no tiene fluorescencia. "l producto fluorescente es inestable en disolucin acuosa y el reacti$o debe prepararse en acetona. Las aminas secundarias no reaccionan, a menos que se con$iertan pre$iamente en aminas primarias, lo que puede #acerse con +' clorosuccinimida, #ipoclorito o cloramina'0. unque el reacti$o tiene inters por su rpida $elocidad de reaccin con los aminocidos a temperatura ambiente, la reaccin no es tan sensible como la de la nin#idrina. Nsotiocianato de fenilo -PN0(.. "l PN0(, tambin conocido como reacti$o de "dman, #a sido largamente usado para la secuenciacin de polipptidos y protenas y fue introducido para el anlisis de aminocidos al principio de los aDos oc#enta. "s actualmente, el agente ms usado para precolumnas de deri$atizacin, seguido de cromatografa en fase re$ersa, en anlisis de aminocidos, siendo empleado para mezclas de aminocidos de una gran $ariedad de fuentes. "n lugar de ser analizados como deri$ados de P0) -feniltio#idantoin., como ocurre durante la secuenciacin de pptido o protenas, los aminocidos son analizados como deri$ados de P0( -feniltiocarbamol.. s, a p) alcalino, los aminocidos primarios y secundarios producen deri$ados de P0(, que pueden ser registrados por absorbancia 67 -,GB',>> nm. con un lmite de deteccin en el

rango de > a >B pmol. 0odos los aminocidos forman deri$ados mono'P0(, e!cepto lisina y cistena, que producen dobles formas P0(. Los productos son relati$amente estables, aunque alguna con$ersin al deri$ado P0) puede ocurrir si el p) no se controla adecuadamente. unque la metodologa PN0( puede ser considerada superior al resto de las tcnicas en un gran n5mero de aspectos, tiene una mayor des$enta8a en que algunos deri$ados P0( de aminocidos son fuertemente afectados por la presencia de algunas sales, cationes di$alentes, metales e iones tampon. s, mientras el acetato amnico, el cloruro sdico y el borato sdico se #a encontrado que no tienen efecto en aminocidos P0(, otras sales, como el fosfato de sodio y el bicarbonato de sodio si que lo tienen. dems la contaminacin por trazas de iones metlicos se #a encontrado que reduce la formacin de aminocidos P0(. Nncluso aDadiendo "?0 se #an conseguido me8ores rendimientos para la deri$atizacin. (loruro de dansilo y cloruro de dabsilo. "l cloruro de dansilo -cloruro de :'dimetilaminonaftaleno'>'sulfonilo. fue inicialmente introducido para el anlisis del nitrgeno terminal de los aminocidos en pptidos y protenas, un propsito para el cual toda$a es empleado. &eacciona con aminas primarias y secundarias para producir deri$ados fluorescentes. 2u aplicacin adolece de la presencia de numerosos productos laterales y de la formacin de m5ltiples deri$ados de ciertos aminocidos. dems de sto est el requerimiento de un largo tiempo de reaccin. s, aunque el cloruro de dansilo es frecuentemente empleado por lo in$estigadores para la deri$atizacin en precolumna seguida de cromatografa en fase re$ersa, este mtodo nunca #a sido ampliamente aceptado para el anlisis automtico de aminocidos. "l cloruro de dabsilo -cloruro de dimetilaminoazobencenosulfonilo. es un agente muy relacionado con el cloruro de dansilo. Eue introducido y desarrolla por (#ang y sus colaboradores, para la deteccin de aminocidos en el rango del $isible y en el ni$el del pmol. &eacciona con aminocidos primarios y secundarios para producir deri$ados que tienen una gran absorbancia en el rango del $isible. La reaccin se realiza a unos @BC( y un p) de < a <L>, produciendo deri$ados altamente estables en :B o :, minutos. 