ISOLASI DNA BUAH

Oleh: Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten : Kasriati Heruningsih : B1J011155 :3 : IV : Roman Bramandita

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2013

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Pada dasarnya, sel mengandung dua asam nukleat yaitu DNA dan RNA. DNA terletak pada kromosom, dijumpai di nukleus, mitokondria dan kloroplas. Sedangkan RNA dijumpai di nukleus, sitoplasma, dan ribosom. DNA ada dalam setiap sel makhluk hidup. Zat ini disebut cetak biru kehidupan karena memiliki peranan yang sangat penting, yaitu sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain. DNA bisa mengalami denaturasi dan renaturasi. Banyak hal yang mempengaruhi prosestersebut, antara lain suhu yang tinggi, pH ekstrim, kandungan elektrolit Na+ atau K+ dan komposisi basa C-G (Hays, 2005). DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida .Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua benang polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai cetak biru kehidupan karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Istanti, 1999). Teknik molekuler bervariasi dalam cara pelaksanaan untuk mendapatkan data, baik tekniknya maupun tingkatan target data yang diinginkan sesuai kemudahan pelaksanaan, ketersediaan sumber daya manusia, fasilitas, dan dana (Karp et al., 1997). Ekstraksi untuk mendapatkan DNA berkualitas tinggi merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam pencandraan sidik jari DNA. Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang

umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol (Lumaret et al., 1998).

B. Tujuan Tujuan praktikum kali ini adalah untuk mengisolasi DNA kromosom buah dan mengetahui prinsip serta proses isolasi DNA buah.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi Bahan yang digunakan adalah buah strawberry (Fragraria vesca), buah papaya (Carica papaya), buah alpukat (Persea americana), buah mangga (Mangifera indica), buah naga (Hylocereus undatus), deterjen cair, NaCl (garam dapur), etanol, etanol 70%, akuades, dan tenderizer. Alat yang digunakan adalah kantung plastik, tabung ependorf, corong plastik, pipet plastik, sarung tangan, saringan (kain), dan kamera digital.

B. Metode Metode yang digunakan dalam praktikum Isolasi DNA buah kali ini adalah: 1. Buah dimasukkan ke dalam kantung plastik kemudian ditambahkan larutan ekstraksi (900 ml akuades, 100 mL deterjen, 2 sendok teh garam dapur) dan remas-remas hingga hancur 2. Detergen ditambahkan ke dalam kantung plastik 3. Serat - serat buah disaring dengan menggunakan saringan sehingga tersisa larutan dari ekstrak buah. 4. Larutan ditambahkan tenderizer sebanyak satu ujung sendok plastik. 5. Hasil saringan diambil sebanyak 0,5 ml menggunakan pipet kemudian di tampung di dalam tabung ependorf. 6. Etanol absolut (dingin) sebanyak 1,5 ml ditambahkan ke dalam tabung kemudian dihomogenkan. 7. DNA kromosom yang terbentuk berupa kabut putih diamati. 8. Hasil isolasi kemudian disimpan di dalam frezeer agar dapat digunakan untuk elektroforesis dan tidak rusak.

B. Pembahasan Buah yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA buah ini antara lain buah strawberry, buah alpokat, buah pepaya, buah mangga, dan buah naga. Dua buah tersebut masing-masing dimasukkan ke dalam kantung plastik. Kemudian, buah di dalam plastik dihancurkan dengan cara meremas-merasnya dengan tangan. Buah yang sudah hancur dimasukkan larutan ekstraksi sebanyak 50 ml. Larutan ekstraksi terdiri dari 900 ml akuades, 100 ml deterjen, dan 2 sendok teh garam dapur. Buah dalam plastik kemudian diremas kembali untuk mencampurkannya dengan larutan. Setelah tercampur, larutan disaring menggunakan corong plastik dan kain saring. Larutan yang sudah tersaring ditambahkan dengan tenderizer dan dimasukkan ke dalam tabung ependorf. Etanol dingin kemudian ditambahkan sampai volumenya 1,5 ml. kabut putih yang terbentuk dalam tabung ependorf selanjutnya diamati. Alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain kantung plastik yang berfungsi sebagai tempat untuk menghancurkan buah. Corong plastik dan kain kasa berfungsi untuk menyaring larutan yang sudah tercampur dengan buah. Sarung tangan digunakan untuk mencegah DNAse yang ada di kulit merusak DNA. Selain itu, sarung tangan juga menjaga agar terhindar dari bahan-bahan mutagenik dan karsinogenik. Pipet plastik digunakan untuk memindahkan larutan. Tabung ependorf berfungsi untuk sentrifugasi dan kamera digital berfungsi untuk mendokumentasikan hasil pengamatan. NaCl yang digunakan dapat juga digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh NaCl mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA, yaitu kutub yang dapat menyebabkan molekul-molekul saling tolak menolak satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA, DNA tersebut akan terkumpul. Jadi, nampak bahwa selain digunakan untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing buffer, NaCl juga membantu dalam proses pemekatan presrpitasi DNA (Albert, 1994). Sebuah protokol isolasi yang baik harus sederhana, cepat dan efisien, menghasilkan cukup jumlah DNA berkualitas tinggi cocok untuk analisis molekuler. Isolasi DNA buah dapat menggunakan metode ekstrak SDS (Alatar et al., 2012). Deterjen berfungsi untuk melisiskan barier (penghalang) sel secara kimia, sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel, Protein telah terpresipitasi dengan penambahan sodium asetat dengan pH 5.3 melalui

