Anda di halaman 1dari 9

BAB III

METODE PENELITIAN
.
3.1. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian akan dilakukan di labolatorium kultur jaringan Balai Pengkajian
Bioteknologi, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT), Serpong. Waktu
penelitian 4 bulan, dimulai pada bulan April 2007 sampai akhir bulan juli 2007.

3.2. Bahan dan Alat


3.2.1. Bahan
Dalam penelitian ini akan digunakan bahan eksplan berupa pucuk. Pucuk
yang diambil dari perkecambahan biji secara in vitro tanaman kamboja (Plumeria
Sp.) berasal dari taman Pejompongan-Jakarta berumur 4-5 minggu. Media yang
digunakan adalah MS0 yang dibagi menjadi 6 stok (A, B, C, D, E, F) dengan masing-
masing merupakan bahan tipe analis. Stok A adalah NH4NO3, stok B adalah KNO3,
stok C adalah CaCl2.2H2O, stok D adalah MgSO4.7H2O dan KH2PO4, stok E adalah
ZnSO4.7H2O, MnSO4.H2O, KI, CuSO4.5H2O , CoCl2.6H2O, dan H3BO3. Dan Stok F
adalah FeSO4 dan Na2EDTA. Vitamin berupa thiamine.HCL, pyridoxin.HCL,
nicotinic acid, glycine dan myo-inositol. Gula menggunakan gula pasir merek
”gulaku”. Sebagai bahan pemadat digunakan agar-agar. Pengaturan pH pada nilai 5,8
dilakukan dengan penambahan NaOH untuk menaikan nilai pH dan HCl untuk
menurunkan nilai pH. Komposisi media MS dapat dilihat pada Lampiran 1.
Zat pengatur tumbuh yang digunakan adalah BAP dari golongan sitokinin dan
IBA dari golongan auksin dengan konsentrasi yang disesuaikan pada perlakuan.
Bahan-bahan lainnya yang digunakan adalah aquades, alkohol 96 %, dan sabun
deterjen merek ”attack”.

23
3.2.2. Alat
Alat yang digunakan untuk pembuatan media adalah gelas ukur, gelas beaker,
labu ukur, pH-meter, pinset, hot plate dan magnetic stirrer, corong gelas, pipet tetes,
botol kultur, autoklaf, rak kultur, timbangan, microwave, dan perekat plastik.
Alat yang digunakan untuk sterilisasi dan tahapan penanaman adalah lampu
bunsen, laminar air flow cabinet, cawan petri, scalpel, gunting, pisau bedah, pinset,
botol ukur dengan ukuran 1000 ml dan 2000 ml, serta spons. Alat-alat lainnya yang
digunakan adalah kertas label, kamera, penggaris, lemari es untuk menyimpan stok,
ruang thermostatik dengan AC pendingin dan lampu TL sebagai sumber cahaya.

3.3. Metode
3.3.1. Metode sterilisasi
Buah kamboja jenis Plumeria Rubra yang sudah tua dengan warna ungu
kehitaman dicuci dengan deterjen menggunakan spons kemudian di bilas hingga
bersih. Setelah dicuci, proses sterilisasi berikutnya dilakukan didalam laminar air
flow cabinet. Buah kamboja dicelupkan kedalam alkohol 96% lalu dibakar 10 detik,
kemudian dikupas kulit bagian luarnya menggunakan pisau bedah, setelah itu
celupkan kembali kedalam alkohol 96% kemudian di bakar. Lalu belah kulit bagian
dalam meggunakan pisau bedah dan ambil biji-biji plumeria menggunakan pinset.
Selanjutnya biji-biji tersebut dikupas menggunakan pisau bedah (ambil bagian
kotiledon dan jangan sampai mata tunasnya terpotong), pada bagian inilah yang
nantinya akan dikecambahkan pada tabung kultur, kecambah yang tumbuh pada
tabung kultur dijadikan sebagai sumber eksplan. Sumber eksplan yang digunakan
dalam penelitian ini adalah bagian pucuk.