2e forman mono y bis'deri$ados de lisina, tirosina e #istidina. pesar de las $enta8as sobre el cloruro de dansilo como agente de deri$atizacin, la tcnica del cloruro de dabsilo tiene una tolerancia limitada a la presencia de sales, y aun no est clara cmo se $era afectada la deteccin a altos ni$eles de sensibilidad -rango del :B al ,B pmol. por la presencia de metales, sales y otros contaminantes. unque no se usa ampliamente en anlisis automticos de aminocidos como la nin#idrina, el *P y el PN0(, una adaptacin comercial del mtodo del cloruro de dabsilo est disponible en FecMman Nnstruments. (loruro de ;'Eluoroenilmetil cloroformato -E9*('(l.. "l E9*('(l reacciona con grupos amino para formar deri$ados carbamados altamente fluorescentes y estables. "ste agente altamente reacti$o, originalmente y toda$a usado como grupo amino protector en sntesis de pptidos, fue primeramente aplicado como un agente deri$atizante en precolumna para anlisis de aminocidos. "l E9*('(l reacciona con todos los aminocidos a p) alcalino y temperatura ambiente para producir deri$ados aminoacdicos altamente estables que tienen una fluorescencia comparable a los deri$ados de *P . 2e pueden formar mono' y bis'deri$ados con #istidina, tirosina y lisina. Las proporciones relati$as de estos deri$ados $aran en funcin del p) y de la proporcin de reacti$o y aminocido. ?urante la reaccin con E9*('(l, los productos de #idrlisis del reacti$o que se forman tienen fluorescencia parecida a la de los deri$ados aminoacdicos. "stos productos interfieren en la separacin por cromatografa de fase re$ersa a menos que sean eliminados por el disol$ente orgnico de e!traccin, antes de aplicar la muestra a la columna de cromatografa de fase re$ersa. 6na $ersin automatizada de este procedimiento de deri$atizacin #a sido desarrollada y comercializada. Fetnr y Eoldi solucionaron el problema de las interferencias por la elucin de grandes picos de E9*(' (l y sus productos de #idrlisis, E9*('*), que son eludos en la misma regin cromatogrfica que muc#os de los aminocidos E9*(, por deri$atizacin del $olumen de e!ceso E9*('(l con una amina #idrofbica. "l deri$ado resultante es eludo ms tarde en el cromatograma despus de todos los aminocidos E9*(. 6na combinacin entre *P /E9*( #a sido descrita, la cual usa un analizador comercialmente disponible -)ewlett'PacMard mino Ouant.. La reaccin de aminocidos primarios es lle$ada a cabo inicialmente por *P , seguida por la reaccin de prolina e #idro!iprolina con E9*(. La determinacin de la fluorescencia para los deri$ados de aminocidos primarios *P y E9*('prolina es lle$ada a cabo entonces a longitudes de onda apropiadas.