percampuran dalam tabung inverse (Alatar et al., 2012), namun dalam praktikum tidak dilakukan penambahan sodium asetat. Sodium asetat digantikan fungsinya dengan menggunakan tenderizer yang berfungsi sebagai protease untuk penghancur protein. Pemberian alkohol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotorpengotornya. DNA dalam alkohol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan DNA dalam air akan larut, tetapi protein tidak dapat larut dalam air. Tahap tersebut merupakan terakhir, disebut juga tahap presipitasi. Presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Hal tersebut dapat terlihat dengan adanya benang-benang endapan DNA pada dasar tabung (Hays, 2005). Kemurnian DNA diperiksa dengan elektroforesis DNA genom diekstraksi pada 1,5% gel agarosa pada 100 V selama 120 menit di 1X TAE (Tris-base, asam asetat glasial, 0,5 M EDTA) penyangga gel pada agarosa gel elektroforesis terendam. Gel diwarnai dengan 0,25 mg / mL ethidium bromide untuk visualisasi gDNA. Analisis UVIsoft (Gel Dokumentasi dan Analisis Sistem, Uvitec, Cambridge, Inggris) digunakan untuk menangkap gambar dan untuk menghitung ukuran molekul (Alatar et al., 2012). Menurut Albert (1994) konsentrasi DNA yang terpresipitasi tergantung dari beberapa hal, antara lain adalah keenceran sumber DNA yang digunakan dan suhu alkohol. Semakin encer filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Sementara semakin dingin alkohol, DNA yang terpresipitasi semakin pekat. Pernyataan tersebut menyatakan alasan mengapa alkohol yang ditambahkan harus dingin, karena semakin dingin alkohol, maka konsentrasi DNA yang akan terikat oleh alkohol tersebut akan semakin pekat atau tinggi. Kadar air juga mempengaruhi presipitasi DNA, semakin tinggi kadar air yang terkandung dalam buah maka semakin rendah DNA yang akan terpresipitasi. Berdasarkan pengamatan, didapatkan hasil bahwa isolasi DNA strawberry kedua-duanya memiliki hasil positif. Begitu juga pada buah mangga dan buah

alpukat. Namun, pada buah pepaya menunjukkan hasil negative dan pada buah naga menunjukkan hasil positif pada tabung eppendorf pertama dan hasil negative pada tabung eppendorf kedua. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya kabut putih yang terbentuk. Sebaliknya, hasil negatif ditunjukkan dengan tidak adanya kabut putih

yang terbentuk. Tidak terbentuknya kabut putih tersebut diduga karena buah yang belum benar-benar hancur atau buah belum tercampur sempurna dengan etanol dingin absolut. Hasil yang positif sesuai dengan pernyataan Jamilah (2005) bahwa pada saat penambahan etanol, larutan akan tampak terbalik untuk beberapa saat, dan pada akhirnya ethanol akan berada di bagian atas tabung, sementara filtrat berada dibagian dasar tabung karena etanol memiliki kerapatan yang lebih kecil dibandingkan air. Isolasi DNA merupakan proses pemisahan dan pengambilan molekul DNA dari sel serta materi intrasel lainnya. Isolasi DNA genom sangat penting dalam rangka pengklonan DNA atau gen sasaran. Konstruksi pustaka genom dan pengklonan DNA membutuhkan DNA yang utuh agar fragmen DNA betul-betul berasal dari proses pemotongan enzimatik yang sangat spesifik. Apabila terpotongnya DNA bukan karena reaksi enzimatik, maka fragmen DNA tersebut sulit disambungkan dengan DNA dari vektor pengklonan. Oleh sebab itu, isolasi DNA genom yang utuh sangat diperlukan bila DNA tersebut akan diproses untuk pengklonan (Suharsono dan Widyastuti, 2006 dalam Anam, 2010). Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: (1) Isolasi sel; (2) Lisis dinding dan membran sel; (3) Ekstraksi dalam larutan; (4) Purifikasi; dan (5) Presipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm. Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA (Rogers and Bendich, 1994). DNA hasil isolasi perlu dimurnikan terlebih dahulu. Pemurnian DNA bertujuan untuk memperoleh DNA yang terbebas dari kontaminasi senyawa dan makromolekul lain. Tahapan yang dilakukan untuk memperoleh DNA murni yaitu membebaskan DNA dari dinding dan membran sel, disosiasi kompleks DNA-protein

