Universidade Federal do ABC

Transformações Bioquı́micas

Experimento 1: Espectrofotometria

Grupo 3
Amadeus Folego da Silva
Cecı́lia Liebort Nina
Eduardo Luiz Kerchner
Felipe Gobatto
Weslei Rosante Lima
Prof. Responsável
Jiřı́ Borecký

31 de outubro de 2009
Sumário

Introdução 2

Objetivo 5

Parte experimental 6
Arranjo experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Cálculo dos reagentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

Resultados 8
Dados do colorı́metro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Dados do espectrofotômetro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

Discussão 9
O método do Biureto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Ajuste do modelo de Beer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Espectro de absorbância . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

Conclusões 11

Referências Bibliográficas 12

1
Introdução

desenvolvimento de métodos para caracterização de proteı́nas tem sido fundamentalmente relevante

O para diversas áreas do conhecimento: favorecendo o diagnóstico de certas doenças, permitindo o
desenvolvimento de matérias primas de maior qualidade tanto na área de engenharia de alimentos quanto
na sı́ntese e purificação de proteı́nas em biotecnologia.

Espectrofotometria
São vários os métodos para determinação de concentração de proteı́nas, no entanto o mais utilizado é
a espectrofotometria no Ultravioleta e no visı́vel (UV-vis) (ZAIA; ZAIA; LICHTIG, 1998). Toda substância
absorve e transmite energia luminosa em função de sua estrutura molecular. Há uma intrı́nseca relação
entre as concentrações das soluções e a absorbância. Através dessas caracterı́sticas e utilizando o instru-
mento fotométrico, podem ser feitas análises comparativas de soluções.

Há obviamente outros métodos de análise de concentração de substâncias, no entanto, em função da

estrutura das moléculas de proteı́na, que lhes confere atividade óptica, o método de Espectrofotometria
foi tido como o de melhor precisão para a análise em questão (JUNIOR et al., 2007). No referido expe-
rimento nos utilizamos desses conhecimentos para quantificar a dosagem de proteı́nas em uma solução
de albumina bovina (BSA) e reagente de biureto, composta por CuSO4 0,15% (m/v), tartarato de Na e
KOH 0,6% (m/v) e NaOH 0, 75 mol/L.

Os dados puderam ser observados através da medição de diferentes soluções (concentrações) de BSA
pelo instrumento de medição Colorı́metro e a elaboração de um gráfico que determinou uma curva de
absorbância de BSA a partir da análise obtida no Espectofotômetro.

Dois aspectos foram muito importantes na execução do experimento: a tara do colorı́metro e a exa-
tidão no preparo das soluções. A troca dos tubos de concentrações diferentes de BSA pode acarretar
um grande erro na elaboração da curva se não for observada no momento do experimento. Já a tara é
necessária para informar ao instrumento quais são os comprimentos de onda que queremos “isolar”.

Fundamentação teórica
É frequentemente utilizada para medir a relação entre a intensidade de luz emitida e a intensidade
absorvida pela proteı́na a grandeza denominada absorbância. A absorbância é definida, sendo I1 a
intensidade emitida e I2 a intensidade absorvida, da seguinte maneira:
I2
A = − log
I1
Após a obtenção dos dados utilizamo-nos da Lei de Lambert-Beer para que pudéssemos analisar de forma
crı́tica o experimento desenvolvido em laboratório.

Lei de Lambert-Beer. A lei de Lambert-Beer declara que a absorbância é proporcional à concentração,

sendo fatores de proporcionalidade o caminho ótico percorrido na amostra e um fator empı́rico chamado
absortividade.

2
Introdução Experimento 1: Espectrofotometria

Ou seja, sendo A a absorbância e C a concentração da substância temos que:

A = ε`C

onde ` é o comprimento do caminho ótico e ε a absortividade (este pode ser denominado coeficiente de
absorção ou ainda de extinção).