@'cloro y @'fluro'G'nitrobenz','o!a':,A'diazole -+F?'(l y +F?'E.. &eacti$os de deri$atizacin basados en la estructura del nitrobenzofurazan, +F?'(l y +F?'E, tienen probada utilidad para aplicaciones especficas en el anlisis de todos los aminocidos. "l +F?'(l fue introducido por J#os# y por I#ite#ouse como un agente fluorignico para aminas, incluyendo aminocidos y posteriormente &ot como una 5til #erramienta para el anlisis de aminocidos, particularmente por su realzada reacti$idad con aminas secundarias. ?esde entonces, este reacti$o #a tenido empleo ocasionalmente para la deteccin de aminocidos, con particular nfasis en la deteccin de prolina e #idro!iprolina. +F?'(l #a sido aplicado a la deri$atizacin en pre' y post' columna, con un lmite de deteccin en stas 5ltimas de : nmol para prolina e #idro!iprolina y un lmite de deteccin en las primeras algo menor. unque +F?'(l es estable y permite una deteccin sensible de aminocidos, reacciona algo ms despacio con aminas y no #a tenido un uso e!tendido como agente analtico general para aminocidos. +F?'E es ms reacti$o que su anlogo de cloro, permitiendo una deri$atizacin ms rpida, acompaDada de una gran fluorescencia para prolina e #idro!iprolina. ?e forma similar al +F?'(l, el +F?'E #a sido aplicado tanto a deri$atizaciones precolumna como postcolumna. Los lmites de deteccin para la precolumna estn definidos en el rango de >':> fmol para la mayora de los aminocidos. "l +F?'E tampoco #a sido utilizado ampliamente como mtodo analtico para aminocidos, aunque algunos in$estigadores emplean este reacti$o #abitualmente. *tros reacti$os deri$ados del isotiocianato. "l GL'+,+'dimetilamino'G'azobencenoisotiocianato -? FN0(. #a sido usado satisfactoriamente en la secuenciacin manual y anlisis de nitrgeno terminal de pptidos y protenas. La degradacin tipo "dman de pptidos y protenas efectuada por este agente produce deri$ados tio#idantoin coloreados -? F0)., que pueden ser separados por cromatografa de fase re$ersa. "l mtodo de degradacin generalmente comprende un doble acoplamiento, primero con ? FN0( y luego con PN0(. La G'+,+' dimetilnaftilazobenzeno #omologa del ? FN0( -? + FN0(. #a sido tambin aplicada con !ito, aunque en menor grado que el ? FN0(. ?ifenilindenonilisotiocianato -?NN0(. #a sido estudiada para ser utilizada cuando la espectrometra de masas por ionizacin qumica es acoplada con identificaciones pre$ias por cromatografa de fase re$ersa. La deteccin de deri$ados de tio#idantoin -?N0). se lle$a a cabo por determinacin 67 -en el rango por deba8o del pmol.. La deteccin electroqumica es un utensilio alternati$o. *tros reacti$os isotiocianatos de deri$atizacin precolumna son G'-t'butilo!icarbonilaminometil.fenil isotiocianato -F 9PN0(, deteccin fluorescente., trimetilsisil isotiocianato para anlisis de secuencia de carbono terminal -deteccin 67. y p'+,+'dimetilaminofenil isotiocianato -?9 PN. como una instrumento electroqumico para el anlisis de aminocidos. &eacti$os mi!tos. *tros reacti$os estn siendo continuamente desarrollados y utilizados para detecciones de aminocidos. lgunos tienen aplicaciones muy especficas y limitadas, mientras otros son tratados como posibles competidores para amplios usos en sistemas automticos. 0ales reacti$os incluyen el cido ,,G,='trinitrobencensulfnico -0+F2. y su anlogo ,,G'dinitrobenceno -?+F2., +,+'dietil',,G' dinitro'>'fluoroanilina, fluoro',,G'dinitrobenceno, cido :,:'difenilbrico y :'fluoro',,G'dinitrofenil'>'L' alanina amida -reacti$o de 9arfey.. La deteccin fluorescente es posible cuando se emplean reacti$os tales como pentano',,G'diona/formalde#ido, ;'antrildiazometano, cloruro laril, ,,A'naftaleno' dicarbo!ialde#ido, succinimida ' naftilcarbamato, A'benzoil',quinolina'carbo!alde#ido, ;' #idro!imetilantraceno e isotiocianato fluorescente y :'naftil isocianato. 6n reacti$o quimioluminiscente, G'isocianatoftal#idrazida, tambin #a sido in$estigado. (on e!cepcin del pentano',,G' diona/formalde#ido, donde el reacti$o fue usado en deri$atizacin postcolumna seguida de intercambio inico )PL( de aminocidos, todos los dems fueron utilizados para la deri$atizacin pre$ia de cromatografa de fase re$ersa. "n la siguiente tabla se pueden comparar las diferentes caractersticas de los reacti$os de deri$atizacin ms importantes para la determinacin de aminocidos% R(A)TI*+, "( "(RI*ATI-A)I./ )omple0os Mtodo de 2ost# o pre# con1 separacin columna os : (N( o electroforsis Post' "eteccin 7N2 >@B nm