3.3.2. Metode Pencucian Tabung Kultur


Tabung kultur dicuci menggunakan sabun cair merek “sunlight”, setelah
proses pencucian selesai tabung digantung di atas rak untuk menghilangkan air yang

24
masih menempel pada saat pencucian. Setelah kering tabung disterilisasi
menggunakan autoklaf untuk memperkecil adanya kontaminan dalam media.

3.3.3. Metode Pembuatan Media


Media yang digunakan dalam perkecambahan biji adalah media MS tanpa
hormon. Media MS dibuat dengan memipet larutan stok A, B, C, D, E dan F dengan
konsentrasi 100x, vitamin yang terdiri dari glisin, asam nikotinat, piridoksin, thiamin
HCl dan myo inositol, kemudian ditambahkan gula dan agar. Untuk pembuatan 1 liter
media, masing-masing larutan stok dipipet sebanyak 10 ml dan dimasukkan ke dalam
labu ukur 1000 ml kemudian ditambahkan vitamin, myo-inositol 100 mg/l, serta gula
20 g/l. Campuran larutan media ini kemudian dihomogenkan dengan menggunakan
magnetic stirrer sambil ditambahkan aquades hingga mencapai volume 1000 ml.
Pindahkan larutan media kedalam gelas beaker lalu diukur pHnya pada pH 5,8
menggunakan pH meter. Jika pH yang diukur lebih dari 5,8 maka dapat diturunkan
dengan penambahan HCl 0,1 N dan jika pH kurang dari 5,8 maka dapat dinaikkan
dengan penambahan NaOH 0,1 N sehingga didapatkan pH yang diinginkan.
Setelah media diukur pH-nya lalu ditambahkan pemadat berupa agar
sebanyak 7 g/l sambil dihomogenkan, kemudian tutup labu ukur dengan plastik seal
dan diberi beberapa lubang, kemudian dimasak sampai mendidih menggunakan
mikrowave. Setelah mendidih media dituang dalam tabung kultur sebanyak 10
ml/tabung dan ditutup, kemudian disterilisasi dengan autoclave pada tekanan 1 atm,
suhu 121oC selama 20 menit. Simpan tabung- tabung media ke dalam ruang kultur
yang tidak berlampu selama minimal 4 hari. Pendiaman tabung-tabung media selama
4 hari bertujuan untuk mengetahui adanya kontaminan endogen pada medium kultur,
setelah 4 hari media siap untuk digunakan.
Media yang digunakan dalam tahapan kultur pucuk adalah MS ditambah ZPT
BAP dan IBA dengan konsentrasi sebesar 0,5; 1; 1,5; 2 PPM ( mg/L), dengan
kombinasi seperti tersaji pada Tabel 1. Sebagai kontrol digunakan media MS tanpa

25
zat pengatur tumbuh. Untuk pembuatan 1 liter media, maka dilakukan cara yang sama
seperti pada pembuatan media MS. Perbedaannya pada saat sebelum ditera terlebih
dahulu ditambahkan ZPT dengan konsentrasi yang diinginkan, tambahkan air suling
sampai dengan 1000 ml kemudian diukur pHnya.

3.3.4. Metode kultur dan subkultur tanaman


Setelah kultur/kecambah berumur 4 minggu atau eksplan sudah tumbuh
kuncup dapat dilakukan kultur. Kultur tanaman dilakukan dalam LAFC (Laminair
Air Flow Cabinet). Sebelum digunakan LAFC permukaannya dibersihkan
menggunakan alkohol 96% . Eksplan dikeluarkan menggunakan pinset dan
diletakkan di atas cawan petri steril kemudian pucuknya di potong menggunakan
gunting bedah dan setelah itu di transfer ke tabung kultur berisi media perlakuan.
Pada proses transfer, ujung penutup tabung bagian bawah dan ujung atas
tabung dilewatkan pada api sebelum eksplan dimasukan dalam tabung. Tujuannya
untuk mengurangi tingkat kontaminasi dari ujung penutup tabung akibat sentuhan.
Setelah eksplan dimasukan dalam tabung proses pelewatan api dilakukan ulang
sebelum dilakukan penutupan tabung. Kemudian setelah selesai transfer tabung
diisolasi menggunakan plastik pembungkus/ plastik seal. Tabung yang sudah diisolasi
dimasukan dalam rak, kemudian diinkubasi di ruang termostatik dengan suhu 25o C
selama 5 minggu.