Albumina Bovina
A Albumina é a mais abundante proteı́na presente no plasma de seres humanos e outros mamı́feros,
possui peso molecular de aproximadamente 65kD e consiste de 584 aminoácidos sem presença de carbohi-
dratos.

Esta proteı́na é essencial para a manutenção da pressão osmótica, que é necessária para a devida
distribuição dos fluidos corporais entre os compartimentos intravasculares e os tecidos corporais. Ela
também age como portadora no plasma de diversos hormônios esteróides hidrofóbicos e como uma proteı́na
de transporte para a hemina e ácidos graxos. Quando associada ao metal cobre ela recebe atividade óptica
que pode ser analisada por espectrofotometria. Sua estrutura nativa pode ser visualizada1 na figura 1.

Figura 1: Estrutura nativa da albumina bovina (BSA)

Já a Albumina Bovina2 (Bovine serum albumin em inglês, abreviada BSA) é comumente utilizada em
procedimentos imunodiagnósticos, como reagente em quı́mica clı́nica, em meio de cultivo de células, na
pesquisa em proteı́nas e em laboratórios de biologia molecular (usualmente para aprimorar suas proprie-
dades protéicas de ligação não especı́ficas).

1 Foi utilizado para a elaboração da figura 1 o software pyMol: DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System

(2002) disponı́vel em http://www.pymol.org

2 Sua sequência de aminoácidos pode ser obtida em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/3336842?report=genpept

3
Introdução Experimento 1: Espectrofotometria

Capı́tulos
O presente trabalho divide-se em seis capı́tulos, a seguir são descritos os próximos:

• Objetivos. A motivação e propósitos do trabalho.

• Parte experimental. Descreve-se como é montado o arranjo experimental e efetuado o experi-
mento.

• Resultados. São apresentados os dados obtidos pelo experimento.

• Discussão. Os dados apresentados no capı́tulo anterior são analisados e discute-se o que pode ser
inferido a partir disso.
• Conclusão. As conclusões obtidas pelo grupo sobre a atividade feita.

4
Objetivos

ste relatório refere-se ao primeiro experimento realizado em laboratório: Espectrofotometria, no qual

E utilizamos as propriedades de isolamento das frequências da luz, emitidas por um instrumento a fim
de se analisar a absorbância da Albumina Bovina.

Através da quantificação das concentrações das substâncias analisadas no experimento, pretendeu-se

assimilar os estudos teóricos sobre as proteı́nas com o conhecimento sobre o método de Espectrofotometria,
bem como as propriedades envolvidas na análise e suas relações com a Lei de Lambert-Beer.

5
Parte experimental

Arranjo experimental
O arranjo experimental foi formado pelas soluções de BSA reagidas com uma solução analı́tica de
biureto, um espectrofotômetro calibrado para medir na faixa de 400-800 nm com passo de 10 nm e
um colorı́metro calibrado para operar em 550 nm. A solução de biureto e as amostras de BSA foram
previamente preparadas pelos colaboradores da disciplina.
As amostras originais de BSA são soluções com as seguintes concentrações: 0.125% (m/v), 0.25%
(m/v), 0.5% (m/v), 0.75% (m/v), 1% (m/v), 1.25% (m/v) e 1.75% (m/v).

Cálculo dos reagentes

Foi preparada uma solução analı́tica de reagente de Biureto, composta por sulfato de cobre 0,15%
(m/v), tartarato de sódio e potássio 0,6% (m/v) e hidróxido de sódio (NaOH) 0,75 mol/L.
Para preparar 100 mL de tal solução calcula-se a quantidade de cada reagente a ser adicionado:

Sulfato de cobre
Obtemos a massa de sulfato de cobre (CuSO4 ) adicionada à solução de Biureto:
O produto da massa molar de CuSO4 (249.68 g/mol) pela concentração de CuSO4 na solução de
100mL do Biureto (0,15 mol/L x 0,1 L = 0,015 mol). Logo, a massa de CuSO4 é resultado do produto
de: (249.68 g/mol x 0,015 mol) que é aproximadamente 3,75 g.