dengan cara denaturasi atau proteolisis, serta pemisahan DNA dari berbagai makromolekul lain (Ausubel et al., 1990). Pemurnian DNA dilakukan dengan menambahkan etanol ke dalam larutan yang mengandung DNA. Penambahan etanol dapat menyebabkan terjadinya pengendapan DNA (Sudjadi, 2008). DNA juga dapat diendapkan dengan larutan isopropanol, namun larutan ini lebih sulit menguap dibandingkan dengan etanol sehingga memerlukan waktu yang lebih lama dalam proses evaporasi. Menurut Syafaruddin dan Santoso (2011), seiring dengan berkembangnya ilmu pengetahuan yang mampu mendukung akselerasi kemajuan dari seleksi untuk mendapatkan karakter yang diinginkan, berbagai metode seleksi dengan

memanfaatkan isolasi DNA juga berkembang, antara lain adalah seleksi dilakukan pada tingkat gametofit dan sporofit, seleksi secara in vitro, dan seleksi tingkat molekuler. Metode PCR dengan menggunakan sepasang primer, yang meliputi : STSs (Sequence-Tagged Sites) dan (SCARs) Sequence Characterized Amplified Regions, DALP (Direct Amplification of Length Polymorphism), SSRs (Simple Sequence Repeats), IFLP (Intron Fragment Length Polymorphism), ESTs (Expressed Sequence Tags), RAMP (Random Amplified Microsatellite Polymorphism) dan REMAP (Retroposon-Microsatellite Amplified Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) dan modifikasinya, SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) dan melacak beberapa sifat QTL (Quantitative Trait Locus). Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis atau forensik, seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman untuk tujuan diagnostik. Di sisi lain, ilmu forensik perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu (misalnya bagi pencuri, kecelakaan atau korban perang), penentuan ayah atau identifikasi hewan.

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan sebelumnya dapat diambil kesimpulan bahwa: 1. Hasil isolasi DNA buah strawberry (Fragraria vesca), buah mangga (Mangifera indica), buah alpukat (Persea americana), dan buah naga (Hylocereus undatus) adalah positif, yang artinya terdapat kabut putih pada tabung ependorf. Sedangkan hasil isolasi DNA buah papaya (Carica papaya) dan adalah negatif. 2. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu isolasi sel, lisis dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi.

B. Saran Untuk praktikum selanjutnya sebaiknya alat dan bahan disediakan lengkap sehingga tidak ada langkah kerja yang terlewatkan karena lupa dan sebaiknya asisten selalu mengingatkan cara kerja kepada praktikan.

DAFTAR REFERENSI

Alatar, A.A. Mahmoud, M.A. Al-Sohaibani, S.A. dan Abd-Elasalam, K.A. 2012. Simple and rapid protocol for the isolation of PCR-amplifiable DNA from medicinal plants. Genetics and Molecular Research 11 (1): 348-354 (2012). Albert, Brush. 1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2. Gramedia, Jakarta. Anam, K. 2010. Laporan II Isolasi DNA Genom. Institut Pertanian, Bogor. Ausubel FM et al. 1990. Current Protocols in Molecular Biology. Kanada, John Willey & Sons. Hays, Lana. 2005. Introduction to DNA Extraction, (http://www.tsl.orst.edu.tgerc/dnaext.html, diakses 18 Mei 2013). (Online),

Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM. Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang. Karp, A., S. Kresovich, K.V. Bhat, W.G. Ayad, and T. Hodgkin. 1997. Molecular Tool in Plant Genetic Resources Conservation: A Guide to The Technologies. IPGRI Technical Bulletin no. 2. Lumaret, R., H. Michaud, J.P. Ripoll, and L. Toumi. 1998. Chloroplast DNA Extraction Procedure For Species High In Phenolics And Polysaccharides. p. 15-17. In A. Karp, P.G. Isaac, and D.S. Ingram (Eds.). Molecular Tool for Screening Biodiversity. Chapman and Hall, London. Rogers, S.O. and Bendich, A.J. 1994. Extraction of total celluler DNA from plants, algae, and fungi. Plant Mol Biol DI: 1-81. Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta, Kanisius. Syafaruddin dan T. J. Santoso. 2011. Optimasi Teknik Isolasi dan Purifikasi Dna Yang Efisien dan Efektif Pada Kemiri Sunan (Reutalis trisperma (Blanco) Airy Shaw). Jurnal Littri 17(1), Maret 2011. Hlm. 11 17.