Gambar 14. Kecambah kamboja usia : 1 MST, 2 MST, dan 4 MST.

26
Setelah 5 minggu eksplan dikulturkan dalam ruang kultur, eksplan yang telah
menghasilkan kalus beserta tunas adventif maupun tunas aksilar disubkultur ke dalam
media baru dengan perlakuan zat pengatur tumbuh yang sama. Subkultur bertujuan
untuk mengganti media yang kandungan hara dan karbonnya hampir habis dengan
media baru yang kandungan hara dan karbon masih lengkap guna pertumbuhan dan
perkembangan eksplan. Eksplan dikeluarkan dalam laminar, kemudian dipisahkan
dari pucuk, hipokotil dan kalus-kalusnya. Pucuk, batang dan kalus atau akar
dikulturkan kembali ke dalam media dengan zat pengatur tumbuh dan konsentrasi
yang sama seperti sebelumnya.

3.4. Teknik Analisa Data


3.4.1. Rancangan Perlakuan
Setelah eksplan dikultur dan disubkultur ke media perlakuan lalu dilakukan
pengamatan secara kualitatif dan kuantitatif. Pengamatan dilakukan tiap minggu
selama 10 minggu. Pengamatan secara kualitatif berdasarkan pada perubahan yang
terjadi pada eksplan dan pengamatan secara kuantitafif meliputi:
1. Persentase eksplan yang terkontaminasi
2. Jumlah pucuk yang tumbuh
3. Tinggi pucuk
4. Jumlah pucuk yang tumbuh pada hipokotil
5. Tinggi batang
6. Kalus
Penelitian ini akan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) 2 faktor yang
terdiri dari 25 kombinasi perlakuan ZPT dan masing – masing kombinasi terdapat 5
ulangan, sehingga terdapat 125 satuan percobaan. Pada Tabel 1 tersaji 25 kombinasi
perlakuan ZPT sebagai berikut :

27
Tabel 1. Tabel Perlakuan ZPT.
BAP (mg/L)
Perlakuan 0 0,5 1 1,5 2
0 1 2 3 4 5
I 0,5 6 7 8 9 10
1 11 12 13 14 15
B (mg/L) 1,5 16 17 18 19 20
A 2 21 22 23 24 25

Keterangan:
1. Perlakuan dengan media MS0 ( kontrol)
2. Perlakuan dengan media MS0 + BAP 0,5 mg/L
3. Perlakuan dengan media MS0 + BAP 1 mg/L
4. Perlakuan dengan media MS0 + BAP 1,5 mg/L
5. Perlakuan dengan media MS0 + BAP 2 mg/L
6. Perlakuan dengan media MS0 + IBA 0,5 mg/L
7. Perlakuan dengan media IBA+ BAP 0,5 mg/L
8. Perlakuan dengan media BAP 1 mg/L + IBA 0,5 mg/L
9. Perlakuan dengan media BAP 1,5 mg/L + IBA 0,5 mg/L
10. Perlakuan dengan media BAP 2 mg/L + IBA 0,5 mg/L
11. Perlakuan dengan media MS0 + IBA 1 mg/L
12. Perlakuan dengan media BAP 0,5 mg/L + IBA 1 mg/L
13. Perlakuan dengan media BAP 1 mg/L + IBA 1 mg/L
14. Perlakuan dengan media BAP 1,5 mg/L + IBA 1 mg/L
15. Perlakuan dengan media BAP 2 mg/L + IBA 1 mg/L
16. Perlakuan dengan media MS0 + IBA 1,5 mg/L
17. Perlakuan dengan media IBA 1,5 mg/L + BAP 0,5 mg/L
18. Perlakuan dengan media BAP 1 mg/L + IBA 1,5 mg/L
19. Perlakuan dengan media BAP 1,5 mg/L + IBA 1,5 mg/L
20. Perlakuan dengan media BAP 2 mg/L + IBA 1,5 mg/L
21. Perlakuan dengan media MS0 + IBA 2 mg/L
22. Perlakuan dengan media BAP 0,5 mg/L + IBA 2 mg/L
23. Perlakuan dengan media BAP 1 mg/L + IBA 2 mg/L
24. Perlakuan dengan media BAP 1,5 mg/L + IBA 2 mg/L
25. Perlakuan dengan media BAP 2 mg/L + IBA 2 mg/L