Tartarato de sódio e potássio

Obtemos a massa de tartarato de sódio e potássio (KNaC4 H4 O6 ·4H2 O) adicionada à solução de
Biureto:
O produto da massa molar de KNaC4 H4 O6 ·4H2 O (282.1 g/mol) por sua concentração em 100mL de
Biureto é 0,6 mol/L x 0,1 L = 0,06 mol. Logo, a massa adicionada do produto é: 282.1 g/mol x 0,06 mol
que é aproximadamente 16,93 g.

Hidróxido de sódio
Obtemos a massa de hidróxido de sódio (NaOH) contida na solução de Biureto calculando:
O produto da massa molar de NaOH (39.9971 g/mol) pela concentração de NaOH na solução de
100mL do Biureto é 0,75 mol/L x 0,1 L = 0,075 mol. Logo, a massa de NaOH adicionada é: 39,9971
g/mol x 0,075mol = 3 g.

Amostras de BSA
A seguir apresentamos a quantidade de BSA em massa necessária para formar 100 mL de cada amostra
original. Relembrando que Concentração = massa (g)/volume (L).

Tubo 3 - Concentração de 0,125% (m/v)

0,00125 g/L = m/0,001L — m = 1, 25.10−6 g

6
Parte experimental Experimento 1: Espectrofotometria

Tubo 2 - Concentração de 0.25% (m/v)

0,0025 g/L = m/0,001L — m = 2, 5.10−6 g

Tubo 4 - Concentração de 0.5% (m/v)

0,005 g/L = m/0,001L — m = 5.10−6 g

Tubo 5 - Concentração de 0.75% (m/v)

0,0075 g/L = m/0,001L — m = 7, 5.10−6 g

Tubo 6 - Concentração de 1% (m/v)

0,01 g/L = m/0,001L — m = 1.10−5 g

Tubo 7 - Concentração de 1,25% (m/v)

0,0125 g/L = m/0,001L — m = 1, 25.10−5 g

Tubo 8 - Concentração de 1,75% (m/v)

0,015 g/L = m/0,001L — m = 1, 75.10−5 g

Procedimento
Antes de iniciar as reações foi feita a identificação dos 9 tubos de ensaio utilizados no experimento,
cada tubo recebeu a identificação Xn, sendo n números únicos de 1 à 9. A identificação seqüencial dos
tubos de ensaio seguiu a ordem de concentração da solução de BSA, da menor para a maior concentração.

Inicialmente, para determinar o pico de transmitância com base no comprimento de onda foi adicio-
nado a uma cubeta o conteúdo do tubo de ensaio X8 (solução de biureto e BSA 1,75% (m/v) e levado
ao espectrofotômetro para varredura da faixa do espectro eletromagnético compreendido entre os com-
primentos de onda 400nm a 800nm, a varredura foi realizada em passos de 10 em 10 nm. O pico de
transmitância foi alcançado no comprimento de onda 545 nm.

Para obtenção dos valores da curva-padrão foram utilizados 8 tubos de ensaio com soluções de biureto
reagido com as soluções de concentração variada de BSA, além de 1 tubo branco preparado com a adição
de água no lugar da amostra de BSA. Composição do tubo branco: 2 mL de H2O destilada.

Para a preparação e medição de todas as amostras foram realizados o seguintes passos:

1. Adicionado 0,5 mL da amostra de BSA e completado o volume com mais 1,5 mL de H2 O destilada.
No caso do tubo branco foi utilizado apenas H2 O destilada.
2. Agitado a solução de BSA e H2 O destilada em um agitador tipo vórtex por aproximadamente 5
segundos
3. Após completado os passos 1 e 2 os tubos foram deixados em repouso, na estante, por cinco minutos.
4. Terminado o repouso, uma amostra de cada vez foi colocada em uma cubeta e submetida ao
colorimetro para determinação da absorbância das soluções. Após a medição a cubeta foi secada e
utilizada novamente para o próxima amostra. Os resultados das medições foram anotados.