*P Eluorescamina PN0( (loruro de dansilo (loruro de dabsilo E9*('(l +F?'(l +F?'E

:os :os :os y ,os :os y ,os :os y ,os :os y ,os :os y ,os :os y ,os

(E& -en post' columna,(N(. (N( o electroforsis (E& (E& (E& (E& (E& (E&

Pre' y post' Post' Pre' Pre' Pre' Pre' Pre' y post' Pre' y post'

Eluorescencia Eluorescencia 67 ,GB',>> nm Eluorescencia 7N2 Eluorescencia Eluorescencia Eluorescencia

Preparacin de las muestras. La reaccin con los deri$atizantes forma el mismo cromforo con las aminas primarias que con las secundarias, por tanto las muestras deben estar libres de sales y lpidos antes de que tengan lugar la #idrlisis y los pasos de deri$atizacin. La mayor causa de los ba8os rendimientos en las reacciones de deri$atizacin es la presencia de contaminantes en la muestra, como son las sales no'$oltiles, detergentes y lpidos. Las sales y los tmpones interfieren tanto en la #idrlisis como en la posterior deri$atizacin, distorsionan la cromatografa y aDaden picos e!tra al cromatograma. Las sales pueden ser eliminadas de las protenas y de los pptidos usando tmpones $oltiles y )PL( de fase re$ersa, precipitacin, dilisis o columnas de filtracin de gel. !. "erivati acin pre#columna frente a post#columna Las opiniones de in$estigadores sobre los $enta8as relati$as de la deri$atizacin antes o despus del )PL(, de aminocidos sern determinadas por los requerimientos de la aplicacin especfica. Eactores como la sensibilidad requerida en la deteccin, cantidad de muestra disponible, tipo de muestra, fuente de muestra, $elocidad de anlisis y reproducibilidad e incluso consideraciones econmicas influirn en la eleccin entre la deri$atizacin pre' o post'columna de aminocidos. ?eri$atizacin post'columna. La deri$atizacin siguiendo a una cromatografa de intercambio catinico de aminocidos libres tiene distintas $enta8as, con tal de que la instrumentacin produzca $elocidades y temperaturas de reaccin reproducibles. dems, para la deri$atizacin no es necesario proceder al completo, y los problemas de estabilidad del deri$ado son insignificantes. *tras $enta8as son que la automatizacin es fcil y que el tiempo consumido y la prdida a causa de la preparacin de la muestra son innecesarias. 0ambin pueden ser usados detectores en serie. 6na gran cantidad de e!periencias #an sido adquiridas del tradicional mtodo de intercambio catinico y tincin con nin#idrina, el cual #a resultado ser fiable, preciso y capaz de una separacin e!celente de mezclas comple8as de aminocidos y sus metabolitos. 6na des$enta8a con un sistema )PL( con$encional es que son necesarios instrumentos ms comple8os que para el mtodo de pre'columna. La deri$atizacin post'columna requiere la adicin de una o ms bombas para los disol$entes y reacti$os deri$atizantes. 0ambin se requiere la adicin de un reactor post'columna, el cual lle$ar a un ensanc#amiento de banda adicional, y por esto, un decrecimiento en la sensibilidad de deteccin. La columna de elucin es continuamente diluida por el reacti$o deri$atizante, pro$ocando un descenso en la sensibilidad de deteccin. s, la m!ima sensibilidad alcanzable por deri$atizacin post'columna ser menor que en el caso de la precolumna. ?eri$atizacin pre'columna. Ksta, acoplada con cromatografa de fase re$ersa en lugar de con cromatografa de intercambio catinico, fue originalmente introducida como respuesta al incremento en la demanda de mayor sensibilidad y mayor $elocidad de anlisis. Las $enta8as de la metodologa de la deri$atizacin pre'columna incluyen simplicidad, $elocidad y alta sensibilidad. Por ello, si se requiere m!ima sensibilidad de deteccin, un reacti$o fluorescente combinado con la deri$atizacin pre' columna es el mtodo ms indicado. (omo des$enta8a est la necesidad de garantizarse la completa reaccin del reacti$o deri$atizante y la posibilidad de interferencia con la separacin por e!ceso de reacti$o, el medio de reaccin o la produccin de diferentes deri$ados de un componente. dems, la estabilidad del deri$ado puede ser un importante factor durante la deri$atizacin pre'columna, la demora entre la deri$atizacin y la inyeccin llega a ser fundamental para los resultados obtenidos. $. %i&lio'rafa.

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