28
3.4.2. Analisis Statistik
Data hasil pengamatan dianalisis melalui analisis sidik ragam (Uji F)
dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil (BNT). Model matematikanya adalah
sebagai berikut:

Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij + єijk


Yij : Nilai pengamatan untuk setiap percobaan
μ : Rataan umum
αi : Pengaruh konsentrasi BAP ke-i
βj : Pengaruh IBA ke-j
(αβ)ij : Pengaruh interaksi antara konsentrasi BAP ke-i dan IBA ke –j.
є : Pengaruh galat

Dengan hipotesis,
H0 : Tidak ada pengaruh dari kedua faktor perlakuan tersebut terhadap pada pucuk
plumeria.
H1 : Ada pengaruh dari kedua faktor perlakuan tersebut terhadap pada pucuk
plumeria.

Atau :
H0 : µ A =µ B =µ C =µ D

H1 : µ A ≠ µ B ≠ µ C ≠ µ D

Kriteria pengujian:
Jika Fhitung < Ftabel , maka H0 diterima (H1 ditolak)
Jika Fhitung > Ftabel , maka H0 ditolak (H1 diterima)

29
Apabila H1 diterima, berarti ada pengaruh dari setiap perlakuan, untuk
mengetahui perlakuan mana yang paling efektif (baik), maka ditempuh dengan
menghitung Beda Nyata Terkecil (BNT).
Rumusnya:

2 RK (k )
BNT = t (0,01/0,05) (dbk) n

Ket:
t(0,01/0,05) : uji t dengan signifikansi 1% atau 5%
dbk : derajat kebebasan kekeliruan
RK(k) : Rataan Kuadrat kekeliruan
n : ulangan

Pengamatan
Pengamatan yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi:

3.4.1. Persentase Kontaminasi


Pengamatan dilakukan pada minggu ke-1 setelah eksplan dikultur dan
disubkultur kemudian dihitung jumlah eksplan yang terkontaminasi dan yang tumbuh
dengan baik pada perbandingan media. Dihitung dengan membagi jumlah eksplan
yang terkontaminasi dengan total jumlah eksplan dikali seratus persen.

3.4.2. Jumlah Pucuk Baru


Pengamatan dilakukan pada minggu ke-0 sebagai data awal hingga minggu
ke-10 setelah eksplan dikultur dan disubkultur kemudian dihitung jumlah pucuk daun
pada tunas yang terbentuk dari masing-masing media perlakuan.

30
3.4.3. Tinggi Pucuk
Pengamatan dilakukan pada minggu ke-0 sebagai data awal hingga minggu
ke-10 setelah eksplan dikultur dan disubkultur kemudian diukur tinggi pucuk pada
tunas yang terbentuk dari masing-masing media perlakuan.

3.4.4. Jumlah Pucuk Batang


Pengamatan dilakukan pada minggu ke-5 hingga minggu ke-10 setelah
eksplan dikultur kemudian diukur jumlah pucuk pada batang yang terbentuk dari
masing-masing media perlakuan.

3.4.5. Tinggi Batang


Pengamatan dilakukan pada minggu ke-5 hingga minggu ke-10 setelah
eksplan dikultur kemudian diukur tinggi pucuk pada batang yang terbentuk dari
masing-masing media perlakuan.

3.4.6. Pertumbuhan Kalus


Pengamatan dilakukan pada minggu ke-0 hingga minggu ke-10, kalus diukur
berdasarkan diameter kalus yang terbentuk kemudian setiap satu satuan ukur diberi
satu tanda ”*”, apabila terjadi pembentukan akar maka setiap satu satuan ukur akar
diberi tanda ”v”.

3.4.7. Penampakan Eksplan


Pengamatan dilakukan pada minggu ke-1 hingga minggu ke-10 setelah
eksplan dikultur dan diamati pada setiap perubahan yang terjadi pada eksplan, seperti:
browning, vitrifikasi, keriting, dll.

31