Houve um incidente com o tubo 5, acidentalmente foi adicionada a amostra BSA de concentração
1.25% (m/v) ao invés de 0.75% (m/v), problema que foi solucionado refazendo-se o procedimento para
outro tubo, que foi rotulado X10.

7
Resultados

seguir apresentamos os dados obtidos no experimento: primeiramente uma correlação entre a con-
A centração e a absorbância medida das amostras de BSA e logo após, o conjunto de dados fornecido
pelo espectrofotômetro interpolado linearmente.
Foi adicionado em cada tubo 0, 5 mL de amostra original de BSA. Como o volume final no tubo é de
3,5 mL, devemos multiplicar o valor da concentração de cada amostra original de BSA por 1/7. Dessa
maneira temos a concentração real de BSA das amostras utilizadas no espectrofotômetro e colorı́metro.

Dados do colorı́metro
Rótulo Concentração Ci [%(m/v)] Absorbância Ai [u.a] Comentário
1 N/A N/A Branco
2 0.0357 0.10 —
3 0.0179 0.05 —
4 0.0714 0.21 —
5 0.1071 0.53 A. corrompida
6 0.1429 0.31 —
7 0.1786 0.46 —
8 0.2500 0.53 —
9 N/A 0.17 A. desconhecida
10 0.1071 0.26 A. refeita

Dados do espectrofotômetro
O espectro de absorbância medido pelo espectrofotômetro pode ser visto na figura 2.

0.6

0.5

0.4
Absorbancia [u.a.]

0.3

0.2

0.1

−0.1
400 450 500 550 600 650 700 750 800
Comprimento de onda [nm]

Figura 2: Curva de absorbância para BSA em 0.25% (m/v)

8
Discussão

O método do Biureto
Muitos métodos espectrofotométricos, ao longo dos anos, têm sido propostos para a determinação de
proteı́nas totais3 , não existe nenhuma metodologia considerada de uso universal para todos os meios. Um
dos métodos mais utilizados é o do Biureto, que se baseia no reativo Biureto, constituı́do de uma mistura
de cobre e de hidróxido de sódio com um complexante que estabiliza esse metal em solução, sendo o
tartarato de sódio recomendado por (GORNALL; BARDAWILL; DAVID, 1951). O cobre, em meio alcalino,
reage com proteı́nas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptı́dica. O produto da
reação apresenta duas bandas de absorção, uma em 270 nm e outra em 540 nm.

Apesar de a banda na região dos 270 nm aumentar seis vezes a sensibilidade do método, a região de
540 nm é mais utilizada para fins analı́ticos, porque diversas substâncias normalmente presente nos meios
utilizados absorvem na região dos 270 nm, causando muita interferência na resposta espectral do método
(JUNIOR et al., 2007).

Segundo (ZAIA; ZAIA; LICHTIG, 1998) não há ainda um procedimento tido como definitivo para espec-
trofotometria entre os diversos propostos, geralmente utiliza-se o mais empregado, isso se deve principal-
mente à falta de trabalhos que mostrem uma comparação entre os diversos métodos disponı́veis.

Ajuste do modelo de Beer

Estamos interessados em analisar a relação entre a absorbância Ai e concentração Ci de BSA de cada
amostra, logo podemos aplicar a lei de Lambert-Beer (INGLE, 1988) da seguinte maneira:

Ai = εbsa `c Ci (1)

onde εbsa é a absortividade da Albumina Bovina e `c = 1 cm é o comprimento da cubeta utilizada.

Ajustamos o fator εbsa do modelo aos dados experimentais. Para isso foi utilizado o método de oti-
mização por mı́nimos quadrados4 , o resultado obtido foi εbsa = 2, 303 ± 0, 237 cm−1 .

Podemos agora prever a concentração de BSA da amostra desconhecida utilizando a equação 1:

A9 = 0.0738 ± 8, 5.10−3

É visı́vel que, apesar de uma ligeira dispersão dos dados experimentais estes aderem bem à reta calcu-
lada. Isso significa que a lei de Lambert-Beer pode ser aplicada confiavelmente como modelo para nosso
experimento.

Devem ser levadas em consideração também as condições do experimento, pois ε pode variar com a
temperatura, pH (JUNIOR et al., 2007), etc... No entanto, acreditamos que a amostra não tenha sofrido
mudanças bruscas destas condições, o que implica que sob condições próximas às do experimento realizado
sua reprodução deve fornecer dados relativos à absortividade próximos aos da medida.

3 Entre eles, o método de Bradford, o de Lowry e o de Smith (ou resumidamente BCA)

4 Foi utilizado para a elaboração das figuras 2, 3 e 4; e também para otimização, o software Matlab.

9
Discussão Experimento 1: Espectrofotometria

0,53
Absorbancia [u.a.] 0,46

Amostra desconhecida
0,31
Ajuste ao Modelo
0,26
Faixa de erro
0,21
0,17 Dados Experimentais

0,1
0,05

0,0179 0,0357 0,0714 0,1071 0,1429 0,1786 0,25

Concentracao de BSA [%(m/v)]

Figura 3: Gráfico apresentando os dados obtidos pelo colorı́metro e o ajuste do modelo de Lambert-Beer

Espectro de absorbância
Os dados experimentais evidenciam que o máximo de absorbância na faixa de 400-800 nm da albu-
mina bovina é obtido em 545 ± 5 nm. Além disso, mostram que a localização do máximo independe da
concentração da amostra, como mostra a figura 4.

1 Procedimento 1
Procedimento 2
Absorbancia normalizada [u.a.]

0.8 Procedimento 3
Procedimento 4
0.6 Procedimento 5
Procedimento 6
0.4 Procedimento 7
Procedimento 8
0.2 Procedimento 9

−0.2

400 450 500 550 600 650 700 750 800

Comprimento de onda [nm]

Figura 4: Curvas de absorbância normalizadas de BSA para diversas concentrações

Portanto justifica-se a calibração dos colorı́metros em 550 nm: a absorbância é maior neste compri-
mento de onda, o que permite uma resolução ótima. E verifica-se o proposto por (ZAIA; ZAIA; LICHTIG,
1998).

10
Conclusões

ste trabalho introduziu novos conceitos cientı́ficos ao grupo, desde métodos de redação e pesquisa bi-
E bliográfica até conhecimento relativo à bioquı́mica e pesquisa cientı́fica. Especificamente, o trabalho
exigiu que os alunos reconhecessem a interface entre teoria e prática em pesquisa e fossem capazes de
compreender o que significa cada proposição envolvida.

Desta forma o grupo conclui que o experimento foi deveras proveitoso para todos, impressionando
positivamente todos os integrantes com relação à colaboração e competência dos envolvidos.

11
Referências Bibliográficas

GORNALL, A. G.; BARDAWILL, C. J.; DAVID, M. M. Determination of serum proteins with the folin
phenol reagent. J. Biol. Chem, v. 193, p. 265–271, 1951.

INGLE, J. D. Spectrochemical Analysis. 1. ed. [S.l.]: Prentice Hall, 1988.

JUNIOR, J. B. S. et al. Interferência do ph, concentração de bsa e de tampão fosfato sobre a resposta
na determinação de proteı́na total pelo método do biureto. Exacta, São Paulo, v. 5, n. 2, p. 335–341,
jul./dez. 2007. ISSN 1983-9308. Revista Online.
ZAIA, D. A. M.; ZAIA, B. V.; LICHTIG, J. Determinação de proteı́nas totais via espectrofometria:
vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Quı́m. Nova, São Paulo, v. 21, n. 6, Nov./Dec. 1998.
ISSN 0100-4042. Disponı́vel no acervo Scielo.

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